MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV BIOCHEMIE
Optimalizace stanovení fytoestrogenů pomocí HPLC-MS Diplomová práce
Alena Goišová
Vedoucí práce: Mgr. Tomáš Kašparovský, Ph.D.
Brno 2015
Bibliografický záznam
Autor:
Alena Goišová Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav Biochemie
Název práce:
Optimalizace stanovení fytoestrogenů pomocí HPLC-MS
Studijní program:
Biochemie
Studijní obor:
Biochemie
Vedoucí práce:
Mgr. Tomáš Kašparovský, PhD.
Akademický rok:
2014/2015
Počet stran:
64
Klíčová slova:
Fytoestrogeny, equol, mléko, sója, daidzein, HPLC, HPLC/MS-TOF
Bibliographic entry
Author:
Bc. Alena Goišová Faculty of Science, Masaryk University Department of Biochemistry
Title of Thesis:
Optimalisation of phytoestrogen determination by HPLC-MS
Degree Programme: Biochemistry Field of Study:
Biochemistry
Supervisor:
Mgr. Tomáš Kašparovský, PhD.
Academic Year:
2014/2015
Number of pages:
64
Keywords:
Phytoestrogens, equol, milk, soya, daidzein, HPLC, HPLC/MS-TOF
Abstrakt Tato diplomová práce se zabývá stanovením základního sloţení mléka a detekcí fytoestrogenních látek. Fytoestrogeny jsou sekundární metabolity rostlin, jedná se o polyfenolické nesteroidní estrogeny. Práce je především zaměřena na daidzein a jeho metabolit equol v mléce. Equol je isoflavandiol, který vykazuje estrogenní a antioxidační aktivitu, díky kterým má pozitivní účinky na lidské zdraví. Práce se dále zabývá stabilitou standardů, které slouţily jako kontrola měření. Byla validována metoda pro stanovení isoflavonů a equolu v mléce pomocí HPLC/MS-TOF. Vzorky byly odebírány první a druhý den po krmení. Prvním závěrem je, ţe ve skupině dojnic přikrmovaných sójovým extraktem byla průměrná hladina equolu 270 ng/ml, zatímco u kontrolní skupiny 170 ng/ml. Dále výzkum ukazuje, ţe ve srovnání s prvním dnem odběru vzorků, hladina equolu druhý den klesá.
Abstract This thesis deals with the determination of basic milk composition and detection of phytoestrogenic substances. Phytoestrogens are plant secondary metabolites that are in polyphenolic nonsteroidal estrogen category. The thesis is particularly focused on daidzein and its metabolite equol in milk. Equol is isoflavandiol which exhibits estrogenic and antioxidant activities that are supposed to have positive effects on human health. The study also discusses stability of standards that served as a measurement control. The method has been validated for determination of isoflavones and equol in milk by HPLC / MS-TOF. Samples were taken on day one and day two after feeding. First conclusion is that in one group of cows fed with the supplementation containing soy extract, the average level of equol was 270 ng / ml, while the average level of equol in control group was 170 ng / ml. Secondly the research reveals that level of equol decreased in sample from day two in comparison to sample from day one.
Poděkování Ráda bych poděkovala panu Mgr. Tomáši Kašparovskému, Ph.D. a paní RNDr. Jitce Kašparovské, pod jejichţ vedením jsem vypracovávala svou diplomovou práci, za jejich pomoc a uţitečné rady. Děkuji Mgr. Kateřině Dadákové za pomoc při zpracovávání výsledků. Dále bych chtěla poděkovat pracovníkům Agrovýzkumu Rapotín za vřelé přijetí a přístup na mé stáţi. Také chci poděkovat své rodině za podporu, kterou mi po celou dobu prokazovala.
Prohlášení Prohlašuji, ţe jsem svoji diplomovou práci vypracovala samostatně, s vyuţitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány. V Brně 15. 5. 2015
……………………………. Alena Goišová
Obsah 1 1.1
Teoretická část ..................................................................................... 10 Fytoestrogeny.................................................................................... 10 1.1.1
1.2
Estrogenní receptory ......................................................................... 15 1.2.1
1.3
Klasifikace .................................................................................. 12
Role ER ve vybraných extragenitálních orgánech ..................... 16
Genistein, daidzein, glycitein ............................................................ 18 1.3.1
Metabolismus isoflavonů .......................................................... 19
Biosyntéza isoflavonů ................................................................................ 20 Metabolismus ............................................................................................ 20 1.4
Equol.................................................................................................. 22
1.5
Detekce isoflavonů ............................................................................ 24
1.6
Mléko................................................................................................. 26 1.6.1
Základní složení mléka............................................................... 26
1.6.2
Syntéza mléka a jeho sekrece ................................................... 28
1.7
Mléčný protein a jeho sekrece .......................................................... 29
1.8
Laboratorní stanovení složek mléka – kontrola kvality ..................... 29
1.9
Aminokyseliny, pH ............................................................................. 30
1.10
Cíl práce ............................................................................................. 31
2 2.1
2.2
3
Experimentální část .............................................................................. 32 Materiál a metody ............................................................................. 32 2.1.1
Stanovení základního složení mléka .......................................... 32
2.1.2
Kontrola stability standardů ...................................................... 35
2.1.3
Stanovení fytoestrogenů v kravském mléce ............................. 36
Výsledky............................................................................................. 39 2.2.1
Stanovení základního složení mléka .......................................... 39
2.2.2
Stabilita standardů .................................................................... 46
2.2.3
Kontrola preciznosti měření ...................................................... 49
2.2.4
Stanovení fytoestrogenů v mléce.............................................. 50
Diskuze ................................................................................................. 56
3.1
Stanovení základního složení mléka .................................................. 56
3.2
Stanovení stability standardů ............................................................ 56
8
3.3
Kontrola preciznosti měření .............................................................. 57
3.4
Stanovení fytoestrogenů v mléce...................................................... 57
4
Závěr ..................................................................................................... 59
5
Seznam použitých zkratek .................................................................... 60
6
Seznam literatury ................................................................................. 61
9
1 Teoretická část 1.1 Fytoestrogeny Fytoestrogeny jsou sekundární metabolity rostlin, které jsou strukturně podobné endogenním estrogenům. Fytoestrogeny se řadí mezi polyfenolické metabolity, nachází se v buněčné stěně rostlin, kde slouţí jako ochrana před bakteriemi a plísněmi. Jejich produkce je aktivována vlivem biotického nebo abiotického stresu (1). Díky strukturní podobnosti se savčím hormonem 17 β-estradiolem mají na savce hormonální účinky. Mohou působit jako estrogenní agonisté, tak i antagonisté. Agonisté způsobují estrogenní efekty a antagonisté blokují estrogenní receptory a brání tak estrogenní aktivitě (2). Z literatury vyplývá, ţe fytoestrogeny by mohly sniţovat riziko v počtu nádorových onemocnění, jako např. prsu, prostaty a střeva (3). Rostlinné fenoly se dělí do několika skupin, jednou z nich jsou flavonoidy. Pokud se zaměříme na jejich strukturu, jedná se o molekulu, která obsahuje dva benzenové kruhy, ty jsou spojené uhlíkatým řetězcem. Flavonoidy jsou odvozené od kyslíkatých heterocyklických sloučenin 2H-chromenu (obr. 1). Ten je v poloze 5 substituovaný fenylovou skupinou a taková sloučenina se nazývá flavan (obr. 2).
Obr. 1 – 2H- chromen
Obr. 2 – flavan
Struktura flavanu se skládá ze dvou benzenových kruhů, na obrázku č. 2 jsou označeny jako A a B, a kruhu C, který je odvozený od 2H-pyranu. Kruh B je spojený s kruhem C v poloze C-2. Sloučeniny, kde je kruh B spojený s pyranovým kruhem C v poloze C-3 se nazývají
10
isoflavonoidy. Ovšem pokud je toto spojení v poloze C-4, jiţ se o isoflavonoidy nejedná. Základním jejich skeletem je isoflavon (obr. 3), nebo-li 3-fenylchrom-4-on (4).
Obr. 3 – Isoflavon
Struktura isoflavonu se skládá ze tří kruhů, kruh A vzniká polyketidovou dráhou a kruhy B a C vznikají naopak fenylpropanoidovou dráhou. Tato struktura vzniká procesem izomerie za přítomnosti enzymů isoflavonsynthasy a cytochromu P450. Isoflavon podléhá substitucím, zejména pak methylaci, hydroxylaci, chloraci, adici aminoskupin nebo cyklizaci (5). Fytoestrogeny se strukturně podobají pohlavním hormonům steroidní povahy - estrogenům (obr. 4).
Obr. 4 - estrogen
Jedná se o planární molekuly, které obsahují benzenové jádro a dvě nebo tři hydroxylové skupiny, struktura je blízká 17 β-estradiolu. Ten se dostává do tkání pomocí krevního oběhu, poté se váţe na jednotlivé receptory a dochází k přeměně na estron a estriol (6). 11
Estrogenní aktivita fytoestrogenů se sniţuje následovně: estradiol > kumesterol > genistein a equol > glycitein > daidzein > formononetin, biochanin A (7).
1.1.1 Klasifikace Fytoestrogeny můţeme rozdělit podle jejich struktury do několika skupin: stilbeny, lignany, kumestany a isoflavony.
Stilbeny Hlavním zástupcem této skupiny v potravě je resveratrol, který se nachází např. v červeném víně. Dále se nachází i v arašídech. U červeného vína se resveratrol nachází pouze ve slupce hroznů, ale v arašídech se nachází v celém plodu. Resveratrol se můţe vyskytovat ve dvou isoformách – cis (Obr. 5) a trans (Obr. 6). Estrogenní účinky má pouze trans forma. Resveratrol má antioxidační aktivitu.
Obr. 5 – cis-resveratrol
Obr. 6 – trans-resveratrol
12
Lignany Mezi nejvýznamnější zástupce této skupiny patří dvě sloučeniny – enterodiol (obr. 7) a enterolakton (obr. 8). Obě mají estrogenní aktivitu. Strukturně jde o fenylpropanoidové dimery a oligomery. Rostlinné lignany (fytolignany) se nacházejí v celé řadě potravin, jako jsou lněná semínka, vícezrnné pečivo, dále v zelenině a v čaji. Estrogenní aktivitu získávají aţ přeměnou pomocí střevní mikroflóry.
Obr. 7 – enterodiol
Obr. 8 – enterolakton
Kumestany Do této skupiny patří velmi velké mnoţství sloučenin, ale jen málo z nich vykazuje estrogenní aktivitu. Takové sloučeniny jsou kumesterol (obr. 9) a 4´-methoxykumesterol. Nejvíce se kumesterolu nachází v luštěninách. Největší obsah má jetel a sójové klíčky (8).
Obr. 9 – kumesterol
13
Isoflavony Isoflavony jsou nejvýznamnější a nejznámější skupinou fytoestrogenů. Vyznačují se tím, ţe mají schopnost vázat se k α i β estrogenním receptorům (ER) (9). Hormonální reakce na fytoestrogeny závisí hlavně na afinitě jednotlivých zástupců k oběma skupinám receptorů. Specifická vazebná afinita k receptorům umoţňuje isoflavonům vyvolat estrogenní i antiestrogenní účinky (10). To, jaké účinky vyvolá je závislé na mnoha různých faktorech – na typu tkáně, na hladině isoflavonu i endogenního estradiolu. Mezi nejvýznamnější zástupce isoflavonů patří genistein (obr. 10), glycitein (obr. 11) a daidzein (obr. 12).
Obr. 10 – genistein
Obr. 11 – glycitein
Obr. 12 – daidzein
14
1.2 Estrogenní receptory Estrogenní receptory (ER) jsou steroidní receptory, které se nachází v cytosolu buněk nebo v buněčném jádře a váţí se na ně estrogeny. U člověka rozeznáváme dva typy receptorů, estrogenní receptor α, nazývaný téţ ESR1 (obr. 13) a estrogenní receptor β, nazývaný ESR2 (obr. 14). Oba tyto receptory jsou schopné vytvářet homodimery, ale také společně heterodimery. Na estrogeny mohou reagovat i jiné receptory, jedním z nich je GPER receptor. Jedná se o speciální receptor, který je spřaţený s G proteinem.
