cobas® EGFR Mutation Test IN VITRO DIAGNOSZTIKAI CÉLRA. ®
cobas DNA Sample Preparation Kit cobas® EGFR Mutation Test
DNA SP
24 Tests
P/N: 05985536190
EGFR
24 Tests
P/N: 06471463190
MEGJEGYZÉS: A termék megvásárlása a vevő számára nukleinsav-szekvenciák amplifikálását és kimutatását teszi lehetővé polimeráz láncreakció (PCR) és rokon eljárások révén humán in vitro diagnosztikai célból. A termék megvásárlásával a vevő a konkrét használati jogon túl semmilyen általános szabadalmi jogot vagy egyéb engedélyt nem kap. FELHASZNÁLÁS MÓDJA A cobas® EGFR mutáció teszt egy valós idejű PCR-vizsgálat az epidermális növekedési faktor receptor [epidermal growth factor receptor (EGFR)] gén 18-as, 19-es, 20-as és 21-es exonjában előforduló mutációk kvalitatív kimutatására és azonosítására formalin-fixált, paraffinba ágyazott [formalin-fixed paraffin-embedded (FFPET)] humán nem-kissejtes tüdőrák [non-small cell lung cancer (NSCLC)] tumorszövetből származó DNS-ben. A vizsgálat célja az olyan előrehaladott NSCLCben szenvedő betegek azonosítása, akikben a daganat mutációt hordoz az EGFR gén 18-as, 19-es, 20-as és 21-es exonjában, és így a betegek kiválasztása az EGFR-t célzó kismolekulájú tirozin-kináz inhibitor (TKI) terápiára. A minta manuális előkészítése a cobas® DNS minta-előkészítő készlet segítségével, az automatikus amplifikálás és kimutatás pedig a cobas z 480 analizátor segítségével történik. A VIZSGÁLAT ÖSSZEGZÉSE ÉS MAGYARÁZATA Az EGFR-t kódoló gén aktiváló mutációi elsősorban NSCLC-ben fordulnak elő, és az EGFR fehérje kináz-aktivitásának konstitutív aktiválódását okozzák, és így szerepük van a tumorképződés folyamatában.1 Ilyen mutációk az NSCLC esetek mintegy 10%-ában fordulnak elő. Ugyanakkor ezek a mutációk leggyakrabban, de nem kizárólagosan ázsiai származású nemdohányzó, illetve könnyű dohányos adenokarcinómát mutató szövettanú nőbetegekben fordulnak elő.2 Klinikai adatok azt mutatják, hogy az olyan előrehaladott NSCLC tumorban szenvedő betegek, akik aktiváló EGFR mutációt hordoznak (amely leggyakrabban 19-es exon deléció vagy 21-es exon L858R pontmutáció), magas válaszarányt és hosszú progressziómentes túlélést (PFS, progression-free survival) mutatnak mind első, mind másodvonalbeli terápiaként alkalmazott anti-EGFR TKI kezelést követően.3-5 Más, kevésbé gyakori EGFR mutációk, mint pl. a 18-as exon G719X szubsztitúció és a 21-es exon L861Q pontmutáció ugyancsak javítják az anti-EGFR kezelésre adott válaszarányt.6-8 Az anti-EGFR TKI kezelésben részesülő EGFR-mutáns NSCLC tumoros betegek átlagos túlélése jelenleg mintegy 2 év.9 Az aktuális klinikai irányelvek ajánlása szerint előrehaladott EGFR-mutáns NSCLC esetén mérlegelni kell az anti-EGFR TKI kezelés, mint első vonalbeli terápia alkalmazását.10,11 Az EGFR-mutáns NSCLC betegek többségénél az anti-EGFR TKI kezelés után előbb-utóbb progresszív betegség alakul ki. Ezeknek a progresszív eseteknek mintegy felében azonosítható az EGFR génben másodlagos rezisztenciamutáció, leggyakrabban a 20-as exon T790M mutáció kialakulása.12 Néhány betegben ilyen másodlagos rezisztenciamutáció már az anti-EGFR TKI kezelés előtt kimutatható a tumorban. Bár ezek a TKI-naív esetek is magas válaszarányt mutatnak a kezelés során, úgy tűnik, hogy az ilyen betegeknek szignifikánsan rövidebb a progressziómentes túlélésük azoknál, akikben a tumor nem tartalmaz ilyen másodlagos mutációt.6,13 AZ ELJÁRÁS ALAPELVEI A cobas® EGFR mutáció teszt két fő lépésből épül fel: (1) manuális minta-előkészítés genom DNS izolálására FFPET-ből; és (2) target DNS PCR-amplifikálása és kimutatása komplementer primerpárok és fluoreszcens festékkel jelölt oligonukleotid próbák segítségével. A tesztet a következő mutációk kimutatására tervezték: 18-as exon G719X (G719A, G719C és G719S), 19-es exon deléciók és komplex mutációk, 20-as exon S768I, T790M és inzerciók, valamint 21-es exon L858R. A mutációk kimutatása PCR analízissel történik a cobas z 480 analizátor segítségével. A futtatás érvényességét az biztosítja, hogy minden futtatás tartalmaz egy mutáns kontrollt és egy negatív kontrollt.
A Dokumentum verzióinformációi rész a dokumentum végén található. 06356583001-01HU 1
Doc Rev. 1.0
Minta előkészítése Az FFPE-szövetminták feldolgozása és a genomi DNS izolálása a cobas® DNS minta-előkészítő készlet segítségével történik egy üvegszálakhoz való nukleinsav kötődésen alapuló generikus manuális minta-előkészítés révén. Az FFPE-szövetminta egy deparaffinált 5 µm-es metszetét magas hőmérsékleten való inkubálás során lizálják egy proteáz és egy olyan chaotrop lízis/kötő puffer segítségével, amely szabaddá teszi a nukleinsavakat, és megvédi a szabaddá tett genomi DNS-t a DNázoktól. Ezt követően izopropanol lesz a líziskeverékhez adva, majd egy üvegszálas szűrőbetétes oszlopon az egész lecentrifugálásra kerül. A centrifugálás során a genomi DNS az üvegszálas szűrő felületéhez kötődik. A nem kötődött anyagok, mint sók, fehérjék és egyéb sejt eredetű szennyezések a centrifugálás révén eltávolításra kerülnek. Az adszorbeált nukleinsavak mosása, majd eluálása egy vizes oldattal történik. A genomi DNS mennyiségét spektrofotometriásan határozzák meg, és egy fix koncentrációra állítják be, amelyet aztán az amplifikációs/kimutatási keverékhez kell adni. A target DNS amplifikálását és kimutatását azután a cobas z 480 analizátor végzi el a cobas® EGFR mutáció teszt készletben biztosított amplifikálási és kimutatási reagensek segítségével. PCR-amplifikálás A targetszekvencia kiválasztása A cobas® EGFR mutáció teszt készlet olyan primereket alkalmaz, amelyek specifikus szekvenciákat határoznak meg az egyes targetmutációkra. A 18-as exon G719X mutációk esetén 104 és 106 bázispár hosszúságú, a 19-es exon deléció mutációk esetén 125 és 141 bázipár hosszúságú, a 20-as exon S768I mutáció esetén 133, a T790M mutáció esetén 118 és a inzerciók esetén 125 és 143 bázispár hosszúságú, a 21-es exon L858R mutáció esetén 138 bázispár hosszúságú a target szekvencia. Az amplifikálás az EGFR génnek csak a primerek közötti régiójában zajlik; a teljes EGFR gén nem amplifikálódik. Targetamplifikálás A Thermus species Z05-AS1 DNS polimeráz egy származékát alkalmazza a rendszer a targetamplifikáláshoz. Először a genomi DNS denaturálása és a primer targetszekvenciák felszabadítása végett a PCR reakcióelegyet fel kell melegíteni. Az elegy kihűlésével az upstream és downstream primerek a target DNS-szekvenciákhoz kapcsolódnak. A Z05 DNS-polimeráz kétértékű fémion és feleslegben levő dNTP-k jelenlétében a kapcsolódott primer folytatásaként egy második DNS-szálat szintetizál. Ezzel a PCR első ciklusa véget ért, létrehozva az EGFR gén target bázispár régióit tartalmazó kettős szálú DNSmásolatot. Ez a folyamat számos cikluson keresztül ismétlődik, és az amplikon DNS mennyisége minden ciklus során megduplázódik. Automatizált valós idejű mutáció kimutatás A cobas® EGFR mutáció teszt valós idejű PCR-technológiát alkalmaz. Minden egyes target-specifikus oligonukleotid próba a reakcióban egy jelzőként szolgáló fluoreszcens festékkel van jelölve, valamint egy blokkoló molekulával, amely az érintetlen próbában elnyeli (blokkolja) a jelölő festék fluoreszcens emisszióját. Az amplifikálás minden egyes ciklusa során a komplementer próba az amplikon egyszálú DNS-szekvenciájához kötődik, majd az 5', 3'-nukleáz aktivitású Z05-AS1 DNSpolimeráz hasítja. Amikor a jelzőfestéktől a blokkolót a nukleáz-aktivitás elválasztja, akkor a jelzőfesték a megfelelő spektrumú fénnyel gerjesztve jellemző hullámhosszú fluoreszcens sugárzást bocsát ki, amely mérhető. A targetmutációk jelöléséhez a teszt négy különböző jelzőfestéket alkalmaz. A hat EGFR szekvencia amplifikálásának kimutatása három egymástól független reakcióban történik a négy jellemző hullámhosszon, adott optikai csatornákban való fluoreszcencia mérés révén. Szelektív amplifikálás A mintában található targetnukleinsav szelektív amplifikálását a cobas® EGFR mutáció teszt az AmpErase® (uracil-Nglikoziláz) enzim és dezoxiuridin-trifoszfát (dUTP) használatával hajtja végre15. Az AmpErase enzim felismeri és katalizálja a dezoxiuridin tartalmú DNS-szálak megsemmisítését, a timidint tartalmazó DNS-ét viszont nem. A dezoxiuridin a természetes DNS-ben nincs jelen, ugyanakkor az amplikonokban mindig megtalálható, miután a master mix reagens a nukleotid-trifoszfátok egyikeként dezoxitimidin-trifoszfát helyett dUTP-t használ; tehát csak az amplikonok tartalmaznak dezoxiuridint. A dezoxiuridinnak köszönhetően a szennyező amplikont az AmpErase enzim még a target DNS amplifikálását megelőzően lebontja. A master mix reagensben lévő AmpErase enzim katalizálja a dezoxiuridint tartalmazó DNS hasítását a dezoxiuridin-csoportoknál úgy, hogy a dezoxiribózlánc felnyílását okozza a C1 helyen. Az első hevítési lépésben lúgos pH-n az amplikon DNS-lánc eltörik a dezoxiuridin helyén, tehát a DNS nem lesz amplifikálható. Az AmpErase enzim 55 °C felett, azaz a hevítési lépések során inaktív, azaz nem bontja le a targetamplikont. A cobas® EGFR mutáció teszt legalább 103 kópia dezoxiuridint tartalmazó EGFR mutáns amplikont inaktivál PCR ciklusonként.
