Longkanker: de detectie van mutaties in EGFR, KRAS, ALK Genmutatie-gerichte therapie Belangrijk onderdeel van de diagnostiek van longkankerpatiënten
Ed Schuuring
Histopathologie
(klinisch) moleculair bioloog Hoofd Moleculaire Diagnostiek Laboratorium voor Moleculaire Pathologie Afdeling Pathologie van UMCG
[email protected]
Overleving van verschillende longtumoren Longkanker is niet één ziekte BAC
Typical carcinoid Histologie (vaak gecombineerd met immunohistochemie) is nog steeds het belangrijkste diagnostische criterium om:
Adeno+ BAC
Atypical carcinoid
NSCLC
het optimale behandelplan van de longkankerpatiënt te bepalen
SCLC
Overleving
Behoefte aan additionele tumormarkers waarmee we de respons op therapie optimaal kunnen voorspellen
in jaren
Anno 2012 beschikken we over veel moleculaire methoden om genetische afwijkingen te detecteren
Welke genetische veranderingen zijn waargenomen in longkanker ? Teveel om op te noemen ! Welke zijn klinisch relevant ?
Mutaties die in aanmerking komen voor gen (mutatie) gerichte therapie in longkanker (gene-targeted therapy) Voorbeelden van toegepaste gen-gerichte therapie in andere maligniteiten:
HER2 in borstkanker: Herceptin EGFR in hoofd&hals carcinoom: panatinumab, cetuximab EGFR in colon carcinoom: panatinumab, cetuximab c-KIT in GIST: imatinib ABL in CML: imatinib
Een arsenaal aan nieuwe farmaceutica gericht tegen longkankercellen die aangrijpen op een gemuteerd eiwit gen-gerichte therapie (gene-targeted therapy)
Mutaties die in aanmerking komen voor gen (mutatie) gerichte therapie in longkanker
KRAS mutaties in adenocarcinomas van de long
KRAS-mutaties Rodenhuis Cancer Res 1992
EGFR-mutaties
EML4-ALK-mutaties
Slebos NEJM 1990
Veelvoorkomende mutaties (%) in longkanker (NSCLC) Gen
HNSCC NSCLC colonca thyroidca breast ca
Riely Clin Cancer Res 2008
EGFR mutaties in longkanker EGFR-mutaties: 32.9% (wereldbreed)
EGFR PIK3CA
3
26
0
6
0
EGFR-mutaties: 15% (blanken) EGFR-mutaties: 10% (Nederland)
10
3
8
5
25
KRAS
4
17
35
3
4
EGFR-mutaties: 30% (aziaten)
BRAF
2
2
15
39
3
EGFR-mutaties: 60% (non-smoking aziaten)
CDKN2A
18
15
5
14
5
P53
70
64
56
2
10
14 27
STR11 APC
6
1
MET
15
2
FGFR3
21
1
HRAS
9
0
47
4
3 Dahabreh, meta-analyse Clin Cancer Res 2010
Cosmic database 09/2009
Sasaki Eur J Cancer 2010
“Lazarus Response” to Gefitinib: Chemoresistant EGFR mutant adenocarcinoma
Activating Mutations in the Epidermal Growth Factor Receptor Underlying Responsiveness of Non–Small-Cell Lung Cancer to Gefitinib
NEJM (2004) 350:2129-2139
Thomas J. Lynch, M.D., Daphne W. Bell, Ph.D., Raffaella Sordella, Ph.D., Sarada Gurubhagavatula, M.D., Ross A. Okimoto, B.S., Brian W. Brannigan, B.A., Patricia L. Harris, M.S., Sara M. Haserlat, B.A., Jeffrey G. Supko, Ph.D., Frank G. Haluska, M.D., Ph.D., David N. Louis, M.D., David C. Christiani, M.D.,Jeff Settleman, Ph.D., and Daniel A. Haber, M.D., Ph.D.