Obr. 13 – Estrogenní receptor α (dimer)
Obr. 14 – Estrogenní receptor β (dimer)
GPER je označení pro skupinu receptorů, které se nachází na cytoplazmatické membráně buněk. Skládají se z alfa-helixových domén a přiléhajících smyček. Tyto smyčky asociují s Gproteinem na vnitrobuněčné straně membrány. G-proteiny jsou důleţité ve vnitrobuněčné signalizaci. Existují jeho dvě formy, kdy jedna je „zapnutá“ (GTP) a druhá „vypnutá“ (GDP). Dalším typem estrogenních receptorů jsou tzv. sirotčí jaderné receptory (ERR). Objev těchto receptorů se datuje do 60. let minulého století. Tento typ receptorů na sebe neváţe endogenní estrogeny. Řadíme je do I. třídy jaderných receptorů, společně s glukokortikoidními, mineralokortikoidními, progesteronovými a androgenovými receptory.
15
ER α
ER β
synonymum
NR3A1
NR3A2
lokalizace na chromozómu
6q25.1
14q23.2
gen
ESR1
ESR2
595
530
počet aminokyselin
Tabulka I – základní charakteristika estrogenních receptorů
Pokud nejsou ER v aktivovaném stavu, nachází se především v buněčné cytoplazmě, kde jsou navázané na HSP 90 (heat shock protein). Je-li přítomný vhodný ligand, dojde k vazbě a následné translokaci do buněčného jádra. Tam se váţí na estrogen responsivní jednotku, téţ nazývanou jako HRE – hormon responsivní jednotka. Jedná se o specifickou oblast DNA, která ovlivňuje transkripci různých genů. Transkripci ovlivňují koregulátory, které mohou transkripci stimulovat (koaktivátory), nebo inhibovat (korepresory). Výsledná odpověď je tedy ovlivňována afinitou k ligandu, afinitou komplexu ER/ligand k ERE a přítomností koregulátorů.
Receptory podléhají posttranslačním modifikacím, jedná se o fosforylaci,
acetylaci, ubiquitinaci, apod. To ovlivňuje jejich výslednou stabilitu. Estrogenní receptor, který je navázaný na membránu endoplazmatického retikula se označuje jako GPER – 1. Prostupuje jí asi sedmkrát a je asociován s GS proteiny. Mechanismus jeho účinku není zcela objasněn, ale jeho exprese zvyšuje účinek estrogenů v buňkách. Estrogeny prostřednictvím svých receptorů kontrolují rozmnoţování. Ovlivňují vývoj pohlavní soustavy i reprodukční chování. Dále ovlivňují hladinu krevních lipidů, ukládání tuku, vody, hospodaření se solemi, ale i paměť (11).
1.2.1 Role ER ve vybraných extragenitálních orgánech Kardiovaskulární systém Estrogeny mají příznivé účinky na lipidogram, tonus hladké svaloviny cévní a také hladinu fibrinogenu. Niţší stimulace ER α souvisí s patologickými změnami ve stěně cév, naopak niţší aktivita ER β souvisí s abnormitami iontových kanálů a navíc můţe být i kofaktorem pro 16
vznik diastolické či systolické hypertenze. Obecně zvyšují sekreci ţlučových kyselin, podporují odbourávání LDL v hepatocytech. CNS V CNS se nachází oba typy estrogenních receptorů, estrogeny jsou v řadě případů popisovány jako protektivní vůči různým toxinům nebo ischémii. Jejich deficit je dáván do souvislosti s moţným vyšším rizikem výskytu Alzheimerovi choroby nebo Parkinsonovy choroby. Tuková tkáň V adipocytech (tukové buňky) se nachází receptory ER α. Estrogeny mají schopnost sniţovat chuť k jídlu, podporují lipolýzu a působí proti insulinové resistenci. Kost Estrogenní deficit je doprovázen rozvojem osteoporózy, proto jsou důleţité ER v kosti, zejména pak v osteoklastech i osteoblastech. Pokud dojde k poškození genu pro ER α , projeví se to poklesem denzity kostní hmoty. Naopak ER β jsou odpovědné za potlačení prorůstového účinku estrogenů na kost. Prevence osteoporózy probíhá tak, ţe fytoestrogeny zabraňují ztrátě vápníku močí (12). Negativní účinek fytoestrogenů Je potřebný další výzkum, který by zhodnotil působení fytoestrogenů na lidské zdraví. Vhodné by bylo, kdyby se určila hranice mezi přínosnou a negativní dávkou fytoestrogenů, dále by se měly určit rozdíly, jak na tyto látky odpovídají jednotlivci, např. v závislosti na pohlaví, a také, jak se ovlivňují jejich účinky v interakci s jinými léky (13). Není rozhodně doporučována kojenecká výţiva, která by obsahovala fytoestrogeny. To samé platí i pro těhotné ţeny, ty by se měly také vyhýbat potravě, která je bohatá na fytoestrogeny. Mohlo by dojít k poruše organizace ţenské osy hypotalamus-hypofýza-gonády (14).
17
1.3 Genistein, daidzein, glycitein Hlavním zdrojem isoflavonů ve formě glykosylovaných konjugátů je sója. Pouze po dekonjugaci střevní bakteriální glukosidásou získáme aktivní sloučeniny sóji – genistein a daidzein. Poté mohou být tyto sloučeniny dále metabolizovány bakterií na p-ethylphenol a equol (15). Metabolizace daidzeinu na equol závisí na řadě faktorů. Kolem 90 % genisteinu, který se nachází v krvi, podléhá metabolické inaktivaci v játrech, kde dochází k jeho konjugaci sulfátem nebo kyselinou glukuronovou (16). Lidé, kteří preferují spíše západní styl ţivota, mají koncentraci genisteinu 100 aţ 1000 niţší neţ lidé, kteří pravidelně konzumují potraviny, obsahující sóju. Navzdory tomu, ţe lidé mají podobný příjem sóji v potravě, konečná koncentrace isoflavonů se můţe individuálně lišit v závislosti na metabolismu jedince, který závisí na přítomnosti střevních bakterií, stáří, pohlaví a také na mnoţství antibiotik, které jedinec uţíval během ţivota (17,18). Genistein byl poprvé izolován v roce 1899 a dále byl zkoumaný pro jeho moţné protinádorové účinky. Skvělou zprávou bylo, ţe kromě toho měl i celou řadu dalších výhod, např. sniţování rizika kardiovaskulárního onemocnění, prevence osteoporózy a dalších potíţí, které souvisí s menopauzou (17). Genistein a daidzein se povaţují za přírodní selektivní estrogenní receptory modulátorů (SERM), které se váţí k ER α a β, větší afinita je ale k ER β. Daidzein podporuje apoptózu v závislosti na tvorbě ROS (reaktivní kyslíkové meziprodukty, Reactive Oxygen species). Genistein je známý inhibitor protein-tyrosin kinázy, DNA topoisomerasy I a II. Tento isoflavon má také antioxidační vlastnosti. To závisí na přítomnosti fenolových skupin ve struktuře isoflavonu, které jsou schopny likvidovat volné radikály, coţ působí jako prevence proti poškození DNA oxidací. Obsah glyciteinu (7-hydroxy-3-(4-hydroxyphenyl)-6-methoxy4-chromenonu) je vyšší v sójových klíčcích neţ v sójových bobech. Jeho metabolity dosud nebyly nalezeny, je tedy velmi pravděpodobné, ţe je metabolizován v malé míře (19). Genistein i daidzein jsou inhibitory 17 β-HSD. Jedná se o enzym, který způsobuje přeměnu estronu na estradiol. Inhibice tohoto enzymu způsobená genisteinem je závislá na typu buňek. Dále můţe způsobovat hormonální a metabolické změny. V porovnání s genisteinem nebyl dosud daidzein tak velmi prozkoumaný (17, 20, 21). 18
1.3.1 Metabolismus isoflavonů Jak jiţ bylo zmíněno, isoflavony daidzein, genistein a také glycitein se nachází v sóji, a to ve formě β-D-glykosidů, tedy jako daidzin, genistin a glycitin. Tyto glykosidické formy jsou inaktivní. Po poţití jsou glykosidy hydrolyzovány β glykosidasami. Výsledkem je jejich přeměna na aktivní aglykony – daidzein, glycitein a genistein.
Obr. 16 – Chemická struktura sójových isoflavonů (22) Aglykované formy jsou přijaté střevními buňkami dále do organismu a jsou aktivní. U lidí, kteří konzumují stravu bez sóji, je koncentrace isoflavonů v nanomolárním rozsahu (23). Farmakokinetické studie prokazují, ţe u zdravých jedinců je vstřebávání isoflavonů rychlé a velmi efektivní. Průměrná doba, za kterou dojde k dosaţení nejvyšší koncentrace v plazmě, je 4 – 7 hodin po poţití aglykonů. Při poţití glykosidů se tato doba prodluţuje, a to na 8 – 11 hodin. Na tento jev má vliv především hydrolýza glykosidické vazby (24).
19
Biosyntéza isoflavonů Struktury isoflavonů obecně vznikají dvěma způsoby – šikimátová dráha nebo polyketidová dráha. Šikimátová dráha poskytuje fenylalanin, ten je povaţován za prekurzor při biosyntéze daidzeinu. Biosyntéza probíhá tak, ţe dochází k deaminaci fenylalaninu, čehoţ se účastní enzym fenylalaninamoniaklyasa (PAL). Tím vzniká kyselina skořicová, konkrétně se jedná o kyselinu trans-skořicovou. Dalším krokem je její hydroxylace pomocí enzymu cinamát-4hydroxylasa (C4H), vzniká kyselina p-kumarová. Ta se mění na 4-kumaroyl-CoA vlivem 4kumarát-CoA ligasy (4CL). V tomto kroku do reakce vstupují 3 molekuly malonyl-CoA z polyketidové dráhy. Tyto molekuly se za účasti chalkonsynthasy a chalkonreduktasy (CHS a CHR) kondenzují společně s 4-kumaroyl-CoA na isoliquiritigenin. Po jeho izomerii vzniká (2S)-liquiritigenin. Isoflavonsynthasa (IFS) dává za vznik sloučenině (2R,3S)-2,7,4‘trihydroxyisoflavanonu, ta je dehydratována 2-hydroxyisoflavanondehydratasou (HID) a následně vzniká konečný produkt – daidzein.
Metabolismus Daidzein je v tlustém střevě přeměňován bakteriemi. Tyto bakterie jsou anaerobní a metabolizují daidzein na dihydrodaidzein (DHD). Následnou deoxygenací vzniká equol (obr. 17). Při štěpení heterocyklického kruhu DHD vzniká O-desmethylangolensin (O-DMA). Pokud se pozorně podíváme na jejich strukturu, vidíme, ţe všechny tyto metabolity mají chirální centrum v poloze C3. To je dáno tím, ţe redukce dvojné vazby probíhala mezi polohami C2 a C3.
20
Obr. 17 – Metabolická dráha genisteinu a daidzeinu
Metabolismu genisteinu začíná metabolizací na dihydrogegenistein a 6‘-hydroxy-O-DMA. U genisteinu toto štěpení pokračuje aţ na kyselinu 4-hydroxyphenyl-2-propionovou a trihydroxybenzen. Po poţití potravin, které jsou bohaté na isoflavony, jsou tedy neaktivní glykosidy deglykosilovány. V lidském organismu se tohoto procesu účastní β-glukosidasy střevní mikroflóry (25). Existuje mnoho bakterií, které jsou schopny u člověka metabolizovat daidzein na equol: Adlercreutzia equolifaciens, Bacteroides ovatus, Bifidobacterium, Eggerthella sp YY7918, Enterococcus faecium, Finegoldia magna, Lactobacillus mucosae, Lactobacillus sp Niu – O16, Lactococcus garvieae (Lc 20-92), Ruminococcus productus, Slackia sp HE8, Slackia equolifaciens (kmen DZE), Streptococcus intermedius, Veillonella sp, směs Lactobacillus mucosae EP12, Enterococcus faecium EP11, Finegoldia magna EP13 a Veillonella sp (26).
