i
PENAPISAN BAKTERI XILANOLITIK DAN KARAKTERISASI XILANASENYA UNTUK HIDROLISIS TONGKOL JAGUNG
DESI MUNGGARANI NATALIA
DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2011
ii
ABSTRAK DESI MUNGGARANI NATALIA. Penapisan Bakteri Xilanolitik dan Karakterisasi Xilanasenya untuk Hidrolisis Tongkol Jagung. Dibimbing oleh ANJA MERYANDINI dan TITI CANDRA SUNARTI. Hemiselulosa merupakan polisakarida terbesar ke-2 di alam, dengan komponen utama penyusunnya adalah xilan. Bakteri xilanolitik mampu menghasilkan enzim ekstraseluler yang dapat menghidrolisis limbah pertanian, khususnya yang mengandung xilan menjadi xilosa dan xilooligosakarida. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan penapisan bakteri xilanolitik isolat lokal dan karakterisasi enzim xilanasenya, yang akan digunakan untuk menghidrolisis tongkol jagung. Pada penelitian ini diseleksi 7 isolat bakteri (isolat C, F, G, H, J, K1, dan P ) secara kualitatif yang mempunyai kemampuan menghidrolisis xilan serta aktivitas enzim hariannya. Enzim dari isolat terpilih kemudian dikarakterisasi pH optimum, spesifitas substrat dan stabilitasnya, serta pemanfaatannya sebagai katalis dalam hidrolisis tongkol jagung. Hasil seleksi terpilih isolat P yang menghasilkan enzim dengan aktivitas tertinggi (17.465 nkat/ml) pada hari ke7. Xilanase tersebut mempunyai aktivitas optimum pada pH 8, dan spesifitas substrat tertinggi pada tongkol jagung, serta stabil pada suhu 30˚C hingga jam ke-12. Produk hasil hidrolisis tongkol jagung setelah jam ke-12 berupa oligosakarida dengan DP sekitar 7. Kata kunci : xilanase, bakteri, isolat lokal, tongkol jagung
ABSTRACT DESI MUNGGARANI NATALIA. Screening of Xylanolitic Bacteria and Characterization of its Xylanase for Corncob Hydrolysis. Supervised by ANJA MERYANDINI and TITI CANDRA SUNARTI. Hemicellulose is the second largest polysaccharide in nature after cellulose, which consists of xylan as main component. Xylanolitic bacteria produce extracellular enzymes that could hydrolyze agricultural waste, especially xylan-rich materials to xylose and xylooligosaccharides. This research is aimed to screen local isolate xylanolitic bacteria and characterize its enzyme, and then utilize the enzyme for corncob hydrolysis. Seven bacteria isolates (isolates C, F, G, H, J, K1, and P) were selected in this research for its capability to hydrolyze xylan qualitatively and produced high activity enzymes. Enzyme from selected isolate was characterized its optimum pH, substrate specifity, and its stability, and applied it as biocatalyst for corncob hydrolysis. Isolate P was selected as produced high activity enzyme (17.465 nkat/ml) after 7 days fermentation. The enzyme has highest activity on pH 8, corncob as substrate, and stable on temperature of 30 oC for 12 hours. Products from enzymatic hydrolysis of corncob after 12 hours were oligosaccharides with DP around 7. Key Word : xylanase, bacteria, isolate local, corncob
iii
PENAPISAN BAKTERI XILANOLITIK DAN KARAKTERISASI XILANASENYA UNTUK HIDROLISIS TONGKOL JAGUNG
DESI MUNGGARANI NATALIA
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2011
iv
Judul Skripsi Nama NIM
: Penapisan Bakteri Xilanolitik dan Karakterisasi Xilanasenya untuk Hidrolisis Tongkol Jagung : Desi Munggarani Natalia : G34062646
Disetujui
Pembimbing I
Pembimbing II
Dr. Anja Meryandini, M.S. NIP.19620327. 198703. 2001
Dr. Ir. Titi Candra Sunarti, M.Si. NIP. 19661219. 199103. 2001
Diketahui Kepala Departemen Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor
Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Si. NIP. 19641002. 198903. 1002
Tanggal Lulus :
v
PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala rahmat dan karuniaNya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini. Karya ilmiah ini merupakan salah satu syarat memperoleh gelar sarjana sains pada Departemen Biologi. Penelitian dilaksanakan sejak bulan Februari sampai November 2010 di Laboratorium Bioteknologi Hewan dan Biomedis, Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB) IPB. Topik yang dipilih berjudul “Penapisan Bakteri Xilanolitik dan Karakterisasi Xilanasenya untuk Hidrolisis Tongkol Jagung”. Penulis mengucapkan terima kasih yang tak terhingga kepada Dr. Anja Meryandini, M.S. dan Dr. Ir. Titi Candra Sunarti, M.Si. selaku pembimbing yang telah memberikan dana penelitian, bimbingan, pengetahuan, saran, kesabaran serta solusi selama penelitian dilaksanakan sampai penulisan karya ilmiah. Terima kasih kepada Ir. Tri Heru Widiarto, M.Sc. selaku Wakil Komisi Pendidikan yang menguji dan terima kasih penulis ucapkan kepada teknisi Laboratorium Bioteknologi Hewan dan Biomedis PPSHB IPB Mba Dewi dan Teh Pipit atas bantuan dan dukungannya selama penelitian dilaksanakan. Terima kasih penulis ucapkan pada rekan dan saudara seperjuangan yang senantiasa memberikan semangat dan dukungan kepada penulis, Devi, Ka Novi, Oni, Mba Eka, Mba Ruri, Mba Heni, dan Pak Azis yang memberikan masukan selama penelitian. Penulis ucapkan terima kasih kepada sahabat terbaik Kerzjakru, teman kosan Bateng 23, Ega, Firda, Fajri, Ka Budi, Indah, Yulita, Sars, Siti, Siska, Nijma dan teman-teman Biologi angkatan 43 yang tidak bisa disebutkan satu persatu atas dukungan, kebersamaan, kasih sayang dan persahabatan. Penulis menyampaikan terima kasih tak terhingga kepada Bapak, Mamah, Ibu, adik serta keluarga atas doa, kasih sayang, pengertian, dan nasihat kepada penulis. Akhir kata, semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Maret 2011
Desi Munggarani Natalia
vi
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Sukabumi pada tanggal 22 Desember 1987. Penulis merupakan anak pertama dari tiga bersaudara dari Bapak Emu Suparma dan Ibu Eem Nuryanti. Tahun 2006 penulis lulus dari SMU Negeri 1 Cibadak, Sukabumi dan pada tahun yang sama penulis diterima di Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor melalui jalur SPMB. Selama mengikuti kuliah penulis pernah menjadi asisten pada praktikum mata kuliah Sistematika Tumbuhan Berpembuluh (tahun ajaran 2008/2009 dan tahun ajaran 2010/2011) Botani Umum (tahun ajaran 2009/2010) Mikrobiologi Dasar (2010/2011) dan Biologi Dasar (2010/2011). Penulis melaksanakan praktik lapang di PT Indolakto (Ice Cream Manufacturing) bagian Quality Control Mikrobiologi. Penulis juga aktif dalam kegiatan organisasi HIMABIO (Himpunan Mahasiswa Biologi) sebagai staf BioWorld (2007/2008 dan 2008/2009).
