TheraScreen : K-RAS Mutation Kit Voor de detectie van 7 mutaties in het K-RAS-gen

TheraScreen®: K-RAS Mutation Kit Voor de detectie van 7 mutaties in het K-RAS-gen Voor gebruik op het Roche LightCycler® 480 Real-Time PCR System (Instrument II) (catalogusnr.: 05015278001) en het Applied BioSystems 7500 Real-Time PCR System (onderdeelnr.: 4351105) Inclusief de gebruikershandleiding voor de LightCycler® Adapt Software v1.1 van Roche Diagnostics (catalogusnr. 05474914001) voor de TheraScreen®: K-RAS Mutation Kit CE-IVD

Instructies voor gebruik Productcodes Grootte van de kit 20 reacties 80 reacties

Instructieversie:

DxS-productcode KR-21 KR-22

DU001g

Datum van herziening: mei 2009 Bewaren bij -18 °C tot -25 °C

Pagina 1 van 39

Bestelnummer Roche Diagnostics 05366216190 05366224190

Uitsluitend voor diagnostisch gebruik

TheraScreen: K-RAS Mutation Kit

Inhoudsopgave 1. Beoogd gebruik / Gebruiksaanwijzing ..................................................3 2. Samenvatting en uitleg van de test .......................................................3 3. Technologische principes ......................................................................4 4. Reagentia..................................................................................................6 5. WAARSCHUWINGEN EN VOORZORGSMAATREGELEN....................7 6. Bewaar-, stabiliteits- en verzendcondities ............................................9 7. Instrument ................................................................................................9 8. Specimens ................................................................................................9 9. K-RAS-mutatiedetectieprotocol .......................................................... 14 10. Beperkingen van de test .................................................................... 26 11. Prestatiekenmerken assay ................................................................ 27 12. Technische ondersteuning ................................................................ 35 13. Gegevens fabrikant en distributeurs ................................................ 36 14. Datum van uitgifte van de recentste versie ..................................... 36 15. Referenties .......................................................................................... 37 Opmerkingen voor de koper: .................................................................. 39

Pagina 2 van 39



BELANGRIJK: Lees vóór gebruik van de K-RAS Kit deze aanwijzingen zorgvuldig door en maak u vertrouwd met alle componenten van de kit. 1. Beoogd gebruik / Gebruiksaanwijzing Beoogd gebruik De DxS TheraScreen®: K-RAS Mutation Kit (K-RAS Kit) is een diagnostische in-vitrotest voor de detectie van zeven somatische mutaties in het K-RAS-oncogen en biedt een kwalitatieve bepaling van de mutatiestatus. De K-RAS Kit dient te worden gebruikt door getraind personeel in een professioneel laboratorium met DNA-monsters geëxtraheerd uit met formaline gefixeerd in paraffine ingebed colorectaal weefsel. Indicaties voor gebruik De resultaten van de K-RAS Kit zijn bedoeld als hulp voor de clinicus bij het identificeren van patiënten met colorectale kanker die mogelijk geen baat hebben bij een behandeling gericht tegen epidermale groeifactorreceptor (EGFR), zoals panitumumab of cetuximab. De K-RAS Kit is niet bestemd voor het diagnosticeren van colorectale kanker. De kit is bedoeld als aanvulling op andere relevante prognostische factoren die gebruikt worden voor de selectie van patiënten die op basis van hun mutatiestatus geschikt zijn voor behandeling met anti-EGFRtherapieën. De mutatiestatus van de patiënt dient bij het nemen van een behandelbeslissing samen met andere ziektefactoren door een clinicus te worden overwogen. Geen enkele behandelbeslissing voor kankerpatiënten mag uitsluitend worden gebaseerd op de K-RAS-mutatiestatus. 2. Samenvatting en uitleg van de test De K-RAS Kit is een CE-gemarkeerd diagnostisch hulpmiddel overeenkomstig EU-richtlijn 98/79/EG betreffende medische hulpmiddelen voor invitrodiagnostiek. Mutaties van het K-RAS-oncogen worden frequent aangetroffen bij kanker bij mensen(1-4). De aanwezigheid van deze mutaties correleert met een ontbrekende respons op behandeling met bepaalde EGFR-remmers bij patiënten met gemetastaseerde colorectale kanker(5-10)(14-21). Detectie van zeven mutaties in het K-RAS-gen is mogelijk in een achtergrond van wildtype genomisch DNA in een real-time PCR-assay gebaseerd op DxS Scorpions®-technologie. Deze methode is in hoge mate selectief. Vooropgesteld dat er voldoende DNA-kopieën zijn, is detectie mogelijk van ongeveer 1% mutant in een achtergrond van wildtype genomisch DNA. De K-RAS Kit detecteert zeven K-RAS-mutaties in de codons 12 en 13 van het K-RAS-oncogen als weergegeven in tabel 1. Pagina 3 van 39



Tabel 1: K-RAS-mutaties die met de DxS-kit worden gedetecteerd COSMIC ID’s zijn overgenomen uit de Catalogue of Somatic Mutations in Cancer http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/ Mutatie Gly12Ala Gly12Asp Gly12Arg Gly12Cys Gly12Ser Gly12Val Gly13Asp

Base-wijziging (GGT>GCT) (GGT>GAT) (GGT>CGT) (GGT>TGT) (GGT>AGT) (GGT>GTT) (GGC>GAC)

Cosmic ID 522 521 518 516 517 520 532

3. Technologische principes De K-RAS Kit combineert twee technologieën, ARMS® en Scorpions® (11,12,13) , voor de detectie van mutaties in real-time PCR-assays. ARMS Allel- of mutatiespecifieke amplificatie wordt uitgevoerd door ARMS. Taq DNA-polymerase is buitengewoon effectief in het maken van onderscheid tussen een match en een mismatch op het 3'-uiteinde van een PCR-primer. Specifieke gemuteerde sequenties kunnen selectief worden geamplificeerd, zelfs in monsters waarin het merendeel van de sequenties geen drager is van de mutatie: • Wanneer de primer volledig matcht, verloopt de amplificatie volledig efficiënt. • Wanneer de 3'-base niet matcht, vindt alleen zwakke achtergrondamplificatie plaats. Scorpions Detectie van amplificatie wordt met Scorpions uitgevoerd. Scorpions zijn bifunctionele moleculen die een PCR-primer bevatten die covalent gebonden is aan een probe. De fluorofoor in deze probe heeft interactie met een quencher (eveneens in de probe opgenomen) die de fluorescentie vermindert. Wanneer tijdens een PCR-reactie de probe zich aan het amplicon bindt, worden de fluorofoor en de quencher gescheiden. Dit leidt tot meer fluorescentie vanuit de reactiebuis. Gegevensanalyse: ∆Ct-methode Scorpions real-time assays gebruiken het aantal PCR-cycli dat nodig is voor het detecteren van een fluorescent signaal boven een achtergrondsignaal, als maat voor de doelmoleculen die bij het begin van de reactie aanwezig zijn. Het punt waarbij het signaal boven de achtergrondfluorescentie wordt gedetecteerd, wordt de ‘Cycle threshold’ (Ct [cyclusdrempel]) genoemd. Pagina 4 van 39



Monster-∆Ct-waarden worden berekend als het verschil tussen de mutatieassay-Ct en de controleassay-Ct van hetzelfde monster. Monsters worden geclassificeerd als mutatiepositief als ze een ∆Ct geven die kleiner is dan de 1% ∆Ct-waarde voor die assay. Boven deze waarde kan het monster minder dan 1% mutaties bevatten (buiten de limiet van de assay) of is het mutatienegatief. Bij gebruik van ARMS-primers kan enige inefficiënte priming optreden, hetgeen kan leiden tot een zeer late achtergrond-Ct door DNA dat geen mutatie bevat. Alle ∆Ct-waarden die uit achtergrondamplificatie worden berekend, zijn groter dan de 1% ∆Ct-waarden, en het monster wordt als mutatienegatief geclassificeerd. De K-RAS Kit is CE-gemarkeerd voor in-vitrodiagnostisch gebruik op het Roche Diagnostics LightCycler® 480 Real-Time PCR System (Instrument II) (LightCycler® 480 Instrument) met 96 wells, Roche-onderdeelnummer: 05015278001, of het Applied BioSystems 7500 Real-Time PCR System, onderdeelnummer 4351105 (ABI7500). Op het LightCycler® 480 Instrument moet de K-RAS Kit worden gebruikt in combinatie met de LightCycler® Adapt Software v1.1 voor de TheraScreen® K-RAS Mutation Kit CE-IVD (LightCycler® Adapt Software). Deze software is ontwikkeld om het aflezen van een positieve of negatieve amplificatieplot te automatiseren en berekent een geschikte drempel voor het verkrijgen van Ct-waarden. Deze worden gebruikt voor het berekenen van monster-∆Ct-waarden, die vergeleken worden met de 1% cut-offwaarden. De software rapporteert een positief of negatief mutatieresultaat en ontdoet de analyse en interpretatie van de met de K-RAS Kit verkregen gegevens van elke subjectiviteit. Inhoud van de K-RAS Kit De K-RAS Kit bevat acht assays. • Eén controleassay • Zeven mutatieassays Alle reactiemengsels bevatten een exogeen controleassay (interne controle) gelabeld met HEX (te detecteren met de JOE-detector op de ABI7500). Deze assay controleert op de aanwezigheid van remmers die fout-negatieve resultaten kunnen veroorzaken. Controleassay De controleassay, gelabeld met FAM, wordt gebruikt voor het bepalen van het totale DNA in een monster. De controleassay amplificeert een regio van exon 4 van het K-RAS-gen. De primers en de probe zijn zo ontwikkeld dat alle bekende K-RAS-polymorfismen worden vermeden.

Pagina 5 van 39



Mutatieassays Elke mutatieassay, gelabeld met FAM, bevat één Scorpions-primer plus één ARMS-primer voor het discrimineren tussen het wildtype DNA en het mutant-DNA dat door een real-time PCR-assay wordt gedetecteerd. 4. Reagentia Deze K-RAS Kit bevat voldoende reagentia voor het uitvoeren van kwaliteitsbepalingen van monsters en het uitvoeren van K-RAS-assays voor maximaal 20 of 80 reacties, afhankelijk van de grootte van de kit. Grootte van DxS-productcode Bestelnummer de kit Roche Diagnostics 20 reacties KR-21 05366216190 80 reacties KR-22 05366224190 Het aantal monsters dat kan worden getest, is afhankelijk van de omvang van de partij monsters. Tabel 2: Inhoud K-RAS Kit 20 reacties 80 reacties Buis Inhoud Inhoud Controlereactiemengsel 1300 µl 5200 µl 1 12ALA-reactiemengsel 650 µl 2600 µl 2 12ASP-reactiemengsel 650 µl 2600 µl 3 12ARG-reactiemengsel 650 µl 2600 µl 4 12CYS-reactiemengsel 650 µl 2600 µl 5 12SER-reactiemengsel 650 µl 2600 µl 6 12VAL-reactiemengsel 650 µl 2600 µl 7 13ASP-reactiemengsel 650 µl 2600 µl 8 Gemengde standaard 300 µl 1000 µl 9 Taq DNA-polymerase 60 µl 240 µl 10 Geleverde reagentia

Niet bij de K-RAS Kit inbegrepen apparatuur en reagentia De gebruiker heeft nog de volgende apparatuur en verbruiksartikelen nodig: • Het LightCycler® 480 Instrument of de ABI7500 Real-time PCR Machine met cycluscapaciteiten als gedefinieerd in paragraaf 9 "K RAS-mutatiedetectieprotocol". • De LightCycler® Adapt Software v1.1 van Roche Diagnostics (catalogusnr. 05474914001). • 0,2 ml DNAse-vrije PCR-platen (LightCycler® 480 Instrument Multiwell Plate 96, catalogusnummer 04729692 001, of ABI MicroAmp Optical 96-well reaction Plate, onderdeelnummer 4306737, met MicroAmp Optical Adhesive Film, onderdeelnummer 4311971). • Steriele buisjes voor het bereiden van de mastermengsels. • Speciale pipetten voor het bereiden van PCR-mengsels. Pagina 6 van 39


• •


Speciale pipetten voor het pipetteren van DNA-template. Steriel nuclease-vrij H2O.

