Opsporen van K-RAS mutaties op colontumoren

Opsporen van K-RAS mutaties op colontumoren

Woord vooraf Dit eindwerk is tot stand gebracht in het AZ Sint-Jan Brugge - Oostende AV - campus Sint-Jan op de dienst pathologische anatomie. Het handelt over de detectie van K-RAS mutaties op colontumoren. Deze detectie is uitermate belangrijk en bepaald mede of patienten al dan niet in aanmerking komen voor een recent ontwikkelde behandeling, uitvoerig beschreven in dit script. Graag zou ik van dit woord vooraf gebruik willen maken om een aantal mensen te bedanken die een bijdrage geleverd hebben in het tot stand brengen van dit werk. Eerst en vooral wil ik mijn stagementor Dr. Jacques Van Huysse bedanken voor de deskundige begeleiding gedurende het onderzoek en het kritisch evalueren van de tekst, alsook de medewerkers van de firma Roche Diagnostics voor de professionele informatie en uiteenzettingen. Daarnaast Thierry Pont, hoofdlaborant, voor de opvolging van de werkzaamheden gedurende het routineproces van de stage. Verder wil ik nog iedereen van het labo pathologische anatomie bedanken voor de boeiende en leerzame stageperiode. Natuurlijk wil ik ook aan alle lectoren, in het bijzonder mijn stagebegeleider en promotor mevr. Nicole Kellner, mijn dank betuigen voor de steun en begeleiding gedurende de volledige opleiding. Een kritische reflectie kwam steeds goed van pas. Niet te vergeten wil ik zeker een dankwoordje tot mijn klasgenoten en vrienden richten voor de drie leuke, gezellige en onvergetelijke jaren, zowel binnen als buiten de schoolmuren. Tevens wens ik ook mijn ouders en broer te bedanken die mij de mogelijkheid geboden hebben deze studierichting te volbrengen en mij steeds gesteund en aangemoedigd hebben als het met periodes wat moeilijker werd. Tot slot richt ik graag een speciaal woordje van dank aan mijn vriend Koen die steeds alles van zichzelf gegeven heeft om er voortdurend voor mij te zijn in deze voor ons beiden moeilijke thesisperiode. Om die reden hoor jij niet onderaan in deze rij te staan, ook niet bovenaan, maar erboven. En daar sta je ook voor mij, in vele opzichten.

1


Samenvatting Colorectaal carcinoom is in onze moderne wereld een steeds vaker optredende aandoening. Na long-, borst- en prostaatcarcinoom is het de meest optredende vorm van kanker met daarenboven een significante mortaliteit. Bij elke vorm van kanker kunnen bepaalde omstandigheden het risico op de ziekte vergroten. In de meeste gevallen ontstaat dikkedarmkanker onder invloed van een combinatie van genetische factoren en omgevingsoorzaken zoals slechte leef- en eetgewoontes. De genetische factoren die een rol spelen bij de ontwikkeling tot kanker zijn mutaties die in een vaste volgorde ontstaan. Door deze mutaties kunnen goedaardige poliepen ontaarden in een kwaadaardig gezwel dat zich later verder kan uitzaaien. De evolutie van normaal slijmvlies tot een zich uitzaaiende kanker is momenteel zeer goed gekend voor veel gevallen van darmkanker. Dit biedt uitstekende mogelijkheden om de ontwikkeling ervan te voorkomen. Verbeterde inzichten in de moleculaire processen die rol spelen bij kankerontwikkeling bieden de mogelijkheid nieuwe geneesmiddelen te vervaardigen die specifieker inwerken op de kankercellen. Een recente behandeling is deze met epidermale groeifactor receptor (EGFR) remmers die de kankercel verhinderen te groeien en te delen. Deze recente therapie is echter niet toepasbaar indien er bij de patiënt sprake is van een K-RAS mutatie. Dergelijke mutaties zorgen er namelijk voor dat de kanker evolutie niet geïnhibeerd wordt door anti-EGFR behandeling. Het is dus belangrijk na te gaan of een K-RAS mutatie al dan niet aanwezig is zodat er kan uitgemaakt worden of een EGFR-remmerbehandeling voor de betrokken patiënt nuttig is. De K-RAS mutaties worden hier opgespoord met behulp van een mutatiekit die het mogelijk maakt zeven somatische mutaties te detecteren via ‘real time’-PCR met de LightCycler®480. De K-RAS kit moet worden gebruikt met DNA-monsters die zijn geëxtraheerd uit in paraffine ingebed colorectaal tumorweefsel. Deze extractie gebeurt met de MagNA Pure LC 2.0 die instaat voor de automatische isolatie van nucleïnezuren. Voorafgaand aan het extractieproces moeten de te gebruiken paraffinecoupes gedeparaffiniseerd worden. Deze deparaffinisatieprocedure werd op vier verschillende manieren uitgetest. Enerzijds werd er gebruik gemaakt van coupes die eerst op glaasjes werden gebracht alvorens in epjes over te brengen, anderzijds coupes die onmiddellijk in een epje werden gebracht. Deze twee manieren werden beide uitgevoerd eens met één coupe en eens met twee 2


coupes. Door de experimentele resultaten te vergelijken met deze die verwacht worden kan men uitmaken of zowel de MagNA Pure als de LightCycler functioneel voldoen om betrouwbare resultaten af te leveren. Het protocol waarbij er slecht één coupe gebruikt wordt is uit experimentele bevindingen het meest aangewezen. Er gebeurt hier namelijk een nauwkeuriger extractie door de MagNa Pure omdat er minder weefsel aanwezig is. Hierdoor is er ook minder kans op inhibitie van de amplificatie wat correcter resultaten oplevert. Er zijn geen verschillen in nauwkeurigheid tussen het gebruik van coupes rechtstreeks in epjes of coupes eerst op glaasjes. Wel is het zo dat coupes op glaasjes minder tijdverlies veroorzaken doordat er minder incubatie tijdens de deparaffinisatie vereist is. Een cruciale stap in de analyse is de bereiding van de mastermixen. Deze moeten zeer goed gemengd en nauwkeurig overgepippetteerd worden wil men geen inhibitie krijgen van de interne controle. Als bepaalde componenten van de mastermixen namelijk niet aanwezig zijn kan de amplificatie niet correct verlopen en kunnen de resultaten niet als betrouwbaar aangenomen worden. Daarnaast is het ook aangewezen om de exacte DNA concentratie van de extracten te achterhalen daar een te hoge of te lage concentratie problemen veroorzaakt bij de analyse. Deze bevindingen in acht houdend kan er algemeen besloten worden dat deze methode ter opsporing van K-RAS mutaties op colontumoren in een relatief snelle tijd betrouwbare resultaten aflevert.

3


Lijst met afkortingen en symbolen 5-FU APC ARMS Ct CT DNA EGF EGFR FAP FCC FOBT HNPCC

5-Fluorouracil; cytostatica Adenomateuze Polyposis Coli Amplification refractory mutation system Cycle threshold Computertomografie Desoxyribonucleïnezuur Epidermale groeifactor Epidermale groeifactor receptor Familiale adenomateuze polyposis Familiale colorectaal carcinoom Fecal occult blood test Hereditaire non polyposis colorectaal car-

IBD MGP MMR MoAb NTC MRI NSAID’s

cinoom Inflammatory bowel disease Magnetische glaspartikels Mismatch repair Monoklonaal antilichaam Negatieve controle Magnetic resonance imaging Non-steroidal anti-inflammatory drugs; ontstekingsremmend geneesmiddel met een pijnstillend en koortsverlagend effect.

PCR STD TKI TNM TP53 WT

Polymerase chain reaction Standaard reactiemix Tyrosine kinase inhibitoren Tumour nodes metastases Tumor proteïn 53 Wildtype DNA

4


Verklarende woordenlijst Acromegalie

Acromegalie is een zeldzame niet aangeboren aandoening van de hypofyse waarbij er zich, een meestal goedaardige, tumor ontwikkeld. De aandoening ontstaat als de tumor zich ontwikkelt in het deel van de

Adenoom

hypofyse dat groeihormoon produceert. Goedaardig gezwel die ontstaat uit epitheliaal kierweefsel.

Appendix vermiformix ARMS-primer

Wormvormig aanhangsel Mutatiespecifieke ‘forward’ primer die de

Amplicon Carcinoom

aanwezigheid van een mutatie identificeert. Wat men wil amplificeren. Kwaadaardige woekering van epitheelcel-

Chaotropisch zout

len. Bevat een kation en een anion die beide zorgen voor het verbreken van de waterstofbruggen in water. Hierdoor verminderd het hydrofiele karakter van het water, waardoor opgeloste eiwitten denatureren. Door snelle denaturatie van RNases wordt

Caecum Colitis ulcerosa

RNA afbraak voorkomen. (pH>7) Blinde darm Chronische ontsteking van het dikkedarmslijmvlies. In tegenstelling tot de ziekte van Crohn komt het alleen in het colon voor. Colitis ulcerosa begint altijd in de endeldarm en kan zich langzaam over de hele

Cytostatica

dikke darm uitbreiden. Geneesmiddel met remmende werking op

Duodenum

de celdeling. Twaalfvingerige darm; eerste gedeelte van de dunne darm. 5


Dysplasie

Het zich ongewoon ontwikkelen en groeien

Ileum

van weefsel. Kronkeldarm; laatste gedeelte van de dun-

Jejunum

ne darm. Nuchtere darm; middelste gedeelte van de

Lamina propria

dunne darm. Laag van losmazig bindweefsel waarop de basissen van de kliercellen zijn ingeplant. Bevindt zich in de slijmlaag. Bevat ook nog

Linkszijdige colitis

lymfe- en bloedvaten. Ontsteking van het colon vanaf de flexura

Microvilli

lienalis. Microscopisch kleine uitstulpingen in de apicale celmembraan van het darmepitheel op de darmvlokken.

Mucines Mucosa Muscularis mucosa Pancolitis

Slijmstoffen Slijmvlieslaag Slijmvlieslaag met spieren Colitis waarbij de volledige dikke darm is

Peritoneum Quencher

aangetast. Buikvlies Dooft een groot deel van het uitgezonden

Rectum Reporter

licht door de reporter. Endeldarm Fluorofoor; stuurt fluorescerend licht uit indien hij aangestraald wordt met de juiste golflengte.

Scorpion-primer

Gemeenschappelijke ‘reversed’ primer die de aanwezigheid van een mutatie signaliseert.

Slokdarmvarices

Gezwollen spataderen in de wanden van

Stoma

de slokdarm. Kunstmatige uitgang van de darm via de

Submucosa

buikwand. Bindweefsellaag onder de mucosa, bevat bloedvaten, lymfevaten en zenuwen. 6


Synchrone tumoren Ureterosigmoïdostomie

Meerdere tumoren tegelijk Het aanleggen van een kanaal tussen het sigmoïd en de urineleider tijdens een operatie.

Villi

Darmvlokken; darmuitstulpingen die zorgen

Ziekte van Crohn

voor oppervlaktevergroting. Chronische ontsteking van de slijmvliezen van het maag-darmkanaal. Meestal zijn de dunne en/of dikke darm getroffen, maar ook de mond, anus of andere slijmvliezen kunnen aangedaan zijn.

7


Lijst van tabellen en figuren Figuur 2-1: Anatomie van de dikke darm (5) .....................................................................19 Figuur 2-2: Ontwikkeling van dikdarmkanker volgens het Vogelstein model (7) ...............22 Figuur 2-3: Poliep zichtbaar gemaakt met CT-colografie (driedimensionale weergave) (12) ...........................................................................................................................................26 Figuur 2-4: De functie van MoAb, TKI en K-RAS mutaties in de EGFR signalisatie pathway A) Binding van ligand op EGFR verzoorzaakt activatie van de pathway B) In de aanwezigheid van TKI of MoAb zal de signalisatie pathway niet geactiveerd worden C) Als er K-RAS mutaties aanwezig zijn zal de pathway niet geinhibeerd worden in aanwezigheid van TKI of MoAb (21).........................................................................................................31 Figuur 2-5: Mechanismen voor EGFR inhibitie (30) ..........................................................32 Figuur 2-6: Binding van de Scorpion-primer/probe (31) ....................................................35 Figuur 2-7: Aanwezigheid van een blocker verhindert een vals detectiesignaal ...............36 Figuur 2-8: Typische PCR amplificatiegrafiek (26) ............................................................37 Figuur 2-9: De ∆Ct-waarden van het monster worden berekend als het verschil tussen de Ct van de mutatieassay en de Ct van de controleassay van hetzelfde monster ..............37 Figuur 3-1: Beginscherm MagNA Pure LC 2.0 software....................................................43 Figuur 3-2: 'Sample ordering screen'.................................................................................44 Figuur 3-3: 'Stage setup screen' ........................................................................................45 Figuur 3-4: Geautomatiseerde DNA isolatie (25)...............................................................45 Figuur 3-5: 'Batch status screen' .......................................................................................46 Figuur 3-6: Result screen ..................................................................................................47 Figuur 3-7: Beginscherm LightCycler® 480 software ........................................................49 Figuur 4-1: Resultaat eerste run patiënt 1 en 2, protocol A en B bij beide methodes .......52 Figuur 4-2: Resultaat run patiënt 1 en 2 controle reactiemix, protocol A en B bij beide methodes ...........................................................................................................................53 8


Figuur 4-3: Interne controle bij run patiënt 1 en 2 controle reactiemix, protocol A en B bij beide methodes .................................................................................................................54 Figuur 4-4: Resultaat run patiënt 1 - 2 - 3, methode 1 protocol A en B .............................55 Figuur 4-5: Amplificatiecurve staal 3-1A ............................................................................56 Figuur 4-6: Resultaat interne controle run patiënt 1 - 2 - 3, methode 1 protocol A en B ...57 Figuur 4-7: Resultaat run patiënt 1 - 2 - 3 - 4 - 5, methode 2 protocol A en B...................58 Figuur 4-8: Resultaat interne controle run patiënt 1 - 2 - 3 - 4 - 5, methode 2 protocol A en B ........................................................................................................................................60 Figuur 4-9: Resultaat run patiënt 6 - 8 - 9 - 10, methode 2 protocol A en B ......................61 Figuur 4-10: Resultaat interne controle run patiënt 6 - 8 - 9 - 10, methode 2 protocol A en B ........................................................................................................................................62 Figuur 4-11: Resultaat run patiënt 1 - 2 - 3 - 4 - 5, methode 2 protocol A en B, 1/2 verdund ...........................................................................................................................................64 Figuur 4-12: Resultaat interne controle run patiënt 1 - 2 - 3 - 4 - 5, methode 2 protocol A en B, 1/2 verdund ..............................................................................................................66 Figuur 4-13: Resultaat run patiënt 6 - 8 - 9 - 10, methode 2 protocol A en B, ½ verdund 67 Figuur 4-14: Resultaat interne controle run patiënt 6 - 8 - 9 - 10, methode 2 protocol A en B, ½ verdund .....................................................................................................................69 Figuur 4-15: Interne controle patiënt 6; links = 1 coupe/tube; rechts = 2 coupes/tube ......70 Figuur 4-16: Interne controle patiënt 8; links = 1 coupe/tube; rechts = 2 coupes/tube ......70 Figuur 4-17: Interne controle patiënt 9; links = 1 coupe/tube; rechts = 2 coupes/tube ......70 Figuur 4-18: Interne controle patiënt 10; links = 1 coupe/tube; rechts = 2 coupes/tube ...71 Figuur 4-19: Resultaat run patiënt 8 - 9 - 10, methode 1 protocol A en B ........................72 Figuur 4-20: Resultaat interne controle voor exon 4 bij run patiënt 8 - 9 - 10, methode 1 protocol A en B ..................................................................................................................73 Figuur 4-21: Interne controle patiënt 8; links = 1 coupe/glaasje; rechts = 2 coupes/glaasje ...........................................................................................................................................74 9


Figuur 4-22: Interne controle patiënt 9; links = 1 coupe/glaasje; rechts = 2 coupes/glaasje ...........................................................................................................................................74 Figuur 4-23: Interne controle patiënt 10; links = 1 coupe/glaasje; rechts = 2 coupes/glaasje ...........................................................................................................................................74