vii
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL ......................................................................................................................... vi DAFTAR GAMBAR .................................................................................................................... vi DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................................................. vi PENDAHULUAN Latar Belakang ................................................................................................................. 1 Tujuan .............................................................................................................................. 1 BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian .......................................................................................... 1 Bahan dan Alat ................................................................................................................. 1 Metode Penelitian ............................................................................................................ 1 Penapisan Isolat Bakteri Xilanolitik Peremajaan Isolat Xilanolitik................................................................................... 2 Pengukuran Indeks Xilanolitik ................................................................................ 2 Penetapan Waktu Inkubasi Aktivitas Harian Xilanase ............................................ 2 Aktivitas Spesifik Harian Isolat Terpilih ................................................................ 2 Karakterisasi Isolat Terpilih Penentuan pH Optimum Xilanase............................................................................ 2 Aktivitas Enzim Xilanase pada Berbagai Jenis Substrat.......................................... 2 Uji Stabilitas Enzim Xilanase Ekstrak Kasar ........................................................... 2 Hidrolisis Tongkol Jagung dengan Xilanase ........................................................... 3 HASIL PENELITIAN Penapisan Isolat Bakteri Xilanolitik Peremajaan Isolat Xilanolitik................................................................................... 3 Pengukuran Indeks Xilanolitik ................................................................................ 3 Waktu Inkubasi Aktivitas Harian Xilanase ............................................................ 3 Aktivitas Spesifik Harian Isolat Terpilih ................................................................ 4 Karakteristik Isolat Terpilih pH Optimum Xilanase ............................................................................................. 5 Aktivitas Enzim Xilanase pada Berbagai Jenis Substrat.......................................... 5 Stabilitas Enzim Xilanase Ekstrak Kasar ................................................................. 5 Hidrolisis Tongkol Jagung dengan Xilanase ........................................................... 5 PEMBAHASAN Penapisan Isolat Bakteri Xilanolitik Peremajaan Isolat Xilanolitik................................................................................... 6 Pengukuran Indeks Xilanolitik ................................................................................ 6 Waktu Inkubasi Aktivitas Harian Xilanase ............................................................ 6 Aktivitas Spesifik Harian Isolat Terpilih ................................................................ 6 Karakteristik Isolat Terpilih pH Optimum Xilanase ............................................................................................. 7 Aktivitas Enzim Xilanase pada Berbagai Jenis Substrat.......................................... 7 Stabilitas Enzim Xilanase Ekstrak Kasar ................................................................. 7 Hidrolisis Tongkol Jagung dengan Xilanase ........................................................... 7 SIMPULAN ................................................................................................................................... 8 SARAN .......................................................................................................................................... 8 DAFTAR PUSTAKA .................................................................................................................... 8 LAMPIRAN ................................................................................................................................. 10
vi
DAFTAR TABEL Halaman 1 2 3 4
Pengukuran indeks xilanolitik ............................................................................................... 3 Aktivitas dan aktivitas spesifik xilanase isolat P ................................................................... 5 Spesifitas substrat xilanase isolat P pada pH 8 dan suhu 30 ºC ............................................. 5 Perubahan komposisi karbohidrat pada xilanase isolat P pada pH 8 dan suhu 30 ºC ............ 5
DAFTAR GAMBAR Halaman 1 2 3 4 5 6 7
Koloni hasil peremajaan isolat G, H, F, C, P, J dan K1 pada media agar-agar xilan birchwood 1% diinkubasi pada suhu ruang selama 2 hari pada suhu ruang. ......................... 3 Kemampuan xilanolitik isolat G, H, F, C, P, J dan K1 pada media agar-agar xilan birchwood 1% setelah inkubasi 2 hari pada suhu ruang ........................................................ 3 Kurva aktivitas harian enzim xilanase isolat G, J dan K1 yang diuji terhadap substrat xilan birchwood pada suhu 30ºC dan pH 7 .............................................................. 4 Kurva aktivitas harian enzim xilanase isolat H, F dan C yang diuji terhadap substrat xilan birchwood pada suhu 30ºC dan pH 7 .............................................................. 4 Kurva aktivitas harian enzim xilanase isolat P yang diuji terhadap substrat xilan birchwood pada suhu 30ºC dan pH 7 ............................................................................ 4 Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim xilanase isolat P pada suhu 30 ºC ............................. 5 Stabilitas xilanase isolat P pada suhu 30ºC selama 48 jam inkubasi ..................................... 5
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 2 3 4 5
Komposisi media agar-agar xilan dan media cair xilan ....................................................... 11 Pereaksi Reagen DNS (Dinitrosalisilic Acid) (Miller 1959) ............................................... 11 Perhitungan Aktivitas Xilanase ........................................................................................... 11 Prosedur Penetapan Kadar Protein (Bradford 1976)............................................................ 12 Prosedur Penentuan Total Gula (Metode Fenol Sulfat ) (Dubois et al. 1956) ..................... 12