06356583001-01HU
2
Doc Rev. 1.0
REAGENSEK cobas® DNA Sample Preparation Kit cobas® DNS minta-előkészítő készlet (P/N: 05985536190) DNA TLB (DNS szövet lízispuffer) trisz-HCl puffer kálium-klorid 0,04% EDTA 0,1% Triton X-100 0,09% nátrium-azid PK (proteináz K) proteináz K (liofilizált) Xn proteináz K
DNA SP
1 x 10 ml
1 x 100 mg
Ártalmas DNA PBB (DNS paraffin kötő puffer) trisz-HCl puffer 49,6% guanidin-hidroklorid 0,05% karbamid 17,3% Triton X-100 Xn 49,6% (w/w) guanidin HCl
1 x 10 ml
Ártalmas WB I (DNS mosópuffer I) trisz-HCl puffer 64% guanidin-hidroklorid Xn 64% (w/w) guanidin HCl
1 x 25 ml
Ártalmas WB II (DNS mosópuffer II) trisz-HCl puffer nátrium-klorid DNA EB (DNS eluáló puffer) trisz-HCl puffer 0,09% nátrium-azid FT (szűrőcsövek kupakkal) CT (gyűjtőcsövek)
06356583001-01HU
24 teszt
1 x 12,5 ml
1 x 6 ml
1 x 25 db 3 x 25 db
3
Doc Rev. 1.0
cobas® EGFR Mutation Test EGFR (P/N: 06471463190) EGFR MMX-1 (EGFR master mix 1) trisz puffer kálium-klorid glicerin EDTA Tween 20 3,13% dimetil-szulfoxid 0,09% nátrium-azid < 0,10% dNTP-k < 0,01% Z05-AS1 DNS-polimeráz (mikrobiális) < 0,01% AmpErase (uracil-N-glikoziláz) enzim (mikrobiális) < 0,01% aptamer < 0,01% upstream és downstream EGFR primerek < 0,01% fluoreszcensen jelölt EGFR próbák EGFR MMX-2 (EGFR master mix 2) trisz puffer kálium-klorid glicerin EDTA Tween 20 3,13% dimetil-szulfoxid 0,09% nátrium-azid < 0,10% dNTP-k < 0,01% Z05-AS1 DNS-polimeráz (mikrobiális) < 0,01% AmpErase (uracil-N-glikoziláz) enzim (mikrobiális) < 0,01% aptamer < 0,01% upstream és downstream EGFR primerek < 0,01% fluoreszcensen jelölt EGFR próbák EGFR MMX-3 (EGFR master mix 3) trisz puffer kálium-klorid glicerin EDTA Tween 20 3,13% dimetil-szulfoxid 0,09% nátrium-azid < 0,10% dNTP-k < 0,01% Z05-AS1 DNS-polimeráz (mikrobiális) < 0,01% AmpErase (uracil-N-glikoziláz) enzim (mikrobiális) < 0,01% aptamer < 0,01% upstream és downstream EGFR primerek < 0,01% fluoreszcensen jelölt EGFR próbák MGAC (magnézium-acetát) magnézium-acetát 0,09% nátrium-azid EGFR MC (EGFR mutáns kontroll) trisz puffer EDTA poli-rA RNS (szintetikus) 0,05% nátrium-azid < 0,1% plazmid DNS, amely EGFR 18-as, 19-es, 20-as és 21-es exon szekvenciákat tartalmaz (mikrobiális) < 0,1% EGFR vad típus DNS (sejtkultúra) DNA SD (DNS mintaoldószer) trisz-HCl puffer 0,09% nátrium-azid
06356583001-01HU
4
24 teszt 2 x 0,4 ml
2 x 0,4 ml
2 x 0,4 ml
6 x 0,2 ml
6 x 0,1 ml
2 x 3,5 mL
Doc Rev. 1.0
FIGYELMEZTETÉSEK ÉS ÓVINTÉZKEDÉSEK A. IN VITRO DIAGNOSZTIKAI CÉLRA. B. Ez a teszt kizárólag FFPET NSCLC minták vizsgálatára alkalmas. C. Ne pipettázzon szájjal. D. Ne egyen, igyon vagy dohányozzon a laboratórium területén. E. Kerülje a reagensek mikrobiális és DNS-kontaminációját. F. A fel nem használt reagensek és hulladék kezelésének összhangban kell lennie a megfelelő országos, szövetségi, állami és helyi szabályozásokkal. G. Lejárati idő után ne használjon fel készletet. H. Ne öntsön össze különböző készletekből vagy gyártási tételekből származó reagenseket. I.
Viseljen kesztyűt, és a minták és reagensek kezelése között váltson kesztyűt, hogy megakadályozza a kontaminációt.
J.
Hogy a master mix (MMX) munkareagens DNS mintával való kontaminálását elkerülje, az amplifikálást és kimutatást elkülönítve kell végezni a DNS-izolálástól. Az amplifikálási és kimutatási munkaterületet alaposan meg kell tisztítani az MMX munkareagens elkészítése előtt. A megfelelő tisztításhoz valamennyi felületet, az állványokat és pipettorokat is beleértve, gondosan le kell törölni 0,5%-os nátrium-hipoklorit oldattal, majd 70%-os etanol oldattal.
K. A DNA PBB és WB I pufferek guanidin-hidrokloridot tartalmaznak. Ha ilyen puffert tartalmazó folyadék ömlik ki, megfelelő laboratóriumi tisztítószerrel és vízzel tisztítsa fel. Ha potenciálisan fertőző ágenst tartalmazó folyadék ömlik ki, először laboratóriumi tisztítószerrel és vízzel, majd 0,5%-os nátrium-hipoklorit oldattal tisztítsa meg az érintett területet*. Ha a kiömlés a cobas z 480 analizátorra történik, kövesse a cobas z 480 analizátor felhasználói kézikönyvének utasításait. *Megjegyzés: A kereskedelemben kapható háztartási fehérítő rendszerint 5,25%-ban tartalmaz nátrium-hipokloritot. Az 1:10 arányban hígított háztartási fehérítő megfelel 0,5%-os nátrium-hipoklorit oldatnak. L. A mintákat fertőzőként kell kezelni a Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories16 és az CLSI Document M29-A317 előírásoknak megfelelő biztonságos laboratóriumi eljárásokat alkalmazva. M. A DNA TLB és DNA PBB pufferek Triton X-100-at tartalmaznak, amely nyálkahártya-irritáló hatású. Kerülje a szemmel, bőrrel és nyálkahártyával való érintkezést. N. A DNA TLB, DNA EB, MGAC, EGFR MMX-1, EGFR MMX-2, EGFR MMX-3, EGFR MC és DNA SD reagensek nátriumazidot tartalmaznak. A nátrium-azid ólom- és rézcsövekkel erősen robbanékony fém-azidokat képezve reakcióba léphet. Amikor nátrium-azid tartalmú oldatot önt ki a laboratóriumi mosogatóba, az azidlerakódás megakadályozására nagy mennyiségű hideg vízzel öblítse ki a lefolyót. O. A xilol veszélyes vegyszer, és csak vegyifülke alatt szabad használni. Kiöntése vegyszergyűjtőbe történjen a megfelelő helyi, állami és szövetségi szabályozás szerint. P. Viseljen szemvédőt, védőruhát és egyszer használatos védőkesztyűt minden reagens kezelése közben. Ezen anyagok bőrrel, szemmel és nyálkahártyával való érintkezése kerülendő. Ha mégis előfordul érintkezés, azonnal öblítse le bő vízzel. Ellenkező esetben égető érzés jelentkezhet. A reagenseket kiömlés esetén szárazra törlés előtt hígítsa vízzel. Q. Az egyszer használatos anyagokat csak egyszer szabad felhasználni. Ne használja újra azokat. R. A lejárati idő után ne használjon fel egyszer használatos anyagokat. S. Ne használjon nátrium-hipoklorit oldatot (fehérítőszer) a cobas z 480 analizátor tisztításához. A cobas z 480 analizátort a cobas z 480 analizátor felhasználói kézikönyvében leírt eljárásoknak megfelelően kell tisztítani. T. A cobas z 480 analizátor fertőzési kockázatának csökkentésére vonatkozó további figyelmeztetések, óvintézkedések és eljárások tekintetében tanulmányozza a cobas z 480 analizátor felhasználói kézikönyvét. U. Steril, egyszer használatos pipetták és DNáz mentes pipettorhegyek használata javasolt. TÁROLÁSI ÉS KEZELÉSI KÖVETELMÉNYEK A. A PK reagens kivételével a reagenseket lefagyasztani tilos. B. A DNA TLB, DNA PBB, WB I, WB II, DNA EB, PK, FT és CT reagenseket 15 °C és 30 °C között tárolja. Felbontást követően a DNA TLB, DNA PBB, WB I, WB II, DNA EB és PK reagensek 8 felhasználásig 90 napon át, illetve a lejárati dátumig stabilak, amelyik előbb következik. C. Miután a PK enzimet steril, nukleázmentes vízben feloldotta, a fel nem használt PK oldatot tárolja 450 µl-es részletekben -20 °C-on. Feloldás után a PK enzimet fel kell használni 90 napon belül, illetve a lejárati dátumig, amelyik előbb következik. D. Abszolút etanol hozzáadását követően a WB I és WB II puffereket tárolja 15 °C és 30 °C között. Ezek a munkaoldatok 90 napig vagy a lejárati dátumig stabilak, amelyik előbb következik.
