PATOLÓGIÁS TERHESSÉGEK DIAGNÓZISÁNAK ÉS NYOMONKÖVETÉSÉNEK ÚJABB SZEMPONTJAI

SEMMELWEIS EGYETEM DOKTORI ÉRTEKEZÉS

DR. BÁTORFI JÓZSEF

PATOLÓGIÁS TERHESSÉGEK DIAGNÓZISÁNAK ÉS NYOMONKÖVETÉSÉNEK ÚJABB SZEMPONTJAI Budapest 2005.

Témavezetők: Prof. Dr. Kopper László az MTA doktora

Dr. Fülöp Vilmos az MTA doktora

1

TARTALOM 1. BEVEZETÉS, CÉLKITŰZÉSEK………………………………………………. 4 2. GESZTÁCIÓS TROFOBLASZTBETEGSÉGEK – MOLATERHESSÉG…. 6 2.1. Az üszögterhességről általában……………………………………….. 7 2.2. Kutatási eredmények…………………………………………….…….. 9 2.2.1. Háttér…………………………………………………………. 9 2.2.2. Újabb biomarker (Osteopontin)……………………….…… 10 2.2.2.1. Beteganyag és módszer……………………….…… 11 2.2.2.2. Eredmények………………………………….…….. 18 2.2.2.3. Értékelés…………………………………………… 21 2.2.3. Fehérjeprofil…………………………………………….…… 23 2.2.3.1. Beteganyag és módszer……………………………. 24 2.2.3.2. Eredmények………………………………….…….. 26 2.2.3.3. Értékelés……………………………………….…… 28 2.3. Újabb szempontok a molaterhesség nyomonkövetésében…….…….. 30 2.3.1. A nyomonkövetés jelenlegi gyakorlata……………….…….. 31 2.3.2. Statisztikai adatelemzés……………………………………... 33 2.3.2.1. Célkitűzés…………………………………………... 33 2.3.2.2. Beteganyag és módszer……………………….……. 33 2.3.2.3. Eredmények………………………………………... 34 2.3.3. Értékelés……………………………………………….……... 39 3. HABITUÁLIS VETÉLÉS – IMMUNOLÓGIAI VONATKOZÁSOK……… 41 3.1. A habituális vetélés definíciója, etiológiája…………………….…….. 42 3.2. A habituális vetélők immunológiai kivizsgálása és immunterápiája – célkitűzések

a

recurrens

spontán

vetélők

multicentrikus

klinikai

programjában……………………………………………………………..... 43 3.3. Módszer………………………………………………………………… 44 3.3.1. Általános kivizsgálás………………………………………… 44 3.3.2. Immunológiai kivizsgálás…………………………………… 45

2

3.3.3. Immunterápia a terhesség alatt…………………………….. 47 3.3.4. A terhesség nyomonkövetése……………………………...... 48 3.4. Eredmények…………………………………………………………… 48 3.5. Értékelés, további célok………………………………………………. 51 4. ÖSSZEFOGLALÁS…………………………………………………………...... 56 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS…………………………………………………….. 60 IRODALOMJEGYZÉK………………………………………………………...… 62 SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE……………………………………...…. 70 MELLÉKLET…………………………………………………………………...… 74

3

1. BEVEZETÉS, CÉLKITŰZÉSEK

Az utóbbi évtizedben a szülészet-nőgyógyászat ágazatai közül reflektorfénybe kerültek a terhességi immunológia, endokrinológia valamint a sterilitás-infertilitás problémakörével foglalkozó szakterületek. Jómagam 1999-ben csatlakoztam ahhoz a munkacsoporthoz, mely munkahelyemen, az Országos Gyógyintézeti Központ (OGYK, korábban HIETE, SE ETK) Szülészeti és Nőgyógyászati Osztályán alakult, és részben a bostoni Harvard Egyetem Nőgyógyászati Onkológiai Laboratóriumával, részben a hazai Országos Hematológiai és Immunológiai Intézettel (OHII) együttműködve, több évtizede végez kutatásokat a patológiás terhességek patogenezisének feltárása céljából. Az OHII budapesti költöztetése az OGYK telephelyére megteremtette a lehetőséget, hogy a jövőben még szorosabb kollaborációban folytathassuk eddigi tanulmányainkat, indíthassunk újabb kutatási projecteket. Dolgozatomban szeretném összefoglalni a munkacsoport legújabb eredményeit. A patológiás terhességek közül két kórképpel foglalkozom részletesen a disszertációban: a molaterhességgel és a habituális vetéléssel. Igyekeztem e betegségeket a rendellenes lepényi működés oldaláról megközelíteni, és az abnormális trofoblaszt kialakulásának molekuláris és immunológiai hátterét elemezni. Az értekezés első részében a gesztációs trofoblasztbetegségek, ezen belül is a mola hydatidosa patogenezisének vizsgálata során elért kutatási eredményeimet ismertetem. Célom az volt, hogy hozzájáruljak a jelenleg még ismeretlen etiológiájú üszögterhesség biológiájának pontosabb megismeréséhez. Arra való tekintettel, hogy a sejtek és szövetek funkcióikat – legyen az fiziológiás vagy patológiás működés – az általuk kiválasztott fehérjéken keresztül fejtik ki, igyekeztem összehasonlítani a normális méhlepényből illetve a molaterhességből származó trofoblasztsejtek fehérje-expressziós tulajdonságait. Elsőként az osteopontin – mint lehetséges biomarker – jelenlétét vizsgáltam az egészséges placentában és mola hydatidosában. Választásom azért esett erre a fehérjére, mert az utóbbi években számtalan rosszindulatú daganatnál kimutatták az osteopontin patognosztikus szerepét a malignitás kialakulásában. Ezt követően egy új labormetodikai módszert, a SELDI-MS ProteinChip rendszert teszteltem abból a szempontból, hogy vajon alkalmazható-e a molaterhesség normálistól eltárő fehérje-

4

expressziós

tulajdonságainak

feltérképezésére,

esetlegesen

újabb

biomarkerek

megismerésére. Ezután a klinikumhoz közelítve, a molaterhesség jelenleg is általánosan használt, szenzitív biomarkerével, a szérum ß-hCG-vel (humán choriogonadotropin) kapcsolatban végeztem statisztikai adatfeldolgozást, mely során retrospektíven értékeltem a molaterhesség nyomonkövetésének jelenlegi protokollját. Célom az volt, hogy elemezzem a betegek nyomonkövetésben való részvételi arányát, valamint az, hogy meghatározzam azt a legrövidebb időt, amíg a molaterhességeket feltétlenül követnünk kell a perzisztens trofoblaszttumorok kialakulásának biztonságos, időben történő felismeréséhez. A dolgozat második részében egy fél évtizede működő hazai multicentrikus klinikai program eredményeit foglalom össze az immunpatológiai hátterű habituális vetélők diagnosztikájával, immunterápiájával és nyomonkövetésével kapcsolatban. A program e betegek immunológiai kivizsgálásának és immunkezelésének új módszerét használva az immunterápia pontos indikáció alapján történő alkalmazását tűzte ki célként. Célom az volt, hogy eddigi eredményeink alapján kimutassam, hogy az ismeretlen eredetű habituális vetélés diagnosztikájában és terápiájában milyen eredményeket ér el a fenti protokoll alkalmazása. E fenti, látszólag két teljesen különböző szülészeti kórkép a sikertelen terhességek két szélső végletét példázza. Választ kerestem arra, hogy miként fejlődhet a megtermékenyítés, beágyazódás után a trofoblaszt olyan irányba, hogy a befogadó anyai szervezetben inváziós jeleket mutat, illetve, hogy az anyai immunrendszer idegenként fogadja a terhességet, és annak kilökődését okozza.

5

2. GESZTÁCIÓS TROFOBLASZTBETEGSÉGEK – MOLATERHESSÉG A patológiás terhességek egyik ritka formáját, az üszögterhességet (mola hydatidosa) 1500 évvel ezelőtt írta le először Aetius amidai (mezopotámiai) orvos (502575), aki a bolyhok koraterhességi hydatid elfajulásáról írt magzat jelenléte nélkül. Az első, molaterhességről szóló összefoglaló közleményt Boivin jelentette meg 1827-ben, aki a betegségcsoportra jellemző triászt a chorionbolyhok vizenyős duzzanatában, érellátási zavarában és kóros burjánzásában határozta meg. Attól függően, hogy az elváltozás a lepény egészét vagy csak egy részét érinti, teljes és részleges üszögterhességet különböztetett meg. A betegség mai napig használt terminológiáját Hertz alkotta meg 1971-ben. Bevezette a gesztációs trofoblasztbetegségek (GTB) fogalmát, mely e betegségcsoport összes fajtáját magában foglalja. Ide tartoznak a klasszikus mola hydatidosa (komplett és parciális mola); az invazív mola, ahol az elváltozás infiltrálja a myometriumot, és akár áttétet is adhat; a placentaágyi trofoblaszttumor, amely a lepény beágyazódási helyéről induló, főleg citotrofoblaszt sejtekből álló daganat; valamint a choriocarcinoma, ami a cito- és szinciciotrofoblaszt sejtek malignus daganata a bolyhok hiányával és a rosszindulatú tumorok minden tulajdonságával. Csoportosítás helyett talán helyesebb, ha ugyanazon betegség különböző stádiumairól beszélünk, hiszen a gesztációs trofoblasztbetegségek altípusai egymásba

átalakulhatnak,

progrediálhatnak.

Gesztációs

trofoblaszttumorokról

beszélünk azoknál a formáknál, amelyek a környezetükbe törnek, áttéteket adnak, és kezelés nélkül a beteg halálához vezetnek. A malignus trofoblaszttumorok több mint fele molaterhesség talaján alakul ki, ezért

a

mola

hydatidosát

malignus

potenciállal

rendelkező

benignus

trofoblasztbetegségként tartják számon. Fordítva, a molaterhességek körülbelül egyötöde progrediál perzisztens trofoblaszttumorrá. Bár a terhességi trofoblaszttumorok kezelés nélkül rendkívül rosszindulatú, gyors progressziót mutató daganatok, az utóbbi évtizedekben a kemoterápia bevezetése óta még a legmalignusabb formáknál is 90 % feletti teljes gyógyulási arányt sikerült elérni, sokszor akár radikális műtét nélkül, a beteg fertilitásának megőrzésével. A kemoterápia alkalmazása trofoblaszttumoroknál Li és munkatársai nevéhez fűződik, akik 1956-ban methotrexat adása mellett három,

6

metasztázissal

szövődött

choriocarcinomában

szenvedő

nőbeteg

gyógyulásáról

számoltak be. E

betegségcsoportban

a

kemoterápia

minden

képzeletet

felülmúló

eredményessége sok kutatót ösztönzött a trofoblasztbetegségek tanulmányozására. Munkacsoportunk is immár két évtizede dolgozik a GTB onkogenetikai és immunpatológiai hátterének vizsgálatán a bostoni Harvard Egyetem Nőgyógyászati Onkológiai Laboratóriumával kollaborációban. A betegség biológiai alapjainak megismerését célzó kutatások eredményeiről a munkacsoport tagjai doktori disszertációkban valamint nemzetközi és hazai közlemények sorában számoltak be. Munkájuk folytatásaként igyekeztem bővíteni a gesztációs trofoblasztbetegségek patogenezisének pontos megértését segítő ismeretanyagot, különös hangsúlyt helyezve a normális

méhlepény

és

a

GTB

fehérje-expressziós

profiljában

jelentkező

különbségekre. [1-5]

2.1. AZ ÜSZÖGTERHESSÉGRŐL ÁLTALÁBAN Molaterhességnél a lepényszövet normálistól eltérő felépítése és működése rendellenes terhesség kialakulásához vezet életképes magzat kifejlődése nélkül. Európaszerte 2000, Magyarországon 1800, az ázsiai országokban 200 terhességre esik egy üszögterhesség. Az eltérő incidencia hátterében etnikai, éghajlati és táplálkozási tényezőknek tulajdonítanak szerepet, valamint fontos a szociális körülmények befolyásoló hatása is. A betegség bármely fertilis korban lévő nőnél előfordulhat, de prediszponáló tényezőnek számít a 20 év alatti és a 40 év feletti életkor. Ismert a molaterhesség családi halmozódása és ismétlődési kockázata is, emellett előzetes mola esetén a rosszindulatú elfajulás esélye 50-60 %-ra emelkedik. Üszögterhesség 25-30 %ban fordul elő első terhességként. [1,3] A betegség citogenetikai hátterét az adja, hogy rendellenes megtermékenyítés folytán komplett molában a chorionszövet sejtmagjai kizárólag apai eredetű kromoszómákat tartalmaznak, míg a sejtplazma mitokondriális DNS-e anyai eredetű marad. A molaterhességből kiinduló rosszindulatú trofoblaszttumorok kemoterápiára való rendkívüli érzékenysége részben magyarázható ezzel a ténnyel, hiszen az

7

immunológiai szempontból teljes egészében idegen (apai eredetű) szövet végleges eliminálásában így igen fontos szerepet játszhat az anyai immunválasz. Részleges mola esetében a genetikai vizsgálatok csaknem mindig triploid kromoszómaállományt igazolnak. A jelenség oka nem tisztázott, a patomechanizmus feltárása állandó kutatások tárgya. [6-9] A mola hydatidosa tünettanának vezető elemei a változó idejű amenorrhoeát és a terhességi tünetek kialakulását követően jelentkező méhűri vérzés, amely során borsó nagyságú hólyagok is ürülhetnek. Hyperemesis 30 %-ban fordul elő, időnként első trimeszterbeli preeclampsiás jelekkel. A jelenség oka a molaterhesség extrém magas hCG (humán chorio-gonadotropin) termelése, mely mind a vizeletben, mind a szérumban kvantitatíven mérhető. A diagnosztikában kórjelző lehet a belső vizsgálati lelet, amely során az amenorrhoeához képest nagyobb „large-for-date” uterust találunk. Bár a végleges diagnózist mindig az uterus műtéti kiürítését követő szövettani vizsgálat eredménye jelenti, az ultrahangos technikák fejlődésével igen gyakran már preszimptómásan felmerül az üszögterhesség határozott gyanúja. Az immunológia térhódításával, a laboratóriumi technikák korszerűsödésével olyan lehetőségek nyíltak meg a betegség biokémiai diagnosztikájának terén, ami mára a GTB kórismézésében szintén alapvető fontosságúvá vált. Az erre a célra kidolgozott radioimmuno-assay (RIA) módszerek megteremtették a lehetőségét a hCG béta alegységének (hCG β subunit) igen érzékeny kvantitatív mérésére. Ez azért fontos, mert az alfa alegység keresztreakciót adhat a LH, FSH és TSH hormonok hasonló aminosavszekvenciájú paralel alegységeivel, így a RIA elterjedésével a hCG béta subunit egy specifikus indikátorává válhatott a GTB biokémiai követésének. Szövődménymentes molaterhesség esetében a teljes gyógyuláshoz elegendő lehet a méh műtétes kiürítése. Természetesen a perzisztens trofoblaszttumorok kialakulásának

időben

történő

felismerése

érdekében

rendkívül

fontos

a

nyomonkövetés, azaz a műtét utáni hCG alapú biokémiai monitorizálás, melyet az erről szóló fejezetben részletezek. A perzisztenssé váló esetek additív kezelésének lehetőségei között az ismételt abrasio, a kemoterápia és a radikális műtét szerepelnek, ezek részletes ismertetése meghaladja jelen dolgozat kereteit. [1,3] A gesztációs trofoblasztbetegségek feltételezett etiológiai tényezői között a környezeti faktorok hatása mellett az onkogenetikai és immunológiai eredet teóriái

8

állnak az élen. A mola hydatidosa patomechanizmusának pontos ismerete igen fontos állomás lenne a betegség helyes orvosi megítélésében, hiszen a komplex biológiai folyamatok megértése adja meg a lehetőséget arra, hogy üszögterhességben a lehető leghatásosabb diagnosztikát, terápiát és nyomonkövetést alkalmazzuk.

2.2. KUTATÁSI EREDMÉNYEK 2.2.1. HÁTTÉR Az utóbbi években a tumorkutatás egyik központi kérdésévé vált a daganatos betegségek normálistól eltérő fehérje-expressziós tulajdonságainak elemzése, hiszen a különböző szövetek, sejtek az általuk termelt fehérjéken keresztül fejtik ki működésüket. Ezek a – fehérjék által meghatározott – funkciók lehetnek az adott szövet funkcionális működéséhez szükséges effektor elemek, de éppúgy fehérjék irányítják az adott sejt vagy szövet életműködéseinek szabályozását is. Ez a genetikailag kódolt, sejttípusonként különböző fehérjekiválasztási potenciál határozza meg a sejtek szaporodási folyamatait, a szövetek proliferációját, és valószínűleg fehérjéken keresztül szabályozott az egyes sejtek élettartama is a programozott sejthalál, azaz az apoptosis adott sejttípusra jellemző pontos regulációjával. Érthető tehát, hogy a tumorkutatás egyik alappillére azon folyamatok feltárására való törekvés, mely a fiziológiás apoptosist megzavarja, és a sejtproliferáció szabályozatlanságát, a szövetek kontroll nélküli növekedését okozza. E szempontból a terhességi trofoblaszttumorok speciális helyet foglalnak el a daganatok skáláján, hiszen már a normális terhességben is alapvető fontosságú az élettanilag fokozott sejtszaporodás megfelelő regulációja. Az egészséges terhesség megtapadása a beágyazódáskor, az embrionális sejtek nagy ütemű osztódása valamint a placentáció során a lepény sejtjeinek burjánzása a tumorszövetek növekedéséhez hasonló mechanizmusokat igényelnek. Igaz, e jellemzők egészséges terhességnél rendkívül pontosan szabályozottak. A terhességi trofoblasztbetegségek esetében a trofoblasztsejtek elvesztik fiziológiás kontrolljukat a szövetburjánzás tekintetében. A molaterhesség, mely a lepényszövet jóindulatú daganataként értelmezhető, szintén rendelkezik malignus potenciállal. Az esetek egy részében a

9

molaterhességből trofoblaszttumor alakulhat ki, így helyi invazív jelleggel az uterusfalba törhet, sőt a folyamat progressziója során távoli metasztázisokat is képezhet. [10-14] Érdemes tehát figyelmet fordítani a normális terhesség, illetve a gesztációs trofoblasztbetegségek szöveteiben a fehérje-expressziós különbségekre. A daganatos szövetekben a normálishoz képest erősebben vagy gyengébben kifejeződő fehérjék egyrészt biomarkerként segítséget nyújthatnak a diagnosztika korszerűsítésében, másrészt a szövetszaporodás mechanizmusában részt vevő proteinek kifejeződésbeni eltéréseit vizsgálva értékes információkhoz juthatunk a trofoblasztbetegségek patomechanizmusának megismerésében, ami természetesen a hatékony kezelés alkalmazásának alapfeltétele.

