cobas® KRAS Mutation Test CSAK IN VITRO DIAGNOSZTIKAI CÉLRA. ®
DNA SP
24 Tests
P/N: 05985536190
®
KRAS
24 Tests
P/N: 05852170190
cobas DNA Sample Preparation Kit cobas KRAS Mutation Test
MEGJEGYZÉS: A termék megvásárlása a vevő számára nukleinsav-szekvenciák amplifikálását és kimutatását teszi lehetővé polimeráz láncreakció (PCR) és rokon eljárások révén humán in vitro diagnosztikai célból. A termék megvásárlásával a vevő a konkrét használati jogon túl semmilyen általános szabadalmi jogot vagy egyéb engedélyt nem kap. FELHASZNÁLÁS MÓDJA ®
®
A cobas KRAS mutáció teszt, mely a cobas 4800 rendszerrel használandó, egy valós idejű (real-time) PCR teszt, mely a KRAS gén mutációit hivatott kimutatni annak 12-es, 13-as és 61-es kodonjain, formalinfixált, paraffinba ágyazott humán colorectalis carcinoma vagy nem-kissejtes tüdőcarcinoma-szövetből kinyert DNS-ből. A VIZSGÁLAT ÖSSZEGZÉSE ÉS MAGYARÁZATA KRAS fehérje: A KRAS fehérje a kis G-proteinek szupercsaládjának tagja. A KRAS GDP/GDP által szabályozott kapcsolóként működik, s olyan extracelluláris jeleket továbbít, melyek a sejtproliferációt, apoptosist, valamint az aktin-sejtváz remodellálódását befolyásolják. A 12-es, 13-as vagy 61-es aminosavakat érintő mutációk, melyek több humán daganattípusban, mint pl. a colorectalis carcinoma (CRC), vagy a nem-kissejtes tüdőrák (non-small cell lung cancer, NSCLC) is jelen vannak, a GTP-kötött, aktivált formájában 1 rögzítik az enzimet, mely konstitutív jelátvitelt eredményez, így járulva hozzá a daganatképződés folyamatához. CRC: 2-3
A tumorok 24-43%-ában észlelhető KRAS-mutáció. Bár a KRAS-génen több mint 3000 pontmutációt azonosítottak, a legtöbb a 12-es (~82%) és a 13-as (~17%) kodonokban jelenik meg, a más kodonokban (pl. 61-es) előforduló KRAS-mutációk ritkábbak (a mutációk 1-4%-a). Bár a 61-es kodon mutációi ritkák, kimutatták, hogy ugyanúgy konstitutív KRAS-aktivációt eredményeznek, 4 mint a 12-es és 13-as kodon mutációi, és a publikált adatok alapján a 61-es kodon mutációi előrejelzik az anti-EGFR 5-6 monoklonális antitestterápiára adandó válasz elmaradását. A cetuximab és a panitumumab az epidermalis növekedésifaktor-receptort (epidermal growth factor receptor, EGFR) célzó monoklonális antitestek, melyek használata áttétes colorectalis carcinoma esetén jóváhagyott. Bár a colorectalis tumorok 50-80%-a overexpresszálja az EGFR fehérjét, annak expressziója és génamplifikációja csak korlátozott prediktív értékkel bír 7 a cetuximabra vagy panitumumabra adott válaszkészségre vonatkozólag. Azonban ma már megalapozott bizonyítékok vannak arra nézve, hogy áttétes colorectalis carcinomás betegeknél a KRASmutáció jelenléte az EGFR-ellenes antitest-terápiára adott válasz hiányával korrelál, és hogy bizonyos esetekben az EGFR8-9 ellenes antitest-terápia ezen beteg-alcsoportban káros lehet. Az eredményeket alátámasztó bizonyítékok forrásai: 10-11
• Egyágú vizsgálatok retrospektív elemzése
• Randomizált vizsgálatok retrospektív elemzése
12-13
14
• Prospektív randomizált vizsgálatok.
Ezen vizsgálatok alapján a KRAS-mutáció vizsgálatát ajánlják az anti-EGFR antitest-terápiában részesítendő betegek 15-16 17 szelekciójára nagyobb onkológiai szakmai szervezetek az Egyesült Államokban (ASCO, NCCN) és Európában (ESMO). Továbbá az egyesült államokbeli és európai szabályozó hatóságok az ilyen hatóanyagok használatát KRAS vad típusát hordozó 18-19 tumoros betegekre korlátozták. NSCLC: NSCLC-ben számos visszatérő molekuláris eltérést azonosítottak. Az előrehaladott NSCLC-s esetek 10-30%-ában találtak 20 KRAS-pontmutációkat, elsődlegesen (de nem kizárólag) adenocarcinomákban. A szomatikus KRAS-mutációk a 12-es, 13-as és 61-es kodonokat érintik, melynek eredményeképpen az aktív KRAS/RAS fehérje felhalmozódik a sejtben, aminek hatására olyan jelátviteli utak aktiválódnak, melyek a malignizálódásban szerepet játszanak.
A Dokumentum verzióinformációi rész a dokumentum végén található. 06322379001-08HU 1
Doc Rev. 9.0
21
A publikált irodalmi adatok arra utalnak, hogy a KRAs-pozitív előrehaladott NSCLC-s betegek kilátásai rosszabbak, és az 22 23 adjuváns terápia vagy az EGFR TKI kezelés valószínűleg nem kecsegtet jó eredménnyel. Azt is kimutatták, hogy azok 24 a betegek, akik tumorai EGFR-mutációt hordoznak, nem hordoznak KRAS-mutációt, és fordítva. Ennélfogva az ilyen betegek egy olyan csoportot képeznek az NSCLC-sek között, amely tagjainak a nagy klinikai igénye nincs kielégítve, mivel a KRAS vad típusú tumorban szenvedő betegekhez képest behatároltabbak a kezelési lehetőségeik. ®
A cobas KRAS mutáció teszt ®
A cobas KRAS mutáció teszt egy PCR-alapú assay, mely arra lett kifejlesztve, hogy a KRAS protoonkogén 12-es, 13-as és 61-es kodonjait érintő szomatikus mutációkat azonosítsa, kiszűrve így azokat az előrehaladott CRC-s betegeket, akiknél nem valószínű, hogy az anti-EGFR monoclonalis antitestekkel való kezelés jó eredménnyel kecsegtet, vagy azokat az NSCLC-s betegeket, akiknél az adjuváns kemoterápia vagy az erlotinib valószínűleg nem kecsegtet jó eredménnyel. AZ ELJÁRÁS ALAPELVEI ®
A cobas KRAS mutáció teszt két fő lépésből épül fel: (1) manuális minta-előkészítés genomikus DNS izolálására formalin-fixált, paraffinba ágyazott szövetből (formalin-fixed, paraffin-embedded tissue, FFPET); és (2) target DNS PCR-amplifikálása komplementer primerpárok és fluoreszcens festékkel jelölt oligonukleotid próbák segítségével. Az egyik próba a KRAS 12/13-as kodonja szekvenciájának (2-es exon), a másik a KRAS 61-es kodonja szekvenciájának (3-as exon) felismerésére szolgál. A mutációk kimutatása olvadáspontgörbe-analízissel történik a cobas z 480 analizátor segítségével. A futtatás érvényességét az biztosítja, hogy minden futtatás tartalmaz egy mutáns kontrollt, egy negatív kontrollt, valamint egy kalibrátort. Minta előkészítése ®
Az FFPE-szövetminták feldolgozása és a genomi DNS izolálása a cobas DNS minta-előkészítő készlet segítségével történik egy üvegszálakhoz való nukleinsav kötődésen alapuló generikus manuális minta-előkészítés révén. Az FFPE-szövetminta egy deparaffinált 5 µm-es metszetét magas hőmérsékleten való inkubálás során lizálják egy proteáz és egy olyan chaotrop lízis/kötő puffer segítségével, amely szabaddá teszi a nukleinsavakat, és megvédi a szabaddá tett genomi DNS-t a DNázoktól. Ezt követően izopropanol lesz a líziskeverékhez adva, majd egy üvegszálas szűrőbetétes oszlopon az egész lecentrifugálásra kerül. A centrifugálás során a genomi DNS az üvegszálas szűrő felületéhez kötődik. A nem kötődött anyagok, mint sók, fehérjék és egyéb sejt eredetű szennyezések a centrifugálás révén eltávolításra kerülnek. Az adszorbeált nukleinsavak mosása, majd eluálása egy vizes oldattal történik. A genomikus DNS mennyiségét spektrofotometriásan határozzák meg, és egy fix koncentrációra állítják be, amelyet aztán az amplifikációs/kimutatási keverékhez kell adni. A target DNS amplifikálását és ® kimutatását azután a cobas z 480 analizátor végzi el a cobas KRAS mutáció teszt készletben biztosított amplifikálási és kimutatási reagensek segítségével. PCR-amplifikálás A targetszekvencia kiválasztása ®
A cobas KRAS mutáció teszt készlet olyan primereket használ, melyek egy 85 bázispár hosszúságú szekvenciát definiálnak a 2-es exonra, mely a 12-es és 13-as kodont tartalmazza, illetve egy 75 bázispár hosszúságú szekvenciát a 3-as exonra, mely a 61-es kodont tartalmazza a humán genomikus DNS-ben. Az amplifikálás a KRAS génnek csak a primerek közötti régiójában zajlik; a teljes KRAS gén nem amplifikálódik. Targetamplifikálás A Thermus species Z05-DNS polimeráz egy származékát alkalmazza a rendszer a targetamplifikáláshoz. Először a genomi DNS denaturálása és a primer targetszekvenciák felszabadítása végett a PCR reakcióelegyet fel kell melegíteni. Az elegy kihűlésével az upstream és downstream primerek a target DNS-szekvenciákhoz kapcsolódnak. A Z05 DNS-polimeráz kétértékű fémion és feleslegben levő dNTP-k jelenlétében a kapcsolódott primer folytatásaként egy második DNS-szálat szintetizál. Ezzel a PCR első ciklusa véget ért, létrehozva a KRAS gén target 85, ill. 75 bázispár hosszúságú régióit tartalmazó kettős szálú DNS-másolatot. Ez a folyamat számos cikluson keresztül ismétlődik, és az amplikon DNS mennyisége minden ciklus során megduplázódik. Az amplifikálás a KRAS génnek csak a primerpárok közötti régiójában zajlik; a teljes KRAS gén nem amplifikálódik. Automatizált valós idejű mutáció kimutatás A cobas z 480 analizátor képes valós időben mérni a specifikus PCR-termékek által generált fluoreszcenciát. Amplifikálást ® követően minden, a cobas KRAS mutáció teszt által generált amplikon egy olvasztóprogramnak lesz alávetve, mely során a hőmérséklet 40°C-ról 95°C-ra emelkedik (TaqMelt). A vad típusra specifikus próba alacsony hőmérsékleten a vad típusú és mutáns amplikonhoz egyaránt kötődik. Kötött állapotban a fluoreszcens jelölőfesték a próba 5' végén elég távol van a 3' végen lévő blokkolófestéktől ahhoz, hogy a fluoreszcens festék egy specifikus hullámhosszú fényt boicsáthasson ki. A hőmérséklet emelkedésével a próba disszociál az amplikonról, lehetővé téve, hogy a blokkolófesték közel kerüljön a fluoreszcens festékhez, csökkentve ezáltal a mérhető fluoreszcencia nagyságát. A próbához tökéletesen illeszkedő amplikonok (vad típus) magasabb olvadásponttal rendelkeznek, mint az egy vagy több mismatchet hordozók (mutánsok). Minden hőmérsékletemelkedésnél megmérésre kerül a fluoreszcencia mennyisége, és az olvadáspont(ok) kiszámolása megtörténik. Mutáns KRAS-szekvencia jelenléte detektálható a 2-es exon 12-es és 13-as kodonján, ill. a 3-as exon 61-es kodonján, ha az olvadáspontok meghatározott tartományban vannak. A 12-es és 13-as kodon csendes (silent) mutációinak érzékelését elkerülendő, egy módosított bázis univerzális bázisként funkcionál, és a vad típus tartományába eső olvadáspontot eredményez. 06322379001-08HU
2
Doc Rev. 9.0
Szelektív amplifikálás ®
A mintában található targetnukleinsav szelektív amplifikálását a cobas KRAS mutáció teszt az AmpErase (uracil-N-glikoziláz) 25 enzim és dezoxiuridin-trifoszfát (dUTP) használatával hajtja végre . Az AmpErase enzim felismeri és katalizálja a dezoxiuridin tartalmú DNS-szálak megsemmisítését, a timidint tartalmazó DNS-ét viszont nem. A dezoxiuridin a természetes DNS-ben nincs jelen, ugyanakkor az amplikonokban mindig megtalálható, miután a reaction mix reagens a nukleotid-trifoszfátok egyikeként timidin-trifoszfát helyett dUTP-t használ; tehát csak az amplikonok tartalmaznak dezoxiuridint. A dezoxiuridinnak köszönhetően a szennyező amplikont az AmpErase enzim még a target DNS amplifikálását megelőzően lebontja. A reakciómix reagensben lévő AmpErase enzim katalizálja a dezoxiuridint tartalmazó DNS hasítását a dezoxiuridin-csoportoknál úgy, hogy a dezoxiribózlánc felnyílását okozza a C1 helyen. Az első hevítési lépésben lúgos pH-n az amplikon DNS-lánc eltörik a dezoxiuridin helyén, tehát a DNS nem lesz amplifikálható. Az AmpErase enzim 55 °C felett, ® 3 azaz a hevítési lépések során inaktív, azaz nem bontja le a targetamplikont. A cobas KRAS mutáció teszt legalább 10 kópia dezoxiuridint tartalmazó KRAS-mutáns amplikont inaktivál PCR ciklusonként. REAGENSEK ®
DNA SP
cobas DNA Sample Preparation Kit ® cobas DNS minta-előkészítő készlet (P/N: 05985536190) DNA TLB (DNS szövet lízispuffer) trisz-HCl puffer kálium-klorid 0,04% EDTA 0,1% Triton X-100 0,09% nátrium-azid
24 teszt
1 x 10 ml
PK (proteináz K) proteináz K (liofilizált)
1 x 100 mg
DNA PBB (DNS paraffin kötő puffer) trisz-HCl puffer 49,6% guanidin-hidroklorid 0,05% karbamid 17,3% Triton X-100
1 x 10 ml
WB I (DNS mosópuffer I) trisz-HCl puffer 64% guanidin-hidroklorid
1 x 25 ml
WB II (DNS mosópuffer II) trisz-HCl puffer nátrium-klorid
1 x 12,5 ml
DNA EB (DNS eluáló puffer) trisz-HCl puffer 0,09% nátrium-azid
1 x 6 ml
FT (szűrőcsövek kupakkal)
1 x 25 db
CT (gyűjtőcsövek)
3 x 25 db
06322379001-08HU
3
Doc Rev. 9.0
®
cobas KRAS mutáció teszt (P/N: 05852170190)
KRAS
24 teszt
KRAS MIX (KRAS reakciómix) tricin puffer kálium-acetát kálium-hidroxid glicerin 4,76% dimetil-szulfoxid < 0,9% dNTP-k < 0,1% Z05 DNS-polimeráz (mikrobiális) < 0,1% AmpErase (uracil-N-glikoziláz) enzim (mikrobiális)
4 x 0,3 ml
MGAC (magnézium-acetát) magnézium-acetát 0,09% nátrium-azid
4 x 0,2 ml
KRAS OM1 (KRAS oligo mix 1) trisz-HCl puffer EDTA poli-rA RNS (szintetikus) ® 0,1% ProClin 300 konzerváló < 0,01% upstream és downstream KRAS primerek < 0,01% fluoreszcensen jelölt KRAS próbák
2 x 0,3 ml
KRAS OM2 (KRAS oligo mix 2) trisz-HCl puffer EDTA poli-rA RNS (szintetikus) ® 0,1% ProClin 300 konzerváló < 0,01% upstream és downstream KRAS primerek < 0,01% fluoreszcensen jelölt KRAS próbák
2 x 0,3 ml
KRAS MC (KRAS mutáns kontroll) trisz-HCl puffer EDTA poli-rA RNS (szintetikus) 0,05% nátrium-azid < 0,001% plazmid DNS, mely a KRAS exon 2-es és 3-as szekvenciáit tartalmazza (mikrobiális) < 0,001% KRAS vad típus DNS (sejtkultúra)
4 x 0,1 ml
KRAS CAL (KRAS kalibrátor) trisz-HCl puffer EDTA poli-rA RNS (szintetikus) 0,05% nátrium-azid < 0,001% KRAS vad típus DNS (sejtkultúra)
4 x 0,1 ml
DNA SD (DNS mintaoldószer) trisz-HCl puffer 0,09% nátrium-azid
06322379001-08HU
2 x 3,5 mL
4
Doc Rev. 9.0
FIGYELMEZTETÉSEK ÉS ÓVINTÉZKEDÉSEK A. CSAK IN VITRO DIAGNOSZTIKAI CÉLRA. B. A teszt formalin-fixált, paraffinba ágyazott colorectalis és nem-kissejtes tüdőcarcinoma szövetminták vizsgálatára szolgál. C. Ne pipettázzon szájjal. D. Ne egyen, igyon vagy dohányozzon a laboratórium területén. E. Kerülje a reagensek mikrobiális és DNS-kontaminációját. F. A fel nem használt reagensek és hulladék kezelésének összhangban kell lennie a megfelelő országos, szövetségi, állami és helyi szabályozásokkal. G. Lejárati idő után ne használjon fel készletet. H. Ne öntsön össze különböző készletekből vagy gyártási tételekből származó reagenseket. I.