21
Metabolity daidzeinu se vyskytují v lidské krevní plazmě, moči a také ve výkalech. To je důsledkem biotransformace střevními mikroorganismy. U laktujících dojnic dochází k procesu, kdy jsou daidzein a další isoflavony metabolizovány díky mikroflóře, která se nachází v bachoru. Následně dochází k prostupu těchto metabolitů do mléka.
1.4 Equol Equol (obr. 18), nebo-li 7-hydroxy-3-4-(4´-hydroxyfenyl)-chroman, patří mezi nesteroidní estrogeny. Poprvé byl izolován roku 1932 z koňské moči, odtud pramení jeho název (equine=koňský). Tato látka není rostlinného původu, proto ji nemůţeme označit za fytoestrogen. Je produktem metabolismu bakterií gastrointestinálního traktu ţivočichů, kteří přijímají potravu bohatou na jeho prekurzory. Těmi mohou být např. formononetin obsaţený v jeteli (Trifolium pratense) nebo sóji (Glycine max). Přeměna daidzeinu na equol není stejná u všech jedinců. Jako producenti equolu jsou povaţování dospělí jedinci, kteří po konzumaci sójových isoflavonů, jsou schopni produkovat equol a v plazmě mají jeho koncentraci vyšší neţ 85 nmol/l. Pokud je jeho koncentrace niţší neţ 40 nmol/l, pak se označují jako neproducenti equolu. Je obecně známo, ţe pouze asi 30 % západoevropské populace je schopno metabolizovat daidzein. Naproti tomu asijská populace je této metabolizace schopná ve větší míře, u ní se uvádí, ţe je to aţ 60 % populace. Strukturně se jedná o heterocyklickou sloučeninu, která obsahuje dvě reaktivní hydroxylové skupiny a jeden nereaktivní kyslík v centrálním furanovém kruhu.
Obr. 18 – struktura equolu 22
Equol se od daidzeinu liší tím, ţe má chirální uhlíkový atom na pozici C3 furanového kruhu. Díky tomu se equol můţe objevovat ve dvou odlišných izoformách: S-(-)equol a R-(+)equol. Střevní bakterie se účastní syntézy S-(-)equolu, který se přednostně váţe k estrogennímu receptoru ER β. Equol má vyšší estrogenní aktivitu neţ daidzein. Equol bývá poměrně rychle absorbován, maximální plazmatické koncentrace bývá dosaţeno uţ po 2 – 3 hodinách po poţití potravy obsahující equol. Kdyţ jej podáme před jídlem, je maximální plazmatické koncentrace dosaţeno po 1 – 2 hodinách. Má vyšší biodostupnost neţ daidzein. S-(-)equol cirkuluje v plazmě, poté je vylučován močí jako glukuronidový konjugát. U lidí je tato konjugace velmi účinná, nejdříve probíhá absorpce v rámci enterocytů a následně konjugace v játrech. Pro equol je za hlavní cestu eliminace povaţována renální exkrece do moči. Faktorů, které ovlivňují produkci equolu je mnoho, nejvýznamnějšími jsou: přítomnost bakterií, které equol produkují přítomnost substrátu (daidzin nebo daidzein) přítomnost vhodných intraluminálních podmínek z hlediska redoxního potenciálu Bez přítomnosti bakterií nelze equol produkovat. Stejně tak platí, ţe k jeho produkci nedojde, pokud jsou bakterie přítomné, ale jsou v inaktivní formě (26, 27, 28). Hladiny equolu se liší u homogenizovaného a nehomogenizovaného mléka. Homogenizace je mechanický proces, kdy dochází k přeměně struktury tukových kuliček mléka. Tuk v mléce se nachází ve formě různě velkých tukových kuliček. Jde tedy o protlačování mléka malým otvorem, tím se zmenší a sjednotí velikost tukových kuliček. Equol je distribuován mezi mléčným tukem a vodnými frakcemi. Navíc equol můţe být odstraňován společně s mléčným tukem během procesu odstřeďování (29).
23
1.5
Detekce isoflavonů
Isoflavony jsou látky, u kterých se diskutuje o pozitivním účinku na lidské zdraví. Nejvíce jsou isoflavony zastoupeny v sóji, dále se nachází v luštěninách, obilovinách, zelenině či travách. Poţité, metabolizované nebo absorbované fytoestrogeny se nachází v mléku, v moči, ve výkalech nebo v plazmě. V těchto sloţkách lze hladiny fytoestrogenů detekovat pomocí různých metod. Stanovení koncentrace daidzeinu a equolu ve vzorcích moči prováděl Suzuki et al. (2014). Ten je detekoval pomocí plynové chromatografie s hmotnostním spektrometrem (GC/MS). Zde se pouţíval daidzein a bisphenol A jako standard pro equol. Tato procedura zahrnovala enzymatickou dekonjugaci, extrakci na pevné fázi a derivatizaci. Limit detekce pro daidzein a equol byl 0,008 a 0,005 μg/ml (30). V další studii podle Tsen et al. (2014) se provádělo měření hladiny fytoestrogenů v kravském mléce. Obsah equolu se měřil pomocí LC-IT-TOF-MS (kapalinová chromatografie hmotnostním detektorem s iontovou pastí a analyzátorem doby letu). Byly stanoveny hladiny equolu ve vzorcích mléka. Plnotučné kravské mléko obsahovalo nejvyšší hladiny equolu, nejméně naopak nízkotučné (Tab. II).
Koncentrace equolu (ng/ml)
Plnotučné mléko
Polotučné mléko
Nízkotučné mléko
47,02
18,85
1,25
Tabulka II – Koncentrace equolu v kravském mléce (upraveno dle zdroje č. 41)
24
Existuje mnoho metod stanovování fytoestrogenů. Nejznámější metody stanovování v potravinách a lidských biologických tekutinách jsou uvedeny v tabulce III.
Technika
Typ
Gas chromatogramy-mass spectrometry (GC- Isotope dilution selected ion monitoring (ID-GCMS-SIM)
MS)
Selected ion monitoring (GC-MS-SIM) Liquid chromatography
UV detection (HPLC-UV) Diode array detection (HPLC-DAD) Elektrochemická detection (HPLC-ED) Single cell Multiple coulometric (HPLC-coularray)
Liquid
chromatogramy-mass
spectrometry Electrospray ionisation (ESI)
(LC-MS) Atmospheric
pressure
chemical
ionisation
(APCI) Immunoassay
Radioimmunoassay (RIA) Time resolved fluorescence immunoassay (TRFIA) Enzyme-linked immunosorbent assai (ELISA)
Tabulka III – Stanovení fytoestrogenů v jídle a lidských biologických tekutinách (převzato ze zdroje č. 31)
25
1.6 Mléko Mléko je nedílnou součástí potravy všech mláďat savců, kteří je také kvůli tomuto účelu produkují. Mléko je vyuţíváno jako doplněk stravy také pro člověka. Významné je zejména proto, ţe je bohatým zdrojem ţivin, které jsou pro zdraví člověka důleţité. Sloţení mléka ovlivňuje několik faktorů, např. sloţení krmiva, genetická výbava dojnic, jejich zdravotní stav, dále stáří, roční období a mnoho dalších faktorů. Sloţením krmiva můţeme ovlivnit zejména hladinu equolu a dalších zdraví prospěšných fytoestrogenních látek v mléku a zvýšit tak jeho zdravotní benefit.
1.6.1 Základní složení mléka Kravské mléko obsahuje asi 87 % vody a 13 % sušiny. Sušina je tvořena mléčným tukem (3,9 %), bílkovinami (3,4 %), mléčným cukrem (4,7 %) a ostatními anorganickými a organickými látkami (0,7 %). Tukuprostá sušina je část mléka, která je tvořena bílkovinami mléka a mléčným cukrem – laktosou, dále vitamíny, enzymy a minerálními látkami.
Mléko je
zdrojem také vápníku, hořčíku, inositolu, biotinu, vitamínu A a D, vitamínů skupinu B a dalších vitamínů. Mezi minerální a stopové prvky nacházející se v mléku patří zinek, měď, fosfor a jód. Bílkoviny jsou nejvýznamnější sloţkou mléka. Obsahují esenciální aminokyseliny. Nejdůleţitější z bílkovin mléka jsou kasein a syrovátkové bílkoviny. Bílkoviny slouţí jako prekursory, protoţe se z nich uvolňují biologicky aktivní peptidy. Ty se uvolňují v trávicím traktu člověka. Některé sniţují krevní tlak, posilují imunitní systém a mají antibakteriální účinky. Mléčný tuk je významný pro jeho energetickou hodnotu. Obsahuje nasycené mastné kyseliny (50 – 70 %). Nejvíce je zde zastoupena kyselina laurová, myristová a palmitová. Mléčný tuk je uspořádán do globulí, coţ jsou tukové kapénky. Jejich velikost je od 0,1 do 12 µm, to umoţňuje jejich snadnou stravitelnost. Jeho součástí jsou také fosfolipidy (především lecitin), cholesterol, vitamíny rozpustné v tucích (hlavně A a E). Mléčný cukr obsahuje laktosu, její obsah v kravském mléce je od 4,7 do 5,2 %. Ta je rozpuštěna v přítomné vodě a dodává mléku nasládlou chuť. Je důleţitá při mléčném kvašení, 26
má vliv na barvu a chuť mléčných výrobků. Při konzumaci mléka probíhá hydrolýza laktosy v tenkém střevě díky enzymu laktase. Některým lidem laktasa chybí a s tím souvisí problémy při trávení – nadýmání, pocit nevolnosti. Minerálních látek v mléku je kolem 7 g v litru. Nejcennější je obsah vápníku, dále hořčíku, draslíku a některých stopových prvků. Tyto látky ovlivňují zdravý vývoj kostry, zubů, působí preventivně proti řídnutí kostí tzv. osteoporóze, a sloţí jako prevence vysokého krevního tlaku. Vitamíny jsou v mléce skoro všechny. Vysoký je obsah vitamínů skupiny B. V době, kdy probíhá pastva a zelené krmení, jsou zvýšené hladiny beta karotenů a vitamínu D. Kaţdý z vitamínů má nezastupitelnou funkci. Vitamín B1 (thiamin) je důleţitý při metabolismu sacharidů a aminokyselin. Vitamín B12 (kobalamin) obsahuje kobalt a má funkci při syntéze nukleových kyselin. Vitamín K (koagulační vitamín) je důleţitý při sráţení krve, jeho nedostatek způsobuje poruchu sráţlivosti krve. Tepelným ošetřováním můţe dojít k malé ztrátě některých vitamínů. Na obsah vitamínů má vliv roční období v závislosti na výţivě dojnic.
Obrázek č. 19 27
Enzymy kravského mléka jsou syntetizovány v mléčné ţláze. Některé se mohou dostat do mléka i z krve (32, 33, 34). Enzymy mohou být rozpuštěny ve vodní fázi, mohou se nacházet v membránách kaseinových micel, nebo mohou být uvnitř nich (35, 36). Mléko můţe také obsahovat enzymy mikrobiální, a to z kontaminující mikroflóry. Důleţité enzymy jsou laktoperoxidasa, xanthinoxidasa, katalasy, lipasy, dále fosfatasy, proteasy, amylasy a lysozym. Volné mastné kyseliny (VMK) se tvoří v mléce tehdy, kdyţ mléčný tuk, který je obsaţený v mléce, je rozloţený na glycerol a volné mastné kyseliny pomocí lipolýzy. Jejich hladina v krvi je indikátorem znehodnocení energetického metabolismu krav v období laktace. Čím vyšší je obsah VMK, tím vyšší je riziko nedostatečného zásobování organismu energií. To můţe vést aţ k poruše, tzv. ketóze. VMK mají ţluklou nebo mýdlovou chuť a vůni. Proto, kdyţ lipolýza překročí určitou hranici, přítomnost VMK negativně ovlivňuje chuť a kvalitu mléka a mléčných výrobků. Neţádoucí hranice výskytu VMK v mléce jsou stanoveny od 1 až 1,5 mmol/100 g tuku. Normální úroveň v mléce je 0,5 mmol/100 g tuku (32, 33, 34, 37).