2.2.2. ÚJABB BIOMARKER (OSTEOPONTIN) Az osteopontin (OPN) egyike azon fehérjéknek, mely koncentrációja számos tumorszövet esetében bizonyítottan eltér az egészséges szövetekben kimutatható mennyiségtől. Molekulasúlya 44 és 66 kDa között váltakozik glikozilációtól és foszforilációtól

függően.

A

fehérje

a

benne

jelenlévő

Arg-Gly-Asp

aminosavszekvencián keresztül képes kötődni különböző típusú receptorokhoz, ideértve az integrineket (αVβ1, αVβ3, αVβ5, α4β1, α5β1, α8β1, α9β1) és a CD44 receptorokat is [15-18]. Ez a sokoldalú kötődőképesség arra enged következtetni, hogy az OPN szerepet játszhat több fiziológiás és patológiás folyamatban. Az extracelluláris mátrix proteinjeként elsőként csontszövetből izolálták mint a csontképzés-csontleépítés egyik fő szabályozóját [16, 19, 20]. A fehérje sejtproliferációt befolyásoló hatása magyarázza azt, hogy fiziológiásan kimutatható többek között a hámszövetben, a gasztrointesztinális rendszerben, az emlőkben és a sejtes immunrendszer egyes sejtjeiben (a makrofágokban és az aktivált T-limfocitákban) is. Emellett az OPN jelen van az erek simaizomzatában, húgyhólyagban, a hasnyálmirigyben, tüdőben, vesében, az agyban, valamint kiválasztódik a vizelettel és az anyatejjel is [16-18, 21, 22]. Az endometrium és a méhlepény chorionbolyhainak trofoblasztsejtjei is termelnek osteopontint, ahol valószínűleg szabályozó funkciót tölt be koraterhességben az implantáció és placentáció

10

során azáltal, hogy serkenti a sejtek közötti interakciókat, elősegíti a beágyazódást, a trofoblasztsejtek megtapadását, migrációját [23, 24]. Mindemellett az OPN-nak szerepet tulajdonítanak a tumorgenezisben számos rosszindulatú daganatnál, így határozottan erősebb kifejeződését igazolták petefészek- [25], prosztata- [26], tüdő- [27] és emlőráknál

[17],

gasztrointesztinális

daganatoknál

[28,

29],

hepatocelluláris

carcinománál [30] neuroblastománál [31] és melanoma malignumnál [32]. Az Országos Gyógyintézeti Központ Szülészeti és Nőgyógyászati Osztályán működő trofoblaszt munkacsoport valamint a bostoni Harvard Egyetem Nőgyógyászati Onkológiai Laboratóriumának együttműködésével megpróbáltuk meghatározni, hogy az osteopontin szerepet játszhat-e a gesztációs trofoblasztbetegségek patogenezisében, abban a malignus potenciálban, mellyel egyszerű üszögterhességből is kiindulhat rosszindulatú trofoblaszttumor az uterus inváziójával és távoli metasztázisok képzésével. Lézervezérelt mikrodisszekció és real-time PCR (RT-PCR) kombinált alkalmazásával vizsgáltuk, hogy van-e különbség az OPN mRNS kifejeződésében mola hydatidosa és a normális placenta között. Továbbá fehérjeszintű vizsgálatokat is végeztünk a normális méhlepény és a mola hydatidosa közötti OPN fehérje-expressziós különbségek kimutatására immunhisztokémiai módszerrel.

2.2.2.1. BETEGANYAG ÉS MÓDSZER Felhasznált szövetek A laboratóriumi vizsgálatokhoz friss fagyasztott metszeteket használtunk. A 13 komplett molából és 2 parciális molából feldolgozásra kerülő metszetek az 5. és a 16. gesztációs hét között nyert szövetet tartalmaztak (átlag: 10.6 hét). Az összehasonlítás alapjaként szolgáló 9 friss normális placentaszövetet hasonló korú terhességekből nyertük művi abortus során (átlag 10.8 hét; 9-től 14. gesztációs hétig). Minden emberi szövet a Human Subjects Committee of the Brigham and Women’s Hospital, (Boston, MA, USA) szabályai szerint került feldolgozásra.

11

Lézervezérelt mikrodisszekció (Laser Captured Microdissection – LCM) A lézervezérelt mikrodisszekció az utóbbi évek egyik új technikai lehetősége a molekuláris laboratóriumi munkában [33, 34]. Segítségével nagy tisztaságú mintákat állíthatunk elő a kiindulási anyagból oly módon, hogy tárgylemezről, a metszetek formájában jelenlévő szövetekből izoláljuk a kívánt célsejteket anélkül, hogy a szövet egyéb sejtjei a nyert anyagba kerülnének. A mikrodisszekció lézervezérléssel, mikroszkóp alatt történik. Kísérletünk során a friss fagyasztott lepényszövetekből készült metszeteken a villózus cito- és szinciciotrofoblaszt sejteket különítettük el a szövet egyéb sejtjeitől s biztosítottunk ezáltal olyan tisztított anyagot, melynek további elemzésével megbízhatóbb eredményekhez juthatunk. Az így nyert nagy specifitású minták feldolgozásával célzottan elemezhettük a normális méhlepényből és a komplett molából származó trofoblasztsejtek közötti fehérje-expressziós különbségeket [1. ábra].

A friss fagyasztott szöveteket OCT (optimal cutting temperature) Tissue-Tek médiumba ágyaztuk (Sakura Finetek, Torrance, CA, USA), és felhasználásig -80 oC–on tároltuk. Közvetlenül a mikrodisszekció előtt hét mikrométer vastagságú metszeteket készítettünk –20 oC–on Leica CM3050S kriosztát használatával. A metszeteket üveg tárgylemezen 70 % alkoholban fixáltuk 30 s-ig, majd metilénkékkel festettük. Emelkedő koncentrációjú alkoholos dehidrálást követően xylénnel tisztítást végeztünk (2x5 perc). 5 perc szárítás után a metszeteken PixCell II lézervezérelt mikrodisszekciós rendszer és ARC200 v1.0.2 szoftver (Arcturus Engineering, Mountain View, CA, USA) segítségével végeztük a mikrodisszekciót, melynek során citotrofoblaszt és a szinciciotrofoblaszt sejteket izoláltunk a tárgylemezről. Mintánként 18000 célzott lövést alkalmaztunk 1.8 ms expozíciós idő és 95 mW teljesítmény beállításokkal. A célsejteket az alább részletezett 100 µl lizáló oldat segítségével gyűjtöttük össze.

12

1. ÁBRA Trofoblasztsejtek izolálása lézervezérelt mikrodisszekcióval (LCM) A: Chorionbolyhok a lepényből származó friss fagyasztott metszeteken

B: LCM-mel eltávolítottuk a villózus trofoblasztsejteket

C: Csak az összegyűjtött trofoblasztsejtek kerülnek további feldolgozásra, ezzel biztosítva a nagy specifitású mintát

13

Totál RNS extrakció

A teljes RNS kinyerése RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Valencia, CA, USA) felhasználásával történt. Röviden: az izolált sejtek falát és maghártyáját 1 % βmercaptoetanolt tartalmazó lízis pufferben oldottuk (Buffer RTL), majd 70 % etanolt adtunk a lizátumhoz. Ezzel megteremtettük az optimális feltételeket az RNS RNeasy membránhoz való szelektív kötődéséhez. A mintákat felhordtuk a kötőmembránt tartalmazó RNeasy oszlopra, majd öblítést végeztünk az esetleges szennyeződések eltávolítására. 50 µl RNáz-mentes vizet használtunk az RNS oszlopról történő leoldásához. A kapott RNS-t –80 oC-on tároltuk.

Real-time kvantitatív PCR és gél-elektroforézis

A trofoblasztsejtekből nyert RNS-t használva c-DNS könyvtárat készítettünk minden mintánál. A cDNS szintéziséhez TaqMan reverz transzkripciós reagenseket használtunk (Roche Molecular Systems, Alameda, CA, USA). Mintánként 50 µl elegyet készítettünk 4 µl RNS és 46 µl TaqMan oldat felhasználásával (5 µl TaqMan RT Buffer, 1 µl 20 U/µl RNáz inhibítor, 11 µl 25mM MgCl2, 10 µl 10mM dNTP, 2,5 µl 50µM random hexamer és 1,25 µl 50 U/µl reverz transzkriptáz 15,25 µl vízben oldva). A cDNS könyvtár szintéziséhez a mintákat 10 percig 25 oC-on, 30 percig 48 oC-on majd 5 percig 95 oC-on inkubáltuk. Az OPN mRNS expressziójának kvantitatív méréséhez real-time PCR-t alkalmaztunk. Mintánként 25 µl PCR oldatot készítettünk 4 µl cDNS és 21 µl SYBR Green elegy felhasználásával (2,5 µl 10x SYBR Green PCR Buffer, 3 µl 25mM MgCl2, 2 µl 12,5mM dNTP-dUTP mix, 0,125 µl 5 U/µl AmpliTaq Gold (PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), 12,975 µl víz és 0,2 – 0,2 µl OPN-specifikus primer-pár). A negatív kontroll vizet tartalmazott c-DNS helyett. Paralel vizsgálatokat végeztünk a GAPDH (glyceraldehyd-3-phosphate dehydrogenáz) gén primer-párjának alkalmazásával a forrásanyag mennyiségi különbségeinek normalizálása érdekében. Az RT-PCR lépései 10 perc denaturáció 95 oC-on, ezt követően 40 PCR ciklus (15 másodperc denaturáció 95 oC-on, 30 másodperc primer kötődés 60 oC-on és 45

14

másodperc extenzió 72 oC-on) voltak. A PCR produktumokat GeneAmp 5700 Sequence Detector Rendszerrel detektáltuk (PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). A SYBR Green I indikátor változásainak kvantitatív mérésére GeneAmp 5700 SDS v1.3 szoftvert használtunk. A PCR reakció specifitásának ellenőrzésére a PCR produktumokkal 1 % agaróz gélen elektroforézist végeztünk.

Immunhisztokémia

Az immunfestéshez monoklonális anti-humán osteopontin IgG antitestet használtunk, melyet egérből nyertek az emberi OPN-nek egy szintetikus polypeptid részletével végzett immunizálás után. Az antitest nincs általános forgalomban, kérésünkre egy kutatópartner laboratóriumban állították elő kifejezetten erre a tanulmányra (Immuno-Biological Laboratories Co., Japán). A friss fagyasztott szövetekből 7 μm vastagságú metszeteket készítettünk Leica CM3050S kriosztát segítségével. A metszeteket 70 %-os etanolban fixáltuk, majd előbb TBS pufferben (10 mM Tris-HCl pH 7,5 és 150 mM NaCl), majd 0.3% H2O2–t tartalmazó metanolban áztattuk 30 percig az endogén peroxidáz semlegesítése érdekében. Ezt követően a metszeteket 2x10 percig TBS-ben mostuk, és a további lépésekhez a párolgás megelőzése miatt nagy páratartalmú, zárt kamrába helyeztük. A tárgylemezen lévő mintákat 20 percig 2% normál blokkoló ló szérummal, majd egy órán keresztül 2 μg/ml anti-humán osteopontin antitesttel inkubáltuk. 2x5 perc TBS mosás után a metszeteket 30 percig reagáltattuk a másodlagos antitesttel (lóból nyert anti-egér antitest). Ismételt mosás után a mintákat 30 percig inkubáltuk ABC reagenssel (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA), 2x5 percig mostuk TBS-ben, majd 5 percig inkubáltuk diaminobenzidin (DAB) oldatban (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA). A metszeteket ezt követően 10 percig mostuk vízben, megfestettük hematoxylinnel, emelkedő koncentrációjú alkoholban dehidráltuk, xylénnel tisztítottuk, majd hagytuk megszáradni a tárgylemezek lefedése előtt.

15

Negatív kontrollként paralel festést végeztünk minden mintánál ugyanazon szövet felhasználásával azzal a különbséggel, hogy az anti-OPN antitest helyett a metszeteket normál blokkoló ló szérummal kezeltük [2. ábra]. A festés értékelésénél a minták pozitivitását egy 0-tól 3-ig terjedő skálán osztályoztuk a festődés intenzitásától függően.

Statisztikai elemzés Az adatok statisztikai feldolgozása Student féle kétmintás T próbával, KruskalWallis teszttel és Mann-Whitney teszttel történt. A különbségeket szignifikánsnak definiáltuk p < 0,05 értéknél. A statisztikai elemzések kivitelezéséhez az SPSS 10.0 és a Microsoft Excel 97 szoftvereket használtuk.

16

2. ÁBRA Az OPN fehérje kimutatása immunhisztokémiai módszerrel A.

B.

OPN negatív metszetek

Az OPN pozitivitást a trofoblasztsejtek barna színű festődése jelzi (nyilak)

17

2.2.2.2. EREDMÉNYEK Az OPN mRNS kifejeződésbeli különbségének meghatározására a normális illetve a molás trofoblasztszöveteknél kvantitatív RT-PCR-t alkalmaztunk. A reakciót minden mintánál GAPDH kontroll mellett végeztük a normalizáció érdekében. Minden szövetminta pozitívnak bizonyult OPN-re. A kapott OPN és GAPDH értékek különbségét véve alapul (ΔCT), az eredményeket relatívan értékeltük a legalacsonyabb értékhez viszonyítva (ΔΔCT) logaritmikus átalakítás után (2ΔΔCT). Az átlagos 2ΔΔCT érték 690 volt normális trofoblaszt esetében (83-tól 1771-ig), 66 komplett molában (1-212) és 328 parciális molában (315-340). A parciális molából származó minták alacsony száma miatt statisztikai szignifikanciát a normális lepény és az összes molaterhesség

összehasonlításával

számoltunk.

Az

összes

mola

hydatidosára

vonatkoztatva (komplett és parciális mola is) az átlagos 2ΔΔCT érték 101 volt (1-340). Az adatok az OPN mRNS szignifikánsan csökkent expresszióját mutatják molában (p=0.001) [3. ábra, 1. táblázat]. Az amplifikált DNS gélelektroforézise szintén igazolta az OPN gyengébb kifejeződését molában.

18

3. ÁBRA A kvantitatív RT-PCR az OPN szignifikánsan gyengébb kifejeződését mutatja mola terhesség mellett. Az adatokat az 1. táblázat foglalja össze. NP = normális placenta; PM = parciális mola; KM = komplett mola

RT-PCR 2000

1000

2

ΔΔCT

1500

500

0 NP

PM

KM

1. TÁBLÁZAT RT-PCR: minta

esetszám

NP

9

KM

13

PM

2

2ΔΔCT érték

95 % konfidencia

Szórás

szignifikancia P

átlag

intervallum

(+-)

értéke

691

294 - 1087

607

101

44 - 158

113

19

0,001

Az OPN fehérje kifejeződésbeli különbségének igazolására a normális illetve a mola terhességből származó trofoblasztszöveteknél immunhisztokémiát alkalmaztunk eredményeink megerősítése céljából. Értékeléskor a festődés intenzitása alapján felállított skála szerint pontoztuk az OPN pozitivitást (0-1-2-3). A 9 normális placentaszövet közül 8 erőteljes festődést mutatott (a skálán 3-as érték), míg a molás esetek többségében a pozitivitás gyenge vagy mérsékelt OPN kifejeződést jelzett (0, 1 illetve 2 érték). A 13 komplett mola mellett

2

esetben

az

immunfestés

negatívnak

bizonyult

OPN-ra,

ez

az

immunhisztokémiai vizsgálat gyengébb szenzitivitásával magyarázható a quantitativ RT-PCR-re szemben. A két részleges mola 2-es illetve 3-as erősségű festődést mutatott. A különbség a normális méhlepények és az összes mola terhességből származó trofoblaszt OPN festődése között statisztikailag szignifikáns volt (p < 0.001) [4. ábra].