1
PENDAHULUAN Latar belakang Perkembangan usaha pertanian di Indonesia menyebabkan peningkatan limbah pertanian yang sebagian besar mengandung lignoselulosa. Limbah pertanian umumnya mengandung polisakarida berupa selulosa (3550%), hemiselulosa (20-30%) dan lignin (2030%) (Subramaniyan dan Prema 2002). Hemiselulosa merupakan heteropolisakarida yang memiliki komposisi berbagai unit gula, rantai molekul yang lebih pendek dan bercabang (Fengel dan Wegener 1995). Hemiselulosa terdiri atas xilan, mannan, galaktan dan arabinan (Beg et al. 2001). Komponen terbesar penyusun hemiselulosa pada tanaman adalah xilan yang merupakan polisakarida terbesar ke-2 di alam setelah selulosa (Subramaniyan dan Prema 2002). Pemanfaatan limbah berlignoselulosa dengan menggunakan jasa mikroorganisme khususnya bakteri xilanolitik penghasil enzim ekstraseluler yang mampu mendegradasi bahan xilan menjadi fraksi penyusunnya. Xilan adalah komponen penyusun hemiselulosa dengan rantai utama homopolimer yang memiliki ikatan rantai β1,4-xilosida (Kulkarni et al. 1999 ; Fengel & Wegener 1995). Xilanase yang dihasilkan bakteri xilanolitik merupakan kelompok enzim ekstraseluler yang memiliki kemampuan menghidrolisis xilan atau polimer dari xilosa dan xilooligosakarida. Xilanase diklasifikasikan berdasarkan substrat yang dihidrolisis yaitu β-xilosidase, eksoxilanase, dan endoxilanase (Beg et al. 2001; Richana 2002). β-xilosidase memiliki kemampuan menghidrolisis xilooligosakarida menjadi rantai pendek xilosa. Aktivitas enzim akan menurun dengan meningkatnya rantai xilooligosakarida. Eksoxilanase memutus rantai polimer xilan pada ujung reduksi, sehingga menghasilkan xilosa sebagai produk utama dan sejumlah oligosakarida rantai pendek seperti xilobiosa. Endoxilanase memutus ikatan β-1,4 pada bagian dalam rantai xilan secara teratur menjadi xilooligosakarida (Richana 2002). Enzim xilanase telah dimanfaatkan dalam industri kertas dan pulp digunakan sebagai pengganti bahan kimia pemutih kertas (Subramaniyan dan Prema 2002; Beg et al. 2001), dalam pembuatan gula xilosa (Kulkarni et al. 1999), campuran pakan ternak dan penjernih sirup (Wong et al. 1988). Hasil hidrolisis xilan menjadi xilooligosakarida
dimanfaatkan sebagai prebiotik (Vazques et al. 2001). Jenis mikroorganisme yang sudah umum menghasilkan xilanase secara ekstraseluler adalah bakteri dan cendawan. Melihat besarnya kandungan hemiselulosa yang terdapat pada limbah pertanian maka pemanfaatan xilanase dalam penanganan masalah limbah pertanian perlu dikembangkan. Informasi mengenai aktivitas katalitik pada pH dan suhu optimumnya serta kemampuan enzim menghidrolisis substrat sangat diperlukan dalam pemanfaatan enzim. Penelitian ini menggunakan tujuh isolat bakteri xilanolitik asal tanah koleksi laboratorium Bioteknologi Hewan dan Biomedis, PPSHB IPB. Isolat yang digunakan telah teridentifikasi memiliki kemampuan xilanolitik. Tujuan Penelitian ini bertujuan untuk menseleksi dan karakterisasi xilanase dari bakteri xilanolitik serta pemanfaatannya untuk hidrolisis tongkol jagung. BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilaksanakan pada bulan Februari sampai Desember 2010 di Laboratorium Bioteknologi Hewan dan Biomedis, Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB) IPB. Bahan dan Alat Mikroorganisme yang digunakan adalah isolat bakteri xilanolitik koleksi laboratorium Bioteknologi Hewan dan Biomedis PPSHB IPB yaitu isolat C, F, G, H, J, K1, dan P. Substrat yang digunakan adalah xilan birchwood, xilan oat spelt, tongkol jagung dan CMC (Carboxy Methyl Cellulose). Larutan bufer sitrat (pH 3-5),bufer fosfat (pH 5-8) dan bufer tris-HCl (pH 8-9), ekstrak khamir, sukrosa, serta bahan untuk analisa. Alat-alat yang digunakan meliputi spektrofotometer, pH meter, inkubator bergoyang, vortex, penangas, pipet mikro, sentrifus, tabung reaksi, erlenmeyer dan peralatan laboratorium lainnya. Metode Penelitian Tahapan penelitian terdiri atas tiga tahap yaitu penapisan isolat bakteri xilanolitik, karakterisasi xilanase terpilih, dan hidrolisis tongkol jagung oleh xilanase terpilih.
2
Penapisan Isolat Bakteri Xilanolitik Peremajaan Isolat Xilanolitik. Isolat C, F, G, H, J, K1, dan P diremajakan pada media agar-agar xilan 1%, komposisi media disajikan pada Lampiran 1. Peremajaan pada media agar-agar diinkubasi pada suhu ruang selama 24-48 jam. Hasil peremajaan digunakan untuk penentuan kurva aktivitas harian xilanase dengan menginokulasi isolat bakteri pada media xilan cair 1 %. Pengukuran Indeks Xilanolitik. Bakteri xilanolitik ditumbuhkan pada media agar-agar xilan 1% dan diinkubasi selama 2 hari pada suhu ruang. Isolat pada cawan ditetesi merah kongo 0,1% (0,1 g merah kongo dalam 100 ml alkohol 96%), didiamkan selama 15 menit kemudian dicuci dengan NaCl fisiologis 0,2 M dan disimpan selama dua hari dalam lemari pendingin. Setelah dua hari dilakukan pengukuran diameter zona bening di sekitar koloni serta diameter koloni yang terbentuk. Indeks xilanolitik ditetapkan berdasarkan pengukuran zona bening dikurangi diameter koloni dibagi diameter koloni. Penetapan Waktu Inkubasi Aktivitas Harian Xilanase. Sebanyak dua lup bakteri hasil peremajaan diinokulasikan ke dalam 100 ml media xilan 1% cair dan diinkubasikan dalam inkubator bergoyang 120 rpm pada suhu 30˚C. Setiap 24 jam sekali selama 7-9 hari dilakukan pengukuran aktivitas xilanase. Ekstrak kasar enzim (supernatan) diperoleh dengan mensentrifugasi kultur pada 10.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4˚C. Aktivitas xilanase diukur dengan menghitung kandungan xilosa yang terbentuk dan dianalisis dengan metode DNS (Miller 1959) dengan cara menambahkan enzim ekstrak kasar sebanyak 500 μl dalam substrat xilan 1% dalam buffer fosfat pH 7 dan diinkubasikan pada suhu 300C selama 10 dan 30 menit. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 1000 μl DNS dan dididihkan pada suhu 1000C selama 15 menit, kemudian didinginkan pada suhu ruang dan dilakukan pengukuran pada λ 540nm dengan spektrofotometer. Prosedur penyiapan pereaksi DNS disajikan pada Lampiran 2. Pengujian aktivitas xilanase dilakukan dengan menggunakan blanko dan kontrol. Xilosa digunakan sebagai standar untuk penghitungan aktivitas xilanase (Lampiran 3). Satu unit aktivitas enzim adalah banyaknya enzim yang dapat memproduksi 1 μmol xilosa/menit/ml dan satu unit aktivitas enzim setara dengan 16.67 nkat/ml (Dybkaer 2001).