Science (2004) 304:1497-1500
PNAS (2004) 101:13306-13311
January 2002
October 2004 Johnson 2004
De ziekte-vrije-overleving van NSCLC patiënten met/zonder EGFR-mutatie behandeld met gefitinib
Belangrijkste resultaten van de behandeling van NSCLC met TKI (erlotinib/gefinitib) 1) Verbeterde ziekte-vrije overleving voor patiënten met EGFR-mutatie 2) Verbeterde overleving voor patiënten met EGFR-mutatie (m.n. primair NSCLC) 3) Veel geringere mate van bijwerkingen i.t.t. chemotherapie 4) Verbeterde kwaliteit-van-leven
Bepalen van de EGFR-mutatie-status is belangrijk onderdeel van de nieuwe landelijke richtlijn “Niet-kleincellig longcarcinoom” (dd 23 mei 2011)).
Mok T et al, NEJM 2009
Detectie van mutaties in EGFR
Resistentie tegen TKI-behandeling (erlotinib/gefitinib)
Waar zitten de mutaties ?
TKI-resistente EGFR-mutaties hotspots 18
G719 (~5%)
19
LREA deletions (45-50%)
Recidieven in ~100% van NSCLC behandeld met erlotinib/gefitinib (verworven TKI-resistentie):
P- loop
Extracellular domain
EGFR-mutatie in exon 20: T790M (~50%) EGFR-insertie in exon 21: T854A EGFR-mutatie in exon 19: D761Y
αC- helix
EGFR-mutatie in exon 19: L747S
Transmembrane region
duplications/ insertions (~5%)
20 N-lobe
ATP binding
TK
T790M (3-5%)
cleft C-lobe
Primaire resistentie bij behandeling met erlotinib/gefitinib (RR 75%):
domain - EGFR-mutaties in exon 20: T790M (~3%)
A- loop
Regulatory
21
domain EGFR-EIWIT-MOLECULE
L858R (35-45%)
- EGFR-inserties in exon 20: D770_N771ins (~5%)
L861 (~2%)
- EGFR-mutaties in exon 18: E709 (~1%) Linardou Nat Rev Cancer 2009; Pao Nat Rev Cancer 2010; Yasuda Lancet 2011; Sequist et al, Sci Transl Med 2011 3:75ra26
EGFR-GEN en EXONEN
Sequist JCO 2007, 25; 587
Detectie van mutaties in EGFR
Detectie van mutaties in EGFR
TKI-sensitieve en TKI-resistente EGFR mutaties
TKI-sensitieve en TKI-resistente EGFR mutaties
hotspots
L858R (35-45%) 21
< 5% TKI-resistente EGFR mutaties
tegen EGFR-targeted therapie
T790M
EGFR-mutaties met resistentie
tegen EGFR-targeted therapie
EGFR-mutaties met resistentie
20
Only 9D761Y with frequency => 1%
EGFR-GEN en EXONEN
L747S
~90% TKI- sensitieve EGFR-
< 5% TKI-resistente
mutaties: del19 en L858R
EGFR mutaties
LREA deletions (45-50%)
19
duplications/ insertions 20 T790M
T854A
L861 (~2%)
Linardou NatRevCancer 2009
EGFR-mutaties die gevoelig zijn
duplications/ insertions
G719 (~5%)
254 EGFR-mutations associated with TKI-response
voor EGFR-targeted therapie
19
EGFR-mutaties die gevoelig zijn
LREA deletions (45-50%)
voor EGFR-targeted therapie
D761Y
T854A
3305 different EGFR-mutations 18
G719 (~5%)
18
L747S
hotspots
L858R (35-45%) 21
L861 (~2%) ~90% TKI- sensitieve EGFR-
EGFR-GEN en EXONEN
mutaties: del19 en L858R
Dual-target EGFR drugs in the pipeline • Agent
Target
Sponsor
Status
•
Lapatinib
EFGR,HER2
GlaxoSmithKline
Phase III breast, kidney cancer
•
ZD6474
EGFR, HER2, VEGFR
AstraZeneca
Phase III, NSCLC; phase II, medullary thyroid carcinoma
•
HKI-272
EGFR, HER2
Wyeth
Phase II, breast, NSCLC
Detectie van mutaties in EGFR (UMCG vanaf 1 mei 2011) (1) Voor-screening mbv High-Melting-Resolution-Analysis: is er een mutatie of niet ?