06356583001-01HU
5
Doc Rev. 1.0
E. Az MGAC, EGFR MMX-1, EGFR MMX-2, EGFR MMX-3, EGFR MC és DNA SD reagenseket tárolja 2 °C és 8 °C között. Felbontást követően ezek a reagensek 4 felhasználásig 90 napon át, illetve a lejárati dátumig stabilak, amelyik előbb következik. F. Az EGFR MMX-1, EGFR MMX-2, EGFR MMX-3 és (az MGAC oldat EGFR MMX-1 vagy EGFR MMX-2 vagy EGFR MMX-3 reagensekhez való hozzáadásával készült) MMX munkareagens fénytől védve tartandó. G. Az MMX munkareagenst tárolja sötétben 2 °C és 8 °C között. Az előkészített mintákat és kontrollokat az MMX munkareagenshez annak elkészítésétől számított 1 órán belül hozzá kell adni. H. A feldolgozott minták (extrahált DNS) 15°C és 30 °C között 7 napig, 2 °C és 8 °C között 60 napig, -15 °C és -20 °C között 60 napig stabilak. A feldolgozott minták 3 fagyasztás/olvasztás után is 60 napig stabilak -15°C és -25 °C között. I.
Az amplifikálást a feldolgozott mintáknak és kontrolloknak az (MGAC oldat EGFR MMX-1 vagy EGFR MMX-2 vagy EGFR MMX-3 reagensekhez való hozzáadásával készült) MMX munkareagenshez való hozzáadását követően 1 órán belül meg kell kezdeni.
A KÉSZLET TARTALMA A. cobas® DNA Sample Preparation Kit cobas® DNS minta-előkészítő készlet (P/N: 05985536190)
DNA SP
24 teszt
EGFR
24 teszt
DNA TLB (DNS szövet lízispuffer) PK (proteináz K) DNA PBB (DNS paraffin kötő puffer) WB I (DNS mosópuffer I) WB II (DNS mosópuffer II) DNA EB (DNS eluáló puffer) FT (szűrőcsövek kupakkal) CT (gyűjtőcsövek) B. cobas® EGFR Mutation Test (P/N: 06471463190) MGAC (magnézium-acetát) (sárga gombos kupak) EGFR MMX-1 (EGFR master mix 1) (fehér gombos kupak) EGFR MMX-2 (EGFR master mix 2) (arany gombos kupak) EGFR MMX-3 (EGFR master mix 3) (kék gombos kupak) EGFR MC (EGFR mutáns kontroll) (piros gombos kupak) DNA SD (DNS mintaoldószer)
06356583001-01HU
6
Doc Rev. 1.0
SZÜKSÉGES, DE NEM BIZTOSÍTOTT ANYAGOK • xilol (Sigma, kat.# 247642 vagy Fisher Scientific, kat.# X5-4 vagy ennek megfelelő) •
abszolút etanol (Sigma, kat.# E7023 vagy Fisher Scientific, kat.# BP2818-500 vagy ennek megfelelő)
•
izopropanol (Sigma, kat.# 190764 vagy Fisher Scientific, kat.# A451-1 vagy ennek megfelelő)
•
steril víz, nukleázmentes (Applied Biosystems PCR Grade Water, kat.# AM9937 vagy Thermo Scientific Molecular Biology Grade Water, kat.# SH-3053801 vagy ennek megfelelő)
•
steril, egyszer használatos szerológiai pipetták: 5 és 25 ml
•
cobas® 4800 rendszer mikrolemez (AD-lemez) és zárófólia (Roche P/N 05232724001)
•
cobas® 4800 zárófólia felhelyező (Roche P/N 04900383001)
•
állítható pipetták*: (10 µl, 20 µl, 200 µl és 1000 µl kapacitású), aeroszolbarrieres vagy pozitív kiszorításos DNáz mentes hegyekkel
•
pipetta segédeszköz (Drummond P/N: 4-000-100 vagy ekvivalens)
•
asztali mikrocentrifuga, 8 000 x g és 16 000-20 000 x g kapacitású (Eppendorf 5417C vagy ekvivalens)**
•
két (2) száraz fűtőblokk, amely képes a mikrocentrifuga csöveket 56 °C és 90 °C hőmérsékletre fűteni**
•
1,5 ml pattintókupakos mikrocentrifuga csövek, steril, RNáz/DNáz-mentes, PCR minőségű (Eppendorf, kat# 022363212)
•
nanodrop UV-Vis spektrofotométer (Thermo Scientific ND-1000 vagy ND-2000)**
•
vortex keverő**
•
mikrocentrifuga csőállványok
•
egyszer használatos kesztyűk, púdermentes
•
kalibrált hőmérők a száraz fűtőblokkokhoz**
•
vízfürdő**, 37 °C fenntartására képes
•
egyélű penge vagy hasonló
*
A pipettákat a gyártó utasításai szerint kell karbantartani, és pontosságuk a megadott térfogathoz képest 3%-on belül legyen. Aeroszolbarrieres vagy pozitív kiszorításos DNáz-mentes pipettahegyeket kell használni ott, ahol alapvető megelőzni a minta degradálódását és a keresztkontaminációt.
** Valamennyi felszerelést megfelelően karban kell tartani a gyártó utasításai szerint. Műszerezettség és szoftver • cobas z 480 analizátor •
cobas® 4800 SR2 rendszervezérlő-egység OSXP képpel
•
cobas® 4800 SR2 rendszerszoftver 2.0-s verzió
•
EGFR analízis csomag szoftver 1.0-s verzió
•
vonalkódolvasó ext USB
•
nyomtató HP P2055d
A MINTA LEVÉTELE, SZÁLLÍTÁSA ÉS TÁROLÁSA MEGJEGYZÉS: Valamennyi mintát fertőző ágensek átvitelére alkalmasként kell kezelni. A. Mintavétel Az NSCLC FFPE-szövetmintákat validálták a cobas® EGFR mutáció teszttel való használathoz. B. Mintaszállítás Az NSCLC FFPE-szövetminták 15 °C és 30 °C között szállíthatóak. Az FFPE-szövetminták szállításának meg kell felelnie a kóroki ágensek transzportjára vonatkozó országos, szövetségi, állami és helyi szabályozásnak.14 C. Mintatárolás Az NSCLC FFPE-szövetminták 15 °C és 30 °C között 12 hónapig tárolhatóak a szövettani mintavétel időpontja után. Tárgylemezre ragasztott 5 µm-es metszetek 15 °C és 30 °C között 30 napig tárolhatóak.
06356583001-01HU
7
Doc Rev. 1.0
HASZNÁLATI UTASÍTÁS MEGJEGYZÉS: Csak területenként legalább 10% tumorsejtet tartalmazó 5 µm vastagságú NSCLC FFPEszövetmetszetek használhatóak a cobas® EGFR mutáció teszttel. Területenként 10%-nál kevesebb tumort tartalmazó bármely mintából deparaffinálás után makrometszetet kell készíteni. MEGJEGYZÉS: A cobas z 480 analizátorra vonatkozó részletes használati útmutatásért tanulmányozza a cobas z 480 analizátor felhasználói kézikönyvét. MEGJEGYZÉS: A mikrocentrifuga csövek melegítésére képes száraz fűtőblokkokat be kell kapcsolni, és 56 °C-ra, illetve 90 °C-ra állítani. Futtatási mennyiség Egyetlen futtatás 1-30 mintát (plusz kontrollok) tartalmazhat 96 lyukú mikrolemezenként. Ha 24 mintánál többet futtat, akkor több cobas® EGFR mutáció teszt készletre lesz szüksége. A cobas® EGFR mutáció teszt elegendő reagenst tartalmaz 3 minta (plusz kontrollok) 8 futtatásához, készletenként maximum 24 mintához. Munkafolyamat A cobas® EGFR mutáció teszt folyamata két lépésből áll: manuális mintaelőkészítés a cobas® DNS minta-előkészítő készlet segítségével, amelyet a cobas z 480 analizátorral végzett amplifikálás/kimutatás követ a cobas® EGFR mutáció teszt készlet segítségével. Reagens-előkészítés A. Oldja fel a proteináz K-t (PK) úgy, hogy 4,5 ml steril, nukleázmentes (PCR minőségű) vizet mér a csőbe egy steril, egyszer használatos 5 ml-es szerológiai pipettával. A cső 5–10-szeri döntögetésével keverje össze az oldatot. Mérjen ki 450 µl-es részleteket a PK oldatból 1,5 ml-es pattintókupakos mikrocentrifuga csövekbe, és tárolja a csöveket -20 °C-on. Ha a proteináz K-t már korábban feloldotta és lefagyasztotta, akkor olvasszon fel elegendő mennyiségű csövet a futtatni kívánt minták feldolgozásához még a deparaffinálás előtt (70 µl PK oldat szükséges minden egyes mintához). B. Valamennyi tárolt oldatnak 15-30 °C-on tisztának kell lennie. Ha bármely reagensben csapadék van jelen, melegítse az oldatot 37 °C-os vízfürdőben, amíg a csapadék feloldódik. Ne használja, amíg minden csapadék fel nem oldódott. C. Készítsen DNS mosópuffer I (WB I) munkaoldatot úgy, hogy 15 ml abszolút etanolt mér a WB I flakonba. A flakon 5–10szeri döntögetésével keverje össze az oldatot. Jegyezze fel a flakon oldalára, hogy etanolt tartalmaz és a dátumot. Tárolja a WB I munkaoldatot 15 °C és 30 °C között. D. Készítsen DNS mosópuffer II (WB II) munkaoldatot úgy, hogy 50 ml abszolút etanolt mér a WB II flakonba. A flakon 5–10szeri döntögetésével keverje össze az oldatot. Jegyezze fel a flakon oldalára, hogy etanolt tartalmaz és a dátumot. Tárolja a WB II munkaoldatot 15 °C és 30 °C között. Tárgylemezre ragasztott FFPE-szövetmetszetek deparaffinálása MEGJEGYZÉS: A xilol veszélyes vegyszer. A deparaffinálás valamennyi lépését vegyszerfülke alatt kell végezni. Lásd: Figyelmeztetések és óvintézkedések. A. Helyezze a tárgylemezt 5 µm-es FFPE-szövetmetszettel egy edénybe, amelyben elegendő mennyiségű xilol van, hogy a szövetet ellepje; áztassa 5 percig. B. Tegye át a tárgylemezt egy edénybe, amelyben elegendő mennyiségű abszolút etanol van, hogy a szövetet ellepje; áztassa 5 percig. C. Vegye ki a tárgylemezt az etanolból, és hagyja levegőn, hogy a metszet teljesen megszáradjon (5-10 perc). D. Készítsen makrometszetet, ha a minta területenkén 10%-nál kevesebb tumort tartalmaz. E. Minden mintához címkézzen meg egy-egy 1,5 ml-es pattintókupakos csövet a minta azonosításához szükséges információval. F. Mérjen 180 µl DNA TLB puffert a 1,5 ml-es pattintókupakos mikrocentrifuga csőbe. G. Mérjen 70 µl PK oldatot a DNA TLB puffert tartalmazó pattintókupakos csőbe. H. Kaparja le a szövetet a tárgylemezről, és tegye a pattintókupakos csőbe. Merítse a szövetet a DNA TLB/PK elegybe. I.