5. WAARSCHUWINGEN EN VOORZORGSMAATREGELEN Voor in-vitrodiagnostische gebruik. De K-RAS Kit is niet bedoeld voor het screenen op of het diagnosticeren van welk type kanker dan ook, inclusief colorectale kanker. Deze kit is bedoeld voor gebruik als aanvulling op andere prognostische factoren die momenteel worden gebruikt voor het selecteren van patiënten die mogelijk geen baat hebben bij anti-EGFR-kankerbehandelingen. Behandeling van kankerpatiënten mag niet uitsluitend worden gebaseerd op de mutatiestatus van het K-RAS-gen. De clinicus dient de mutatiestatus van de patiënt samen met andere ziektefactoren te overwegen. De inhoud van de K-RAS Kit mag maximaal 8 keer worden ingevroren en ontdooid zonder dat dit een negatief effect heeft op de assayprestaties. De K-RAS Kit-reagentia mogen NIET vaker dan 8 keer worden ingevroren en ontdooid. Houd er rekening mee dat tumormonsters niet-homogeen zijn en dat gegevens afkomstig uit een bepaald tumormonster mogelijk niet identiek zijn aan die van andere coupes van dezelfde tumor. Tumormonsters kunnen ook niet-tumorweefsel bevatten. Van DNA van weefsel zonder tumor is niet te verwachten dat het de K-RAS-mutaties bevat die de K-RAS Kit detecteert. Alle assays in de K-RAS Kit genereren korte PCR-producten. De K-RAS Kit werkt echter niet met sterk gefragmenteerd DNA. DNA-bepaling dient op PCR te worden gebaseerd en kan verschillen van kwantificering op basis van meting van optische dichtheid. Er wordt extra controlereactiemengsel geleverd om vóór het uitvoeren van runs met de K-RAS Kit de kwaliteit en kwantiteit van het DNA in monsters te bepalen. De reagentia voor de K-RAS Kit zijn optimaal verdund. Verdere verdunning van de reagentia wordt niet aanbevolen en leidt tot slechtere prestaties. Gebruik van minder dan 25 µl reactievolume wordt niet aanbevolen en vergroot de kans op fout-negatieven. Alle reagentia in de K-RAS Kit zijn specifiek samengesteld voor gebruik met de vermelde tests. Voor het behoud van optimale prestaties mogen de reagentia van de K-RAS Kit niet worden vervangen. Voor optimale activiteit en prestaties moeten Scorpions-primers (net als alle fluorescerend gelabelde moleculen) worden beschermd tegen licht om bleken door licht te voorkomen. Pagina 7 van 39



Werk buitengewoon zorgvuldig om besmetting van PCR-reacties met synthetisch controlemateriaal te voorkomen. Aanbevolen wordt om aparte speciale pipetten te gebruiken voor het maken van reactiemengsels en het toevoegen van DNA-template. De bereiding en het pipetteren van reactiemengsels moet worden uitgevoerd in een ruimte die gescheiden is van die waarin de template wordt toegevoegd. Na een PCR-reactie mogen buisjes nooit geopend worden. Elke assay in de K-RAS Kit heeft zijn eigen kenmerken. Bij de berekening van het resultaat moet worden gerefereerd aan de juiste assayparameters (zie de paragraaf "Rapportage/Interpretatie van de gegevens"). Mutatie-Ct-waarden van 38 of hoger moeten als negatief of lager dan de limieten van de kit worden gescoord. De assays bevatten, naast de bedoelde reactie, een exogene controlereactie (interne controle) (zie de paragraaf "Technologische principes"). Als beide assays zijn mislukt, mogen de gegevens niet worden gebruikt omdat er mogelijk remmers aanwezig zijn die tot foutnegatieve resultaten kunnen leiden. Het verdunnen van het monster kan de invloed van remmers verminderen, maar vergeet niet dat het DNA dan ook wordt verdund. Er dienen algemene laboratoriumvoorzorgen te worden toegepast, zoals onder meer: a) b) c)

Niet met de mond pipetteren Niet roken, eten of drinken in ruimten waar specimens of kitreagentia worden gehanteerd Handen wassen na het uivoeren van de test

Gebruik uitsluitend de Taq-polymerase (Taq) die in de kit is meegeleverd, niet vervangen door Taq uit andere kits van hetzelfde of een ander type, of door Taq van een andere leverancier. Ontdooi uitsluitend de reagentia die voor een run nodig zijn, ontdooi niet elke keer de gehele kit, zodat het aantal cycli van invriezenontdooien tot een minimum beperkt blijft. Veiligheidsinformatie Voorzichtig: Alle chemische en biologische materialen moeten als potentieel gevaarlijk worden beschouwd. Specimens zijn potentieel infectieus en moeten als zodanig worden behandeld. De K-RAS Kit mag alleen worden gebruikt door personen die getraind zijn in de geëigende laboratoriumtechnieken. Draag bij het werken met de componenten van deze K-RAS Kit altijd een geschikte laboratoriumjas, wegwerphandschoenen en een veiligheidsbril. Na gebruik moeten de componenten van de K-RAS Kit worden afgevoerd als klinisch afval. Pagina 8 van 39



6. Bewaar-, stabiliteits- en verzendcondities Bewaren De gehele inhoud van de K-RAS Kit moet na ontvangst onmiddellijk donker worden opgeslagen tussen -18 °C en -25 °C in een vriezer met een constante temperatuur. Voorkom onnodig ontdooien van de inhoud van de K-RAS Kit. Stabiliteit Gebruik de K-RAS Kit niet na de aangegeven uiterste gebruiksdatum. Bij opslag onder de aanbevolen bewaarcondities en in de originele verpakking is de inhoud van de K-RAS Kit stabiel tot de uiterste gebruiksdatum. De inhoud van de K-RAS Kit mag maximaal 8 keer worden ingevroren en ontdooid zonder dat dit een negatief effect heeft op de assayprestaties. De K-RAS Kit-reagentia mogen NIET vaker dan 8 keer worden ingevroren en ontdooid. Verzendcondities De inhoud van de K-RAS Kit is verzonden op droogijs en moet bij aankomst nog bevroren zijn. Als de K-RAS Kit bij ontvangst niet bevroren is, als de buitenverpakking tijdens de verzending geopend is en/of als de zending geen pakbon, gebruiksaanwijzing of reagentia bevat, neem dan contact op met het lokale kantoor van Roche Diagnostics; zie paragraaf 12 "Technische ondersteuning" voor contactinformatie. 7. Instrument Raadpleeg de gebruikershandleiding bij het instrument voor volledige instructies over de installatie en het gebruik van het real-time PCRinstrument. 8. Specimens Het specimenmateriaal moet humaan genomisch DNA zijn, geëxtraheerd uit met formaline gefixeerde in paraffine ingebedde colorectale tumormonsters. Specimenafname en -preparatie 1. Specimentransport: standaard pathologiemethodiekom de kwaliteit van het specimen te bewaren. 2. Aanbevolen proces voor monsterextractie: DNA-extractie met de Qiagen QIAamp® DNA FFPE-weefselkit (catalogusnummer 56404). De volgende wijzigingen moeten worden toegepast: • FFPE-coupes moeten op glazen objectglaasjes worden aangebracht. • Een te veel aan paraffine moet met een nieuw, steriel scalpel rond de weefselcoupes worden weggeschraapt. Pagina 9 van 39



•

Schraap weefselcoupemateriaal in microcentrifugebuisjes met voor elk te extraheren monster een nieuw scalpel. • Digestie van proteïnase K moet worden voortgezet tot de digestie voltooid is. Dit kan tot 48 uur duren. • De monsters moeten worden uitgewassen in 200 µl ATE-buffer uit de Qiagen-extractiekit. Andere methoden voor monsterpreparatie moeten door de eindgebruiker worden gevalideerd. 3. Bewaren van geëxtraheerd DNA: vóór analyse bij -20 oC bewaren. Protocol monsterbepaling Het extra controleassaymengsel dat met de K-RAS Kit is meegeleverd, moet worden gebruikt voor het bepalen van het totale DNA in een monster. De controleassay amplificeert een regio van exon 4 van het K-RAS-gen. De monsters dienen te worden bewerkt met alleen het controleassay, met de gemengde standaard als positieve controle en water als de templateloze controle. Denk eraan dat de monsters gegroepeerd dienen te worden om de reagentia uit de K-RAS Kit optimaal te kunnen gebruiken. Alle proefruns moeten controles bevatten. Als er monsters apart worden getest, kost dat meer reagentia, waardoor er minder monsters met de K-RAS Kit kunnen worden getest. Protocol monsterbepaling – klaarmaken van de plaat 1. Ontdooi het controlereactiemengsel en de gemengde standaard uit de K-RAS Kit bij kamertemperatuur. Meng elke oplossing na het ontdooien door elk buisje 10 keer om te keren, zodat plaatselijke zoutconcentraties worden vermeden. Bereid voldoende mengsels voor de DNAmonsters, één gemengde standaardreactie en één templateloze controlereactie, plus 2 reacties extra. 2. Gebruik voor het bereiden van het mastermengsel de hoeveelheden reagentia per reactie als aangegeven in tabel 3. Tabel 3: Volumes mastermengsel controleassay

Assay Controleassay

Mastermengsel Reactiemengsel Taq (µl)x1 (µl)x1 19,8

0,2

3. Taq en reactiemengsels met Taq mogen NIET worden geschud omdat het enzym door schudden onwerkzaam kan worden. 4. Zorg ervoor dat de Taq vóór gebruik op kamertemperatuur is. Draai de flacon af zodat de Taq zich op de bodem van de flacon verzamelt, en pipetteer vervolgens door de tip van de pipet net onder het oppervlak van de Taq te plaatsen om het risico te verkleinen dat zich een overmaat aan Taq als laagje aan de tip hecht. Pagina 10 van 39



5. Meng het mastermengsel door de pipet voorzichtig op en neer te bewegen. 6. Doe onmiddellijk 20 µl controlemastermengsel in elke reactiewell. 7. Voeg onmiddellijk 5 µl monster, gemengde standaard of water (voor de templateloze controles) toe aan de reactiewells. 8. De plaat moet worden geïnstalleerd met de gemengde standaard in well A1 en de templateloze controle (water) in well A2. Alle andere gebruikte wells moeten de monsters bevatten. 9. Sluit de PCR-plaat af en draai de plaat kort af zodat de reagentia zich op de bodem van de wells verzamelen. 10. Stel het instrument in volgens de aanwijzingen voor het betreffende platform. Protocol monsterbepaling – instelling LightCycler® 480 Instrument 1. Doe de plaat onmiddellijk in het LightCycler® 480 Instrument. 2. Selecteer het pictogram van de LightCycler® 480 Software op het bureaublad van het aan het instrument gekoppelde werkstation. Log in op de software en selecteer in het ‘Overview’-scherm ‘New Experiment from Template’. Kies uit de lijst run templates ‘K-RAS LC480II Run Template’. Deze template heeft de volgende parameters: 1. Detectieformaat is ‘DxS IVD Assays’. 2. Reactievolume is 25. 3. Een initiële wachtstap van 4 minuten bij 95 °C. 4. Een 2-stapsamplificatie gedurende 45 cycli met denaturatie gedurende 30 seconden bij 95 °C en uitgloeien gedurende 1 minuut bij 60 °C. De fluorescentieacquisitie is een enkelvoudige acquisitie bij de 60 °C-stap. 3.

Selecteer tabblad ‘Sample Editor’ en selecteer onder ‘Step 1’: ‘Select Workflow’ het selectievakje ‘Abs Quant’. Zorg er onder ‘Select Filter Combinations’ voor dat beide filters geselecteerd zijn (465-510 nm en 533-580 nm). Stel de monsternamen in onder Step 2 en Step 3. Het ‘Quantification Sample Type’ dient te worden ingesteld als ‘unknown’. De kolom replicaten dient blanco te worden gelaten.