1.6.2 Syntéza mléka a jeho sekrece Syntéza mléka je proces, který probíhá v sekrečních buňkách mléčné ţlázy, a to z látek, které jsou odebírané z krve. Sloţky potravy musí projít přeměnou na prekurzory mléka, ta probíhá hlavně mimo mléčnou ţlázu – většinou v játrech. Pro sekreci mléka u přeţvýkavců jsou důleţité mastné kyseliny, které jsou důleţité při tvorbě bílkovin, jsou zdrojem jejich strukturální uhlíkové kostry. V předţaludku se také tvoří aminokyseliny. Ovšem na syntézu to nestačí, proto mléčná ţláza odebírá z krevního řečiště mnoţství albuminu, fibrinogenu, globulinu, glykoproteinů a nebílkovinných látek (38). Intenzita tvorby mléčného sekretu závisí na několika faktorech, např. na zásobení mléčné ţlázy krví s dostatečným obsahem ţivin (39). Sekreci mléka můţeme rozdělit do 4 stádií. Nejdříve dochází k přestupu prekurzorů mléka z krve do mamární epiteliální buňky. Následuje syntéza sloţitějších látek v mamární epiteliální buňce a poté vyloučení těchto látek do dutin alveolu. Na závěr dochází k obnovení původní velikosti a struktury buněk (40). Při procesu sekrece jsou důleţité dva procesy. Jedním z nich je změna koncentrace některých sloţek krve, které poté přechází do mléka, a to aktivním transportem nebo také difúzí. Druhým procesem je tvorba kaseinu, laktózy a 28
mastných kyselin, ty se v krvi nenachází a vznikají aţ činností ţlázových buněk mléčné ţlázy (41).
1.7 Mléčný protein a jeho sekrece Mléčné prekurzory se dostávají do endoplazmatického retikula, kde jsou zpracovávány po dobu asi 15 aţ 20 minut. Zde jsou vytvořené bílkovinné meziprodukty, a to ve formě sekrečních vezikul, které následně přestupují do Golgiho aparátu. Po asi 25 aţ 45 minutách vezikuly odcházejí z Golgiho aparátu a s ním vytváří tzv. Golgiho síť. Vezikuly se mění na micely, ty obsahují vláknité struktury a kasein. Aby sekreční proteiny mohly procházet přes membrány jednotlivých oddělení, musí vzniknout transportní vezikuly. Ty se odlučují od dárcovských organel a poté splývají s organelami, které je přijímají. Na opačné straně buňky splývají sekreční vezikuly s lipidovými kapénkami. Tento mechanismus umoţňuje vznik hlavní bílkoviny mléka – kaseinu. Dále vzniká laktoglobulin, laktoferin, a další (40). Energetická stránka celého procesu je zajištěna pomocí mitochondrií, a to díky štěpení ATP. Vzhledem k tomu, ţe zásobení ATP je dost nerovnoměrné, má to vliv i na sekreci mléka, která poté také probíhá nerovnoměrně (42).
1.8 Laboratorní stanovení složek mléka – kontrola kvality Je velmi důleţité, aby mléko prošlo akreditovanými laboratořemi, které vzorky mléka zkontrolují a otestují. Toto testování umoţňuje kontrolu zdravotní nezávadnosti a kvality mléka, zda má dané parametry jaké má mít a zda koncentrace sloţek mléka jsou v normálu. Pokud laboratoře najdou nějakou odchylku, kontaktují klienta, který vzorek dodal. Tyto odchylky mohou upozorňovat na mnoho faktorů, jedním z nich je například zdravotní stav skotu. Takové mléko není rozhodně vhodné pro následnou produkci.
29
Vstupní kontrola v mlékárenském průmyslu sleduje hodnoty suroviny (např. mléka) a to po stránce: Senzorické (smyslové) Fyzikální (mnoţství, teplota, obsah vody, obsah sušiny) Chemické (kyselost, obsah tuku, obsah bílkovin a laktosy) Mikrobiologické (počet neţádoucích bakteriií, kvasinek a plísní) Pro mikrobiologické rozbory se provádí speciální odběr. Vzorky se po odběru musí rychle zchladit a uchovávají při teplotě 0 - 5 ºC. Následný rozbor musí být proveden do 24 hodin. Před hodnocením mléka musí být vzorek dobře promíchaný a zahřátý na 20 ºC.
1.9 Aminokyseliny, pH V kravském mléku můţeme najít celkem 18 aminokyselin. Standardními postupy se ovšem stanovuje pouze 17 z nich. Tento postup pracuje na principu kyselé a oxidativně – kyselé hydrolýzy. Nejvíce je zde zastoupena kyselina glutamová. Důleţitou skupinou jsou esenciální aminokyseliny, mezi které patří leucin a lysin. Tyto dvě esenciální aminokyseliny jsou zde nejvíce zastoupeny. Neesenciální skupina aminokyselin je nejvíce zastoupena kyselinou glutamovou, kyselinou asparagovou a také prolinem. Tyto aminokyseliny (leucin, lysin, prolin, kyselina aspartová, kyselina glutamová) tvoří více neţ 50 % z celkového zastoupení aminokyselin v kravském mléku (43). Hodnoty pH kravského mléka po skončení fermentačních procesů se pohybují kolem 4,5. Na tuto hodnotu mají vliv probiotické bakterie. Během fermentace laktosy dochází ke sníţení pH, vlivem kyseliny mléčné, která se zde tvoří. Hodnota pH je velmi důleţitý faktor při fermentaci a při tvorbě biogenních aminů. Dekarboxylace aminokyselin je proto vyšší v kyselém prostředí. Enzymy dekarboxylace mají pH optimum kolem 5 (44).
30
1.10 Cíl práce Fytoestrogeny jsou látky, které patří mezi sekundární metabolity rostlin. Navíc vykazují i estrogenní účinky. Tím, ţe se nachází v rostlinách, jsou tedy součástí potravy dojnic, a následně se mohou vyskytovat v potravinách, např. v mléku a mléčných výrobcích. Jejich přítomnost je ţádoucí, a to hlavně proto, ţe se diskutuje o moţném pozitivním účinku na lidské zdraví.
Cílem této práce je stanovení fytoestrogenů v mléku pomocí HPLC-MS
detekce. Diplomová práce se dále zabývá stanovením základního sloţení mléka. Tato část probíhala v rámci stáţe BiochemNet ve zkušební laboratoři pro syrové mléko v Agrovýzkumu Rapotín s. r. o.
31
2 Experimentální část 2.1 Materiál a metody 2.1.1 Stanovení základního složení mléka Ţivočišná výroba společnosti je orientovaná na chov skotu holštýnského plemene a na produkci mléka. Ve velkokapacitní stáji je ustájeno cca 1 100 ks dojnic a 160 ks vysokobřezích jalovic. Dojírna, kterou společnost vyuţívá je typu side-by-side 2x22 stání vedle sebe. Analýzy odebraných vzorků byly provedeny v akreditované zkušební laboratoři č. 1340 akreditované ČIA podle ČSN EN ISO/IEC 17025 a Národní referenční laboratoři pro syrové mléko Výzkumného ústavu pro chov skotu s.r.o. Rapotín. Činnost laboratoře je pravidelně kontrolována účastí v mezilaboratorních porovnávacích testech (zkoušení způsobilosti) na národní i mezinárodní úrovni. Odběry vzorků pro laboratorní rozbory se uskutečnily v období prosinec 2013 aţ říjen 2014 a byly spojeny s odběry vzorků pro kontrolu uţitkovosti. K analýzám bylo odebíráno 60 vzorků mléka od náhodně vybraných dojnic v průběhu ranního (5x) a poledního dojení (2x). Vzorky byly po odběru uchovány v termoboxech s chladicími vloţkami a s minimální časovou ztrátou převezeny do laboratoře, kde byly analyzovány na stanovení sloţek mléka - tuk, tukuprostá sušina, bílkovina, laktóza, počet somatických buněk, elektrická vodivost, pH, BMM. Vzorky odebírané v termínech pouze s ranním dojením byly analyzovány po doručení do laboratoře v den odběru, vzorky z termínů zahrnujících i odpolední dojení byly konzervovány přípravkem na bázi bronopolu (Broad Spectrum Microtabs®, D&F Control Systems, Inc.) a analyzovány druhý den po odběru. Základní sloţení mléka (obsah tuku, bílkovin, monohydrátu laktózy a sušiny tukuprosté) bylo měřeno pomocí infračervené spektrometrie (MilkoScan 133B, technologie optických filtrů a Delta Lactoscope FTIR na principu měření celého spektra vyhodnocení prostřednictvím Fourierových transformací (FTIR-FT)). Hodnota pH byla stanovena potenciometricky na pHmetru Cyber-Scan 510 (Eutech Instruments) při 20°C, který byl kalibrován pomocí pufrů pH 32
4,0 a 7,0. Hodnota elektrické vodivosti byla určena konduktometrem Radelkis OK-102/1 při 20°C, kalibrace pomocí standardního roztoku 1413µS/cm (25°C) Reagecon. Bod mrznutí mléka byl stanoven kryoskopicky na zařízení Cryo-Star automatic Funke-Gerber s kalibrací pomocí roztoků NaCl. Stanovení počtu somatických buněk (SCC) bylo provedeno fluoroopto-elektronickou metodou na zařízení Fossomatic90 (FOSS, Dánsko) a průtokovou cytometrií na zařízení DeLaval (Švédsko). Infračervený absorpční analyzátor (IR analyzátor) měří mnoţství absorbovaného světla vazbami chemických skupin typických pro příslušný analyt. U tuku je to například mnoţství světla absorbované karbonylovými skupinami esterových vazeb glyceridů a mezi CH2 a CH3 skupinami. U bílkovin jsou peptidické vazby sekundárních amidových skupin a u laktózy to jsou hydroxylové skupiny. Jedná se o nepřímé metody měření, a proto je nutno IR analyzátory pravidelně kalibrovat na hodnoty stanovené podle příslušné referenční metody.
2.1.1.1 Stanovení kyseliny citrónové Stanovení kyseliny citrónové se provádí IR analyzátorem. Její obsah se obvykle uvádí v mmol/l, popřípadě v %. Kyselina citrónová se přirozeně vyskytuje v mléku v koncentracích 8 – 10 mmol/l. Nízký obsah značí nedostatek energie pro metabolismus dojnic, naopak vysoký signalizuje její přebytek.
2.1.1.2 Stanovení tučnosti mléka metodou podle Gerbera Obsah tuku v mléce je podíl tuku, který se oddělí v butyrometru po rozpuštění fosfolipidického obalu tukových kuliček. K porušení dochází díky kyselině sírové, působením odstředivé síly. Fyziologická hodnota pro obsah tuku je nejméně 33 g / l. Do butyrometru dáme 10 ml kyseliny sírové, pak po stěnách vpustíme 11 ml mléka tak, aby se s kyselinou nesmíchalo, ale zůstaly dvě vrstvy a přidáme 1 ml amylalkoholu. Butyrometr uzavřeme zátkou a protřepeme, obsah je potom hnědý. Butyrometr vloţíme do centrifugy, poté se oddělí vrstva tuková, kterou si zatlačením nebo povolením zátky nastavím tak, aby byla v měrné části butyrometru a na stupnici odečteme obsah tuku v procentech, který nám udává délka tukového sloupce. 33
2.1.1.3 Stanovení laktosy polarimetrem Principem této metody je, ţe část světla procházející Nikolovým hranolem se polarizuje. Pokud dáme do cesty těmto polarizovaným paprskům glukosu, která je opticky aktivní, pootočí nám tuto rovinu o určitý úhel, který závisí na otáčivosti látky a na její koncentraci, délce vrstvy a teplotě. Princip metody je, ţe se na toto světlo díváme druhým Nikolovým hranolem, a hledáme místo, kdy vidíme nejvíce světla, toho dosáhneme otáčením druhého hranolu. Na stupnici pak odečteme koncentraci glukosy.
2.1.1.4 Stanovení počtu somatických buněk Počet somatických buněk (SB) v syrovém mléce je stanovován pomocí fluoro-optoelektronické metody. Pro tento postup jsou somatické buňky definovány jako částice, které mají minimální intenzitu fluorescence vlivem barvení fluorescenčním barvivem. Obarvené SB vytvářejí v průtočném citometru elektrický impuls, který je zaznamenám. Stanovení počtu buněk imunitního systému, které se nachází v mléce, má velký význam, protoţe nám tím ukazuje, ţe jedinec, od kterého mléko pochází, je buď zdravý, nebo nemocný, a to v případě, ţe počet somatických buněk je vyšší neţ 400 000 buněk/1 ml.