Aktivitas Spesifik Harian Isolat Terpilih. Aktivitas spesifik dihitung berdasarkan nilai aktivitas enzim xilanase dibagi dengan kadar protein. Pengukuran kadar protein menggunakan metode Bradford (1976) dengan mencampurkan 200 μl enzim ekstrak kasar dengan 2 ml reagen Bradford, divortex lalu didiamkan selama 15 menit dan diukur pada panjang gelombang λ595 nm. BSA (Bovin Serum Albumin) digunakan sebagai standar protein dalam pembuatan kurva standar protein (Lampiran 4). Karakterisasi Isolat Terpilih Penentuan pH Optimum Xilanase. Penentuan pH optimum dilakukan dengan cara mereaksikan enzim dengan substrat pada berbagai pH pada suhu 30˚C selama 10 menit. Bufer yang digunakan yaitu bufer sitrat fosfat (pH 3.0-5.5), bufer fosfat (pH 6.0-8.0) dan bufer Tris-HCl (pH 7.0-9.0). Gula pereduksi yang terbentuk diukur dengan metode DNS (Miller 1959). Aktivitas Enzim Xilanase pada berbagai Jenis Substrat. Enzim ekstrak kasar isolat terpilih pada hari dan pH optimum dengan suhu 30˚C diujikan pada substrat xilan birchwood, xilan oat spelt, CMC (Carboxy Methyl Cellulose) dan tongkol jagung. Sebanyak 5 ml substrat ditambahkan 5 ml xilanase ekstrak kasar, yang direaksikan dalam erlenmeyer 100 ml selama 10 menit pada suhu 30˚C. Campuran enzim dan substrat diambil sebanyak 1 ml kemudian ditambahkan DNS, setelah itu reaksi dihentikan dengan menginkubasi sampel pada suhu 100˚C selama 15 menit. Pada hidrolisis tongkol jagung, sebanyak 0.05 g tongkol jagung dilarutkan dalam 5 ml bufer dan 5 ml enzim ekstrak kasar pada erlenmeyer 100 ml selama 10 menit pada suhu 30˚C. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 50 μl NaOH 0.2 M pada campuran, selanjutnya campuran larutan tersebut disentrifugasi pada kecepatan 2500 rpm selama 20 menit. Xilosa yang terbentuk ditetapkan dengan metode DNS. Sebanyak 1 ml supernatan ditambahkan 1 ml DNS lalu diinkubasi 100˚C selama 15 menit. Sampel diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang λ 540 nm. Uji Stabilitas Enzim Xilanase Ekstrak Kasar. Stabilitas xilanase isolat terpilih diuji dengan menginkubasi enzim ekstrak kasar yang diperoleh pada substrat tongkol jagung pada suhu 30˚C dan pH optimum. Aktivitas xilanase dihitung setiap 12 jam sekali sampai
3
mengalami penurunan aktivitas yaitu dengan menghitung jumlah xilosa yang terbentuk melalui metode DNS (Miller 1959). Nilai aktivitas relatif xilanase dinyatakan dalam persentase. Hidrolisis Tongkol Jagung dengan Xilanase. Tongkol jagung dihidrolisis dengan enzim xilanase dari isolat terpilih. Xilanase diperoleh dari isolat yang ditumbuhkan pada media cair substrat tongkol jagung. Sebanyak 10 ml ekstrak kasar xilanase hasil sentrifugasi direaksikan dengan 50 ml substrat tongkol jagung dalam erlenmeyer 250 ml. Sampel hasil hidrolisis sebanyak 1 ml diambil setiap 6 jam sekali. Perubahan gula pereduksi yang terbentuk diamati dengan metode DNS (Miller 1959) sedangkan total gula dengan metode fenol asam sulfat Dubois et al. (1956) (Lampiran 5). Karakteristik produk hasil hidrolisis ditentukan berdasarkan perubahan nilai derajat polimerisasi berdasarkan perbandingan total gula dengan gula pereduksi. HASIL PENELITIAN Penapisan Isolat Bakteri Xilanolitik Peremajaan Isolat Xilanolitik. Isolat bakteri xilanolitik yang ditanam pada media agar-agar xilan birchwood 1% membutuhkan waktu tumbuh sekitar 2 hari untuk masing-masing isolat. Berdasarkan hasil peremajaan, ketujuh isolat memiliki koloni bakteri dengan ciri dan warna yang berbeda (Gambar 1). Isolat G, F, dan C memiliki warna koloni kuning muda, tipis dan sedikit licin. Koloni H, P, J dan K berwarna kuning sedikit timbul dan mengeluarkan polisakarida.
G
H
F
C
P
J
K Gambar 1 Koloni hasil peremajaan isolat G, H, F, C, P, J dan K1 pada media agar-agar xilan birchwood 1% diinkubasi pada suhu ruang selama 2 hari.
Pengukuran Indeks Xilanolitik. Kemampuan ketujuh isolat mendegradasi xilan ditunjukkan dengan terbentuknya zona bening di sekitar koloni pada media agar-agar xilan 1 %. Setelah inkubasi selama 2 hari zona bening divisualisasi menggunakan merah kongo 0,1%. Zona bening terbesar dimiliki oleh isolat P (Gambar 2). Nilai indeks xilanolitik tertinggi ditunjukkan oleh isolat P (Tabel 1). P
J
C K 1 F H
G
Gambar 2 Kemampuan xilanolitik isolat G, H, F, C, P, J dan K1 pada media agar-agar xilan birchwood 1% setelah inkubasi 2 hari pada suhu ruang. Tabel 1 Pengukuran Indeks Xilanolitik Isolat
Indeks Xilanolitik
C F G H J K1 P
0,50 0,50 0,60 0,40 0,38 0,33 0,64
Waktu Inkubasi Aktivitas Harian Xilanase. Produksi enzim xilanase tertinggi ditunjukkan oleh isolat G dan dicapai pada hari ke-3 dengan aktivitas 2.293 nkat/ml dengan waktu inkubasi 10 menit dan hari ke-4 dengan aktivitas 0.470 nkat/ml dengan waktu inkubasi 30 menit. Aktivitas tertinggi enzim xilanase isolat J pada waktu inkubasi 10 dan 30 menit masing-masing 3.352 nkat/ml dan 0.235 nkat/ml pada hari ke-4. Isolat K1 memiliki dua puncak aktivitas xilanase pada inkubasi 10 menit dan mencapai aktivitas tertinggi pada hari ke-2 dengan aktivitas 3.528 nkat/ml dan meningkat kembali pada hari ke-4, sedangkan pada inkubasi 30 menit produksi xilanase tertinggi pada hari ke-4 dengan aktivitas 0.235 nkat/ml (Gambar 3).