4.

Selecteer de ‘Experiment’-knop en klik op de ‘Start Run’-knop om de proef op te slaan en de cyclus te starten.

5.

Selecteer na afloop van de run het tabblad ‘Analysis’ en kies ‘Abs Quant/2nd Derivative Max’ in het ‘Create New Analysis’-venster.

Pagina 11 van 39



Accepteer de standaarden uit het ‘Create New Analysis’-scherm. Zorg ervoor dat de ‘Filter Comb’-knop op ‘465-510’ staat en selecteer de ‘Calculate’-knop. De Ct-waarden worden in de ‘Samples’-tabel weergegeven. 6.

Selecteer de ‘Filter Comb’-knop en wijzig de filters in 533-580 nm. Selecteer de ‘Calculate’-knop, waarna de exogene controle Ct-waarden in de 'Samples'-tabel worden weergegeven.

Protocol monsterbepaling – instelling ABI7500 Instrument 1. Doe de plaat onmiddellijk in het ABI7500 Instrument. 2. Selecteer het pictogram van de 7500 System Software op het bureaublad van het aan het instrument gekoppelde werkstation. Open een nieuw runbestand uit het bestandsmenu in de 7500 Sequence Detection Software versie 1.4. 3. Selecteer ‘Standard Curve (Absolute Quantification)’ onder ‘Assay’. Selecteer ‘Standard 7500’ onder ‘Run Mode’. 4. Ga naar het detectorinstellingenvenster door de ‘Next’-knop te selecteren. Voeg een FAM- en een JOE-detector aan de detectorenlijst toe, met quenchers ingesteld op ‘none’. Als deze detectoren niet al bestaan, selecteer dan de ‘New Detectors’-knop en stel een FAM- en een JOE-detector in met de quencher ingesteld op ‘none’. 5. Stel ‘Passive Reference’ in op ‘None’ en selecteer de ‘Next’-knop. 6. Selecteer de gehele plaat en vink de selectievakjes aan voor de FAMen de JOE-detectoren om ervoor te zorgen dat beide kleurstoffen in elke well worden gecontroleerd. Selecteer de ‘Finish’-knop. 7. Stel onder het tabblad ‘Instrument’ de cyclus in als aangeven in tabel 4. Tabel 4: Cycluscondities ABI7500

Temperatuur Fase 1 95 oC Fase 2 95 oC 60 oC

Tijd

Cycli

4 min

1

30 sec 1 min

40

Gegevensverzameling

FAM, JOE

8. Selecteer de ‘Start’-knop om de proef op te slaan en de cyclus te starten.

Pagina 12 van 39



9. Zorg er na afloop van de run voor dat de passieve referentie in het wellinspector-scherm ingesteld is op 'none'. Selecteer in het tabblad ‘Amplification Plot’ alle gebruikte wells en selecteer de JOE-kleurstof in het detector-dropdown-menu. 10. Controleer het JOE-signaal van elk monster en vergelijk dit met het JOE-signaal in de NTC-well. Let op monsters die een verlate amplificatiecurve hebben of waarvan de amplificatie voor de exogene controle mislukt is in vergelijking met de NTC. 11. Selecteer in het tabblad ‘Amplification Plot’ alle gebruikte wells en selecteer de FAM-kleurstof in het detector-dropdown-menu. Gebruik de automatische baseline-instellingen en de handmatige Ct, en stel vervolgens de drempel handmatig in het midden van de exponentiële fase in; gebruik daarbij de log-schaal voor de Y-as als beschreven in de gebruikershandleiding bij de ABI7500. 12. Selecteer de ‘Analyse’-knop om Ct-waarden te verkrijgen. Interpretatie van de monsterbepaling Bepaal de NTC-Ct-waarden om er zeker van te zijn dat geen sprake is van contaminatie die een positieve amplificatie in het FAM-kanaal oplevert (Ct kleiner dan 40) of van een mislukte exogene controlereactie in het HEXkanaal (geen Ct), wat op een instellingsprobleem duidt. De gemengde standaard dient een controleassay-Ct (FAM-kanaal) op te leveren van 26-29 op de ABI7500 en ≤ 29 op het LightCycler® 480 Instrument. De gegevens dienen niet te worden gebruikt als één van deze 2 runcontroles mislukt is. Controleassay-Ct 29-35: voorzichtig interpreteren omdat low-level mutaties mogelijk niet gedetecteerd worden. Controleassay-Ct 35-38: in dergelijke monsters zijn slechts een paar amplificeerbare DNA-kopieën aanwezig en de kans dat mutaties worden gezien, is alleen aanwezig als de meeste kopieën gemuteerd zijn. Controleassay-Ct ≥ 38: keur het monster af aangezien er een minimale hoeveelheid DNA aanwezig is en de K-RAS Kit geen mutaties erin kan detecteren. Let op: als een monster een late controleassay-Ct oplevert, dient de exogene controle-Ct van het monster te worden vergeleken met de exogene controle van de NTC. Als de exogene controle van het monster vergeleken met de NTC vertraagd of negatief is, kan er sprake zijn van een remmer. Het is mogelijk het effect van een remmer te reduceren door het monster te verdunnen, al wordt het DNA dan eveneens verdund. Monsterverdunning: Bij een controle-Ct < 24 worden de mutatieassays overladen. Monsters met een controle-Ct < 24 moeten worden verdund.

Pagina 13 van 39



Let op: Ct-waarden verkregen met de 2e afgeleide methode op het LightCycler® 480 Instrument kunnen iets verschillen van de Ct-waarden verkregen met LightCycler® Adapt Software. Aanbevolen wordt geconcentreerde monsters zodanig te verdunnen dat ze > 24, maar < 29 zijn (Ctwaarden gebaseerd op de 7500 Sequence Detection Software of de LightCycler® 480 Instrument Software), ervan uitgaande dat ½ verdunnen de Ct met 1 doet toenemen. 9. K-RAS-mutatiedetectieprotocol Lees vóór gebruik van de K-RAS Kit deze aanwijzingen zorgvuldig door en maak u vertrouwd met alle componenten van de kit. Om de K-RAS Kit efficiënt te gebruiken, moeten de monsters worden gegroepeerd in groepen van 10 (om één plaat met 96 wells te vullen). Kleinere groepen betekent dat er minder monsters met de K-RAS Kit kunnen worden getest. LightCycler® 480 Instrument – opstelling van de proef Voor elk DNA-monster moeten alle controle- en mutatie-assays worden geanalyseerd in dezelfde PCR-run om run/run-variaties te vermijden. 1. Ontdooi de reactiemengsels en de gemengde standaard uit de K-RAS Kit bij kamertemperatuur. Meng elke oplossing na het ontdooien door elk buisje 10 keer om te keren, zodat plaatselijke zoutconcentraties worden vermeden. Bereid voldoende mengsels voor de DNA-monsters, de gemengde standaard en de templateloze controles, plus 2 reacties extra per mengsel als aangegeven in tabel 5. Tabel 5: Volumes K-RAS-mastermengsel

Assay

Reactiemengsel (µl)x1

Controleassay Mutatieassays

19,8 19,8

Mastermengsels Reactiemengsel (µl) Taq (µl) per plaat Taq (µl)x1 per plaat (x14) (x14) 0,2 0,2

277,2 277,2

2,8 2,8

2. Taq en reactiemengsels met Taq mogen NIET worden geschud omdat het enzym door schudden onwerkzaam kan worden. 3. Zorg ervoor dat de Taq vóór gebruik op kamertemperatuur is. Draai de flacon af zodat de Taq zich op de bodem verzamelt, en pipetteer vervolgens door de tip van de pipet net onder het oppervlak van de Taq te plaatsen om het risico te verkleinen dat zich een overmaat aan Taq als laagje aan de tip hecht. 4. Meng de mastermengsels door de pipet voorzichtig op en neer te bewegen. 5. Doe onmiddellijk 20 µl van de mastermengsels in de reactiewells. Pagina 14 van 39



6. Voeg onmiddellijk 5 µl monster, gemengde standaard of water (voor de templateloze controles) toe aan de reactiewells. Elk DNAmonster moet worden getest met zowel de controle- als alle mutatieassays. Tabel 6 toont de plaatindeling. Tabel 6: Plaatindeling K-RAS Kit Indeling met 96 wells Assay A Controle B 12ALA C 12ASP D 12ARG E 12CYS F 12SER G 12VAL H 13ASP

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

Gemengde standaard

NTC

Monster 1 Monster 2 Monster 3 Monster 4 Monster 5 Monster 6 Monster 7 Monster 8 Monster 9 Monster 10

Gemengde standaard

NTC


Gemengde standaard

NTC


Gemengde standaard

NTC


Gemengde standaard

NTC


Gemengde standaard

NTC


Gemengde standaard

NTC


Gemengde standaard

NTC


7. Sluit de PCR-plaat af en draai de plaat kort af zodat de reagentia zich op de bodem van de wells verzamelen. 8. Doe de plaat onmiddellijk in het LightCycler® 480 Instrument. LightCycler® 480 Instrument – instelling 1. Selecteer het pictogram van de LightCycler® 480 Instrument Software op het bureaublad van het aan het instrument gekoppelde werkstation. Log in op de software en selecteer in de overzichtspagina ‘New Experiment from Template’. 2. Kies ‘K-RAS LC480II Run Template’ uit de ‘Run Templates’-lijst (zie de paragraaf “LightCycler® 480 Instrument – monsterbepaling” voor de bijzonderheden). 3. Selecteer tabblad ‘Sample Editor’ en selecteer onder ‘Step 1: Select Workflow’ het selectievakje ‘Abs Quant’. Zorg er onder ‘Select Filter Combinations’ voor dat beide filters geselecteerd zijn (465-510 nm en 533-580 nm). Stel de monsternamen in onder Step 2 en Step 3. In kolom 1 moet de monsternaam ‘Mixed Standard’ zijn. In kolom 2 mag de monsternaam niet ‘NTC’ zijn. In de kolommen 3-12 dienen monsternamen te zijn ingevoerd. In kolom 1 moeten de namen voor alle wells identiek zijn. Het ‘Quantification Sample Type’ dient te worden ingesteld als ‘unknown’. Pagina 15 van 39



De ‘replicate’-kolom dient blanco te worden gelaten omdat de LightCycler® Adapt Software geen rekening houdt met replicaten. 4. Selecteer de ‘Experiment’-knop en klik op de ‘Start Run’-knop om de proef op te slaan en de cyclus te starten. LightCycler® 480 Instrument – monsteranalyse 1. Exporteer de proef (.ixo-bestand) na afloop van de run op het LightCycler® 480 Instrument via het navigatievenster naar een geschikte locatie die toegankelijk is met de LightCycler® Adapt Software. 2. BELANGRIJK: De LightCycler® Adapt Software is gevalideerd voor gebruik op één computersysteem, gedefinieerd als een enkele regeleenheid (werkstation) door Roche Diagnostics geleverd voor gebruik met één LightCycler® 480 Instrument II. Deze validatie van de LightCycler® 480 Adapt Software geldt momenteel alleen voor regeleenheden die standalone-computers zijn, d.w.z. geen deel uitmaken van een netwerk. Het gebruik van andere computers is verboden omdat de software dan mogelijk niet naar behoren functioneert. 3. Open de LightCycler® Adapt Software door op het pictogram van de LightCycler® Adapt Software op het bureaublad van het werkstation te klikken en de gebruikersnaam in het desbetreffende veld in te voeren. Deze naam wordt ingevoerd als de auteur van het rapport. 4. Gebruik de browser-knop in het hoofdmenu om één LightCycler® 480 Instrument-runbestand te selecteren (om een selectie te verwijderen moet de software worden afgesloten en weer worden opgestart). 5. Selecteer een rapporttype (pdf of csv). Als csv wordt gekozen, wordt daarnaast automatisch een pdf-versie aangemaakt. 6. Selecteer ‘Analyse’ om het resultatenrapport aan te maken. Het rapport wordt automatisch opgeslagen in de folder met het runbestand en krijgt dezelfde naam als het runbestand. 7. Het rapport wordt automatisch getoond. 8. Het rapporteerbare resultaat wordt getoond in de ‘Mutation Status’kolom van de ‘Sample Result Table’. LightCycler® Adapt Software – rapportinterpretatie 1. Het LightCycler® Adapt Software-rapport bevat algemene informatie over de analyse. 1.1. De auteur van het rapport is degene die de software heeft gedraaid en het rapport heeft aangemaakt. 1.2. De datum en het tijdstip van de analyse worden weergegeven.