2.1.1.5 Stanovení obsahu kaseinu Obsah kaseinu je zjišťován IR analyzátorem a je uváděn v g / 100 g. Význam zjišťování kaseinu je posuzován především z hlediska "výtěţnosti" bílkovin na výrobu tvarohu a potaţmo sýrů. Průměrný obsah kaseinu z celkových bílkovin je na úrovni 78 aţ 80 %.
2.1.1.6 Stanovení volných mastných kyselin (VMK) Stanovení obsahu VMK je zjišťováno IR analyzátorem. Obsah VMK je uváděn v mmol / 100 g mléčného tuku. Zvýšený obsah VMK v individuálních vzorcích mléka signalizuje metabolické problémy (energetický deficit ve výţivě, negativní energetická bilance v první fázi laktace, lipomobilizační syndrom, ketózy). Rovněţ zdravotní problémy dojnic (mastitidní onemocnění, zvýšení počtu somatických buněk) se projevují ve vyšším mnoţství VMK v mléce. Podle ČSN70529 je maximální přípustný obsah 1,3 mmol / 100 g tuku. 34
2.1.1.7 Stanovení obsahu močoviny Stanovení koncentrace močoviny je prováděno enzymaticko-konduktometrickou metodou nebo IR analyzátorem. Koncentrace močoviny je uváděna v mg / 100 ml mléka. Pro přepočet na mmol / litr mléka se hodnota zjištěná v mg / 100 ml mléka dělí šesti. Mnoţství močoviny v mléce je povaţováno za kritérium zásobování organismu dusíkatými látkami. Fyziologický obsah močoviny je obvykle uváděn v rozpětí od 20 do 30 mg / 100 ml mléka. S vyšší uţitkovostí dojnic je tolerován vyšší obsah močoviny (do 35 mg / 100 ml). Přebytek N – látek v krmné dávce vyvolává vysokou tvorbu amoniaku v bachorovém prostředí, který nestačí bachorová mikroflóra zpracovat. Přebytečný amoniak přechází stěnou bachoru do krve a v játrech je detoxikován na močovinu. Kříţovou analýzou močoviny a bílkovin je moţné vyhodnotit vyrovnanost výţivy (ţivin v krmné dávce).
2.1.2 Kontrola stability standardů Materiál Komerční standardy od firmy Cayman v práškové formě (glycitein, daidzin, glycitin, genistin, daidzein, equol, genistein 4-HBP). Metody Příprava zásobních standardů Malé mnoţství práškového standardu se rozpustí v 1 ml 100% methanolu v mikrozkumavce Eppendorf (objem 1,5 ml) a následně se promíchá na vortexu. Poté se mikrozkumavky vloţí do centrifugy (5 min.; 11 000 g). Roztoky se přefiltrují přes mikrofiltry (LUT SYRINGE FILTERS, 0,22 μm, LPT 1322-100) do vialek. Poté se změří jejich absorbance (Spektrofotometr Biovawe II) a spočítá jejich koncentrace. Standardy v 100% methanolu byly uchovávány pod inertním plynem N2 v mrazáku (při -20°C). Následně byla naředěna směs (equol, daidzein, genistein, glycitein, glycitin, daidzin, genistin a 4-HBP) na výslednou koncentraci jednotlivých sloţek 100 ng/ml v 50% methanolu. 35
2.1.3 Stanovení fytoestrogenů v kravském mléce Materiál Hladina fytoestrogenů a zejména equolu se stanovovala u vzorků mlék, které byly odebírány na farmě Míšovice v dubnu 2014. Dojnice byly krmeny krmnou směsí. První skupině (M101 aţ M106, M201 aţ M206) byl do krmné směsi navíc přidáván sójový extrakt obsahující isoflavony. Vzorky před analýzou byly uchovávány v mrazáku při - 20°C. Metody Odstranění bílkovin Do 15 ml centrifugační zkumavky se napipetují 3 ml rozmraţeného kravského mléka, 3 ml acetonu a 2 μl methanolického roztoku vnitřního standardu 4-HBP (4-hydroxybenzophenone) o koncentraci 50 μg/ml. Tato směs je ručně třepána po dobu 3 minut, poté je zkumavka vloţena do centrifugy na 5 minut při 11 000 x g (Eppendorf centrifuge 5804 R; rotor GL104). Následně se odebírá veškerý kapalný obsah do srdcové baňky o objemu 50 ml. Obsah srdcové baňky je odpařen do sucha na rotační vakuové odparce (RVO 004 INGOS). Enzymová hydrolýza K odpařenému vzorku v srdcové baňce se přidají 3 ml acetátového pufru (pH 5; 73,8 mM) a 100 μl enzymu β-glukuronidasy (H. pomatia, Sigma-Aldrich). Směs je následně inkubována při 37°C (N-BIOTECH NB-205) po dobu 12 hodin, nejlépe přes noc. Extrakce vzorku Enzymový hydrolyzát je převeden do nové 15 ml centrifugační zkumavky a jsou přidány 3 ml ethylacetátu. Směs je intenzivně ručně třepána po dobu 3 minut, následně se zkumavka vloţí do centrifugy na 5 minut při 11 000 x g (Eppendorg centrifuge 5804 R, rotor GL104). Směs se ve zkumavce rozdělí na tři části. Horní organický podíl je odebrán do nové 15 ml centrifugační zkumavky. Do původní centrifugační zkumavky jsou znovu přidány 3 ml ethylacetátu. Směs je znovu ručně třepána po dobu 5 minut a následně je zkumavka vloţena 36
do centrifugy při 11 000 x g (Eppendorf centrifuge 5804 R, rotor GL104) po dobu 5 minut. Z těchto zkumavek se opět odebere horní organický podíl, ten je přidán do zkumavek, které obsahují organickou fázi z předchozí centrifugace. Otevřené zkumavky se spojenými organickými podíly jsou ponechány 15 minut v mrazáku při -20°C, tím dochází k vymraţení zbytků tuku. Poté byly spojené organické podíly znovu centrifugovány (Eppendorg centrifuge 5804 R, rotor GL104) po dobu 5 minut při 11 000 x g. Centrifugace probíhá při 0°C. Horní vrstva jiţ neobsahuje tuk a je odebrána do 10 ml srdcových baněk a následně je odpařena na rotační vakuové odparce (RVO 004 INGOS) do sucha. Příprava vzorku na analýzu HPLC-MS Odparek se nechá rozpustit v 1 ml 50% methanolu a následně je vloţen na 15 minut do ultrazvuku (Branson 5510 Ultrasonic Cleaner). Dalším krokem je mikrofiltrace. Vzorek je přefiltrován přes mikrofiltry (LUT SYRINGE FILTERS, 0,22 μm, LPT 1322-100) do vialek. Vialky s filtrátem jsou analyzovány na HPLC-MS-TOF. Analýza na HPLC/MS-TOF Analýza byla prováděna pomocí HPLC (Agilent Technologies 1260). Vyuţívaly se kolonky Zorbax Extend - C18 (2,1 x 50 mm; 1,8 µm, Agilent). Mobilní fáze pro HPLC byly: 0,1 % kyselina octová ve vodě (A) Metanol (B) Podmínky gradientu jsou zobrazeny v následující tabulce IV. Objem nástřiku byl 5 µl a průtok byl 0,2 ml/min. Čas (min)
Rozpouštědlo (B) (%)
0
25
6
45
6,01
50
12
50
12,01
100
17
100
Tabulka IV – Podmínky gradientu pro HPLC 37
Látky byly detekovány pomocí hmotnostního detektoru MS-TOF Agilent 6224. Parametry měření jsou uvedeny v tabulce V.
Ionization
ESI-
Gas Temp
325 °C
Drying gas
10 l/min
Nebulizer
35 psig
VCap
4000 V
Fragmentor
150 V
Skimmer
65 V
OCT 1 RF Vpp
750 V
Tabulka V – Parametry MS-TOF analýzy
38
2.2 Výsledky 2.2.1 Stanovení základního složení mléka Obrázek č. 20 zobrazuje hladiny tuků v jednotlivých vzorcích mléka. Hodnoty jsou vyjádřeny v g / 100 ml. Nejniţší průměrná hodnota T (3,20 g / 100 ml) byla naměřena 30. 6. 2014 a nejvyšší hodnota (3,95 g / 100 ml) tuků byla naměřena 2. 12. 2013. Literatura uvádí, ţe hodnota tuků v mléku u holštýnského plemene by se měla pohybovat v rozmezí 3,22 – 4,93 g / 100 ml. Všechny vzorky odpovídají této hladině, pouze vzorek z 30. 6. 2014 je mírně pod hranicí, ale takovou chybu lze pominout.
5.0 4.5 4.0
g/100 ml
3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 2.12.
4.2.
30.6
1.9.
2.10.
Obrázek č. 20 – Koncentrace tuků v kravském mléku
Obrázek č. 21 ukazuje hladiny koncentrace bílkovin v mléku. Nejniţší hladinu bílkovin obsahoval vzorek měřený 30. 6. 2014, naopak průměrně nejvyšší hladiny byly naměřeny 2. 12. 2013 a 4. 2. 2014. Nejniţší koncentrace byla 3,13 g / 100 ml, naopak nejvyšší hladiny byly 3,46 g / 100 ml. Hodnota bílkovin se má pohybovat v rozmezí 3,1 – 3,55 g/100 ml pro holštýnské plemeno. Všechny vzorky mají tedy standardní hladinu bílkovin v mléku.
39
4.5 4.0 3.5
g/100 ml
3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 2.12.
4.2.
30.6
1.9.
2.10.
Obrázek č. 21 – koncentrace bílkovin v kravském mléku
Laktóza je mléčný cukr, jehoţ hladina u holštýnského plemene je v rozmezí 4,64 – 4,95 g / 100 ml. U našich vzorků (obrázek č. 22) byla naměřena nejniţší hladina 2. 12. 2013, kdy daná hodnota byla 4,80 g / 100 ml. Tato hodnota je tedy v normálu. Nejvyšší hladina (4,98 g / 100 ml) byla naměřena u vzorků ze dne 4. 2. 2014. Hladina laktózy je standardní.
6 5
g/100 ml
4 3 2 1 0 2.12.
4.2.
30.6
1.9.
2.10.
Obrázek č. 22 – koncentrace laktózy v kravském mléku
40
Tukuprostá sušina mléka je podíl, který zůstane po vysušení. Její hodnota je v rozmezí 8,5 – 9 g / 100 ml. Obrázek č. 23 zobrazuje tyto hodnoty pro sušinu, všechny vzorky byly tedy nad minimální hodnotou. Nejniţší hladina byla naměřena 1. 9. 2014 (8,72 g / 100 ml). Vzorky měřené 4. 2. 2014 a 30. 6. 2014 jsou sice nad horní hranicí pro tukuprostou sušinu, ale vzhledem k odchylce jsou hodnoty v rámci tabelovaných hodnot. Nejvyšší hodnota byla 9,26 g / 100 ml ze dne 30. 6. 2014.
14 12
g/100 ml
10 8 6 4 2 0 2.12.
4.2.
30.6
1.9.
2.10.
Obrázek č. 23 – Koncentrace tukuprosté sušiny (SNF) v kravském mléku
Počet somatických buněk (PSB, SCC) je významným indikátorem, který nám umoţňuje velmi rychle stanovit, zda je daný jedinec zdravý či nemocný. U Holštýnského plemene se uvádí, ţe PSB se pohybuje okolo 178 tis. / ml. Pokud je tedy jejich počet vyšší jak 400 tis. / ml, můţe to znamenat, ţe jedinec mohl prodělat nějaký zánět, nebo něco podobného, je to znak, kdy jeho imunitní systém byl něčím aktivovaný. Obrázek č. 24 zobrazuje počet somatických buněk u jednotlivých vzorků. Nejniţší hladina (79,96 tis. / ml) byla naměřena 2. 10. 2014. Naopak nejvyšší hladina (156,57 tis. / ml) byla naměřena 1. 9. 2014. Obě hraniční hodnoty jsou v normě.
41
600 500
tis./ml
400 300 200 100 0 2.12.