4
Gambar 3 Kurva aktivitas harian enzim xilanase isolat G, J dan K1 yang diuji terhadap substrat xilan birchwood pada suhu 30ºC dan pH 7.
hari ke-3 dan hari ke-2. Isolat C memiliki dua puncak aktivitas pada waktu inkubasi 10 menit. Hari produksi enzim tertinggi dicapai pada hari ke-3 (4.058 nkat/ml) dan mengalami peningkatan nilai aktivitas kembali pada hari ke-5. Produksi xilanase tertinggi pada waktu inkubasi 30 menit dicapai pada hari ke-4 dengan nilai aktivitas 1.588 nkat/ml. Produksi xilanase tertinggi isolat P pada hari ke-7 dengan waktu inkubasi 10 dan 30 menit. Isolat P memiliki tiga puncak aktivitas pada inkubasi 10 menit yaitu pada hari ke-2, ke-4 dan ke-7. Nilai aktivitas hari ke-2 sebesar 5.116 nkat/ml, aktivitas meningkat pada hari ke-4 sebesar 6,527 nkat/ml dan aktivitas xilanase mencapai aktivitas tertinggi pada hari ke-7 sebesar 17.465 nkat/ml. Produksi enzim isolat P pada inkubasi 30 menit memiliki dua puncak aktivitas hari ke-2 dan meningkat kembali pada hari ke-7 dengan aktivitas sebesar 7.586 nkat/ml.
Produksi enzim xilanase isolat H tertinggi pada hari ke-2 dengan waktu inkubasi 10 dan 30 menit dengan aktivitas masing-masing 4.763 nkat/ml dan 1.823 nkat/ml (Gambar 4). Nilai aktivitas xilanase dengan waktu inkubasi 30 menit meningkat kembali pada hari ke-7.
Gambar 5
Kurva aktivitas harian enzim xilanase isolat P yang diuji terhadap substrat xilan birchwood pada suhu 30ºC dan pH 7.
Nilai aktivitas enzim terbesar pada masing-masing isolat ditunjukkan pada lama inkubasi 10 menit. Isolat hasil seleksi yaitu isolat P dipilih untuk karakterisasi lebih lanjut Gambar 4 Kurva aktivitas harian enzim xilanase isolat H, F dan C yang diuji terhadap substrat xilan birchwood pada suhu 30ºC dan pH 7. Produksi enzim isolat F pada waktu inkubasi 10 dan 30 menit memiliki aktivitas masing-masing 5.645 nkat/ml dan 4.410 nkat/ml pada hari ke-5 inkubasi. Isolat F memiliki dua puncak aktivitas pada inkubasi 10 dan 30 menit yaitu masing-masing pada
Aktivitas Spesifik Harian Isolat Terpilih. Kadar protein yang diperoleh digunakan sebagai pembagi aktivitas xilanase untuk memperoleh aktivitas spesifiknya. Peningkatan nilai aktivitas spesifik sejalan dengan kurva aktivitas harian. Nilai aktivitas tertinggi pada aktivitas xilanase 17.465 nkat/ml sejalan nilai terbesar aktivitas spesifiknya sebesar 123,87 nkat/mg (Tabel 2).
5
Tabel 2 Aktivitas dan aktivita spesifik xilanase isolat P. Aktivitas Enzim (nkat/ml) 3,705 5,116 1,941 6,527 6,351 6,704 17,465 8,115 0,000
Hari 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Aktivitas Spesifik (nkat/mg) 23,6 34,57 13,57 44,4 43,2 46,55 123,87 70,57 0
Stabilitas Enzim Xilanase Ekstrak Kasar. Xilanase isolat P yang diuji stabilitasnya selama 48 jam, mengalami penurunan aktivitas pada selang inkubasi 12 jam. Penurunan aktivitas sebesar 66.7% dari aktivitas pada jam ke-12 mengalami penurunan kembali pada jam ke-24 hingga 16.7% pada jam ke-36 dan kehilangan aktivitasnya pada inkubasi jam ke-48 (Gambar 7).
Karakteristik Isolat Terpilih pH Optimum Xilanase. Xilanase dari isolat P mencapai aktivitas tertinggi pada pH 8 dengan nilai aktivitas enzim 13.196 nkat/ml (Gambar 6).
Gambar 6 Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim xilanase isolat P pada suhu 30 ºC . Aktivitas Enzim Xilanase pada Berbagai Jenis Substrat. Aktivitas tertinggi xilanase isolat P didapat pada substrat tongkol jagung dengan nilai aktivitas 1.411 nkat/ml (Tabel 3). Tabel 3 Spesifitas substrat xilanase isolat P pada pH 8 dan suhu 30 ºC.
Substrat
Aktivitas Enzim (nkat/ml)
Gambar 7 Stabilitas xilanase isolat P pada suhu 30ºC selama 48 jam inkubasi.
Hidrolisis Tongkol Jagung dengan Xilanase. Produksi enzim xilanase ekstrak kasar isolat P pada hari ke-7 dari substrat tongkol jagung digunakan untuk menghidrolisis tongkol jagung. Produk hidrolisis xilanase isolat P memperlihatkan kenaikan gula pereduksi selama inkubasi 12 jam dan nilai total gula sampel relatif tetap. Xilanase aktif menghidrolisis substrat tongkol jagung sampai jam ke-12. Nilai derajat polimerisasi hasil hidrolisis xilanase isolat P pada substrat tongkol jagung mengalami penurunan sejalan dengan meningkatnya gula pereduksi yang terbentuk, nilai DP yang dihasilkan sekitar 7 (Tabel 4). Tabel 4 Perubahan komposisi karbohidrat pada tongkol jagung oleh xilanase isolat P pada pH 8 dan suhu 30 ºC. Jam ke-
Total
Gula
Gula
Pereduksi
(mg/ml)
(mg/ml)
Derajat Polimerisasi
Xilan Oat spelt
1,059
0
15,186
1,867
8,134
Xilan Birchwood
0,882
6
13,957
1,883
7,412
CMC
1,235
12
13,561
1,962
6,912
Tongkol Jagung
1,411
18
13,719
1,93
7,108
6
PEMBAHASAN Penapisan Isolat Bakteri Xilanolitik Peremajaan Isolat Xilanolitik. Isolat bakteri xilanolitik yang ditanam pada media agar-agar xilan birchwood 1% membutuhkan waktu tumbuh sekitar 2-3 hari untuk masing-masing isolat. Kemampuan tumbuh mikroorganisme bergantung pada kondisi pH, suhu, waktu inkubasi dan konsentrasi substrat sebagai sumber karbonnya (Schlegel dan Schmidt 1994; Fardiaz 1992). Ketujuh isolat ini dapat menggunakan xilan sebagai sumber karbon yang terdapat dalam media xilan. Morfologi isolat xilanolitik yang diremajakan pada media xilan memiliki bentuk dan warna yang berbeda. Hal ini dikarenakan keragaman fisiologis masing-masing isolat. Pengukuran Indeks Xilanolitik. Kemampuan ketujuh isolat dalam menguraikan substrat xilan birchwood dapat dilihat dengan terbentuknya zona bening disekitar koloni. Substrat xilan menginduksi dengan baik sintesis xilanase. Zat warna kongo berikatan dengan ikatan glikosidik pada xilan menghasilkan warna merah. Pembentukan zona bening menunjukkan bahwa substrat xilan pada media agar-agar dihidrolisis oleh xilanase. Waktu