4. ÁBRA Immunfestéssel igazoltuk az OPN határozottan gyengébb kifejeződését mola terhességben. KM = komplett mola; PM = parciális mola; NP = normális placenta

20

2.2.2.3. ÉRTÉKELÉS A molaterhesség és a normális méhlepény OPN expressziójának különbségét vizsgálva előbb m-RNS szinten (lézervezérelt mikrodisszekció, RNS extrakció, realtime PCR és gél-elektroforézis alkalmazásával) igazoltuk az OPN m-RNS szignifikánsan gyengébb kifejeződését a molaterhességből származó szöveteken. Fehérjeszintű

vizsgálatokkal

(immunhisztokémiát

alkalmazva)

az

eredményt

megerősítettük, a kutatások itt is az OPN szignifikánsan gyengébb jelenlétét mutatták mola hydatidosában - különösen komplett molában - hasonló terhességi korból származó normális trofoblaszthoz viszonyítva. Ha az irodalmi adatokat elemezzük, az eredmény meglepő, hiszen az osteopontin szerepe számos rosszindulatú daganat esetében már tisztázott. E tumoroknál azonban az OPN kifejeződése erősebb volt az egészséges szövetekben tapasztaltaknál [17, 25-32]. Az indirekt jelenség oka nem egyértelműen tisztázott, de a különbség határozottsága felhívja a figyelmet az OPN gyengébb kifejeződésének fontosságára a trofoblasztbetegségek patogenezisében. Mi lehet az oka annak, hogy – eltérően a többi daganattól, ahol a tumorgenezisben az OPN erősebb kifejeződésének tulajdonítanak szerepet – molaterhességben az osteopontin jelenléte alacsonyabb a normális méhlepényhez viszonyítva? Korábban már leírták a normális humán placenta OPN expresszióját [24]. Egészséges terhességben az OPN kifejeződése szigorúan szabályozott, hormonális befolyásolás alatt álló folyamat. A progeszteron mint fő regulátor faktor emeli az OPN expresszióját a normális méhlepényben [23, 35]. Ismert, hogy mola hydatidosában a vér progeszteronszintje alacsonyabb [36-38], és hogy a lepényben a progeszteronreceptorok kisebb számban vannak jelen, mint az egészséges terhességeknél [39, 40]. Így az OPN csökkent kifejeződésének egyik oka lehet GTB-ben a trofoblasztszövetek csökkent érzékenysége az amúgy is alacsonyabb szérumkoncentrációjú progeszteronnal szemben. Az extracelluláris mátrixban kialakuló változások komplett molában szerepet játszhatnak a perzisztens trofoblaszttumorok kialakulásában [41, 42]. Normális terhességben a trofoblasztsejtek betörése az endometriumba az implantáció és placentáció során olyan molekuláris mechanizmusokat igényel, melyek hasonlóak a

21

malignus betegségek inváziójához. A különbség az, hogy a rosszindulatú daganatoknál az invázió kontrollálatlanná válik, míg terhességnél ez az élettani folyamat végső soron a terhesség megtapadását eredményezi. Az egészséges lepényszövetben tehát ezek a változások igen szigorúan szabályozottak. Számos tényező, így hormonális faktorok, a genomiális imprinting, a protoonkogének, a tumor szupresszor gének, bizonyos növekedési faktorok, onkoproteinek és a matrix-proteázok rendellenes működése szerepet játszhatnak a trofoblasztproliferáció, a sejtterjedés, a sejt-sejt illetve a sejtmátrix interakciók normálistól eltérő megnyilvánulásában [36-41, 43-45]. Az extracelluláris mátrixban jelen lévő fehérjék működésének változásai kihatással vannak egymásra, és az élettani beágyazódást biztosító összetett szabályozó mechanizmusok felborulásával

terhességi

trofoblasztbetegségek

kialakulásához

vezethetnek.

Munkacsoportunk korábbi kutatásai során az extracelluláris mátrix fehérjéit tanulmányozta patológiás és normális terhességekben. A vizsgált fehérjék közül az egyik a mátrix metalloproteináz-2 (MMP-2) volt, melyről igazoltuk, hogy kifejeződése szignifikánsan erősebb komplett molában a normális placentához viszonyítva [46]. Az MMP-2 és egyéb mátrix metalloproteinázok emelkedett aktivitása komplett molában felelős lehet a lokális invazív képességért az extracelluláris mátrix fehérjéinek erőteljes bontása útján. Tekintettel arra, hogy az MMP-2 és az OPN – mely szintén az extracelluláris mátrix fehérjéje – a sejtfelszínen ugyanazon αVβ3 integrin receptorhoz kötődnek, lehetséges, hogy az MMP-2 kompetitíven szabályozza az OPN aktivitást a közös receptorért történő versengésen keresztül [21, 47]. Normális terhességben a trofoblasztsejtek növekedése és inváziója pontos szabályozás alatt áll. Az élettani beágyazódást biztosító komplex mechanizmusok egysége

nélkülözhetetlen

az

egészséges

terhesség

kialakulásához.

Gesztációs

trofoblasztbetegségekben ezek az összetett folyamatok sérülnek, megváltoznak. Egyelőre nem tisztázott, hogy az osteopontin milyen módon vesz részt az implantáció szabályozásában, de extracelluláris proteinként jelen van az egészséges méhlepényben és a mola terhességek trofoblasztjában egyaránt. A jelen tanulmányban is igazolt kifejeződésbeli különbség arra utal, hogy az OPN csökkent expressziója valamilyen módon kapcsolódik a gesztációs trofoblasztbetegségek kialakulásához vezető biokémiai folyamatokhoz.

22

Természetesen további vizsgálatok szükségesek ahhoz, hogy meghatározzuk az OPN pontos szerepét a GTB patogenezisében. Érdemes lenne kutatásokat végezni a szövődménymentes mola hydatidosa és a perzisztens trofoblasztbetegséggé alakuló mola terhességek közötti OPN expressziós különbségek irányában. A későbbiekben fontos lehet choriocarcinomás esetek tanulmányozása is, így a bővebb ismeretek birtokában közelebb kerülhetünk a gesztációs trofoblasztbetegségek molekuláris hátterének megismeréséhez

2.2.3. FEHÉRJEPROFIL A molekuláris laboratóriumi technikák fejlődése egyre bővülő lehetőségeket biztosít a kutató orvos számára. Mindössze néhány évvel ezelőtt jelentek meg a különböző protein-chip rendszerek a fehérjeanalízis metodikáinak palettáján, melyek igen kis mennyiségű biológiai mintából képesek meghatározott kötődőképességű polypeptidek jelenlétének kimutatására. Ilyen új technika a SELDI-MS (surface enhanced laser desorption/ionization mass spectrometry), mely alkalmas biomarkerek gyors és egyszerű meghatározására és különböző sejtpopulációk fehérje-expressziós profiljának feltérképezésére. Az alkalmazott fehérjechip komplex biológiai mintákból meghatározott fehérjék izolálását teszi lehetővé specifikus fehérjekötő képessége révén [48, 49]. A metodika elméleti lényege röviden a következő: a vizsgált anyagot felvisszük a chip felszínére, amely megköt bizonyos specifitású polipeptideket (ez a chiptől függ, jelen tanulmányban olyan chipet használtunk, mely a fémkötő képességgel rendelkező fehérjéket köti meg). A nem kötött fehérjéket lemossuk, és a chipet "leolvastatjuk" lézerrel, az erre a célra szolgáló készülékkel és szoftverrel. Végeredményül egy olyan grafikont kapunk, melynek az X tengelye a molekulasúly, az Y érték pedig az adott molekulasúlyhoz tartozó fehérjeintenzitás. Így a grafikon bizonyos molekulasúlyoknál csúcsokkal jelzi, ha a chip polipeptidet kötött meg. A SELDI-MS az utóbbi években hatásosnak bizonyult számos betegség szöveteinek,

sejtjeinek

fehérje-expressziós

elemzésében,

így

új

biomarkerek

felfedezésében petefészekráknál [50, 51], hasnyálmirigy adenocarcinománál [52] és prosztataráknál [53]. Mivel a SELDI-MS technika igen kis mennyiségű biológiai

23

mintánál is alkalmazható, ezért ideális – a korábbi fejezetben már leírt, és alkalmazott – lézervezérelt mikrodisszekcióval (LCM, Laser Capture Microdissection) izolált sejtek fehérjeprofiljának elemzésére [33, 34]. Az Országos Gyógyintézeti Központ Szülészeti és Nőgyógyászati Osztályának és a bostoni Harvard Egyetem Nőgyógyászati Onkológiai Laboratóriumának kollaborációjában – az alább ismertetett munkánk során – a normális méhlepény és a komplett mola hydatidosa közötti potenciális fehérje-expressziós különbségeket vizsgáltuk SELDI-MS és LCM kombinált alkalmazásával. E módszerrel a gesztációs trofoblasztbetegségek patogenezisének érthetőbbé válása mellett lehetőség nyílhat olyan új fehérje biomarkerek izolálására, melyek az általánosan használt szérum β-hCG szint ellenőrzések kiegészítőjeként hasznosak lehetnek a betegség diagnosztikájában és nyomonkövetésében egyaránt.

2.2.3.1. BETEGANYAG ÉS MÓDSZER

Felhasznált szövetek Az eljárás során friss fagyasztott szöveteket használtunk fel. Kilenc mintát az 5. és a 14. terhességi hét között végzett abrasio során nyertünk komplett mola terhességekből (átlag: 10 hét). A kontrollként használt tíz normális méhlepény hasonló terhességi korú művi abortuszokból származott a 9. és a 14. gesztációs hét között (átlag: 10,8 hét). Az emberi szövetek a Human Subjects Committee of the Brigham and Women’s Hospital, (Boston, MA, USA) protokolljának szabályai szerint kerültek feldolgozásra.

Lézervezérelt mikrodisszekció (Laser Captured Microdissection – LCM) A lézervezérelt mikrodisszekció részletes metodikáját a korábbi fejezetben már ismertettem, képekkel illusztráltam. A technika alkalmazása itt annyiban tért el, hogy mintánként mindössze 4000 célzott lövést alkalmaztunk 1,8 ms expozíciós idő és 95 mW teljesítmény beállításokkal. Ennek jelentősége abban áll, hogy a proteolízis

24

megelőzése érdekében az egy metszetre eső mikrodisszekciós idő minden esetben 30 percnél kevesebb ideig kellett, hogy tartson. A SELDI-MS rendkívüli szenzitivitása, a minimális mintákon történő alkalmazhatósága mindezt lehetővé tette. Az izolált sejteket 10 µl 20 mM Hepes -t és 0.1 % Nonidet P-40 -et tartalmazó 0,5 ml lízis pufferben oldottuk, majd -80 oC -on tároltuk. SELDI-MS (Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry) fehérjechip rendszer A SELDI-MS analízishez IMAC (immobilized metal affinity capture) fehérjechip rendszert használtunk (Ciphergen Biosystems, Inc., Fremont, CA, USA) [5. ábra]. Az alkalmazott IMAC3 fehérjechip felszínén immobilizált nikkel nagy affinitással köti azokat a polipeptideket, melyek aktív hisztidint, triptofánt vagy ciszteint tartalmaznak.

5. ÁBRA A 8 aktív fehérjekötő hellyel rendelkező IMAC3 fehérjechip fényképe

25

Az IMAC3 chip aktív kötőhelyeit 10 µl 50 mM-os CuSO4 oldattal aktiváltuk 15 percig, majd vízzel kétszer öblítést végeztünk. Ezt követően a chipet 5 percig inkubáltuk 15 µl pufferben (0,1 M 7,2 pH-jú nátrium-foszfát, 0,5 M NaCl és 10 mM imidazol), mely a fehérjék megkötésére ideális feltételeket teremti meg. Száradás után a mikrodisszekcióval gyűjtött és lízis pufferben tárolt mintákból 3-3 µl -t vittünk fel az aktív kötőhelyekre, majd hagytuk megszáradni. Öblítést követően a chipet kétszer kezeltük 50 % acetonitrilben és 0,5 % trifluoroacetilsavban oldott szinapinsavban. A chipek leolvasására és elemzésére Ciphergen SELDI Protein Biology rendszert és szoftvert használtunk (Ciphergen Biosystems, Inc., Fremont, CA, USA). Az adatok leolvasása a következő beállítások mellett történt: lézer intenzitás 250, detektor érzékenység 10, automatikus csúcsérzékelés 3 és 50 kDa molekulasúly között. Statisztikai elemzés A fehérjeprofil spektrumain kapott csúcsok különbségeinek statisztikai feldolgozása Student féle kétmintás T próbával történt, Microsoft Excel 97 szoftver használatával. A különbséget statisztikailag szignifikánsnak tekintettük p < 0,05 értéknél.

2.2.3.2. EREDMÉNYEK

A

normális

lepényből

és

a

komplett

mola

hydatidosából

származó

trofoblasztsejtek SELDI-MS vizsgálatával négy fémkötő képességgel rendelkező polipeptidet izoláltunk 2,8 és 20 kDa molekulasúly között [6. ábra]. A fehérjemasszák spektrumait az egyes csúcsok magassága, azaz intenzitásbeli különbsége alapján elemeztük. Az izolált polipeptidek becsült molekulasúlya 11,3 kDa (P1), 13,8 kDa (P2), 14,0 kDa (P3) illetve 15,2 kDa (P4) volt. A P1, P2 és P3 polipeptidnek megfelelő csúcsok nagy intenzitást jeleztek normális méhlepényben, míg komplett molában alacsony kifejeződésre utaltak. Az összes normális placentából származó mintánál kimutatható volt a P1, a P2 és a P3 polipeptid, míg komplett molában e markerek mindössze 89 %, 56 % illetve 67 % -ban voltak pozitívak. A P4 marker a normális

26

trofoblasztsejteknél 70 %-ban, komplett mola mellett 67 %-ban volt kimutatható. Az átlagos csúcs-intenzitásokat és konfidencia intervallumokat táblázatban foglaltuk össze [2. táblázat]. Az adatok statisztikai elemzése a P1, P2 és P3 proteinek szignifikánsan erősebb kifejeződését mutatta egészséges méhlepényben a komplett molával szemben (p<0.001, p<0,03 és p<0,01). A P4 marker szintjében nem találtunk szignifikáns különbséget a normális méhlepényekből és a komplett molából származó trofoblaszt között.

6. ÁBRA Reprezentatív példa a komplett mola és a normális méhlepény fehérjespektrumának különbségeire SELDI-MS technika és IMAC3 fehérjechip alkalmazásával. P1, P2, P3 és P4 jelzik a kapott fehérjecsúcsokat. A P1, a P2 és a P3 polipeptideknek megfelelő csúcsok intenzitása nagyobb normális méhlepényben. A P4 fehérje kifejeződése példánkban komplett molában erősebb, egyébként nem mutatott szignifikáns eltérést.

27

2. TÁBLÁZAT A normális méhlepényből és a komplett molából származó trofoblasztsejtek fehérjeprofiljának összehasonlítása

esetszám: FEHÉRJE

molekulasúly (kDa):

P1

11,3

95 % -os konfidencia intervallum pozitivitás aránya (% ) Átlag intenzitás

P2

95 % -os konfidencia intervallum pozitivitás aránya (% ) Átlag intenzitás

P3 P4

14,0 15,2

Komplett mola

10

9 P érték

Átlag intenzitás

13,8

Normál méhlepény

13,1

2,6

8.9 - 17.3

1.1 - 4.1

100

89

10,9

2

4.2 - 17.6

0.7 - 3.3

100

56

10,6

2

5.5 - 15.7

0.7 - 3.3

pozitivitás aránya (% )

100

67

Átlag intenzitás

4,6

9,2

2 - 7.2

1.9 - 16.5

70

67

95 % -os konfidencia intervallum

95 % -os konfidencia intervallum pozitivitás aránya (% )

0,0004

0,026

0,007

0,24

2.2.3.3. ÉRTÉKELÉS

A laboratóriumi kutatásokban egyre inkább tért hódító fehérjeprofil elemző módszerek új távlatokat nyitottak meg a tumor biomarkerek meghatározásában, s ezáltal olyan fehérjék izolálásában, melyek a klinikumban segítséget nyújthatnak adott betegségek korai felismerésében és progressziójának megítélésében. Jelen munkánkkal igazoltuk, hogy a lézervezérelt mikrodisszekció és a SELDI-MS fehérjechip technológia kombinált használata sikeresen alkalmazható a komplett mola hydatidosa és a normális méhlepény közötti fehérje-expressziós különbségek vizsgálatára. Munkánk során kimutattunk három fehérjét, melyek kifejeződése komplett molában szignifikánsan gyengébb, mint a hasonló terhességi korból származó normális placentában. A SELDIMS technika segítségével a fehérjeprofil elemzés területén a lehetőségek tárháza végtelen, ezt biztosítja a protein-chipek abszorpciós képesség szerinti sokfélesége. Más

28

kötődőképességgel rendelkező chipek alkalmazásával a későbbiekben izolálhatunk fehérjéket, melyek erősebben fejeződnek ki molában a normális méhlepényhez viszonyítva,

s

e

fehérjék

potenciálisan

alkalmazhatók

lesznek

a

betegség

monitorizálásában. Természetesen a proteinchip-rendszerek használata csak egy kezdeti lépés újabb biomarkerek felfedezésére. A SELDI technika ugyan alkalmas különböző biológiai minták közti proteinprofil-eltérések kimutatására, de mindenképpen szükséges a későbbiekben az adott molekulasúlyú polypeptidek karakterizálása, identifikálása. A Harvard Egyetem Nőgyógyászati Onkológiai Laboratóriumában korábban már sikeresen alkalmazták a SELDI-MS módszert a petefészekrák újabb biomarkereit kutatva. Fehérjechip technológiával több fehérjecsúcsot sikerült kimutatni ovárium daganatok mellett. Ezek közül az egyik további karakterizálása során izolálták a haptoglobin-α1

fehérjét,

mely

hasznos

biomarkerré

válhat

a

petefészekrák

felismerésében és a betegség progressziójának követésében, növelve a széles körben használt CA-125 tumormarker specifitását [54]. A gesztációs trofoblasztbetegségek patogenezisének pontos megértése céljából régóta folynak kutatások [55-61]. A fehérje-expressziós sajátosságok további elemzésével valószínűleg közelebb juthatunk az etiológia és a patogenezis tisztázásához. Bár a komplett molában és a normális méhlepényben talált fehérjecsúcsok további karakterizálása fontos és szükséges, jelenlegi munkánk jól demonstrálja, hogy az LCM és a SELDI-MS technikák kombinált alkalmazása hatásos módszer a gesztációs trofoblasztbetegségek

normálistól

eltérő

fehérje-expressziós

tulajdonságainak

igazolására. Az eljárás egyre terjedő alkalmazásával remélhetőleg lehetőség nyílik a gesztációs trofoblasztbetegségek molekuláris hátterének jobb megértésére, mely által a betegség diagnosztikája, kezelése és nyomonkövetése hatásosabbá tehető.