Tabel 2-1: Stadiumindeling op basis van TNM- en Dukes-classificatiesysteem................20 Tabel 2-2: Door de kit gedetecteerde K-RAS mutaties......................................................33 Tabel 2-3: Verwachte ∆Ct waarden ...................................................................................38 Tabel 2-4: 1% Cut-off waarden..........................................................................................38 Tabel 3-1: Onderzochte patiënten met te verwachten mutatiestatus ................................39 Tabel 3-2: Bereiding van de reactiemixen voor 1 reactie ..................................................48 Tabel 3-3: Pipetteershema voor de LightCycler® 480 plaat met de verschillende reactiemixen en stalen.......................................................................................................48 Tabel 3-4: Instellingen aantal cycli, temperatuur en tijd voor de activatie-, amplificatie-, en coolingstap.........................................................................................................................50 Tabel 4-1: Ct-waarden bij controle reactiemix ...................................................................53 Tabel 4-2: Ct-waarden interne controle bij controle reactiemix .........................................54 Tabel 4-3: Ct-waarden run patiënt 1 - 2 - 3, methode 1 protocol A en B ...........................55 Tabel 4-4: delta Ct-waarden run patiënt 1 - 2 - 3, methode 1 protocol A en B ..................55 Tabel 4-5: Mutatiestatus patiënt 1 - 2 - 3 ...........................................................................56 Tabel 4-6: Ct-waarden interne controle run patiënt 1 - 2 - 3, methode 1 protocol A en B .57 Tabel 4-7: Ct-waarden run patiënt 1 - 2 - 3 - 4 - 5, methode 2 protocol A en B.................58 Tabel 4-8: delta Ct-waarden run patiënt 1 - 2 - 3 - 4 - 5, methode 2 protocol A en B........59 Tabel 4-9: Mutatiestatus patiënt 1 - 2 - 3 - 4 - 5.................................................................59 Tabel 4-10: Ct-waarden interne controle run patiënt 1 - 2 - 3 - 4 - 5, methode 2 protocol A en B ...................................................................................................................................60 10


Tabel 4-11: Ct-waarden run patiënt 6 - 8 - 9 - 10, methode 2 protocol A en B..................61 Tabel 4-12: delta Ct-waarden run patiënt 6 - 8 - 9 - 10, methode 2 protocol A en B .........61 Tabel 4-13: Mutatiestatus patiënt 6 - 8 - 9 - 10..................................................................62 Tabel 4-14: Ct-waarden interne controle run patiënt 6 - 8 - 9 - 10, methode 2 protocol A en B ........................................................................................................................................63 Tabel 4-15: Mutatiestatus patiënt 6 - 8 - 9 - 10 volgens de LightCycler® Adapt Software 63 Tabel 4-16: Ct-waarden run patiënt 1 - 2 - 3 - 4 - 5, methode 2 protocol A en B, 1/2 verdund..............................................................................................................................64 Tabel 4-17: delta Ct-waarden run patiënt 1 - 2 - 3 - 4 - 5, methode 2 protocol A en B, 1/2 verdund..............................................................................................................................65 Tabel 4-18: Mutatiestatus patiënt 1 - 2 - 3 - 4 - 5...............................................................65 Tabel 4-19: Ct-waarden interne controle run patiënt 1 - 2 - 3 - 4 - 5, methode 2 protocol A en B, 1/2 verdund ..............................................................................................................66 Tabel 4-20: Ct-waarden run patiënt 6 - 8 - 9 - 10, methode 2 protocol A en B, ½ verdund ...........................................................................................................................................67 Tabel 4-21: delta Ct-waarden run patiënt 6 - 8 - 9 - 10, methode 2 protocol A en B, ½ verdund..............................................................................................................................68 Tabel 4-22: Mutatiestatus patiënt 6 - 8 - 9 - 10..................................................................68 Tabel 4-23: Mutatiestatus patiënt 6 - 8 - 9 - 10 volgens de LightCycler® Adapt Software 69 Tabel 4-24: Ct-waarden run patiënt 8 - 9 - 10, methode 1 protocol A en B ......................72 Tabel 4-25: delta Ct-waarden run patiënt 8 - 9 - 10, methode 1 protocol A en B .............72 Tabel 4-26: Mutatiestatus patiënt 8 - 9 - 10 .......................................................................73

11


Inhoudsopgave Woord vooraf .....................................................................................................................1 Samenvatting .....................................................................................................................2 Lijst met afkortingen en symbolen ..................................................................................4 Verklarende woordenlijst ..................................................................................................5 Lijst van tabellen en figuren .............................................................................................8 Inhoudsopgave ................................................................................................................12 1

Inleiding, situatieschets en probleemstelling .................................................16

2

Literatuurstudie .................................................................................................18

2.1

Anatomie van het colon .......................................................................................18

2.2

Voorkomen ..........................................................................................................19

2.3

Prognose .............................................................................................................20

2.4

Ontstaan ..............................................................................................................21

2.5

Screening.............................................................................................................22

2.5.1

Fecesonderzoek ..................................................................................................22

2.5.2

2.5.3

2.5.1.1

Lekkende markers..................................................................................23

2.5.1.2

Uitgescheiden markers ..........................................................................24

2.5.1.3

Afgeschilferde markers ..........................................................................24

Endoscopische onderzoeken...............................................................................24 2.5.2.1

Recto-sigmoïdoscopie............................................................................24

2.5.2.2

Totale colonoscopie ...............................................................................24

Beeldvormend onderzoek....................................................................................25 2.5.3.1

Colon-inloop foto ....................................................................................25

2.5.3.2

Colografie...............................................................................................25

2.6

Risicofactoren ......................................................................................................27

2.6.1

Erfelijke vormen ...................................................................................................27

2.6.2

Familiaal colorectaal carcinoom (FCC)................................................................27 12


2.6.3

Aandoeningen met een verhoogd risico op colorectaal carcinoom .....................28 2.6.3.1

Inflammatoire darmziekten .....................................................................28

2.6.3.2

Acromegalie en ureterosigmoïdostomie.................................................28

2.6.3.3

Adenomateuze poliepen en dikkedarmkanker in de voorgeschiedenis .28

2.7

Symptomen..........................................................................................................28

2.8

Behandeling.........................................................................................................29

2.8.1

Chirurgie ..............................................................................................................29

2.8.2

Radiotherapie ......................................................................................................30

2.8.3

Chemotherapie ....................................................................................................30

2.8.4

’Targeted’ therapie...............................................................................................30 2.8.4.1

TKI..........................................................................................................31

2.8.4.2

MoAb ......................................................................................................32

2.9

Extractie (25) ..........................................................................................................32

2.10

TheraScreen® K-RAS mutatiekit .........................................................................33

2.10.1

ARMS ..................................................................................................................34

2.10.2

Scorpions ............................................................................................................34

2.10.3

‘Real time’-PCR...................................................................................................36

3

Materiaal en methode ........................................................................................39

3.1

Selectie paraffinecoupes .....................................................................................39

3.2

Benodigdheden....................................................................................................39

3.3

Deparaffinisatieprocedure....................................................................................41

3.3.1

Methode 1: Paraffinecoupes (5-10 µm) op objectglaasjes ..................................41

3.3.2

Methode 2: Paraffinecoupes (5-10 µm), gesneden en direct in 1,5 mL eppendorf

tubes gebracht ...................................................................................................................42 3.4

Extractie (25) ..........................................................................................................43

3.4.1

‘Software main screen’ ........................................................................................43

3.4.2

‘Sample ordering screen’ .....................................................................................43

3.4.3

‘Stage setup screen’ ............................................................................................44

3.4.4

Geautomatiseerde DNA-isolatie ..........................................................................45

3.4.5

‘Batch status screen’............................................................................................46

3.4.6

‘Result screen’ .....................................................................................................46 13


3.5

PCR .....................................................................................................................47

3.5.1

TheraScreen® K-RAS mutatiekit .........................................................................47 3.5.1.1

Bereiding van de verschillende mastermixen.........................................48

3.5.1.2

Pipetteren van de LightCycler® 480 plaat volgens onderstaand schema 48

3.5.2

LightCycler® 480 .................................................................................................49 3.5.2.1

PCR programma ....................................................................................49

3.5.2.2

Monsteranalyse......................................................................................50

4

Resultaten en discussie....................................................................................52

4.1

Legende...............................................................................................................52

4.2

Patiënt 1 en 2 (Methode 1 en 2, protocol A en B)................................................52

4.3

Patiënt 1 en 2 (Methode 1 en 2, protocol A en B voor controle reactiemix).........53

4.4

Patiënt 1 - 2 - 3 (Methode 1, protocol A en B) .....................................................55

4.5

Patiënt 1 - 2 - 3 - 4 - 5 (Methode 2, protocol A en B) ...........................................58

4.6

Patiënt 6 - 8 - 9 - 10 (Methode 2 protocol A en B) ...............................................61

4.7

Patiënt 1 - 2 - 3 - 4 - 5 (Methode 2 protocol A en B ½ verdund) ..........................63

4.8

Patiënt 6 - 8 - 9 - 10 (Methode 2 protocol A en B ½ verdund) .............................67

4.9

Patiënt 8 - 9 - 10 (Methode 1 protocol A en B) ....................................................71

5

Conclusie............................................................................................................75

Literatuurlijst....................................................................................................................77 Bijlagen.............................................................................................................................80 Bijlage I – LightCycler® Adapt Software rapport patiënt 1, 2 en 3 methode 1, protocol A en B. .......................................................................................................................................81 Bijlage II – LightCycler® Adapt Software rapport patiënt 1, 2, 3, 4 en 5 methode 2, protocol A en B. .................................................................................................................85 Bijlage III – LightCycler® Adapt Software rapport patiënt 6, 8, 9 en 10 methode 2, protocol A en B. ...............................................................................................................................89 Bijlage IV – LightCycler® Adapt Software rapport patiënt 1, 2, 3, 4 en 5 methode 2, protocol A en B, ½ verdund. ..............................................................................................93

14


Bijlage V – LightCycler® Adapt Software rapport patiënt 6, 8, 9 en 10 methode 2, protocol A en B, ½ verdund. ............................................................................................................98 Bijlage VI – LightCycler® Adapt Software rapport patiënt 8, 9 en 10 methode 1, protocol A en B. ................................................................................................................................102 Slotwoord .......................................................................................................................106 Voor akkoord verklaring ...............................................................................................107

15

Opsporen van K-RAS mutaties op colontumoren Literatuurstudie

1

Inleiding, situatieschets en probleemstelling

Dikkedarmkanker of colorectale kanker is één van de meest voorkomende kankers in Vlaanderen met een overlijdingskans van ongeveer 50%. Ongezonde leefgewoonten zoals weinig groenten en fruit, onvoldoende vezels, veel vet en roken verhogen het risico op dikkedarmkanker. Dikkedarmkanker begint in de meeste gevallen met een goedaardige poliep die kan uitgroeien tot een kwaadaardig gezwel, dat later verder kan uitzaaien. Hoe gezond weefsel ontaard en tot een tumor evolueert is momenteel zeer goed gekend voor veel gevallen van darmkanker. Dit biedt uitstekend mogelijkheden om de ontwikkeling ervan te voorkomen. Door verbeterde inzichten in de moleculaire mechanismen die een rol spelen bij het ontstaan van kanker kunnen nieuwe middelen worden ontwikkeld die specifieker inwerken op de kankercellen. De meest recente ontwikkeling hierbij is de behandeling met tyrosine kinase inhibitoren (TKI) en monoklonale antilichamen (MoAb). Door in te werken op de epidermale groeifactor receptor (EGFR) verhinderen ze de kankercel om te groeien en delen. Deze therapie is echter niet toepasbaar bij alle gevallen van dikkedarmkanker daar er ook resistentie bestaat tegen de gebruikte therapeutica. De aanwezigheid van K-RAS mutaties correleert namelijk met een afwezigheid aan respons op bepaalde behandelingen met TKI en MoAb. Het is dus belangrijk om na te gaan of een K-RAS mutatie al dan niet aanwezig is. Op deze manier hoeven patiënten die geen baat hebben bij de dure EGFR-remmerbehandeling niet onnodig te leiden aan eventueel toxische neveneffecten en kan er gezocht worden naar de beste alternatieve behandelingsmethode. Op de dienst pathologische anatomie in het AZ Sint-Jan Brugge - Oostende AV - campus Sint-Jan wordt het praktisch gedeelte van dit eindwerk tot uitvoering gebracht. De K-RAS mutatiestatus van patiënten met colorectale kanker wordt beoordeeld met behulp van DNA-monsters geëxtraheerd uit in paraffine ingebed colorectaal tumorweefsel. Deze extractie gebeurt met behulp van de MagNA Pure LC 2.0, een nieuw instrument dat instaat voor de automatische isolatie van nucleïnezuren afkomstig van verschillende types biologisch materiaal met behulp van speciaal ontwikkelde kits. Na de extractie worden eventueel aanwezige mutaties opgespoord door gebruik te maken van een kit die de detectie van zeven mutaties in het K-RAS gen mogelijk maakt op een achtergrond van wildtype DNA in een ‘real time’-PCR assay. De LightCycler ® 480 is een ‘real time’-PCR toestel die 16


hier gebruikt wordt voor het opsporen van de K-RAS mutaties. Van een reeks patiënten waarvan de mutatiestatus reeds gekend is worden de mutaties opgespoord met behulp van deze twee nieuwe instrumenten. De bekomen resultaten worden vergeleken met de verwachte en hieruit kan nagegaan worden of zowel de MagNA Pure LC 2.0 als de LightCycler® 480 in staat zijn om een correcte analyse te leveren. De resultaten van de mutatiedetectie zijn bedoeld als hulp voor de arts bij het identificeren van patiënten met colorectaal carcinoom die mogelijk geen baat hebben bij een behandeling met anti-EGFR.

17


2

Literatuurstudie

2.1

Anatomie van het colon

Onmiddellijk na de maag begint het eerste deel van de darm, het duodenum. Deze gaat over in het jejunum en ileum en vervolgens in het colon. Op de overgang bevind zich de ileo-caecale klep, ook klep van Bauhin genoemd, die voorkomt dat de darminhoud van de dikke darm naar de dunne darm teruggaat. De dikke darm bestaat uit 5 delen. Het caecum bevindt zich rechts onder in de buik en vormt het begin van de dikke darm. Aan het caecum zit het de appendix vermiformis. Dit is de eigenlijke dikke darm en is het grootste deel. Aan de rechterzijde van de buik loopt het opstijgende deel, het colon ascendens, tot aan de lever. Ter hoogte van de lever is er een bocht naar links, de flexura hepatica, die overgaat in het dwarslopende deel of colon transversum. Aan de linker zijde van de buik ter hoogte van de milt is er opnieuw een bocht, de flexura lienalis. Hier gaat het colon transversum over in het colon descendens. Deze gaat vervolgens over in het s-vormige deel of sigmoïd. Het sigmoïd gaat over in het rectum, het laatste deel van de dikke darm die eindigt met de sluitspier of anus. De totale lengte van de dikke darm is ongeveer anderhalve meter. De dikke darm ligt in de buikholte en is grotendeels omgeven door het peritoneum. De wand van de dikke darm bestaat uit verschillende lagen. Aan de binnenzijde of het lumen is de dikke darm bekleed met mucosa. Deze mucosa bestaat uit eenlagig cilindrisch epitheel met zeer veel slijmcellen enerzijds en de lamina propria met de muscularis mucosa anderzijds. Bij de anus gaat het eenlagig cilindrisch epitheel over in meerlagig niet-verhoornd epitheel om uiteindelijk meerlagig verhoornd epitheel of huidepitheel te worden. Van binnen naar buiten gaat de mucosa over in het submucosa, de muscularis mucosa en de subserosa of het peri-rectale vetweefsel. De muscularis is opgebouwd uit een laag circulaire spieren en een laag lengtespieren omgeven door het peritoneum. Meer dan de helft van de dikkedarmkankers doen zich voor in het sigmoïd en vooral het rectum (Fig. 2-1). (2, 4, 29)

18


Figuur 2-1: Anatomie van de dikke darm (5)

2.2

Voorkomen

Colorectaal carcinoom is in de westerse wereld een steeds vaker optredende ziekte. Na long-, borst-, en prostaatcarcinoom is het de meest voorkomende vorm van kanker met daarenboven een significante mortaliteit. Het risico op het spontaan optreden van colorectaal carcinoom bedraagt ongeveer 4% en de ziekte treedt over het algemeen pas op na het vijftigste levensjaar. Slechts een kleine minderheid van de gevallen van colorectaal carcinoom ontstaat door een erfelijke aanleg. Meestal komt de ziekte geïsoleerd voor, dit wil zeggen dat de patiënt de enige is in de familie die een colorectaal carcinoom doormaakt. In 15% van de gevallen zijn ook andere familieleden aangedaan. Men spreekt dan van familiaal colorectaal carcinoom (FCC). Hierbij is er nog niet noodzakelijk sprake van een erfelijke aanleg, er wordt enkel aangegeven dat er vaker dergelijke carcinomen in de familie voorkomen. Slechts 5% van de colorectaalcarcinomen ontstaat op basis van een erfelijke aanleg. De twee belangrijkste vormen van gekend erfelijk colorectaal carcinoom zijn een variant met adenomateuze polyposis, familiale adenomateuze polyposis (FAP) en een zonder polyposis, hereditaire non polyposis colorectaal carcinoom (HNPCC). Ze maken respectievelijk 1 en 3% uit van het totale aantal colorectale carcinomen. (3)

19


2.3

Prognose

Dikkedarmkanker kent verschillende stadia. Deze onderscheiden zich op basis van de grootte van de tumor en de aanwezigheid van uitzaaiingen in nabijgelegen lymfeklieren of elders in het lichaam. Vaak worden de stadia ingedeeld volgens de ‘Tumour-NodesMetastases’ (TNM) classificatie. Deze classificatie beschrijft de tumor zelf (T), de lymfeklieren rond de tumor (N) en het al of niet aanwezig zijn van uitzaaiingen elders in het lichaam (M). Een combinatie van deze drie criteria bepaalt het stadium van de kanker. Deze indeling kent vijf stadia: 0, I, II, III en IV. Een andere indeling die wordt gebruikt om het stadium van dikkedarmkanker te omschrijven is de Dukes-classificatie. De Dukes- en TNM-classificatie overlappen grotendeels, waarbij stadia 0 en I van de TNM-classificatie overeenkomen met stadium A in de Dukes-classificatie (Tabel 2-1). Tabel 2-1: Stadiumindeling op basis van TNM- en Dukes-classificatiesysteem

Uitgebreidheid tumor en uitzaaiinTNM-classificatie

Stadium

Dukes-stadium

T0-2N0M0

0-I

A

gen Tumor beperkt tot

de darmwand

zonder doorbraak van de muscularis propria.