Viseljen kesztyűt, és a minták és reagensek kezelése között váltson kesztyűt, hogy megakadályozza a kontaminációt.
J.
Hogy a master mix (MMX) munkareagens DNS mintával való kontaminálását elkerülje, az amplifikálást és kimutatást elkülönítve kell végezni a DNS-izolálástól. Az amplifikálási és kimutatási munkaterületet alaposan meg kell tisztítani az MMX munkareagens elkészítése előtt. A megfelelő tisztításhoz valamennyi felületet, az állványokat és pipettorokat is beleértve, gondosan le kell törölni 0,5%-os nátrium-hipoklorit* oldattal, majd 70%-os etanol oldattal.
K. A DNA PBB és WB I pufferek guanidin-hidrokloridot tartalmaznak. Ha ilyen puffert tartalmazó folyadék ömlik ki, megfelelő laboratóriumi tisztítószerrel és vízzel tisztítsa fel. Ha potenciálisan fertőző ágenst tartalmazó folyadék ömlik ki, először laboratóriumi tisztítószerrel és vízzel, majd 0,5%-os nátrium-hipoklorit* oldattal tisztítsa meg az érintett területet. Ha a kiömlés a cobas z 480 analizátorra történik, kövesse a cobas z 480 analizátor felhasználói kézikönyvének utasításait. *Megjegyzés: A kereskedelemben kapható háztartási fehérítő rendszerint 5,25%-ban tartalmaz nátrium-hipokloritot. Az 1:10 arányban hígított háztartási fehérítő megfelel 0,5%-os nátrium-hipoklorit oldatnak. L. A mintákat fertőzőként kell kezelni a Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 27 M29-A3 előírásoknak megfelelő biztonságos laboratóriumi eljárásokat alkalmazva.
26
és a CLSI Document
M. A DNA PBB pufferek Triton X-100-at tartalmaznak, amely nyálkahártya-irritáló hatású. Kerülje a szemmel, bőrrel és nyálkahártyával való érintkezést. N. A DNA TLB, DNA EB, MGAC, KRAS MC, KRAS CAL és DNA SD reagensek nátrium-azidot tartalmaznak. A nátrium-azid ólom- és rézcsövekkel erősen robbanékony fém-azidokat képezve reakcióba léphet. Amikor nátrium-azid tartalmú oldatot önt ki a laboratóriumi mosogatóba, az azidlerakódás megakadályozására nagy mennyiségű hideg vízzel öblítse ki a lefolyót. O. A xilol veszélyes vegyszer, és csak vegyifülke alatt szabad használni. Kiöntése vegyszergyűjtőbe történjen a megfelelő helyi, állami és szövetségi szabályozás szerint. P. Viseljen szemvédőt, védőruhát és egyszer használatos védőkesztyűt minden reagens kezelése közben. Ezen anyagok bőrrel, szemmel és nyálkahártyával való érintkezése kerülendő. Ha mégis előfordul érintkezés, azonnal öblítse le bő vízzel. Ellenkező esetben égető érzés jelentkezhet. A reagenseket kiömlés esetén szárazra törlés előtt hígítsa vízzel. Q. Az egyszer használatos anyagokat csak egyszer szabad felhasználni. Ne használja újra azokat. R. A lejárati idő után ne használjon fel egyszer használatos anyagokat. S. Ne használjon nátrium-hipoklorit oldatot (fehérítőszer) a cobas z 480 analizátor tisztításához. A cobas z 480 analizátort a cobas z 480 analizátor felhasználói kézikönyvében leírt eljárásoknak megfelelően kell tisztítani. T. A cobas z 480 analizátor fertőzési kockázatának csökkentésére vonatkozó további figyelmeztetések, óvintézkedések és eljárások tekintetében tanulmányozza a cobas z 480 analizátor felhasználói kézikönyvét. U. Steril, egyszer használatos pipetták és DNáz mentes pipettorhegyek használata javasolt.
06322379001-08HU
5
Doc Rev. 9.0
TÁROLÁSI ÉS KEZELÉSI KÖVETELMÉNYEK A. A DNA TLB, DNA PBB, WB I, WB II, DNA EB, PK, FT és CT reagenseket 15 °C és 30 °C között tárolja. Felbontást követően a DNA TLB, DNA PBB, WB I, WB II, DNA EB és PK reagensek 8 felhasználásig 90 napon át, illetve a lejárati dátumig stabilak, amelyik előbb következik. B. Miután a PK enzimet steril, nukleázmentes vízben feloldotta, a fel nem használt PK oldatot tárolja 450 µl-es részletekben -20 °C-on. Feloldás után a PK enzimet fel kell használni 90 napon belül, illetve a lejárati dátumig, amelyik előbb következik. C. Abszolút etanol hozzáadását követően a WB I és WB II puffereket tárolja 15 °C és 30 °C között. Ezek a munkaoldatok 90 napig vagy a lejárati dátumig stabilak, amelyik előbb következik. D. A KRAS MIX, MGAC, KRAS OM1, KRAS OM2, KRAS MC, KRAS CAL és DNA SD reagenseket –25 °C és –15 °C között tárolja. Felnyitás után ezen reagensek 60 napon belül 4 használatig, vagy a lejárati dátumig stabilak, amelyik előbb következik. E. Felhasználás előtt az összes reagenst hagyja 15-30 °C-on olvadni legalább 1 órán keresztül. Kiolvadást követően a reagenseket 1 órán belül használja fel, a fel nem használt reagenseket tegye vissza -15 és -25 °C közötti tárolási hőmérsékletre 1 órán belül. Felbontást követően, minden reagensampulla, kivéve a DNA SD, legfeljebb 4 részletben történő pipettázásra felhasználható 60 napon belül, vagy a lejárat dátuma előtt (amelyik előbb következik). F. A KRAS OM1, KRAS OM2 és az MMX-munkaoldat (utóbbi a KRAS OM1 vagy KRAS OM2 és MGAC oldatok KRAS MIX reagenshez való hozzáadásával készül) fénytől védve tartandók. G. Az MMX munkareagenst sötétben, 2 °C és 8 °C között kell tárolni. Az előkészített mintákat és kontrollokat az MMX munkareagenshez annak elkészítésétől számított 1 órán belül hozzá kell adni. H. A feldolgozott (extrahált DNS) minták max. 24 óráig stabilak 15 és 30 °C között, max. 14 napig 2 és 8 °C között, és max. 60 napig -15 és -25 °C között, illetve miután -15 és -25 °C között tárolva átestek 3 fagyasztás-kiolvasztáson. Az extrahált DNS ® amplifikálását az ajánlott tárolási időszak alatt, illetve a DNS extrahálásához használt cobas DNS minta-előkészítő készlet lejárati ideje előtt kell elvégezni attól függően, hogy melyik a korábbi időpont. I.
Az amplifikálást a feldolgozott mintáknak és kontrolloknak az (a KRAS OM1 vagy KRAS OM2 és az MGAC oldatok KRAS MIX reagenshez való hozzáadásával készült) MMX munkareagenshez való hozzáadását követően 1 órán belül meg kell kezdeni.
A KÉSZLET TARTALMA ®
A. cobas DNA Sample Preparation Kit ® cobas DNS minta-előkészítő készlet (P/N: 05985536190)
DNA SP
24 teszt
DNA TLB (DNS szövet lízispuffer) PK (proteináz K) DNA PBB (DNS paraffin kötő puffer) WB I (DNS mosópuffer I) WB II (DNS mosópuffer II) DNA EB (DNS eluáló puffer) FT (szűrőcsövek kupakkal) CT (gyűjtőcsövek)
06322379001-08HU
6
Doc Rev. 9.0
®
B. cobas KRAS mutáció teszt (P/N: 05852170190)
KRAS
24 teszt
KRAS MIX (reakció mix) (áttetsző gombos kupak) MGAC (magnézium-acetát) (sárga gombos kupak) KRAS OM1 (KRAS oligo mix 1) (fehér gombos kupak) KRAS OM2 (KRAS oligo mix 2) (arany gombos kupak) KRAS MC (KRAS mutáns kontroll) (piros gombos kupak) KRAS CAL (KRAS kalibrátor) (lila gombos kupak) DNA SD (DNS mintaoldószer) SZÜKSÉGES, DE NEM BIZTOSÍTOTT ANYAGOK ·
xilol (Sigma, kat.# 247642 vagy Fisher Scientific, kat.# X5-4)
·
abszolút etanol (Sigma, kat.# E7023 vagy Fisher Scientific, kat.# BP2818-500)
·
izopropanol (Sigma, kat.# 190764 vagy Fisher Scientific, kat.# A451-1)
·
steril víz, nukleázmentes (Applied Biosystems PCR Grade Water, kat.# AM9937 vagy Thermo Scientific Molecular Biology Grade Water, kat.# SH-3053801)
·
steril, egyszer használatos szerológiai pipetták: 5 és 25 ml
·
cobas 4800 rendszer mikrolemez (AD-lemez) és zárófólia (Roche P/N 05232724001)
·
cobas 4800 zárófólia-felhelyező (Roche P/N 04900383001)
·
állítható pipetták* (10 µl, 20 µl, 200 µl és 1000 µl kapacitású), aeroszolbarrieres vagy pozitív kiszorításos DNáz mentes hegyekkel
·
pipetta segédeszköz (Drummond P/N: 4-000-100 vagy ekvivalens)
·
asztali mikrocentrifuga, 8 000 x g és 16 000-20 000 x g kapacitású (Eppendorf 5417C vagy ekvivalens)**
·
két (2) száraz fűtőblokk, amely képes a mikrocentrifuga csöveket 56 °C és 90 °C hőmérsékletre fűteni**
·
1,5 ml Safe-Lock mikrocentrifuga csövek, steril, RNáz/DNáz-mentes, PCR minőségű (Eppendorf, kat# 022363212)
·
nanodrop UV-Vis spektrofotométer (Thermo Scientific ND-1000 vagy ND-2000)**
·
vortex keverő**
·
mikrocentrifuga csőállványok
·
egyszer használatos kesztyűk, púdermentes
·
kalibrált hőmérők a száraz fűtőblokkokhoz**
·
vízfürdő**, 37 °C fenntartására képes
·
egyélű penge vagy hasonló
·
-15 és -25 °C közötti tárolásra alkalmas fagyasztó
®
®
*
A pipettákat a gyártó utasításai szerint kell karbantartani, és pontosságuk a megadott térfogathoz képest 3%-on belül legyen. Aeroszolbarrieres vagy pozitív kiszorításos DNáz-mentes pipettahegyeket kell használni ott, ahol alapvető megelőzni a minta degradálódását és a keresztkontaminációt. ** Valamennyi felszerelést megfelelően karban kell tartani a gyártó utasításai szerint.
06322379001-08HU
7
Doc Rev. 9.0
Műszerezettség és szoftver ·
cobas z 480 analizátor
·
cobas 4800 SR2 rendszervezérlő-egység Windows XP-vel
·
cobas 4800 SR2 rendszerszoftver 2.0-s vagy újabb verzió
·
KRAS analízis csomag szoftver 1.0-s vagy újabb verzió
·
vonalkódolvasó ext USB
·
nyomtató
®
®
A MINTA LEVÉTELE, SZÁLLÍTÁSA ÉS TÁROLÁSA MEGJEGYZÉS: Valamennyi mintát fertőző ágensek átvitelére alkalmasként kell kezelni. A. Mintavétel ®
A colorectalis carcinoma és nem-kissejtes tüdőrák FFPE-szövetmintákat validálták a cobas használathoz.
KRAS mutáció teszttel való
B. Mintaszállítás FAz FFPE-szövetminták 15 °C és 30 °C között szállíthatóak. Az FFPE-szövetminták szállításának meg kell felelnie a kóroki 28 ágensek transzportjára vonatkozó országos, szövetségi, állami és helyi szabályozásnak. C. Mintatárolás Az FFPE-szövetminták 15 °C és 30 °C között 12 hónapig tárolhatóak a szövettani mintavétel időpontja után. Tárgylemezre ragasztott 5 mikronos metszetek, 15 °C és 30 °C között 60 napig tárolhatók. HASZNÁLATI UTASÍTÁS ®
MEGJEGYZÉS: Csak legalább 10% daganatot tartalmazó 5 µm vastagságú FFPE metszetek használhatóak a cobas KRAS mutáció teszt során. A 10%-nál kevesebb daganatot tartalmazó mintákból deparaffinálás előtt makrometszetet kell készíteni. MEGJEGYZÉS: A cobas z 480 analizátorra vonatkozó részletes használati útmutatásért tanulmányozza a cobas z 480 analizátor felhasználói kézikönyvét.