4.2.
30.6
1.9.
2.10.
Obrázek č. 24 – Počet somatických buněk v kravském mléku
Další důleţitou vlastností mléka je jeho bod mrznutí (BMM). Poţadovaná hodnota pro BMM je ≥ - 0,520 °C. Pokud je daná hodnota niţší, mohlo dojít k technologickému zvodnění mléka, nesprávnému uchovávání nebo nedostatečné minerální výţivě dojnic. Obrázek č. 25 zobrazuje zvýšené BMM, ale jen mírné. Všechny hodnoty se pohybují kolem referenční hodnoty.
2.12.
4.2.
30.6
1.9.
-0.48 -0.49 -0.50
(°C)
-0.51 -0.52 -0.53 -0.54 -0.55 -0.56
Obrázek č. 25 – Bod mrznutí kravského mléka
42
2.10.
Obsah močoviny v mléku se pohybuje v rozmezí 20 – 30 mg / 100 ml mléka. Obrázek č. 26 zobrazuje tuto závislost. Nejniţší hodnota byla naměřená 4. 2. 2014 (24,64 mg / 100 ml) a nejvyšší hladina močoviny v mléku byla naměřena 2. 10. 2014 (37,99 mg / 100 ml). Vzorek z 2. 10. 2014 obsahoval vyšší mnoţství močoviny.
50 45 40
mg/100 ml
35 30 25 20 15 10 5 0 2.12.
4.2.
30.6
1.9.
2.10.
Obrázek č. 26 – koncentrace močoviny v kravském mléku
pH v kravském mléku se u zdravých dojnic pohybuje v rozmezí 6,4 – 6,8. Vzorky dojnic holštýnského plemene mají tuto hodnotu v rámci referenčních hodnot. Na obrázku č. 27 jsou tyto hodnoty zobrazeny. Nejvyšší hodnota byla naměřena 30. 6. 2014 (7,01), naopak nejniţší hodnota byla naměřena 4. 2. 2014 (6,80). Vzorek naměřený 2. 10. 2014 má hodnotu pH mírně pod spodní hranicí tabelovaných hodnot.
43
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5 2.12.
4.2.
30.6
1.9.
2.10.
Obrázek č. 27 – pH kravského mléka
Hodnoty měrné vodivosti se pohybují v rozmezí 3,8 – 4,5 mS / cm. Na obrázku č. 28 je zobrazena vodivost kravského mléka. Vzorek měřený 4. 2. 2014 je mírně pod hranicí, jeho hodnota je 3,31 mS / cm. Ostatní vzorky jsou v rámci referenčních hodnot. Hodnoty měrné vodivosti mohou být ovlivňovány obsahem mléčných bílkovin a řadou dalších faktorů.
6 5
mS/cm
4 3 2 1 0 2.12.
4.2.
30.6
1.9.
Obrázek č. 28 – Vodivost kravského mléka
44
2.10.
Dále se hodnotily tzv. bazénové vzorky. Jedná se o směsné vzorky mléka z tanku v mléčnici. Obrázek č. 29 zobrazuje hodnoty těchto vzorků, které byly měřeny 3. 12. 2014 a 4. 2. 2014. Hodnoty těchto tří parametrů jsou v normě, volné mastné mají referenční hodnotu 1,3 mmol / l. Kys. citrónová se má pohybovat v rozmezí 8 – 10 mmol / l. Koncentrace 3. 12. 2014 se naměřila hladina kaseinu 2,48 g / 100 g mléka a dne 4. 2. 2014 dosahovala hodnoty 2,57 g / 100 g mléka. Hladina kyseliny citrónové se stanovila na 8,20 mmol / l (3. 12. 2014) a na 8,16 mmol / l (4. 2. 2014). Poslední parametr měřený u těchto vzorků jsou volné mastné kyseliny. Jejich koncentrace byla dne 3. 12. 2014 1,38 mmol / l a dne 4. 2. 2014 byla 1,25 mmol / l.
9.00 8.00 7.00 6.00 5.00 4.00 3.00 2.00 1.00 0.00 Kasein (g/100 g)
Kys. citrónová (mmol/l) 3.12.2013
VMK (mmol/l)
4.2.2014
Obrázek č. 29 – Stanovení kaseinu, kys. citrónové a volných mastných kyselin (VMK) v kravském mléku (bazénové vzorky
45
2.2.2 Stabilita standardů Kombinovaná směs standardů byla pouţívána jako kontrola při měření vzorků mléka na HPLC/MS-TOF. Bylo důleţité stanovit jejich stabilitu, abychom je mohli pouţívat jako kontrolu. U standardů, které byly uchovávány při - 20°C, byla měřena jejich absorbance v pěti po sobě následujících dnech. Tabulky č. 6 aţ 9 zobrazují hodnoty absorbancí naměřených u glycitinu, genistinu, daidzinu a glyciteinu. U zbylých směsí se absorbance proměřovat nemusela, jejich stabilita je jiţ známá. Absorbance glycitinu se měří při vlnové délce 262 nm. Kontrola jeho spektra byla v pořádku.
Glycitin
16. 2. 2015
17. 2. 2015
18. 2. 2015
19. 2. 2015
20. 2. 2015
0,154
0,236
0,201
0,230
0,198
0,169
0,251
0,189
0,159
0,229
0,170
0,199
0,189
0,178
0,213
0,150
0,243
0,174
0,174
0,209
0,134
0,383
0,219
0,138
0,241
0,172
0,226
0,202
0,159
0,250
0,178
0,196
0,190
0,179
0,268
0,161
0,210
0,156
0,173
0,234
0,186
0,248
0,185
0,187
0,190
0,140
0,189
0,160
0,196
0,184
Tabulka VI – Hodnoty absorbancí glycitinu v pěti následujících dnech
46
Genistin je látka, která má maximální absorbanci při vlnové délce 262 nm. Spektrum této látky bylo v pořádku. Genistin
16. 2. 2015
17. 2. 2015
18. 2. 2015
19. 2. 2015
20. 2. 2015
0,572
0,681
0,701
0,591
0,700
0,699
0,790
0,644
0,434
0,705
0,689
0,734
0,679
0,563
0,767
0,626
0,768
0,708
0,420
0,516
0,670
0,748
0,749
0,600
0,612
0,627
0,694
0,727
0,587
0,654
0,612
0,702
0,623
0,616
0,692
0,642
0,727
0,630
0,577
0,762
0,511
0,708
0,592
0,676
0,661
0,452
0,717
0,630
0,563
0,682
Tabulka VII – Hodnoty absorbancí genistinu v pěti následujích dnech
Daidzin má maximální absorbanci při vlnové délce 258 nm, tím se liší od ostatních zmíněných látek. Jeho spektrum bylo také v pořádku, mohla se tedy měřit jeho absorbance.
Daidzin
16. 2. 2015
17. 2. 2015
18. 2. 2015
19. 2. 2015
20. 2. 2015
0,449
0,633
0,497
0,446
0,670
0,508
0,537
0,500
0,521
0,681
0,451
0,540
0,644
0,443
0,543
0,500
0,583
0,552
0,546
0,574
0,479
0,557
0,544
0,469
0,635
0,503
0,594
0,484
0,443
0,585
0,504
0,602
0,539
0,521
0,624
0,446
0,564
0,526
0,473
0,551
0,519
0,479
0,464
0,557
0,624
0,472
0,444
0,570
0,509
0,563
Tabulka VIII – Hodnoty absorbancí daidzinu v pěti následujících dnech
47
Glycitein byl jako jediný z aglykonů testován z důvodu jeho přepokládané nízké stability. Jeho absorpční spektrum odpovídalo tabelovaným hodnotám/literárním zdrojům. Absorbance se měřily při vlnové délce 262 nm. Glycitein
16. 2. 2015
17. 2. 2015
18. 2. 2015
19. 2. 2015
20. 2. 2015
0,324
0,423
0,312
0,264
0,210
0,266
-
0,312
0,238
0,282
0,337
0,336
0,324
0,353
0,243
0,216
0,337
0,314
0,290
0,223
0,235
0,282
0,282
0,269
0,341
0,213
0,291
0,288
0,237
0,346
0,292
0,285
0,311
0,321
0,339
0,295
0,383
0,381
0,316
0,315
0,319
0,388
0,301
0,330
0,316
0,269
0,393
0,343
0,352
0,348
Tabulka IX – Hodnoty absorbancí glyciteinu v pěti následujích dnech U glyciteinu (tabulka IX) jsme po testech odlehlých výsledků vyloučili jednu hodnotu, a to ze 17. 2. 2015.
Obrázek č. 30 zobrazuje stabilitu standardů, tedy závislost absorbance v čase. Z grafu je patrné, ţe tyto standardy v 100% methanolu jsou stabilní a je moţné je skladovat minimálně pět dnů při -20°C. Při přípravě kombinovaných standardů se nemusí vţdy přeměřovat absorbance a lze pouţít zásobní standardy přímo. Jejich stabilita byla ještě podpořena uchováváním látek pod atmosférou dusíku, tím se zabránilo přístupu kyslíku.
48
Stanovení stability standardů 0.8 0.7 Absorbance
0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 16.2. Glycitin
17.2.
18.2.
Genistin
19.2.
Daidzin
20.2. Glycitein
Obrázek č. 30 – Stanovení stabilita standardů
2.2.3 Kontrola preciznosti měření Abychom měli jistotu, ţe měření probíhá přesně, nejdříve jsme provedli kontrolu preciznosti a mezilehlé preciznosti měření. To se provádělo kvůli ověření přesnosti námi pouţívané metody. Postup probíhal stejně, jako při analýze všech vzorků mléka. Stanovení přesnosti měření probíhalo v jeden den, došlo k analýze vzorku kravského mléka (FE mléko 5. 4. 2012), tento vzorek se připravoval v pěti replikách. V tabulce X jsou znázorněny koncentrace daidzeinu, glyciteinu, equolu a genisteinu. Je patrné, ţe preciznost této metody je dostatečná, a je tedy vhodná ke stanovení fytoestrogenů v mléce.
Daidzein (ng/ml)
Glycitein (ng/ml)
Equol (ng/ml)
Genistein (ng/ml)
průměr
173,39
362,17
202,79
142,26
Sd
6,89
16,58
8,00
4,46
RSD
3,98
4,58
3,95
3,13
Tabulka X – Stanovení preziznosti měření
49
Měření probíhalo také ještě v několika dnech. Tím se kontrolovala tzv. mezilehlá preciznost měření. Můţeme se podívat, ţe i mezilehlá preciznost měření vykazuje malé chyby, toto měření je tedy vhodné provádět i několik dnů po sobě, a výsledky z měření jsou dostatečně reprodukovatelné. Tabulka XI nám zobrazuje dané hodnoty.
Daidzein (ng/ml)
Glycitein (ng/ml)
Equol (ng/ml)
Genistein (ng/ml)
Průměr
158,87
323,68
196,71
134,03
Sd
9,21
29,43
26,02
3,19
RSD
5,8
9,1
13,2
2,4
Tabulka XI – Mezilehlá preciznost měření
2.2.4 Stanovení fytoestrogenů v mléce Stanovení fytoestrogenů probíhalo v kravském mléce, které můţeme rozdělit do několika skupin. Vzorky mléka označené M101 – M106 a M201 – M206 byly odebírány od dojnic, které byly přikrmovány sójou. Vzorky M107 – M112 a M207 – M212 byly odebírány od dojnic, které naopak nebyly přikrmované sójou, a mohou tedy slouţit jako kontrolní skupina. Hladina isoflavonů u těchto skupin je znázorněna v následujících grafech.
50
900 800 700
ng/ml
600 500 400 300 200 100 0 daidzein M101
glycitein M102
M103
equol M104
M105
genistein M106
Obrázek č. 31 – Hladina isoflavonů u dojnic krmených sójou
900 800 700
ng/ml
600 500 400 300 200 100 0 daidzein M201
glycitein M202
M203
equol M204
M205
genistein M206
Obrázek č. 32 – Hladina isoflavonů u dojnic krmených sójou
51
Pokud se podíváme na oba dva grafy, je patrný přírůstek isoflavonů. Zejména pak equolu, který se pohybuje v koncentracích 377, 56 ng / ml u vzorků M101 aţ M106. U vzorků M201 aţ M206 je jeho koncentrace kolem 174,29 ng / ml. Jako kontrolní skupina byly pouţity vzorky dojnic, které nebyly přikrmované sójou. Hodnoty naměřené v těchto vzorcích jsou znázorněny v grafech.