29

2.3. ÚJABB SZEMPONTOK A MOLATERHESSÉG NYOMONKÖVETÉSÉBEN A gesztációs trofoblasztbetegségek egyik legnagyobb veszélye a gyógykezelést követően, tehát a beteg tünetmentességének elérése után hetekkel vagy hónapokkal a betegség kiújulása, relapszusa. Még az eredetileg jóindulatú formákban is (részleges vagy komplett molaterhesség) reális annak az esélye, hogy átmeneti, panaszmentes stádium után a tünetek újból fellángolnak, sőt a betegség nemegyszer rosszabb prognózisú, malignusabb formában jelentkezik. A GTB csoportjába tartozó betegségek egy része ugyanis a malignus betegségekre jellemző tulajdonságokkal rendelkezik; a méhfalba történő betöréssel helyi invazív jelleget ölthet, illetve távoli áttétek képzésével a rosszindulatú daganatos betegségekre jellemző progressziót mutathat. Igaz, ezek az állapotok a malignus betegségek egy speciális csoportját alkotják, hiszen az egyetlen olyan daganattípusról van szó, mely nem a gazdaszervezet saját sejtjeiből indul ki. Emellett a malignus trofoblasztbetegségek kemoterápiára való rendkívüli érzékenysége folytán az egyik legjobban gyógyítható rosszindulatú elváltozásról van szó. Alapvető fontosságú tehát az éles határ meghúzása a jó és rosszindulatú trofoblasztbetegségek között, tekintettel arra, hogy a GTB fent felsorolt különböző típusai a kórlefolyás során egymásba

átalakulhatnak,

progressziót

mutathatnak.

Invazív

mola,

vagy

a

choriocarcinoma éppúgy kialakulhat üszögterhesség szövődményeként, mint primer módon. A jóindulatú formáknál (a teljes és részleges molaterhességnél) a méh műtéti kiürítését követően az esetek 5-23 %-ában alakul ki a betegség relapszusa, mely felismerés nélkül, megkésett utókezelés esetén nemegyszer távoli áttétek kialakulását, rosszabb esetben az agresszív terápia ellenére a beteg halálát okozza. Ezeket az eseteket nevezzük

perzisztens

trofoblasztbetegségeknek

(PTB),

ahol

további

terápiás

beavatkozások válnak szükségessé (a méh ismételt műtéti kiürítése, citosztatikus kezelés, szükség esetén radikális műtét) a teljes gyógyulás érdekében. Az időben felismert perzisztens betegségek viszont közel 100 %-ban gyógyíthatóak. Rendkívüli fontosságú tehát annak eldöntése, hogy egy adott molaterhesség átalakul-e magas rizikójú perzisztens betegséggé vagy sem. A gesztációs trofoblasztbetegségek menedzselésének így az egyik legalapvetőbb pontja a pontos szövettani elemzés, a kiindulási szérum ß-hCG szint valamint az anamnézis mellett a primer kezelést követő gondos utánkövetés a hCG titer rendszeres

30

ellenőrzésével annak érdekében, hogy a perzisztens esetek időben felismerésre kerüljenek, és adekvát terápiával megfelelő ellátást kapjanak. [10-14, 62-67]

2.3.1. A NYOMONKÖVETÉS JELENLEGI GYAKORLATA A

gesztációs

trofoblasztbetegségek

minden

formája

hCG-t

(humán

choriogonadotropin) termel, mely laboratóriumi eszközökkel mind a szérumban, mind a vizeletben kimutatható és quantitativen mérhető. A szérum β-hCG szintje a betegség lefolyásának rendkívül érzékeny indikátora. Alkalmas az alkalmazott kezelések hatásosságának értékelésére csakúgy, mint az esetleges relapszus felismerésére, PTB kialakulásának igazolására. Bár elméletileg a korábbi fejezetekben tárgyalt biomarkerek a progresszió pontosabb előrejelzésével a jövőben kiegészíthetik a jelenlegi, hCG alapú monitorizálást, a szérum β-hCG szint önmagában is kiválóan alkalmas a trofoblasztbetegségek folyamatának követésére [7-8. ábra]. A világ legtöbb országában, így hazánkban is jelenleg a következő nyomonkövetési protokollt alkalmazzák molaterhesség kiürítését követően: Komplett mola hydatidosa szövettani diagnózisa mellett hetente β-hCG szint ellenőrzés javasolt 3 egymást követő negatív titer eléréséig, ezután havi ellenőrzések következnek 6 egymást követő negatív hónapig, ettől kezdve a beteg gyógyultnak tekinthető. Részleges mola hydatidosa esetén, amennyiben a szérum β-hCG szint a mola evakuációt követően 7 héten belül negatívvá válik, a havi ellenőrzéseket elegendő 3 egymást követő negatív hónapig megkövetelni, a többi esetben a komplett molára is vonatkozó követési szabályok érvényesek. Ha egy beteg néhány alkalommal nem jelentkezik a szükséges kontrollokon, telefonon és postán keresztül is megkísérlik elérni, ismételten felhívni a figyelmét a pontos β-hCG követés elmulasztásának veszélyeire. Ezzel egyidőben az elsődleges kezelőorvost is értesítik.

31

7. ÁBRA

„Szövődménymentes molaterhességnél” a méh műtéti kiürítése után

a szérum ß-hCG szint folyamatos csökkenést mutat az ellenőrzések során.

8. ÁBRA

A hCG-követés során a stagnálás vagy az ismételt emelkedés nagy

kockázatú perzisztens trofoblasztbetegségre utal.

32

2.3.2. STATISZTIKAI ADATELEMZÉS 2.3.2.1. CÉLKITŰZÉS A jelenleg alkalmazott nyomonkövetési protokollok a hCG titer negatívvá válása után hónapokig megkívánják a rendszeres kontrollt, és a teljes gyógyulás csak több havi negatív

eredmény

után

trofoblasztbetegségben

mondható

szenvedőket

ki.

Vajon

nyomonkövetni

meddig ahhoz,

kell hogy

a

gesztációs biztonsággal

felismerjük a PTB kialakulását? A kérdés megválaszolása azért fontos, mert az idevonatkozó irodalmi adatok szerint a betegek rosszul tolerálják a hosszú, gyakran több mint fél évig tartó rendszeres ellenőrzéseket. Azon betegek aránya, akik nem teljesítik a protokoll szerinti hCG nyomonkövetési programot, 19 % és 81 % között mozog a különböző centrumokban. A Dél-Kaliforniai Egyetem jelentése szerint a betegek 19 %a idő előtt abbahagyta a javasolt nyomonkövetési programot [68]. Ez az arány 27 % Kóreában [69], illetve 81 % egy chicagói központ jelentése alapján [70]. A bostoni Harvard Egyetem trofoblaszt centruma (NETDC – New England Trophoblast Disease Center) és a budapesti Országos Gyógyintézeti Központ szülészetének kollaborációs munkájával felmérést készítettünk a GTB-ben szenvedő betegek hCG követéséről. Célunk az volt, hogy retrospektíven elemezzük a betegek nyomonkövetésben való részvételi arányát, és meghatározzuk azt a minimális nyomonkövetési időtartamot, amely feltétlenül szükséges a mola terhességek után kialakuló perzisztens betegségek kiszűréséhez. 2.3.2.2. BETEGANYAG ÉS MÓDSZER

Összesen

550

gesztációs

trofoblasztbetegségben

szenvedő

beteg

hCG

követésének adatait elemeztük. Az adatok nagyobbik részét a New England Trofoblast Disease Center beteganyagának felhasználásával gyűjtöttük össze, véletlenszerűen kiválasztott 400 fő adatainak elemzésével. Az adatbázis az összes regisztrált GTB-ben szenvedő beteg adatait tartalmazza 1965 júniusától napjainkig. Itt megtalálható a betegek általános orvosi és szülészeti kórelőzménye, szociális anamnézise, az adott

33

GTB lefolyásának részletei, a kezelés, a stádiumbeosztás és a szövettani diagnózis csakúgy, mint a hCG nyomonkövetés adatai. Az adatgyűjtés másik része hazai anyagból származik, az Országos Gyógyintézeti Központ Szülészeti és Nőgyógyászati Osztályának

1998

és

2001

közötti

betegnyilvántartásából

választottunk

ki

randomszerűen 150 molás beteget a hCG nyomonkövetés retrospektív elemzése céljából. Elemeztük a perzisztens trofoblasztbetegségek kialakulásának gyakoriságát, a pontos szövettani diagnózis megoszlását, a nyomonkövetésben való részvételi arányt, a kiindulási hCG szinteket illetve a negatív értékek eléréséig eltelt hetek számát. A betegek életkora 13 és 54 év között volt 27,3 éves átlagéletkorral. A szövettani diagnózis 387 esetben (70,4 %) komplett mola hydatidosa, 163 betegnél (29,6 %) részleges mola hydatidosa volt. Az adatok statisztikai elemzéséhez Student féle kétmintás t-próbát és Pearson tesztet alkalmaztunk. A különbségeket p<0,05 értéknél tekintettük statisztikailag szignifikánsnak. Az elemzésekhez Microsoft Excel 2002 és SPSS (10.0 verzió) szoftvereket használtunk.

2.3.2.3. EREDMÉNYEK Az 550 random kiválasztott eset közül 440 (80 %) mutatott spontán regressziót a molaterhesség kiürítése után a szérum beta-hCG értékek – negatívig történő – folyamatos

csökkenésével.

91

esetben

(16,5

%)

alakult

ki

perzisztens

trofoblasztbetegség a hCG szintek stagnálásával vagy ismételt emelkedésével, további kemoterápiás vagy műtétes kezelést téve szükségessé. 19 beteg (3,5 %) követését elvesztettünk, még mielőtt a szérum β-hCG szint elérte volna a negatív értéket. Komplett mola mellett (n=387) 83 esetben (21,4 %) alakult ki PTB. Az átlagos hCG szint az uterus kiürítése előtt 255356 IU/l volt. Ez az érték 197421 IU/l azoknál a betegeknél, akik kezelést követően spontán gyógyultak, ill. 431277 IU/l azoknál, ahol később PTB alakult ki (p=0,001). A spontán remissziót mutató esetekben átlagosan 8,7 hét telt el a szérum β-hCG negatívvá válásáig. Részleges mola mellett (n=163) 8 esetben (4,9 %) alakult ki PTB. Az átlagos hCG szint az uterus kiürítése előtt 86183 IU/l volt. Ez az érték 80023 IU/l azoknál a

34

betegeknél, akik kezelést követően spontán gyógyultak, ill. 248095 IU/l azoknál, ahol később PTB alakult ki (statisztikai szignifikanciát a perzisztenssé váló esetek alacsony száma miatt nem számoltunk). A spontán remissziót mutató esetekben átlagosan 6 hét telt el a szérum β-hCG negatívvá válásáig. A fenti adatok statisztikai elemzése szignifikáns különbséget mutatott komplett és részleges mola hydatidosa között a mola evakuáció előtti szérum β-hCG szintekben (p=0,02) és a perzisztenssé nem váló esetek között a negatív hCG értékek eléréséig eltelt hetek számában (p<0.01) [9-11. ábra]. Ezek az eredmények megfelelnek az irodalomban korábban közölt adatoknak [71-73]. Nem volt azonban szignifikáns különbség a komplett és a részleges mola között a diagnózis felállításakor a terhességi korban (komplett mola mellett átlagosan 12,5 hetes ill. részleges mola mellett 12,8 hetes amenorrhoea). Komplett mola terhességnél 39 %, részleges molánál 26 % volt a primigravidák aránya. Az előzetes mola gyakorisága 3-3 % volt.

9. ÁBRA

A diagnózis felállításakor mért kiindulási szérum β-hCG szint

átlagok komplett mola (KM) és parciális mola (PM) mellett (mértékegység: IU/L)

35

10. ÁBRA

A kiindulási szérum β-hCG szint átlagok alakulása annak

függvényében, hogy a későbbiekben kialakult-e perzisztens trofoblasztbetegség

11. ÁBRA

A perzisztenssé nem váló eseteknél a negatív szérum β-hCG szint

eléréséig eltelt hetek száma komplett mola (KM) és parciális mola (PM) esetén

36

A továbbiakban megpróbáltuk megvizsgálni, hogy szövődménymentes mola mellett (tehát azon betegeknél, ahol műtét után a szérum β-hCG folyamatos csökkenést mutatott a negatív értékek eléréséig) előfordult-e perzisztens betegség kialakulása a negatív β-hCG értékek elérése után. Ezért a további elemzésből kizártuk azokat az eseteket, ahol PTB alakult ki a β-hCG szint negatívvá válása előtt (n=91). A fennmaradó 459 beteg közül mindössze 283 (62 %) teljesítette maradéktalanul a β-hCG nyomonkövetési ajánlatunkat (303 komplett mola és 156 részleges mola). 19 beteg (4 %) eltűnt, mielőtt β-hCG értékük negatívvá vált volna, és 157 beteg (34 %) hagyta abba a rendszeres kontroll ellenőrzéseket idő előtt ugyan, de a negatív értékek elérése után [12-13. ábra]. 13 esetben (2,8 %) a nyomonkövetési protokoll idő előtti felfüggesztésének oka a betegek teherbe esése volt. Ez utóbbi csoportból mindannyian a negatív β-hCG szint elérése után váltak terhessé.

A vizsgált populációban (TEHÁT AZON 440 BETEG KÖZÜL, AKIKNÉL A SZÉRUM ß-HCG ÉRTÉKEK FOLYAMATOS CSÖKKENÉST MUTATTAK A NEGATÍV TITER ELÉRÉSÉIG) egyetlen esetben sem találtunk relapszust a negatív ß-hCG értékek elérése után.

37

12. ÁBRA

A betegek megoszlása a javasolt hCG nyomonkövetés komplettálása

szempontjából

550 molaterhesség (387 teljes mola és 163 részleges mola)

19 eset (3,5 %): a negatív hCG elérése előtt félbeszakított hCG követés

91 eset (16,5 %): a negatív hCG elérése előtt PTB alakult ki

440 eset (80 %): a hCG folyamatos csökkenést mutatott a negatív értékek eléréséig

283 eset: a hCG követést komplettálták

157 eset: a hCG követést nem komplettálták

38

13. ÁBRA

A

perzisztenssé

váló

esetek

kizárása

utáni

nyomonkövetési

statisztika, a javasolt szérum ß-hCG monitorizálás végigvitelének százalékos megoszlása

2.3.3. ÉRTÉKELÉS A gesztációs trofoblasztbetegségek jól ismert szövődménye a méh műtéti kiürítését követően kialakuló relapszus [10-14, 62-67]. Mivel a betegség lezajlásának folyamata rendkívül jól monitorizálható a szérum β-hCG szint ellenőrzésével, a műtét után minden betegnek hosszútávú hCG követést javaslunk annak érdekében, hogy időben felismerjük az esetlegesen kialakuló perzisztens trofoblaszttumort. Sajnos a mindenre kiterjedő felvilágosítás ellenére a betegek jelentős része nem teljesíti maradéktalanul az ajánlott nyomonkövetési programot. Az általunk elemzett populációban a betegek mindössze 62 %-a komplettálta teljes egészében a javasolt szérum β-hCG monitorizálási protokollt. Lebontva az elemzett eseteket, ez az arány a Harvard Egyetem beteganyagát tekintve 63 %, a hazai adatokat vizsgálva pedig 57 % volt.

39

Mindezek alapján úgy tűnik, hogy a betegek rosszul tolerálják a hosszú ideig tartó rendszeres ellenőrzéseket. Ezen az arányon az sem javít, hogy a felvilágosítás kiterjed a nyomonkövetés felfüggesztésének rendkívüli veszélyeire.