Folytassa a DNS-izolálás műveletének A lépésével.
06356583001-01HU
8
Doc Rev. 1.0
Tárgylemezre nem ragasztott FFPE-szövetmetszetek deparaffinálása MEGJEGYZÉS: A xilol veszélyes vegyszer. A deparaffinálás valamennyi lépését vegyszerfülke alatt kell végezni. Lásd: Figyelmeztetések és óvintézkedések. MEGJEGYZÉS: Ha a minta területenként 10%-nál kevesebb tumort tartalmaz, a metszetet fel kell ragasztani tárgylemezre makrometszet készítéshez, és a “Tárgylemezre ragasztott FFPE-szövetmetszetek deparaffinálása” szakaszban részletezett eljárást kell követni. A. Helyezzen egy 5 mikronos FFPE-szövetmetszetet egy 1,5 ml-es pattintókupakos csőbe, amely el van látva a minta azonosításához szükséges információval. B. Mérjen 500 µl xilolt az FFPE-szövetmetszetet tartalmazó pattintókupakos csőbe. C. Vortexelje jól össze 10 másodpercig. D. Hagyja a csövet állni 5 percig 15 °C és 30 °C között. E. Adjon hozzá 500 µl abszolút etanolt, és vortexelje jól össze 10 másodpercig. F. Hagyja a csövet állni 5 percig 15 °C és 30 °C között. G. Centrifugázza a csövet 16 000-20 000 x g-n 2 percig. Távolítsa el a felülúszót anélkül, hogy az üledéket felzavarná. Dobja ki a felülúszót vegyszergyűjtőbe. H. Adjon hozzá 1 ml abszolút etanolt, és vortexelje 10 másodpercig. I.
Centrifugázza a csövet 16 000-20 000 x g-n 2 percig. Távolítsa el a felülúszót anélkül, hogy az üledéket felzavarná. Dobja ki a felülúszót vegyszergyűjtőbe.
MEGJEGYZÉS: Ha az üledék lebeg a maradék felülúszóban, akkor ismét centrifugázza 1 percig 16 000-20 000 x g-n. Távolítsa el a maradék felülúszót. J.
Szárítsa a szövetüledéket 10 percig 56 °C-os fűtőblokkban úgy, hogy a cső nyitva van.
MEGJEGYZÉS: Ellenőrizze, hogy az etanol teljesen elpárolgott és az üledék száraz, mielőtt folytatná a következő lépéssel. MEGJEGYZÉS: Szükség esetén a száraz üledék 2 °C és 8 °C között 24 óráig tárolható. K. Oldja fel újra a szövetüledéket 180 µl DNS szövet lízispufferben (DNA TLB). L. Adjon hozzá 70 µl PK oldatot. M. Folytassa a DNS-izolálás műveletének A lépésével. MINTA-ELŐKÉSZÍTÉS DNS-izolálás művelete MEGJEGYZÉS: A mintá(ka)t negatív kontrollal együtt dolgozza fel. A negatív kontrollt úgy készítse el, hogy 180 µl DNS szövet lízispuffert (DNA TLB) és 70 µl PK oldatot összekever egy 1,5 ml-es pattintókupakos mikrocentrifuga csőbe, és ráírja, hogy NEG CT. A negatív kontrollt ugyanazt az eljárást követve kell feldolgozni, mint a mintákat. A. Vortexelje a minta/DNA TLB/PK keveréket és a negatív kontroll keveréket (NEG CT) tartalmazó csöveket 30 másodpercig. MEGJEGYZÉS: A szövetet a DNA TLB/PK elegy teljesen el kell, hogy lepje. B. Helyezze a csöveket 56 °C-os száraz fűtőblokkba, és inkubálja 60 percig. C. Vortexelje a csöveket 10 másodpercig. MEGJEGYZÉS: A szövetet a DNA TLB/PK elegy teljesen el kell, hogy lepje. D. Helyezze a csöveket 90 °C-os száraz fűtőblokkba, és inkubálja 60 percig. MEGJEGYZÉS: Az inkubálás ideje alatt készítse elő a kívánt számú pattintókupakos szűrőcsövet (FT) úgy, hogy az FT csövet egy gyűjtőcsőre (CT) helyezi, és mindegyik FT kupakját ellátja a megfelelő minta- vagy kontrollazonosítóval. MEGJEGYZÉS: Minden egyes mintához 1 FT, 3 CT és 1 eluáló cső (1,5 ml-es mikrocentrifuga cső) szükséges. MEGJEGYZÉS: Az inkubálás ideje alatt lássa el a kívánt számú eluáló csövet (1,5 ml-es mikrocentrifuga cső) a megfelelő minta- vagy kontrollazonosító információval. E. Hagyja a csöveket lehűlni 15 °C és 30 °C közé. Lehűlés után pulzuscentrifugával centrifugálja a csöveket, hogy a kupakokról a folyadék lejöjjön. F. Mérjen 200 µl DNA PBB puffert mindegyik csőbe; 3-szori fel-le pipettázással keverje össze. G. Inkubálja a csöveket 15 °C és 30 °C között 10 percig. 06356583001-01HU
9
Doc Rev. 1.0
H. Mérjen 100 µl izopropanolt mindegyik csőbe; 3-szori fel-le pipettázással keverje össze a lizátumot. I.
Vigyen át minden egyes lizátumot a megfelelően jelölt FT/CT egységbe.
J.
Centrifugázza az FT/CT egységeket 8 000 x g-n 1 percig.
K. Tegyen minden FT csövet egy új CT csőre. Öntse ki a szűrletet a használt CT csőből vegyszergyűjtőbe, és megfelelően eljárva dobja ki a használt CT csövet. L. Mérjen 500-500 µl WB I munkaoldatot mindegyik FT csőbe. MEGJEGYZÉS: A WB I munkaoldat készítése a “Reagens-előkészítés” szakaszban van ismertetve. M. Centrifugázza az FT/CT egységeket 8 000 x g-n 1 percig. N. Öntse ki a szűrletet minden CT csőből vegyszergyűjtőbe. Tegye az FT csövet vissza ugyanarra a CT csőre. O. Mérjen 500-500 µl WB II munkaoldatot mindegyik FT csőbe. MEGJEGYZÉS: A WB II munkaoldat készítése a “Reagens-előkészítés” szakaszban van ismertetve. P. Centrifugázza az FT/CT egységeket 8 000 x g-n 1 percig. Q. Tegyen minden FT csövet egy új CT csőre. Öntse ki a szűrletet a használt CT csőből vegyszergyűjtőbe, és megfelelően eljárva dobja ki a használt CT csövet. R. Centrifugázza az FT/CT egységeket 16 000-20 000 x g-n 1 percig, hogy a szűrőmembránok megszáradjanak. S. Helyezzen minden FT csövet egy-egy minta- vagy kontrollazonosítóval ellátott eluáló csőbe (1,5 ml-es mikrocentrifuga cső). Öntse ki a szűrletet a használt CT csőből vegyszergyűjtőbe, és megfelelően eljárva dobja ki a használt CT csövet. T. Mérjen 100 µl DNA EB puffert minden egyes FT közepére anélkül, hogy hozzáérne az FT membránhoz. U. Inkubálja az FT csövet az eluáló csővel 15 °C és 30 °C között 5 percig. V. Centrifugázza az FT csövet az eluáló csővel 8 000 x g-n 1 percig, hogy az eluátum összegyűljön az eluáló csőben. Megfelelően eljárva dobja ki a használt FT csövet. W. Zárja le az eluáló cső kupakját. Az eluáló csőben van a DNS törzs. Folytassa a DNS mennyiségi meghatározása szakaszban az A lépéssel. MEGJEGYZÉS: A DNS-koncentráció mérését azonnal el kell végezni a DNS-izolálás művelete után még tárolás előtt. DNS mennyiségi meghatározása: A. Vortexelje mindegyik DNS törzset 5 másodpercig. B. Határozza meg a DNS mennyiségét Nanodrop UV-Vis Spektrofotométer (ND-1000 or ND-2000) segítségével a gyártó utasításai szerint. Referencia mintaként a készülékhez használjon DNA EB puffert. Két konzisztens leolvasás átlaga szükséges. A két mérésnek ±10% eltérésen belül kell lennie egymáshoz képest, ha a DNS-koncentráció leolvasás ≥ 20,0 ng/µl. Ha a DNS-koncentráció leolvasás < 20,0 ng/µl, akkor a két mérésnek ± 2 ng/µl eltérésen belül kell lennie. Ha a két mérés nincs ± 10% eltérésen belül egymáshoz képest, ha a DNS-koncentráció leolvasás ≥ 20,0 ng/µl, vagy ± 2 ng/µl eltérésen belül, ha a DNS-koncentráció leolvasás < 20,0 ng/µl, akkor 2 további leolvasást kell végezni, amíg a feltételek nem teljesülnek. Ezután a két új mérés átlagát kell kiszámolni. MEGJEGYZÉS: A feldolgozott negatív kontrollból (NEG CT) származó DNS törzset nem szükséges mérni. C. A mintákból származó DNS törzs koncentrációjának ≥ 2 ng/µl-nek kell lennie ahhoz, hogy a cobas® EGFR mutáció teszt elvégezhető legyen. Mintánként három amplifikálás/kimutatás történik, minden amplifikálás/kimutatás esetén 25 µl-rel a DNS törzs 2 ng/µl-es hígításából (összesen 50 ng DNS). MEGJEGYZÉS: A DNS törzs koncentrációjának legalább 2 ng/µl-nek kell lennie ahhoz, hogy a cobas® EGFR mutáció teszt elvégezhető legyen. Ha a DNS törzs koncentrációja < 2 ng/µl, ismételje meg a deparaffinálás, DNS-izolálás és DNS mennyiségi meghatározás lépéseket az adott mintára úgy, hogy két 5 µm FFPE-szövetmetszetet használ. Tárgylemezre ragasztott metszetek esetén a deparaffinálást követően tegye egyetlen csőbe a két metszetből származó szövetet, merítse a szövetet a DNA TLB + PK elegybe, és végezze el a DNS-izolálást és mennyiségi meghatározást a fentiek szerint. Tárgylemezre nem ragasztott metszetek esetén tegye egyetlen csőbe a két metszetet, merítse a szövetet a DNA TLB + PK elegybe, és végezze el a DNS-izolálást és mennyiségi meghatározást a fentiek szerint. Ha a DNS törzs még mindig < 2 ng/µl, kérjen egy másik FFPE-szövetmetszetmintát a megfelelő klinikai helyszíntől. MEGJEGYZÉS: Tárolja a DNS törzset (feldolgozott minta és negatív kontroll) 2 °C és 8 °C között 2 hétig vagy -20 °C-on 60 napig.