Pagina 16 van 39



2. Het rapport biedt een analyseoverzicht met de naam van het gebruikte runbestand plus het bestand met de definitie van de algoritme en de sequentie van de algoritme. De bijzonderheden over de algoritme liggen vast en kunnen niet worden gewijzigd. 3. In het resultatengedeelte staan de volledige naam en het bestandspad van de run op het LightCycler® 480 Instrument plus de volgende bijzonderheden: 3.1. Het serienummer van het LightCycler® 480 Instrument. 3.2. De naam van het instrument: de identifier die in de LightCycler® 480 Instrument-software aan het LightCycler® 480 Instrument is gegeven. 3.3. Datum van de run: datum en tijdstip van de run op het LightCycler® 480 Instrument. 3.4. Runoperator: de naam van degene die op de LightCycler® 480 Instrument-software was ingelogd toen de proef werd gedraaid. 3.5. Naam van de proef: naam van het runbestand. 3.6. Softwareversie: de versie van de software die op het LightCycler® 480 Instrument gebruikt is. 3.7. Partijnummer: overgenomen van het ‘Lot No’-veld in het proefsetup-scherm van het LightCycler® 480 Instrument. 4. De plaatindeling wordt verschaft met de monsternamen die overgenomen zijn uit het ‘Sample Editor’-scherm van het LightCycler® 480 Instrument. 5. Er wordt een ‘Run Summary Result’ verschaft waarbij de run als ‘Valid’ of ‘Invalid’ wordt benoemd. Dit hangt af van de runcontroles in kolom 1 en kolom 2. 6. Runcontroles 6.1. De LightCycler® Adapt Software berekent automatisch de ∆Ctwaarde voor de gemengde standaard met behulp van de formule Mutatie-Ct – Controle-Ct = ∆Ct 6.2. De LightCycler® Adapt Software vergelijkt de waarden met de verwachte waarden in tabel 7. Tabel 7: LightCycler® Adapt Software – verwachte ∆Ct-waarden Assay Gemengde standaard ∆Ct 12ALA -0,61 12ASP -0,61 12ARG 0,34 12CYS -0,79 12SER -0,13 12VAL 0,1 13ASP -0,74 6.3. De CT- en de ∆Ct-waarden worden gerapporteerd. Pagina 17 van 39



6.4. Voor de runcontroles in kolom 1 en kolom 2 worden de volgende waarschuwingen gerapporteerd: Tabel 8: LightCycler® Adapt Software – waarschuwingen voor de runcontroles Waarschuwing CT_OUT_OF_RANGE EXO_FAIL

Betekenis

DELTA_CT_OUT_OF_RANGE EXO_CONTROL_INVALID TARGET_CHANNEL_INVALID 6.4.1.

FAM-Ct voor controleassay buiten bereik Voor de gemengde standaard is de controle-Ct < 30 of negatief wanneer het FAM-resultaat negatief is De mutatie-∆Ct-waarden liggen buiten het bereik van de set De exogene controlereactie in een NTC is mislukt De FAM-reactie heeft een positieve Ct-waarde in een NTC

De betekenissen van de waarschuwingen worden hieronder uitgebreider besproken:

6.4.1.1. CT_OUT_OF_RANGE: de controleassay voor de gemengde standaard moet een Ct-waarde hebben van 26,60 ± 2. Als de assay buiten dit bereik ligt, wordt deze waarschuwing weergegeven voor alle wells met gemengde standaard, aangezien de ∆Ct-waarden niet worden berekend en de gemengde standaard ongeldig is. Dit geeft aan dat de controleassay niet goed werkt. 6.4.1.2. EXO_FAIL: deze waarschuwing wordt weergegeven als de exogene controleassay in een van de wells met gemengde standaard lager is dan 30; dit kan erop duiden dat sprake is van PCR-contaminatie in dit mengsel. Als de exogene controleassay mislukt wanneer een FAMreactie in een van de wells met de gemengde standaard mislukt, wordt de waarschuwing EXO_FAIL ook getoond. Dit duidt op een probleem met deze assay, dat tot fout-negatieve resultaten kan leiden. De gemengde standaard is al ongeldig geworden vanwege de mislukte FAM. 6.4.1.3. DELTA_CT_OUT_OF_RANGE: als de ∆Ct-waarden van de gemengde standaard binnen ± 2,00 liggen van de waarden in tabel 7, rapporteert de software de status als geldig. Als de ∆Ct buiten het verwachte bereik ligt, is de status ongeldig en wordt deze waarschuwing getoond. Dit duidt op een probleem met een assay dat tot foute resultaten kan leiden. 6.4.1.4. EXO_CONTROL_INVALID: in de wells met templateloze controle moet de exogene controleassay in alle 8 wells een positief resultaat opleveren (Ct < 41). Als het resultaat negatief is, wordt deze waarschuwing weergegeven en de status als ongeldig getoond. Pagina 18 van 39



Dit duidt op een probleem met de assay, dat tot foute resultaten kan leiden. 6.4.1.5. TARGET_CHANNEL_INVALID: in de 8 wells met templateloze controle moet het FAM-resultaat negatief zijn (Ct > 38). Amplificatie duidt op contaminatie. Een positief resultaat leidt ertoe dat deze waarschuwing wordt weergegeven en de templateloze controle ongeldig is. 6.5. Als een well met gemengde standaard of een well met templateloze controle de status ongeldig krijgt, wordt in het ‘Run Summary Result’ het resultaat als ‘Run Invalid’ weergegeven. In de ‘Sample Result Table’ worden de monsternamen en controle-Ct-waarden gerapporteerd ,maar wordt de mutatiestatus als ‘Invalid’ gerapporteerd. De gemengde standaard geeft aan dat alle assays goed werken. Als dat niet het geval blijkt te zijn, kan dat tot een foutpositieve of fout-negatieve mutatie-uitslag leiden. De templateloze controle geeft aan dat de mastermengsels niet gecontamineerd zijn en dat de exogene controle werkt zoals verwacht. 6.6. In het onwaarschijnlijke geval dat de LightCycler® Adapt Software een foutmelding geeft, raadpleeg dan paragraaf 12 “Technische ondersteuning”. 7. Monsterresultaten 7.1. De ‘Sample Result Table’ rapporteert monsternamen, overgenomen uit de LightCycler® 480 Instrument-software, en controleassay-Ct-waarden. 7.2. De LightCycler® 480 Adapt Software berekent ∆Ct-waarden en bepaalt of een monster mutatiepositief of mutatienegatief is op basis van de 1% cut-off-waarden uit tabel 9. Tabel 9: LightCycler® Adapt Software 1% cut-off-waarden Assay 12ALA 12ASP 12ARG 12CYS 12SER 12VAL 13ASP

1% delta-Ct 6,25 7,72 6,83 6,95 8,95 6,5 9,09

7.3. Als een mutatie-∆Ct-waarde voor een monster lager is dan de bijbehorende 1% cut-off-waarde, wordt het monster als mutatiepositief benoemd. De LightCycler® Adapt Software rapporteert welke mutatie aanwezig is, maar rapporteert slechts één mutatie.

Pagina 19 van 39



Als er 2 positieve ∆Ct-waarden zijn, wordt de kleinste waarde gerapporteerd. Aangenomen wordt dat de tweede waarde het gevolg is van kruisreactiviteit van een mutatieprimer die zich vanuit een andere mutatie bindt en primet. In zeldzame gevallen waarin sprake is van een dubbele mutatie is de klinische beslissing dezelfde als wanneer er sprake is van één mutatie. 7.4. Als de monster-∆Ct-waarden groter zijn dan de 1% ∆Ct-waarden, wordt het monster als mutatienegatief gerapporteerd (kan een mutatie bevatten, maar dan bij een zodanig niveau dat die buiten de limieten van de kit valt). 7.5. Waarschuwingen 7.5.1. De LightCycler® Adapt Software rapporteert voor de monsters in de ‘Sample Result Table’ een aantal waarschuwingen als beschreven in tabel 10. Tabel 10: LightCycler® Adapt Software – waarschuwingen Waarschuwing REP_DILUTION CONF_LEVEL LIMITED EXO_FAIL FAIL

Betekenis De controle-Ct is kleiner dan 24 De controle-Ct is groter dan 28,9 en er wordt geen mutatie gerapporteerd De controle-Ct is groter dan 35 De exogene controleassay is mislukt wanneer de FAM-reactie in een mutatiereactie eveneens mislukt is of de exogene controle-Ct is kleiner dan 30 De software is niet in staat een curve als positief of negatief te benoemen

7.5.2.

De betekenissen van de waarschuwingen worden hieronder uitgebreider besproken: 7.5.2.1. REP_DILUTION: controle-Ct < 24. De assays zijn gevalideerd tot een DNA-niveau dat een controle-Ct van 24 of hoger oplevert. Als een monster een lagere controleassay-Ct oplevert dan moet het worden verdund om ervoor te zorgen dat het binnen het geldige werkbereik valt. 7.5.2.2. CONF_LEVEL: controle-Ct > 28,9. De waarschuwing CONF_LEVEL wordt weergegeven bij een negatief monster met een controle-Ct > 28,9. Mutatie-Ct-waarden worden als negatief of buiten de limieten van de kit geclassificeerd wanneer ze groter dan of gelijk aan 38 zijn. Een controle-Ct van 28,9 of lager is nodig om voldoende DNA te verkrijgen om, gezien de 1% cut-offwaarden en de Ct-cut-off-waarde van 38, 1% mutatie te kunnen detecteren. Als de controle-Ct hoger is dan 28,9 en er wordt een mutatie gedetecteerd, wordt de positieve mutatie weergegeven en blijft deze waarschuwing achterwege aangezien dit monster een duidelijke mutatie bevat. Pagina 20 van 39



Als de controle-Ct echter hoger is dan 28,9 en het monster mutatienegatief blijkt te zijn, wordt deze waarschuwing weergegeven om aan te geven dat er mogelijk low-level mutaties gemist zijn. Naarmate de controle-Ct hoger dan 28,9 wordt, neemt de gevoeligheid van mutatiedetectie af. 7.5.2.3. LIMITED: controle-Ct > 35. Dit geeft aan dat er zeer weinig amplificeerbaar DNA aanwezig is en er dus alleen mutaties kunnen worden gedetecteerd wanneer die in hoge percentages aanwezig zijn. Als bij LIMITEDmonsters een positieve mutatie een Ct < 38 oplevert, krijgt de mutatie toch de status ‘Valid’ en wordt deze mutatie gerapporteerd. De aanwezigheid van low-level mutaties in een monster met een negatief resultaat en een LIMITED-waarschuwing kan niet buiten beschouwing worden gelaten. 7.5.2.4. EXO_FAIL: de software controleert op amplificatie van de exogene controleassay om vast te stellen of er sprake kan zijn van een remmer, wat tot een fout-negatief resultaat kan leiden. De volgende logica wordt gehanteerd: a. De exogene controlereactie wordt alleen in de mutatiereactiewells bepaald, niet in de controlereactiewell, met uitzondering van de kolommen gemengde standaard en NTC (zie punt 6) of als er een exogene controle-Ct < 30 is. b. Als een mutatie positief wordt genoemd, maar de exogene controleassay in de mutatiepositieve well is mislukt, wordt de EXO_FAIL-waarschuwing niet weergegeven aangezien er sprake kan zijn van competitieve remming vanuit de FAM-reactie. De mutatiestatus is ‘Valid’. c. Als een monster in een mutatiewell als positief wordt benoemd en een exogene controleassay in een andere mutatiewell voor hetzelfde monster is mislukt, wordt de mutatie in de eerste well benoemd en is het resultaat ‘Valid’. Er wordt echter een EXO_FAILwaarschuwing weergegeven. Deze waarschuwing geeft aan dat er een probleem met de assay is in de well waarin de exogene controleassay mislukt is en er mogelijk een mutatie in deze well gemist is. Het is mogelijk dat de genoemde mutatie kruisreactiviteit tussen de assays is in plaats van een echte mutatie die gemist is. De mutatiestatus in de assay die de mutatie als positief benoemt, blijft echter geldig aangezien er duidelijk sprake is van een mutatie en de klinische beslissing dezelfde blijft, ongeacht van welke mutatie sprake is.