Fontos lenne

meghatározni, hogy mi az a minimális követési idő, amellyel a perzisztens trofoblasztbetegségek kialakulása megbízhatóan felismerhető. Egy rövidebb, de nem kevésbé biztonságos monitorizálási programmal a költségkímélésen kívül talán az is elérhető, hogy növekedjen a betegek részvételi aránya a javasolt követési protokoll teljesítésében. Anyagunkban 550 betegből 283 mutatott spontán remissziót a mola terhesség műtéti kiürítését követő negatív szérum β-hCG értékek elérésének időpontjáig. Közülük egyetlen esetben sem alakult ki PTB a későbbiekben. Az adatok azt sugallják, hogy szövődménymentes molaterhesség után (tehát ahol nem jelent meg PTB a hCG titer negatívvá válása előtt) a negatív β-hCG értékek elérését követően perzisztens trofoblasztbetegség kialakulásának igen csekély a valószínűsége. Érdemes lenne elgondolkozni azon, hogy szövődménymentes molaterhesség esetén valóban szükségese a javasolni a követés második fázisát, a havi ellenőrzéseket. Természetesen egy világszerte jól bevált protokoll megváltoztatásához ezek az adatok nem elegendőek, de talán felhívják a figyelmet a további statisztikai adatfeldolgozás fontosságára. Elképzelhető, hogy szövődménymentes mola hydatidosa után kellő biztonsággal elegendő lenne rövidebb nyomonkövetési programot javasolni a betegek számára, egészségük felesleges veszélyeztetése nélkül A negatív hCG szint eléréséig tartó heti utánkövetés a havi ellenőrzések nélkül egyrészt költségkímélést jelentene, mely szempontot egyre inkább Magyarországon is figyelembe kell venni, másfelől talán csökkenthető lenne a rosszul kooperáló betegek aránya azáltal, hogy egy könnyebben átlátható, rövidebb ideig tartó nyomonkövetési rendszert javaslunk számukra a betegség monitorizálására. Mindez természetesen nem vonatkozik a perzisztens esetekre, ahol a titercsökkenés nem mutat spontán remissziót a negatív értékek eléréséig. Náluk indokolt a hosszútávú rendszeres ellenőrzés a teljes gyógyulás kimondásáig. Jelen tanulmány alapján összegzésként elmondhatjuk, hogy az üszögterhesség azon szövődménymentes eseteiben, ahol a nyomonkövetés során a ß-hCG szint folyamatos csökkenést mutat, a negatív értékek eléréséig tartó követés biztonságosnak tűnik. Ezen esetekben mérlegelendő a további kontrollok szükségessége.

40

* * *

A molaterhességek után áttérnék kutatási területem másik fő fejezetére, amely a habituális vetélés témájával foglalkozik, és ismertet egy olyan klinikai protokollt, mely lehetőséget ad a fenti betegségben szenvedő pároknak arra, hogy az egyéb okkal nem magyarázható vetéléseik hátterében keresse az immunológiai eredetet, és pozitív esetben terhesség alatti immunterápiával segítse egészséges gyermek kihordását.

3. HABITUÁLIS VETÉLÉS – IMMUNOLÓGIAI VONATKOZÁSOK Az értekezés második részében a szokványos vetéléssel kapcsolatos újabb diagnosztikai és terápiás lehetőségekről, az ezzel összefüggésben álló kutatási eredményekről, és az általános bevezetés kezdeti stádiumában álló immunterápia klinikai alkalmazásának eredményeiről számolnék be. Az utóbbi évtizedben a klinikai kutatások fénypontjába kerülő reproduktív medicina fejlődése, az infertilis párok növekvő igénye meddőségük eredményes kezelésére megkívánja, hogy a sterilitás mellett a habituális vetélés kivizsgálásával és kezelésével kapcsolatos technikák is kidolgozásra és bevezetésre kerüljenek az e betegségben szenvedők mind szélesebb körében. Ismert, hogy az asszisztált reprodukció folyamatosan bővülő lehetőségei mellett egyre több olyan pár válik alkalmassá gyermekvállalásra, akik korábban sikertelenül próbálkoztak terhességgel. Nem szabad azonban megfeledkeznünk azokról a párokról, ahol a gyermekvállalás gátja nem a meddőség, hanem a teherbeesést követően létrejövő, ismétlődő vagy szokványos vetélés. Társadalmi és népesedéspolitikai szempontból e két betegség igen közel áll egymáshoz, hiszen az érintett pár a gyermekvállalás szándéka ellenére nem tud utódot létrehozni.

41

3.1. A HABITUÁLIS VETÉLÉS DEFINÍCIÓJA, ETIOLÓGIÁJA Habituális vetélésnek nevezzük (recurrens spontán abortusz, RSA), ha egy nőnél három, vagy több vetélés követi egymást, típusosan a terhesség első trimeszterében. A betegség incidenciája fertilis korban lévő nők között 0,5 – 1 % [3, 74]. A kiváltó okok között igen széles skálán nőgyógyászati (anatómiai ill. funkcionális), andrológiai, genetikai, endokrinológiai, belgyógyászati betegségek sorolhatók fel, de okozhat ismétlődő vetélést tünetmentes bakteriális vagy virális fertőzés is. A véralvadási rendszer optimális működése úgyszintén fontos szerepet játszik a terhesség szövődménymentes lefolyásában. A graviditás fiziológiás körülmények között is hypercoagulabilis állapot. Érthető tehát, hogy hematológiai elváltozásoknak, így a veleszületett és szerzett trombofíliáknak is szerepük lehet a terhesség során fellépő szövődmények, így a vetélések kialakulásában. A méhlepény ereiben kialakuló trombózisok károsítják a placenta vérellátását, a méhlepény növekedését, a fetomaternális transzportot. Mindezek mellett a habituális vetélés hátterében igen gyakran nem találjuk meg az alapbetegséget, a vetélések magyarázatát. Az immunológia fejlődésével egyre nő azon betegségek száma, ahol eddig ismeretlen etiológia mellé feltételezett vagy igazolt immunopatológiai háttér társul. Az egyéb okkal nem magyarázható habituális vetélések egy részének hátterében szintén immunológiai ok áll. Az anya – mint idegen szövetet, „transzplantátumot” – kilöki szervezetéből az embriót. A terhesség fiziológiás immunregulációs hatásának elmaradása, vagyis az apa „idegen” antigénjeivel szembeni specifikus immunreakció, valamint autoimmun mechanizmusok egyaránt szerepet játszhatnak ebben a „host-versus-graft” reakcióban, amely végül vetéléshez vezet. A nemzetközi irodalom már régóta közöl sikereket a más okkal nem magyarázható

habituális

vetélők

terhességében

alkalmazott

immunterápiával

kapcsolatban. A különböző közlemények szerint az intravénás immunglobulin használatával az egyéb okkal nem magyarázható RSA betegek kezelése 62-74 %-ban sikeres, egészséges gyermek születését eredményezi [75-79].

42

3.2. A HABITUÁLIS VETÉLŐK IMMUNOLÓGIAI KIVIZSGÁLÁSA ÉS IMMUNTERÁPIÁJA

–

CÉLKITŰZÉSEK

A

RECURRENS

SPONTÁN

VETÉLŐK MULTICENTRIKUS KLINIKAI PROGRAMJÁBAN

A habituális vetélés immunológiai aspektusból történő tanulmányozása tehát új dimenziókat nyit meg a betegség eredményes kezelésében. 2000. augusztusában az Országos Hematológiai és Immunológiai Intézet valamint a Semmelweis Egyetem Egészségtudományi Kar (jelenleg Országos Gyógyintézeti Központ, OGYK) Szülészeti és Nőgyógyászati Osztályának szervezésével multicentrikus klinikai program indult, mely a habituális vetélők immunológiai kivizsgálásának és immunkezelésének koordinálását tűzte ki célul. A program bevezetett egy alaposan kidolgozott protokollt, amely a habituális vetélők kivizsgálására és kezelésére jól áttekinthető ajánlást ad. A protokoll tartalmazza a recurrens spontán vetélés definícióját, kivizsgálásának pontos lépéseit, a más okkal nem magyarázható habituális vetélések immunológiai kivizsgálásának és – pozitív esetben – terápiájának menetét. A klinikai kísérletsorozat lényege az immunterápia alkalmazása olyan kiválasztott beteganyagon, ahol a szokványos vetélés immunopatológiai hátterét előzetesen igazoltuk az egyéb okok gondos kizárása mellett. A betegek ilyen jellegű gondos előszűrése igen fontos, hiszen csak az igazolt immunopatológiai háttér mellett várhatunk eredményt a tervezett terhesség alatti immunterápiától, melynek költségessége miatt sem szerencsés, ha sok esetben feleslegesen és sikertelenül alkalmazzuk. A 2001 óta működő Habituális Vetélők Immunterápiás és Regisztrációs Lista Bizottsága (HABAB Bizottság) szakmai tagjai között már az Országos Egészségbiztosítási Pénztár (OEP) képviselője is részt vesz. Az Egészségügyi Tudományos Tanács (ETT 171/2000; ETT 172/2000) valamint az Egészségügyi Minisztérium engedélye alapján működő klinikai kísérletsorozat céljai között a protokoll széles körű, OEP által általánosan támogatott alkalmazásának elfogadtatása is szerepel.

43

3.3. MÓDSZER Tekintettel arra, hogy a szokványos vetélők immunterápiája igen drága kezelési módszer és egyelőre az OEP által nem általánosan támogatott eljárás, jelenleg a HABAB Bizottság döntése szükséges ahhoz, hogy egy adott beteg bekerüljön a programba, és a társadalombiztosító indokolt esetben biztosítsa számára a terhesség alatti immunkezelést. A Bizottság tagjai között a szülész-nőgyógyászokon és immunológusokon kívül jelen van egy gyógyszerész valamint az OEP és a Human RT gyógyszergyár egy-egy képviselője, kiknek jóváhagyása szükséges ahhoz, hogy a programban regisztrált szokványos vetélők részére a program ideje alatt kedvezményes áron hozzáférhetővé váljon az immunterápiát jelentő immunglobulin.

Ennek

megfelelően szigorú protokoll szerint történik a regisztrált betegek kivizsgálása, kezelése illetve nyomon követése.

3.3.1. ÁLTALÁNOS KIVIZSGÁLÁS Primer habituális vetélésről definíció szerint akkor beszélünk, ha három vagy több, típusosan első trimeszterbeli vetélés követi egymást, és a házaspárnak még nincs élő gyermeke [3]. Szekunder habituális vetélésnek nevezzük, ha a nő már szült gyermeket, és ezt követően alakul ki az ismétlődő vetélés kórképe. Természetesen a programba történő bekerülés további feltétele, hogy a vetélések egyazon partner mellett történtek, hiszen az apai antigének elleni specifikus védekezés csak ebben az esetben értelmezhető. A beteg első kórházi jelentkezésekor az anamnézis felvételét követően az orvos egy protokoll szerinti vizsgálatsorozatot jelöl ki a beteg számára, amellyel feltérképezi és kizárja a habituális vetélés egyéb lehetséges (nem immunológiai) okait: Az anatómiai és funkcionális nőgyógyászati okokat manuális vizsgálattal, kismedencei ultrahanggal, a ciklus 13. napján végzett folliculometriával illetve a reproduktív hormonális státusz vizsgálatával (LH, FSH, ösztradiol, progeszteron és prolaktin szint meghatározása) elemezzük. Az uterus cavumának belső anatómiai megítélése

is

szükséges

HSG

(hystero-salpingographia),

ECHO-HSG

vagy

hysteroscopia alkalmazásával. A férj 5 napos carentiát követő spermatogram lelete a

44

szokványos vetélés andrológiai hátterét szűri ki. Általános belgyógyászati vizsgálattal kizárjuk a súlyos rendszerbetegségeket és egyéb belgyógyászati, infectológiai kórképeket,

az endokrinológiai okokat (vizsgálatok Cushing-kór, pajzsmirigy

betegségek, cukorbetegség irányában, a mellékvese működésének szűrése) valamint a súlyos autoimmun betegségeket (SLE, APS, thyreoiditis, stb…). Az adatlap kitöltéséhez szükséges a fentieken kívül negatív lues szűrés, thrombophilia vizsgálatok valamint genetikai vélemény arról, hogy a habituális vetélés hátterében genetikai ok nem igazolható. Utóbbi genetikai kivizsgálás minden esetben a szülők kariotipizálását jelentette limfocita tenyésztéssel, hogy kizárjuk az anyai vagy apai kiegyensúlyozott transzlokációkból adódó ismétlődő vetéléseket. Az adatlap nagyon jól használható sémát ad a habituális vetélés hátterének feltérképezésére [1. melléklet]. Ha a fenti részletes vizsgálatok nem találnak okot az RSA hátterében, a beteg immunológiai kivizsgálásra kerül férjével együtt.

3.3.2. IMMUNOLÓGIAI KIVIZSGÁLÁS A betegek komplex immunológiai kivizsgálása során az anyai és apai vér felhasználásával celluláris és humorális immunológiai, immungenetikai és autoimmun vizsgálatokat végeztünk: -A celluláris immunológiai vizsgálatok keretében in vitro meghatároztuk az anyai vérben az apai lymphocytákra specifikus cytotoxikus T lymphocyta precursorok gyakoriságát (CTLpf-teszt) korlátozott hígítási tesztrendszerben (Limiting Dilution Analysis, LDA), valamint ezek cytotoxikus aktivitását sejtközvetített cytotoxicitási teszttel (Cell Mediated Lympholysis, CML) [80-82]. Immunológiai hátteret 1 : 20 000 – nél magasabb CTLp frekvencia esetén valószínűsítettünk. Mértük a természetes ölő (natural killer, NK) sejtek cytotoxikus aktivitását 51Króm felszabadítási teszttel [83], és a helper T lymphocyta precursorok gyakoriságát is (HTLpf-teszt) [84]. Az immungenetikai és a humorális immunitásra vonatkozó vizsgálatok során HLA tipizálás (HLA A, B, C, DR, DP, DQ, G és E antigének meghatározása), HLA keresztpróba a partnerrel szemben, ennek pozitivitása esetén HLA antitest szűrés, FcR

45

blokkoló antitest meghatározás és az eredmények birtokában a TLX (trofoblaszt leukocita keresztreagáló alloantigén) egyezés véleményezése történt [85, 86]. Az autoimmun kivizsgálás az antinukleáris antitest (ANA), kettős szálú DNS elleni autoantitest (dsDNA), antifoszfolipid antitest (APA) (ezen belül anticardiolipin antitest (ACA) és lupus anticoagulans (LA)), valamint az alvadási paraméterek szűrését foglalta magában. Szintén szűrések történtek pajzsmirigy ellenes antitestek (thyroid peroxidase antitest – anti-TPO; human thyreoglobin antitest – anti-TG), illetve coeliakia specifikus antitestek (endomysium antitest – EMA, szöveti transglutaminase – tTG IgA és IgG antitestek) kimutatására. A fenti immunológiai tesztek eredményeinek összesítésével választ kaptunk arra, hogy a szokványos vetélés hátterében az immunopatológiai ok valószínűsíthető-e. Az immunológiai eredetű RSA minimális diagnosztikus kritériumai a jelenleg végzett RSA immunterápiás programban tehát a következőkben összegezhetők: - Az RSA nőgyógyászati-szülészeti kritériumainak megléte a jelenlegi partnerrel (férjjel) szemben. - Az RSA nőgyógyászati, endokrinológiai, belgyógyászati, genetikai és andrológiai okai kizárhatók. A nőbetegeknél rendszerbetegségek nem igazolhatók. - A nő savójában nincs vagy alacsony az FcR blokkoló antitestek szintje. - A nő partnerével TLX antigénben egyezik. - Magas az apai antigénekkel szembeni cytotoxikus T lymphocyta előalak (prekurzor sejt) gyakoriság. A feltételezett immunológiai eredetet alátámasztja, ha a celluláris immunológiai vizsgálatok eredményei is kórosak, de ezek önmagukban nem elegendőek az immunológiai ok kimondásához.

46

3.3.3. IMMUNTERÁPIA A TERHESSÉG ALATT Azokban az esetekben, ahol a habituális vetélés egyéb okainak kizárása után az immunopatológiai háttér igazolódott, a bizottság a következő terhesség alatti immunterápiát indokoltnak tartotta. Ez 3 hetente történő intravénás immunglobulin kezelést jelent (IVIG) a magzati szívhang ultrahangos megjelenésétől (kb. 6. gesztációs hét) a 24. terhességi hétig. Az első kezelés dózisa 0,3-0,4 g/tskg, a továbbiaké 0,2-0,3 g/tskg. A használt immunglobulin az esetek többségében Humaglobin volt, néhány esetben Intraglobin-F. A készítmények paraméterei megegyeznek, bennük a blokkoló faktorok szintje közel azonos. Preferáltuk a Humaglobin alkalmazását, hiszen ez egy magyar készítmény, és az ára is jóval kedvezőbb. A kezelt betegek mindenre kiterjedő felvilágosítást kaptak, mely magában foglalta a vérkészítmények alkalmazásával kapcsolatos esetleges szövődményeket, valamint azt, hogy a kezelés nem minden esetben jár sikerrel. Ezt a beleegyező nyilatkozatban aláírásukkal is igazolták. Mivel a kezelés hatásossága a terápia korai kezdésével jelentősen megnövelhető, ezért mesterségesen létrehozott terhességek esetében (IVF, ET) az első dózis alkalmazása a 0. napon, tehát a beültetés napján indokolt lehet. Tekintettel arra, hogy Magyarországon a habituális vetélők IVIG kezelése – elsősorban anyagi megfontolások alapján – jelenleg csupán a HABAB Bizottság koordinálásával listára került esetekben engedélyezett és OEP-támogatott, ezen esetekben az immunterápia ily módú, korai alkalmazásától egyelőre eltekintettünk. Bizonytalan ugyanis az IVF sikeressége, sok esetben a beteg feleslegesen kapná meg a 0. napi IVIG dózist. A későbbiekben, a klinikai kutatási fázis lezárása után, ha már kellően nagyszámú beteganyagon igazoltuk a habituális vetélők immunkezelésének létjogosultságát, egy újabb project részeként érdemes lenne tanulmányozni az asszisztált reproduktív technikák melletti 0. napos IVIG-kezelés hasznosságát.