T3-4N0M0

IIA-B

B

Tumor groeit door de muscularis propria, zonder

T1-2-3-4N0-1M0

IIIA-B-C

C

lymfeklier metasta-

sen. Aanwezigheid van lymfeklier metastasen.

T1-2-3-4N1-2 M1

IV

D

Aanwezigheid van metastasen.

De overleving bij dikkedarmkanker is afhankelijk van het stadium van de kanker bij diagnose. Deze loopt uiteen van meer dan 90% voor stadium I patiënten tot minder dan 5% voor stadium IV patiënten. Om de mortaliteit te verminderen is het in de eerste plaats belangrijk dat mensen met een hoger risico op colorectaal carcinoom, zoals personen met erfelijke aanleg, periodiek gescreend worden. (1)

20


2.4

Ontstaan

Colorectaal carcinoom ontstaat onder invloed van een combinatie van genetische en omgevingsfactoren. Bij ongeveer 5% van de patiënten is een erfelijk voorkomende genetische verandering de oorzaak. (3) Hoewel roken ook een potentiële risicofactor is, zijn de omgevingsfactoren die geassocieerd zijn met het ontstaan van dikkedarmkanker, grotendeels terug te leiden op voedingsgewoonten. Er bestaat een verband tussen het krijgen van dikkedarmkanker en de consumptie van vetten en vezels. De kans op deze kankervorm wordt groter als men voedsel eet dat veel vetten en weinig vezels bevat. Voor de vertering van vetten zijn galzuren nodig, deze ontstaan in de lever. Na opslag in de galblaas komen de galzuren via de dunne darm in de dikke darm terecht. Hoe groter de hoeveelheid vet in het lichaam, des te meer galzuren voor vertering nodig zijn. Er bestaan aanwijzingen dat bacteriën in de dikke darm galzuren zodanig bewerken dat er kankerbevorderende stoffen vrijkomen. Meer vet in de voeding geeft dus een grotere hoeveelheid galzuren, waardoor mogelijk meer kankerbevorderende stoffen in de dikke darm ontstaan. Producten met veel vezels hebben een beschermende werking. Vezels bevorderen namelijk een snellere doorgang van het voedselrestant in de dikke darm. Daardoor hebben eventueel aanwezige kankerbevorderende stoffen kortere tijd contact met het darmslijmvlies. Door de aanwezigheid van vezels ontstaat er tevens een grotere voedselrestant in de dikke darm. Dit heeft een sterkere verdunning van de eventueel aanwezige kankerbevorderende stoffen tot gevolg. Contact met het slijmvlies is daardoor minder intensief. (8, 17) Volgens het Vogelstein model zijn de genetische factoren die een rol spelen bij de ontwikkeling tot kanker mutaties die in vaste volgorde ontstaan (Fig. 2-2). Via mutaties in de genen APC, K-RAS en TP53 ontstaat stapsgewijs vanuit normaal darmslijmvlies een niet kwaadaardige adenomateuze poliep die kan ontaarden in kanker. Additionele veranderingen kunnen er toe leiden dat het carcinoom uitzaait. De verandering van adenoom naar een carcinoom duurt gemiddeld tien jaar. Omdat dikkedarmpoliepen en dikkedarmtumoren met verschillende methoden kunnen worden vastgesteld, bestaat er bij dikkedarmkanker een unieke kans op vroegdiagnostiek van tumoren en een goede mogelijkheid voor vroege opsporing van voorstadia. (6, 7)

21


Figuur 2-2: Ontwikkeling van dikdarmkanker volgens het Vogelstein model (7)

2.5

Screening

Primaire preventie, zoals het stoppen met roken, heeft tot doel het ontstaan van de aandoening te voorkomen. Als er echter al sprake is van een carcinoom is secundaire preventie, zoals screening, belangrijk voor de vroegtijdige ontdekking van de aandoening om zo de kans op genezing te vergroten. Vooral bij personen met bepaalde aandoeningen, die het risico op het ontstaan van colorectale kankers sterk doen toenemen, is screening belangrijk. Maar aangezien colorectaal carcinoom voornamelijk geïsoleerd voorkomt is screening van personen met een gemiddeld risico al even belangrijk. Voor het vroegtijdig opsporen van dikkedarmkanker bestaan verschillende technieken. De belangrijkste technieken die tegenwoordig voor screening worden gebruikt, zijn testen die berusten op het aantonen van onzichtbare hoeveelheden bloed in de ontlasting, endoscopische en beeldvormende onderzoeken. 2.5.1

Fecesonderzoek

Fecesonderzoek heeft verschillende voordelen ten opzichte van andere screeningsmethoden. Het is niet invasief, vereist geen darmvoorbereiding en het maakt onderzoek van de volledige dikke darm mogelijk. Grote poliepen en kwaadaardige tumoren kunnen door analyse van bepaalde markers in de feces opgespoord worden. Deze verschillende markers worden onderverdeeld volgens de manier waarop ze in feces terechtkomen. Ze kunnen vanuit de poliep of de kwaadaardige tumor in de feces lekken, worden uitgescheiden of afschilferen. Als de fecestest positief is, zal altijd een colonoscopie volgen om de aanwezigheid van poliepen of kwaadaardige tumoren te onderzoeken. (9) 22


2.5.1.1 Lekkende markers De belangrijkste test in de categorie van de lekkende markers is de ‘fecal occult blood test’ (FOBT). Dit is een onderzoek om de aanwezigheid van onzichtbare bloedsporen in de stoelgang op te sporen. Er zijn hiervoor verschillende verkrijgbare testen op de markt die elk een andere stof in het bloed aantonen. De drie verschillende stoffen zijn peroxidase, haemoporfyrine en hemoglobine. Een eerste test is de ‘guaiac-smear’ test, gebaseerd op de detectie van peroxidase. Het nadeel van deze test is echter de lage sensiviteit en de grote kans op vals positieve resultaten. Om deze te voorkomen zijn er dieetveranderingen vereist zoals het niet eten van rood vlees alsook het stopzetten van aspirinegebruik of andere ‘non-steroidal anti-inflammatory’ drugs (NSAID’s). De lage sensiviteit van de test kan verhoogd worden door rehydratatie van het fecesmonster, maar dit leidt echter tot een sterke verlaging van de specificiteit waardoor het aantal colonoscopieën onnoemelijk hoog wordt. Detectie van haemoporfyrine via de HemoQuant-test vereist minder dieetmaatregelen dan guaiac-gebaseerde methoden, maar is echter zeer gevoelig voor bloedverlies uit het bovenste deel van het spijsverteringskanaal, zoals slokdarmvarices, en is bijgevolg niet geschikt voor de screening van colorectaal carcinoom. Bij de immunodetectie van hemoglobine zijn er geen noodzakelijke dieetmaatregelen maar de onthouding van NSAID’s gedurende een aantal dagen is wel vereist. Deze methode is gevoeliger dan guaiac-gebaseerde methoden en kan kleinere hoeveelheden bloed in de ontlasting opsporen. Andere lekkende markers die in de feces kunnen opgespoord worden zijn albumine en alpha-1-antitrypsine. Het belangrijkste nadeel van testen gebaseerd op lekkende markers is dat zowel poliepen als kwaadaardige tumoren slechts intermitterend lekken, waardoor de concentraties van markers in monsters van eenzelfde patiënt, gedurende opeenvolgende dagen afgenomen, aanzienlijk verschillen. Om deze reden worden monsters van verschillende dagen afgenomen, maar het is ook noodzakelijk om de test jaarlijks te herhalen. Een tweede nadeel is de lage specificiteit die optreedt omdat bloedverlies niet enkel voorkomt bij dikkedarmkanker maar bijvoorbeeld ook als gevolg van ontstekingen in de darm of maagbloedingen. Ook de sensitiviteit is niet zo hoog. Pogingen om de sensitiviteit te verbeteren om zo meer kwaadaardige tumoren op te sporen, resulteren in een toename van het aantal vals positieve resultaten. (9)

23


2.5.1.2 Uitgescheiden markers Kwaadaardige tumoren scheiden voortdurend mucines uit. Deze kunnen echter niet aangetoond worden in de feces daar ze onmiddellijk afgebroken worden. (9) 2.5.1.3 Afgeschilferde markers Kwaadaardige darmtumoren scheiden naast mucines ook grote hoeveelheden cellen af, terwijl het normale dikkedarmslijmvlies er slechts weinig afscheidt. Door de aanwezigheid van deze afgeschilferde cellen in de ontlasting na te gaan kunnen kwaadaardige tumoren opgespoord worden. Bij deze DNA-analyse vormt afbraak geen probleem aangezien DNA stabiel is in feces. Enkele mutaties typerend voor dikkedarmkanker zijn reeds bekend en maken zeer specifieke testen mogelijk Een eerste marker die in feces kan onderzocht worden is het K-RAS gen, dat slechts een klein aantal mogelijke mutatieplaatsen heeft. Andere onderzochte veranderingen zijn mutaties in het APC-gen en TP53. (9, 10) 2.5.2

Endoscopische onderzoeken

Endoscopie is de meest gevoelige methode. Met behulp van een flexibele buis met camera wordt de binnenzijde van het colon bekeken. Indien nodig kunnen tijdens het onderzoek stukjes weefsel of poliepen weggenomen voor verder onderzoek. Sigmoïdoscopie en colonoscopie zijn beide endoscopische technieken die ingezet kunnen worden voor endoscopische screening op colorectaal carcinoom. (11) 2.5.2.1 Recto-sigmoïdoscopie Een sigmoïdoscopie is een endoscopisch onderzoek van het laatste deel van de dikke darm, namelijk het rectum, het sigmoïd en het colon descendens (Fig. 1.1.). De te onderzoeken personen worden voorbereid door middel van een laxatief, dat niet lang voor het onderzoek wordt toegediend. Sigmoïdoscopie is een veilig onderzoek. Perforaties van de darm komen slechts zeer sporadisch voor en dit geldt ook voor bloedingen. (11) 2.5.2.2 Totale colonoscopie Een colonoscopie is een endoscopisch onderzoek van de gehele dikke darm. De voorbereiding bestaat uit een zeer sterk laxeermiddel of een totale darmlavage. Indien bij colonoscopie afwijkingen worden gevonden die verdacht zijn voor dikkedarmkanker zullen deze, indien mogelijk, meteen worden verwijderd. Colonoscopie is over het algemeen een 24


veilig onderzoek, maar complicaties komen vaker voor dan tijdens een sigmoïdoscopie. (11) 2.5.3

Beeldvormend onderzoek

2.5.3.1 Colon-inloop foto Bij de colon-inloop foto of, anders genoemd, het dubbelcontrast bariumonderzoek wordt een witte contrastvloeistof (bariumpap) via de endeldarm ingebracht. Daarna wordt lucht het colon ingepompt waarna de contouren van de darm op een röntgenfoto zichtbaar zijn. Zo kan de aanwezigheid van poliepen of gezwellen opgespoord worden. (11) 2.5.3.2 Colografie Virtuele colonoscopie of colografie is een radiologische techniek voor de detectie van colorectaal carcinoom en poliepen. Hierbij wordt het darmoppervlak van buitenaf met computertomografie (CT) of ‘magnetic resonance imaging’ (MRI) onderzocht. (12)

Æ CT-colografie Bij CT-colografie worden CT-opnamen gemaakt van het colon nadat deze werd ontplooid door middel van lucht- of koolstofdioxide-insufflatie. Door deze ontplooiing kunnen poliepen en kwaadaardige tumoren zichtbaar worden gemaakt. Poliepen worden geïdentificeerd als bolvormige verhevenheden van het colonoppervlak (Fig. 2-3). (12)

25


Figuur 2-3: Poliep zichtbaar gemaakt met CT-colografie (driedimensionale weergave) (12)

CT-colografie vereist een belastende voorbereiding van de darm, vergelijkbaar met de voorbereiding voor colonoscopie. De CT-colografiebeelden kunnen op verschillende wijze door de radioloog worden beoordeeld. De beelden kunnen tweedimensionaal worden beoordeeld, zoals gebruikelijk is voor een CT-onderzoek, of via driedimensionale methoden in de vorm van een filmpje (Fig. 2-3). (12)

Æ MR-colografie Bij MR-colografie worden MRI-opnamen verkregen na verdund contrastmiddelinloop of lucht- of koolstofdioxide-insufflatie in de endeldarm. Poliepen worden eveneens geïdentificeerd als verhevenheden, met eventueel een contrastverschil met de omgevende structuren. Het onderzoek duurt wat langer dan bij CT-colografie, terwijl de beoordelingsmethoden vergelijkbaar zijn. MRI heeft drie voordelen ten opzichte van CT: het ontbreken van stralenbelasting, een grote keuze aan scantechnieken en een intrinsiek groot verschil in contrasten tussen verschillende weefsels onderling en met overige structuren. Deze laatste eigenschap kan belangrijk zijn voor een hoge specificiteit (onderscheid tussen poliep en feces) en biedt de mogelijkheid tot minder belastende voorbereidingsschema’s. De grote keuze aan technieken en voorbereidingsschema’s werkt echter wel als een vertragende factor. (12) 26


2.6

Risicofactoren

Er zijn verschillende groepen te onderscheiden die een verhoogd risico lopen op de ontwikkeling van dikkedarmkanker. Tot een eerste groep behoren personen met een erfelijke predispositie voor dikkedarmkanker zoals ‘hereditary non polyposis cancer’ (HNPC) en familiale adenomateuze polyposis (FAP). Slechts 5% van de colorectaalcarcinomen ontstaat op basis van een erfelijke aanleg. Personen met een matig verhoogd risico op ontwikkeling van colorectaal carcinoom op grond van het voorkomen bij één of meerdere verwanten (familiair colorectaal carcinoom (FCC)) vormen een tweede groep. Dit komt voor bij 15% van de gevallen. Een derde groep wordt gevormd door personen met bepaalde aandoeningen zoals inflammatoire darmziekten, acromegalie, ureterosigmoïdostomie of personen met dikkedarmadenomen of dikkedarmkanker in de voorgeschiedenis. (3) 2.6.1

Erfelijke vormen

Een eerste aandoening is het familiaal voorkomen van dikkedarmkanker, nl. familiale adenomateuze polyposis (FAP). Bij deze patiënten is de tumor initiatie versneld doordat er een geërfde mutatie in het APC-gen zit. Deze patiënten vertonen duizenden poliepjes in de darm en zijn daardoor al één stap dichter bij het ontwikkelden van een carcinoom dan gezonde personen. Een tweede aandoening is de zogenoemde ‘hereditary non polyposis cancer’ (HNPC). Bij deze patiënten is de tumor initiatie normaal: er wordt geen opvallend hoger aantal adenoma’s vastgesteld. De tumor progressie echter is bij deze patiënten sterk versneld door een defect in het herstellen van DNA-schade (‘Mismatch Repair’, MMR), waardoor ontstane mutaties niet meer worden hersteld en zich zo gaan opstapelen. (7) 2.6.2

Familiaal colorectaal carcinoom (FCC)