Pagina 21 van 39



d. Als het monster als negatief wordt benoemd, maar in een van de mutatieassays is een exogene controlereactie mislukt, wordt de EXO_FAIL-waarschuwing weergegeven en is de status ‘Invalid’. Het is mogelijk dat er een mutatie gemist is. e. Als in een van de 8 wells de exogene controleassayCt < 30 is, wordt de EXO_FAIL-waarschuwing weergegeven en is de status ‘Invalid’. Het is mogelijk dat er in deze assay sprake is van PCR-productcontaminatie. f. Het LightCycler® 480 Instrument-runbestand kan worden gecontroleerd om vast te stellen wat de mogelijke oorzaak is van het mislukken van exogene controleassays. Als alle exogene controlereacties in een kolom mislukt zijn, kan er sprake zijn van een remmer. Als dit slechts in 1 well het geval is, kan er een probleem met de plaat zijn. 7.5.2.5. FAIL: er wordt een FAIL-waarschuwing weergegeven wanneer de software niet in staat is te bepalen of een amplificatiecurve positief of negatief is, bijvoorbeeld als de curve een abnormale vorm heeft. 7.5.3. De LightCycler® Adapt Software controleert of de monsternaam binnen een kolom identiek is om er zeker van te zijn dat de mutatie- en controleassay-Ct-waarden, gebruikt voor het berekenen van ∆Ct-waarden, afkomstig zijn uit hetzelfde monster. De monsternamen worden overgenomen uit het proefrunbestand in het ‘'Sample Editor’-scherm van het LightCycler® 480 Instrument. Als ergens in de kolom de monsternaam niet klopt, rapporteert de software ‘SAMPLE MISMATCH’ in de ‘Sample Name’-kolom in de ‘Sample Result Table’. In de plaatindeling rapporteert de software de monsternaam gevolgd door (MISMATCH). Als dit een typefout is, kan de naam in het LightCycler® 480 Instrument-runbestand worden gecorrigeerd en de gegevens opnieuw met de LightCycler® Adapt Software worden geanalyseerd. ABI7500 – opstelling van de proef Voor elk DNA-monster moeten alle controle- en mutatie-assays worden geanalyseerd in dezelfde PCR-run om run/run-variaties te vermijden. 1. Ontdooi de reactiemengsels en de gemengde standaard uit de K-RAS Kit bij kamertemperatuur. Meng elke oplossing na het ontdooien door elk buisje 10 keer om te keren, zodat plaatselijke zoutconcentraties worden vermeden. Bereid voldoende mengsels voor de DNA-monsters, de gemengde standaard en de templateloze controles, plus 2 reacties extra per mengsel als aangegeven in tabel 11.

Pagina 22 van 39



Tabel 11: Volumes K-RAS-mastermengsel

Assay

Reactiemengsel (µl)x1

Controleassay Mutatieassays

19,8 19,8

Mastermengsels Reactiemengsel (µl) Taq (µl) per plaat Taq (µl)x1 per plaat (x14) (x14) 0,2 0,2

277,2 277,2

2,8 2,8

2. Taq en reactiemengsels met Taq mogen NIET worden geschud omdat het enzym door schudden onwerkzaam kan worden. 3. Zorg ervoor dat de Taq vóór gebruik op kamertemperatuur is. Draai de flacon af zodat de Taq zich op de bodem verzamelt, en pipetteer vervolgens door de tip van de pipet net onder het oppervlak van de Taq te plaatsen om het risico te verkleinen dat zich een overmaat aan Taq als laagje aan de tip hecht. 4. Meng de mastermengsels door de pipet voorzichtig op en neer te bewegen. 5. Doe onmiddellijk 20 µl van de mastermengsels in de reactiewells. 6. Voeg onmiddellijk 5 µl monster, gemengde standaard of water (voor de templateloze controles) toe aan de reactiewells. Elk DNAmonster moet worden getest met zowel de controle- als de mutatieassays. Tabel 12 toont de plaatindeling. Tabel 12: ABI7500 K-RAS-plaatindeling Indeling met 96 wells Assay A Controle B 12ALA C 12ASP D 12ARG E 12CYS F 12SER G 12VAL H 13ASP

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

Gemengde standaard

NTC

Monster 1

Monster 2

Monster Monster Monster Monster Monster 3 4 5 6 7

Monster Monster 8 9

Monster 10

Gemengde standaard

NTC

Monster 1

Monster 2


Monster Monster 8 9

Monster 10

Gemengde standaard

NTC

Monster 1

Monster 2


Monster Monster 8 9

Monster 10

Gemengde standaard

NTC

Monster 1

Monster 2


Monster Monster 8 9

Monster 10

Gemengde standaard

NTC

Monster 1

Monster 2


Monster Monster 8 9

Monster 10

Gemengde standaard

NTC

Monster 1

Monster 2


Monster Monster 8 9

Monster 10

Gemengde standaard

NTC

Monster 1

Monster 2


Monster Monster 8 9

Monster 10

Gemengde standaard

NTC

Monster 1

Monster 2


Monster Monster 8 9

Monster 10

7. Sluit de PCR-plaat af en draai de plaat kort af zodat de reagentia zich op de bodem van de wells verzamelen. Pagina 23 van 39



8. Doe de plaat onmiddellijk in het ABI7500 Instrument. ABI7500 Instrument – instelling 1. Selecteer het pictogram van de 7500 System Software op het bureaublad van het aan het instrument gekoppelde werkstation. Open een nieuw runbestand uit het bestandsmenu in de 7500 Sequence Detection Software versie 1.4. 2. Selecteer ‘Standard Curve (Absolute Quantification)’ onder ‘Assay’. Selecteer ‘Standard 7500’ onder ‘Run Mode’. 3. Ga naar het detectorinstellingenvenster door de ‘Next’-knop te selecteren. Voeg een FAM- en een JOE-detector aan de detectorenlijst toe, met quenchers ingesteld op ‘none’. Als deze detectoren niet al bestaan, selecteer dan de ‘New Detectors’-knop en stel een FAM- en een JOE-detector in met de quencher ingesteld op ‘none’. 4. Stel ‘Passive Reference’ in op ‘None’ en selecteer de ‘Next’-knop. 5. Selecteer de gehele plaat en vink de selectievakjes aan voor de FAMen de JOE-detectoren om ervoor te zorgen dat beide kleurstoffen in elke well worden gecontroleerd. Selecteer de ‘Finish’-knop. 6. Stel onder het tabblad ‘Instrument’ de cyclus in als aangeven in tabel 13. Tabel 13: Cycluscondities ABI7500 Temperatuur Fase 1 95 oC Fase 2 95 oC 60 oC

Tijd

Cycli

4 min

1

30 sec 1 min

40

Gegevensverzameling

FAM, JOE

7. Selecteer de ‘Start’-knop om de proef op te slaan en de cyclus te starten. ABI7500 – monsteranalyse 1. Zorg ervoor dat de passieve referentie in het wellinspector-scherm ingesteld is op ‘none’. 2. Controleer of elke well een JOE-signaal geeft van de exogene controleassay. a. Als de exogene controleassay een positief resultaat oplevert, ga dan door met de analyse. b. Als de exogene controleassay is mislukt, maar de FAM-reactie heeft krachtig geamplificeerd, ga dan door met de analyse omdat de FAM-reactie sterker is geweest dan de exogene controlereactie. Pagina 24 van 39



c. Als zowel de FAM-reactie als de exogene controlereactie is mislukt, mogen de gegevens niet worden gebruikt omdat er mogelijk remmers aanwezig zijn. Deze remmers kunnen fout-negatieve resultaten veroorzaken. 3. Selecteer in het tabblad ‘Amplification Plot’ alle gebruikte wells en selecteer de FAM-kleurstof in het detector-dropdown-menu. Gebruik de automatische baseline-instellingen en de handmatige Ct, en stel vervolgens de drempel handmatig in het midden van de exponentiële fase in; gebruik daarbij de log-schaal voor de Y-as als beschreven in de gebruikershandleiding bij de ABI7500. 4. Analyseer de gegevens en bereken de ∆Ct-waarde als volgt: [Ct monstermutatieassay] – [Ct monstercontroleassay] =∆Ct De gegevens kunnen naar Microsoft Excel worden geëxporteerd om ze gemakkelijker te kunnen analyseren. ABI7500 – gegevensinterpretatie 1. Controle-Ct-waarden: 1.1. De controle-Ct-waarde moet ≥ 24 zijn om het overbelasten van de assay te vermijden. 1.2. Controle-Ct < 29: de K-RAS Kit is in staat zo weinig als 1% mutatie in deze monsters te detecteren. 1.3. In monsters met een controle-Ct ≥ 29 detecteert de kit niet tot 1% mutaties, maar nog wel hogere mutatieniveaus. 1.4. Controle-Ct ≥ 35: in het monster zijn slechts een paar amplificeerbare DNA-kopieën aanwezig en de kans dat mutaties worden gezien is alleen aanwezig als de meeste kopieën gemuteerd zijn. 1.5. Controle-Ct ≥ 38: er is weinig DNA en de gegevens mogen niet worden gebruikt. 2. ∆Ct-waarden gemengde standaard 2.1. De ∆Ct-waarden van de gemengde standaard dienen als de waarden in tabel 14 te zijn, maar door verschillende drempelinstellingen op verschillende instrumenten kunnen variaties van ± 2 optreden. Tabel 14: ABI7500 ∆Ct-waarden en 1% cut-off-punten van de gemengde standaard

Assays 12ALA 12ASP 12ARG 12CYS 12SER 12VAL 13ASP

Gemengde standaard ∆Ct

-0,70 -1,04 -0,02 -0,98 0,02 -0,19 -1,12

Acceptabel bereik gemengde standaard -2,70 tot 1,30 -3,04 tot 0,96 -2,02 tot 1,98 -2,98 tot 1,02 -1,98 tot 2,02 -2,19 tot 1,81 -3,12 tot 0,88

Pagina 25 van 39

1% ∆Ct monster 6,5 8 8 7 9 6,5 9



3. Monster-∆Ct-waarden: 3.1. Als de monster-∆Ct-waarde hoger is dan de 1% waarde (als aangegeven in tabel 14), wordt het DNA-monster geclassificeerd als mutatienegatief of als onder de limieten van de K-RAS Kit. 3.2. Als de monster-∆CT kleiner is dan de 1% waarde, wordt het DNAmonster geclassificeerd als mutatiepositief. 3.3. Mutatie-Ct-waarden van 38 of hoger moeten als negatief of lager dan de limieten van de kit worden gescoord. 10. Beperkingen van de test Een monstercontroleassay-Ct < 29 op de ABI7500 en < 28,9 op het LightCycler® 480 Instrument is nodig om 1% mutatie te detecteren in een achtergrond van wildtype DNA. De assays zijn niet in staat 1% mutatie te detecteren in monsters met een hogere controle-Ct-waarde; de gevoeligheid van mutatiedetectie neemt af als de controle-Ct boven deze waarden uitstijgt. De controle-Ct-waarde van een DNA-monster wordt gebaseerd op de concentratie zoals die met PCR is bepaald. Waarden op basis van meting van optische dichtheid komen in gefragmenteerde DNA-monsters niet overeen met controleassay-Ct-waarden. Er wordt extra controlereactiemengsel geleverd om de monster-Ct-waarden te kunnen bepalen voordat een run met de kit wordt uitgevoerd. Als een monster een mutatiepositief resultaat te zien geeft bij een mutatieCt ≥ 38, moet de assay als negatief of lager dan de limieten van de kit worden gescoord. De LightCycler® Adapt Software doet dit automatisch. Er kan zich enige kruisreactiviteit tussen mutatiereacties voordoen. Als bijvoorbeeld een high-level 12ALA-mutatie wordt gezien, geven enkele andere mutatiereacties eveneens een positief resultaat te zien. Dit komt doordat de ARMS-primers andere mutaties binnen een paar basen van elkaar detecteren. Op synthetisch controlemateriaal vormt de kruisreactiviteit een leesbaar patroon op de ABI7500 waarmee de echte positieve mutatie uit verscheidene signalen te onderscheiden is (zie tabel 15).