MEGJEGYZÉS: A mikrocentrifuga csövek melegítésére képes száraz fűtőblokkokat be kell kapcsolni, és 56 °C-ra, illetve 90 °C-ra állítani. Futtatási mennyiség Egyetlen futtatás 1-45 mintát (plusz kontrollok és kalibrátor) tartalmazhat 96 lyukú mikrolemezenként. Ha 24 mintánál többet ® futtat, akkor több cobas KRAS mutáció teszt készletre lesz szüksége ugyanazon tételből. ®
A cobas KRAS mutáció teszt elegendő reagenst tartalmaz 3 minta (plusz kontrollok és kalibrátor) 8 futtatásához, készletenként maximum 24 mintához. Munkafolyamat ®
®
A cobas KRAS mutáció teszt folyamata két lépésből áll: manuális mintaelőkészítés a cobas DNS minta-előkészítő készlet ® segítségével, amelyet a cobas z 480 analizátorral végzett amplifikálás/kimutatás követ a cobas KRAS mutáció teszt készlet segítségével.
06322379001-08HU
8
Doc Rev. 9.0
Reagens-előkészítés 1. Oldja fel a proteináz K-t (PK) úgy, hogy 4,5 ml steril, nukleázmentes (PCR minőségű) vizet mér a csőbe egy steril, egyszer használatos 5 ml-es szerológiai pipettával. A cső 5-10-szeri döntögetésével keverje össze az oldatot. Mérjen ki 450 µl-es részleteket a PK oldatból 1,5 ml-es pattintókupakos mikrocentrifuga csövekbe, és tárolja a csöveket -20 °C-on. Ha a proteináz K-t már korábban feloldotta és lefagyasztotta, akkor olvasszon fel elegendő mennyiségű csövet a futtatni kívánt minták feldolgozásához még a deparaffinálás előtt (70 µl PK oldat szükséges minden egyes mintához). 2. Valamennyi tárolt oldatnak 15-30 °C-on tisztának kell lennie. Ha bármely reagensben csapadék van jelen, melegítse az oldatot 37 °C-os vízfürdőben, amíg a csapadék feloldódik. Ne használja, amíg minden csapadék fel nem oldódott. 3. Készítsen DNS mosópuffer I (WB I) munkaoldatot úgy, hogy 15 ml abszolút etanolt mér a WB I flakonba. A flakon 5-10-szeri döntögetésével keverje össze az oldatot. Jegyezze fel a flakon oldalára, hogy etanolt tartalmaz és a dátumot. Tárolja a WB I munkaoldatot 15 °C és 30 °C között. 4. Készítsen DNS mosópuffer II (WB II) munkaoldatot úgy, hogy 50 ml abszolút etanolt mér a WB II flakonba. A flakon 5-10szeri döntögetésével keverje össze az oldatot. Jegyezze fel a flakon oldalára, hogy etanolt tartalmaz és a dátumot. Tárolja a WB II munkaoldatot 15 °C és 30 °C között. Tárgylemezre ragasztott FFPE-szövetmetszetek deparaffinálása MEGJEGYZÉS: A xilol veszélyes vegyszer. A deparaffinálás valamennyi lépését vegyszerfülke alatt kell végezni. Lásd: Figyelmeztetések és óvintézkedések. A. Helyezze a tárgylemezt 5 µm-es FFPE-szövetmetszettel egy edénybe, amelyben elegendő mennyiségű xilol van, hogy a szövetet ellepje; áztassa 5 percig. B. Tegye át a tárgylemezt egy edénybe, amelyben elegendő mennyiségű abszolút etanol van, hogy a szövetet ellepje; áztassa 5 percig. C. Vegye ki a tárgylemezt az etanolból, és hagyja levegőn, hogy a metszet teljesen megszáradjon (5-10 perc). D. Végezzen makrodisszekciót, ha a minta 10%-nál kevesebb tumort tartalmaz. E. Minden mintához címkézzen meg egy-egy 1,5 ml-es pattintókupakos csövet a minta azonosításához szükséges információval. F. Mérjen 180 µl DNA TLB puffert a 1,5 ml-es pattintókupakos mikrocentrifuga csőbe. G. Mérjen 70 µl PK oldatot a DNA TLB puffert tartalmazó pattintókupakos csőbe. H. Kaparja le a szövetet a tárgylemezről, és tegye a pattintókupakos csőbe. Merítse a szövetet a DNA TLB/PK elegybe. I.
Folytassa a DNS-izolálás műveletének A lépésével.
Tárgylemezre nem ragasztott FFPE-szövetmetszetek deparaffinálása MEGJEGYZÉS:
A xilol veszélyes vegyszer. A deparaffinálás valamennyi lépését vegyszerfülke alatt kell végezni. Lásd: Figyelmeztetések és óvintézkedések.
MEGJEGYZÉS: Ha a minta területenként 10%-nál kevesebb tumort tartalmaz, a metszetet fel kell ragasztani tárgylemezre makrometszet készítéshez, és a “Tárgylemezre ragasztott FFPE-szövetmetszetek deparaffinálása” szakaszban részletezett eljárást kell követni. A. Helyezzen egy 5 mikronos FFPE-szövetmetszetet egy 1,5 ml-es pattintókupakos csőbe, amely el van látva a minta azonosításához szükséges információval. B. Mérjen 500 µl xilolt az FFPE-szövetmetszetet tartalmazó pattintókupakos csőbe. C. Vortexelje jól össze 10 másodpercig. D. Hagyja a csövet állni 5 percig 15 °C és 30 °C között. E. Adjon hozzá 500 µl abszolút etanolt, és vortexelje jól össze 10 másodpercig. F. Hagyja a csövet állni 5 percig 15 °C és 30 °C között. 06322379001-08HU
9
Doc Rev. 9.0
G. Centrifugázza a csövet 16 000-20 000 x g-n 2 percig. Távolítsa el a felülúszót anélkül, hogy az üledéket felzavarná. Dobja ki a felülúszót vegyszergyűjtőbe. H. Adjon hozzá 1 ml abszolút etanolt, és vortexelje 10 másodpercig. I.
Centrifugázza a csövet 16 000-20 000 x g-n 2 percig. Távolítsa el a felülúszót anélkül, hogy az üledéket felzavarná. Dobja ki a felülúszót vegyszergyűjtőbe.
MEGJEGYZÉS: Ha az üledék lebeg a maradék felülúszóban, akkor ismét centrifugázza 1 percig 16 000-20 000 x g-n. Távolítsa el a maradék felülúszót. J.
Szárítsa a szövetüledéket 10 percig 56°C-os fűtőblokkban úgy, hogy a cső nyitva van.
MEGJEGYZÉS: Ellenőrizze, hogy az etanol teljesen elpárolgott és az üledék száraz, mielőtt folytatná a következő lépéssel. MEGJEGYZÉS: Szükség esetén a száraz üledék 2 °C és 8 °C között 24 óráig tárolható. K. Oldja fel újra a szövetüledéket 180 µl DNS szövet lízispufferben (DNA TLB). L. Adjon hozzá 70 µl PK oldatot. M. Folytassa a DNS-izolálás műveletének A lépésével. MINTA-ELŐKÉSZÍTÉS DNS-izolálás művelete MEGJEGYZÉS: A mintá(ka)t negatív kontrollal együtt dolgozza fel. A negatív kontrollt úgy készítse el, hogy 180 µl DNS szövet lízispuffert (DNA TLB) és 70 µl PK oldatot összekever egy 1,5 ml-es pattintókupakos mikrocentrifuga csőbe, és ráírja, hogy NEG CT. A negatív kontrollt ugyanazt az eljárást követve kell feldolgozni, mint a mintákat. A. Vortexelje a minta/DNA TLB/PK keveréket és a negatív kontroll keveréket (NEG CT) tartalmazó csöveket 30 másodpercig. MEGJEGYZÉS: A szövetet a DNA TLB/PK elegy teljesen el kell, hogy lepje. B. Helyezze a csöveket 56 °C-os száraz fűtőblokkba, és inkubálja 60 percig. C. Vortexelje a csöveket 10 másodpercig. MEGJEGYZÉS: A szövetet a DNA TLB/PK elegy teljesen el kell, hogy lepje. D. Helyezze a csöveket 90 °C-os száraz fűtőblokkba, és inkubálja 60 percig. MEGJEGYZÉS: Az inkubálás ideje alatt készítse elő a kívánt számú pattintókupakos szűrőcsövet (FT) úgy, hogy az FT csövet egy gyűjtőcsőre (CT) helyezi, és mindegyik FT kupakját ellátja a megfelelő minta- vagy kontrollazonosítóval. MEGJEGYZÉS:
Minden egyes mintához 1 FT, 3 CT és 1 eluáló cső (1,5 ml-es mikrocentrifuga cső) szükséges.
MEGJEGYZÉS: Az inkubálás ideje alatt lássa el a kívánt számú eluáló csövet (1,5 ml-es mikrocentrifuga cső) a megfelelő minta- vagy kontrollazonosító információval. E. Hagyja a csöveket lehűlni 15 °C és 30 °C közé. Lehűlés után pulzuscentrifugával centrifugálja a csöveket, hogy a kupakokról a folyadék lejöjjön. F. Mérjen 200 µl DNA PBB puffert mindegyik csőbe; 3-szori fel-le pipettázással keverje össze. G. Inkubálja a csöveket 15 °C és 30 °C között 10 percig. H. Mérjen 100 µl izopropanolt mindegyik csőbe; 3-szori fel-le pipettázással keverje össze a lizátumot. I.
Vigyen át minden egyes lizátumot a megfelelően jelölt FT/CT egységbe.
J.
Centrifugázza az FT/CT egységeket 8 000 x g-n 1 percig.
06322379001-08HU
10
Doc Rev. 9.0
K. Tegyen minden FT csövet egy új CT csőre. Öntse ki a szűrletet a használt CT csőből vegyszergyűjtőbe, és megfelelően eljárva dobja ki a használt CT csövet. L. Mérjen 500-500 µl WB I munkaoldatot mindegyik FT csőbe. MEGJEGYZÉS: A WB I munkaoldat készítése a “Reagens-előkészítés” szakaszban van ismertetve. M. Centrifugázza az FT/CT egységeket 8 000 x g-n 1 percig. N. Öntse ki a szűrletet minden CT csőből vegyszergyűjtőbe. Tegye az FT csövet vissza ugyanarra a CT csőre. O. Mérjen 500-500 µl WB II munkaoldatot mindegyik FT csőbe. MEGJEGYZÉS: A WB II munkaoldat készítése a “Reagens-előkészítés” szakaszban van ismertetve. P. Centrifugázza az FT/CT egységeket 8 000 x g-n 1 percig. Q. Tegyen minden FT csövet egy új CT csőre. Öntse ki a szűrletet a használt CT csőből vegyszergyűjtőbe, és megfelelően eljárva dobja ki a használt CT csövet. R. Centrifugázza az FT/CT egységeket 16 000-20 000 x g-n 1 percig, hogy a szűrőmembránok megszáradjanak. S. Helyezzen minden FT csövet egy-egy minta- vagy kontrollazonosítóval ellátott eluáló csőbe (1,5 ml-es mikrocentrifuga cső). Öntse ki a szűrletet a használt CT csőből vegyszergyűjtőbe, és megfelelően eljárva dobja ki a használt CT csövet. T. Mérjen 100-100 µl DNA EB puffert minden egyes FT közepére anélkül, hogy hozzáérne az FT membránhoz. U. Inkubálja az FT csövet az eluáló csővel 15 °C és 30 °C között 5 percig. V. Centrifugázza az FT csövet az eluáló csővel 8 000 x g-n 1 percig, hogy az eluátum összegyűljön az eluáló csőben. Megfelelően eljárva dobja ki a használt FT csövet. W. Zárja le az eluáló cső kupakját. Az eluáló csőben van a DNS törzs. Folytassa a DNS mennyiségi meghatározása szakaszban az A lépéssel. MEGJEGYZÉS: A DNS-koncentráció mérését azonnal el kell végezni a DNS-izolálás művelete után még tárolás előtt. DNS mennyiségi meghatározása: A. Vortexelje mindegyik DNS törzset 5 másodpercig. B. Határozza meg a DNS mennyiségét Nanodrop UV-Vis Spektrofotométer (ND-1000 vagy ND-2000) segítségével a gyártó utasításai szerint. Referencia mintaként a készülékhez használjon DNA EB puffert. Két konzisztens leolvasás átlaga szükséges. A két mérésnek ± 10% eltérésen belül kell lennie egymáshoz képest, ha a DNS-koncentráció leolvasás ≥ 20,0 ng/µl. Ha a DNS-koncentráció leolvasás < 20,0 ng/µl, akkor a két mérésnek ± 2 ng/µl eltérésen belül kell lennie. Ha a két mérés nincs ± 10% eltérésen belül egymáshoz képest, ha a DNS-koncentráció leolvasás ≥ 20,0 ng/µl, vagy ± 2 ng/µl eltérésen belül, ha a DNS-koncentráció leolvasás < 20,0 ng/µl, akkor 2 további leolvasást kell végezni, amíg a feltételek nem teljesülnek. Ezután a két új mérés átlagát kell kiszámolni. MEGJEGYZÉS: A feldolgozott negatív kontrollból (NEG CT) származó DNS törzset nem szükséges mérni. ®
C. A mintákból származó DNS törzs koncentrációjának ≥ 4 ng/µl-nek kell lennie ahhoz, hogy a cobas KRAS mutáció teszt elvégezhető legyen. Mintánként két amplifikálás/kimutatás történik, minden amplifikálás/kimutatás esetén 25 µl-rel a DNS törzs 2 ng/µl-es hígításából (összesen 50 ng DNS). ®
MEGJEGYZÉS: A DNS törzs koncentrációjának legalább 4 ng/µl-nek kell lennie ahhoz, hogy a cobas KRAS mutáció teszt elvégezhető legyen. Ha a DNS törzs koncentrációja < 4 ng/µl, ismételje meg a deparaffinálás, DNS-izolálás és DNS mennyiségi meghatározás lépéseket az adott mintára úgy, hogy két 5 µm-es FFPE-szövetmetszetet használ. Tárgylemezre ragasztott metszetek esetén a deparaffinálást követően tegye egyetlen csőbe a két metszetből származó szövetet, merítse a szövetet a DNA TLB + PK elegybe, és végezze el a DNS-izolálást és mennyiségi meghatározást a fentiek szerint. Tárgylemezre nem ragasztott metszetek esetén tegye egyetlen csőbe a két metszetet, merítse a szövetet a DNA TLB + PK elegybe, és végezze el a DNS-izolálást és mennyiségi meghatározást a fentiek szerint. Ha a DNS törzs még mindig < 4 ng/µl, kérjen egy másik FFPE-szövetmintát.