Als ook andere familieleden zijn aangedaan (in 15% van de gevallen) spreekt men van familiaal colorectaal carcinoom. Hierbij is er geen sprake van een gekende erfelijke aanleg zoals bij FAP en HNPC maar er komen wel vaker dergelijke carcinomen voor in de familie. De oorzaken hiervoor kunnen vergelijkbare leef- en eetgewoonten zijn, eenzelfde woonomgeving of blootstelling aan andere gemeenschappelijke risicofactoren. Daarnaast is er het samenspel van een aantal genen die elk op zich weinig invloed hebben maar 27


samen met bovengenoemde omgevingsfactoren een licht verhoogde kans op coloncarcinoom geven. De kans op dikkedarmkanker hangt af van het aantal getroffen personen uit dezelfde familie en van de leeftijd van die personen. Hoe jonger de getroffen persoon is, hoe groter het risico voor zijn omgeving. (3) 2.6.3

Aandoeningen met een verhoogd risico op colorectaal carcinoom

2.6.3.1 Inflammatoire darmziekten Patiënten met een inflammatoire darmziekte (‘inflammatory bowel disease’ (IBD)) zoals Colitis Ulcerosa en de ziekte van Crohn hebben een verhoogd risico op de ontwikkeling van dikkedarmkanker. (13) Dikkedarmkanker, geassocieerd met IBD, word gekenmerkt door een vroege leeftijd van diagnose (gemiddeld 45 jaar), een verhoogde kans (12%) op synchrone tumoren en een slechte prognose. Algemeen wordt aangenomen dat dikkedarmkanker voorafgegaan wordt door dysplasie. Het vaststellen van dysplasie vormt een indicatie voor een geheel of gedeeltelijke operatieve verwijdering van het colon. (14) 2.6.3.2 Acromegalie en ureterosigmoïdostomie Ook patiënten met acromegalie of uretersigmoïdostomie hebben een verhoogd risico op de ontwikkeling van adenomen en dikkedarmkanker. (15, 16) 2.6.3.3 Adenomateuze poliepen en dikkedarmkanker in de voorgeschiedenis De overgrote meerderheid van de kwaadaardige tumoren van de dikke darm ontstaat uit een premaligne voorstadium, het adenoom. (7) Patiënten met adenomen hebben een verhoogd risico om opnieuw adenomen te ontwikkelen. Daarom wordt geadviseerd om deze patiënten na de poliepectomie regelmatig te onderzoeken door middel van colonoscopieën. (3) Personen die behandeld zijn voor kanker in de dikke darm hebben een verhoogde kans opnieuw een kwaadaardige dikkedarmtumor te ontwikkelen. (3)

2.7

Symptomen

De klachten die bij dikkedarmkanker optreden zijn sterk afhankelijk van de plaats van de tumor. Als deze zich in het sigmoïd of het rectum bevindt zal de patiënt andere klachten hebben dan bij een tumor die gelokaliseerd is in het begin van de dikke darm. Bij een proximale tumor in het colon ascendens zijn er gedurende een lange tijd geen sympto28


men. Bloedarmoede als gevolg van onzichtbaar bloedverlies via de ontlasting is vaak het eerste teken. Later kunnen darmkrampen en pijn optreden. Distale tumoren, dichter bij het rectum gelegen veroorzaken bloed- en slijmverlies via de anus en verandering van het ontlastingspatroon. Vaak gaat dit samen met krampende pijn, als gevolg van verstopping. Bij een tumor in het rectum is het meest voorkomende symptoom een verandering in de normale stoelgang onder de vorm van loze ontlastingsdrang en bloedverlies. Over het algemeen hebben patiënten met dikkedarmkanker vaak pijn die verergert bij bewegen en problemen met de ontlasting, variërend van een veranderd ontlastingspatroon tot continue aandrang, slijmafscheiding en bloedverlies. (1)

2.8

Behandeling

Voor de behandeling van kanker bestaan er drie regelmatig toegepaste types. Het gaat om chirurgie, radiotherapie en chemotherapie. Indien nodig krijgt de patiënt een combinatie van deze verschillende behandelingen. De keuze van de behandeling hangt af van de aard van de kankercel, de lokalisatie, het stadium en de algemene gezondheidstoestand van de patiënt. (18, 19) Daarnaast zijn er ook nieuwe technologieën in ontwikkeling die specifieker inwerken op kankercellen. Hiertoe behoren tyrosine kinase inhibitoren (TKI) en monoklonale antilichamen (MoAb) gericht tegen bepaalde receptoreiwitten van tumorcellen. (20) 2.8.1

Chirurgie

De meest toegepaste en belangrijkste behandeling bij colorectaal carcinoom is een operatie. Hierbij wordt de tumor, een gedeelte van de darm of de gehele dikke darm verwijderd, afhankelijk van de grootte en het aantal tumoren. Afhankelijk van de omvang van de operatie, zal al dan niet een tijdelijk stoma nodig zijn, om de darm de kans te geven te herstellen van de operatie. Als de tumor zich in het rectum bevindt zijn er verschillende operatietechnieken mogelijk. Een kleine tumor kan verwijderd worden via de anus, grotere tumoren moeten via de buikwand verwijderd worden. Wanneer de tumor erg groot is of dichtbij de kringspier zit, is het soms nodig om ook de kringspier te verwijderen. In sommige gevallen is het nodig om de hele dikke darm te verwijderen. Bij mensen met een erfelijke vorm van darmkanker wordt deze operatie ook wel preventief gedaan. (18, 19)

29


2.8.2

Radiotherapie

Bestraling wordt bij darmkanker alleen toegepast bij een tumor in de endeldarm. Het doel van de bestraling is om ofwel de tumor kleiner te maken, zodat een operatie een grotere kans van slagen heeft of om na een operatie de kans op het terugkeren kleiner te maken. Straling beschadigt de kankercellen, die zich moeilijk herstellen, zodat de tumor geheel of gedeeltelijk wordt vernietigd. Een neveneffect van straling is echter dat ook de omringende gezonde cellen aangetast worden. De bestraling wordt meestal in series toegediend. In de periode tussen de series krijgen gezonde cellen de kans om te herstellen. Het aantal bestralingen is afhankelijk van de grootte van de tumor. (19) 2.8.3

Chemotherapie

Chemotherapie op basis van 5-Fluorouracil (5-FU) gebeurt door middel van intraveneuze injecties, waarna ze zich door het hele lichaam verspreiden en ook kankercellen in uitzaaiingen op afstand kunnen bereiken. Vaak wordt voor de toediening van chemotherapeutica onder plaatselijke verdoving een subcutane veneuze poortkatheter (‘Port-a-cath’) aangebracht. Deze poortkatheter maakt het mogelijk om op een eenvoudige manier gedurende langere tijd cytostatica en andere medicijnen en vloeistoffen toe te dienen. Niet alle kankercellen zijn even gevoelig voor dezelfde medicijnen. Daarom wordt vaak een cocktail van cytostatica voorgeschreven. Chemotherapie na een operatie kan in bepaalde gevallen de kans op herval verminderen en zo de overlevingskansen verbeteren. De behandeling wordt ook gebruikt bij uitzaaiingen daar ze deze soms verkleinen of symptomen van een gevorderde kanker verlichten. (19) 2.8.4

’Targeted’ therapie

Door verbeterd inzicht in de moleculaire mechanismen die een rol spelen bij het ontstaan van kanker kunnen nieuwe antikanker middelen worden ontwikkeld die specifieker inwerken op de kankercellen. Tyrosine kinase remmers (TKI) en antilichamen (MoAb ) tegen bepaalde receptor eiwitten van tumorcellen zijn voorbeelden van moderne ‘targeted’therapieën. Deze zorgen ervoor dat de receptoren geen signalen meer kunnen doorgeven aan de cel waardoor de functie van de receptor verhinderd wordt. (20) Onderzoek heeft aangetoond dat de therapie het meest effectief is bij aanwezigheid van activerende mutaties in het EGFR-gen. Activerende K-RAS mutaties daarentegen zorgen voor resistentie 30


van de tumor aangezien deze continu geactiveerd wordt ongeacht of er inhibitoren aanwezig zijn of niet (Fig 2-4). Het is dus belangrijk om de aan- of afwezigheid van K-RAS mutaties op te sporen aangezien de aanwezigheid van deze mutaties correleert met een gebrek aan respons op bepaalde EGFR-remmerbehandelingen, die daarenboven zeer duur zijn en niet zonder neveneffecten. (21)

Figuur 2-4: De functie van MoAb, TKI en K-RAS mutaties in de EGFR signalisatie pathway A) Binding van ligand op EGFR verzoorzaakt activatie van de pathway B) In de aanwezigheid van TKI of MoAb zal de signalisatie pathway niet geactiveerd worden C) Als er K-RAS mutaties aanwezig zijn zal de pathway niet geinhibeerd worden in aanwezigheid van TKI of MoAb (21)

2.8.4.1 TKI Tyrosine kinase behoort tot een familie van eiwitten die een belangrijke rol spelen in celproliferatie en differentiatie. De epidermale groeifactor (EGF) is een voorbeeld van een dergelijke kinase. Via een proces van fosforylatie en defosforylatie wordt het kinase geactiveerd. Als de tyrosine kinase echter geïnhibeerd wordt door een TKI kan de fosforylatie niet meer doorgaan en zal het proces van proliferatie en differentiatie niet meer uitgevoerd worden (Fig. 2-5). (27) Gefinitib en Erlotinib zijn voorbeelden van TKI gericht tegen de 31


epidermale groeifactor receptor (EGFR). (20) Als deze receptor geblokkeerd wordt door de intracellulaire binding van TKI zal de epidermale groeifactor niet meer kunnen binden en zal er geen signaal meer doorgegeven worden aan de kankercel om te groeien en te delen wat resulteert in minder wildgroei van de cel. (28) 2.8.4.2 MoAb Monoklonale antilichamen blokkeren dezelfde signalisatie pathway als TKI maar via een ander mechanisme. De MoAb binden aan het extracellulair domein van de EGFR in plaats van intracellulair (zoals TKI) om deze in zijn functie te belemmeren (Fig 2-5). (28) Cetuximab en Panitumumab zijn voorbeelden van moAb gericht tegen EGFR. (20)

Figuur 2-5: Mechanismen voor EGFR inhibitie (30)

2.9

Extractie (25)

De MagNA Pure LC 2.0 is het instrument dat gebruikt word voor de automatische isolatie van nucleïnezuren met behulp van speciaal ontwikkelde kits. Het instrument staat ook in voor de automatische vulling van PCR plaatjes met PCR reactiemixen en templaatnucleïnezuren. Het onderliggend principe van de MagNA Pure LC 2.0 steunt op magnetisme. Alle nodige reagentia bevinden zich in de kits. De protocols voor het purificatieproces zijn 32


voorgeprogrammeerd en bevatten alle instructies voor de isolatiestappen. De protocols zijn afhankelijk van het staaltype en het type nucleïnezuur dat moet geïsoleerd worden. In de nucleasevrije reactietips worden nucleïnezuren gebonden aan magnetische glaspartikels (MGP), gewassen van onzuiverheden en vervolgens geëlueerd van de MGP in hun pure vorm. Het oppervlakte van de MGP bestaat uit silica en hun kern is magnetisch. De nucleïnezuren worden gebonden aan het silica in de aanwezigheid van isopropanol en hoge concentraties chaotropisch zout. Deze verwijderen het water van de gehydrateerde molecules in oplossing. Polysachariden en proteïnen worden niet gebonden aan de beads en worden dus weggewassen tijdens de wasstappen. Het zuivere nucleïnezuur wordt dan geëlueerd van de beads door gebruik te maken van lage zoutcondities en warmte. Als ze eenmaal gebonden zijn aan de MGP kunnen de nucleïnezuren gescheiden worden van de oplossing met behulp van een magneet (Fig. 3-1).

2.10 TheraScreen® K-RAS mutatiekit De TheraScreen® K-RAS mutatiekit is een diagnostische test bedoeld voor de detectie van zeven somatische mutaties in de codons twaalf en dertien op exon één van het KRAS oncogen in een achtergrond van wildtype genomisch DNA (exon vier) in een ‘real time’-PCR (Tabel 2-2). De kit levert een kwalitatieve beoordeling van de mutatiestatus. De K-RAS kit moet worden gebruikt met DNA-monsters die zijn geëxtraheerd uit in paraffine ingebed colorectaal tumorweefsel. De resultaten van de K-RAS test zijn bedoeld als hulp voor de arts bij het identificeren van patiënten met colorectaal carcinoom die mogelijk geen baat hebben bij een behandeling met anti-EGFR daar de aanwezigheid van deze mutaties

correleert

met

een

gebrek

aan

respons

op

bepaalde

EGFR-

remmerbehandelingen. (22) Tabel 2-2: Door de kit gedetecteerde K-RAS mutaties

Mutatie Base-wijziging Gly12Ala GGT > GCT Gly12Asp GGT > GAT Gly12Arg GGT > CGT Gly12Cys GGT > TGT Gly12Ser GGT > AGT Gly12Val GGT > GTT Gly13Asp GGC > GAC

33


De K-RAS kit combineert twee technologieën, ARMS® en Scorpions®, voor de detectie van mutaties in ‘real time’-PCR. (22) 2.10.1 ARMS De allelspecifieke amplificatie wordt uitgevoerd met behulp van ARMS. De ARMStechnologie maakt gebruik van de mogelijkheid van het Taq DNA polymerase om een onderscheid maken tussen een ‘match’ en een ‘mismatch’ aan het 3’-uiteinde van een PCR-primer. Specifiek gemuteerde sequenties kunnen selectief worden geamplificeerd want de amplificatie verloopt slechts optimaal efficiënt als de primer volledig ‘matcht’. Ook wanneer er aan het 3’-uiteinde een ‘mismatch’ aanwezig is zal er geen effficiënte amplificatie volgen. Er wordt gebruik gemaakt van twee allel-specifieke primers en één gemeenschappelijke primer. De twee allel-specifieke forward primers zijn als eerste de primer die complementair is aan het wildtype DNA (exon vier), dit om na te gaan of er voldoende start DNA aanwezig is. Als tweede is er de primer die complementair is aan het mutant DNA (de ARMS-primer). Deze forward primers induceren de transcriptie van de 5'-streng. De gemeenschappelijke reverse primer induceert de transcriptie van de 3'-streng (de Scorpion-primer). Er worden acht PCR reacties uitgevoerd per staal. In de ene reactie wordt de primer specifiek voor het wildtype-allel (exon vier) gebruikt en in de andere reacties de primers specifiek voor het opsporen van de zeven mutaties. De Scorpion-primer wordt bij alle reacties gebruikt. (23) 2.10.2 Scorpions De detectie van de amplificatie wordt uitgevoerd met Scorpions. Dit zijn bifunctionele moleculen die een PCR-primer bevatten die covalent gebonden is aan een probe. De fluorofoor in de probe heeft interactie met een quencher, ook geïntegreerd in de probe, die de fluorescentie vermindert. Tijdens een PCR-reactie, bij de binding van de probe met het amplicon, worden fluorofoor en quencher gescheiden. Dit leidt tot meer fluorescentie vanuit de reactiebuis. Gedurende de PCR-reactie is de eerste stap een denaturatiestap met als doel de dubbelstrengige DNA-sequentie enkelstrengig te maken. Tijdens de tweede stap zal de Scorpion-primer binden aan het ‘target’-DNA. Stap drie resulteert terug in dubbelstrengig DNA door verlenging van de primer. Na de extentiefase volgt er terug een denaturatiefase om enkelstrengig DNA te verkrijgen alsook om de waterbruggen van de Scorpion-probe te verbreken zodat deze kan openklappen en de reporter en quencher 34


gescheiden worden. Tijdens stap vijf zal de opengeklapte probe binden aan zijn complementair stukje amplicon en kan het fluorescentiesignaal gedetecteerd worden. Er kan dus pas vanaf een tweede cyclus gemeten worden daar de eerste cyclus noodzakelijk is voor de binding van de Scorpion (Fig. 2-6). De Scorpion-primer/probe bevat ook een ‘blocker’ die verhindert dat de probe zelf wordt afgeschreven wat zou resulteren is een vals detectiesignaal (Fig. 2-7). (24)

Figuur 2-6: Binding van de Scorpion-primer/probe (31)

35


Figuur 2-7: Aanwezigheid van een blocker verhindert een vals detectiesignaal

2.10.3 ‘Real time’-PCR De ‘real time’-PCR is gebaseerd op detectie en kwantificering van fluorescerende labels (reporters), waarvan het signaal evenredig toeneemt met de hoeveelheid PCR product die er gevormd is in de PCR. Er wordt dus reeds gemeten voordat de PCR zijn plateaufase bereikt heeft. De voordelen van deze methode zijn ten eerste dat je direct resultaten hebt zonder dat het product op gel moet gezet worden. Hierdoor wordt het contaminatierisico sterk verlaagd. Ten tweede is het ook mogelijk om een kwantitatieve uitspraak te doen over de hoeveelheid DNA die in het monster aanwezig was. De detectie van de amplificatie wordt hier uitgevoerd met Scorpions. Wanneer het Taq DNA polymerase de reporter afbreekt wordt deze niet meer geïnhibeerd door de quencher maar zal bij een specifieke golflengte licht emitteren. Dit licht wordt gedetecteerd en is een maat voor de hoeveelheid gevormd product. Per monster kan de fluorescentie over een aantal cycli worden afgelezen en via gespecialiseerde software worden geanalyseerd. Het meten van de hoeveelheid signaal die de reporter uitzendt is de basis van de ‘real time’-PCR. Als we ervan uitgaan dat er een hoeveelheid target aanwezig is, zal bij iedere cyclus meer van de detectieprobe worden afgebroken, waardoor er ook meer signaal afkomstig van de reporter kan worden gedetecteerd. De PCR-cyclus kan goed worden gevolgd vanaf het detecteren van het eerste signaal, via het lineair gebied van de PCR-reactie tot en met het bereiken van het plateau van de reactie (Fig. 2-8). Wanneer er meer ‘input’ aanwezig is, zal het signaal ook eerder te detecteren zijn. (26)

36


Figuur 2-8: Typische PCR amplificatiegrafiek (26)

Elk staal bereikt na een verschillend aantal cycli een bepaalde hoeveelheid fluorescentie. De ‘cycle treshold’ (Ct) is het aantal cycli die nodig zijn om die hoeveelheid fluorescentie te bereiken. Het meten van het detectiesignaal vindt continu tijdens de DNA-synthese plaats. Er bestaat een directe relatie tussen het PCR-cyclusnummer waarin een signaal voor het eerst waarneembaar is (de Ct) en de hoeveelheid start doelwitmoleculen. Het is namelijk zo dat hoe meer DNA-kopijen aanwezig, hoe lager de Ct-waarde. (26) De ∆Ctwaarden van het monster worden berekend als het verschil tussen de Ct van de mutatieassay en de Ct van de controleassay van hetzelfde monster (Tabel 2-3).