06356583001-01HU
10
Doc Rev. 1.0
AMPLIFIKÁLÁS ÉS KIMUTATÁS MEGJEGYZÉS: Hogy az MMX munkareagens DNS mintával való kontaminálását elkerülje, az amplifikálást és kimutatást elkülönítve kell végezni a DNS-izolálástól. Az amplifikálási és kimutatási munkaterületet alaposan meg kell tisztítani az MMX munkareagens elkészítése előtt. A megfelelő tisztításhoz valamennyi felületet, az állványokat és pipettorokat is beleértve, gondosan le kell törölni 0,5%-os nátrium-hipoklorit oldattal, majd 70%-os etanol oldattal. A kereskedelemben kapható háztartási fehérítő rendszerint 5,25%-ban tartalmaz nátrium-hipokloritot. Az 1:10 arányban hígított háztartási fehérítő megfelel 0,5%-os nátrium-hipoklorit oldatnak. Készülék összeállítása: A cobas z 480 összeállítására vonatkozó részletes útmutatásért tanulmányozza a cobas z 480 analizátor felhasználói kézikönyvét. Teszt sorrend összeállítása: Az EGFR munkafolyamat lépéseire vonatkozó részletes útmutatásért tanulmányozza az alábbi dokumentumot: cobas® 4800 rendszer felhasználói készikönyv szoftver 2.0-s verzió a cobas® EGFR mutáció teszthez (cobas® EGFR felhasználói kézikönyv). Minta DNS törzs hígítás kiszámítása: Hígítás kiszámítása 2 ng/µl - 36 ng/µl DNS törzs koncentrációk esetén MEGJEGYZÉS: Mintákból származó DNS törzseket amplifikálás és kimutatás előtt azonnal fel kell hígítani. MEGJEGYZÉS: Mintánként három (3) amplifikálás/kimutatás történik, ehhez összesen 75 µl (a három reakció mindegyikéhez 25-25 µl) szükséges a DNS törzs 2 ng/µl-es hígításából (összesen 150 ng DNS). A. Minden mintához számolja ki a DNS törzs szükséges térfogatát (µl): DNS törzs µl = (90 µl x 2 ng/µl) ÷ DNS törzs koncentráció [ng/µl] B. Minden mintához számolja ki a DNS mintaoldószer (DNA SD) szükséges térfogatát (µl): DNA SD µl = 90 µl – DNS törzs µl Példa: DNS törzs koncentráció = 6,5 ng/µl A. DNS törzs µl = (90 µl x 2 ng/µl) ÷ 6,5 ng/µl = 27,7 µl B. DNA SD µl = (90 µl – 27,7 µl) = 62,3 µl Hígítás kiszámítása >36 ng/µl DNS törzs koncentrációk esetén MEGJEGYZÉS: Mintákból származó DNS törzseket amplifikálás és kimutatás előtt azonnal fel kell hígítani. MEGJEGYZÉS: Mintánként három (3) amplifikálás/kimutatás történik, ehhez összesen 75 µl (a három reakció mindegyikéhez 25-25 µl) szükséges a DNS törzs 2 ng/µl-es hígításából (összesen 150 ng DNS). A. Ha a DNS törzs koncentráció > 36 ng/µl, használja az alábbi képletet a DNS mintaoldószer (DNA SD) mennyiségének kiszámításához, amely legalább 90 µl hígított DNS törzs készítéséhez szükséges. Ennek lényege, hogy minden mintába legalább 5 µl DNS törzs kerüljön. B. Minden minta esetén számítsa ki a DNA SD térfogatát (µl), amely 5 µl DNS törzs 2 ng/µl koncentrációra való hígításához szükséges: Szükséges DNA SD térfogat (µl) = ((5 µl DNS törzs x DNS törzs koncentráció (ng/µl) / 2 ng/µl) – 5 µl Példa: DNS törzs koncentráció = 100 ng/µl A.
Szükséges DNA SD térfogat (µl) = ((5 µl x 100 ng/µl) / 2 ng/µl) – 5 µl = 245 µl
B.
5 µl DNS törzs hígításához használja a kiszámított DNA SD térfogatot.
Minta hígítás A. Készítse elő a kívánt számú 1,5 ml-es pattintókupakos mikrocentrifuga csövet a DNS hígításhoz, és lássa el őket a megfelelő mintaazonosítóval. B. Aeroszol-rezisztens heggyel ellátott pipetta segítségével pipettáza a DNA SD oldószer kiszámított térfogatait a megfelelően jelölt csövekbe. Pipettázzon 45 µl DNA SD oldószert a NEG CT jelölésű pattintókupakos csőbe. C. Vortexeljen minden egyes DNS törzset és a negatív kontrollt 5-10 másodpercig. 06356583001-01HU
11
Doc Rev. 1.0
D. Aeroszol-rezisztens pipettaheggyel ellátott pipetta segítségével (minden pipettázáshoz új hegy) óvatosan pipettázza minden egyes DNS törzs esetén a kiszámított térfogatot a DNA SD oldószert tartalmazó megfelelő csőbe. Pipettázzon 45 µl negatív kontrollt (extrahált eluátum) a NEG CT csőbe. E. Csavarja a csövekre a kupakokat, és vortexelje mindegyiket 5-10 másodpercig. F. Cseréljen kesztyűt. Master mix (MMX-1, MMX-2 a MMX-3) munkareagensek elkészítése MEGJEGYZÉS: Az EGFR MMX-1, EGFR MMX-2, EGFR MMX-3 és az MMX munkareagens fényérzékenyek, és fénytől védve tartandóak. MEGJEGYZÉS: Mivel az EGFR MIXEK és az MMX munkareagens viszkózus folyadékok, lassan pipettázzon, hogy biztosan a teljes mennyiség kijöjjön a hegyből. MEGJEGYZÉS: Az EGFR MMX-1, EGFR MMX-2 és EGFR MMX-3 reagensek színe világoskék/lilás lehet. Ez nem befolyásolja a reagens minőségét. Készítsen három külön MMX munkareagenst: egyet EGFR MMX-1-ből, egyet EGFR MMX-2-ből és egy harmadikat EGFR MMX-3-ból külön 1,5 ml-es pattintókupakos mikrocentrifuga csövekbe. A. Számítsa ki az egyes MMX munkareagensekhez szükséges EGFR MMX-1 vagy EGFR MMX-2 vagy EGFR MMX-3 térfogatot az alábbi képlet segítségével: Szükséges EGFR MMX-1 vagy EGFR MMX-2 vagy EGFR MMX-3 térfogat = (minták száma + 2 kontroll + 1) x 20 µl B. Számítsa ki az egyes MMX munkareagensekhez szükséges MGAC térfogatot az alábbi képlet segítségével: Szükséges MGAC térfogat = (minták száma + 2 kontroll + 1) x 5 µl Az 1. táblázat segítségével határozza meg az egyes reagenseknek az MMX munkareagens készítéséhez szükséges térfogatát a futtatásban részt vevő minták száma alapján. 1. táblázat MMX-1 munkareagens, MMX-2 munkareagens és MMX-3 munkareagens készítéséhez szükséges reagens térfogatok
MMX 20 µl MGAC 5 µl Össztérfogat az egyes MMX munkareagensekhez (µl)
1 80 20
2 100 25
3 120 30
4 140 35
100
125
150
175
Minták száma* 5 6 160 180 40 45 200
225
7 200 50
8 220 55
9 240 60
10 260 65
250
275
300
325
* A minták számához tartozó térfogatok a (minták száma + 2 kontroll +1) összeg alapján vannak kiszámítva C. Vegye ki a hűtőből 2 °C és 8 °C között tárolt megfelelő számú EGFR MMX-1, EGFR MMX-2, EGFR MMX-3 és MGAC csövet. Használat előtt vortexelje mindegyik reagenst 5 másodpercig és gyűjtse a cső aljára a folyadékot. Lásson el jelöléssel steril mikrocentrifuga csöveket az MMX-1 munkareagens, MMX-2 munkareagens és MMX-3 munkareagens számára. D. Mérje az EGFR MMX-1 vagy EGFR MMX-2 vagy EGFR MMX-3 kiszámított térfogatát a megfelelő MMX munkareagens csőbe. E. Mérje az MGAC kiszámított térfogatát az MMX munkareagens csövekbe. F. A megfelelő keveredés érdekében vortexelje a csövet 3-5 másodpercig. MEGJEGYZÉS: A mintákat és kontrollokat az MMX munkareagensekhez, azok elkészítésétől számított 1 órán belül hozzá kell adni a mikrolemezen (AD-lemez). MEGJEGYZÉS: Csak cobas® 4800 rendszer mikrolemezt (AD-lemez) és zárófóliát (Roche P/N 05232724001) használjon.