Pagina 26 van 39



Tabel 15: Patroon van kruisreactiviteit met synthetisch controlemateriaal op de ABI7500 ‘Ja’ geeft het echte signaal aan. Het cijfer geeft bij benadering het aantal cycli na het echte signaal aan waarin een kruisreactiviteitsignaal kan worden gezien. De waarden na 9 cycli liggen in de negatieve zone, reden waarom niet meer dan 9 cycli zijn aangegeven. Positief 12ALA- 12ASP- 12ARG- 12CYS- 12SER- 12VAL- 13ASPmonster signaal signaal signaal signaal signaal signaal signaal 12ALA Ja 9 6 3 6 9 Ja 12ASP Ja 12ARG 7 4 Ja 12CYS 9 6 9 Ja 8 12SER 4 Ja 12VAL Ja 13ASP NB: Het patroon van kruisreactiviteit kan per DNA-monster, bijvoorbeeld in paraffine ingebedde DNA-monsters, verschillen. De K-RAS Kit is ontworpen om één mutatie in een DNA-monster te detecteren. Als een tweede mutatieassay een positief resultaat oplevert, is dat waarschijnlijk het gevolg van kruisreactiviteit. Er zijn echter dubbele mutanten waargenomen, zij het zelden. Als het patroon niet bij het patroon van kruisreactiviteit past, kan nader onderzoek nodig zijn. 11. Prestatiekenmerken assay De assayprestatie is voor de K-RAS Kit gekenmerkt op de ABI7500 en het LightCycler® 480 Instrument (waarbij de LightCycler® Adapt Software is gebruikt voor het verkrijgen van Ct-waarden). Op elk instrument is een verscheidenheid aan tests uitgevoerd. Hieronder volgt een samenvatting van de resultaten van die tests. Validatie 1% cut-off: LightCycler® 480 Instrument: De detectie van 1% mutatie in een achtergrond van K-RAS-mutatienegatief cellijn-DNA is bepaald in een reeks van drie verschillende concentraties cellijn-DNA om aan elke mutatieassay een cut-off-∆Ct-waarde toe te kennen. Voor elke assay werden 1% standaarden in drievoud getest, in 3 afzonderlijke runs, voor zowel de controleassay als de mutatieassay. Dit werd door 3 verschillende operators herhaald. Ct-waarden werden verkregen met behulp van de LightCycler® Adapt Software. De 1% ∆Ct-waarden werden berekend uit alle combinaties van mutatie- en controle-Ct-waarden van de replicaten binnen een run.

Pagina 27 van 39



De cut-off-∆Ct-waarden werden vastgesteld als de gemiddelde waarde genomen over alle runs en concentraties. De resultaten van deze tests zijn samengevat in de paragraaf “Gegevensinterpretatie”. ABI7500: Voor elke assay werden 1% verdunningen in drievoud getest, voor 3 partijen kits, in 3 afzonderlijke runs, voor zowel de controleassay als de mutatieassay. De gemengde standaard werd op iedere plaat gebruikt om te controleren of de assays binnen de gespecificeerde criteria werden uitgevoerd. De 1% ∆Ct-waarden werden berekend uit gemiddelde Ct-waarden van de replicaten binnen een run en een partij. De cut-off-∆Ct-waarden werden vastgesteld als de gemiddelde waarde (t.o.v. de dichtstbijzijnde 0,5), genomen over alle partijen, runs en concentraties, voor concentraties waarbij alle replicaten een Ct-waarde opleverden. De resultaten van deze tests zijn samengevat in tabel 16 hieronder. Tabel 16: ABI7500 – validatieresultaten 1% cut-off-waarden 1% ∆Ctwaarden 12ALA 6,68 6,5 12ASP 8,2 8 12ARG 8,16 8 12CYS 6,94 7 12SER 8,83 9 12VAL 7,67 7,5* 13ASP 8,89 9 * De 1% cut-off voor 12VAL werd op basis van het doorbraakonderzoek gewijzigd in 6,5. Zie onderstaande bespreking. Assay

Gem.

Bepaling ∆Ct gemengde standaard: LightCycler® 480 Instrument: De ∆Ct-waarden van de gemengde standaard zijn gemiddelde waarden genomen over 50 runs waarin de gemengde standaard getest werd. Ct-waarden werden verkregen met behulp van de LightCycler® 480 Adapt Software. De verwachte ∆Ct-waarden voor de gemengde standaard zijn vermeld in de paragraaf “Gegevensinterpretatie”. ABI7500: De waarden voor de gemengde standaard zijn vastgesteld aan de hand van het gemiddelde van 422 ∆Ct-waarden. Deze zijn berekend voor vele verschillende kitpartijen en runs. De verwachte ∆Ct-waarden voor de gemengde standaard zijn vermeld in de paragraaf “Gegevensinterpretatie”. Doorbraakvalidatie: ‘Doorbraak' wordt gedefinieerd als de niet-specifieke amplificatie in de mutatieassays van een wildtype doel-DNA dat in een specifiek monster aanwezig is. Dit veroorzaakt een meetbaar niveau van achtergrondruis. De doorbraak van wildtype DNA werd voor elke mutatieassay bepaald. Pagina 28 van 39



Uit het doorbraakonderzoek bleek dat de eerder vastgestelde 1% cut-offwaarden lager waren dan het doorbraakniveau en rapportage van een foutpositief resultaat zouden voorkomen. LightCycler® 480 Instrument: Er werden tests uitgevoerd met 10 monsters van K-RAS-mutatienegatief cellijn-DNA in verschillende concentraties, 5 FFPE K-RAS-mutatienegatieve monsters en 5 FFPE K-RASmutatiepositieve monsters; de tests werden in duplo en op 5 platen uitgevoerd. De mutatiepositieve monsters waren positief voor één mutatie; de overige mutaties werden gebruikt om op doorbraak te testen. Ct-waarden werden verkregen met de LightCycler® Adapt Software; alle combinaties van Ct-waarden werden gebruikt voor het berekenen van ∆Ct-waarden. De resultaten van mutatienegatieve assays van cellijn-DNA en FFPEmonsters leverden ∆Ct-waarden op die allemaal boven de 1% cut-offwaarden lagen, wat aangeeft dat de 1% cut-off-waarden robuuste waarden zijn. Tabel 17 toont de slechtste doorbraakniveaus van de 5 runs. Tabel 17: Doorbraakresultaten Assay 12ALA 12ASP 12ARG 12CYS 12SER 12VAL 13ASP

Slechtste doorbraak∆Ct-waarden 12,35 11,36 Geen doorbraak Geen doorbraak 11,74 12,29 11,29

ABI7500: Doorbraak werd bepaald met gepoold cellijn-DNA uit K-RASmutatienegatieve cellijnen bij 3 verschillende DNA-niveaus. Er werden drie identieke PCR-platen getest. Elke plaat bevatte 3 partijen reagentia. De gemengde standaard werd gebruikt als positieve controle. Verder werden positieve FFPE-monsters in duplo getest. De meerderheid van de mutatiepositieve monsters is positief voor slechts één mutatie. De andere mutatieassays kunnen worden gebruikt voor het bepalen van doorbraak (al wordt enige kruisreactiviteit verwacht tussen sommige assays en positieve mutaties. Dit levert echter een bekend patroon op). Er werden Ct-waarden en ∆Ct-waarden verkregen en vergeleken met de 1% cut-off-waarden. De gegevens van cellijn-DNA-monsters en FFPE-monsters leverden ∆Ctwaarden op die allemaal boven de 1% cut-off-waarden lagen, met uitzondering van één FFPE-monster dat een ∆Ct opleverde die net onder (6,84) de cut-off van 7,5 lag. Omdat de 1% cut-off-bepaling op 6,84 uitkwam, werd de 1% ∆Ct-waarde voor de 12VAL-assay gewijzigd van 7,5 in 6,5 om het risico van fout-positieve resultaten te vermijden. Tabel 18 hieronder toont de huidige 1% ∆Ct-waarden, gebaseerd op de doorbraakvalidatieresultaten.

Pagina 29 van 39



Tabel 18: Resultaten doorbraakvalidatie Assay 12ALA 12ASP 12ARG 12CYS 12SER 12VAL 13ASP

1% ∆Ct-waarden 6,5 8 8 7 9 6,5 9

Precisievalidatie: LightCycler® 480 Instrument: De precisie werd getest met 1% synthetische controles bij 3 verschillende niveaus van K-RAS-mutatienegatief cellijn-DNA. Iedere controle werd voor de relevante assay in drievoud getest op een plaat die eveneens gemengde standaardreacties in duplo en enkelvoudige NTC-reacties bevatte om te controleren of de reacties binnen de specificaties werkten. Dezelfde plaat werd 54 keer in 6 dagen herhaald. In deze matrix van runs was het gebruik van 3 instrumenten, 3 reagentiapartijen en 3 operators opgenomen. Ct-waarden werden verkregen met de LightCycler® Adapt Software; alle combinaties van Ct-waarden werden gebruikt voor het berekenen van ∆Ctwaarden. Iedere ∆Ct-waarde die hoger was dan drie keer het interkwartielbereik werd als uitschieter gezien en uit de analyse verwijderd. Er werden gemiddelden, standaardfouten en standaarddeviaties berekend; de gegevens werden gegroepeerd naar kitpartij, instrument of operator om de door deze variabelen veroorzaakte variatie te bepalen. Verder werd de algemene herhaalbaarheid van de assays bepaald. Uit de gegevens blijkt dat de totale variabiliteit binnen de assays laag is en dat 2 standaarddeviaties rond het gemiddelde uitkomt op ± 1,4 cycli van het gemiddelde van de assay met de grootste standaardafwijking. Bij iedere test lag de gemiddelde ∆Ct per operator binnen 0,15 cyclus van het totale gemiddelde van de gehele gegevensset. De verschillen tussen de operators waren niet groter dan 0,2 Ct, waaruit bleek dat de variatie tussen operators niet groter was dan de variatie binnen de gehele gegevensset en dat de assays robuust genoeg zijn om variabiliteit tussen operators te weerstaan. Bij iedere test was het verschil tussen de gemiddelden voor afzonderlijke instrumenten en het totale gemiddelde ± 0,097 en was het verschil tussen gemiddelden voor afzonderlijke instrumenten niet slechter dan ± 0,186, waaruit bleek dat de variatie tussen instrumenten niet groter was dan de variatie binnen de gehele gegevensset en dat de assays robuust genoeg zijn om variabiliteit tussen instrumenten te weerstaan.