Figuur 2-9: De ∆Ct-waarden van het monster worden berekend als het verschil tussen de Ct van de mutatieassay en de Ct van de controleassay van hetzelfde monster

37


Tabel 2-3: Verwachte ∆Ct waarden

Mutatie 12ALA 12ASP 12ARG 12CYS 12SER 12VAL 13ASP

Verwachte ∆Ct waarden -0,61 -0,61 0,34 -0,79 -0,13 0,1 -0,74

Monsters worden geclassificeerd als mutatiepositief als ze een ∆Ct opleveren van minder dan de 1% ∆Ct-waarde voor de mutatieassay (Tabel 2-4). (22) Tabel 2-4: 1% Cut-off waarden

Mutatie 12ALA 12ASP 12ARG 12CYS 12SER 12VAL 13ASP

1% ∆Ct 6,25 7,72 6,83 6,95 8,95 6,5 9,09

38

Opsporen van K-RAS mutaties op colontumoren Materiaal en methode

3

Materiaal en methode

3.1

Selectie paraffinecoupes

De detectie van zeven mogelijke somatische mutaties met behulp van de K-RAS kit gebeurt op DNA-monsters die zijn geëxtraheerd uit in paraffine ingebed colorectaal tumorweefsel. Men selecteert paraffinecoupes waarvan er met zekerheid geweten is dat de patiënt colonkanker heeft. Aan de hand van coupes die reeds vroeger gesneden en gekleurd werden selecteert men de coupes waarbij er zoveel mogelijk viabel tumoraal weefsel aanwezig is. Ook wordt er bij de selectie gekozen voor patiënten waarbij men weet welke mutatie er aanwezig is (Tabel 3-1). Deze mutaties werden reeds opgespoord in samenwerking met het UZ Leuven. Tabel 3-1: Onderzochte patiënten met te verwachten mutatiestatus

Patiënt Biopsienummer 1 06B 12534/5 2 08B 3437/2 3 06B 7706/2 4 06B 4637/4 5 08B 1155/4 6 05B 7146/8 8 08B 4601/8 9 06B 4030/2 10 05B 5259/3

3.2

Te verwachten resultaat 13ASP 12VAL 12CYS 12ASP 12ASP 12ASP 12ASP 12ASP 12SER

Benodigdheden

Microtoom

Microtoommesje

Verwarmplaat Gaaskompressen

Type Serienr. Producent Type Lotnr. Producent

HM 340E 14210 Microm Shanon MX 35 premier + 6L236304 Thermo electron corporati-

Type Producent Type

on TFP 40 Medite Sterilux ® ES

(7,5 x 7,5

cm) 39


Objectglaasjes

Eppendorf tubes

Scalpel

Lotnr. Producent Type

61007601 Hartmann Gewassen - ontvet - ge-

Producent Type Lotnr. Vervaldatum Producent Type

bruiksklaar / 76x26x1 mm Knittel Gläser Microtube 1,5mL, PP 7072501 Juni 2010 Sarstedt Disposable scalpels sterile, sterilized with gamma radiation

Pipetten

Xyleen

Ethanol 100%

Vortex

Thermomixer

Centrifuge

MagNA Pure

Kit MagNA Pure

Lotnr. Vervaldatum Producent Type Lotnr. Producent Lotnr. Vervaldatum Producent Lotnr. Vervaldatum Producent Type

6090504 April 2010 Swann-Morton epReference³ Pack 1 X109338R Eppendorf AG 20080129 Juli 2013 Fiers 20820.293 Juli 2013 VWR International VM-3000 Mini vortexer

Serienr. Producent Type Serienr. Producent Type Serienr. Producent Type Serienr. Producent Type

9453044 090112002 VWR International Thermomixer Comfort 5355 40987 Eppendorf AG Galaxy 16DH R711324 VWR International MagNA Pure LC 2.0 LC2C00000036 Roche Diagnostics MagNa Pure LC DNA Isola-

Lotnr. Vervaldatum

tion Kit I 10772600 Nov 2010 40


Real-time PCR

Mutatiekit

Steriel PCR water

3.3

Producent Type Serienr. Producent Type

Roche Diagnostics Light Cycler® 480 08212-10189 Roche Diagnostics TheraScreen® K-RAS mu-

Lotnr.

tatiekit DK093-01

Vervaldatum Producent Type

DK090-01 Sep 2009 TheraScreen Aqua ad iniectabilia Stella

Lotnr. Vervaldatum Producent

10 mL 00D17 April 2005 Laboratoires Stella s.a.

Deparaffinisatieprocedure

De extractie van het DNA uit de monsters wordt voorafgegaan door een deparaffinisatiestap. Er worden 4 deparaffinisatiemogelijkheden uitgetest om na te gaan welke er de best bruikbare extracten levert. Enerzijds maakt men gebruik van coupes die eerst op glaasjes worden gebracht alvorens in een epje over te brengen. Anderzijds gaat men coupes gebruiken die rechtstreeks in het epje worden gedaan. Deze twee manieren worden elk nog eens opgesplitst in een protocol waarbij er één coupe in een epje gaat en een protocol waarbij er twee coupes in een epje gaan. Per patiënt worden er twaalf coupes gedeparaffiniseerd waardoor elk testprotocol in principe in tweevoud kan worden uitgevoerd. 3.3.1

Methode 1: Paraffinecoupes (5-10 µm) op objectglaasjes

- per patiënt: 6 coupes (2x 1 coupe op een glaasje; 2x 2 coupes op een glaasje) - 2 protocols in parallel uittesten:

protocol A: 1 coupe / tube protocol B: 2 coupes / tube

- deparaffinisatieprocedure: o

alle coupes voorverwarmen gedurende 5 min bij 90°C (oplossen paraffine)

o

benoem per patiënt 4 eppendorf tubes en vul deze tubes met 180 µL DNA Tissue Lysis Buffer en 20 µL Proteïnase K 41


o

deparaffinisatie: 2x xyleen (2 min), 1x 100% ethanol (2 min)

o

breng een druppel (10 µL) lysis buffer op het objectglaasje en schraap de coupe met behulp van deze druppel in de respectievelijke eppendorf tubes

3.3.2

o

overnacht incubatie bij 56°C

o

incubatie bij 90°C gedurende 1 uur

Methode 2: Paraffinecoupes (5-10 µm), gesneden en direct in 1,5 mL eppendorf tubes gebracht

- per patiënt: 6 coupes - 2 protocols in parallel uittesten:

protocol A: 1 coupe / tube protocol B: 2 coupes / tube

- deparaffinisatieprocedure: o

voeg 800 µL xyleen toe en meng voorzichtig

o

laat 2 min inwerken

o

voeg 400 µL 100% ethanol toe en meng voorzichtig

o

centrifugeer de tubes gedurende 2 min bij 13.000 rpm

o

verwijder het supernatans

o

voeg 1 mL 100% ethanol toe en meng voorzichtig

o


o

verwijder het supernatans

o

centrifugeer de tubes kort bij 13.000 rpm en dep supernatans af

o

voeg 180 µL DNA Tissue Lysis Buffer toe en 20 µL Proteinase K

o

even vortexen

o


o

voeg 70 µL Proteïnase K toe

o

even vortexen 42


3.4

o


o


o

voeg 20 µL Proteïnase K toe

o

even vortexen

o


o

incubatie bij 90°C gedurende 1 uur

Extractie (25)

MagNA Pure LC 2.0 3.4.1

‘Software main screen’

In Fig. 3-1 wordt het beginscherm weergegeven. Via ‘Ordering’ kan overgegaan worden naar het volgende scherm.

Figuur 3-1: Beginscherm MagNA Pure LC 2.0 software

3.4.2

‘Sample ordering screen’

Via het ‘Sample ordering screen’ kan er gekozen worden welk protocol er voor de extractie moet toegepast worden, alsook het staal- en elutievolume (Fig. 3-2).

43


Figuur 3-2: 'Sample ordering screen'

1. extractieprotocol:

DNA I, high performance

2. staalvolume

200 µL

3. elutievolume

100 µL

4. staalinfo 3.4.3

‘Stage setup screen’

Bij het ‘stage setup screen’ scherm wordt al het nodige materiaal en reagentia toegevoegd. Indien iets werd toegevoegd kunnen de vakjes afgeklikt worden en kan men vervolgens voor start kiezen (Fig. 3-3).

44


Figuur 3-3: 'Stage setup screen'

3.4.4

Geautomatiseerde DNA-isolatie

Figuur 3-4: Geautomatiseerde DNA isolatie (25)

1. 200µL staal overbrengen in de welletjes van de ‘Sample Cartridge’. 2. Toevoeging van 300µL ‘Lysis/Binding Buffer’ aan het staal. Dit resulteert in cellysis en het vrijkomen van nucleïnezuren. Daarna overbrengen in 100µL Proteïnase K + mengen. Dit resulteert in de afbraak van proteïnen, waaronder nucleasen, die storend kunnen zijn. 45


3. Overbrengen in 150µL MGP + mengen + incuberen. Het DNA zal binden met het silica in de aanwezigheid van isopropanol en hoge concentraties chaotropisch zout. 4. Overbrengen van de beads in 850µL ‘Wash Buffer I’ + mengen. Scheiden van het DNA gebonden aan MGP via magnetisme. 5. Overbrengen van de beads in 450µL ‘Wash Buffer II’ + mengen. Het DNA-MGPcomplex worden herhaaldelijk gewassen om zo proteïnen (nucleasen), celmembranen en PCR inhibitoren te verwijderen. 6. Overbrengen van de beads in 450µL ‘Wash Buffer II’ + mengen. De voorgaande wasstap wordt nogmaals uitgevoerd zodat alle onzuiverheden verwijderd worden. 7. Overbrengen van de beads in ‘Elution Buffer’ bij een temperatuur van 70°C + mengen + incubatie. 3.4.5

‘Batch status screen’

Het ‘batch status screen’ geeft de evolutie van de extractie weer (Fig. 3-5).

Figuur 3-5: 'Batch status screen'

3.4.6

‘Result screen’

Het uiteindelijke ‘result screen’ geeft weer of de extractie al dan niet succesvol is volbracht (Fig. 4-6). 46


Figuur 3-6: Result screen

3.5 3.5.1

PCR TheraScreen® K-RAS mutatiekit

De TheraScreen® K-RAS mutatiekit bevat de volgende reagentia en reactiemixen. 1. De controle reactiemix bevat ARMS specifiek voor het wildtype DNA (WT), nl. exon vier. Indien de controle reactiemix een Ct-waarde geeft van 29-35 bestaat er een grote kans dat mutaties niet gedetecteerd worden. Ook waarden van 35-38 en >38 kunnen voor problemen zorgen doordat er hier slechts een minimum aan DNA aanwezig is en mutaties hierdoor niet gedetecteerd worden. De ideale Ct-waarden zijn gelegen tussen 24 en 29. Waarden lager dan 24 wijzen erop dat er teveel DNA aanwezig is (>50ng/µL). Deze staaltjes worden het best verdund. 2. De mutatie reactiemixen bevatten ARMS specifiek voor de te detecteren mutaties. 3. De standaard reactiemix (STD) is een positieve controle. Bij deze controle zijn alle zeven mutaties aanwezig. 4. Als negatieve controle (NTC) wordt steriel nuclease-vrij H2O gebruikt. Het is de bedoeling dat deze controle negatief blijft indien er geen contaminatie is opgetreden. 5. In elke reactiemix is er tevens een interne controle aanwezig om eventuele inhibitie van de amplificatie op te sporen. Deze controle bevat synthetisch target DNA en moet dus telkens opkomen; dit indien er geen inhibitie is van de amplificatie. Het 47


fluorescentiesignaal van deze curven komt op bij een andere golflengte dan de reactiemixen, nl. 580 nm in plaats van 510 nm. Deze golflengte verandering wordt teweeggebracht door gebruik te maken van verschillende filters. 3.5.1.1 Bereiding van de verschillende mastermixen De reactiemix wordt samengesteld zoals weergegeven in tabel 3-2. Tabel 3-2: Bereiding van de reactiemixen voor 1 reactie

controle reactiemix mutatie reactiemix

mastermix reactiemix taq 19,8 µL 0,2 µL 19,8 µL 0,2 µL

Deze hoeveelheden moet men vermenigvuldigen met het totale aantal reacties ( = STD + NTC + aantal stalen + 1 dood volume) 3.5.1.2 Pipetteren van de LightCycler® 480 plaat volgens onderstaand schema Tabel 3-3: Pipetteershema voor de LightCycler® 480 plaat met de verschillende reactiemixen en stalen

1 A WildT B 12ALA C 12ASP D 12ARG E 12CYS F 12SER G 12VAL H 13ASP

2

STD NTC STD NTC STD NTC STD NTC STD NTC STD NTC STD NTC STD NTC

3 Staal 1 Staal 1 Staal 1 Staal 1 Staal 1 Staal 1 Staal 1 Staal 1










- pipetteer 20 µL van de controlemix en 20 µL van de verschillende mutatiemixen in de respectievelijke rijen - pipetteer 5 µL STD in elk cupje van kolom 1 - pipetteer 5 µL NTC in elk cupje van kolom 2 48


- pipetteer respectievelijk 5 µL van staal 1 t.e.m. 10 in elk cupje van kolom 3 t.e.m. 12 - sluit de plaat af met behulp van folie en applicator - centrifugeer de plaat gedurende 3 min bij 3000 rpm 3.5.2

LightCycler® 480

3.5.2.1 PCR programma 1. Doe de plaat onmiddellijk in het LightCycler® 480 Instrument. 2. Selecteer het pictogram van de LightCycler® 480 Software op het bureaublad van het aan het instrument gekoppelde werkstation. Log in op de software en selecteer in het ‘Overview’-scherm ‘New Experiment from Template’.

Figuur 3-7: Beginscherm LightCycler® 480 software

49


3. Kies uit de lijst run templates ‘K-RAS LC480II Run Template’. Deze template heeft de volgende parameters: Detectieformaat is ‘DxS IVD Assays’. Reactievolume is 25 µL Een initiële wachtstap van 4 minuten bij 95 °C. Een 2-stapsamplificatie gedurende 45 cycli met denaturatie gedurende 30 seconden bij 95°C en uitgloeien gedurende 1 minuut bij 60°C. De fluorescentieacquisitie is een enkelvoudige acquisitie bij de 60°C stap. Tabel 3-4: Instellingen aantal cycli, temperatuur en tijd voor de activatie-, amplificatie-, en coolingstap.