06356583001-01HU
12
Doc Rev. 1.0
Lemez elkészítése 1. ábra Lemez elrendezés minta 1. ábra. Lemez elrendezés a cobas® EGFR mutáció teszthez Sor / Oszlop
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A
MUT MMX-1
MUT MMX-2
MUT MMX-3
S7 MMX-1
S7 MMX-2
S7 MMX-3
S15 MMX-1
S15 MMX-2
S15 MMX-3
S23 MMX-1
S23 MMX-2
S23 MMX-3
B
NEG MMX-1
NEG MMX-2
NEG MMX-3
S8 MMX-1
S8 MMX-2
S8 MMX-3
S16 MMX-1
S16 MMX-2
S16 MMX-3
S24 MMX-1
S24 MMX-2
S24 MMX-3
C
S1 MMX-1
S1 MMX-2
S1 MMX-3
S9 MMX-1
S9 MMX-2
S9 MMX-3
S17 MMX-1
S17 MMX-2
S17 MMX-3
S25 MMX-1
S25 MMX-2
S25 MMX-3
D
S2 MMX-1
S2 MMX-2
S2 MMX-3
S10 MMX-1
S10 MMX-2
S10 MMX-3
S18 MMX-1
S18 MMX-2
S18 MMX-3
S26 MMX-1
S26 MMX-2
S26 MMX-3
E
S3 MMX-1
S3 MMX-2
S3 MMX-3
S11 MMX-1
S11 MMX-2
S11 MMX-3
S19 MMX-1
S19 MMX-2
S19 MMX-3
S27 MMX-1
S27 MMX-2
S27 MMX-3
F
S4 MMX-1
S4 MMX-2
S4 MMX-3
S12 MMX-1
S12 MMX-2
S12 MMX-3
S20 MMX-1
S20 MMX-2
S20 MMX-3
S28 MMX-1
S28 MMX-2
S28 MMX-3
G
S5 MMX-1
S5 MMX-2
S5 MMX-3
S13 MMX-1
S13 MMX-2
S13 MMX-3
S21 MMX-1
S21 MMX-2
S21 MMX-3
S29 MMX-1
S29 MMX-2
S29 MMX-3
H
S6 MMX-1
S6 MMX-2
S6 MMX-3
S14 MMX-1
S14 MMX-2
S14 MMX-3
S22 MMX-1
S22 MMX-2
S22 MMX-3
S30 MMX-1
S30 MMX-2
S30 MMX-3
Ahol: NEG = negatív kontroll, MUT = mutáns kontroll, S# = mintaazonosító és MMX-# = master mix reagens 1, 2 vagy 3. MEGJEGYZÉS: Hogy eredményt kapjon, bármely mintát három egymás melletti oszlop azonos sorába kell elosztani. A. Pipettázzon 25 µl MMX munkareagenst a futtatáshoz szükséges minden reakciólyukba a mikrolemezen (AD-lemez). Ügyeljen, hogy a pipetta hegye ne érjen a lemezhez a lyukon kívül. • Mérjen szükség szerint (EGFR MMX-1 tartalmú) MMX-1 munkareagenst a mikrolemez (AD-lemez) lyukakba az 1., 4., 7. és 10. oszlopba. • Mérjen szükség szerint (EGFR MMX-2 tartalmú) MMX-2 munkareagenst a mikrolemez (AD-lemez) lyukakba a 2., 5., 8. és 11. oszlopba. • Mérjen szükség szerint (EGFR MMX-3 tartalmú) MMX-3 munkareagenst a mikrolemez (AD-lemez) lyukakba a 3., 6., 9. és 12. oszlopba. B. Pipettázzon 25 µl EGFR MC kontrollt a mikrolemez (AD-lemez) A1, A2 és A3 lyukaiba; keverje jól össze a pipettát a lyukon belül legalább kétszer felszívva és kiürítve. C. Új pipettaheggyel pipettázzon 25 µl NEG CT kontrollt a mikrolemez (AD-lemez) B1, B2 és B3 lyukaiba; keverje jól össze a pipettát a lyukon belül legalább kétszer felszívva és kiürítve. MEGJEGYZÉS: Minden futtatásnak tartalmaznia kell pozitív kontrollt (EGFR MC) az A1, A2 és A3 lyukakban, és negatív kontrollt (NEG CT) a B1, B2 és B3 lyukakban, különben a futtatást a cobas z 480 analizátor érvényteleníti. MEGJEGYZÉS: Szükség szerint cseréljen kesztyűt, hogy megelőzze a minta-minta kontaminációt, illetve a PCR reakciócső külső eredetű kontaminálását. D. Minden egyes minta DNS hígításhoz új pipettahegyet használva mérjen 25 µl-t az első minta DNS-ből a mikrolemez (AD-lemez) C1, C2 és C3 lyukaiba (minden lyuk esetén a minta DNS hozzáadásához új hegyet használjon); keverje jól össze a pipettát a lyukon belül legalább kétszer felszívva és kiürítve. Ismételje meg az eljárást a második mintából származó DNS hígítás esetén (D1, D2 és D3 lyukak). Kövesse az 1. ábrán látható elrendezést, amíg valamennyi minta DNS hígítást be nem töltötte a mikrolemez (AD-lemez) lyukaiba. Ellenőrizze, hogy az összes folyadék a lyukak aljára gyűlt. E. Fedje le a mikrolemezt (AD-lemezt) zárófóliával (a lemezek mellé jár). A zárófólia felhelyező segítségével rögzítse a fóliát légmentesen a mikrolemezre (AD-lemezre). F. A PCR indítása előtt ellenőrizze, hogy az összes folyadék az egyes lyukak aljára gyűlt. MEGJEGYZÉS: Az amplifikálást és kimutatást az első minta DNS hígításnak az MMX munkaoldathoz való hozzáadását követő 1 órán belül meg kell kezdeni.
06356583001-01HU
13
Doc Rev. 1.0
PCR indítása Az EGFR munkafolyamat lépéseire vonatkozó részletes útmutatásért tanulmányozza a cobas® EGFR felhasználói kézikönyvet. EREDMÉNYEK ÉRTELMEZÉSE MEGJEGYZÉS: Minden futtatási és minta validálást a cobas® 4800 szoftver hajt végre. MEGJEGYZÉS: Egy érvényes futtatás tartalmazhat érvényes és érvénytelen mintaeredményeket is. Egy érvényes futtatás mintaeredményeit a 2. táblázat szemlélteti. 2. táblázat cobas® EGFR mutáció teszt eredmények értelmezése Teszteredmény Mutation Detected
Mutation Not Detected* Invalid
Failed
Mutáció eredmény 19-es exon deléció S768I L858R T790M G719X (G719A, G719C, G719S) 20-as exon inzerció (egynél több mutáció is jelen lehet) N/A
Magyarázat Kimutatott mutáció egy meghatározott target EGFR régióban.
N/A
A minta eredménye érvénytelen. Az érvénytelen eredményű minták vizsgálatát ismételje meg az alábbi Érvénytelen eredményű minták ismételt vizsgálata szakaszban leírtak szerint. Hibás futtatás hardver- vagy szoftverhiba miatt. Vegye fel a kapcsolatot a Roche helyi szervizével műszaki segítségért
N/A
Nincs kimutatható mutáció a target EGFR régiókban
* A “Mutation Not Detected” eredmény nem zárja ki mutáció jelenlétét a target EGFR régiókban, mivel az eredmény a mutáns szekvenciák százalékos arányától, a minta megfelelő integritásától, a gátlóanyagok hiányától és az elegendő mennyiségű kimutatható DNS jelenlététől is függ. Érvénytelen eredményű minták ismételt vizsgálata A. Ismételje meg az érvénytelen minta DNS törzs hígítását az AMPLIFIKÁLÁS ÉS KIMUTATÁS szakaszban leírt Minta DNS törzs hígítás kiszámítása és Minta hígítás műveletektől kezdve. B. Miután elvégezte a DNS törzs 2 ng/µl-re való hígítását a Minta hígítás szakasz szerint, folytassa a Master mix (MMX-1, MMX-2 a MMX-3) munkareagensek elkészítése művelettel, illetve az amplifikálás és kimutatás folyamatának többi lépésével. MEGJEGYZÉS: Ha a minta az ismételt vizsgálat után is érvénytelen marad, vagy nem volt elegendő DNS törzs új hígítás készítéséhez az “Érvénytelen eredményű minták ismételt vizsgálata” szakasz A lépésében, akkor ismételje meg az adott minta teljes vizsgálati folyamatát egy új 5 mikronos FFPEszövetmetszettel a Deparaffinálás és DNS izolálás lépésekkel kezdődően. MINŐSÉG-ELLENŐRZÉS Egy-egy cobas® EGFR teszt mutáns kontroll (EGFR MC) és egy-egy negatív kontroll (NEG CT) az MMX-1 munkareagens, MMX-2 munkareagens és MMX-3 munkareagens mindegyikéhez tartozóan minden, legfeljebb 30 mintát tartalmazó futtatásban szerepel. Egy futtatás akkor érvényes, ha az EGFR mutáns kontroll (EGFR MC) lyukak (A1, A2 és A3), valamint a negatív kontroll (NEG CT) lyukak (B1, B2 és B3) eredménye érvényes. Ha az EGFR mutáns kontroll (EGFR MC) vagy a negatív kontroll (NEG CT) eredménye az MMX-1, MMX-2 vagy MMX-3 munkareagensek bármelyike esetén érvénytelen, akkor a teljes futtatás érvénytelen, és meg kell ismételni. Készítsen egy friss hígítást a korábban izolált minta DNS törzsből, és állítson össze egy új mikrolemezt (AD-lemezt) kontrollokkal az amplifikáláshoz és kimutatáshoz. Pozitív kontroll Az EGFR mutáns kontroll (EGFR MC) eredménye “Valid” kell legyen az MMX-1, MMX-2 és MMX-3 munkareagensek mindegyike esetén. Ha az EGFR MC eredménye következetesen érvénytelen lesz, technikai segítségért vegye fel a kapcsolatot a helyi Roche irodával. Negatív kontroll A negatív kontroll (NEG CT) eredménye “Valid” kell legyen az MMX-1, MMX-2 és MMX-3 munkareagensek mindegyike esetén. Ha a NEG CT eredménye következetesen érvénytelen lesz, technikai segítségért vegye fel a kapcsolatot a helyi Roche irodával. 06356583001-01HU
14
Doc Rev. 1.0
AZ ELJÁRÁSSAL KAPCSOLATOS ÓVINTÉZKEDÉSEK Mint minden vizsgálati eljárásnál, a helyes laboratóriumi technika alapvető a vizsgálat megfelelő kivitelezéséhez. A vizsgálat nagy analitikai érzékenysége miatt ügyeljen arra, hogy a reagensek és amplifikálási keverékek szennyeződéstől mentesek maradjanak. ELJÁRÁSSAL KAPCSOLATOS KORLÁTOZÁSOK 1. Csak a jelzett mintatípusokat vizsgálja. A cobas® EGFR mutáció tesztet csak NSCLC FFPE-szövetmintákkal való használathoz validálták. 2. A cobas® EGFR mutáció tesztet csak a cobas® DNS minta-előkészítő készlettel (Roche P/N: 05985536190) való használathoz validálták. 3. Egy mutáció kimutatása a mintában levő kópiák számától függ, ezért befolyásolhatja a minta integritása, az izolált DNS mennyisége és zavaró anyagok jelenléte is. 4. A megbízható eredmény a megfelelő minta fixáláson, -szállításon, -tároláson és -feldolgozáson múlik. Kövesse az ebben a használati utasításban és a cobas® EGFR felhasználói kézikönyvben leírt műveleteket. 5. Egyéb potenciális változók, mint például különböző minta-fixálási lehetőségek hatását nem vizsgálták. 6
Az AmpErase enzim hozzáadása a cobas® EGFR mutáció teszt master mixhez lehetővé teszi a target DNS szelektív amplifikálását, ugyanakkor a reagensek szennyeződésének elkerüléséhez a helyes laboratóriumi gyakorlat és ezen használati utasításban meghatározott eljárások gondos betartása szükséges.