Inkubasi Aktivitas Harian Xilanase. Peningkatan nilai aktivitas pada inkubasi kultur sampai hari ke-7 atau ke-9 menandakan adanya induksi xilanase pada masing-masing isolat tersebut. Beg et al. (2001) menyatakan bahwa enzim xilanase dapat diinduksi oleh xilan murni. Isolat-isolat yang dikulturkan ada yang memiliki lebih dari satu puncak aktivitas. Kurva aktivitas enzim mengalami fluktuasi penurunan dan peningkatan aktivitas selama inkubasi. Hal ini kemungkinan dikarenakan adanya sistem enzim yang bekerja secara sinergis dalam menghidrolisis xilan yaitu β-xilosidase, eksoxilanase, dan endoxilanase (Beg et al. 2001) tidak dikeluarkan secara bersamaan. Selain itu, penurunan aktivitas xilanase bisa juga dikarenakan adanya penghambatan metabolit (feedback inhibition) pada saat penurunan aktivitas. Hal ini terjadi karena produk akhir enzim biasanya memberikan efek alosterik negatif terhadap kerja enzim (Purwoko 2007). Menurut Madigan dan Martinko (2006), penurunan aktivitas enzim dapat juga disebabkan adanya isoenzim yang merupakan protein berbeda yang dapat mengkatalisis
reaksi yang sama yang menghambat kerja aktivitas enzim. Isolat yang ditumbuhkan pada media cair xilan birchwood 1% memiliki waktu optimum untuk produksi enzim xilanase yang berbeda. Perbedaan waktu optimum aktivitas xilanase menunjukkan adanya keragaman fisiologi diantara masing-masing isolat dalam hal pemanfaatan xilan sebagai sumber karbon. Xilanase yang mengurai xilan menjadi monomer-monomer xilosa yang bersifat sebagai gula pereduksi. Pembentukan gula pereduksi dikuantifikasi dengan metode DNS (Miller 1959). Penambahan DNS (Dinitrosalisilic Acid) memperlihatkan adanya perubahan warna yang terjadi karena adanya reaksi antara gula pereduksi dalam hal ini xilosa yang memiliki gugus karbonil yang berada pada ujung rantai karbon dengan asam dinitrosalisilat (Miller 1959). Lama waktu inkubasi mempengaruhi kerja enzim dengan substratnya yang mempengaruhi nilai aktivitas. Reaksi enzimatis pada perlakuan lama waktu inkubasi antara 10 menit dan 30 menit memiliki nilai aktivitas yang berbeda. Hasil pengukuran kandungan gula pereduksi pada substrat xilan birchwood 1% dari ketujuh isolat memiliki aktivitas tertinggi pada waktu inkubasi 10 menit dibandingkan dengan lama inkubasi 30 menit. Hal ini menunjukkan xilanase bekerja secara optimal selama waktu inkubasi 10 menit, setelah itu xilanase bersifat tidak stabil sehingga pada pengukuran aktivitas dengan waktu inkubasi 30 menit laju pembentukkan gula pereduksi yang dihasilkan tidak bertambah. Menurunnya kestabilan yang ditandai dengan berkurangnya nilai aktivitas diduga akibat adanya perubahan konformasi enzim sehingga situs aktifnya tidak dapat berikatan dengan substrat (Lehninger 1982). Selain itu, kemungkinan terbatasnya ketersediaan xilan yang dapat dihidrolisis oleh xilanase. Aktivitas Spesifik Harian Isolat Terpilih. Spesifitas kerja enzim xilanase isolat P dihitung dengan mengukur kadar protein dari enzim tersebut. Peningkatan nilai aktivitas spesifik sejalan dengan kurva aktivitas harian. Hal ini menunjukkan bahwa enzim yang bekerja adalah enzim spesifik xilanase pada protein yang diukur. Besarnya aktivitas spesifik yang dihasilkan xilanase isolat P untuk mencapai waktu optimum sampai hari ketujuh sejalan dengan peningkatan aktivitas enzim xilanasenya.
7
Karakteristik Isolat Terpilih pH Optimum Xilanase. Enzim memiliki pH optimum yang khas yang menyebabkan aktivitas maksimal. Perubahan pH akan mempengaruhi hilangnya aktivitas enzim (Lehninger 1982). Kondisi pH optimum dibutuhkan enzim untuk mengaktifkan seluruh kerja enzim yang mengikat substrat dan mengubahnya menjadi produk. Kondisi pH yang rendah atau pH yang tinggi dapat menyebabkan terjadinya proses denaturasi yang akan menyebabkan menurunnya aktivitas enzim, selain itu seperti pada protein struktur ion enzim bergantung pada pH lingkungan (Poedjiadi 1994). Perubahan pH lingkungan berpengaruh pada efektivitas sisi aktif dalam membentuk kompleks enzim substrat. Hasil yang disajikan pada Gambar 6 menunjukkan bahwa pada kondisi pH asam, xilanase mengalami denaturasi yang menyebabkan kehilangan aktivitasnya. Kisaran pH enzim xilanase yang dihasilkan sangat luas antara pH 6-9. Kisaran pH yang luas yang dimiliki enzim xilanase tersebut kemungkinan adanya beberapa enzim yang bekerjasama secara total dalam menghidrolisis xilan. Aktivitas Enzim Xilanase pada Berbagai Jenis Substrat. Enzim memiliki spesifitas yang tinggi terhadap substratnya (Lehninger 1982). Satu enzim tunggal akan bereaksi dengan hanya satu substrat tunggal, atau dalam beberapa hal dengan gugus kimia tertentu pada substrat-substrat yang secara kimiawi sekerabat (Pelczar dan Chan 1986). Xilanase isolat P memiliki aktivitas yang cukup besar pada berbagai substrat yang berbeda. Nilai aktivitas enzim menunjukkan hasil berbeda pada struktur xilan yang berbeda. Xilanase memiliki afinitas yang besar pada xilan oat spelt dibandingkan dengan xilan birchwood. Oat spelt merupakan xilan kayu lunak yang terdiri atas arabino-4-0metilglukoroxilan dan 4-0-metilglukoronat yang merupakan rantai samping dari xilosa (Li et al. 2000). Selain menghidrolisis rantai utama xilanase isolat P juga menghidrolisis rantai samping yang dimilikinya sehingga aktivitas yang dihasilkan lebih besar dari xilan birchwood. Xilan birchwood merupakan xilan dari kayu keras yang terdiri atas O-asetil-(4O-metilglukoronoxilan yang tidak memiliki rantai samping arabinosil (Beg et al. 2001; Subramaniyan dan Prema 2002). Xilanase isolat P juga memiliki aktivitas yang cukup besar pada substrat CMC (Carboxymetyl