06322379001-08HU
11
Doc Rev. 9.0
MEGJEGYZÉS: A feldolgozott (extrahált DNS) minták max. 24 óráig stabilak 15 és 30 °C között, max. 14 napig 2 és 8 °C között, és max. 60 napig -15 és -25 °C között, illetve miután -15 és -25 °C között tárolva átestek 3 fagyasztás-kiolvasztáson. Az extrahált DNS amplifikálását az ajánlott tárolási időszak alatt, illetve ® a DNS extrahálásához használt cobas DNS minta-előkészítő készlet lejárati ideje előtt kell elvégezni attól függően, hogy melyik a korábbi időpont. AMPLIFIKÁLÁS ÉS KIMUTATÁS MEGJEGYZÉS: Hogy az MMX munkareagens DNS mintával való kontaminálását elkerülje, az amplifikálást és kimutatást elkülönítve kell végezni a DNS-izolálástól. Az amplifikálási és kimutatási munkaterületet alaposan meg kell tisztítani az MMX munkareagens elkészítése előtt. A megfelelő tisztításhoz valamennyi felületet, az állványokat és pipettorokat is beleértve, gondosan le kell törölni 0,5%-os nátrium-hipoklorit oldattal, majd 70%-os etanol oldattal. A kereskedelemben kapható háztartási fehérítő rendszerint 5,25%-ban tartalmaz nátrium-hipokloritot. Az 1:10 arányban hígított háztartási fehérítő megfelel 0,5%-os nátrium-hipoklorit oldatnak. Készülék összeállítása: A cobas z 480 összeállítására vonatkozó részletes útmutatásért tanulmányozza a cobas z 480 analizátor felhasználói kézikönyvét. Teszt sorrend összeállítása: ®
A KRAS munkafolyamat lépéseire vonatkozó részletes útmutatásért tanulmányozza az alábbi dokumentumot: cobas 4800 ® ® rendszer felhasználói készikönyv a cobas KRAS mutáció teszthez (cobas KRAS felhasználói kézikönyv). Minta DNS törzs hígítás kiszámítása: Hígítás kiszámítása 4 ng/µl - 28 ng/µl DNS törzs koncentrációk esetén MEGJEGYZÉS: Mintákból származó DNS törzseket amplifikálás és kimutatás előtt azonnal fel kell hígítani. MEGJEGYZÉS: Mintánként kettő (2) amplifikálás/kimutatás történik, ehhez összesen 50 µl (az MMX 1-hez és az MMX 2-höz egyaránt 25 µl) szükséges a DNS-törzs 2 ng/µl-es hígításából (összesen 100 ng DNS). A. Minden mintához számolja ki a DNS törzs szükséges térfogatát (µl): DNS törzs µl = (70 µl x 2 ng/µl) ÷ DNS törzs koncentráció [ng/µl] B. Minden mintához számolja ki a DNS mintaoldószer (DNA SD) szükséges térfogatát (µl): DNA SD µl = 70 µl – DNS törzs µl Példa: DNS törzs koncentráció = 6,5 ng/µl A. DNS törzs µl = (70 µl x 2 ng/µl) ÷ 6,5 ng/µl = 21,5 µl B. DNA SD µl = (70 µl – 21,5 µl) = 48,5 µl Hígítás kiszámítása akkor, ha a DNS törzs koncentrációk értékei > 28 ng/µl MEGJEGYZÉS: Mintákból származó DNS törzseket amplifikálás és kimutatás előtt azonnal fel kell hígítani. MEGJEGYZÉS: Mintánként kettő (2) amplifikálás/kimutatás történik, ehhez összesen 50 µl (az MMX 1-hez és az MMX 2-höz egyaránt 25 µl) szükséges a DNS-törzs 2 ng/µl-es hígításából (összesen 100 ng DNS). A. Ha a DNS törzs koncentráció > 28 ng/µl, használja az alábbi képletet a DNS mintaoldószer (DNA SD) mennyiségének kiszámításához, amely legalább 70 µl hígított DNS törzs készítéséhez szükséges. Ennek lényege, hogy minden mintába legalább 5 µl DNS törzs kerüljön. B. Minden minta esetén számítsa ki a DNA SD térfogatát (µl), amely 5 µl DNS törzs 2 ng/µl koncentrációra való hígításához szükséges: Szükséges DNA SD térfogat (µl) = [(5 µl DNS törzs x DNS törzs koncentráció (ng/µl) / 2 ng/µl)]– 5 µl
06322379001-08HU
12
Doc Rev. 9.0
Példa: DNS törzs koncentráció = 31,7 ng/µl A.
Szükséges DNA SD térfogat (µl) = [(5 µl x 31,7 ng/µl) / 2 ng/µl] – 5 µl = 74,3 µl
B.
5 µl DNS törzs hígításához használja a kiszámított DNA SD térfogatot.
Minta hígítás FIGYELEM:
Vegye ki a mintaoldószert (DNA SD) a -15 és -25 °C közötti hőmérsékletű tárolóból, és olvassza 15 és 30 °C között a DNS hígítását megelőzően legalább 1 óráig. Használat előtt vortexelje mindegyik reagenst 5 másodpercig és gyűjtse a cső aljára a folyadékot.
A. Készítse elő a kívánt számú 1,5 ml-es pattintókupakos mikrocentrifuga csövet a DNS hígításhoz, és lássa el őket a megfelelő mintaazonosítóval. B. Aeroszol-rezisztens heggyel ellátott pipetta segítségével pipettáza a DNA SD oldószer kiszámított térfogatait a megfelelően jelölt csövekbe. Pipettázzon 35 µl DNA SD oldószert a NEG CT jelölésű pattintókupakos csőbe. C. Vortexeljen minden egyes DNS törzset és a negatív kontrollt 5-10 másodpercig. D. Aeroszol-rezisztens pipettaheggyel ellátott pipetta segítségével (minden pipettázáshoz új hegy) óvatosan pipettázza minden egyes DNS törzs esetén a kiszámított térfogatot a DNA SD oldószert tartalmazó megfelelő csőbe. Pipettázzon 35 µl negatív kontrollt (extrahált eluátum) a NEG CT csőbe. E. Csavarja a csövekre a kupakokat, és vortexelje mindegyiket 5-10 másodpercig. F. Cseréljen kesztyűt. Master mix (MMX 1 és MMX 2) munkareagensek elkészítése MEGJEGYZÉS: A KRAS OM1, KRAS OM2 reagensek, valamint az MMX munkareagens fényérzékenyek, és fénytől védve tartandók. MEGJEGYZÉS: Mivel a KRAS MIX és az MMX munkareagens viszkózus folyadékok, lassan pipettázzon, hogy biztosan a teljes mennyiség kijöjjön a hegyből. MEGJEGYZÉS: A KRAS MIX, KRAS MMX 1 és KRAS MMX 2 színtelen, illetve sárga lehet. Ez nem befolyásolja a reagens minőségét. Készítsen két külön MMX munkareagenst: egyet KRAS MMX 1 reagensből, egyet pedig KRAS MMX 2 reagensből külön 1,5 ml-es pattintókupakos mikrocentrifuga-csövekbe. A. Számítsa ki az egyes MMX munkareagensekhez szükséges KRAS MIX térfogatot az alábbi képlet segítségével: Szükséges KRAS MIX térfogat = (minták száma + 2 kontroll + 1 kalibrátor + 1) x 10 µl B. Számítsa ki az egyes MMX munkareagensekhez szükséges KRAS OM1 vagy KRAS OM2 térfogatot az alábbi képlet segítségével: Szükséges KRAS OM1 vagy KRAS OM2 térfogat = (minták száma + 2 kontroll + 1 kalibrátor + 1) x 10 µl C. Számítsa ki az egyes MMX munkareagensekhez szükséges MGAC térfogatot az alábbi képlet segítségével: Szükséges MGAC térfogat = (minták száma + 2 kontroll + 1 kalibrátor + 1) x 6 µl Az 1. táblázat segítségével határozza meg az egyes reagenseknek az MMX munkareagens készítéséhez szükséges térfogatát a futtatásban részt vevő minták száma alapján.
06322379001-08HU
13
Doc Rev. 9.0
1. táblázat A szükséges reagenstérfogat az MMX 1 és az MMX 2 munkaoldatokhoz A szükséges reagenstérfogat az MMX munkaoldatokhoz Minták száma* 1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
KRAS MIX
10 µl
50
60
70
80
90
100
110
120
130
140
KRAS OM1 vagy OM2
10 µl
50
60
70
80
90
100
110
120
130
140
MGAC
6 µl
30
36
42
48
54
60
66
72
78
84
130
156
182
208
234
260
286
312
338
364
Össztérfogat (µl)
* Elegendő mennyiséget tartalmaz mintánként 1 csőhöz, 2 kontrollcsőhöz, 1 kalibrátorcsőhöz és 1 plusz csőhöz D. Vegye ki a hűtőből a –15 °C és –25 °C között tárolt megfelelő számú KRAS MIX, KRAS OM1, KRAS OM2 és MGAC csövet. Felhasználás előtt az összes reagenst hagyja 15-30 °C-on olvadni legalább 1 órán keresztül. Használat előtt vortexelje mindegyik reagenst 5 másodpercig és gyűjtse a cső aljára a folyadékot. Lásson el jelöléssel egy steril mikrocentrifuga-csövet az MMX 1 és MMX 2 munkareagensek számára. FIGYELEM: A reagensek kiolvadását követően az MMX-munkaoldatokat 1 órán belül el kell készíteni. Kiolvadást követően a megmaradt, fel nem használt reagenseket felhasználást követően tegye vissza -15 és -25 °C közötti tárolási hőmérsékletre 1 órán belül. E. Mérje a KRAS MIX kiszámított térfogatát az MMX munkareagens csövekbe. F. Mérje a KRAS OM1 vagy a KRAS OM2 kiszámított térfogatát a megfelelő MMX csőbe. G. Mérje az MGAC kiszámított térfogatát az MMX munkareagens csövekbe. H. A megfelelő keveredés érdekében vortexelje a csövet 3-5 másodpercig. MEGJEGYZÉS: A mintákat, kontrollokat, valamint a kalibrátort az MMX munkareagensekhez azok elkészítésétől számított 1 órán belül hozzá kell adni a mikrolemezen (AD-lemez). MEGJEGYZÉS: Csak cobas használjon.
®
4800 rendszer mikrolemezt (AD-lemez) és zárófóliát (Roche P/N 05232724001) 1. ábra Lemez elrendezés minta
1
2
3
4
5
6
7
8
A
KRAS MC MMX1
KRAS MC MMX2
6. minta MMX1
6. minta MMX2
14. minta MMX1
14. minta MMX2
22. minta MMX1
22. minta MMX2
B
KRAS NC MMX1
KRAS NC MMX2
7. minta MMX1
7. minta MMX2
15. minta MMX1
15. minta MMX2
23. minta MMX1
23. minta MMX2
C
KRAS CAL KRAS CAL MMX1 MMX2
8. minta MMX1
8. minta MMX2
16. minta MMX1
16. minta MMX2
24. minta MMX1
24. minta MMX2
D
1. minta MMX1
1. minta MMX2
9. minta MMX1
9. minta MMX2
17. minta MMX1
17. minta MMX2
E
2. minta MMX1
2. minta MMX2
10. minta MMX1
10. minta MMX2
18. minta MMX1
18. minta MMX2
F
3. minta MMX1
3. minta MMX2
11. minta MMX1
11. minta MMX2
19. minta MMX1
19. minta MMX2
G
4. minta MMX1
4. minta MMX2
12. minta MMX1
12. minta MMX2
20. minta MMX1
20. minta MMX2
H
5. minta MMX1
5. minta MMX2
13. minta MMX1
13. minta MMX2
21. minta MMX1
21. minta MMX2
06322379001-08HU
14
9
10
11
12
Doc Rev. 9.0
A. Pipettázzon 25 µl MMX munkareagenst a futtatáshoz szükséges minden reakciólyukba a mikrolemezen (AD-lemez). Ügyeljen, hogy a pipetta hegye ne érjen a lemezhez a lyukon kívül. ·
Mérjen (KRAS OM 1-et tartalmazó) MMX 1 munkareagenst a mikrolemez (AD-lemez) páratlan (1., 3., 5. stb.) oszlopokban található lyukaiba.
·
Mérjen (KRAS OM 2-t tartalmazó) MMX 2 munkareagenst a mikrolemez (AD-lemez) páros (2., 4., 6. stb.) oszlopokban található lyukaiba.
B. Pipettázzon 25 µl KRAS MC kontrollt a mikrolemez (AD-lemez) A1 és A2 lyukaiba, keverje jól össze a pipettát a lyukon belül legalább kétszer felszívva és kiürítve. C. Új pipettaheggyel pipettázzon 25 µl NEG CT kontrollt a mikrolemez (AD-lemez) B1 és B2 lyukaiba; lyukaiba; keverje jól össze a pipettát a lyukon belül legalább kétszer felszívva és kiürítve. D. Új pipettaheggyel pipettázzon 25 µl KRAS CAL kontrollt a mikrolemez (AD-lemez) C1 és C2 lyukaiba; lyukaiba; keverje jól össze a pipettát a lyukon belül legalább kétszer felszívva és kiürítve. MEGJEGYZÉS: Minden futtatásnak tartalmaznia kell pozitív kontrollt (KRAS MC) az A1 és A2 lyukakban, negatív kontrollt (NEG CT) a B1, B2 lyukakban és kalibrátort (KRAS CAL) a C1 és C2 lyukakban, különben a futtatás érvénytelen. MEGJEGYZÉS: Szükség szerint cseréljen kesztyűt, hogy megelőzze a minta-minta kontaminációt, illetve a PCR reakciócső külső eredetű kontaminálását. E. Minden egyes minta DNS hígításhoz új pipettahegyet használva mérjen 25 µl-t az első minta DNS-ből a mikrolemez (AD-lemez) D1 és D2 lyukaiba; keverje jól össze a pipettát a lyukon belül legalább kétszer felszívva és kiürítve. Ismételje meg az eljárást a második mintából származó DNS hígítás esetén (E1 és E2 lyukak). Kövesse az 1. ábrán látható elrendezést, amíg valamennyi minta DNS hígítást be nem töltötte a mikrolemez (AD-lemez) lyukaiba. Ellenőrizze, hogy az összes folyadék a lyukak aljára gyűlt. F. Fedje le a mikrolemezt (AD-lemezt) zárófóliával (a lemezek mellé jár). A zárófólia-felhelyező segítségével rögzítse a fóliát légmentesen a mikrolemezre (AD-lemezre). G. A PCR indítása előtt ellenőrizze, hogy az összes folyadék az egyes lyukak aljára gyűlt. MEGJEGYZÉS: Az amplifikálást és kimutatást az első minta DNS hígításnak az MMX munkaoldathoz való hozzáadását követő 1 órán belül meg kell kezdeni. PCR indítása ®
A KRAS munkafolyamat lépéseire vonatkozó részletes útmutatásért tanulmányozza a cobas KRAS felhasználói kézikönyvet.