Pagina 30 van 39



Bij iedere test was het grootste verschil tussen een partij en het totale gemiddelde ± 0,195 en waren de slechtste verschillen tussen partijen ± 0,38, waaruit bleek dat de variatie tussen partijen niet groter was dan de variatie binnen de gehele gegevensset en dat de assays robuust genoeg zijn om variabiliteit tussen partijen te weerstaan. ABI7500: Er werden proeven uitgevoerd om de precisieprestatie van elke assay te bepalen door één PCR-plaat te herhalen met een reeks monsters met een hoge en een lage DNA-concentratie en een hoog en een laag mutatieniveau, voor 3 reagentiapartijen binnen een dag, tussen dagen, tussen operators en tussen instrumenten. Er werd een one-way ANOVA gebruikt voor het bepalen van de variatie tussen replicaten, reagentiapartijen, runs, testdagen, instrumenten en operators. De nulhypothese was dat de gemiddelde waarden in alle categorieën gelijk waren. Voor de Ct-waarden werden eveneens totale gemiddelden, SD en % CV berekend. Geen van de assays vertoonde significante deviatie, op het niveau p = 0,05, van de nulhypothese dat de gemiddelden in alle categorieën gelijk zouden zijn. Dit duidt erop dat de assays robuust genoeg zijn om variaties tussen instrumenten, operators, partijen, dagen en runs te weerstaan. Nauwkeurigheidsvalidatie: LightCycler® 480 Instrument: De nauwkeurigheid is bepaald met 92 FFPE-monsters en 28 mutatiepositieve cellijnverdunningen. Deze monsters zijn getest met de K-RAS Kit en eveneens gesequenced met Sanger-sequencing. De met de 2 methoden als K-RAS-mutatie benoemde monsters zijn met elkaar vergeleken; er waren 18 tegenstrijdige resultaten (5 FFPE’s en 13 cellijnen), waarbij sequencing op een negatief resultaat duidde, maar het monster in de DxS-assay positief was. Om aanwezigheid van een mutatie in deze 18 monsters te bevestigen, werd van elk monster de regio rond de mutaties gekloond. De aanwezigheid van een mutatiepositieve kloon werd gebruikt om de tegenstrijdigheid op te lossen. ABI7500: De nauwkeurigheid werd bepaald met synthetische controles verdund tot 2 niveaus K-RAS-mutatienegatief cellijn-DNA, wat 3 verschillende percentages mutatie opleverde, wat zowel positieve als negatieve mutatieniveaus dekte. Per mutatie werden runs met 3 identieke platen, elk met 3 reagentiapartijen, uitgevoerd. De geteste mutatieniveaus waren 25%, 5% en 0,5%. (De 25%- en 5%-monsters moesten een mutatiepositief resultaat opleveren [∆Ct lager dan de 1% cut-off-waarden]; het 0,5%-monster moest een mutatienegatief resultaat opleveren [∆Ct hoger dan de 1% cut-off-waarden]). De resultaten zijn samengevat in tabel 19 hieronder.

Pagina 31 van 39



Tabel 19: ABI7500 – Resultaten nauwkeurigheidsvalidatie Assay

25%

5%

0,5%

Assay

100%

100%

94%

12ALA

100%

100%

100%

12ASP

100%

100%

100%

12ARG

100%

100%

100%

12CYS

100%

100%

100%

12SER

100%

100%

100%

12VAL

100%

100%

100%

13ASP

100%

100%

100%

De afname in nauwkeurigheid van het 12ALA-assay is het gevolg van variatie tussen replicaten bij één DNA-niveau. Lineariteitsvalidatie: LightCycler® 480 Instrument: De lineariteit is bepaald met synthetische standaarden bij mutatieniveaus van 100%, 1% en 0% per assay. Bij elk mutatiepercentage is een seriële verdunning uitgevoerd om het mutatieniveau te handhaven, maar de totale hoeveelheid DNA te verkleinen. Er werden standaardcurven geproduceerd door voor de controleassay en de relevante mutatieassay van elke verdunning in drievoud een run uit te voeren op 3 replicaatplaten. Ct-waarden werden geproduceerd met behulp van de LightCycler® Adapt Software. Voor elke mutatie werd een grafiek geproduceerd (gegevens niet getoond) waarin de controleassay-Ct en de mutatieassay-Ct tegen elkaar werden uitgezet en per mutatieniveau een regressieanalyse werd uitgevoerd. De 95%-betrouwbaarheidsintervallen werden eveneens per mutatieniveau uitgezet. Uit de 0% tests werden geen mutatie-Ct-waarden verkregen. Uit de 100%en 1%-grafieken bleek dat de gegevenssets duidelijk van elkaar werden onderscheiden en dat de curvehellingen substantieel gelijkwaardig waren, wat op vergelijkbare amplificatie-efficiëntie duidt bij verschillende mutatieconcentraties. ABI7500: In dit onderzoek is de efficiëntie van elke mutatieassay bij een reeks DNA-concentraties in een achtergrond van wildtype DNA en in water bepaald. Elke mutatieassay moest een efficiëntie hebben van 90-110% (100% ± 10%). Er werden standaardcurven opgesteld met een vijfvoudige seriële verdunning; per assay werd een run met één PCR-plaat met drie partijen kitreagentia uitgevoerd. De 100% mutatiestandaarden werden door verdunning met water bij 50 ng, 10 ng, 2 ng en 0,4 ng DNA op elk van de mutatieassays getest. De mutatieassays werden eveneens getest met een vijfvoudige seriële verdunning tot 10 ng/µl cellijn-DNA om het effect van doorbraak te bepalen. Pagina 32 van 39



Voor elke mutatieassay werden op basis van de proefgegevens standaardcurven gegenereerd. De PCR-efficiënties werden berekend met de vergelijking:

100((10-1/helling)-1)

Het hoogste niveau van doorbraak in de 10 ng/µl cellijnverdunningen leverde efficiënties op van meer dan 100%. De totale efficiënties van de reagentiapartijen werd berekend. Alle waarden waren vergelijkbaar en binnen 10% van de efficiëntie van de controleassay. De controleassay en de mutatieassays hadden parallelle standaardcurven, wat betekent dat de ∆Ct-analysemethode geschikt is voor gebruik. De lineariteit bleef acceptabel bij 0,4 ng DNA tot 50 ng DNA. Validatie kruisreactiviteit: LightCycler® 480 Instrument: Er is geen validatie van kruisreactiviteit uitgevoerd omdat de LightCycler® Adapt Software alleen een mutatie met de kleinste ∆Ct rapporteert. ABI7500: Aangezien alle door de K-RAS Kit gedetecteerde mutaties zich in een regio met 5 basenparen bevinden, is te verwachten dat er enige kruisreactiviteit tussen primers zal plaatsvinden. In dit onderzoek is het patroon van kruisreactiviteit voor de K-RAS Kit bepaald. De tests werden uitgevoerd met synthetische mutatiecontroles om vast te stellen in hoeveel cycli na een echt positief signaal een kruisreactiviteitsignaal kon worden gedetecteerd. Van elk mutatiereactiemengsel werd een run uitgevoerd met zes replicaten van de zeven afzonderlijke 100% mutatiecontroles. Verder werd in dezelfde run elke controle getest met het gematchte reactiemengsel en alle andere reactiemengsels. Het kruisreactiviteitpatroon werd bepaald door het berekenen van het verschil tussen de werkelijke amplificatie-Ct-waarde uit de gematchte cassette en het kruisreactiviteitsignaal van iedere andere primer. Het verwachte kruisreactiepatroon staat vermeld in tabel 20 hieronder. Het kruisreactiviteitpatroon bleek consistent te zijn en stelt de gebruiker in staat een amplificatiepatroon af te lezen, wanneer meer dan één assay een positief resultaat geeft, om het correcte assayresultaat te verkrijgen. De cijfers in de cellen duiden bij benadering op het aantal cycli na detectie van het echte positieve signaal waarin een kruisreactiviteitsignaal kan worden gezien. Er zijn geen waarden hoger dan 9 cycli opgenomen omdat die worden geclassificeerd als mutatienegatieve resultaten.

Pagina 33 van 39



Tabel 20: ABI7500 – Resultaten validatie kruisreactiviteit Positief monster

12ALAsignaal

12ASPsignaal

12ARGsignaal

12CYSsignaal

12SERsignaal

12VALsignaal

13ASPsignaal

12ALA 12ASP 12ARG 12CYS 12SER 12VAL 13ASP

Ja 9 9 4 -

9 Ja 7 6 -

Ja 4 9 -

6 Ja -

3 Ja -

6 Ja -

8 Ja

Validatie cyclustolerantie: LightCycler® 480 Instrument: In deze onderzoeken is de tolerantie van de mutatieassays voor variaties in cyclustemperatuur bepaald. Aangezien de uitgloeitemperatuur de meest kritische temperatuur voor het presteren van de assays is, is de uitgloeitemperatuur de parameter die gevarieerd werd. De cyclustolerantie is bepaald met 1% synthetische standaarden bij 3 verschillende DNA-niveaus. Voor elke mutatie is met deze monsters een run in drievoud uitgevoerd naast gemengde standaardreacties in duplo en enkelvoudige NTC-reacties om te controleren of de assays binnen de specificaties werden uitgevoerd. Elke plaat werd getest bij een uitgloeitemperatuur van 59 °C, 60 °C en 61 °C. 60 °C is de optimale temperatuur voor het uitvoeren van de assay, maar variatie over of tussen PCR-blokken betekent dat de assay binnen het aangegeven bereik robuust moet zijn. Met elke plaat werd in drievoud bij elke temperatuur een run uitgevoerd. Ct-waarden werden verkregen met de LightCycler® Adapt Software; alle combinaties van controle- en mutatieCt-waarden per monster werden gebruikt voor het berekenen van ∆Ctwaarden. Alle assays voldeden aan de acceptatiecriteria dat de waarden bij 59 °C en 61 °C niet mochten verschillen van de gemiddelde waarde bij 60 ° ± de standaarddeviatie bij 60 °C. Hieruit blijkt dat de assays robuust genoeg zijn om een afwijking van 1 °C in de uitgloeitemperatuur te weerstaan. ABI7500: Bij iedere uitgloeitemperatuur werd een run met 3 identieke PCR-platen, elk met 3 kitreagentiapartijen, uitgevoerd. De gemengde standaard werd getest, evenals 50 ng gepoold mutatienegatief cellijn-DNA . Aangezien 60 °C de aanbevolen uitgloeitemperatuur is, werden de runs met de platen uitgevoerd bij 58 °C, 60 °C en 62 °C. Als de assays robuust genoeg waren om de proeftemperaturen te tolereren, moesten de ∆Ctwaarden van de gemengde standaard binnen ± 1,5 van de vaste waarden voor de gemengde standaard zijn en moesten de ∆Ct-waarden van de gepoolde cellijn boven de 1% cut-off-punten liggen.

Pagina 34 van 39



12ASP bleek het gevoeligst voor temperatuurvariaties te zijn; alle assays presteerden echter acceptabel bij de 3 temperaturen, waaruit bleek dat de assays robuust zijn wanneer ze worden uitgevoerd bij temperaturen die 2 °C hoger of lager zijn dan de optimale temperatuur. Validatie Taq-tolerantie: LightCycler® 480 Instrument: In deze onderzoeken is de tolerantie bepaald van de mutatieassays voor variaties in de hoeveelheid Taqpolymerase, een mogelijke bron van gebruikersvariatie aangezien Taq door de gebruiker wordt toegevoegd. De tolerantie van de assays voor verschillende hoeveelheden Taq is bepaald met 1% synthetische standaarden bij 3 verschillende DNA-niveaus. Elk monster werd in drievoud getest bij een hoog, normaal en laag Taq-niveau (hoog niveau is 20% extra Taq, laag niveau is 20% minder Taq dan normaal). Ook werden gemengde standaardreacties in duplo en enkelvoudige NTC-reacties getest om te controleren of de assays binnen de specificaties werkten. Met elke plaat werd in drievoud een run uitgevoerd waarbij 3 verschillende hoeveelheden Taq werden getest. Ct-waarden werden verkregen met behulp van de LightCycler® Adapt Software; alle combinaties van Ct-waarden van replicaten op een plaat werden gebruikt voor het berekenen van ∆Ct-waarden. Alle assays voldeden aan de acceptatiecriteria dat de gemiddelden van de monsters met veel en weinig Taq met niet meer dan 1 standaarddeviatie van de normale Taq-gegevens mochten verschillen van het gemiddelde van de normale hoeveelheid Taq. ABI7500: Per mutatieassay werden runs uitgevoerd met 3 identieke PCRplaten met elk 3 reagentiapartijen, waarbij de hoeveelheid Taq werd gevarieerd met +10% en -10% van de aanbevolen hoeveelheid; de aanbevolen hoeveelheid werd eveneens getest. De gemengde standaard werd getest, evenals 1% standaarden bij 2 DNA-niveaus en 50 ng mutatienegatief cellijn-DNA. De assaygegevens werden geanalyseerd op gemiddelde, standaarddeviatie en variatiecoëfficiënt. Uit de resultaten bleek weinig variatie (gelijkwaardige SD van de assays, % VC < 10%) in assayresultaten wanneer de hoeveelheid Taq met ± 10% werd gevarieerd, waaruit bleek dat de assays tot 10% variatie in de hoeveelheid Taq-polymerase tolereerden. 12. Technische ondersteuning Neem voor technische ondersteuning en aanvullende informatie contact op met uw Roche-leverancier. Paragraaf 13 bevat een lijst met contactgegevens van de hoofddistributeurs van Roche.