7. A terméket csak a PCR technikák terén jártas személyzet által és a cobas® 4800 rendszeren szabad használni. 8. Csak a cobas z 480 analizátort validálták a termékkel való használatra. A temékkel más, valós idejű optikai detektálással működő PCR-készüléket nem lehet használni. 9. A technológiák különbözősége miatt javasolt, hogy az egyik technológiáról a másikra való áttéréskor a felhasználók végezzenek korrelációs laboratóriumi vizsgálatokat, hogy a technológiák közötti különbség minősíthető legyen. 10. Ritkán bár, de előfordulhat, hogy a cobas® EGFR mutáció teszt primerei és/vagy próbái által lefedett EGFR gén genomi DNS régióiban levő mutációk következtében egy mutáció jelenlétének kimutatása sikertelen lesz. 11. PCR-inhibitorok jelenléte álnegatív vagy érvénytelen eredményeket okozhat. 12. Ritkán bár, de előfordulhat, hogy a cobas® EGFR mutáció teszt “Mutation Not Detected” eredményt ad egyes mutációkra, ugyanakkor korlátozott keresztreaktivitást (“Mutation Detected” eredményt) mutat a 18-as, 19-es, 20-as és 21-es exonban a targetmutációkkal szomszédos mutációk esetén. 13. A cobas® EGFR mutáció tesztet reakciólyukanként 50 ng DNS-sel való használathoz validálták. Reakciólyukanként 50 ng-nál kisebb DNS-mennyiség használata nem javasolt. NEM KLINIKAI ÉRTÉKELÉS Analitikai érzékenység A cobas® EGFR mutáció teszt analitikai érzékenysége plazmidkeverék segítségével Hat, a teszttel kimutatható mutációosztályoknál leggyakrabban észlelt mutációkat tartalmazó DNS plazmid konstrukciót kevertek össze vad típusú sejtvonal DNS-sel úgy, hogy a megcélzott végső összetétel genomi DNS ekvivalensek alapján 5% mutáns szekvencia legyen. Az 5%-os mutáns szekvencia törzsekből sorozathígítást készítettek, és minden egyes paneltag 24 ismétlését vizsgálták a cobas® EGFR mutáció teszt készlet 3 gyártási tételének mindegyikével. Az analitikai érzékenységet úgy határozták meg, mint a legkisebb DNS mennyiség, amely legalább 95% arányban adott EGFR “Mutation Detected” eredményt a target mutációk esetén (3. táblázat). 3. táblázat A cobas® EGFR mutáció teszt érzékenysége plazmid- vagy sejtvonalkeverékből származó DNS segítségével EGFR exon
EGFR mutáció
Target nukleinsav-szekvencia
Legkisebb DNS (ng) mennyiség abban az 5% mutáns paneltagban reakciólyukanként, amely ≥ 95% arányban “Mutation Detected” eredményt adott (N=72 ismétlés)
18 19 20 20 20 21
G719A 19-es exon deléció S768I T790M 20-as exon inzerció L858R
2156 G>C 2235-2249del15 2303 G>T 2369 C>T 2307_2308ins9 (GCCAGCGTG) 2573 T>G
3,13 0,78 0,78 3,13 3,13 0,78
06356583001-01HU
15
Doc Rev. 1.0
Analitikai érzékenység FFPET mintakeverék segítségével 19-es exon deléció és L858R mutációk esetén három FFPET minta DNS extraktumot kevertek össze EGFR vad típus FFPET minta extraktumokkal úgy, hogy a mintakeverékek target mutáció szintje 10, 5,0, 2,5 és 1,25% legyen egy validált, masszívan párhuzamos piroszekvenálási módszerrel, a 454 szekvenálással (454 Life Sciences, Branford, CT, USA). A mintakeverékekből sorozathígítást készítettek, és minden egyes paneltag nyolc (8) ismétlését futtatták a cobas® EGFR mutáció teszt készlet 3 gyártási tételének mindegyikével (n=24/paneltag). Az egyes minták érzékenységét úgy határozták meg, mint a legkisebb DNS mennyiség, amely legalább 95% arányban adott EGFR “Mutation Detected” eredményt a target mutációk esetén (4. táblázat). 4. táblázat A cobas® EGFR mutáció teszt érzékenysége FFPET mintakeverékek segítségével
EGFR mutáció 19-es exon deléció
L858R
Minta
EGFR nukleinsavszekvencia
Mutáció-százalék abban a paneltagban, amely ≥ 95% arányban “Mutation Detected” eredményt adott reakciólyukanként 50 ng DNSmennyiség mellett (N=24 ismétlés)
Minta #1 Minta #2 Minta #3 Minta #4 Minta #5 Minta #6
2235_2249del15 2236_2250del15 2238_2252del15 2573 T>G 2573 T>G 2573 T>G
1,4 2,5 2,4 4,0 4,2 4,3
Ez a vizsgálat demonstrálja, hogy a cobas® EGFR mutáció teszt képes az EGFR 19-es és 21-es exonok legalább 5%-os mutációszintű mutációinak kimutatására a standard, reakciólyukanként 50 ng mennyiség mellett. Referencia módszerrel való korreláció 201 NSCLC FFPET minta összehasonlító vizsgálatát végezték el a cobas® EGFR mutáció teszt 2 különböző tételével és 2X bidirekcionális Sanger-féle szekvenálással, hogy meghatározzák a módszerek közti pozitív, negatív és teljes megfelelési arányt. A cobas® EGFR mutáció teszttel és a Sanger-féle szekvenálással kapott eltérő eredmények feloldását 454 szekvenálással végezték. A cobas® EGFR mutáció teszttel és/vagy Sanger-féle szekvenálással érvénytelen eredményt adó mintákat kizárták a vizsgálatból. A cobas® EGFR mutáció teszt eredményeit akkor tekintették érvénytelennek, ha a vizsgált mutációk bármelyike “invalid” eredményt adott (2. táblázat). A Sanger eredményeket akkor tekintették érvénytelennek, ha egy minta esetén a négy exon közül bármelyik érvénytelen eredményt adott. cobas® EGFR mutáció teszt és Sanger eredmények Az összehasonlításban szereplő 201 mintából 49 mintát nem tudtak értékelni konkordancia szempontjából, mert egyik vagy mindkét módszer érvénytelen eredményt adott. 48 minta volt érvénytelen Sanger-módszerrel (23,8%), 6 minta volt érvénytelen cobas® EGFR mutáció teszt 1. tétellel (3,0%) és 5 minta volt érvénytelen cobas® EGFR mutáció teszt 2. tétellel (2,5%). Az érvénytelen eredmények megoszlását az egyes módszerek között az 5. táblázat mutatja. 5. táblázat Érvénytelen eredmények megoszlása a módszerek között Érvénytelen minták módszer szerint csak Sanger érvénytelen csak cobas® érvénytelen Sanger és cobas® érvénytelen Összes
06356583001-01HU
16
cobas® EGFR mutáció teszt 1. tétel 2. tétel 43 44 1 1 5 4 49 49
Doc Rev. 1.0
A 152 érvényes eredmény összehasonlítását Sanger-módszer és a cobas® EGFR mutáció teszt esetén a 6. táblázat mutatja. 6. táblázat A cobas® EGFR mutáció teszt (tétel szerint) vs. Sanger-módszer megfelelési vizsgálat Sanger MD MND Összes MD 69 2 71 cobas® MND 3 78 81 1. tétel Összes 72 80 152 Pozitív megfelelési arány = 95,8% (95% CI = 88,3 - 99,1%) Negatív megfelelési arány = 97,5% (95% CI = 91,3 - 99,7%) Teljes megfelelési arány = 96,7% (95% CI = 92,5 - 98,9%) MD: Kimutatható mutáció (Mutation Detected) MND: Nincs kimutatható mutáció (Mutation Not Detected)
Sanger MD MND Összes MD 69 2 71 cobas® MND 3 78 81 2. tétel Összes 72 80 152 Pozitív megfelelési arány = 95,8% (95% CI = 88,3 - 99,1%) Negatív megfelelési arány = 97,5% (95% CI = 91,3 - 99,7%) Teljes megfelelési arány = 96,7% (95% CI = 92,5 - 98,9%)
A cobas® EGFR mutáció teszt és a Sanger-módszer közti konkordancia 96,7% volt (összesen 5 eltérő eredmény) az 1. tétel és 96,7% volt (összesen 5 eltérő eredmény) a 2. tétel esetén. A cobas® EGFR mutáció teszt és a Sanger-módszer összehasonlítása minden egyes minta esetén hat targetet értékelt. Összesen 912 mutáció vizsgálata történt a 152 érvényes minta eredményei alapján. A 7. táblázat és a 8. táblázat a cobas® EGFR mutáció teszt és a Sanger-módszer összehasonlítását mutatja mutációnként rendre az 1. tétel és a 2. tétel esetén. Két érvényes minta adott eltérő eredményt a cobas® EGFR mutáció teszt 1. és 2. tételével: egy minta 20-as exon inzerciót mutatott az 1. tétellel és MND eredményt adott a 2. tétellel; a második minta 19-es exon deléciót mutatott a 2. tétellel és MND eredményt adott az 1. tétellel. 7. táblázat A cobas® EGFR mutáció teszt (1. tétel) vs. Sanger-módszer mutációnkénti összehasonlítás
cobas® 1. tétel
G719X Ex 19 Del S768I Ex 20 Ins T790M L858R MND Összes
Sanger G719X 5 2 7
Ex 19 Del 39 1 40
S768I 3 3
Ex 20 Ins 2 2
T790M 1 1
L858R 23 23
MND 2 833 835
Egyéb 1* 1
Összes 5 39 3 4 1 23 837 912
* Egy minta eredménye a Sanger-módszerrel G719D volt, amely egy a cobas® EGFR mutáció teszt által nem vizsgált mutáció. A vizsgálat szempontjából ez a minta mint MND került kategorizálásra mindkét módszernél. 8. táblázat A cobas® EGFR mutáció teszt (2. tétel) vs. Sanger-módszer mutációnkénti összehasonlítás
cobas® 2. tétel
G719X Ex 19 Del S768I Ex 20 Ins T790M L858R MND Összes
Sanger G719X 5 2 7
Ex 19 Del 39 1 40
S768I 3 3
Ex 20 Ins 2 2
T790M 1 1
L858R 23 23
MND 1 1 833 835
Egyéb 1* 1
Összes 5 40 3 3 1 23 837 912
* Egy minta eredménye a Sanger-módszerrel G719D volt, amely egy a cobas® EGFR mutáció teszt által nem vizsgált mutáció. A vizsgálat szempontjából ez a minta mint MND került kategorizálásra mindkét módszernél.