06322379001-08HU
15
Doc Rev. 9.0
EREDMÉNYEK ÉRTELMEZÉSE ®
MEGJEGYZÉS: Minden futtatási és minta validálást a cobas 4800 szoftver hajt végre. MEGJEGYZÉS: Egy érvényes futtatás tartalmazhat érvényes és érvénytelen mintaeredményeket is. Egy érvényes futtatás mintaeredményeit a 2. táblázat szemlélteti. 2. táblázat ® cobas KRAS mutáció teszt eredmények értelmezése Teszteredmény
Mutáció eredmény
Magyarázat
Mutation Detected
12/13-as vagy 61-es kodon (mindkettő jelen lehet)
A rendszer mutációt észlelt a KRAS 12/13-as, 61-es vagy mindkét kodonjában.
Mutation Not Detected vagy No Mutation Detected*
N/A
A rendszer nem észlelt mutációt a KRAS12/13-as, ill. 61-es kodonjában.
Invalid
N/A
A minta eredménye érvénytelen. Az érvénytelen eredményű minták vizsgálatát ismételje meg az alábbi “Érvénytelen eredményű minták ismételt vizsgálata“ szakaszban leírtak szerint.
Failed
N/A
Hibás futtatás hardver- vagy szoftverhiba miatt. Vegye fel a kapcsolatot a Roche helyi szervizével műszaki segítségért
* A “Mutation Not Detected” vagy “No Mutation Detected” eredmény nem zárja ki mutáció jelenlétét a target KRAS 12/13-as vagy 61-es kodon(ok)on, mivel az eredmény a mutáns szekvenciák százalékos arányától, a minta megfelelő integritásától, a gátlóanyagok hiányától és az elegendő mennyiségű kimutatható DNS jelenlététől is függ. Érvénytelen eredményű minták ismételt vizsgálata A. Ismételje meg az érvénytelen minta DNS törzs hígítását az AMPLIFIKÁLÁS és KIMUTATÁS szakaszban leírt Minta DNS törzs hígítás kiszámítása és Minta hígítás műveletektől kezdve. B. Miután elvégezte a DNS törzs 2 ng/µl-re való hígítását a “Minta hígítás” szakasz szerint, folytassa a “Master Mix (MMX 1 és MMX 2) munkareagensek elkészítése” művelettel, illetve az amplifikálás és kimutatás folyamatának többi lépésével. MEGJEGYZÉS: Ha a minta az ismételt vizsgálat után is érvénytelen marad, vagy nem volt elegendő DNS törzs új hígítás készítéséhez az “Érvénytelen eredményű minták ismételt vizsgálata” szakasz A lépésében, akkor ismételje meg az adott minta teljes vizsgálati folyamatát egy új 5 mikronos FFPEszövetmetszettel a Deparaffinálás és DNS izolálás lépésekkel kezdődően. MINŐSÉG-ELLENŐRZÉS ®
Egy-egy cobas KRAS teszt mutáns kontroll (KRAS MC), negatív kontroll (NEG CT) és KRAS kalibrátor (KRAS CAL) az MMX 1 és MMX 2 munkaoldatokhoz minden futtatás részét képezi. A futtatás akkor értékelhető, ha a KRAS mutáns kontroll (KRAS MC) (A1 és A2 jelű lyukak), a negatív kontroll (NEG CT) (B1 és B2 jelű lyukak), valamint a KRAS kalibrátor (KRAS CAL) (C1 és C2 jelű lyukak) egyaránt értékelhetőek. Ha a KRAS mutáns kontroll (KRAS MC), a negatív kontroll (NEG CT) vagy a KRAS kalibrátor (KRAS CAL) az MMX 1 vagy MMX 2 munkareagensek bármelyike esetén érvénytelen, akkor a teljes futtatás érvénytelen, és meg kell ismételni. Készítsen egy friss hígítást a korábban izolált minta DNS törzsből, és állítson össze egy új mikrolemezt (AD-lemezt) kontrollokkal az amplifikáláshoz és kimutatáshoz. Pozitív kontroll A KRAS mutáns kontroll (KRAS MC) eredménye “Valid” kell legyen az MMX 1 és MMX 2 munkareagensek mindegyike esetén. Ha a KRAS MC eredménye következetesen érvénytelen lesz, technikai segítségért vegye fel a kapcsolatot a helyi Roche irodával. Negatív kontroll A negatív kontroll (NEG CT) eredménye “Valid” kell legyen az MMX 1 és MMX 2 munkareagensek mindegyike esetén. Ha a NEG CT eredménye következetesen érvénytelen lesz, technikai segítségért vegye fel a kapcsolatot a helyi Roche irodával.
06322379001-08HU
16
Doc Rev. 9.0
Kalibrátor A KRAS kalibrátor (KRAS CAL) eredménye “Valid” kell legyen az MMX 1 és MMX 2 munkareagensek mindegyike esetén. Ha a KRAS CAL eredménye következetesen érvénytelen lesz, technikai segítségért vegye fel a kapcsolatot a helyi Roche irodával. AZ ELJÁRÁSSAL KAPCSOLATOS ÓVINTÉZKEDÉSEK Mint minden vizsgálati eljárásnál, a helyes laboratóriumi technika alapvető a vizsgálat megfelelő kivitelezéséhez. A vizsgálat nagy analitikai érzékenysége miatt ügyeljen arra, hogy a reagensek és amplifikálási keverékek szennyeződéstől mentesek maradjanak. ELJÁRÁSSAL KAPCSOLATOS KORLÁTOZÁSOK ®
1. Csak a jelzett mintatípusokat vizsgálja. A cobas KRAS mutáció tesztet csak colorectalis carcinoma és nem-kissejtes tüdőrák FFPE-szövetmintákkal való használathoz validálták. ®
®
2. A cobas KRAS mutáció tesztet csak a cobas használathoz validálták.
DNS minta-előkészítő készlettel (Roche P/N: 05985536190) való
3. Egy mutáció kimutatása a mintában levő kópiák számától függ, ezért befolyásolhatja a minta integritása, az izolált DNS mennyisége és zavaró anyagok jelenléte is. 4. A megbízható eredmény a megfelelő mintalevételen, -szállításon, -tároláson és -feldolgozáson múlik. Kövesse az ebben ® a használati utasításban és a cobas KRAS felhasználói kézikönyvben leírt műveleteket. ®
5
Az AmpErase enzim hozzáadása a cobas KRAS mutáció teszt master mixhez lehetővé teszi a target DNS szelektív amplifikálását, ugyanakkor a reagensek szennyeződésének elkerüléséhez a helyes laboratóriumi gyakorlat és ezen használati utasításban meghatározott eljárások gondos betartása szükséges.
6
A terméket csak a PCR technikák terén jártas személyzet által és a cobas 4800 rendszeren szabad használni.
®
7. Csak a cobas z 480 analizátort validálták a termékkel való használatra. A temékkel más, valós idejű optikai detektálással működő PCR-készüléket nem lehet használni. 8. A technológiák különbözősége miatt javasolt, hogy az egyik technológiáról a másikra való áttéréskor a felhasználók végezzenek korrelációs laboratóriumi vizsgálatokat, hogy a technológiák közötti különbség minősíthető legyen. 9. Egyéb potenciális változók, mint például különböző minta-fixálási lehetőségek hatását nem vizsgálták. ®
10. Ritkán bár, de előfordulhat, hogy a cobas KRAS mutáció teszt primerei és/vagy próbái által lefedett KRAS gén genomi DNS régióiban levő mutációk következtében egy mutáció jelenlétének kimutatása sikertelen lesz. 11. PCR-inhibitorok jelenléte álnegatív vagy érvénytelen eredményeket okozhat. 29
®
12. Ritkán bár (< 0,2% ), de előfordulhat, hogy a cobas KRAS mutációteszt „Mutation Not Detected” eredményt ad a 12/13-as és 61-es kodonok bizonyos komplex és többszörös mutációira, ugyanakkor korlátozott keresztreaktivitást mutat a 12/13-as (2-es exon), a 61-es (3-as exon), valamint az 59-es kodonokkal szomszédos mutációk esetén. A szomszédos régiókban mutációt eredményező minták esetén a teszt esetenként „Mutation Detected” eredményt adhat. ®
13. A cobas KRAS mutáció tesztet reakciólyukanként 50 ng DNS-sel való használatkor ellenőrizték. Reakciólyukanként 50 ngnál kisebb DNS-mennyiség használata nem javasolt. 29
14. A fent leírt folyamat betartásával KRAS-mutációkra vad típusú DNS hátterében ≥ 5%-nyi mutáns szekvencia kimutatható (3. táblázat).
06322379001-08HU
17
Doc Rev. 9.0
3. táblázat ® A cobas KRAS mutáció teszttel kimutatható mutációk Mutáció
Aminosav változás
COSMIC azonosító
c.34G>T
12C
516
c.34G>A
12S
517
c.34G>C
12R*
518
c.35G>T
12V
520
c.35G>A
12D
521
c.35G>C
12A
522
c.37G>T
13C
527
c.37G>A
13S
528
c.37G>C
13R*
529
c.38G>A
13D
532
c.38G>C
13A
533
c.38G>T
13V
534
c.181C>A
61K*
549
c.181C>G
61E
550
c.182A>C
61P
551
c.182A>G
61R
552
c.182A>T
61L
553
c.183A>C
61H (CAC)
554
c.183A>T
61H (CAT)
555
*NSCLC FFPE-szövetmintákkal nem tesztelték Félkövér = plazmidokkal tesztelve
NEM KLINIKAI ÉRTÉKELÉS Nem-klinikai értékelés colorectalis carcinoma szövetmintánál Analitikai érzékenység ®
A cobas KRAS mutáció teszt analitikai érzékenységének meghatározása négy különböző mintatípus hígítási sorain történt: ·
Sejtvonalkeverék, amelyet KRAS mutáns sejtvonalból és KRAS vad típus sejtvonalból származó DNS törzsek összekeverésével készítettek.
·
Plazmidkeverék, amelyet egy KRAS mutációt tartalmazó plazmidból, valamint KRAS vad típus sejtvonalból származó DNS törzsek összekeverésével készítettek.
·
Mintakeverékek, melyeket KRAS-mutáns és KRAS vad típusú FFPE szövetmintákból származó DNS-törzsek összekeverésével készítettek.
·
Egy egyéni FFPE szövetmintából kivont DNS-törzs.
Hogy meghatározzák az egyes minták százalékos mutációs arányát, a vizsgálatban használt valamennyi mintát 454 Genome Sequencer FLX Titanium (454 szekvenálás) segítségével szekvenálták. ®
A cobas KRAS mutáció teszt érzékenysége sejtvonal- vagy plazmidkeverékek segítségével Colorectalis sejtvonalakból (melyek a KRAS 2-es exonjának 12-es vagy 13-as kodonját tartalmazzák) származó DNS került kivonásra, majd elegyítésre KRAS vad típusú sejtvonalból származó DNS-kivonatokkal úgy, hogy kb. 5% legyen a mutációk aránya; az ellenőrzés 454 szekvenálással történt. Három különböző hígítási sor, mely az alábbi hígításokat tartalmazta (50,0, ® 25,0, 12,5, 6,3, 3,1, 1,6, 0,8, és 0,4 ng/25 µl). Minden egyes paneltag 24-24 ismétlését vizsgálták mindhárom cobas KRAS mutáció teszt készlet gyártási tételeivel (összesen 72 ismétlés). Az érzékenységet úgy határozták meg, mint az a legkisebb DNS mennyiség, amely legalább 95%-ban KRAS “Mutation Detected” eredményt ad (4. táblázat). 06322379001-08HU
18
Doc Rev. 9.0
4. táblázat ® A cobas KRAS mutáció teszt érzékenysége CRC sejtvonal- vagy plazmidkeverék segítségével Százalékos mutáció*
DNS mennyiség abban a paneltagban (ng/25 µl), amely ≥ 95% arányban “Mutation Detected” eredményt adott (N=72 ismétlés)
Sejtvonalkeverék
5,3%
0,8
13-es kodon (2-as exon)
Sejtvonalkeverék
4,9%
1,6
61-es kodon (3-as exon)
Plazmidkeverék
5,8%
6,3
KRAS mutáció
Mintatípus
12-es kodon (2-as exon)
* Átlagos százalékos mutáció 454 szekvenálással A teszt során a “Mutation Detected” aránya 95% volt 0,8 ng/25 µl hígításnál, 1,6 ng/25 µl hígításnál, valamint 6,3 ng/25 µl hígításnál (1:64, 1:32, és 1:8 hígításai az ajánlott 50 ng/25 µl bevitelkori DNS-koncentrációnak) a KRAS 12-es, 13-as és 61-es kodonján (ebben a sorrendben). Ez azt jelenti, hogy a teszt akkor is kimutatná a vizsgált KRAS mutációkat, amikor a DNS ~87%-a degradálódott vagy nem amplifikálható a fixálás miatt, feltételezve azt, hogy a sejtvonali és plazmid-DNS keverékek 100%-ban intakt és amplifikálható DNS-t tartalmaztak. Analitikai érzékenység FFPE-szövetminta és szövetmintakeverék segítségével A KRAS 12-es, 13-as és 61-es kodonjain mutációt hordozó, FFPE szövetmintákból kivont DNS-minták elegyítése történt KRAS vad típusú FFPE szövetmintákból származó kivonatokkal úgy, hogy kb. 5% legyen a mutációk aránya. Egy természetben előforduló mintát használtak a KRAS 12-es kodonján lévő mutáció vizsgálatára. A végső mutációs szintek minden mintán 454 szekvenálással lettek ellenőrizve. A minta/minták keverékeinek hígításával álltak elő a hígítási sor tagjai (50,0, 25,0, 12,5, 6,3, 3,1, 1,6, 0,8, és 0,4 ng/25 µl). A sor 50 ng/25 µl koncentrációjú tagja a 2-es számú keverékre (3-as exon, 61-es kodon) nem lett tesztelve. ®
Minden egyes paneltag nyolc-nyolc (8) ismétlését futtatták cobas KRAS mutáció teszt készlet 3 gyártási tételének mindegyikével (n=24/paneltag). Az érzékenységet minden egyes minta esetén úgy határozták meg, mint az a legkisebb DNS mennyiség, amely legalább 95%-ban KRAS “Mutation Detected” eredményt ad (5. táblázat). 5. táblázat ® A cobas KRAS mutáció teszt érzékenysége CRC minta és mintakeverékek segítségével KRAS mutáció 12-es kodon (2-as exon) 13-es kodon (2-as exon) 61-es kodon (3-as exon)
DNS mennyiség abban a paneltagban (ng/25 µl), amely ≥ 95% arányban “Mutation Detected” eredményt adott (N=24 ismétlés) 3,1 3,1 3,1 3,1 1,6 1,6 3,1 3,1 6,3
Százalékos mutáció
Mintatípus FFPE-szövetminta FFPE szövet keverék FFPE szövet keverék FFPE szövet keverék FFPE szövet keverék FFPE szövet keverék FFPE szövet keverék FFPE szövet keverék FFPE szövet keverék
4,3% 4,2% 4,7% 5,0% 4,6% 7,2% 4,4% 5,5% 3,8%
®
Ez a vizsgálat azt mutatja meg, hogy a cobas KRAS mutáció teszt képes a KRAS 12-es, 13-as és 61-es kodonok legalább 5%os mutációszintű mutációinak kimutatására a standard 50 ng/25 µl beviteli koncentráció mellett. A teszt képes alacsonyabb bevitt DNS szintek mellett is a mutáció kimutatására, ami azt jelenti, hogy bár a minták a fixálási eljárás következtében degradált vagy nem amplifikálható DNS-t tartalmazhatnak, mégis kimutatható marad a mutáció. Referencia módszerrel való korreláció ®
Száznyolcvannyolc (188) FFPE szövetmintát teszteltek a cobas KRAS mutáció teszt készletek 2-2 gyári kiszerelésével. 2X ® bidirekcionális Sanger-féle szekvenálással összehasonlító vizsgálatot végeztek valamennyi mintán. A cobas KRAS mutáció teszttel és a 2X bidirekcionális Sanger-féle szekvenálással kapott eltérő eredmények feloldását 454 szekvenálással végezték.