900 800 700
ng/ml
600 500 400 300 200 100 0 daidzein M107
glycitein M108
M109
equol M110
M111
genistein M112
Obrázek č. 33 – Hladina isoflavonů u dojnic nekrmených sójou
900 800 700
ng/ml
600 500 400 300 200 100 0 daidzein M207
glycitein M208
M209
equol M210
M211
genistein M212
Obrázek č. 34 – Hladina isoflavonů u dojnic nekrmených sójou 52
Při srovnání hladiny isoflavonů a equolu ve skupinách M101 – M112 a M201 – M212, vidíme u kontrolní skupiny niţší koncentraci těchto látek. Pro porovnání hladin equolu ve vzorcích mléka slouţí následující dva grafy (Obrázek č. 35, obrázek č. 36). Porovnání je vţdy v rámci jedné skupiny. Na grafech je viděn nepatrný rozdíl v hladinách equolu mezi zkušební a kontrolní (bez příkrmu sójou) skupinou.
800 700 600 ng/ml
500 400 300 200 100 0 equol M101-M106
M107-M112
Obrázek č. 35 – Koncentrace equolu v kravském mléce
400 350 300 ng/ml
250 200 150 100 50 0 equol M201-M206
M207-M212
Obrázek č. 36 – Koncentrace equolu v kravském mléce
53
Celkem bylo mléko odebíráno od dvanácti dojnic, vţdy ve dvou dnech. Vzorky odebírány první den po krmení jsou značeny jako M101 aţ M112. Vzorky odebírány od stejné dojnice, ale druhý den po krmení, jsou značeny jako M201 aţ M212. Následná analýza těchto vzorků nám umoţňuje sledovat hladinu equolu ve dvou dnech. Můţeme tak sledovat, jak se jeho koncentrace liší a jak velký vliv na jeho hladinu v mléce má právě den odběru. Obrázek č. 37 zobrazuje hladinu equolu ve dvou dnech u dojnic, které byly přikrmované sójou. Hladina equolu je tady tedy vyšší, neţ u zbylé skupiny. Pokud nám vzorky M101 – M106 značí vzorky odebírány první den po krmení, z grafu je patrný pokles vzorků odebíraných druhý den po krmení (M201 – M206).4ím vyšší hladina equolu v mléku byla první den, tím vyšší byl pokles následující den (vzorky dojnice 4 a dojnice 5). Jinak pokles equolu v kravském mléce nebyl tak velký.
1000 900 M105 M104
800 700
ng/ml
600 500 M205
400 300 M103
200 100
M102
M204
M106 M206
M203
M101 M201
M202
Dojnice 1
Dojnice 2
0 Dojnice 3
Dojnice 4
Dojnice 5
Dojnice 6
Obrázek č. 37 – Hladina equolu v kravském mléce ve dvou dnech U kontrolní skupiny vzorků, tedy u M107 aţ M112 a M207 aţ M212 byly hladiny equolu niţší. Ale i tady se potvrdilo, ţe hladina equolu jiţ druhý den po krmení klesá (Obrázek č. 38). Je tedy lepší odebírat mléko hned první den po krmení, pokud ho chceme mít obohacené o equol. Poklesy proti první skupině jsou niţší, coţ můţe souviset právě s niţší koncentrací equolu v mléce u dojnic přikrmovaných sójou. 54
1000 900 800 700 ng/ml
600 500 400 M109
300 200 100
M108 M107
M208
M110 M210 M209
M111
M207
M112 M211
M212
Dojnice 11
Dojnice 12
0 Dojnice 7
Dojnice 8
Dojnice 9
Dojnice 10
Obrázek č. 38 – Hladina equolu v kravském mléce ve dvou dnech Porovnání hladiny equolu všech vzorků první a druhý den po krmení dojnic je znázorněno na obrázku č. 39. Z grafu vyplývá, ţe hladina equolu v obou skupinách je nízká. Musíme zváţit i fakt, ţe výsledky měření mohou být zatíţeny hrubou chybou. Mohlo dojít k nepřesné práci při přípravě vzorků, nebo k nedbalosti při odběru vzorků.
500 450 400 350 300 250
1. den
200 2.den
150 100 50 0 equol
Obrázek č. 39 – Porovnání hladiny equolu první a druhý den odběru vzorku
55
3 Diskuze 3.1 Stanovení základního složení mléka Výsledné hladiny jednotlivých sloţek byly v rozmezí referenčních hodnot. Hladina tuků se pohybovala u vzorků v rozmezí 3,20 aţ 3,95 g/100 g mléka. Referenční hodnota je stanovena na 3,22 aţ 4,93 g /100 g mléka. Hladina bílkovin se v mléku pohybuje v rozmezí 2,97 aţ 3,44 g/100 g mléka. U vzorků byla tato koncentrace stanovena na 3,13 aţ 3,46 g/100 g mléka. Mléčný cukr laktóza se nachází v mléku v koncentracích 4,64 aţ 4,95 g/100 g mléka. Testované vzorky měly jeho hladina v rozmezí 4,80 aţ 4,98 g/100 g mléka. Tukuprostá sušina má referenční hodnoty v rozmezí 8,5 aţ 9 g/100 g mléka. Hladina ve vzorcích byla stanovena na 8,72 aţ 9,26 g/100 g mléka. Počet somatických buněk by neměl být vyšší neţ 400 tis./ml mléka. Počet těchto buněk ve vzorcích byl 77 aţ tis./ml mléka. Bod mrznutí mléka má být vyšší neţ -0,52°C. Ve vzorcích mléka byly tyto hodnoty stanoveny na -0,51 aţ -0,54°C. Koncentrace močoviny se ve vzorcích pohybovala v rozmezí 25 aţ 38 mg/100 ml mléka. Referenční hodnoty této látky jsou stanoveny na 20 aţ 30 mg/100 ml mléka. pH mléka se pohybuje v rozmezí 6,5 aţ 7. V testovaných vzorcích byla tato hodnota stanovena na 6,8 aţ 7. Posledním měřeným parametrem je vodivost. Ta má referenční hodnoty v rozmezí 3,8 aţ 4,5 mS/cm. U vzorků byla vodivost naměřena na 3,3 aţ 4,5 mS/cm. U bazénových vzorků se stanovovala hladina kaseinu, ksyeliny citrónové a volných mastných kyselin. Hladina kaseinu byla 2,5 g/100 g mléka. Kyselina citrónová měla hodnoty odpovídající referenčním, a to 8 mmol/l a volné mastné kyseliny také odpovídaly referenčním hodnotám - 1,3 mmol/l.
3.2 Stanovení stability standardů Kromě glyciteinu, daidzinu, genistinu byla u ostatních jejich stabilita známá. Vzhledem k tomu, ţe metoda byla rozšířená o další látku (glycitin), byla provedena tzv. validace pro tuto širší skupinu, aby se zjistilo, zda je metoda přesná. Bylo tedy nutné ověřit stabilitu těchto čtyřech látek v 100% methanolu. Tento roztok byl připravován z práškových komerčních standardů. Proměřovala se jejich absorbance během pěti dnů, vţdy v deseti replikách u kaţdého. Následně se porovnávala jejich stabilita. Pouze u glycitinu se po testech odlehlosti výsledků musela jedna hodnota absorbance vyřadit. Tato hodnota byla zatíţena hrubou chybou, která mohla být způsobena při odběru vzorku, nebo při následné analýze. Při porovnávání stability jednotlivých sloučenin se zjistilo, ţe tyto látky jsou v 100% methanolu 56
stabilní. V rámci chyb měření, se jejich absorbance drţela ve stejné hladině. Odchylky v měření mohly být způsobeny nepřesností přípravy roztoků, nebo i nepřesností měření. Tím, ţe se nám jejich stabilita potvrdila, značí to, ţe lze si tyto standardy připravit jako zásobní pro následnou přípravu kombinovaných standardů. Standardy byly uchovávány pod atmosférou dusíku, aby se zabránilo přístupu kyslíku při - 20°C. Takto uchované standardy jsou tedy pouţitelné minimálně pět dnů.
3.3 Kontrola preciznosti měření Metoda pouţívaná pro stanovení fytoestrogenů v mléku je jiţ známá, a ověřená. Ale před měřením bylo třeba ověřit její preciznost a mezilehlou preciznost. To se provádí proto, abychom si ověřili, ţe výsledky z měření budou přesné a reprodukovatelné. A ţe tato metoda nemá významnou chybu v měření. Stanovení preciznosti měření probíhalo tak, ţe se porovnávaly výsledky měření 5 totoţných vzorků během jednoho dne. Následně se stanovovala jejich směrodatná odchylka. Při porovnávání hodnot a chyb měření jsme dospěli k závěru, ţe tato metoda je velmi přesná. Odchylky měření byly zanedbatelné. Test mezilehlé preciznosti se prováděl u totoţných vzorků, ale v rámci několika dnů (pěti). Následně se porovnávaly tyto hodnoty. Porovnáním těchto hodnot se nám potvrdila mezilehlá preciznost tohoto měření. Je tedy tato metoda vhodná k měření, které se provádí několik dnů po sobě, a výsledky jsou přesné. Je třeba si uvědomit, ţe pracujeme s biologickými vzorky. Kaţdý vzorek mléka obsahoval mnoţství isoflavonů, nelze zajistit vzorek, který by měl hladinu isoflavonů nulovou, a zároveň by vznikl přírodní cestou.
3.4 Stanovení fytoestrogenů v mléce Stanovení fytoestrogenů v mléce probíhalo u vzorků, které byly odebírány od dvanácti dojnic. První skupina (dojnice č. 1 – 6) byla krmená kukuřičnou siláţí s přídavkem sójového extraktu. Druhá skupina (dojnice č. 7 – 12) byla krmena bez sójového extraktu a slouţila tedy jako kontrolní skupina. Stanovení fytoestrogenů v mléku probíhalo vytřepáváním do ethylacetátu a následnou analýzou na HPLC/MS-TOF. Protoţe daidzein je látka, která se hojně vyskytuje v sóji a jejích produktech, předpokládalo se, ţe hladina daidzeinu by měla být vyšší u skupiny číslo jedna. Stejně tak i hladina equolu, který vzniká působením bakteriální mikroflóry a 57
následně se dostává do mléka, by měla být vyšší u skupiny číslo jedna. Kontrolní skupina by měla mít hladiny těchto látek niţší. Při porovnávání těchto dvou skupin, se nám toto potvrdilo. Zvláště hladina equolu byla u první skupiny dojnic značně vyšší neţ u skupiny druhé – kontrolní. Při porovnání těchto hodnot, se hladina equolu pohybovala u první skupiny v rozmezí 170 – 370 ng/ml. U druhé kontrolní skupiny se tato hladina pohybovala 90 – 150 ng/ml. Je tedy patrné, ţe pokud dojnice budou přikrmovány sójovým extraktem, hladina equolu můţe být aţ dvojnásobná. S tím, ţe se diskutuje o pozitivním účinku na lidské zdraví, je tedy moţné, ţe by mléko mohlo být bohatým zdrojem pro látku equol. Rozptyl koncentrací u hladiny equolu v obou skupinách je způsobený i tím, ţe zahrnuje dva dny odběru. U obou skupin dojnic, probíhal odběr ve dvou dnech – první den po krmení a druhý den po krmení. Tyto hodnoty koncentrace equolu jsme tedy porovnávali v rámci skupiny dojnic a ve dvou dnech. U obou skupin se nám potvrdil pokles hladiny equolu druhý den. Pokud ho tedy srovnáváme s prvním dnem po krmení. Z grafu je patrné, ţe čím vyšší hladina equolu byla první den, o to více klesla jeho koncentrace den druhý. U hladiny equolu, která činila asi 200 ng / ml, pokles druhý den nebyl tak velký. Pokles byl zaznamenán u obou skupin, tedy i u skupiny kontrolní. Při celkovém srovnání, ale hladina equolu byla mírně zvýšena u pokusné skupiny dojnic.