47

3.3.4. A TERHESSÉG NYOMONKÖVETÉSE Az IVIG protokoll szerinti alkalmazása mellett az immunológiai paraméterek folyamatos monitorizálásával ellenőriztük a terápia hatékonyságát. A betegektől minden kezelés előtti napon illetve a kezelések után kb. egy héttel vért vettünk immungenetikai kontroll vizsgálatra (FcR blokkoló aktivitás ellenőrzése, HLA-szerológiai keresztpróba ismétlése az immunterápia végén). A kezelés megkezdése előtt, valamint az első, a negyedik és a hetedik kezelés utáni héten az esetektől és az előbbi adatoktól függően az apai és anyai vérminták felhasználásával CTLpf kontrollvizsgálatokat végeztünk. Az IVIG melletti nyomonkövetés az esetek legnagyobb részében immunológiai paraméterekkel jelezte az immunglobulin hatását: a kezelések után nőtt az FcR blokkoló ellenanyag szintje, és ezzel párhuzamosan legtöbbször csökkent a CTLpf értéke. A pontos monitorizálás segített az immunterápia hatékonyságának nyomonkövetésében.

3.4. EREDMÉNYEK A Habituális Vetélők Multicentrikus Klinikai Programjának első 5 évében összesen 120 házaspár jelentkezett a HABAB programba, akiknél az alapellátó intézmény nem találta meg az RSA kiváltó okát. Huszonnyolc esetben (23 %) a részletes előszűrés az ismétlődő vetélések hátterében nem immunológiai okokat tárt fel (nőgyógyászati, endokrinológiai, infectológiai, belgyógyászati, genetikai, stb… okok) [14. ábra]. A maradék 92 esetben megkezdtük a házaspár immunológiai kivizsgálását, ahol 91 %-ban (83 eset) a párnál igazolódott az anya és apa közötti immunológiai összeférhetetlenség [15. ábra]. Ezek lettek azok a kiválasztott esetek, ahol a bizottság a következő terhesség alatt immunterápiát javasolt. 32 habituális vetélő esett teherbe a bizottsági döntés után, és kapta meg a protokollban leírtak szerint a kúraszerű intravénás immunglobulin kezelést. Az alkalmazott IVIG mellett 23 terhes egészséges gyermeket szült. 9 esetben a terhesség az IVIG alkalmazása ellenére ismét vetéléssel végződött (28 %).

48

14. ÁBRA

Az egyéb okok kizárására irányuló részletes vizsgálat 28 esetben

(23%) megtalálta az RSA (nem immunológiai eredetű) kiváltó okát. E betegek visszakerültek beutaló orvosukhoz további kezelésre. Mindez jól példázza a program globális hasznosságát a habituális vetélésekkel kapcsolatban.

15. ÁBRA

Az ismeretlen eredetű habituális vetélések igen jelentős részében

immunológiai háttér igazolódott

49

A 23 sikeres és a 9 sikertelen terhességi kimenetel IVIG mellett a program eredményességét bizonyítja 72 %-ban. Bár ez az eredmény is megfelel a nemzetközi szakirodalomban közölteknek, a sikertelen esetek részletesen utóvizsgálatával a következő 6 esetben magyarázatot lehetett találni a kezelés eredménytelenségére: 1. beteg: A vetélést követően a szövettan részleges üszögterhesség diagnózisát igazolta. 2. beteg: IVF-t követően létrejött hármas ikerterhesség, melyet a beteg kérésére kettőre redukáltak. Mind a trigemini terhesség, mind a beavatkozás jelentős rizikótényezőt jelent. 3. beteg: A sok korábbi sikertelen próbálkozás miatt a beteg kérésére a protokolltól eltérően az IVIG kezelést megkezdtük a magzati szívhangok ultrahangos megjelenése előtt, azaz IVF-t követően a terhesség létrejöttének mindössze biokémiai igazolása után. Utólag méhen kívüli, kürtterhesség igazolódott. 4. beteg: Hasonlóan személyes kérésre, az ultrahanggal megerősített élő terhesség kialakulása előtt (már a petezsák megjelenésekor) elkezdtük az immunterápiát. A szívhangok később sem jelentek meg, valószínű, hogy a kezelés megkezdésekor a terhesség már nem élt. 5-6. beteg: A kezelést az RSA hátterében kimutatott endokrin ok és paralel igazolt immunológiai háttér együttes jelenléte mellett kezdtük meg. 3 betegnél nem találtunk egyéb magyarázatot az IVIG sikertelenségére.

Mindezek alapján – az utólagos értékelések szerint – három eset tekinthető az immunterápia „immunológiai eredménytelenségének”. Amennyiben kizárjuk a fenti 6 „nem tiszta vagy kombinált immunológiai” esetet, az IVIG kezelés 88,5 %-os eredménnyel zárult. [16. ábra] Immunterápiából adódó szövődményünk ezidáig nem volt.

50

16. ÁBRA

Eredményeink az RSA programban

3.5. ÉRTÉKELÉS, TOVÁBBI CÉLOK A Habituális Vetélők Multicentrikus Klinikai Programjának eddigi öt éve alatt 32 igazoltan immunológiai hátterű RSA betegnél alkalmazott IVIG mellett 23 esetben a kezelt nők sikeresen kiviselték terhességüket (72 %). A nem tisztán immunológiai hátterű hat eset kizárásával az alkalmazott immunterápia hatékonysága 88,5 %-os. Az eredménytelen esetek utólagos értékelése felhívta a figyelmünket a protokoll betartásának fontosságára. Bár kezdeti sikereink miatt szerettük volna, hogy az általános bevezetés előtt álló módszer minél szélesebb körben terjedhessen, abba a hibába estünk hogy néhány habituális vetélőnél hiányos, illetve nem kellő körültekintéssel végzett vizsgálatok alapján alkalmaztuk az IVIG terápia indikációját. Ez kihangsúlyozza az általános előszűrés rendkívüli fontosságát, és azt, hogy az indokolt esetekben is csak a magzati szívhangok ultrahangos megjelenése után kezdhető el a kezelés.

51

Sokszor jelentős presszió nehezedik a bizottságra a fokozott rizikójú terhességek esetén. A habituális vetélők immunológiai kivizsgálása, pozitív esetben pedig a terhesség alatt alkalmazott immunterápiára adott javaslat – tehát a betegek listára vétele – akkor születik, amikor az adott beteg még nem terhes. Etikai szempontból megoldhatatlan, hogy ha magas kockázatú terhesség alakul ki ezeknél a nőknél (pl IVF, trigemini terhesség, redukció utáni állapot), megtagadjuk tőlük az igazolt immunológiai háttér ellenére a beígért IVIG kezelést. Az immunterápia indikációjának felállítása sokszor nem egyszerű döntés. Példaként említhetjük az in vitro fertilizációs (IVF) technikával létrejött terhességek kérdését. Többszörösen eredménytelen IVF próbálkozások felvethetik a sikertelenség immunológiai hátterét. Az ilyenkor igényelt immunológiai vizsgálatok megtagadása sem szakmai, sem etikai szempontból nem elfogadható, bár ilyenkor legtöbbször az immunológiai tesztek elvégzésére az általános előszűrés nélkül kerül sor. Az optimális eljárás az lenne, ha az IVF programba kerülés előtt már megtörténne a közleményünkben vázolt protokoll szerinti kivizsgálás. Ha ilyenkor az alloimmun kóroki tényező fennállása igazolható, az immunkezelés korábbi megindításával már a magzat beágyazódását is elő lehetne segíteni, a szokásos terhesség-fenntartó immunterápia alkalmazása előtt. Diagnosztikus nehézséget jelenthet az autoimmun betegségek jelenléte is. A tünetekkel járó s emellett laboratóriumi leletekkel igazolt autoimmun betegségeknél nem érdemes az alloimmun irányban tovább vizsgálódni, hiszen az IVIG alkalmazásának sikeressége az autoimmunitás szövődményeként fellépő RSA eseteiben nem bizonyított. Ilyen például az SLE, a pajzsmirigy és a gonádok autoimmun betegségségei vagy az antifoszfolipid szindróma. Nehéz azonban megítélni azokat az eseteket, ahol klinikai tünetek nélkül autoantitestek mutathatók ki, és mindössze ez tereli a figyelmünket az autoimmun háttér irányába. Ilyenkor a kimutatható autoantitestek típusa, illetve egyéb autoantitestek esetleges egyidejű jelenléte az, amely alapján elbírálható az RSA autoimmun eredete. Az RSA nem immunológiai okainak pontos kizárása az előszűrés során bizonyos esetekben nem egyszerű feladat. Gondot okozhat például a genetikai vizsgálat negatív lelete, ha kisebb kromoszóma rendellenesség rejtve marad a vizsgálat során. Kisebb transzlokációknál előfordulhat, hogy – még ha a szülők limfocita-tenyészeteinek

52

analízisére sor is került – a citogenetikai vizsgálat nem ismeri fel az elváltozást. Ennek ellenére a magzanál 50 %-ban előforduló kiegyensúlyozatlan transzlokáció habituális vetélést okozhat. Előfordul, hogy a genetikai rendellenességek csak az anyai sejtek bizonyos populációin vagy csupán a magzati eredetű sejtekben detektálhatók, melyek adott esetben nem képezték a vizsgálat tárgyát. Nem mindig könnyű a hormontermelési zavarok megítélése sem. Példaként a koraterhességi gesztagének alacsonyabb szintjének észlelése mellett, ha nem sikerül hormonpótlással normális progeszteronszintet elérni, nem jöhet szóba az immunterápia, hiszen nem várható tőle eredmény. Kérdéses, hogy ilyen esetekben, ha az alloimmun hátteret a terhesség előtt igazoltuk, megtagadható-e a terhestől az immunterápia lehetősége. A koraterhességi gesztagén-elégtelenség ugyanis – bár csak a hormonszint kontrollok alapján megítélhető eredményességgel – hormonkészítményekkel bizonyos esetekben jól kezelhető, és ennek alkalmazása az immunterápiával párhuzamosan eredményre vezethet. A habituális vetélők kivizsgálása során a teendők protokolláris összefoglalása segítséget nyújt a szülész-nőgyógyász számára a beteg első jelentkezésekor a nem immunológiai hátterű RSA etiológiájának feltárásában. A programba jelentkezettek 23 %-ánál sikerült feltárni olyan nem immunológiai okokat, melyek az alapellátó, azaz beutaló intézményben felderítetlenek maradtak. Ezek a betegek visszakerültek kezelőorvosukhoz habituális vetélésük immár kimutatott – nem immunológiai – hátterének további kezelése végett. A HABAB program klinikai alkalmazása során számos eddig megválaszolatlan kérdés merült fel, melyek részleteinek tisztázása további feladataink közé tartozik. Az RSA betegek IVIG kezelésének optimális dózisa, az adagolások időintervallumai nincsenek tudományos alapossággal kellően feltárva. Az eseteinkben alkalmazott IVIG kezelési sémának alapját a veleszületett és másodlagos immundeficienciák valamint egyes autoimmun betegségek terápiájával kapcsolatban szerzett tapasztalatok képezték. Az RSA-hoz hasonló alloimmun reaktivitás gátlására IVIG kezeléssel korábban csak a vesetranszplantációs kilökődési reakció gátlása kapcsán került sor. Az alkalmazás ezen felül itt is csak mint additív kezelés került szóba, immunszuppresszív gyógyszerek

53

alkalmazása mellett. Mindez arra utal, hogy szükség van olyan kísérletes klinikai kutatásra, mely a dozírozás optimális lehetőségeit hivatott feltárni, beleértve a kezelések számát, az adagolások időintervallumait és a dózisok nagyságát. Szintén nem ismert, és további kutatási feladataink része annak kiderítése, hogy az immunterápia alkalmazása átmeneti vagy hosszú távú immunregulációs hatást képes kiváltani. Kérdés, hogy az IVIG kezelés védelmében kihordott első normális terhesség olyan változást indukál-e, mely későbbi terhességek esetében is pozitív hatású, esetleg újabb kezelés nélkül. Amennyiben az első immunterápia tartós változást képes létrehozni a tolerancia indukcióján keresztül, elképzelhető, hogy a második terhesség esetében csupán egy alacsony dózisú, rövid, emlékeztető IVIG kezelés alkalmazása elegendő vagy egyáltalán nincs szükség további kezelésre. Ugyancsak

megoldásra

váró

feladat

a

monitorizálás

módszertanának

továbbfejlesztése. Az immunregulációs hatás kialakulása immunológiai vizsgálatokkal követhető jelenség. A terápia nyomon követése igen fontos, hiszen az IVIG kezelésre adott immunválasz egyénenként különböző lehet. Így elképzelhető, hogy egyes esetekben csak magasabb IVIG dózissal vagy sűrűbb adagolással illetve egyéb kiegészítő terápiával lehetne elérni a kívánt hatást. Másrészt lehetnek olyan terhesek, akik kiválóan reagálnak már az első kezelésekre, és esetleg csökkenteni lehetne a további dózisokat és/vagy a kezelések számát. A kezelés költségessége miatt ennek anyagi vetülete nem hanyagolható el. Mindezek a megoldatlan kérdések azt mutatják, hogy jelentős elméleti és alkalmazott klinikai kutatási feladatok állnak még előttünk az indikáció esetleges bővítése, a terápiás protokoll szakmai és gazdaságossági optimalizálása valamint a monitorizálási módszertan továbbfejlesztése tekintetében. A szokványos vetélők terhességmegőrző kezelése thrombocyta transzfúzióval vagy IVIG kezeléssel nem új a szakmában [75, 76, 87-89]. Hazánkban szociális és népesedéspolitikai szempontból is különleges fontosságú a reproduktív rendszer betegségeinek megfelelő kezelése. Eredményeink azt mutatják, hogy a habituális vetélés - mely relatíve magas incidenciája miatt sem elhanyagolható tényező – az immunterápia bevezetésével jól kezelhető a fent leírt protokoll szerint. Mindezeket figyelembe véve a

54

recidív spontán abortuszok immunológiai kivizsgálásának és immunterápiájának helye van a korszerű orvostudományban.

* * *

55

4. ÖSSZEFOGLALÁS Egészséges terhességben a méhlepény az a szerv, mely felelős a fetomaternális transzportért, a magzat oxigénnel és tápanyagokkal történő megfelelő ellátásáért. Szerepe azonban ennél jóval messzebbre mutat, hiszen a molekuláris orvostudományok és az immunológia fejlődésével olyan funkciói is látótérbe kerültek, mint szövetproliferáció szabályozása, a terhesség immunológiai koordinálása, az a barrierfunkció, amely megakadályozza, hogy terhességben az anya kilökődési mechanizmusokkal válaszoljon a számára részben idegen magzati szövetekkel szemben. A placenta normálistól eltérő működése tehát számtalan ponton befolyásolhatja a terhesség kimenetelét. A rendellenes lepényi működések közül dolgozatomban két betegséget emeltem ki. Elemeztem a molaterhességben jelentkező lepényi diszfunkciót, ahol a rendellenes fehérjeexpressziós jellemzőkön keresztül igyekeztem közelebb kerülni a – jórészt még ismeretlen – molekuláris háttér részleteinek tisztázásához. Mivel az egyes intra- és extracellulárisan zajló folyamatokat szabályozó biológiai tényezők aktivitása egymással szoros kapcsolatban áll, remélem, hogy a kutatómunkám során tapasztalt eredmények az állandóan bővülő ismeretanyag részeként további tudományos kísérletek kiindulópontját és alapját képezhetik. Ezt követően egy gyakorlatiasabb kérdésben, a molaterhesség utáni klinikai monitorizálásban végeztem statisztikai adatelemzést, vázolva egy lehetséges új, költségkímélő és biztonságos, a betegek számára is könnyen elfogadható nyomonkövetési protokoll alapjait. A kóros lepényi működés egy másik példája az ismeretlen eredetű szokványos vetélés, az értekezésben ennek immunológiai aspektusait tárgyaltam. Bemutattam az öt éve működő Habituális Vetélők Multicentrikus Klinikai Programját, melyben kutatóként és bírálóbizottsági tagként a kezdetektől részt veszek. Az immunológiai kivizsgálás és az alkalmazott immunterápia eredményeinek összefoglalásával igyekeztem felhívni a figyelmet a program úttörő szerepére az RSA korszerű értékelésében.