06322379001-08HU
19
Doc Rev. 9.0
®
cobas KRAS mutáció teszt és 2X bidirekcionális Sanger-féle szekvenálás eredményei A 6. táblázat összegzi a mintainformációt, illetve a 2X bidirekcionális Sanger-féle szekvenálás eredményét 188 mintán. Nyolcvanegy (81) minta a 188-ból a KRAS 12/13 kodonján, 7 a KRAS 61-es kodonján hordozott mutációt, míg 107 minta vagy KRAS vad típusú volt, vagy nem a 12/13-as kodonon hordozta a mutációt a Sanger-féle szekvenálás alapján, 181 minta pedig KRAS vad típusú volt, vagy nem a 61-es kodonon hordozta a mutációt. 6. táblázat Tumorstádium vs. Sanger-féle szekvenálás 2X bidirekcionális Sanger-féle szekvenálás eredményei Tumorstádium
12-es kodon
13-es kodon
61-es kodon
Vad típus
Összes
Összes (%)
I. stádium
6
2
0
3
11
5,8%
II. stádium
20
5
3
37
65
34,4%
III. stádium
21
8
1
38
68
36,0%
IV. stádium
17*
3*
3
20
43
22,8%
Ismeretlen stádium
0
0
0
2
2
1,1%
Összes
64
18
7
100
189
100,0%
* A 81 darab 12/13-as kodonra nézve mutáns minta egyike mind a 12-es, mind a 13-as kodonokon hordozott mutációt. ®
A két tételnyi cobas KRAS mutáció teszttel vizsgált 188 colorectalis carcinoma tumorminta kapcsán kapott eredmények összevetése a 2-es exon 12/13-as kodonjainak, ill. a 3-as exon 61-es kodonja mutációinak 2X bidirekcionális Sanger-féle szekvenálása során kapott eredmények a 7. és 8. táblázatban láthatóak. 7. táblázat ® cobas KRAS mutáció teszt (1. tétel) vs. 2X bidirekcionális Sanger-féle szekvenálás 2X bidirekcionális Sanger-féle szekvenálás
®
cobas KRAS 1. tétel
MT 12/13-as kodon
MT 61-es kodon
WT
Összesen
MT 12/13-as kodon
78
0
6
84
MT 61-es kodon
0
6
1
7
WT
2
1
93
96
Összesen
80
7
100
187*
Pozitív megfelelési arány = 96,6% (95% CI = 90,3-98,8%) Negatív megfelelési arány = 93,0% (95% CI = 86,3-96,6%) Teljes megfelelési arány = 94,7% (95% CI = 90,4-97,1%) MT: mutáns WT: vad típus *Egy mintát nem teszteltek az 1. tétellel. 8. táblázat ® cobas KRAS mutáció teszt (2. tétel) vs. 2X bidirekcionális Sanger-féle szekvenálás 2X bidirekcionális Sanger-féle szekvenálás
®
cobas KRAS 2. tétel
MT 12/13-as kodon
MT 61-es kodon
WT
Összesen
MT 12/13-as kodon
79
0
6
85
MT 61-es kodon
0
6
1
7
WT
2
1
93
96
Összesen
81
7
100
188
Pozitív megfelelési arány = 96,6% (95% CI = 90,5-98,8%) Negatív megfelelési arány = 93,0% (95% CI = 86,3-96,6%) Teljes megfelelési arány = 94,7% (95% CI = 90,5-97,1%) MT: mutáns WT: vad típus ® A cobas KRAS mutáció teszt és a 2X bidirekcionális Sanger-féle szekvenálás teljes megfelelési aránya a KRAS 2-es ® exonjának 12/13-as kodonjában lévő mutációkra 94,7% (összesen 10 eltérő eredmény) volt a cobas KRAS mutáció teszt reagensek mindkét gyártási tétele esetén. 06322379001-08HU
20
Doc Rev. 9.0
Eltérő eredmények vizsgálata 454 szekvenálással ®
A cobas KRAS mutáció teszttel és a 2X bidirekcionális Sanger-féle szekvenálással kapott eltérő eredmények feloldását 454 szekvenálással végezték az 1-es és a 2-es tétel esetén egyaránt (9. és 10. táblázat). 9. táblázat ® A cobas KRAS mutáció teszttel (1. tétel) és a 2X bidirekcionális Sanger-féle szekvenálással kapott eltérő eredmények 454 szekvenálással feloldva 2X bidirekcionális Sanger-féle szekvenálás, 454 szekvenálással feloldva
®
cobas KRAS 1. tétel
MT 12/13-as kodon
MT 61-es kodon
WT
Összesen
MT 12/13-as kodon
83
0
1
84
MT 61-es kodon
0
7
0
7
WT
0
0
96
96
Összesen
83
7
97
187*
Pozitív megfelelési arány = 100,0% (95% CI = 95,9-100,0%) Negatív megfelelési arány = 99,0% (95% CI = 94,4-99,8%) Teljes megfelelési arány = 99,5% (95% CI = 97,0-99,9%) MT: mutáns WT: vad típus *Egy mintát nem teszteltek az 1. tétellel. 10. táblázat ® cobas KRAS mutáció teszt (2. tétel) vs. 2X bidirekcionális Sanger-féle szekvenálás 2X bidirekcionális Sanger-féle szekvenálás, 454 szekvenálással feloldva MT 12/13-as kodon MT 61-es kodon WT Összesen ®
cobas KRAS 2. tétel
MT 12/13-as kodon
84
0
1
85
MT 61-es kodon
0
7
0
7
WT
0
0
96
96
Összesen
84
7
97
188
Pozitív megfelelési arány = 100,0% (95% CI = 95,9-100,0%) Negatív megfelelési arány = 99,0% (95% CI = 94,4-99,8%) Teljes megfelelési arány = 99,5% (95% CI = 97,0-99,9%) MT: mutáns WT: vad típus ® A cobas KRAS mutáció teszt és a 2X bidirekcionális Sanger-féle szekvenálás közötti eltérő eredmények 454 szekvenálással ® történő feloldását követően a teljes megfelelési arány 99,5%-ra javult a cobas KRAS mutáció teszt reagensek első és második gyártási tétele esetén egyaránt. Specificitás ®
A cobas KRAS mutáció teszt specificitásának meghatározása 188 colorectalis carcinoma FFPE szövetminta vizsgálatával történt, a “Referencia módszerrel való korreláció” vizsgálattal egyszerre. Sanger-féle szekvenálás ®
A cobas KRAS mutáció teszt specificitásának kiszámolása úgy történt, hogy 2X bidirekcionális Sanger-féle szekvenálással ® meghatározták a vad típusúként azonosított, és így a cobas KRAS mutáció teszt alapján helyesen vad típusúnak jelzett FFPE szövetminták százalékos arányát (negatív megfelelési arány). ®
A 188 tumorminta a KRAS 12/13-as és 61-es kodonjának mutációjára cobas KRAS mutáció teszttel történő vizsgálatának specificitása (negatív megfelelési arány) a 2X bidirekcionális Sanger-féle szekvenálás eredményeivel összevetve 93,0%-nak ® adódott (6-7. táblázat) a cobas KRAS mutáció teszt reagensek első és második gyártási tétele esetén egyaránt. Eltérő eredmények vizsgálata 454 szekvenálással ®
A cobas KRAS mutáció teszt reagensei esetén a KRAS 12/13-as és 61-es kodonjának mutációi vizsgálata során a specificitás 99,0%-ra javult az első és második gyártási tétel esetén egyaránt (8-9. táblázat), miután 454 szekvenálással feloldották ® a cobas KRAS mutáció teszt és a 2X bidirekcionális Sanger-fle DNS-szekvenálás közötti eltérő eredményeket. ®
A cobas KRAS mutáció teszt specificitásában a 454 szekvenálást követően beállt javulás elsősorban annak volt betudható, hogy a 454 szekvenálás olyan KRAS mutációkat is észlel, amiket a Sanger-féle szekvenálás nem, ugyanis utóbbi szenzitivitása az előbbinél alacsonyabb. 06322379001-08HU
21
Doc Rev. 9.0
Keresztreaktivitás ®
A cobas KRAS mutáció teszt keresztreaktivitását az alábbi vizsgálatok során értékelték; ·
KRAS silent mutációs plazmidok tesztelése,
·
KRAS homológ plazmidok tesztelése
·
A vastagbélben előforduló mikroorganizmusok tesztelése.
A keresztreaktivitás értékelésre került úgy is, hogy megállapították, hogy a KRAS silent mutációs plazmidok, KRAS homológ plazmidok, valamint a vastagbélben előforduló mikroorganizmusok jelenléte zavarja-e a KRAS 12-es, 13-as és 61-es kodon mutációinak meghatározását. KRAS silent mutációs plazmidok Vad típusú sejtvonal DNS-ét háttérnek használva, plazmidmintákat készítettek, és a KRAS 2-es exon 12-es kodonjának alábbi három silent mutációjára vizsgálták: GGA, GGC és GGG. Vizsgálták továbbá a KRAS 2-es exon 13-es kodonjának alábbi három silent mutációjára is: GGA, GGT és GGG. A KRAS 2-es exon 12-es, illetve 13 kodonjának silent mutációi esetében a plazmidokkal keresztreakció nem volt megfigyelhető. A KRAS 12-es, illetve 13-as kodon plazmidkeverékei 5% mutáns ráta mellett vad típusú sejtvonali DNS-t háttérként használva lettek elkészítve a megfelelő silent mutációs plazmidok jelenlétében, és nem lehetett zavarjelet megfigyelni a silent mutációs plazmidok részéről. KRAS homológ plazmidok Vad típusú sejtvonali DNS-t háttérként használva, a hat KRAS homológ plazmid (KRAS 12/13-as kodon pszeudogén, 61-es ® kodon pszeudogén, NRAS 2-es exon, NRAS 3-as exon, HRAS 2-es exon és HRAS 3-as exon) készült, és cobas KRAS mutáció teszttel háromszori vizsgálatnak lett alávetve. A plazmid minták egyikével sem észleltek keresztreaktivitást. A KRAS 12-es, 13-as, illetve 61-es kodon plazmidkeverékei 5% mutáns ráta mellett vad típusú sejtvonali DNS-t háttérként használva lettek elkészítve a megfelelő homológ plazmidok jelenlétében, és nem lehetett zavarjelet megfigyelni a homológ plazmidok részéről. Vastagbélben előforduló mikroorganizmusok ®
Az alábbi vastagbélben előforduló mikroorganizmusokat vizsgálva, azok nem keresztreagáltak a cobas KRAS mutáció teszt 6 során, amikor a szövetlízis lépésben 1 x 10 telepképző egység mennyiségben hozzáadták őket 5-5 KRAS 12-es, 13-as és 61-es vad típusú KRAS mintához: 1. Bacteroides caccae 2. Prevotella intermedia 3. Escherichia coli (E. coli) A vizsgált mikroorganizmusok ugyancsak nem mutattak zavaró hatást a KRAS 12-es (2 minta), 13-as (1 minta) vagy 61-es 6 (2 minta) kodon mutációinak kimutatásakor, amikor a szövetlízis lépésben 1 x 10 telepképző egység mennyiségben hozzáadták őket a 11. táblázatban felsorolt mennyiségekben KRAS mutációt tartalmazó mintákhoz. 11. táblázat A minták mutációs aránya a vastagbélben előforduló mikroorganizmusok zavaró hatásának vizsgálata során Minta #
Mutációs állapot
%-os mutáció 454 szekvenálással
1 2 3
12-es kodon 12-es kodon 13-es kodon
15,9 16,1 42,8
4 5
61-es kodon 61-es kodon
17,0 19,8
Interferencia 30
Trigliceridek (≤ 37 mM, CLSI által javasolt magas koncentráció ), hemoglobin (≤ 2 mg/ml, CLSI által javasolt magas 30 ® koncentráció ) és ≤ 50% nekrotikus szövet vizsgálatakor azok nem mutattak zavaró hatást a the cobas KRAS mutáció teszt során, amikor a potenciális zavaró anyagot hozzáadták a lízis lépéshez a minta-előkészítés folyamán. 06322379001-08HU
22
Doc Rev. 9.0
Állékonyság ®
A cobas KRAS mutáció teszt állékonyságát egy 2-es exon, 12-es kodon mutáns, valamint egy 3-as exon, 61-es kodon mutáns colorectalis carcinoma FFPE szövetmintával határozták meg, 13,1, illetve 17%-os mutáns ráta mellett (ebben a sorrendben), minden mintából 100 darab 5 mikronos metszet készült elemzés céljából. ®
A genomi DNS-t minden egyes metszetből a cobas DNS minta-előkészítő készlet segítségével extrahálták. Az extrahált genomi DNS egyetlen ismétlését vizsgálták a 100 metszet mindegyike esetén mind a 2 mintánál. Tíz külön futtatást végeztek, ® ® futtatásonként 20 metszetet vizsgálva a cobas KRAS mutáció teszttel. A cobas KRAS mutáció teszt a másolatok száz (100) százalékában “Mutation Detected”-et jelzett a 12-es és a 61-es kodonon mutálódott minták esetében egyaránt, mely alapján az álnegatív eredmények aránya 0%. Reprodukálhatóság ®
A cobas KRAS mutációteszt reprodukálhatóságát nyolc colorectalis carcinoma (CRC) FFPE-szövetminta segítségével értékelték. A minták jellemzőit a 12. táblázat ismerteti. A mintákat két-két párhuzamos mintaként vizsgálta két vizsgáló két különböző reagenstétel és négy cobas z 480 analizátor segítségével 4 napon keresztül (n=32/minta). 12. táblázat ® cobas KRAS mutáció teszt reprodukálhatóság
1
KRAS mutációs státusz 12-es kodon
16,4%
32
0
100%
2
12-es kodon
20,6%
32
0
100%
3
13-as kodon
16,7%
32
0
100%
4
13-as kodon
10,3%
32
0
100%
5
61-es kodon
28,1%
32
0
100%
6
61-es kodon
31,5%
32
0
100%
7
Vad típus
-
0
32
100%
8
Vad típus
-
0
32
100%
Mintaszám
Mutációs arány
Mutation Detected (n=32)
Mutation Not Detected
Megfelelési arány
®
A cobas KRAS mutáció tesztnek a vizsgálati napokra, mintákra, ismétlésekre, vizsgáló személyekre és reagenstételekre számított kombinált reprodukálhatósága 100% (256/256) volt.