58
4 Závěr U vzorků mléka dojnic holštýnského plemene proběhla kontrola, kde se stanovovalo základní sloţení. U všech vzorků se potvrdili referenční hodnoty těchto sloţek (tuk, bílkovina, laktóza, pH, močovina, bod mrznutí mléka, vodivost, tukuprostá sušina, počet somatických buněk). Mléko tedy splňovalo podmínky pro následnou distribuci. Pro ověření přesnosti pouţívané metody pro stanovení fytoestrogenů v mléku se provedl test preciznosti a mezilehlé preciznosti. Tento test nám potvrdil, ţe metoda je pro toto stanovení přesná. Stejně tak kontrola stability standardů, které byly pouţívané při měření vzorků na HPLC/MS-TOF. Bylo potvrzeno, ţe roztoky glyciteinu, daidzinu, genistinu a glycitinu v 100% methanolu jsou stabilní, a to po dobu minimálně pěti dnů. U ostatních látek (daidzeinu, equolu, genisteinu a 4-HBP) byla stabilita jiţ známá. U stanovování fytoestrogenů v kravském mléku, jsme se zaměřovali hlavně na hladinu equolu. Testovaly se vzorky dojnic, které byly rozděleny do dvou skupin. První skupina dostávala jako krmivo kukuřičnou siláţ s přídavkem sójového extraktu. Druhá skupina slouţila jako kontrolní, a ta dostávala jako krmivo kukuřičnou siláţ bez přídavku sójového extraktu. U první skupiny byly vyšší hladiny daidzeinu, a tedy i jeho metabolitu equolu, coţ se očekávalo. Tím se nám potvrdil fakt, ţe pokud bychom krmili dojnice s přídavkem sóje, mléko by bylo bohatší na equol, který má pozitivní účinky na lidské zdraví. Hladinu equolu ovšem druhý den po krmení klesá, je tedy vhodné vzorky mléka odebírat první den po krmení, pokud jsou ţádoucí vyšší hladiny equolu v mléku.
59
5 Seznam použitých zkratek
4CL
4-kumarát-CoA ligása
4-HBP
4-hydroxybenzophenone
17-β-HSD
17 β-hydroxysteroid dehydrogenása
ATP
adenosintrifosfát
BMM
bod mrznutí mléka
C4H
cinamát-4-hydroxylása
CHR
chalkonreduktása
CHS
chalkonsynthása
DHD
dihydrodaidzein
DNA
deoxyribonukleová kyselina
ER
estrogenní receptor
ERR
estrogen závislý receptor
GDP
guanosindifosfát
GPER
skupina receptorů na cytoplazmatické membráně
GTP
guanosintrifosfát
HID
2-hydroxyisoflavanondehydratása
HPLC
vysokoúčinná kapalinová chromatografie
HRE
hormon represivní jednotka
HSP
heat shock protein
IFS
isoflavon synthasa
LDL
lipoproteiny o nízké hustotě
MS-TOF
hmotnostně
spektrometrický
detektor
s analyzátorem doby letu O-DMA
O-desmethylangolensin
PAL
fenylalaninamoniaklyasa
ROS
reaktivní kyslíkové meziprodukty
SERM
selektivní estrogenní receptory modulátorů
VMK
volné mastné kyseliny
60
6 Seznam literatury 1.
Heldt H-W, Piechulla 2011 B. 16 - Secondary metabolites fulfill specific ecological functions in plants. Plant Biochem. Fourth Ed. [online]. [cit. 2014-10-05]. SanDiego: Academic Press., 399–408.
2.
Krajčová Anna, V. Schulzová, J. Lojza, L. Křížová, J. Hajšlová. Phytoestrogens in bovine plasma and milk – LC-MS/MS analysis. Czech J. Food Sci. 2010. 28: 264-274
3.
Horn-Ross, Pamela L., Marion Lee, Esther M. John, Jocelyn Koo. Sources of phytoestrogen exposure among non-Asian women in California, USA. Kluwer Academic Publishers. Cancer Causes and Control 11. 2000. 299-302.
4.
Velíšek J, Hajšlová J. Chemie potravin I. 3. Vyd. Tábor: OSSIS. 2009; 602 s.
5.
Reynaud J, Guilet D, Terreux R, lussignol M, Walchshofer N. Isoflavonoids in non-leguminous families: an update. Nat. Prod. Rep. 2005; 22(4):504-515
6.
Mazur W, Adlercreutz H. Overview of naturally occurring endocrine-active substances in the human diet in relation to human health. Nutr. Burbank Los Angeles Cty. Calif. 2000;16(7):654–8.
7.
Njastad K. M., Adler S. A., Hansen-Moller J., Thuen E., Gustavsson A. M., Steinshamn H. Gastroinestinal metabolism of phytoestrogens in lactating dairy cos fed silages with different botanical composition. J. Dairy Sci. 2014; 97: 7753 – 7750
8.
Cos P, De Bruyne T, Apers S, Berghe D. V., Pieters L., Vlientick A. J. Phytoestrogens: recent developments. Planta Medica – Nat. Prod. Med. Plant Res. 2003. 69(7):589-599
9.
Lincová D, Farghali H. Základní a aplikovaná farmakologie. 2. vyd. Praha: Galén. 2007; 672 s. ISBN 978-80-7262-373-0.
10.
Ariazi EA, Jordán VC. Estrogen-related receptors as emergingtargets in cancer and metabolit disorders. Curr. Top Med. Chem. 2006; 6:203-215
11.
Dahlman-Wright K, Cavailles V, Fuqua SA et al. Estrogen receptors. International Union of Pharmacology. LXIV. Pharmacol.Rev. 2006; 58:773–781
12.
Slíva Jiří. Receptory pro estrogen a strukturně podobné molekuly. Moderní babictví 19. 2010. www.levret.cz
13.
Ibarreta D, Daxenberger A, Meyer HH. Possible health impal of phytoestrogens and xenoestrogens in food. Apmis. 2001; 109(S103):402-425
14.
Baber R. Phytoestrogens and post reproductive health. Maturitas. 2010; 66(4):344349 61
15.
Duffy Ch., Perez K., Partridge A. Implications of Phytoestrogen Intake for Breast Cancer. CACancer J. Clin. 2007. 57: 260 – 277
16.
Sathyamoorthy N., Wang T. T. Y. Differntial Effects of Dietary Phytoestrogens Daidzein and Equol on Human Breast Cancer MCF-7 Cells. Eur J. Cancer. 1997. Vol. 33, No. 14, pp. 2384 – 2389
17.
Pavesse J. M., Farmer R. L., Bergan R. L. Inhibition of cancer cell invasion and metastasis by genistein. Cancer Metastasis Rev. 2010. 29: 465-482
18.
Knight D. C., eden J. A. Phytoestrogens – a short review. Maturitas. 1995. 22: 167175
19.
Heinonen, S. M., Hoikkala, A., Wähälä, K. & Adlercreutz, H. Metabolism of the soy isoflavones daidzein, genistein and glycitein in human subjects. Identification of new metabolites having an intact isoflavonoid skeleton. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. (2003): 87, 285-299
20.
Oseni T., Patel R. Pyle J., Jordan V. C. Selective Estrogen receptor Modulators and phytoestrogens. Planta Med. 2008. 74(13): 1656-1665
21.
Theil C., Briese V., Gerber B., Richter D. U. The effects of different-positive and negative breast cancer carcinoma cells in vitro. Arch Gynecol obstet. 2010. DOI: 10.1007/s00404-010-1661-4
22.
Shao, S. et al. Tracking isoflavones: From soybean to soy flour, soy protein isolates to functional soy bread. J. Funct. Food 1. 2009. 119-127
23.
Nakamura Y, Tsuji S, Tonogai Y. Determination of the levels of isoflavonoids in soybeans and soy-derived fous and estimation of isoflavonoids in the Japanese daily intake. J. Aoac Int. 2000; 83(3):635-644
24.
Setchell KD, Brown NM, Desai P. Zimmer-Nechemias l, Wolfe BE, Brashear WT, et al. Biovailability of pure isoflavones in healthy humus and analysis of comercial soy isoflavone supplements. J. Nutr. 2001; 131(4):1362-1375
25.
Kim M, Han J, Kim S-U. Isoflavone daidzein: chemismy and bacterial metabolism. J. Appl. Biol. Chem. 2008; 51:253-61.
26.
Setchell K. D., Clerici C. Equol: history, chemismy and formativ. J. Nutr. 2010; 140(7): 1355-1362
27.
Setchell K. D., Clerici C. Equol: pharmacokinetics and biological actions. J. Nutr. 2010; 140(7): 1363 – 1368.
28.
Setchell K. D., Clerici C., Lephart E. D., Cole S. J., hexan C., Castellani D., at al. S-equol, a potent ligand for estrogen receptor β, is the exklusive enantiomeric form of 62
the soy isoflavone metabolite produced by human intestinal bacterial flora. Am. J. Clin. Nutr. 2005; 81(5): 1072-1079 29.
Tsen S. Y., Siew J., Lau E. K. L., Roslee F. A., Chan H. M., Loke W. M. Cow´s milk as a dietary source of equol and phenolic antioxidants: differential distribution in the milk aqueous and lipid fractions. Dairy Sci. & Technol. 2014; 94:625-632
30.
Suzuki Y., Hisada A., Yoshinaga J. Inter- and intra-individual variation in urinary excretion of daidzein and equol in fiale Japanese. Informa Healthcare. 2014. ISSN: 1354-750X
31.
Wilkinson A. P., Wahala K., Williamson. Identification and quantification of polyphenol phytoestrogens foods and human biological fluids. Journal of Chromatography B (2002): 777:93-109
32.
Ceballos L. S., Morales E. R., de la Torre Adarve G., Castro J. D., Martínez L. P., Sampelayo M. R. S. Composition of goat and cow milk produced under similar conditions and analyzed by identical methodology. J. Food Compos. Anal. 2009; 22(4):322–9.
33.
Jensen R. G. Handbook of milk composition. Academic press.1995; 919 s. ISBN 0080533116.
34.
Fox P. F., McSweeney P. L. Dairy chemistry and biochemistry. Chapman & Hall. 1998; 478 s. ISBN: 0412720000.
35.
Swaisgood H. E. Enzymes idigenous to bovine milk. In: Jensen, R. G.: Handbook of milk composition. Academic Press San Diego, 1995: 472.
36.
Slavík P., Illek J., Matějíček M., Klouda Z. Mléko jako ukazatel zdraví dojnic – bílkoviny. Veterinářství 2004; 54: 459-464.
37.
Hurtaud C. Effect of infused volatile fatty-acids and caseinate on milk-composition and coagulation in dairy cows. J Dairy Sci. 1993; 76(10): 3011-3020.
38.
Bequette B. J. Current concepts of amino acids and protein metabolism in the mammary gland of the lactating ruminant. J Dairy Sci 1998; 81(9):2540-2559.
39.
Illek J. Výţiva a zdraví vysokoprodukčních dojnic. Sborník z odborného semináře Veteduca, spol. s r. o.; Brno, 2002:7-9.
40.
Jelínek P. Sekrece mléka. In: Fyziologie hospodářských zvířat. MZLU Brno; Brno, 2003: 344-348.
41.
Jelínek P, Koudela K. Fyziologie hospodářských zvířat, MZLU v Brně. 2003; 351s. ISBN-80-7157-644-1.
63
42.
Boisgard R., Chanat E., Lavialle F., Pauloin A., Ollivier-Bousquet M. Roads taken by milk proteins in mammary epithelial cells. In: Livestock production science, 2001:49-61
43.
Davis TA, Nguyen HV, Garcia-Bravo R, Fiorotto ML, Jackson EM, Lewis DS. Amino Acid Composition of Human Milk Is Not unique1’2’3. Am. J. Nutr.1994; 0022-3166/94
44.
Costa, M. P., Balthazar, C. F., Rodrigues, B. L., Lazaro, C. A., Silva, A. C. O., Cruz, A. G. and Conte Junior, C. A. Determination of biogenic amines by highperformance liquid chromatography (HPLC-DAD) in probiotic cow's and goat's fermented
milks
and
acceptance.
doi: 10.1002/fsn3.200
64
Food
Science
&
Nutrition.
2015