56

Az értekezés fontosabb kérdéseinek és válaszainak összefoglalása: 1. kérdés: Szerepet játszhat-e az osteopontin fehérje – mely sok rosszindulatú daganatnál igazoltan eltérő mértékben fejeződik ki az egészséges szövetekhez viszonyítva – a gesztációs trofoblasztbetegségek, ezen belül a molaterhesség patogenezisében? Válasz: Lézervezérelt mikrodisszekcióval izolált trofoblasztsejteken alkalmazott real-time PCRral valamint fagyasztott metszeteken végzett immunhisztokémiával az OPN mRNS és fehérje szignifikánsan gyengébb kifejeződését mutattam ki mola hydatidosában a normális méhlepényhez viszonyítva. Természetesen további vizsgálatok szükségesek ahhoz, hogy meghatározzuk az OPN pontos helyét a mola terhesség kialakulásához vezető

biokémiai

folyamatokban,

de

az

igazolt

kifejeződésbeli

különbség

mindenképpen arra utal, hogy az OPN csökkent expressziója szerepet játszik a gesztációs trofoblaszt betegségek patogenezisében. * * * 2. kérdés: Alkalmas-e a SELDI proteinchip rendszer a molaterhességből és a normális méhlepényből származó trofoblaszt fehérje expressziós különbségeinek kimutatására és potenciálisan újabb biomarkerek felismerésére? Válasz: Lézervezérelt mikrodisszekcióval izolált trofoblasztsejteken alkalmazott SELDI-MS proteinchip technikával kimutattam három fémkötő képességgel rendelkező fehérjét (molekulasúlyuk 11,3 kDa, 13,8 kDa és 14,0 kDa), melyek kifejeződése komplett molában szignifikánsan gyengébb, mint a normális méhlepény trofoblasztsejtjeiben. Bár e polypeptidek további karakterizálása illetve identifikálása fontos és szükséges, az eredmények jól demonstrálják, hogy az LCM és a SELDI-MS technikák kombinált alkalmazása hatásos módszer a gesztációs trofoblasztbetegségek normálistól eltérő fehérje-expressziós tulajdonságainak igazolására. Más kötődőképességgel rendelkező chipek alkalmazásával a későbbiekben izolálhatunk fehérjéket, melyek erősebben

57

fejeződnek ki molában a normális méhlepényhez viszonyítva, s e fehérjék potenciálisan biomarkerként alkalmazhatók lesznek a betegség monitorizálásában. * * * 3. kérdés: Lehet-e létjogosultsága szövődménymentes molaterhesség után az eddiginél rövidebb szérum β-hCG nyomonkövetési protokollnak? Válasz: A New England Trofoblast Disease Center valamint az Országos Gyógyintézeti Központ

Szülészeti

és

Nőgyógyászati

Osztályának

betegnyilvántartásából

véletlenszerűen kiválasztott 550 molaterhesség elemzése kapcsán az adatok azt mutatják, hogy szövődménymentes molaterhesség esetén a negatív szérum hCG szint elérése után – bár jelenleg további havonkénti ellenőrzés javasolt – perzisztens trofoblaszttumor kialakulásának igen kicsi a valószínűsége. Elképzelhető, hogy érdemes lenne átgondolni a nyomonkövetési protokoll időintervallumát. A betegek követése a negatív hCG értékek eléréséig költségkímélő és biztonságos megoldásnak tűnik, ráadásul javíthatja a betegek együttműködését a protokoll teljesítésében. * * * 4. kérdés: Javítja-e a habituális vetélés (recidív spontán abortusz, RSA) diagnosztikáját és terápiáját a 2000-ben indult RSA multicentrikus klinikai program? Válasz: Az RSA multicentrikus klinikai program a habituális vetélők immunológiai kivizsgálásának és immunkezelésének új módszerét alkalmazva az immunterápia pontos indikáció alapján történő alkalmazását tűzte ki célként. A betegek kivizsgálása szigorú protokoll szerint történt, melynek során először kizártuk az RSA nem immunológiai okait, majd celluláris és humorális immunológiai, immungenetikai és autoimmun vizsgálatok alapján igazoltuk vagy elvetettük az immunpatológiai háttér fennállását. Az immunpatológiailag igazolt esetekben a következő terhesség alatt intravénás immunglobulin kezelést (IVIG) alkalmaztunk, az immunológiai paraméterek folyamatos monitorizálása mellett.

58

Az RSA program első 5 éve alatt 120 eset vizsgálata során a tiszta alloimmun hátterű RSA betegeknél alkalmazott IVIG kezelés 88,5 %-ban eredményes volt. Adataink azt mutatják, hogy az RSA immunológiai kivizsgálásának és immunterápiájának helye van a korszerű, „bizonyításon alapuló” orvostudományban. * * *

59

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Itt mondanék köszönetet mindazoknak, akik közvetve, vagy közvetlenül támogatták kutatómunkámat és segítségemre voltak abban, hogy ez az értekezés elkészülhessen. Kiemelten szeretném megköszönni: Dr. Fülöp Vilmosnak, témavezetőmnek, a tőle kapott szakmai tanácsokért, útmutatásaiért. Sűrű elfoglaltsága ellenére sokszor szakított időt rám hazai és külföldi munkám során egyaránt. Bostoni tartózkodásom alatt két alkalommal is meglátogatott rövid időre, hogy segítse kutatómunkám akadálytalan folytatását, egyengesse utamat. Megteremtette külföldi tanulmányutam anyagi hátterét, és távollétemben – sok akadályt lekűzdve – képviselte érdekeimet hazai munkahelyemen. Dr. Kopper László professzor úrnak, témavezetőmnek, aki értékes tanácsaival segítette munkám elindulását, és javaslataival hozzájárult dolgozatom végső formába öntéséhez. Az OGYK-ban dolgozó trofoblaszt munkacsoport tagjainak, Dr. Szigetvári Iván Professzor Úrnak, Dr. Szepesi Jánosnak és Dr. Végh Györgynek. Dr. Gáti István, Dr. Doszpod József, Dr. Cseh Imre, Dr. Egyed Jenő és Dr. Török Miklós Professzor Uraknak, akik a tudományos munkám évei alatt intézetvezetőim voltak. Nyugodt munkahelyi körülmények biztosításával segítették, hogy a klinikum mellett szabadon végezhessem kutatómunkámat. Engedélyezték, hogy az Országos Hematológiai és Immunológiai Intézetben több hónapos gyakorlat alatt gyarapítsam munkám

eredményeit,

emellett

lehetővé

tették

külföldi

tartózkodásomat

is.

Útmutatásaikkal és szakmai tanácsaikkal támogatták a Ph.D. programban való részvételemet. Dr. Kotlán Beatrixnak, Dr. Padányi Ágnesnek, Dr. Réti Mariannak, Dr. Gyódi Évának, Dr. Rajczy Katalinnak, Dr. Miklós Katalinnak, Dr. Németh Juliannának, Dr. Petrányi Győző Professzor Úrnak valamint Sonkoly Gabriella laborasszisztensnek és az összes laboratóriumi munkatársamnak, akik az Országos Hematológiai és Immunológiai

60

Intézet dolgozóiként a kísérleti munka örömeibe bevezettek, és szakmai irányításukkal, tapasztalataikkal önzetlenül támogattak munkám során. Dr. Ross S. Berkowitz és Samuel C. Mok harvardi professzoroknak, akik elméleti és gyakorlati tanácsaikkal, útmutatásaikkal hozzásegítettek és garanciát szolgáltattak Egyesült

Államokbeli

eredményeim

eléréséhez.

Bizalommal

rendelkezésemre

bocsátották a NETDC adatbázisát, mely alapján hatalmas beteganyagon végezhettem statisztikai adatelemzést. Dr. Jae-Hoon Kim, Dr. Colleen M. Feltmate és Dr. Bin Ye kollégáknak, akikkel a Harvard Egyetem Nőgyógyászati Onkológia Laboratóriumában közös kutatási témában együtt dolgoztam; A Schering, az Abbott és a Lilly cégeknek valamint a Magzati Élet Védelméért és a XXI. Század Generációjáért Alapítványoknak, mert támogatásukkal lehetővé tették, hogy munkám jelentős részét a Harvard Egyetemen, az Amerikai Egyesült Államokban, Bostonban végezhessem kilenc hónapon keresztül; Minden kollégámnak, akik hazai és külföldi távollétem alatt helyettesítettek a klinikumban, ellátták betegeimet, és kitartóan dolgoztak az osztályos munka egyébként rám eső részét is elvégezve; Szüleimnek, hogy elindítottak az orvosi pályán, és külföldi tanulmányaim alatt anyagilag is támogatták, hogy családom mellettem lehessen. Végül hálámat szeretném kifejezni feleségemnek, Katalinnak, aki gyermekeinkkel együtt mindvégig mellettem állt. Szeretetükkel segítették munkámat, kérésemre – félretéve félelmeiket, aggodalmaikat – elkísértek külföldi utamra, hogy jelenlétükkel biztosítsák a szakmai munka békés, nyugodt családi hátterét. Nélkülük ez a disszertáció nem készülhetett volna el.

61

IRODALOMJEGYZÉK 1. Szigetvári I: A mola hydatidosa. (fejezet Doszpod J: Az intrauterin magzat c. könyvéből) Medicina Könyvkiadó RT 2000; 262-290. 2. Li MC, Hertz R, Spencer DB: Effect of methotrexate therapy on choriocarcinomaand chorioadenoma. Proc Soc Exp Biol, 1956; 93: 361. 3. Papp Z.: A szülészet-nőgyógyászat tankönyve. Semmelweis Kiadó 1999; 333-339. 4. Fülöp V: Terhességi betegségek immunológiai és onkogenetikai jellemzése. 2001, MTA Doktori disszertáció 5. Végh Gy: A terhességi trofoblaszt daganatok potenciális biológiai markerei. 2001, Ph.D. doktori értekezés 6. Elston CW: Cellular reaction to choriocarcinoma. J Path 1969; 97: 261. 7. Deligdisch L, Driscoll SG, Goldstein DP: Gestational trophoblastic neoplasms: morphologic correlates of therapeutic response. Am J Obstet Gynecol 1978; 130: 801. 8. Ito S, Sekine T, Komuro N, Tanaka T, Yokoyama S, Hosokawa T: Histologic stromal reaction of the host with gestational choriocarcinoma and its relation to clinical stage classification and prognosis. Am J Obstet Gynecol 1981; 140: 781. 9. Cinander B, Hayley MA, Rider WD, Warwick OH: Immunotherapy of a patient with choriocarcinoma. Canad M A J 1961; 84: 306. 10. Kohorn EI: Hydatidiform mole and gestational trophoblastic disease in Southern Connecticut. Obstet Gynecol 1982; 59: 78-84. 11. Lurain JR, Brewer JI, Torok EE, Halpern B: Natural history of hydatidiform mole after primary evacuation. Am J Obstet Gynecol 1983; 145: 591-595. 12. Soper JT, Clarke-Pearson D, Hammond CB: Metastatic gestational trophoblastic disease: prognostic factors in previously untreated patients. Obstet Gynecol 1988; 71: 338-343. 13. Berkowitz RS, Goldstein DP: Chorionic Tumors. N Engl J Med 1996; 335: 17401748. 14. Seckl MJ, Fisher RA, Salerno G, Rees H, Paradinas FJ, Foskett M, Newlands ES: Choriocarcinoma and partial hydatidiform moles. Lancet 2000; 356: 36-39. 15. Denhardt DT, Noda M, O’Regan AW, Pavlin D, Berman JS: Osteopontin as a means to cope with environmental insults: regulation of inflammations, tissue

62

remodeling, and cell survival. The Journal of Clinical Investigation 2001; 107: 10551061. 16. Hu DD, Lin EC, Kovach NL, Hoyer JR, Smith JW: A biochemical characterization of the binding of osteopontin to integrins aVb1 and aVb5. J Biol Chem 1995; 270: 26232-26238. 17. Kim YW, Park Y-K, Lee J, Ko SW, Yang MH: Expression of osteopontin and osteonectin in breast cancer. J Korean Med Sci 1998; 13: 652-657. 18. Xie Y, Sakatsume M, Nishi S, Narita I, Arakawa M, Gejyo F: Expression, roles, receptors and regulation of osteopontin in the kidney. Kidney Int 2001; 60: 1645-1657. 19. Ihara H, Denhardt DT, Furuya K, Yamashita T, Muguruma Y, Tsuji K, Hruska KA, Higashio K, Enomoto S, Nifuji A, Rittling SR, Noda M: Parathyroid hormone-induced bone resorption does not occure in the absence of osteopontin. J Biol Chem 2001; 276: 13065-13071. 20. Yoshitake HY, Rittling SR, Denhardt DT, Noda M: Osteopontin-deficient mice are resistant to ovariectomy-induced bone resorption. Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96: 8156-8160. 21. Nemir M, Bhattacharyya D, Li X, Singh K, Mukherjee AB, Mukherjee BB: Targeted inhibition of osteopontin expression in the mammary gland causes abnormal morphogenesis and lactation deficiency. J Biol Chem 2000; 275: 969-976 22. Weintraub AS, Schnapp LM, Lin X, Taubman MB: Osteopontin deficiency in rat vascular smooth muscle cells is associated with an inability to adhere to collagen and increased apoptosis. Lab Invest 2000; 80: 1603-1615. 23. Johnson GA, Spencer TE, Burghardt RC, Taylor KM, Gray CA, Bazer FW: Progesterone modulation of osteopontin gene expression in the ovine uterus. Biol Reprod 2000; 62: 1315-1321. 24. Johnson GA, Burghardt RC, Spencer TE, Newton GR, Ott TL, Bazer FW: Ovine osteopontine: II. Osteopontin and αvβ3 integrin expression in the uterus and conceptus during the periinplantation period. Biol Reprod 1999; 61: 892-899. 25. Kim JH, Skates SJ, Uede T, Wong Kk KK, Schorge JO, Feltmate CM, Berkowitz RS, Cramer DW, Mok SC: Osteopontin as a potential diagnostic biomarker for ovarian cancer. JAMA 2002; 287: 1671-1679.

63

26. Thalmann GN, Sikes RA, Devoll RE, Kiefer JA, Markwalder R, Klima I, FarachCarson CM, Studer UE, Chung LWK: Osteopontin: Possible role in prostate cancer progression. Clin Cancer Res 1999; 5: 2271-2277. 27. Chambers AF, Wilson SM, Kerkvliet N, O’Malley FP, Harris JF, Casson AG: Osteopontin expression in lung cancer. Lung Cancer 1996; 15: 311-323. 28. Agrawal D, Chen T, Irby R, Quackenbush J, Chambers AF, Szabo M, Cantor A, Coppola D, Yeatman TJ: Osteopontin identified as lead marker of colon cancer progression, using pooled sample expression profiling. J Natl Cancer Inst 2002; 94: 513-521. 29. Ue T, Yokozaki H, Kitadai Y, Yamamoto S, Yasui W, Ishikawa T, Tahara E: Coexpression of osteopontin and CD44v9 in gastric cancer. Int J Cancer 1998; 79: 127132. 30. Gotoh M, Sakamoto M, Kanetaka K, Chuuma M, Hirohashi S: Overexpression of osteopontin in hepatocellular carcinoma. Pathol Int 2002; 52: 19-24. 31. Takahashi F, Akatugawa S, Fukumoto H, Tsukiyama S, Ohe Y, Takahashi K, Fukuchi Y, Saijo N, Nishio K: Osteopontin induces angiogenesis of murine neuroblastoma cells in mice. Int J Cancer 2002; 98: 707-712. 32. Philip S, Bulbule A, Kundu GC: Osteopontin stimulates tumor growth and activation of promatrix metalloproteinase-2 through nuclear factor-Kb-mediated induction of membrane type 1 matrix metalloproteinase in murine melanoma cells. J Biol Chem 2001; 276: 44926-44935. 33. Sirivatanauksorn Y, Drury R, Crnogorac-Jurcevic T, Sirivatanauksorn V, Lemoine NR: Laser-assisted microdissection: Applications in molecular pathology. J Pathol 1999; 189: 150-154. 34. Simone NL, Paweletz CP, Charboneau L, Petricoin EF, Liotta LA: Laser capture microdissection: Beyond functional genomics to proteomics. Mol Diagn 2000; 5: 301307. 35. Omigbodun A, Ziolkiewitz P, Tessler C, Hoyer JR, Coutifaris C: Progesterone regulates osteopontin expression in human trophoblasts: a model of paracrine control in the placenta? Endocrinol 1997; 138: 4308-4315.

64

36. Rodriguez GC, Hughes CL, Soper JT, Berchuck A, Clarke-Pearson DL, Hammond CB: Serum progesterone for exclusion of early pregnancy in women at risk for recurrent gestational trophoblastic neoplasia. Obstet Gynecol 1994; 84: 794-797. 37. Genti-Raimondi S, Alvarez CI, Patrito LC, Flury A: Low aromatase activity in microsomes from complete hydatidiform mole. J Clin Endocrinol Metab 1993; 76: 108111. 38. Ho PC, Wong LC, Ma HK: Plasma prolactin, progesterone, estradiol, and human chorionic gonadotropin in complete and partial moles before and after evacuation. Obstet Gynecol 1986; 67: 99-106. 39. Cseh I, Szepesi J, Walentin S, Szabo T, Dravucz S, Szalay J, Gati I: Significance of the determination of estrogen and progesterone receptors in trophoblast diseases. Zentralbl Gynacol 1990; 112: 151-159. 40. Cheung AN, Ngan HY, Ng WF, Khoo US: The expression of cathepsin D, oestrogen

receptor

and

progestogen

receptor

in

hydatidiform

mole

–

an

immunohistochemical study. Histopathol 1995; 27: 341-347. 41. Fulop V, Mok SC, Gati I, Berkowitz RS: Recent advances in molecular biology of gestational trophoblastic diseases. J Reprod Med 2002; 47: 369-379. 42. Bischof P, Martelli M, Campana A: The regulation of endometrial and trophoblastic metalloproteinases during blastocyst implantation and placentation. Contracept Fertil Sex 1994; 22: 48-52. 43. Fulop V, Mok SC, Genest DR, Gati I, Doszpod J, Berkowitz RS: p53, p21, Rb and mdm2 oncoproteins. Expression in normal placenta, partial and complete mole, and choriocarcinoma. J Reprod Med 1998; 43: 119-127. 44. Tuncer ZS, Vegh GL, Fulop V, Genest DR, Mok SC, Berkowitz RS: Expression of epidermal growth factor receptor-related family products in gestational trophoblastic diseases and normal placenta and its relationship with development of postmolar tumor. Gynecol Oncol 2000; 77: 389-393. 45. Ohlsson R: Growth factors, protooncogenes and human placental development. Cell Growth Differ 1989; 28: 1-15. 46. Vegh GL, Selcuk Tuncer Z, Fulop V, Genest DR, Mok SC, Berkowitz RS: Matrix metalloproteinases and their inhibitors in gestational trophoblastic diseases and normal placenta. Gynecol Oncol 1999; 75: 248-253.