Activatie Amplificatie Cooling

Temperatuur 95°C 95°C 60°C 40°C

Tijd 4 min 30 sec 1 min 30 sec

Cycli 1 45 1

4. Selecteer tabblad ‘Sample Editor’ en selecteer onder ‘Step 1: Select Workflow’ het selectievakje ‘Abs Quant’. Zorg er onder ‘Select Filter Combinations’ voor dat beide filters geselecteerd zijn (465-510 nm en 533-580 nm). Stel de monsternamen in onder Step 2 en Step 3. Het ‘Quantification Sample Type’ dient te worden ingesteld als ‘unknown’. De kolom replicaten dient blanco te worden gelaten. 5. Selecteer de ‘Experiment’-knop en klik op de ‘Start Run’-knop om deproef op te slaan en de cyclus te starten. 6. Selecteer na afloop van de run het tabblad ‘Analysis’ en kies ‘Abs Quant/2nd Derivative Max’ in het ‘Create New Analysis’-venster. Accepteer de standaarden uit het ‘Create New Analysis’-scherm. Zorg ervoor dat de ‘Filter Comb’-knop op 465-510 nm staat en selecteer de ‘Calculate’-knop. De Ct-waarden worden in de ‘Samples’-tabel weergegeven. 7. Selecteer de ‘Filter Comb’-knop en wijzig de filters in 533-580 nm. Selecteer de ‘Calculate’-knop, waarna de interne controle Ct-waarden in de 'Samples'-tabel worden weergegeven. 3.5.2.2 Monsteranalyse 1. Exporteer de proef (.ixo-bestand) na afloop van de run op het LightCycler® 480 Instrument via het navigatievenster naar een geschikte locatie die toegankelijk is met de LightCycler® Adapt Software. 2. Open de LightCycler® Adapt Software door op het pictogram van de LightCycler® Adapt Software op het bureaublad van het werkstation te klikken en de gebruikersnaam in het desbetreffende veld in te voeren. 3. Gebruik de browser-knop in het hoofdmenu om één LightCycler® 480 Instrument-runbestand te selecteren. 50


4.

Selecteer een rapporttype (pdf of csv).

5. Selecteer ‘Analyse’ om het resultatenrapport aan te maken. Het rapport wordt automatisch opgeslagen in de folder met het runbestand en krijgt dezelfde naam als het runbestand. 6. Het rapport wordt automatisch getoond. 7. Het rapporteerbare resultaat wordt getoond in de ‘Mutation Status’-kolom van de ‘Sample Result Table’. i. De LightCycler® Adapt Software berekent automatisch de ΔCtwaarde met behulp van de formule Mutatie-Ct – Controle-Ct = ΔCt en vergelijkt de waarden met de verwachte waarden (Tabel 32). ii. Op basis van de 1% cut-off-waarden wordt bepaald of een monster mutatiepositief of mutatienegatief is (Tabel 3-3). iii. Als een mutatie-ΔCt-waarde voor een monster lager is dan de bijbehorende 1% cut-off-waarde, wordt het monster als mutatiepositief benoemd. De LightCycler® Adapt Software rapporteert welke mutatie aanwezig is, maar rapporteert slechts één mutatie. Als er 2 positieve ΔCt-waarden zijn, wordt de kleinste waarde gerapporteerd. Aangenomen wordt dat de tweede waarde het gevolg is van kruisreactiviteit van een mutatieprimer die zich vanuit een andere mutatie bindt en primet. In zeldzame gevallen waarin sprake is van een dubbele mutatie is de klinische beslissing dezelfde als wanneer er sprake is van één mutatie.

51

Opsporen van K-RAS mutaties op colontumoren Resultaten en discussie

4

Resultaten en discussie

4.1

Legende

Methode 1 = Paraffinecoupes (5-10 µm) op objectglaasjes. Methode 2 = Paraffinecoupes (5-10 µm), gesneden en direct in 1,5 mL eppendorf tubes gebracht. Protocol A = 1 coupe / tube Protocol B = 2 coupes / tube Rode lijn = De curven zijn hier opgekomen door correcte amplificatie van het aanwezige DNA. Groene lijn = Er zijn hier geen curven opgekomen. Bij de interne controle is dit is te wijten aan een incorrecte amplificatie doordat er geen of weinig DNA aanwezig is of door inhibitie van de amplificatie. Het niet opkomen van de groene curven bij de mastermixen wijst erop dat de desbetreffende mutatie niet aanwezig is. (Dit indien de interne controle wel is opgekomen.)

4.2

Patiënt 1 en 2 (Methode 1 en 2, protocol A en B)

Figuur 4-1: Resultaat eerste run patiënt 1 en 2, protocol A en B bij beide methodes

Deze curven zijn niet zoals verwacht en wijzen op een probleem met de Light Cycler® 480. Na vernieuwing en herinstallatie van één van de onderdelen van het PCR-toestel wordt er een run ingezet met enkel de controle reactiemix. Dit om zeker te zijn of alles nu in orde is.

52


4.3

Patiënt 1 en 2 (Methode 1 en 2, protocol A en B voor controle reactiemix)

Figuur 4-2: Resultaat run patiënt 1 en 2 controle reactiemix, protocol A en B bij beide methodes Tabel 4-1: Ct-waarden bij controle reactiemix Mixed standard Exon 4

1-1A 39,15

1-1B

1-2A 40,00

1-2B 40,00

2-1A 40,00

2-1B 39,35

2-2A

2-2B

Uit de controle run kan afgeleid worden dat de curven opkomen (Fig. 4-2). Hieruit kan men besluiten dat de Light Cycler® 480 functioneel in orde is en dus klaar voor verdere PCR analyses. De bekomen Ct-waarden liggen echter zeer hoog (Tabel 4-1) wat er op wijst dat er slechts een minimale hoeveelheid DNA aanwezig is in de gebruikte extracten. Hierdoor kunnen de eventueel aanwezige mutaties niet gedetecteerd worden door de KRAS kit.

53


Figuur 4-3: Interne controle bij run patiënt 1 en 2 controle reactiemix, protocol A en B bij beide methodes Tabel 4-2: Ct-waarden interne controle bij controle reactiemix Mixed standard NTC 1-1A 1-1B Exon 4 40,00 2-1A 2-1B 40,00

1-2A

1-2B

2-2A

2-2B

Bij deze controle run zijn er ook een groot aantal interne controles niet opgekomen (Fig 43; Tabel 4-2). Deze interne controle is aanwezig in elke reactiemix en moet sowieso opkomen als de amplificatie correct verlopen is. Deze run kan bijgevolg niet gevalideerd worden daar er inhibitie is van de amplificatie.

54


4.4

Patiënt 1 - 2 - 3 (Methode 1, protocol A en B)

Figuur 4-4: Resultaat run patiënt 1 - 2 - 3, methode 1 protocol A en B Tabel 4-3: Ct-waarden run patiënt 1 - 2 - 3, methode 1 protocol A en B Exon 4 12ALA 12ASP 12ARG 12CYS 12SER 12VAL 13ASP

Mixed Standard 29,03 29,98 28,02 27,47 26,99 28,72 27,05 29,03

1-1A 40,00

1-1B 40,00

2-1A 37,40

2-1B 36,77

3-1A 37,28

3-1B 36,73

40,00

37,89 40,00

37,60

37,12

3-1A

3-1B

36,95

40,00

Tabel 4-4: delta Ct-waarden run patiënt 1 - 2 - 3, methode 1 protocol A en B 12ALA 12ASP 12ARG 12CYS 12SER 12VAL 13ASP

Mixed Standard 0,95 -1,01 -1,56 -2,04 -0,31 -1,98 0,00

1-1A

1-1B

2-1A

2-1B

2,72 0,32 0,49 0,00

0,39

0,18

0,00

Uit de manueel berekende ΔCt-waarden kunnen de aanwezige K-RAS mutaties afgeleid worden (Tabel 4-5).

55


Tabel 4-5: Mutatiestatus patiënt 1 - 2 - 3

1-1A 1-1B 2-1A 2-1B 3-1A 3-1B

Verwachte mutatie 13ASP 13ASP 12VAL 12VAL 12CYS 12CYS

Experimentele mutatie 13ASP 13ASP 12VAL 12VAL 12CYS 12CYS

De experimenteel bekomen mutatiestatus komt overeen met deze die verwacht werd. Bij staal 3-1A zien we dat er twee mogelijke mutaties zijn, namelijk 12CYS en 12ASP. Als we de amplificatiecurven van dit staal nader bekijken (Fig. 4-5) zien we dat de 12ASP mutatie slechts weinig opkomt. Deze mutatie is dus het gevolg van kruisreactiviteit en wordt niet gerapporteerd.

Figuur 4-5: Amplificatiecurve staal 3-1A

56


Figuur 4-6: Resultaat interne controle run patiënt 1 - 2 - 3, methode 1 protocol A en B Tabel 4-6: Ct-waarden interne controle run patiënt 1 - 2 - 3, methode 1 protocol A en B Exon 4 12ALA 12ASP 12ARG 12CYS 12SER 12VAL 13ASP

Mixed Standard 40,00

NTC 40,00

1-1A 40,00

1-1B 40,00

2-1A 40,00

2-1B 40,00

3-1A 40,00

40,00 40,00 40,00 40,00 40,00 40,00

40,00 40,00 40,00 40,00 40,00 40,00

40,00 40,00 40,00 39,20 40,00 40,00

40,00 40,00 40,00 40,00 40,00 40,00

40,00 40,00 38,88 40,00 40,00 40,00

40,00 40,00 40,00 40,00 40,00 40,00

40,00

3-1B 40,00

40,00 39,52 40,00 40,00 40,00

40,00 40,00 40,00 40,00

De interne controle bij de 12ALA mutatie reactiemix is echter niet opgekomen waardoor we niet met zekerheid kunnen aannemen of deze mutatie al dan niet aanwezig is (Fig. 46; Tabel 4-6). Ook de 12ARG mutatiemix bij staal 3-1A en de 12ASP mutatiemix bij staal 3-1B is niet opgekomen. Doordat de interne controle op deze plaatsen niet opgekomen is wordt deze run niet gevalideerd door de LightCycler® Adapt Software en wordt de mutatiestatus niet automatisch berekend. Bijlage I: LightCycler® Adapt Software rapport patient 1, 2 en 3 methode 1, protocol A en B.

57


4.5

Patiënt 1 - 2 - 3 - 4 - 5 (Methode 2, protocol A en B)

Figuur 4-7: Resultaat run patiënt 1 - 2 - 3 - 4 - 5, methode 2 protocol A en B Tabel 4-7: Ct-waarden run patiënt 1 - 2 - 3 - 4 - 5, methode 2 protocol A en B Exon 4 12ALA 12ASP 12ARG 12CYS 12SER 12VAL 13ASP

Mixed Standard 28,88 28,33 29,27 28,59 29,94 28,94 27,08 29,92

1-2A 35,89

1-2B 35,74

2-2A 33,44 40,00

2-2B 34,48

40,00

40,00 3-2B 32,64 40,00 40,00 40,00 37,81 40,00 40,00 40,00

40,00 4-2A 31,99 40,00 36,16 40,00

40,00 37,42

34,67

35,46

4-2B 30,04

5-2A 32,88 40,00 40,00

36,75

3-2A 32,99

40,00 5-2B 34,47 40,00

40,00 40,00 40,00

58


Tabel 4-8: delta Ct-waarden run patiënt 1 - 2 - 3 - 4 - 5, methode 2 protocol A en B 12ALA 12ASP 12ARG 12CYS 12SER 12VAL 13ASP

Mixed Standard -0,55 0,39 -0,29 1,06 0,06 -1,8 1,04

1-2A

1-2B

2-2A 6,56

2-2B

6,56

4,11 3-2B 7,36 7,36 7,36 5,17 7,36 7,36 7,36

4,26 4-2A 8,01 4,17 8,01

7,01 4,43

1,23

0,98

4-2B

5-2A 7,12 7,12

6,71

3-2A

7,01 5-2B 5,53

8,01 9,96 8,01

Uit de manueel berekende ΔCt-waarden kunnen de aanwezige K-RAS mutaties afgeleid worden (Tabel 4-9). Tabel 4-9: Mutatiestatus patiënt 1 - 2 - 3 - 4 - 5

1-2A 1-2B 2-2A 2-2B 3-2A 3-2B 4-2A 4-2B 5-2A 5-2B

Verwachte mutatie 13ASP 13ASP 12VAL 12VAL 12CYS 12CYS 12ASP 12ASP 12ASP 12ASP

Experimentele mutatie 13ASP 13ASP 12VAL 12VAL 12CYS 12CYS 12ASP 12ASP 12ASP 12ASP

De experimenteel bekomen mutatiestatus komt voor elk staal overeen met deze die verwacht werd. Als er meerdere mogelijke mutaties zijn wordt deze met de laagste ΔCtwaarde aangenomen daar de mutaties met een hogere waarde het gevolg zijn van kruisreactiviteit.

59


Figuur 4-8: Resultaat interne controle run patiënt 1 - 2 - 3 - 4 - 5, methode 2 protocol A en B Tabel 4-10: Ct-waarden interne controle run patiënt 1 - 2 - 3 - 4 - 5, methode 2 protocol A en B Mixed Standard NTC 1-2A 1-2B 2-2A 2-2B 3-2A 3-2B 4-2A 4-2B Exon 4 40,00 40,00 38,53 34,99 40,00 40,00 40,00 12ALA 40,00 40,00 40,00 40,00 40,00 40,00 40,00 40,00 40,00 40,00 12ASP 40,00 40,00 40,00 40,00 40,00 40,00 40,00 37,59 38,84 12ARG 40,00 40,00 40,00 40,00 40,00 40,00 40,00 40,00 40,00 12CYS 40,00 40,00 40,00 40,00 38,97 40,00 12SER 40,00 40,00 40,00 40,00 39,01 40,00 37,95 40,00 40,00 12VAL 40,00 40,00 40,00 40,00 40,00 35,98 39,40 40,00 40,00 40,00 13ASP 40,00 38,91 40,00 40,00 40,00 37,84 38,45 40,00

5-2A 40,00 40,00 40,00 40,00 38,23 40,00 40,00

De interne controle bij het staal 5-2B is nergens opgekomen waardoor we hier niet met zekerheid kunnen aannemen welke mutatie er voor dit staal aanwezig is. Ook bij de overige stalen zijn er een aantal interne controles niet opgekomen (Fig. 4-8; Tabel 4-10). De mutaties voor deze stalen kunnen dus niet met zekerheid gerapporteerd worden. Doordat de interne controle op deze plaatsen niet opgekomen is wordt deze run niet gevalideerd door de LightCycler® Adapt Software en wordt de mutatiestatus niet automatisch berekend. Bijlage II: LightCycler® Adapt Software rapport patient 1, 2, 3, 4 en 5 methode 2, protocol A en B.

60

5-2B


4.6

Patiënt 6 - 8 - 9 - 10 (Methode 2 protocol A en B)

Figuur 4-9: Resultaat run patiënt 6 - 8 - 9 - 10, methode 2 protocol A en B Tabel 4-11: Ct-waarden run patiënt 6 - 8 - 9 - 10, methode 2 protocol A en B

Exon 4 12ALA 12ASP 12ARG 12CYS 12SER 12VAL 13ASP

Mixed Standard 28,01 26,52 28,04 26,88 27,82 27,67 27,19 27,23

6-2A 34,84

6-2B 34,49

38,75 40,00

40,00

8-2A 32,11

8-2B 31,62

9-2A 30,86

9-2B 30,73

10-2A 32,15

36,41

37,08

40,00 40,00 37,34

40,00 37,95

40,00 40,00

40,00 40,00

40,00

9-2A

9-2B

10-2A

10-2B

5,55

6,35

7,85 7,85 5,19

9,14

9,27 9,27

7,85 7,85

40,00

40,00 40,00

10-2B

Tabel 4-12: delta Ct-waarden run patiënt 6 - 8 - 9 - 10, methode 2 protocol A en B

12ALA 12ASP 12ARG 12CYS 12SER 12VAL 13ASP

Mixed Standard -1,49 0,03 -1,13 -0,19 -0,34 -0,82 -0,78

6-2A

6-2B

3,91 5,16

5,51

8-2A

8-2B

8,38

8,38

Uit de manueel berekende ΔCt-waarden kunnen de aanwezige K-RAS mutaties afgeleid worden. Dit kan echter niet voor het staal 8-2A daar er hier geen mutatie assay is opgekomen en ook niet voor staal 10-2A wegens het niet opkomen van de controle assay (Tabel 4-13). 61


Tabel 4-13: Mutatiestatus patiënt 6 - 8 - 9 - 10

6-2A 6-2B 8-2A 8-2B 9-2A 9-2B 10-2A 10-2B

Verwachte Experimentele mutatie mutatie 12ASP 12ASP 12ASP 12ASP 12ASP 12ASP 12ASP 12ASP 12ASP 12ASP 12SER 12CYS 12SER

De experimenteel bekomen mutatiestatus komt voor patiënt 6 en 9 overeen met deze die verwacht werd. Voor patiënt 8 kan er niet afgeleid worden welke mutatie er aanwezig is. Dit is bij staal 8-2A te wijten aan de afwezigheid van een mutatie assay. Bij staal 8-2B kan de mutatie niet afgeleid worden wegens de aanwezigheid van twee mogelijke mutaties die beide wijzen op kruisreactiviteit. Staal 10-2A wijst volgens de experimenteel bekomen resultaten op de aanwezigheid van 12CYS mutatie. Dit komt echter niet overeen met de verwachte mutatie en wordt later verder onderzocht.