80% 60% 40% 20% 10% 5% tonsil
•
BIBW-2992
EGFR, HER2
Boehringer-Ingelheim Planning for phase II in breast, prostate, and ovarian cancer
• • • •
AEE788 BMS-599626 CI-1033 XL-647
EGFR, HER2, VEGFR Novartis Phase I solid tumor EGFR, HER2 Bristol-Myers Squibb Phase I for solid tumors EGFR, HER2, HER4 Pfizer Phase II breast, NSCLC EGFR, HER2, VEGFR2, EphB4 Exelixis Phase I completed; phase II
Sensitivity for HMRA of EGFR exon 19 del (Inge Platteel)
(2) Indien ja, bevestiging met directe (bidirectionele) sequentie analyse
Wild type
planned fo rNSCLC del746 -750
EGFR Exon 19
Groen 2010
De moleculaire diagnostiek van longkanker tbv genmutatie-gerichte therapie In 2012: • EGFR-mutatie-analyse Landelijke richtlijn “Niet-kleincellig longcarcinoom” (23-05-2011)
De enige moleculair-diagnostische test in de huidige richtlijn !!!
Is er nog iets anders dan EGFR ……………
De moleculaire diagnostiek van longkanker tbv gen-mutatie-gerichte therapie
EML4EML4-ALK translocaties/inversies in NSCLC
Vanaf 2012 (verwachtte toepassingen): • • • • • • • • •
“resistente” EGFR mutaties ALK-ELM4 translocatie FGFR1-amplificatie BRAF-mutatie KRAS-mutatie MET-amplificatie ROS1-translocatie HER2-mutatie EGFR-amplificatie
(100% AC) (<4% AC) (~20% SCC) (< 2% AC) (~40% AC) (4-20% AC) (1.7% AC) (2% AC) (10% AC)
> next-generation-TKI > crizotinib, … > dasatinib, … > PLX4732 > sorafenib, … > crizotinib, Metmab, … > crizotinib > herceptin > cetuximab, erlotinib, …
Momenteel geen toegepaste therapie (in de pipe-line; vaak in trial)
Veelbelovende data: implementatie van de detectie van deze mutaties binnen de Moleculaire Diagnostiek (conform CCKL/ISO15189)
Soda et al., Nature 448: 561-566, 2007
ALK fusie-genen
EML4EML4-ALK translocaties/inversies in NSCLC •
EML4-ALK translocaties in 3.8% van ongeselecteerd NSCLC.