65

47. Brooks PC, Stromblad S, Sanders LC, von Schalscha TL, Aimes RT, StetlerStevenson WG, Quigley JP, Cheresh DA: Localization of matrix metalloproteinase MMP-2 to the surface of invasive cells by interaction with integrin alpha v beta 3. Cell 1996; 85: 683-693. 48. Issaq HJ, Veenstra TD, Conrads TP, Felschow D: The SELDI-TOF MS approach to proteomics: protein profiling and biomarker identification. Biochem Biophys Res Commun 2002; 292: 587-592. 49. Sreekumar A, Nyati MK, Varambally S, Barrette TR, Ghosh D, Lawrence TS, Chinnaiyan AM: Profiling of cancer cells using protein microarrays: discovery of novel radiation-regulated proteins. Cancer Res. 2000; 61: 7585-7593. 50. Petricoin EF, Ardekani AM, Hitt BA, Levine PJ, Fusaro VA, Steinberg SM, Mills GB, Simone C, Fishman DA, Kohn EC, Liotta LA: Use of proteomic patterns in serum to identify ovarian cancer. Lancet 2002; 359: 572-577. 51. Garner EO, Leung S-M, Berkowitz RS, Muto MG, Cramer DW, Mok SC: Protein profiling of epithelial ovarian tumors by surface enhanced laser desorption/ionization mass spectrometry (SELDI) analysis. Proceedings of the Society of Gynecologic Oncologists 2001. Abstract 26. 52. Rosty C, Christa L, Kuzdzal S, Baldwin WM, Zahurak ML, Carnot F, Chan DW, Canto M, Lillemoe KD, Cameron JL, Yeo CJ, Hruban RH, Goggins M: Identification of hepatocarcinoma-intestine-pancreas/pancreatitis-associated protein I as a biomarker for pancreatic ductal adenocarcinoma by protein biochip technology. Cancer Res 2002; 62: 1868-1875. 53. Xiao Z, Jiang X, Beckett ML, Wright GL Jr: Generation of a baculovirus recombinant prostate-specific membrane antigen and its use in the development of a novel protein biochip quantitative immunoassay. Protein Expr Purif 2000; 19: 12-21. 54. Ye B, Cramer DW, Pratomo V, Fu L, Li E, Skates S, Leung S-M, Berkowitz RS, Mok SC: A novel ovarian cancer biomarker: Haptoglobin alpha chain, identification and characterization with mass spectrometry and liquid chromatography. Proceedings of the American Association for Cancer Research 2002. Abstract 3687. 55. Vegh GL, Fulop V, Liu Y, Ng SW, Tuncer ZS, Genest DR, Paldi-Haris P, Foldi J, Mok SC, Berkowitz RS: Differential gene expression pattern between normal human

66

trophoblast and choriocarcinoma cell lines: downregulation of heat shock protein-27 in choriocarcinoma in vitro and in vivo. Gynecol Oncol 1999; 75: 391-396. 56. Fulop V, Mok SC, Genest DR, Szigetvari I, Cseh I, Berkowitz RS: c-myc, c-erbB-2, c-fms and bcl-2 oncoproteins. Expression in normal placenta, partial and complete mole, and choriocarcinoma. J Reprod Med 1998; 43: 101-110. 57. Sakuragi N, Matsuo H, Coukos G, Furth EE, Bronner MP, VanArsdale CM, Krajewsky S, Reed JC, Strauss JF: Differentiation-dependent expression of the BCL-2 proto-oncogene in the human trophoblast lineage. J Soc Gynecol Investig 1994; 1: 164172. 58. Muhlhauser J, Crescimanno C, Kaufmann P, Hofler H, Zaccheo D, Castellucci M: Differentiation and proliferation patterns in human trophoblast revealed by c-erbB-2 oncogene product and EGF-R. J Histochem Cytochem 1993; 41: 165-173. 59. Visvader J, Verma IM: Differential transcription of exon 1 of the human c-fms gene in placental trophoblasts and monocytes. Mol Cell Biol 1989; 9: 1336-1341. 60. Sarkar S, Kacinski BM, Kohorn EI, Merino MJ, Carter D, Blakemore KJ: Demonstration of myc and ras oncogene expression by hybridization in situ in hydatidiform mole and in the BeWo choriocarcinoma cell line. Am J Obstet Gynecol 1986; 154: 390-393. 61. Cheung AN, Srivastava G, Pittaluga S, Man TK, Ngan H, Collins RJ: Expression of c-myc and c-fms oncogenes in trophoblastic cells in hydatidiform mole and normal human placenta. J Clin Pathol 1993; 46: 204-207. 62. Bolis G, Belloni C, Bonazzi C, Mangili G, Presti M, Zanaboni F, et al: Analysis of 309 cases after hydatidiform mole: different follow-up program according to biologic behavior. Tumori 1988; 74: 93-96 63. Lajos S, Kóbor G, Vereczkey G, Szabó T, Arnold L, Kereszti J: Correlation of placentotropin and choriogonadotropin concentration during early pregnancy and hydatidiform mole. Orv Hetil 1974; 115: 1029-1031 64. Szepesi J, Szigetvári I, Fülöp V: A molaterhesség és a terhességi trofoblasztdaganatok korszerű diagnózisa és kezelése. Magy Nőorv L 1996; 59: 171178 65. Papp Z: Szülészet-nőgyógyászati protokoll. Budapest 1999; 280-290

67

66. Bagshawe KD, Lawler SD, Paradinas FJ, Dent J, Brown P, Boxer GM: Gestational trophoblastic tumors following initial diagnosis of partial hydatidiform mole. Lancet 1990; 335: 1074-1076 67. Szepesi J, Szigetvári I, Tóth A, Hajdu K, László J: Partielle Mole mit Lungenmetastasen und multiplen Missbildungen des Feten. Zent Bl Gynacol 1988; 110: 246-249 68. Schlaerth JB, Morrow CP, Kletzky OA, Nalick RH, D’Ablaing GA: Prognostic characteristics of serum human chorionic gonadotropin titer regression following molar pregnancy. Obstet Gynecol 1981; 58: 478-482 69. Kim DS, Moon H, Kim KT, Moon YJ, Hwang YY: Effects of prophylactic chemotherapy for persistent trophoblastic disease in patients with complete hydatidiform mole. Obstet Gynecol 1986; 67: 690-694 70. Massad LS, Abu-Rustum NR, Lee SS, Renta V: Poor compliance with postmolar surveillance and treatment protocols by indigent women. Obstet Gynecol 2000; 96: 940944 71. Paradinas FJ, Browne P, Fisher RA, Foskett M, Bagshawe KD, Newlands E: A clinical, histopathological and flow cytometric study of 149 complete moles, 146 partial moles and 107 non-molar hydropic abortions. Histopathology 1996; 28: 101-110 72. Rob L, Rovova H, Pluta M, Kulovany E, Hrehorcak M, Chmel R, et al: Regression of hCG in various types of molar pregnancies – clinical course and prognosis. Ceska Gynecol 2001; 66: 230-235 73. Mungan T, Kuscu E, Dabakoglu T, Senoz S, Ugur M, Cobanoglu O: Hydatidiform mole: clinical analysis of 310 patients. Int J Gynecol Obstet 1996; 52: 233-236 74. Patriarca A, Piccioni V, Gigante V, Benedetto C: The use of intravenous immunoglobulin in sine causa or alloimmune recurrent spontaneous abortion. Panminerva Med 2000; 42: 193-195 75. Christiansen OB: Intravenous immunoglobulin in the prevention of recurrent spontaneous abortion: the European experience. Am J Reprod Immunol 1998; 39: 77-81 76. Coulam CB, Krysa L, Stern JJ és mtsai: Intravenous immunoglobulin for treatment of recurrent pregnancy loss. Am J Reprod Immunol 1995; 34: 333-340

68

77. Dupont E, Moriaux M, Lambermont M, Englert Y: Re-evaluation of immunomodulator treatments for recurrent abortions. Rev. Med. Brux. 1998; 19: 69-72 78. Scott JR: Immunotherapy for recurrent miscarriage. Cochrane Database Syst Rev 2003; 1, CD000112. 79. Hill JA. Immunologic factors in spontaneous abortion. Reprod Immunol 1996; 433442 80. Kotlán B, Fülöp V, Padányi Á és mtsai: High anti-paternal cytotoxic T-lymphocyte precursor frequencies in women with unexplained recurrent spontaneous abortions. Hum. Reprod 2001; 16: 1278-1285 81. Lefkovits I, Waldman H: Limiting dilution analysis. Immunol. Today, 1984; 5: 265268 82. Yamada K: Analysis of the CTLp frequency before and after immunotherapy for patients with unexplained habitual abortion. Nipoon-Sanka Fujinka Zasshi 1993; 45: 527-532 83. Benczúr M: Killersejtek citotoxikus képességének in vitro vizsgálata. Klinikai Immunol. III Módszerek, 1993; 176-181 84. Young NT, Roelen DL, Dallman MJ, Wood KJ, Morris PJ, Welsh KI: Enumeration of human alloreactive helper T lymphocyte precursor frequencies by limiting dilution analysis of interleukin-2 production. J. of Immunol. Methods, 1996; 195: 33-41 85. Kovács L., Szabó J., Molnár K. Kovács A., Pokorny Gy.: Antineutrophil cytoplasmic antibodies and other immunologic abnormalities in patients with habitual abortion. Am. J. Reprod. Immunol., 1999; 41: 264-270 86. Padányi Á., Gyódi É., Sármay G. és mtsai: Functional and immunogenetic characterization of FcR-blocking antibody. Immunol. Letters 1991; 20: 141-151 87. Kotlán B., Fülöp V., Bátorfi J. és mtsai: Recurrens spontán vetélők immunterápiás lehetőségei: Transzfúziós előkezelés, intravénás immunglobulin-terápia. Transzfúzió. 2001; 34: 147-156 88. Omwandho C.A., Tinneberg H.R., Tumbo-Oeri A.G., Roberts TK, Falconer J.: Recurrent pregnancy losses and the role of immunotherapy. Arch. Gynecol. Obstet. 2000; 264: 3-12 89. Stephenson M.D., Dreher K., Houlihan E. és mtsai: Prevention of unexplained recurrent spontaneous abortion using intravenous immunoglobulin: a prospective,

69

randomized, double blinded placebo controlled trial. Am. J. Reprod. Immunol. 1998; 39: 82-88

SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE

AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁBAN MEGJELENT KÖZLEMÉNYEK 1. Bátorfi J, Szigetvári I. Funkcionális fehérjegének kifejeződése normál lepényben és terhességi trophoblastbetegségekben Orvosképzés 2001; 76:56-66 2. Kotlán B, Fülöp V, Bátorfi J, Padányi Á, Réti M, Doszpod J, Petrányi Gy. Recurrens spontán vetélők immunterápiás lehetőségei: transzfúziós előkezelés, intravénás immunglobulin-terápia Transzfúzió 2001; 34:147-156 3. Bátorfi J, Kotlán B, Padányi Á, Réti M, Gyódi É, Rajczy K, Szigetvári I, Doszpod J, Petrányi Gy, Fülöp V. Habituális vetélők immunológiai kivizsgálása és immunterápiája – kezdeti tapasztalatok Magy Nőorv L 2002; 65:93-96 4. Batorfi J, Bin Ye, Mok SC, Cseh I, Berkowitz RS, Fulop V. Protein profiling of complete mole and normal placenta using ProteinChip analysis on laser capture microdissected cells Gynecol Oncol 2003 Mar; 88(3):424-428 doi: 10.1016/S0090-8258(02)00167-1 5. Feltmate CM, Batorfi J, Fulop V, Goldsetin DP, Doszpod J, Berkowitz RS. Human Chorionic Gonadotropin Follow-up in Patients With Molar Pregnancy: A Time for Reevaluation Obstet Gynecol 2003 Apr; 101(4):732-736

70

doi: 10.1016/S0029-7844(03)00009-7 6. Batorfi J, Fulop V, Jae-Hoon Kim, Genest DR, Doszpod J, Mok SC, Berkowitz RS. Osteopontin is down-regulated in hydatidiform mole Gynecol Oncol 2003 Apr; 89(1):134-139 doi: 10.1016/S0090-8258(03)00067-2 7. Bátorfi J, Fülöp V, Végh Gy, Jae-Hoon Kim, Mok SC, Berkowitz RS, Szigetvári I, Szepesi J, Doszpod J. Az osteopontin gyengébb kifejeződése mola terhességben Magy Nőorv L 2003; 66:89-94 8. Bátorfi J, Bin Ye, Mok SC, Doszpod J, Cseh I, Végh Gy, Berkowitz RS, Fülöp V. Komplett mola és normál méhlepény fehérjeprofilja lézervezérelt mikrodisszekcióval izolált trofoblasztsejteken Magy Nőorv L 2003; 66:149-154 9. Bátorfi J, Feltmate CM, Szigetvári I, Doszpod J, Cseh I, Berkowitz RS, Fülöp V. Újabb ajánlás a molaterhesség befejezését követő hCG-nyomonkövetés eddigi gyakorlatához Magy Nőorv L 2003 szept; 66:291-295 10. Bátorfi J, Végh Gy, Jae-Hoon Kim, SC Mok, RS Berkowitz, Doszpod J, Fülöp V, Cseh I. Az osteopontin Csökkent kifejeződésének újabb bizonyítékai mola hydatidosában Magy Nőorv L 2003; 66:351-355 11. Bátorfi J, Cseh I, Feltmate CM, Szigetvári I, Berkowitz RS, Fülöp V. Meddig ellenőrizzük a szérum-hCG-szintet molaterhesség után? Orvosképzés 2003; 4:163-166 12. Batorfi J, Vegh Gy, Szepesi J, Szigetvari I, Doszpod J, Fulop V. How long should patients be followed after molar pregnancy? Analysis of serum hCG follow-up data Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 2004 Jan 15; 112(1):95-97 13. Padányi Á, Kotlán B, Fülöp V, Bátorfi J, Réti M, Gyódi É, Rajczy K, Nagymányoki Z, Doszpod J, Petrányi Gy. Rekurrens spontán vetélők immunterápiájával elért eredményeink

71

Transzfúzió 2004; 37:71-78 14. Fülöp V, Bátorfi J, Szigetvári I, Szepesi J, Dancsó J, Végh Gy, Cseh I. Hüvelyi metasztázissal szövődött invazív mola hydatidosa klinikai jellemzői és kezelése Magy Nőorv L 2004; 67(4):233-236

EGYÉB KÖZLEMÉNYEK 15. Hajdu K, Bátorfi J, Mészáros J, Doszpod J. Az élő magzatok számának redukciója többesterhességekben Magy Nőorv L 1998; 61:447-450 16. Bátorfi J, Egyed J. Intrauterin graviditás szimultán extrauterin terhességgel Magy Nőorv L 2000; 63:69-70 17. Bátorfi J, Hajdu K. Középidős vetélésindukció laminaria és intravénás sulproston alkalmazásával Magy Nőorv L 2001; 64:31-34 18. A Toth, EP Tardy, K Hajdu, J Batorfi, J Doszpod, J Egyed, I Gati. Fluorescence in situ hybridisation of chorionic interphase cells for prenatal screening of Down syndrome Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 2001; 94:46-50 19. A Toth, EP Tardy, S Gombos, K Hajdu, J Batorfi, Cs Kausz. AZFc deletion detected in a newborn with prenatally diagnosed Yq deletion Prenatal Diagnosis 2001; 21:253-255 20. Dancsó J, Török M, Bátorfi J, Végh Gy, Kovács P, Drávucz S, Fülöp V. Szövethegesztés alkalmazása nőgyógyászati műtétekben Magy Nőorv L 2005; 68:251-258

72

KÖZLÉSRE LEADOTT, MÉG MEG NEM JELENT PUBLIKÁCIÓK: - Szigetvári I, Szepesi J, Végh Gy, Bátorfi J, Arató G, Gáti I, Berkowitz RS, Fülöp V. 25 years experience in the treatment of gestational trophoblastic diseases (GTD) in Hungary J Reprod Med - Bátorfi J, Kotlán B, Padányi Á, Réti M, Gyódi É, Rajczy K, Miklós K, Németh J, Melicher F, Vályi-Nagy I, Petrányi Gy, Fülöp V. Az immunpatológiai hátterű habituális vetélés kezelése terhesség alatti intravénás immunglobulinnal Orvosi Hetilap - Vegh GL, Szigetvari I, Soltesz I, Major K, Batorfi J, Dancso J, Zsirai L, Fulop V. Primary pulmonary choriocarcinoma: A successfully treated case Eur J Gynecol Oncol

73

MELLÉKLET 1. melléklet: Adatlap

74