Figuur 4-10: Resultaat interne controle run patiënt 6 - 8 - 9 - 10, methode 2 protocol A en B

62


Tabel 4-14: Ct-waarden interne controle run patiënt 6 - 8 - 9 - 10, methode 2 protocol A en B


Mixed Standard 40,00 40,00 40,00 40,00 40,00 40,00 40,00 40,00

NTC 39,28 40,00 40,00 40,00 40,00 40,00 40,00 40,00

6-2A 37,49 40,00 40,00 40,00 40,00 40,00 40,00 38,67

6-2B 38,28 40,00 40,00 40,00 40,00 40,00 40,00 38,81

8-2A 40,00 39,16 40,00 38,98 40,00 39,35 40,00 40,00

8-2B 31,67 40,00 40,00 40,00 40,00 40,00 40,00

9-2A 40,00 40,00 40,00 40,00 36,42 40,00 40,00

9-2B 40,00 40,00 40,00 40,00 40,00 39,27 40,00 40,00

10-2A

10-2B

37,28 40,00 40,00 40,00 40,00 40,00 40,00

37,95 40,00 40,00 40,00 40,00 40,00 40,00

De interne controle voor exon 4 is bij een aantal stalen niet opgekomen (Fig. 4-10; Tabel 4-14). Dit veroorzaakt dus terug onzekerheid bij het afleiden van de aanwezige mutatie. Desondanks wordt deze run wel gedeeltelijk gevalideerd door de LightCycler® Adapt Software en dit voor de stalen 9-2A, 9-2B en 10-2A (Tabel 4-15). Deze mutaties komen overeen met deze die manueel werden berekend. Voor staal 10-2A komt de mutatie echter niet overeen met de verwachte. Tabel 4-15: Mutatiestatus patiënt 6 - 8 - 9 - 10 volgens de LightCycler® Adapt Software Software mutatie 6-2A 6-2B 8-2A 8-2B 9-2A 9-2B 10-2A 10-2B

12ASP 12ASP 12CYS

Bijlage III: LightCycler® Adapt Software rapport patiënt 6, 8, 9 en 10 methode 2, protocol A en B.

4.7

Patiënt 1 - 2 - 3 - 4 - 5 (Methode 2 protocol A en B ½ verdund)

Doordat de interne controle bij de voorgaande runs voor een groot aantal staaltjes niet is opgekomen wordt er nu een run ingezet met de stalen ½ verdund. Hierdoor zal de DNA concentratie lager liggen en de curven later opkomen. Door deze verdunning uit te voeren wordt verwacht dat er minder inhibitie zal zijn van de interne controle. Als de interne con-

63


trole dus niet geïnhibeerd wordt zal de run wel volledig gevalideerd worden door de LightCycler® Adapt Software en wordt de mutatiestatus automatisch berekend.

Figuur 4-11: Resultaat run patiënt 1 - 2 - 3 - 4 - 5, methode 2 protocol A en B, 1/2 verdund Tabel 4-16: Ct-waarden run patiënt 1 - 2 - 3 - 4 - 5, methode 2 protocol A en B, 1/2 verdund Exon 4 12ALA 12ASP 12ARG 12CYS 12SER 12VAL 13ASP

Mixed Standard 34,55 27,13 27,05 27,55 27,17 28,32 27,20

1-2A 37,40

1-2B 38,42 40,00

2-2A 37,21 40,00 40,00

2-2B 39,01 40,00 40,00

3-2A

39,46

3-2B 36,67

40,00 36,50

36,05

36,49

4-2A 35,59

4-2B 34,77

5-2A 36,19

34,96

34,30

36,60

5-2B 44,88

39,04 40,00

64


Tabel 4-17: delta Ct-waarden run patiënt 1 - 2 - 3 - 4 - 5, methode 2 protocol A en B, 1/2 verdund 12ALA 12ASP 12ARG 12CYS 12SER 12VAL 13ASP

Mixed Standard -7,42 -7,5 -7 -7,38 -6,23 -7,35

1-2A

1-2B

2-2A 2,79 2,79

2-2B 0,99 0,99

-1,16

-2,52

4-2A

4-2B

5-2A

-0,63

-0,47

0,41

1,58

3-2B

3,33 -0,17

3-2A

5-2B

3,45 5,23

Uit de manueel berekende ΔCt-waarden kunnen de aanwezige K-RAS mutaties afgeleid worden (Tabel 4-18). Tabel 4-18: Mutatiestatus patiënt 1 - 2 - 3 - 4 - 5

1-2A 1-2B 2-2A 2-2B 3-2A 3-2B 4-2A 4-2B 5-2A 5-2B

Verwachte Experimentele mutatie mutatie 13ASP 13ASP 12ASP 12VAL 12VAL 12VAL 12VAL 12CYS 12CYS 12CYS 12ASP 12ASP 12ASP 12ASP 12ASP 12ASP 12ASP

De experimenteel bekomen mutaties komen echter niet altijd overeen met de verwachte mutaties. Dit was bij dezelfde staaltjes, onverdund, wel het geval. Hieruit kan dus besloten worden dat het verdunnen van de staaltjes in dit geval geen positief effect heeft op de analyse. Ook de interne controles zijn niet overal opgekomen (Fig. 4-12; Tabel 4-19). Het verdunnen heeft dus niet voor minder inhibitie van de interne controle gezorgd.

65


Figuur 4-12: Resultaat interne controle run patiënt 1 - 2 - 3 - 4 - 5, methode 2 protocol A en B, 1/2 verdund Tabel 4-19: Ct-waarden interne controle run patiënt 1 - 2 - 3 - 4 - 5, methode 2 protocol A en B, 1/2 verdund


Mixed Standard 32,65 40,00 40,00 40,00 40,00 40,00 40,00

NTC 40,00 38,82 38,42 40,00 40,00 40,00 40,00

1-2A 40,00 38,41 40,00 40,00 40,00 38,45 40,00

1-2B 40,00 38,73 40,00 40,00 40,00 37,90 40,00

2-2A

2-2B

3-2A

3-2B

4-2A

4-2B

40,00 40,00 40,00 40,00 40,00 40,00

40,00 40,00 40,00 39,22 39,56 39,55

40,00 40,00 40,00 40,00 38,24 40,00

40,00 38,72 40,00 40,00 38,51 40,00

37,08 40,00 40,00 40,00 40,00 40,00

37,90 40,00 40,00 40,00 40,00 40,00

5-2A 36,10 40,00 39,40 40,00 40,00 40,00 40,00

Bij deze run is de interne controle bij exon 4 voor een groot aantal stalen niet opgekomen. Bij deze stalen kan de mutatiestatus weeral niet met zekerheid aangenomen worden. Ook voor de 13ASP mutatie assay is de interne controle nergens opgekomen. Men kan dus voor geen enkel staal afleiden of deze mutatie al dan niet aanwezig is (Fig. 4-12; Tabel 419). Deze run kan onmogelijk gevalideerd worden door de LightCycler® Adapt Software. Bijlage IV: LightCycler® Adapt Software rapport patiënt 1, 2, 3, 4 en 5 methode 2, protocol A en B, ½ verdund. Bij de volgende runs die ingezet worden zal er extra aandacht besteed worden aan de bereiding van de mastermixen en het pipetteren van de plaat. Hiermee willen we nagaan

66

5-2B

40,00 40,00 40,00 40,00


of het niet opkomen van de interne controle misschien te maken heeft met het onvoldoende gemengd zijn van de mixen.

4.8

Patiënt 6 - 8 - 9 - 10 (Methode 2 protocol A en B ½ verdund)

Van de patiënten 6, 8, 9 en 10 wordt de run opnieuw ingezet, dit terug voor methode 2. Nu worden de staaltjes ½ verdund om inhibitie van de interne controle te vermijden maar er wordt daarenboven ook extra rekening gehouden met de bereiding van de mastermixen, dit om zeker te zijn dat alle componenten overgepippeteerd worden in de welletjes van de PCR-plaat en hun bijdrage leveren aan de PCR-analyse.

Figuur 4-13: Resultaat run patiënt 6 - 8 - 9 - 10, methode 2 protocol A en B, ½ verdund Tabel 4-20: Ct-waarden run patiënt 6 - 8 - 9 - 10, methode 2 protocol A en B, ½ verdund


Mixed Standard 27,96 26,80 26,18 26,91 26,29 27,22 27,04 27,33

6-2A 36,03

6-2B 33,77

8-2A 32,89

8-2B 30,49

37,45

36,10 35,64

36,58 33,92

36,90 38,86

40,00 40,00

39,47

9-2A 30,49 34,77 33,09

9-2B 30,51

10-2A 31,24

33,09 38,25 33,77

40,00

40,00 36,97 40,00

67

10-2B 31,30 40,00 36,98 39,21 32,49 40,00 40,00 35,79


Tabel 4-21: delta Ct-waarden run patiënt 6 - 8 - 9 - 10, methode 2 protocol A en B, ½ verdund


Mixed Standard -1,16 -1,78 -1,05 -1,67 -0,74 -0,92 -0,63

6-2A

6-2B

8-2A

8-2B

1,42

2,33 1,87

3,69 1,03

6,41 8,37

9,51 6,23

6,58

9-2A 4,28 2,60

9-2B

10-2A

2,58 7,74 3,26

9,51

9,49 6,46 9,49

Bij deze run komen alle curven zeer mooi op en liggen de Ct-waarden binnen de aanvaardbare grenzen (Fig 4-13; Tabel 4-20), wat bij de vorige runs niet altijd het geval was. Een nauwkeuriger bereiding van de mastermixen speelt dus zeker een rol bij de eigenlijke PCR-analyse. Hiermee zal er tijdens volgende analyses zeker rekening moeten gehouden worden. Uit de manueel berekende ΔCt-waarden kunnen de aanwezige K-RAS mutaties afgeleid worden (Tabel 4-22). Dit kan echter niet nauwkeurig voor patiënt 8 daar er hier te veel twijfel bestaat over de eventueel aanwezige mutaties. Ook voor patiënt 10 kunnen we zien dat de experimentele mutatie terug wijst op 12CYS terwijl het eigenlijk 12SER moet zijn. Tabel 4-22: Mutatiestatus patiënt 6 - 8 - 9 - 10

6-2A 6-2B 8-2A 8-2B 9-2A 9-2B 10-2A 10-2B

Verwachte Experimentele mutatie mutatie 12ASP 12ASP 12ASP 12ASP 12ASP 12ASP 12ASP 12ASP 12ASP 12ASP 12SER 12CYS 12SER 12CYS

68

10-2B 8,70 5,68 7,91 1,19 8,70 8,70 4,49


Figuur 4-14: Resultaat interne controle run patiënt 6 - 8 - 9 - 10, methode 2 protocol A en B, ½ verdund

Door bij deze run rekening te houden met de bereiding van de mastermixen en uiterst nauwkeurig te pipetteren zijn alle interne controles mooi opgekomen (Fig. 4-14). Deze run zal dus gevalideerd worden door de LightCycler® Adapt Software waarbij de mutatiestatus per staal automatisch berekend wordt (Tabel 4-23). Toch zijn er ook hier een aantal mutaties die zelfs met de Adapt Software niet kunnen opgespoord worden. Dit is het geval voor patiënt 8. Ook voor het staal 6-2A wordt de mutatiestatus niet automatisch berekend, dit is de wijten aan de Ct-waarde die zich boven de 35 bevindt wat dus wijst op een te lage DNA-concentratie. Tabel 4-23: Mutatiestatus patiënt 6 - 8 - 9 - 10 volgens de LightCycler® Adapt Software

6-2A 6-2B 8-2A 8-2B 9-2A 9-2B 10-2A 10-2B

Verwachte Software mutatie mutatie 12ASP 12ASP 12ASP 12ASP 12ASP 12ASP 12ASP 12ASP 12ASP 12SER 12CYS 12SER 12CYS

Bijlage V: LightCycler® Adapt Software rapport patient 6, 8, 9 en 10 methode 2, protocol A en B, ½ verdund. 69


Als we nu een vergelijking maken tussen het opkomen van de interne controles bij één coupe rechtstreeks in een tube tegenover twee coupes rechtstreeks in de tube kan hieruit afgeleid worden dat de interne controle telkens vroeger opkomt bij de PCR waarbij er slecht één coupe in de tube gebracht werd (Fig. 4-15; 4-16; 4-17; 4-18).

Figuur 4-15: Interne controle patiënt 6; links = 1 coupe/tube; rechts = 2 coupes/tube



70



Uit deze bevindingen kan er besloten worden dat het protocol waarbij er slechts één coupe rechtstreeks in het epje wordt gebracht de minste inhibitie van de interne controle teweegbrengt. Indien er teveel weefsel aanwezig is zorgt dit voor een minder nauwkeurige extractie door MagNa Pure waardoor er ook een grotere kans is op inhibitie van de amplificatie bij de PCR-analyse. Dit omdat er eventueel nog onzuiverheden in de extracten aanwezig zijn die een correcte amplificatie kunnen verhinderen.

4.9

Patiënt 8 - 9 - 10 (Methode 1 protocol A en B)

Nu alle PCR-analyses min of meer valideerbaar zijn wordt er ook nog eens een run ingezet van de coupes die op glaasjes gebracht werden om na te gaan welke methode en protocol er het beste resultaat geeft. Van patiënt 8 wordt dit uitgevoerd met en zonder een verdunning van ½ omdat dit staal moeilijk te analyseren valt. Voor patiënt 9 en 10 wordt enkel een PCR-analyse gedaan waarbij er geen voorgaande verdunning uitgevoerd wordt.

71


Figuur 4-19: Resultaat run patiënt 8 - 9 - 10, methode 1 protocol A en B Tabel 4-24: Ct-waarden run patiënt 8 - 9 - 10, methode 1 protocol A en B


Mixed Standard 28,62 27,54 27,32 27,02 26,85 26,56 28,27

8-1A 32,45

8-1B 32,64

40,00 40,00

40,00

40,00

40,00 40,00

8-1A2 33,53

40,00

8-1B2 32,50 38,60 40,00

9-1A 33,45

9-1B 33,00

10-1A 33,98

10-1B 34,17

36,80

36,92

40,00 40,00 35,76

40,00 40,00 36,93

40,00

40,00

9-1A

9-1B

10-1A

10-1B

3,35

3,92

6,02 6,02 1,78

5,83 5,83 2,76

7,00

6,02

40,00

Tabel 4-25: delta Ct-waarden run patiënt 8 - 9 - 10, methode 1 protocol A en B


Mixed Standard -1,08 -1,30 -1,60 -1,77 -28,62 -2,06 -0,35

8-1A

8-1B

7,55 7,55

7,36

7,55

7,36 7,36

8-1A2

6,47

8-1B2 6,10 7,50

7,50

Ook bij deze run komen alle curven zeer mooi op en liggen de Ct-waarden binnen de aanvaardbare grenzen (Fig 4-19; Tabel 4-24). Uit de manueel berekende ΔCt-waarden kunnen de aanwezige K-RAS mutaties afgeleid worden (Tabel 4-26). Voor patiënt 8 is dit echter terug niet nauwkeurig mogelijk aangezien er ook hier te veel twijfel bestaat over de

72


eventueel aanwezige mutaties. Ook voor patiënt 10 wijst de experimentele mutatie ook hier terug op 12CYS terwijl het eigenlijk 12SER moet zijn. Tabel 4-26: Mutatiestatus patiënt 8 - 9 - 10

8-2A 8-2B 8-2A2 8-2B2 9-2A 9-2B 10-2A 10-2B

Verwachte Experimentele mutatie mutatie 12ASP 12ASP 12ASP 12ASP 12ASP 12ASP 12ASP 12ASP 12SER 12CYS 12SER 12CYS

Figuur 4-20: Resultaat interne controle voor exon 4 bij run patiënt 8 - 9 - 10, methode 1 protocol A en B

Bij deze run zijn er echter terug een aantal interne controles niet opgekomen, dit bij exon 4 (Fig. 4-20). Deze run kan dus niet gevalideerd worden door de LightCycler® Adapt Software waardoor we enkel manueel de mutatiestatus kunnen berekenen. Bijlage VI: LightCycler® Adapt Software rapport patiënt 8, 9 en 10 methode 1, protocol A en B. Als we ook hier bij methode 1 een vergelijking maken tussen het opkomen van de interne controles bij één coupe op een glaasje tegenover twee coupes op een glaasje kan hieruit afgeleid worden dat de interne controle telkens vroeger opkomt bij de PCR waarbij er slecht één coupe op het glaasje gebracht werd (Fig. 4-21; 4-22; 4-23). 73


Figuur 4-21: Interne controle patiënt 8; links = 1 coupe/glaasje; rechts = 2 coupes/glaasje



Tussen het gebruik van methode 1 versus methode 2 bestaan er geen kritische verschillen in nauwkeurigheid bij de PCR-analyse.