Nem klinikai értékelés nem-kissejtes tüdőrák szövet esetén Analitikai érzékenység ®
A cobas KRAS mutáció teszt analitikai érzékenységének meghatározása kettő különböző mintatípus hígítási sorain történt: •
Sejtvonalkeverék, amelyet KRAS mutáns sejtvonalból és KRAS vad típus sejtvonalból származó DNS törzsek összekeverésével készítettek.
•
Mintakeverékek, melyeket KRAS-mutáns és KRAS vad típusú FFPE szövetmintákból származó DNS-törzsek összekeverésével készítettek.
Hogy meghatározzák az egyes minták százalékos mutációs arányát, a vizsgálatban használt valamennyi mintát 454 Genome Sequencer FLX Titanium (454 szekvenálás) segítségével szekvenálták.
06322379001-08HU
23
Doc Rev. 9.0
®
A cobas KRAS mutáció teszt érzékenysége sejtvonalkeverékek segítségével Tüdő sejtvonalakból (melyek a KRAS 12-es, 13-as vagy 61-es mutáns kodonját tartalmazzák) származó DNS került kivonásra, majd elegyítésre KRAS vad típusú sejtvonalból származó DNS-kivonatokkal úgy, hogy 2, 5 és 10% legyen a mutációk aránya; az ellenőrzés 454 szekvenálással történt. Három különböző hígítási panel tartalmazta az alábbi hígításokat (50,0, 12,5, 3,1, 0,8 ® és 0 ng/25 µl). Minden egyes paneltag 24-24 ismétlését vizsgálták mindhárom cobas KRAS mutáció teszt készlet gyártási tételeivel (összesen 72 ismétlés). Az érzékenységet úgy határozták meg, mint az a legkisebb DNS mennyiség, amely legalább 95%-ban KRAS “Mutation Detected” eredményt ad (13. táblázat). 13. táblázat ® A cobas KRAS mutáció teszt érzékenysége tüdő sejtvonalkeverék esetén KRAS mutáció
12-es kodon (2-es exon)
13-as kodon (2-es exon)
61-es kodon (3-es exon)
Mintatípus
12,1%
DNS mennyiség abban a paneltagban (ng/25 µl), amely ≥ 95% arányban "Mutation Detected" eredményt adott (N=72 ismétlés) 0,8
6,1%
3,1
2,4%
50,0
7,8%
0,8
4,9%
3,1
2,8%
3,1
10,2%
0,8
6,1%
0,8
2,7%
12,5
Százalékos mutáció*
Sejtvonal
Sejtvonal
Sejtvonal
* Átlagos százalékos mutáció 454 szekvenálással A teszt során a “Mutation Detected” aránya 95% volt 2,4%-nyi (50 ng/25 µl), 2,8%-nyi (3,1 ng/25 µl) és 2,7%-nyi (12,5 ng/25 µl) mutáció esetén a KRAS 12-es, 13-as és 61-es kodonjára, ebben a sorrendben. Ez a vizsgálat demonstrálja, hogy a teszt képes a legalább 5%-nyi szintű KRAS-mutációk kimutatására 50 ng/25 µl bevitelkori DNS-koncentrációnál. Továbbá a teszt során a “Mutation Detected” aránya 95% volt 3,1 ng/25 µl, 3,1 ng/25 µl és 0,8 ng/25 µl (az ajánlott 50 ng/25 µl bevitelkori DNS-koncentráció 1:16, 1:16 és 1:64 arányú hígításai) a KRAS 12-es, 13-as és 61-es kodon mutációi esetén kb. 5%-nyi mutációnál, ebben a sorrendben. Ez azt jelenti, hogy a teszt akkor is kimutatná a KRAS mutációkat, amikor a DNS ~94%-a degradálódott vagy nem amplifikálható a fixálás miatt, feltételezve azt, hogy a sejtvonali DNS keverékek 100%-ban intakt és amplifikálható DNS-t tartalmaztak. Analitikai érzékenység FFPE-szövetmintakeverék segítségével A KRAS 12-es, 13-as és 61-es kodonjain mutációt hordozó, FFPE szövetmintákból kivont DNS-minták elegyítése történt KRAS vad típusú FFPE szövetmintákból származó kivonatokkal úgy, hogy kb. 5% legyen a mutációk aránya. A végső mutációs szintek minden mintán 454 szekvenálással lettek ellenőrizve. A minta/minták keverékeinek hígításával álltak elő a hígítási sor tagjai (50,0, 12,5, 3,1, 0,8, és 0 ng/25 µl). ®
Minden egyes paneltag nyolc-nyolc (8) ismétlését tesztelték cobas KRAS mutáció teszt készlet 3 gyártási tételének mindegyikével (n=24/paneltag). Az érzékenységet minden egyes minta esetén úgy határozták meg, mint az a legkisebb DNS mennyiség, amely legalább 95%-ban KRAS “Mutation Detected” eredményt ad (14. táblázat).
06322379001-08HU
24
Doc Rev. 9.0
14. táblázat ® A cobas KRAS mutáció teszt érzékenysége tüdőkarcinóma mintakeverék segítségével KRAS mutáció
Mintatípus
12-es kodon (2-es exon)
FFPE szövet keverék
13-as kodon (2-es exon)
61-es kodon (3-es exon)
FFPE szövet keverék
FFPE szövet keverék
Százalékos mutáció*
DNS mennyiség abban a paneltagban (ng/25 µl), amely ≥ 95% arányban "Mutation Detected" eredményt adott (N=24 ismétlés)
6,2%
12,5
6,0%
3,1
5,6%
3,1
6,2%
3,1
4,4%
3,1
4,4%
3,1
6,5%
3,1
6,4%
3,1
4,5%
3,1
* Átlagos százalékos mutáció 454 szekvenálással ®
Ez a vizsgálat azt mutatja meg, hogy a cobas KRAS mutáció teszt képes a KRAS 12-es, 13-as és 61-es kodonok legalább 5%-os mutációszintű mutációinak kimutatására a standard 50 ng/25 µl beviteli koncentráció mellett. A teszt képes alacsonyabb bevitt DNS szintek mellett is a mutáció kimutatására, ami azt jelenti, hogy bár a minták a fixálási eljárás következtében degradált vagy nem amplifikálható DNS-t tartalmazhatnak, mégis kimutatható marad a mutáció. Referencia módszerrel való korreláció ®
Százkilencvennégy (194) nem-kissejtes tüdőrák FFPE-szövetmintát vizsgáltak a cobas KRAS mutáció teszt 2 gyártási tételének mindegyikével. 2X bidirekcionális Sanger-féle szekvenálással összehasonlító vizsgálatot végeztek valamennyi mintán. ® A cobas KRAS mutáció teszttel és a 2X bidirekcionális Sanger-féle szekvenálással kapott eltérő eredmények feloldását 454 szekvenálással végezték. ®
cobas KRAS mutáció teszt és 2X bidirekcionális Sanger-féle szekvenálás eredményei A 15. táblázat összegzi a mintainformációt, illetve a 2X bidirekcionális Sanger-féle szekvenálás eredményét 194 mintán. Kilencvenöt (95) minta a 194-ből a KRAS 12/13 kodonján (egy 12-es kodonon mutáns a 61-es kodonon is mutációt hordozott), egy a KRAS 61-es kodonján hordozott mutációt, míg 98 minta vagy KRAS vad típusú volt, vagy nem a 12/13-as kodonon hordozta a mutációt a Sanger-féle szekvenálás alapján, 192 minta pedig KRAS vad típusú volt, vagy nem a 61-es kodonon hordozta a mutációt. 15. táblázat Tumorstádium vs. Sanger-féle szekvenálás 2X bidirekcionális Sanger-féle szekvenálás eredményei Tumorstádium
12-es kodon
13-as kodon
61-es kodon
Vad típus
Összes
Összes (%)
I. stádium
15
2
0
29
46
23,7%
II. stádium
12
0
0
7
19
9,8%
III. stádium
21
4
1
9
35
18,0%
IV. stádium
11
3
0
1
15
7,7%
Ismeretlen stádium
24
3
0
52
79
40,7%
Összes
83
12
1
98
194
100,0%
®
A 194 cobas KRAS mutáció teszttel vizsgált nem-kissejtes tüdőtumor-minta kapcsán kapott eredmények összevetése a 2-es exon 12/13-as kodonjainak, ill. a 3-as exon 61-es kodonja mutációinak 2X bidirekcionális Sanger-féle szekvenálása során kapott eredményekkel a 16. és 17. táblázatban látható.
06322379001-08HU
25
Doc Rev. 9.0
16. táblázat ® cobas KRAS mutáció teszt (1. tétel) vs. 2X bidirekcionális Sanger-féle szekvenálás 2X bidirekcionális Sanger-féle szekvenálás
®
cobas KRAS 1. tétel
MT 12/13-as kodon
MT 61-es kodon
WT
Összesen
MT 12/13-as kodon
90
0
6
96
MT 61-es kodon
0
1
1
2
WT
5
1
91
97
Összesen
95
2
98
195*
Pozitív megfelelési arány = 93,8% (95% CI = 87,2-97,1%) Negatív megfelelési arány = 92,9% (95% CI = 86,0-96,5%) Teljes megfelelési arány = 93,3% (95% CI = 88,9-96,1%) MT: mutáns WT: vad típus * N=194, egy minta duplán mutált (12-es és 61-es kodon) a Sanger alapján ®
A cobas KRAS mutáció teszt és a 2X bidirekcionális Sanger-féle szekvenálás teljes megfelelési aránya a KRAS 12/13-as és ® 61-es kodonjában lévő mutációkra 93,8% (összesen 13 eltérő eredmény) volt a cobas KRAS mutáció teszt reagensek 1. gyártási tétele esetén. 17. táblázat ® cobas KRAS mutáció teszt (2. tétel) vs. 2X bidirekcionális Sanger-féle szekvenálás 2X bidirekcionális Sanger-féle szekvenálás
®
cobas KRAS 2. tétel
MT 12/13-as kodon
MT 61-es kodon
WT
Összesen
MT 12/13-as kodon
90
0
8
98
MT 61-es kodon
0
1
1
2
WT
5
1
88
94
Összesen
95
2
97
194*
Pozitív megfelelési arány = 93,8% (95% CI = 87,2-97,1%) Negatív megfelelési arány = 90,7% (95% CI = 83,0-95,0%) Teljes megfelelési arány = 92,3% (95% CI = 87,6-95,1%) MT: mutáns WT: vad típus * N=193, egy minta duplán mutált (12-es és 61-es kodon) a Sanger alapján. A 194 minta egyike nem valós eredményt adott. ®
A cobas KRAS mutáció teszt és a 2X bidirekcionális Sanger-féle szekvenálás teljes megfelelési aránya a KRAS 12/13-as és ® 61-es kodonjában lévő mutációkra 93,8% (összesen 15 eltérő eredmény) volt a cobas KRAS mutáció teszt reagensek 2. gyártási tétele esetén.
06322379001-08HU
26
Doc Rev. 9.0
Eltérő eredmények vizsgálata 454 szekvenálással ®
A cobas KRAS mutáció teszttel és a 2X bidirekcionális Sanger-féle szekvenálással a target KRAS 12/13-as és 61-es kodonokra kapott eltérő eredmények feloldását 454 szekvenálással végezték, amint az a 18. és 19. táblázatban látható. 18. táblázat ® A cobas KRAS mutáció teszttel (1. tétel) és a 2X bidirekcionális Sanger-féle szekvenálással kapott eltérő eredmények 454 szekvenálással feloldva Sanger-féle szekvenálás, 454 szekvenálással feloldva
®
cobas KRAS 1. tétel
MT 12/13-as kodon
MT 61-es kodon
WT
Összesen
MT 12/13-as kodon
96
0
0
96
MT 61-es kodon
0
1
1
2
WT
3
0
94
97
Összesen
99
1
95
195*
Pozitív megfelelési arány = 97,0% (95% CI = 91,5-99,0%) Negatív megfelelési arány = 98,9% (95% CI = 94,3-99,8%) Teljes megfelelési arány = 97,9% (95% CI = 94,8-99,2%) MT: mutáns WT: vad típus *N=194, egy minta duplán mutált (12-es és 61-es kodon) a Sanger alapján
19. táblázat ® A cobas KRAS mutáció teszttel (2. tétel) és a 2X bidirekcionális Sanger-féle szekvenálással kapott eltérő eredmények 454 szekvenálással feloldva Sanger-féle szekvenálás, 454 szekvenálással feloldva
®
cobas KRAS 2. tétel
MT 12/13-as kodon
MT 61-es kodon
WT
Összesen
MT 12/13-as kodon
98
0
0
98
MT 61-es kodon
0
1
1
2
WT
0
0
94
94
Összesen
98
1
95
194*
Pozitív megfelelési arány = 100,0% (95% CI = 96,3-100,0%) Negatív megfelelési arány = 98,9% (95% CI = 94,3-99,8%) Teljes megfelelési arány = 99,5% (95% CI =97,1-99,9%) MT: mutáns WT: vad típus * N=193, egy minta duplán mutált (12-es és 61-es kodon) a Sanger alapján. A 194 minta egyike nem valós eredményt adott. ®
A cobas KRAS mutáció teszt és a 2X bidirekcionális Sanger-féle szekvenálás közötti eltérő eredmények 454 szekvenálással ® történő feloldását követően a teljes megfelelési arány 97,9, illetve 99,5%-ra javult a cobas KRAS mutáció teszt reagensek 1. és 2. gyártási tétele esetén, ebben a sorrendben. Specificitás ®
A cobas KRAS mutáció teszt specificitásának meghatározása 194 nem-kissejtes tüdőrák FFPE szövetminta vizsgálatával történt, a “Referencia módszerrel való korreláció” vizsgálattal egyszerre. Sanger-féle szekvenálás ®
A cobas KRAS mutáció teszt specificitásának kiszámolása úgy történt, hogy 2X bidirekcionális Sanger-féle szekvenálással ® meghatározták a vad típusúként azonosított, és így a cobas KRAS mutáció teszt alapján helyesen vad típusúnak jelzett FFPE szövetminták százalékos arányát (negatív megfelelési arány). ®
A 194 tumorminta a KRAS 12/13-as és 61-es kodonjának mutációjára cobas KRAS mutáció teszttel történő vizsgálatának specificitása (negatív megfelelési arány) a 2X bidirekcionális Sanger-féle szekvenálás eredményeivel összevetve 92,9%-nak (15. ® táblázat) és 90,7%-nak (16. táblázat) a cobas KRAS mutáció teszt reagensek 1. és 2. gyártási tétele esetén, ebben a sorrendben.