cellulose) yang menunjukkan adanya kerja selulase dalam menghidrolisis ikatan β-1,4 glikosidik pada struktur selulosa murni yang amorf (Lynd et al. 2002). Xilanase ekstrak kasar isolat P pada pH optimumnya memiliki aktivitas tertinggi pada substrat tongkol jagung. Xilanase dapat terinduksi oleh komponen lignoselulosa seperti tongkol jagung (Beg et al. 2001). Komposisi lignoselulosa tongkol jagung setelah didelignifikasi pada varietas bisma memiliki kandungan selulosa 44.36%, hemiselulosa 30.38%, dan lignin 19.21% (Meryandini et al. 2008). Xilanase isolat P mampu menghidrolisis substrat tongkol jagung yang memiliki struktur lebih kompleks dengan kandungan selulosa yang tinggi dibandingkan hemiselulosa dan lignin. Artinya enzim isolat P selain mampu menghidrolisis srtruktur xilan dan selulosa murni juga mampu menghidrolisis struktur kompleks tongkol jagung sehingga aktivitasnya lebih besar dari substrat murni. Mekanisme sintesis enzim dibutuhkan suatu induser yang merupakan substansi berberat molekul rendah berupa subtrat dari reaksi katalisis enzim (Pelczar dan Chan 1986). Substrat xilan birchwood, oat spelt dan tongkol jagung merupakan induser mikroba untuk menghasilkan xilanase, sedangkan CMC merupakan induser mikroba yang menghasikan selulase hal ini sesuai yang telah dilaporkan (Richana et al. 2008). Stabilitas Enzim Xilanase Ekstrak Kasar. Secara umum enzim tidak memiliki waktu penyimpanan yang cukup lama karena berkurangnya aktivitas dan efektivitasnya. Secara alami enzim akan kehilangan aktivitasnya baik selama penggunaan maupun selama penyimpanan karena faktor kimia, fisika dan biologi (Crueger dan Crueger 1984). Stabilitas xilanase isolat P pada kondisi pH optimum dari tongkol jagung yang disimpan pada suhu 27-30ºC mengalami penurunan aktivitas selama penyimpanan sampai 48 jam. Penurunan aktivitas seiring bertambahnya waktu penyimpanan dimungkinkan adanya perubahan konformasi xilanase yang mempengaruhi aktivitas enzim. Selain itu banyak faktor baik fisika, kimia maupun faktor biologi yang mempengaruhinya saat penyimpanan (Pelczar dan Chan 1986). Hidrolisis Tongkol Jagung dengan Xilanase. Gula pereduksi yang dihasilkan dari produk hidrolisis xilanase pada tongkol jagung memperlihatkan kenaikan selama
8
inkubasi 12 jam. Hal ini menunjukkan bahwa selama 12 jam inkubasi, xilanase mampu memecah xilan menjadi fraksi penyusunnya. Total gula merupakan keseluruhan gula yang dihasilkan dari hasil hidrolisis xilan oleh enzim xilanase berupa oligosakarida dan monosakarida. Total gula ditetapkan berdasarkan metode fenol dengan prinsip bahwa gula sederhana, oligosakarida, polisakarida dan turunannya bereaksi dengan fenol dan asam sulfat pekat menghasilkan warna oranye (Dubois et al. 1956). Derajat polimerisasi (DP) merupakan perbandingan antara total gula dengan gula pereduksi hasil hidrolisis tongkol jagung oleh xilanase. Derajat polimerisasi menunjukkan seberapa besar rantai polisakarida yang merupakan polimer xilan dapat dipecah menjadi monomernya xilosa. Semakin meningkatnya nilai gula pereduksi maka nilai derajat polimerisasinya semakin menurun. Nilai DP yang semakin menurun menunjukkan adanya proses hidrolisis secara enzimatik oleh xilanase pada tongkol jagung. Proses hidrolisis ini memecah polisakarida tongkol jagung menjadi gula sederhana. Xilanase yang bekerja menghidrolisis polimer tongkol jagung menjadi oligomer gula sederhana dengan nilai DP sekitar 7 adalah endoxilanase. Xilooligosakarida adalah oligomer-oligomer gula dari unit xilosa dengan derajat polimerisasi 2 hingga 20 (Vazquez et al. 2001). Selama 12 jam masa inkubasi xilanase menghidrolisis xilan (polisakarida) menjadi xilooligosakarida. Xilanase pada pH alkali bisa digunakan sebagai biobleaching pada industri pulp dan kertas (Beg et al. 2001). Hasil hidrolisis xilanase pada tongkol jagung menjadi xilooligosakarida bisa dimanfaatkan sebagai bahan pemanis dan bahan prebiotik (Vazques et al. 2001).
Performance Liquid Chromatography) untuk menentukan produk hidrolisis dan menentukan besar ukuran polimer yang terhidrolisis.
SIMPULAN
Lehninger A. 1982. Dasar-dasar Biokimia. Volume ke-1. Suhartono MT, penerjemah; Jakarta: Erlangga. Terjemah dari Principles of Biochemistry.
Isolat xilanolitik yang terpilih adalah isolat P yang memiliki aktivitas 17.465 nkat/ml selama 10 menit inkubasi pada hari ke-7. Xilanase Isolat P optimum pada pH 8 dan juga memiliki selulase. Xilanase isolat P stabil hingga inkubasi 12 jam dengan nilai DP produk hasil hidrolisis tongkol jagung berkisar 7. SARAN Agar pemanfaatan xilanase efektif, perlu analisa produk hidrolisis xilooligosakarida secara kuantitatif dengan analisis HPLC (High
DAFTAR PUSTAKA Beg Q, Kapoor KM, Mahajan L, Hoondal GS. 2001. Microbial xylanases and their industrial aplications. J. Appl. Micribiol. Biotechnol. 56:326-338. Bradford MM. 1976. A rapid amd sensitif method of quantition of microorganism quantities of protein utilizing the principle of protein binding. Anal Biochem 72: 248-254. Crueger W, Crueger A. 1984. Biotechnology: a Textbook of Industrial Microbiology. Sinauer Associates, Inc, Sunderland USA. Dubois M, Gilles KA, Hamilton JK, Rebers PA, Smith F. 1956. Colorimetric method for determination of sugar and related substances. Anal Chem 28 (3):350-356. Dybkaer R. 2001. Unit katal for catalytic activity. Pure Appl Chem 73: 927-931. Fardiaz S. 1992. Mikrobiologi Pangan 1. Jakarta : Gramedia Pustaka Utama. Fengel D dan Wegener G. 1995. Kayu: Kimia, Ultrastruktur, Reaksi-reaksi. Sastrohamidjojo H, penerjemah. Yogyakarta: Gajah Mada University Press. Terjemahan dari: Wood: Chemistry, Ultrastructure, Reaction. Kulkarni N, A Shendye, M Rao. 1999. Molecular and biotechnological aspects of xylanases. FEMS Microbial Rev. 23:411-456.