Pagina 35 van 39



13. Gegevens fabrikant en distributeurs DxS Limited 48 Grafton Street, Manchester M13 9XX, Verenigd Koninkrijk Roche Molecular Systems, Inc. Branchburg, NJ, 08876 VS Lid van de Roche Group VERENIGD KONINKRIJK

FRANKRIJK

SPANJE

Roche Diagnostics Charles Avenue Burgess Hill West Sussex Verenigd Koninkrijk RH15 9RY Roche Diagnostics S.A. 2 Avenue du Vercors BP 59, Meylan Cedex, 38240 Roche Diagnostics S.L. Av. de la Generalitat, s/n Sant Cugat del Valles Barcelona, E-08190

DUITSLAND

Roche Diagnostics GmbH Sandhoferstr. 116 Dept. VM-G Mannheim, D-68298

ZWITSERLAND

Roche Diagnostics (Schweiz) AG Industriestr. 7 Rotkreuz, CH-6343 Roche Diagnostics – Italy V. le G.B. Stucchi 110 Monza (MI), I-20052

ITALIË

Als u deze kit hebt aangeschaft in een land dat niet in bovenstaande lijst kantoren van Roche Diagnostics vermeld staat, neem dan contact op met Roche Diagnostics GmbH op onderstaand adres in Mannheim, Duitsland. HOOFDDISTRIBUTIECENTRUM

Roche Diagnostics GmbH Sandhofer Strasse 116 D-68305 Mannheim

14. Datum van uitgifte van de recentste versie Datum recentste versie: februari 2009 Samenvatting wijzigingen: Verandering van de waarde in tabel 5 en 11. Enkele kleine typografische veranderingen.

Pagina 36 van 39



15. Referenties 1. R.A. Hilger, M.E. Scheulen, D. Strumberg. (2002). The Ras-Raf-MEKERK Pathway in the Treatment of Cancer. Onkologie 25: 511-518. 2. Pavan Bachireddy, Pavan K. Bendapudi, Dean W. Felsher. (2005). Getting at MYC through RAS. Clin Cancer Res 11(12):4278-4281. 3. Sae-Won Han, Tae-You Kim, Yoon Kyung Jeon, Pil Gyu Hwang, SeockAh Im, Kyung-Hun Lee, Jee Hyun Kim, Dong-Wan Kim, Dae Seog Heo, Noe Kyeong Kim, Doo Hyun Chung, Yung-Jue Bang. (2006). Optimization of Patient Selection for Gefitinib in Non-Small Cell Lung Cancer by combined analysis of Epidermal Growth Factor Receptor Mutation, K-ras Mutation, and AKT Phosphorylation. Clin Cancer Res 12(8):2538-2544. 4. William Pao, Theresa Y. Wang, Gregory J. Riely, Vincent A. Miller, Qiulu Pan, Marc Ladanyi, Maureen SF. Zakowski, Robert T. Heelan, Mark G. Kris, Harold E. Varmus. (2005). KRAS Mutations and Primary Resistance of Lung Adenocarcinomas to Gefitinib or Erlotinib. PloS Medicine 2(1):57-61. 5. Astrid Lievre, Jean-Baptiste Bachet, Delphine Le Corre, Valerie Boige, Bruno Landi, Jean-Francois Cote, Gorana Tomasic, Christophe Penna, Michel Ducreux, Philippe Rougier, Frederique Penault-Llorca, Pierre Laurent-Puig. (2006). KRAS Mutation Status is Predictive of Response to Cetuximab Therapy in Colorectal Cancer. Cancer Res 66 (8): 39923995. 6. Silvia Benvenuti, Andrea Sartore-Bianchi, Federica Di Nicolantonio, Carlo Zanon, Mauro Moroni, Silvio Veronese, Salvatore Siena, Alberto Bardelli. (2007). Cancer Res 67 (6): 2643-2648. 7. W. De Roock, J. De Schutter, G. De Hertogh, M. Jannsens, B. Biesmans, N. Personeni, K. Geboes, C. Verslyp, E. Van Cutsem, S. Tejpar. (2007). Journal of Clinical Oncology 25 (18S): 4132. 8. G. Finocchiaro, F. Cappuzzo, P.A. Janne, K. Bencardino, C. Carnaghi, W.A. Franklin, M. Roncalli, L. Crino, A. Santoro, M. Varella-Garcia. (2007). Journal of Clinical Oncology 25 (18S): 4021. 9. F. Di Fiore, F. Blanchard, F. Charbonnier, F. Le Pessot, A. Lamy, M.P. Galais, L. Bastit, A. Killian, R. Sesboue, J.J. Tuech, A.M. Queuniet, B. Paillot, J.C. Sabourin, F. Michot, P. Michel, T. Frebourg (2007). British Journal of Cancer 96: 1166-1169. 10. Shirin Khambata-Ford, Christopher R. Garrett, Neal J. Meropol, Mark Basik, Christopher T. Harbison, Shujian Wu, Tai W. Wong, Xin Huang, Chris H. Takimoto, Andrew K. Godwin, Benjamin R. Tan, Smitha S. Krishnamurthi, Howard A. Burris III, Elizabeth A. Poplin, Manuel Hidalgo, Jose Baselga, Edwin A. Clark, David J. Mauro. (2007). Journal of Clinical Oncology 25(22): 3230-3237. 11. Newton CR, Graham A, Heptinstall LE, Powell SJ, Summers C et al. (1989). Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS) Nucleic Acids Res. 17 (7): 2503-16. 12. Whitcombe, D., Theaker J., Guy, S.P., Brown, T., Little, S. (1999). Detection of PCR products using self-probing amplicons and fluorescence. Nature Biotech 17: 804-807.

Pagina 37 van 39



13. Thelwell, N., Millington, S., Solinas, A., Booth, J. and Brown, T. (2000). Mode of Action and Application of Scorpion Primers to Mutation Detection. Nucleic Acids Research 28(19): 3752-3761 14. De Roock W, Piessevaux H, De Schutter J, Janssens M, De Hertogh G, Personeni N, Biesmans B, Van Laethem JL, Peeters M, Humblet Y, Van Cutsem E, Tejpar S. KRAS wild-type state predicts survival and is associated to early radiological response in metastatic colorectal cancer treated with cetuximab. Ann Oncol. 2007, Nov. 12. 15. Lièvre A, Bachet JB, Le Corre D, Boige V, Landi B, Emile JF, Côté JF, Tomasic G, Penna C, Ducreux M, Rougier P, Penault-Llorca F, LaurentPuig P. KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer. Cancer Res. 2006;66:3992-5. 16. Lièvre A, Bachet JB, Boige V, Cayre A, Le Corre D, Buc E, Ychou M, Bouché O, Landi B, Louvet C, André T, Bibeau F, Diebold MD, Rougier P, Ducreux M, Tomasic G, Emile JF, Penault-Llorca F, Laurent-Puig P. KRAS mutations as an independent prognostic factor in patients with advanced colorectal cancer treated with cetuximab. J Clin Oncol. 2008;26:374-9. 17. C. Bokemeyer et al., K-RAS status and efficacy of first-line treatment of patients with metastatic colorectal cancer (mCRC) with FOLFOX with or without cetuximab: The OPUS experience. J Clin Oncol 26: 2008 (May 20 suppl; abstr 4000) 18. E. Van Cutsem et al., K-RAS status and efficacy in the first-line treatment of patients with metastatic colorectal cancer (mCRC) treated with FOLFIRI with or without cetuximab: The CRYSTAL experience. J Clin Oncol 26: 2008 (May 20 suppl; abstr 2) 19. S. Tejpar et al., Relationship of efficacy with K-RAS status (wild type versus mutant) in patients with irinotecan-refractory metastatic colorectal cancer (mCRC), treated with irinotecan (q2w) and escalating doses of cetuximab (q1w): The EVEREST experience (preliminary data). J Clin Oncol 26: 2008 (May 20 suppl; abstr 4001). 20. 10th World Congress on Gastrointestinal Cancer: Abstract o-037. Presented June 27, 2008. "KRAS mutation status is a predictive biomarker for cetuximab benefit in the treatment of advanced colorectal cancer. Results from NCIC CTG CO.17: A phase III trial of cetuximab versus best supportive care". Christos Karapetis et al. 21. Rafael G. Amado, Michael Wolf, Marc Peeters, Eric Van Cutsem, Salvatore Siena, Daniel J. Freeman, Todd Juan, Robert Sikorski, Sid Suggs, Robert Radinsky, Scott D. Patterson and David D, Chang. WildType KRAS Is Required for Panitumumab Efficacy in Patients with Metastatic Colorectal Cancer. J. Clin. Oncol. 2008; 26: 1626-1634.

Pagina 38 van 39



Opmerkingen voor de koper: Zonder schriftelijke toestemming van DxS Limited mag noch dit product, noch de TheraScreen® K-RAS Mutation Kit, noch enigerlei component worden doorverkocht, anderszins worden overgedragen of worden gemodificeerd voor doorverkoop. TheraScreen® en Scorpions® zijn gedeponeerde handelsmerken van DxS Limited. ARMS® is een gedeponeerd handelsmerk van AstraZeneca UK Limited. LIGHTCYCLER en ROCHE zijn handelsmerken van Roche. ABI7500 is een handelsmerk van Applied BioSystems. Dit product is een CE-gemarkeerd diagnostisch hulpmiddel overeenkomstig EU-richtlijn 98/79/EG betreffende medische hulpmiddelen voor in-vitrodiagnostiek. Aankoop van dit product is gekoppeld aan een beperkte, niet-overdraagbare licentie voor het gebruik van ARMS®- en Scorpions®-technologieën en is uitsluitend voor in-vitrodiagnostisch gebruik. ARMS® valt onder de octrooien US 5,595,890 en EP 332435; Scorpions® valt onder de octrooien US 6,326,145 en EP 1088102. De in dit document gegeven informatie kan worden gewijzigd. DxS Limited aanvaardt geen aansprakelijkheid voor eventuele fouten in dit document. In geen geval is DxS Limited op enigerlei wijze aansprakelijk (op basis van contract, onrechtmatige daad [met inbegrip van nalatigheid] of anderszins) voor schade in verband met, of voorvloeiend uit, het gebruik van dit product. Niets in dit document sluit aansprakelijkheid uit, of beperkt aansprakelijkheid, die DxS Limited niet wettelijk mag uitsluiten of beperken. © Copyright 2009. DxS Limited. Alle rechten voorbehouden. DxS Limited 48 Grafton Street Manchester M13 9XX VK www.dxsdiagnostics.com

Pagina 39 van 39

TheraScreen : K-RAS Mutation Kit Voor de detectie van 7 mutaties in het K-RAS-gen

Recommend Documents