06322379001-08HU
27
Doc Rev. 9.0
Eltérő eredmények vizsgálata 454 szekvenálással ®
A cobas KRAS mutáció teszt reagensei esetén a KRAS 12/13-as és 61-es kodonjának mutációi vizsgálata során a specificitás ® 98,9%-ra javult mindkét gyártási tétel esetén egyaránt (18-19. táblázat), miután 454 szekvenálással feloldották a cobas KRAS mutáció teszt és a 2X bidirekcionális Sanger-fle DNS-szekvenálás közötti eltérő eredményeket. ®
A cobas KRAS mutáció teszt specificitásában a 454 szekvenálást követően beállt javulás elsősorban annak volt betudható, hogy a 454 szekvenálás olyan KRAS mutációkat is észlel, amiket a Sanger-féle szekvenálás nem, ugyanis utóbbi szenzitivitása az előbbinél alacsonyabb. Keresztreakció a tüdőben előforduló mikroorganizmusokkall ®
A cobas KRAS mutáció teszt keresztreaktivitását az alábbi, a tüdőben előforduló mikroorganizmusokra vonatkoztatott vizsgálatok során értékelték. A keresztreakciót úgy is vizsgálták, hogy meghatározták, hogy a mikroorganizmusok jelenléte zavarja-e a KRAS 12-es, 13-as és 61-es kodonjainak mutációmeghatározását. ®
Az alábbi tüdőben előforduló mikroorganizmusokat vizsgálva, azok nem keresztreagáltak a cobas KRAS mutáció teszt során, 6 amikor a szövetlízis lépésben 1 x 10 telepképző egység mennyiségben hozzáadták őket 5-5 KRAS 12-es, 13-as és 61-es vad típusú KRAS mintához: 1. Streptococcus pneumoniae 2. Haemophilus influenzae A vizsgált mikroorganizmusok ugyancsak nem mutattak zavaró hatást a KRAS 12-es (3 minta), 13-as (1 minta) vagy 61-es 6 (1 minta) kodon mutációinak kimutatásakor, amikor a szövetlízis lépésben 1 x 10 telepképző egység mennyiségben hozzáadták őket a 20. táblázatban felsorolt mennyiségekben KRAS mutációt tartalmazó mintákhoz. 20. táblázat A minták mutációs aránya a tüdőben előforduló kórokozók zavaró hatásának vizsgálata során
1 2 3
Mutációs állapot 12-es kodon 12-es kodon 12-es kodon
%-os mutáció 454 szekvenálással 15,3 32,3 32,5
4 5
13-as kodon 61-es kodon
13,4 32,6
Minta #
Interferencia 30
Trigliceridek (≤ 37 mM, CLSI által javasolt magas koncentráció ), hemoglobin (≤ 2 mg/ml, CLSI által javasolt magas 30 ® koncentráció ) és ≤ 80% nekrotikus szövet vizsgálatakor azok nem mutattak zavaró hatást a cobas KRAS mutáció teszt során, amikor a potenciális zavaró anyagot hozzáadták a lízis lépéshez a minta-előkészítés folyamán. Állékonyság ®
A cobas KRAS mutáció teszt állékonyságát a 12-es, 13-as és 61-es kodonokon mutáns nem-kissejtes tüdőrák FFPEszövetminták segítségével határozták meg. ®
A genomi DNS-t minden egyes metszetből a cobas DNS minta-előkészítő készlet segítségével extrahálták. Az extrahált genomikus DNS egyetlen replikáját 100 metszetnél 12-es kodonra, 102-nél 13-as kodonra, 100-nál pedig 61-es kodonra ® tesztelték. Tizennégy különböző futás ment le a cobas KRAS mutáció teszttel. Mind a száz 12-es és 61-es kodonon mutált minta replikája “Mutation Detected” eredményt adott. A 13-as kodonon mutált minták közül száz “Mutation Detected” eredményt ® adott, egy replika “Mutation Not Detected”, egy pedig nem valós (“Invalid”) eredményt adott cobas KRAS mutáció teszttel. Összességében az álnegatív minták aránya 0,7% (2/302).
06322379001-08HU
28
Doc Rev. 9.0
Reprodukálhatóság ®
A cobas KRAS mutáció teszt reprodukálhatóságát nyolc nem-kissejtes tüdőrák FFPE-szövetminta segítségével értékelték. A minták jellemzőit a 21. táblázat ismerteti. A mintákat két-két párhuzamos mintaként vizsgálta két vizsgáló két különböző reagenstétel és négy cobas z 480 analizátor segítségével 4 napon keresztül (n=32/minta). 21. táblázat ® cobas KRAS mutáció teszt reprodukálhatóság Mintaszám
KRAS mutációs státusz
Mutációs arány
Mutation Detected (n=32)
Mutation Not Detected
Megfelelési arány
1
12-es kodon
15,3%
32
0
100%
2
12-es kodon
17,5%
32
0
100%
3
13-as kodon
13,3%
32
0
100%
4
13-as kodon
27,8%
32
0
100%
5
61-es kodon
14,1%
32
0
100%
6
61-es kodon
32,6%
32
0
100%
7
Vad típus
-
0
32
100%
8
Vad típus
-
0
32
100%
®
A cobas KRAS mutáció tesztnek a vizsgálati napokra, mintákra, ismétlésekre, vizsgáló személyekre és reagenstételekre számított kombinált reprodukálhatósága 100% (256/256) volt.
06322379001-08HU
29
Doc Rev. 9.0
HIVATKOZÁSOK 1. Shankaran V, Obel J, Benson III AB. Predicting response to EGFR inhibitors in metastatic colorectal cancer: current practice and future directions. The Oncologist 2010 15:157-67. 2. Samowitz WS, Curtin K, Schaffer D, et al. Relationship of Ki-ras mutations in colon cancers to tumor location, stage, and survival: a population-based study. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2000 Nov 9(11):1193-7. 3. Andreyev HJ, Norman AR, Cunningham D, et al. Kirsten ras mutations in patients with colorectal cancer: the 'RASCAL II' study. Br J Cancer 2001 Sep 1;85(5):692-6. H
4. Der CJ, Finkel T, Cooper GM. Biological and biochemical properties of human ras genes mutated at codon 61. Cell 1986 Jan 17; 44:167-176. 5. Loupakis F, Ruzzo A, Cremolini C, et al. KRAS codon 61, 146 and BRAF mutations predict resistance to cetuximab plus irinotecan in KRAS codon 12 and 13 wild-type metastatic colorectal cancer. Br J Cancer 2009 Aug 18;101(4):715-21. 6. De Roock W, Claes B, Bernasconi D. et al. Effects of KRAS, BRAF, NRAS, and PIK3CA mutations on the efficacy of cetuximab plus chemotherapy in chemotherapy-refractory metastatic colorectal cancer: a retrospective consortium analysis. Lancet Oncology, 2010 Aug 11(8):753-62. 7. Siena S, Sartore-Bianchi A, Di Nicolantonio F, et al. Biomarkers predicting clinical outcome of epidermal growth factor receptor-targeted therapy in metastatic colorectal cancer. J Natl Cancer Inst 2009 Oct 7;101(19):1308-24. 8. Bokemeyer C, Bondarenko I, Makhson A, et al. Fluorouracil, leucovorin, and oxaliplatin with and without cetuximab in the first-line treatment of metastatic colorectal cancer. J Clin Oncol 2009 Feb 10;27(5):663-71. 9. Tol J, Koopman M, Cats A, et al. Chemotherapy, bevacizumab, and cetuximab in metastatic colorectal cancer. N Engl J Med 2009 Feb 5;360(6):563-72. 10. Lièvre A, Bachet JB, Le Corre D, et al. KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer. Cancer Res 2006 Apr 15;66(8):3992-5. 11. Benvenuti S, Sartore-Bianchi A, Di Nicolantonio F, et al. Oncogenic activation of the RAS/RAF signaling pathway impairs the response of metastatic colorectal cancers to anti-epidermal growth factor receptor antibody therapies. Cancer Res 2007 Mar 15;67(6):2643-8. 12. Amado RG, Wolf M, Peeters M, et al. Wild-type KRAS is required for panitumumab efficacy in patients with metastatic colorectal cancer. J Clin Oncol 2008 Apr 1;26(10):1626-34. 13. Karapetis CS, Khambata-Ford S, Jonker DJ, et al. K-ras mutations and benefit from cetuximab in advanced colorectal cancer. N Engl J Med 2008 Oct 23;359(17):1757-65. 14. Douillard J-Y, Siena S, Cassidy J et al. randomized, Phase III trial of panitumumab with infusional fluorouracil, leucovin, and Oxaliplatin (FOXFOX4) versus FOLFOX4 alone as first-line treatment in patients with previously untreated metastatic colorectal cancer: The PRIME Study. J Clin Oncol 2010 28:4697-4705. 15. Allegra CJ, Jessup JM, Somerfield MR, et al. American Society of Clinical Oncology provisional clinical opinion: testing for KRAS gene mutations in patients with metastatic colorectal carcinoma to predict response to anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody therapy. J Clin Oncol 2009 Apr 20;27(12):2091-6. 16. National Comprehensive Cancer Network. NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology. Colon cancer, 2010, v.2. 17. Van Cutsem E, Oliveira J; ESMO Guidelines Working Group. Advanced colorectal cancer: ESMO clinical recommendations for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol 2009 May;20 Suppl 4:61-3. 18. Food and Drug Administration. Class labeling changes to anti-EGFR monoclonal antibodies, cetuximab (Erbitux) and panitumumab (Vectibix): KRAS mutations. http://www.fda.gov/AboutFDA/CentersOffices/ CDER/ucml172905.htm. 19. European Medicines Agency: Committee for Medicinal Products for Human Use post-authorisation summary of positive opinion for Erbitux. http://www.emea.europa.eu/pdfs/human Erbitux_28040208en.pdf. 20. Karachaliou, N, Mayo, C, Costa, C. et al. KRAS Mutations in Lung Cancer. Clinical Lung Cancer, (In press) 21. Mascaux, C, Lannino, N, Martin, B. et al. The role of RAS oncogene in survival of patients with lung cancer: a systematic review of the literature with meta-analysis. British Journal of Cancer (2005) 92, 131 – 139. 22. Shepherd, F, Bourredjem, A, Brambilla, E. et al. Prognostic and predictive effects of KRAS mutation subtype in completely resected non-small cell lung cancer (NSCLC): A LACE-bio study. J Clin Oncol 30, 2012 (suppl; abstr 7007) 23. Mao, C, Qiub, L, Liao R. et al. KRAS mutations and resistance to EGFR-TKIs treatment in patients with non-small cell lung cancer: A meta-analysis of 22 studies. Lung Cancer 69 (2010) 272–278 24. Riely, G, Politi, K, Vincent, A. et al. Update on Epidermal Growth Factor Receptor Mutations in Non -Small Cell Lung Cancer. Clin Cancer Res 2006;12:7232-7241. 25. Longo, M.C., Berninger, M.S. and Hartley, J.L. 1990. Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions. Gene. 93:125-128. 06322379001-08HU
30
Doc Rev. 9.0
26. Chosewood, L.C. and Wilson, D.E. Biosafety and Microbiological and Biomedical Laboratories. HHS Publication Fifth # edition.(CDC) 21-1112. 2009. 27. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Protection of Laboratory Workers from Occupationally Acquired Infections. Approved Guideline-Third Edition. CLSI Document M29-A3 Villanova, PA:CLSI, 2005. 28. International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations, 52nd Edition. 2011. 29. Catalogue of Somatic Mutations in Cancer (COSMIC), 2011, v.51, http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/. 30. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) EP7-A2, Interference Testing in Clinical Chemistry; Approved Guidelines – Second Edition, Appendix D 2005.
06322379001-08HU
31
Doc Rev. 9.0
Dokumentum verzióinformációi Doc Rev. 8.0 04/2015
Az egész dokumentumban frissítettük az oligo mixekhez kapcsolódó terminológiát. Eltávolítottuk a veszély szimbólumokat, kulcsszavakat és kódokat a REAGENSEK részből. GTIN szimbólum és leírás hozzáadása a harmonizált szimbólumoldalon. Esetleges kérdésével forduljon a Roche helyi képviselőjéhez.
Doc Rev. 9.0 01/2016
A KRAS MIX módosított összetételében többé nem szerepel a 0,1%-os ProClin® 300 konzerválószer. Frissített leírások a használati utasítás végén a harmonizált szimbólumok oldalán. Esetleges kérdésével forduljon a Roche helyi képviselőjéhez.
06322379001-08HU
32
Doc Rev. 9.0
Készült az Amerikai Egyesült Államokban Roche Diagnostics GmbH Sandhofer Strasse 116 68305 Mannheim, Germany
Roche Diagnostics (Schweiz) AG Industriestrasse 7 6343 Rotkreuz, Switzerland
Roche Diagnostics 2, Avenue du Vercors 38240 Meylan, France
Roche Diagnostics GmbH Sandhofer Strasse 116 68305 Mannheim, Germany
Distributore in Italia: Roche Diagnostics S.p.A. Viale G. B. Stucchi 110 20052 Monza, Milano, Italy
Distributed by
Roche Diagnostics, SL Avda. Generalitat, 171-173 E-08174 Sant Cugat del Vallès Barcelona, Spain
Distribuidor em Portugal: Roche Sistemas de Diagnósticos Lda. Estrada Nacional, 249-1 2720-413 Amadora, Portugal
Roche Diagnostics 201, boulevard Armand-Frappier H7V 4A2 Laval, Québec, Canada (For Technical Assistance call: Pour toute assistance technique, appeler le: 1-877-273-3433)
Roche Diagnostica Brasil Ltda. Av. Engenheiro Billings, 1729 Jaguaré, Building 10 05321-010 São Paulo, SP Brazil
Védjegyek és szabadalmak Lásd: http://www.roche-diagnostics.us/patents ©2016 Roche Molecular Systems, Inc. 01/2016 Doc Rev. 9.0
06322379001-08HU
06322379001-08
33
Doc Rev. 9.0
A következő szimbólumok használatosak a Roche PCR diagnosztikai termékek jelölésére.
Segédszoftver
In vitro diagnosztikai felhasználásra
Meghatalmazott képviselő az Európai Közösségben
Csak IVD teljesítmény értékelésre
Vonalkód adatlap
Megadott tartomány alsó határa
Lotszám
Gyártó
Biológiai veszély
Sötétben tárolandó
Katalógusszám
Tárolási hőmérséklet
Olvassa el a használati útmutatót
Vizsgálatdefiníciós fájl
Tartalma
vizsgálathoz elegendő
Megadott tartomány felső határa
A csomag tartalma
Lejárat dátuma
Forgalmazó
Ez a termék teljesíti az in vitro orvosi diagnosztikai eszközökről szóló 98/79/EK irányelv előírásait.
Globális kereskedelmi cikkszám
Felhasználói technikai segítségnyújtás az Egyesült Államokban 1-800-526-1247
06322379001-08HU
34
Doc Rev. 9.0