Li K, Parastoo A, Robert C, Jeffrey T, John SK, Karl–Erik LE. 2000. Relationships between activities of xylanases and xylan structures. Enzyme and Microbial Tech 27:89-94. Lynd LR, Weimer PJ, Zyl WH, Pretorius IS. 2002. Microbial cellulose utilization: Fundamental and biotechnology. Microbial Molecul Bio Reviews 66:506577.
9
Madigan T, Martinko JM. 2006. Brock Biology of Microorganisms. Prentice Hall Internasional Inc, New Jersey. Meryandini A, Sunarti TC, Naomi A, Mutia F. 2008. Using Streptomyces xylanase to produce xilooligosacharides from corncob. Biotropia 15(2): 119-128. Miller GL. 1959. Dinitrosalisic assay. Anal Chem 31: 426-428. Pelczar Michael J, Chan ECS. 1986. Dasardasar Mikrobiologi I. Hadioetomo RS et al., penerjemah. Jakarta: Universitas Indonesia (UI-Ptress). Terjemahan dari: Elements of Microbiology. Poedjiadi A. 1994. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta: UI Press. Purwoko T. 2007. Fisiologi Mikroba. Jakarta: Bumi Aksara. Richana N. 2002. Produksi dan prospek enzim xilanase dalam pengembangan bioindustri di Indonesia. AgroBio 5(1):29-36. Richana N, Irawadi TT, Nur A, Syamsu A. 2008. Isolasi identifikasi bakteri penghasil xilanase serta karakterisasi enzimya. AgroBio 4(1):24-34. Schlegel Hans G, Schmidt K. 1994. Mikrobiologi Umum. Baskoro T, penerjemah. Yogyakarta: Gajah Mada University Press. Terjemahan dari: All Gemeine Mikrobiologie. Subramaniyan S, Prema P. 2002. Biotechnology of Microbial Xylanases: Enzymology, molecular biology and aplication. Critic. Rev. in Biotechnol. 22(1):33-64. Vazquez MJ, Alonso JL, Dominguez H, Parajo JC. 2001. Xylooligosaccharides: Manufacture and Applications. Trends Food Sci Technol 11: 387-393. Wong KKY, Tan LUL, Saddler JN. 1988. Multiplicity of β-1,4-xylanase in microorganisms: functions and applications. Microbial Rev. 52(3); 305317.
10
LAMPIRAN
11
Lampiran 1 Komposisi media agar-agar xilan dan media cair xilan Bahan
Media agar-agar xilan (g/l) 10 103 10 16
Birchwood xylan Sukrosa Ekstrak khamir Agar-agar
Media cair xilan (g/l) 10 103 10 -
Lampiran 2 Pereaksi Reagen DNS (Dinitrosalisilic Acid) (Miller 1959) Bahan NaOH K-Na- Tartarat Na2SO3 DNS (Dinitrosalisilic Acid) Aquades
jumlah media 10 g 182 g 0.5 g 10 g 1000 ml
Prosedur Pembuatan Kurva Standar Xilosa Metode DNS (Miller 1959) Stok xilosa sebesar 0.01 g (10 mg) dalam aquades 10 ml dengan konsentrasi 1 mg/ml diambil 0 ml, 0.10 ml, 0.20 ml, 0.30 ml, 0.40 ml, 0.50 ml, 0.60 ml dan 0.70 ml masing-masing ditempatkan pada tabung reaksi dan ditambahkan aquades steril sampai volume larutan stok xilosa dan aquades yang ditambahkan pada tabung reaksi adalah 2 ml. Setiap tabung reaksi yang berisi campuran larutan kemudian ditambahkan pereaksi DNS sebanyak 2 ml. Selanjutnya larutan dipanaskan selama 15 menit, setelah dingin diukur menggunakan spektrofotometer pada λ = 540nm. Kurva standar xilosa
Lampiran 3 Perhitungan Aktivitas Xilanase Aktivitas Enzin (nkat/ml)
=
(Xs – Xk) x 1000 x fp BM xilosa x t
Keterangan : Xs : Kadar gula sampel (mg/ml) Xk : Kadar gula kontrol (mg/ml) fp : Faktor pengenceran t : Waktu inkubasi (menit) BM : Bobot Molekul xilosa 150,3 g/mol
x 16.67
12
Lampiran 4 Prosedur Penetapan Kadar Protein (Bradford 1976) Pereaksi Bradford Bahan CBB G-250 Etanol 95% Asam Phosphor 85% Aquades
jumlah media 0.05 g 25 ml 50 ml 500 ml
Prosedur Pembuatan Kurva Standar Protein Stok BSA (Bovin Serum Albumin) sebesar 0.1 mg dalam 10 ml aquades dengan konsentrasi 0.01 mg/ml diambil 0 ml, 0.04 ml, 0.08 ml, 0.12 ml, 0.16 ml dan 0.20 ml masing-masing ditempatkan pada tabung reaksi dan ditambahkan aquades steril sampai volume larutan stok BSA dan aquades yang ditambahkan pada tabung reaksi adalah 200µl. Setiap tabung reaksi yang berisi campuran larutan kemudian ditambahkan pereaksi Bradford sebanyak 2 ml. Selanjutnya larutan dikocok kemudian didiamkan selama 15 menit dan diukur menggunakan spektrofotometer pada λ=595nm. Kurva Standar Protein
Lampira 5 ProsedurPenentuan Total Gula (Metode Fenol Sulfat) (Dubois et al. 1956) Prosedur Pembuatan Kurva Standar Xilosa Metode DNS (Miller 1959) Stok xilosa sebesar 1 mg dalam aquades 10 ml dengan konsentrasi 0.1 mg/ml diambil 0 ml, 0.10 ml, 0.20 ml, 0.30 ml, 0.40 ml, 0.50 ml, 0.60 ml dan 0.70 ml masing-masing ditempatkan pada tabung reaksi dan ditambahkan aquades steril hingga volume larutan stok xilosa dan aquades yang ditambahkan pada tabung reaksi adalah 1ml. Setiap tabung reaksi yang berisi campuran larutan kemudian ditambahkan larutan fenol 5% sebanyak 1 ml dan H2SO4 pekat 2.5 ml. Selanjutnya larutan pada tabung reaksi dikocok dan didiamkan hingga dingin, setelah dingin diukur menggunakan spektrofotometer pada λ = 490nm. Kurva Standar Total Gula