74

Opsporen van K-RAS mutaties op colontumoren Conclusie

5

Conclusie

De bedoeling van dit eindwerk was de evaluatie van een testmethode voor de analyse van K-RAS mutaties bij patiënten met colorectale kanker waarvan de mutatiestatus reeds gekend is. Voor het onderzoek werd gebruik gemaakt van DNA-monsters geëxtraheerd uit in paraffine ingebed colorectaal tumorweefsel. De extractie van het DNA uit het weefsel gebeurde automatisch met behulp van de MagNA Pure LC 2.0. Als voorbereiding op de extractie werden er vier deparaffinisatiemogelijkheden uitgetest. Enerzijds werd er gebruik gemaakt van coupes die eerst op glaasjes werden gebracht alvorens in epjes over te brengen, anderzijds coupes die onmiddellijk in een epje werden gebracht. Deze twee manieren werden beide uitgevoerd eens met één coupe en eens met twee coupes. Uit experimentele bevindingen kan er besloten worden dat het protocol waarbij er slechts één coupe gebruikt wordt de minste inhibitie van de interne controle teweegbrengt. Indien er teveel weefsel aanwezig is zorgt dit voor een minder nauwkeurige extractie door MagNa Pure waardoor er ook een grotere kans is op inhibitie van de amplificatie bij de PCRanalyse. Dit omdat er eventueel nog onzuiverheden in de extracten aanwezig zijn die een correcte amplificatie kunnen verhinderen. De MagNA Pure LC 2.0 levert dus de beste extracten indien er niet teveel te extraheren materiaal aanwezig is. Tussen het gebruik van methode 1 versus methode 2 bestaan er geen kritische verschillen in nauwkeurigheid bij de PCR-analyse. Een reden om toch voor methode 1 te kiezen in plaats van methode 2 zit in het feit dat er voor de extractie van het DNA bij methode 2 tweemaal een overnachtincubatie vereist is in tegenstelling tot methode 1. Als we dus kiezen voor methode 1, nl. coupes op glaasjes tijdens het deparaffiniseren, zorgt dit voor minder tijdsverlies wat niet onbelangrijk is. De eigenlijke analyse van de mutatiestatus gebeurt via ‘real time’-PCR met de LightCycler® 480. Om na te gaan of dit instrument correcte resultaten levert worden de experimentele waarden vergeleken met de verwachte. Over het algemeen kan geconcludeerd worden dat deze beide overeenkomen. Bij de eerst uitgevoerde analyses was er echter een probleem met de interne controles. Doordat deze niet wilden opkomen kon de run niet gevalideerd door de LightCycler® Adapt Software waardoor de mutatiestatus bijgevolg niet automatisch berekend wordt. Omdat er zich geen mogelijkheid aanbood de DNA concentraties van de extracten te meten kon het zijn dat het niet opkomen van de interne 75

Opsporen van K-RAS mutaties op colontumoren Conclusie

controles te wijten was een te hoge concentratie aan DNA. Een eerste mogelijke oplossing bestond er dus in de extracten ½ te verdunnen om overbelasting van de mutatieassay te vermijden. Hierdoor zou er minder inhibitie van de interne controle moeten zijn. Uit verdere analyses bleek echter dat een verdunning alleen niet voldoende is om inhibitie van de amplificatie te vermijden. Een volgende oplossing was om, naast een ½ verdunning, zeer zorgvuldig en beheerst de mastermixen te bereiden. Door deze bereidingswijze te respecteren en door zowel de standaard als de extracten goed op te mengen alvorens over de plaat te verdelen worden betrouwbare resultaten verkregen. Alle curven komen mooi op wat op een correcte amplificatie wijst en ook de Ct-waarden liggen binnen de aanvaardbare grenzen. Om een correcte PCR-analyse te verkrijgen is het dus belangrijk dat er rekening gehouden wordt met deze bereiding. Het is van cruciaal belang dat de mastermixen op een uiterst nauwkeurige manier aangemaakt worden omdat anders niet alle componenten overgepipetteerd worden en zo een foutief resultaat leveren. Het is ten eerste belangrijk dat alle reactiemixen na ontdooien goed gemengd worden alvorens de mastermixen effectief te bereiden alsook na de bereiding dat alles nog eens gemengd wordt voordat men gaat overpipetteren in de PCR-plaat. Ondanks de mogelijkheid om nu correcte PCR-resultaten te verkrijgen blijft er echter één staal waarbij de exacte mutatiestatus niet kan achterhaald worden, nl. staal 8. Een reden hiervoor kan zijn dat het geëxtraheerde DNA van dit weefsel zeer gevoelig is aan kruisreactiviteit en bijgevolg verschillende mutaties aangeeft. Een andere mogelijkheid bestaat erin dat er onvoldoende DNA aanwezig is waardoor een correcte mutatie niet kan gedetecteerd worden. Beter zou dus zijn om van elke extract de DNA concentratie te bepalen om na te gaan of deze niet te hoog of te laag ligt. Op deze manier zouden twijfeldilemma’s zoals het al of niet verdunnen uitgeschakeld worden. Anderzijds is het voor de uiteindelijke behandeling niet zozeer belangrijk welke mutatie er aanwezig is maar eerder of er wel sprake is van een mutatie. Dit omdat een remmerbehandeling op de epidermale groeifactor receptor slechts nuttig is indien er geen K-RAS mutatie aanwezig is en dus niet toegepast wordt bij patiënten die aan een dergelijke mutatie lijden. Algemeen kan men dus toch aannemen dat deze nieuwe methode ter opsporing van KRAS mutaties snelle resultaten levert die daarenboven betrouwbaar zijn. Er mag echter niet vergeten worden om zeer zorgvuldig en nauwkeurig met de mastermixen om te springen omdat dit een zeer cruciale stap is in het verkrijgen van correcte analyses. 76


Literatuurlijst 1. Kampman, E en Cats, A., Wat is dikkedarmkanker en wat is het beloop?, 13 maart 2006, RIVM Nationaal Kompas Volksgezondheid. URL: [http://www.rivm.nl/vtv/object_document/o1156n17273.html] Gezien 21 februari 2008 2. Stevens, A; Lowe, J. (2003). Pathologie. Houten, Bohn Stafleu van Loghum. ISBN 90 313 3475 8 3. Van Os, Th.; Schrander-Stumpel; De Nijs Bik, H. (2002). Klinische genetica (34): erfelijke vormen van colorectaal carcinoom. Patient Care, 29, 33-42. URL: [http://www.erfelijkheid.nl/documentatie/pdf/pc/pc34.pdf] 4. Chirurgische Oncologie Utrecht, KankerOperatie.nl, 2005, Lennart Hennipman. URL: [http://www.kankeroperatie.nl/anatomie/anatomie/anatomie-en-functie-van-dedarm.html] Gezien 21 februari 2008 5. Natuurinformatie.nl, Trezorix URL: [http://www.natuurinformatie.nl/nnm.dossiers/natuurdatabase.nl/i003642.html] Gezien 21 februari 2008 6. Offerhaus G.J.A. en Slebos R.J.C. (1995). Moleculair-genetische detectie van colorectumcarcinoom in de faeces. Nederlands Tijdschrift voor geneeskunde, 139, 27142715. URL: [http://www.ntvg.nl/publicatie/moleculair-genetische-detectie-van-colo/volledig] 7. Willems, A. (2007). Hematologie. Hemato-oncologie. Brugge: Howest Simon Stevin. 8. Physicians Committee for Responsible Medicine, Kanker en voeding, 18 november 1998. URL: [http://users.telenet.be/myprojects/gezondevoeding/gezondheid/kanker.html] Gezien 27 februari 2008 9. Federico Sopeña, Angel Ferrandez, and Angel Lanas (2008). Noninvasive diagnostic modalities for early detection of colorectal cancer. Current Colorectal Cancer Reports, 1, 24-33. URL: [http://www.springerlink.com/content/eg45r2m4q3135141] 10. D.W. Swinkels (1998). Detectie van tumorspecifiek DNA in feces en bloed van patiënten met een colorectumcarcinoom. Nederlands Tijdschrift voor geneeskunde, 23, 193194. 11. Jaap Stoker en Han Laméris (2002). Bevolkingsonderzoek naar colorectaal carcinoom. Nederlandse vereniging voor radiologie. URL: [http://www.radiologen.nl/36/798/artikelen-en-opinies/bevolkingsonderzoek-naarcolorectaal-carcinoom.html] 12. Jaap Stoker (2006). Virtuele coloscopie (CT- en MR-colografie). Nederlandse vereniging voor radiologie. URL: [http://www.radiologen.nl/36/3051/artikelen-en-opinies/virtuele-coloscopie-ct-enmr-colografie-jaap-stoker.html] 77


13. Eaden JA, Abrams KR, Mayberry JF (2001). The risk of colorectal cancer in ulcerative colitis: a meta-analysis. Gut, 48, 526-535. URL: [http://gut.bmj.com/cgi/content/abstract/48/4/526] 14. Eaden JA, Mayberry JF (2002). Guidelines for screening and surveillance of asymptomatic colorectal cancer in patients with inflammatory bowel disease. Gut, 51, V10– V12. URL: [http://www.bsg.org.uk/pdf_word_docs/ccs4.pdf] 15. Jenkins PJ, Fairclough PD (2002). Screening guidelines for colorectal cancer and polyps in patients with acromegaly. Gut, 51, V13–V14. URL: [http://gut.bmj.com/cgi/content/full/51/suppl_5/v13] 16. Woodhouse CR (2002). Guidelines for monitoring of patients with ureterosigmoidostomy. Gut, 51, V15–V16. URL: [http://gut.bmj.com/cgi/content/full/51/suppl_5/v15] 17. Kampman, E en Cats, A., Welke factoren beïnvloeden de kans op dikkedarmkanker?, 13 maart 2006, RIVM Nationaal Kompas Volksgezondheid. URL: [http://www.rivm.nl/vtv/object_document/o1162n17273.html] Gezien 2 maart 2008 18. Kampman, E en Cats, A., Wat zijn de mogelijkheden voor diagnostiek en behandeling?, 13 maart 2006, RIVM Nationaal Kompas Volksgezondheid. URL: [http://www.rivm.nl/vtv/object_document/o1164n17273.html] Gezien 2 maart 2008 19. VLK, Vlaamse Liga tegen Kanker. URL: [http://www.tegenkanker.net/node/447] Gezien 3 maart 2008 20. Heideman, D.A.M. (2009). EGFR en K-ras mutatie analyse binnen de moleculaire diagnostiek in de pathologie. VAP Visie, 2, 42-43. 21. Pao, W.; Wang, T.Y.; Riely, G.J.; Miller, V.A.; Pan, Q.; Ladanyi, M.; Zakowski, M.F.; Heelan, R.T.; Kris, M.G.; Varmus, H.E. (2005). KRAS Mutations and primary resistance of lung adenocarcinomas to Gefitinib or Erlotinib. PLoS Medicine, 2, 57-61. 22. DXS Limited, DXS Diagnostic Innovations, Cooltide Interactive. URL: [http://www.dxsdiagnostics.com/Content/KRASMutationTestKit.aspx] Gezien 3 maart 2008 23. Virga Jesseziekenhuis, 2008. URL: [http://www.virgajesse.be/deelwebsites/Moleculaire_Diagnostiek/Testinfo/Hematologie /Opsporen_van_APC-resistentie_met_behulp_van_PCR] Gezien 3 maart 2008 24. Stephen Little, Medical Device Link, 1996, Canon Communications LLC. URL: [http://www.devicelink.com/ivdt/archive/05/11/011.html] Gezien 3 maart 2008 25. Roche Diagnostics GmbH (2008). MagNA Pure LC 2.0 Instrument Operator’s Manual. Germany. 78


26. Demeyere, M. (2007). Biotechnologie I. DNA- en RNA-technieken. Brugge: Howest Simon Stevin. 27. Louagie, H. (2008). Hematologisch onderzoek II. Hematologie. Brugge: Howest Simon Stevin. 28. Luis E. Raez; Gilberto Lopes; Rogerio Lilenbaum. (2005). Clinical responses to Gefinitib after failure of treatment with cetuximab in advanced non-small-cell lung cancer. Journal of clinical oncology, 4244-4245. 29. Willems, A. (2007). Exploratie van de mens. Histologie. Brugge: Howest Simon Stevin. 30. West. (2009). What is EBFR and why do we target it? GRACE; Global Resource for Advancing Cancer Education. URL: [http://cancergrace.org/cancer-treatments/2009/03/02/egfr-basics/] 31. BioCat, BioCat Catalyze Your Success. URL: [http://www.biocat.com/cgibin/page/sub2.pl?main_group=gene_analysis&sub1=oligonucleotide_synthesis_servic e&sub2=black_hole_scorpions_synthesis_and_purification_service] Gezien 7 maart 2009

79


Bijlagen Bijlage I – LightCycler® Adapt Software rapport patiënt 1, 2 en 3 methode 1, protocol A en B. Bijlage II – LightCycler® Adapt Software rapport patiënt 1, 2, 3, 4 en 5 methode 2, protocol A en B. Bijlage III – LightCycler® Adapt Software rapport patiënt 6, 8, 9 en 10 methode 2, protocol A en B. Bijlage IV – LightCycler® Adapt Software rapport patiënt 1, 2, 3, 4 en 5 methode 2, protocol A en B, ½ verdund. Bijlage V – LightCycler® Adapt Software rapport patiënt 6, 8, 9 en 10 methode 2, protocol A en B, ½ verdund. Bijlage VI – LightCycler® Adapt Software rapport patiënt 8, 9 en 10 methode 1, protocol A en B.

80


Bijlage I – LightCycler® Adapt Software rapport patiënt 1, 2 en 3 methode 1, protocol A en B.

81


82


83


84


Bijlage II – LightCycler® Adapt Software rapport patiënt 1, 2, 3, 4 en 5 methode 2, protocol A en B.

85


86


87


88


Bijlage III – LightCycler® Adapt Software rapport patiënt 6, 8, 9 en 10 methode 2, protocol A en B.

89


90


91


92


Bijlage IV – LightCycler® Adapt Software rapport patiënt 1, 2, 3, 4 en 5 methode 2, protocol A en B, ½ verdund.

93


94


95


96


97


Bijlage V – LightCycler® Adapt Software rapport patiënt 6, 8, 9 en 10 methode 2, protocol A en B, ½ verdund.

98


99


100


101


Bijlage VI – LightCycler® Adapt Software rapport patiënt 8, 9 en 10 methode 1, protocol A en B.

102


103


104


105


Slotwoord De stage en het eindwerk waren voor mij een uitdaging om op basis van de leerstof en werkmethodes gedurende deze driejarige opleiding opgedaan dit eindwerk uit te werken. Het onderzoek gaf mij de mogelijkheid om op een doordachte en creatieve manier mijn kennis en vaardigheden extra te ontplooien. Bij elke stap naar de opbouw van dit eindwerk werd nieuwe kennis opgedaan of kon ik reeds opgedane kennis in praktijk omzetten. Daarnaast werd ook mijn doorzettingsvermogen en zelfredzaamheid op te proef gesteld door de vele onverwachte wendingen die elk onderzoek met zich meebrengt. Er werd met veel plezier gewerkt aan de opbouw van dit uitdagende project en ik hoop van harte dat u, als lezer, evenveel plezier ervaart bij het lezen. Deze stage en eindwerk hebben zonder enige twijfel een meerwaarde gegeven aan mijn opleiding. Hierdoor kan ik met een grote graad van tevredenheid stellen dat deze thesis voor mij een leerrijke ervaring was, die zeker nog in mijn verdere carrière nuttig zal zijn. Ik ben dan ook blij deze ervaring te hebben mogen meemaken.

106


Voor akkoord verklaring

Dit eindwerk is een examen; eventuele fouten die worden vastgesteld tijdens de eindwerkverdediging of erna werden niet gecorrigeerd. Het gebruik als referentie in publicaties is toegelaten na goedkeuring van de stagebegeleider, vermeld op de titelbladzijde.

Dr. Jacques Van Huysse

Mevr. Nicole Kellner

Stagementor

Stagebegeleider

107

Opsporen van K-RAS mutaties op colontumoren

Recommend Documents