•
De ALK-EML4 translocatie komt vaker voor: * in (signet cell) adenocarcinomas * jong-volwassenen * never-smokers (< 100 cigarettes in lifetime) * light-smokers (< 15 pack-years) * tumoren zonder EGFR en KRAS mutatie (geen overlap)
•
Aanbeveling: adenocarcinoom zonder EGFR en KRAS mutatie
ALK-gen EML4/ALK fusie-produkt
13.14 Mb
EML4-gen
inversie
EML4
Soda et al., Nature 448: 561-566, 2007
Sasaki Eur J Cancer 2010 Sasaki Eur J Cancer 2010
Solomon J Thor Oncol 2009
ALK Break Apart Probe Vysis FDA-approved assay (Pfizer-trial)
EML4-ALK translocatie/inversie kan gedetecteerd worden met FISH, IHC and RT-PCR/sequencing
EML4
FISH
Histopathologie (signet cell AC)
• Normaal
Commerciële ALK-FISH-probes: RT-PCR en sequentie-analyse
immunohistochemie
• Translocatie en Inversie
• Vysis ALK break apart • Poseidon ALK break apart
Kwak NEJM 2010
• Poseidon ALK/EML4 colocalisatie
ALK Break Apart Probe Vysis FDA-approved assay (Pfizer-trial) FISH als gouden standaard
EML4-ALK FISH op paraffine coupes Meer complexe patronen (D-H) dan klassiek (C)
Lastige moleculaire test ! A
B
C
D Klassiek translocatie patroon C in ALK-positieve tumoren is NIET zichtbaar
• Normaal
Sasaki EJC 2010
• Translocatie en Inversie E
F
G
H Yoshida J Thor Oncol 2011
A
B
C
D
E
F
G
H
Camidge Clin Canc Res 2010
Respons op crizotinib van 31 EML4-ALK-positieve Niet-kleincellige longcarcinoompatiënten is indrukwekkend
PFPF-02341066 = crizotinib N
Potent & selective ATP competitive oral inhibitor of MET and ALK kinases and their oncogenic variants
N N
Cl F Cl
MET/HGFR
ALK
β α
Cytoplasmic Fusion Variants of ALK
SEMA Extracellular
TM TM
Extracellular
TM TM P
Intracellular
Intracellular
Kinase
Y Y P
Y Y
P
Kinase
Y Y P
Y Y
P P
Kinase
Y Y P
Kinase
Y Y P
Y Y
Y Y YP Y YP Y YP Y P Y Y
P
Y Y
YP Y P
Y Y
YP Y P
Y Y
NPM-ALK EML4-ALK
N
O N
Kinase
IC50 (nM) Mean
c-Met
8
Selectivity Ratioα ---
ALK
20
2X
RON
248
31X
Axl
308
39X
Tie-2
448
56X
Trk A
580
73X
Trk B
399
50X
PF02341066 was >100X selective for MET/ALK across a panel of 150 additional kinases.
pretreatment
After 2 cycles
Kwak NEJM 2010
P
Y Y
Effect van crizotinib bij patiënt met FISH positieve EML4-ALK translokatie
ALK-EML4 translocatie en gen-gerichte therapie in longkanker Momenteel (2012) geen gangbare therapie Pfizer trial (crizotinib): * ALK-FISH wordt uitgevoerd in centraal Europees lab * in Nederland 5 EML4-ALK-positieve patienten in trial (coördinatie Prof Harry Groen, UMCG) * eerste resultaten tonen een indrukwekkende respons reeds 2 weken na start therapie (n=3) * follow-up is nog te kort om iets concluderen over langdurige respons en eventuele bijwerkingen
Maar deze veelbelovende therapie zal binnenkort wsl toegevoegd worden als behandeling voor EML4-ALK-positieve longkankerpatiënten vandaar dat we de detectie van de EML4-ALK translocatie valideren binnen de Moleculaire Voor start crizotinib
Pathologie (conform CCKL)
Na 6 weken crizotinib
FISH als standaard-methode; validatie immunohistochemie en RT-PCR Groen NTvG 155;2032:2011
de classificatie van longkanker in de tijd
Tumor-specifieke mutaties in adenocarcinoom van de long genoom-sequentie-analyse
N=188 tumors
Pao, Lancet Oncol 2011
15107 mutaties in 827 verschillende genen !
L Ding et al. Nature 455, 1069-1075 (2008)
Detectie van mutaties Hoe ziet de toekomst eruit ? 1) Meer specifieke gen-gerichte therapeutica tegen verschillende genmutaties (in ontwikkeling) 2) Meer mutaties bepalen >>> mutation
profiling
3) Hoeveelheid en grootte van ingestuurde biopten blijft gelijk 4) Doorlooptijd moeten vergelijkbaar zijn, danwel versnellen 5) De kosten moeten gelijk blijven (liefst verminderen)
Vereist innovatieve technische ontwikkeling >>> Next-Generation-Sequencing
Welke zijn driver mutaties ??? >>> Personalized gene-targeted therapy
Dank voor uw aandacht
[email protected]