06356583001-01HU
17
Doc Rev. 1.0
Eltérő eredmények vizsgálata 454 szekvenálással A Sanger-módszerrel való összehasonlítási vizsgálatok alapján 5 minta adott érvényes, de eltérő eredményt mindkét cobas® EGFR mutáció teszt tétel esetén. A cobas® EGFR mutáció teszttel és a Sanger-módszerrel eltérő eredményt adó mintákat 454 szekvenálással vizsgálták (9. táblázat). A 454 eredmények alapján ismételt megfelelési vizsgálatot végeztek. Ebben a vizsgálatban a cobas® EGFR mutáció teszt eredményével megegyező 454 eredményt adó mintákat "megegyezőnek" tekintették. A Sanger-módszer eredményével megegyező 454 eredményt adó mintákat "eltérőnek" tekintették. 9. táblázat Eltérő eredményt adó minták feloldása 454 szekvenálással Minta 1. minta 2. minta* 3. minta 4. minta** 5. minta 6. minta
Sanger G719A G719S Ex 19 Del MND MND MND
cobas® 1. tétel MND MND MND MND Ex 20 Ins Ex 20 Ins
cobas® 2. tétel MND MND MND Ex 19 Del Ex 20 Ins MND
454 feloldás MND G719S (1,1% mutáció) MND Ex 19 Del (3,0% mutáció) Ex 20 Ins (12,9% mutáció) MND
* A 2. minta 454-módszerrel megerősített mutációja G719S volt 1,1% mutációs rátával. Ez a cobas® EGFR mutáció teszt kimutatási határa alatt van. ** A 4. minta 454-módszerrel megerősített mutációja 19-es exon deléció volt 3,0% mutációs rátával. Ez a cobas® EGFR mutáció teszt kimutatási határán vagy akörül van. A cobas® EGFR mutáció teszttel és a Sanger-módszerrel kapott eltérő eredmények 454 szekvenálással való feloldását követően a valamennyi target mutációosztályra vonatkoztatott teljes megfelelési arány 98,7% lett a cobas® EGFR mutáció teszt 1. és 99,3% lett a teszt 2. tétele esetén (10. táblázat). 10. táblázat A cobas® EGFR mutáció teszt (tétel szerint) vs. Sanger-módszer megfelelési vizsgálat az eltérő eredmények 454 szekvenálással való feloldásával
®
cobas 1. tétel
Sanger-módszer, 454 szekvenálással feloldva
Sanger-módszer, 454 szekvenálással feloldva
MD
MND
Összes
MD
MND
Összes
MD
70
1
71
MD
71
0
71
MND
1
80
81
MND
1
80
81
Összes
71
81
152
Összes
72
80
152
®
cobas 2. tétel
Pozitív megfelelési arány = 98,6% (95% CI = 92,4 - 100%) Negatív megfelelési arány = 98,8% (95% CI = 99,3 - 100%) Teljes megfelelési arány = 98,7% (95% CI = 95,3 - 99,8%)
06356583001-01HU
Pozitív megfelelési arány = 98,6% (95% CI = 92,5 - 100%) Negatív megfelelési arány = 100% (95% CI = 96,3 - 100%) Teljes megfelelési arány = 99,3% (95% CI = 96,4 - 100%)
18
Doc Rev. 1.0
A 11. táblázat és a 12. táblázat a cobas® EGFR mutáció teszt és a Sanger-módszer összehasonlítását mutatja az eltérő eredmények 454 szekvenálással való feloldásával mutációnként rendre az 1. tétel és a 2. tétel esetén. 11. táblázat A cobas® EGFR mutáció teszt (1. tétel) vs. Sanger-módszer az eltérő eredmények 454 szekvenálással való feloldásával, mutációnkénti összehasonlítás
cobas® 1. tétel
G719X Ex 19 Del S768I Ex 20 Ins T790M L858R MND Összes
Sanger-módszer, 454 szekvenálással feloldva G719X Ex 19 Del S768I Ex 20 Ins T790M 5 39 3 3 1 1 6 39 3 3 1
L858R 23 23
MND 1 835 836
Egyéb 1* 1
Összes 5 39 3 4 1 23 837 912
* Egy minta eredménye a Sanger-módszerrel G719D volt, amely egy a cobas® EGFR mutáció teszt által nem vizsgált mutáció. A vizsgálat szempontjából ez a minta mint MND került kategorizálásra mindkét módszernél. 12. táblázat A cobas® EGFR mutáció teszt (2. tétel) vs. Sanger-módszer az eltérő eredmények 454 szekvenálással való feloldásával, mutációnkénti összehasonlítás
cobas® 2. tétel
G719X Ex 19 Del S768I Ex 20 Ins T790M L858R MND Összes
Sanger-módszer, 454 szekvenálással feloldva G719X Ex 19 Del S768I Ex 20 Ins T790M 5 40 3 3 1 1 6 40 3 3 1
L858R 23 23
MND 835 835
Egyéb 1* 1
Összes 5 40 3 3 1 23 837 912
* Egy minta eredménye a Sanger-módszerrel G719D volt, amely egy a cobas® EGFR mutáció teszt által nem vizsgált mutáció. A vizsgálat szempontjából ez a minta mint MND került kategorizálásra mindkét módszernél.
06356583001-01HU
19
Doc Rev. 1.0
Inkluzivitás plazmidokkal A cobas® EGFR mutáció teszt igazoltan az alábbi mutációkat képes kimutatni (13. táblázat). 13. táblázat A cobas® EGFR mutáció teszttel kimutatható mutációk 18-as exon – G719X mutáció Mutáció 2155 G>A 2155 G>T 2156 G>C
Aminosav változás G719S G719C G719A
COSMIC azonosító 6252 6253 6239
19-es exon – 19-es exon deléció Mutáció Aminosav változás
COSMIC azonosító
2235_2249del15
E746_A750del
6223
2236_2250del15
E746_A750del
6225
2240_2257del18
L747_P753>S
12370
2240_2254del15
L747_T751del
12369
2239_2256del18
L747_S752del
6255
2239_2251>C
L747_T751>P
12383
2237_2251del15
E746_T751>A
12678
2237_2255>T
E746_S752>V
12384
2239_2248TTAAGAGAAG>C
E747_A750>P
12382
2239_2253del15
L747_T751del
6254
2239_2247del9
L747_E749del
6218
2235_2252>AAT
E746_T751>I
13551
2236_2253del18
E746_T751del
12728
2237_2254del18
E746_S752>A
12367
2238_2255del18
E746_S752>D
6220
2238_2248>GC
L747_A750>P
12422
2238_2252>GCA
L747_T751>Q
12419
2239_2258>CA
L747_P753>Q
12387
2240_2251del12
L747_T751>S
6210
2233_2247del15
K745_E749del
26038
2253_2276del24
S752_I759del
13556
2235_2248>AATTC
E746_A750>IP
13550
2237_2252>T
E746_T751>V
12386
2235_2251>AATTC
E746_T751>IP
13552
2235_2255>AAT
E746_S752>I
12385
2237_2253>TTGCT
E746_T751>VA
12416
2237_2257>TCT
E746_P753>VS
18427
2238_2252del15
L747_T751del
23571
2239_2256>CAA
L747_S752>Q
12403
06356583001-01HU
20
Doc Rev. 1.0
20-as exon – T790M, S768I, 20-as exon inzerció Mutáció Aminosav változás 2303 G>T S768I 2369 C>T T790M 2319_2320insCAC H773_V774insH 2310_2311insGGT D770_N771insG 2307_2308ins9GCCAGCGTG V769_D770insASV 2309_2310AC>CCAGCGTGGAT V769_D770insASV 2311_2312ins9GCGTGGACA D770_N771insSVD
COSMIC azonosító 6241 6240 12377 12378 12376 13558 13428
21-es exon – L858R mutáció Mutáció 2573 T>G 2573_2574TG>GT
COSMIC azonosító 6224 12429
Aminosav változás L858R L858R
Keresztreaktivitás Tüdőben előforduló mikroorganizmusok Streptococcus pneumoniae és Haemophilus influenzae baktériumokat vizsgálva, azok nem keresztreagáltak a cobas® EGFR mutáció teszt során, amikor a szövetlízis lépésben 1 x 106 telepképző egység mennyiségben hozzáadták őket vad típusú és mutáns EGFR szekvenciákat tartalmazó mintákhoz. Interferencia Trigliceridek (≤ 37 mM, CLSI által javasolt magas koncentráció19) és hemoglobin (≤ 2 mg/ml, CLSI által javasolt magas koncentráció19) vizsgálatakor azok nem mutattak zavaró hatást a cobas® EGFR mutáció teszt során, amikor a potenciális zavaró anyagot hozzáadták a lízis lépéshez a minta-előkészítés folyamán. Legfeljebb 85% nekrotikus szövetet tartalmazó minták vizsgálatakor azok nem mutattak zavaró hatást a cobas® EGFR mutáció teszt során. Állékonyság A cobas® EGFR mutáció teszt állékonyságát egy 22%-os mutációs rátájú EGFR L858R mutáns FFPET minta segítségével értékelték. A vizsgálathoz a mintából 100, egyenként 5 µm-es metszetet készítettek. A DNS-t minden egyes metszetből a cobas® DNS minta-előkészítő készlet segítségével extrahálták. Az extrahált DNS egyetlen ismétlését vizsgálták a mintából készült 100 metszet mindegyike esetén. Az ismétlések 100 %-a adott “Mutation Detected” eredményt a cobas® EGFR mutáció teszt során az L858R mutációra, így az álnegatív mérési arány 0% volt. Reprodukálhatóság A cobas® EGFR mutáció teszt reprodukálhatóságát hat FFPET minta segítségével értékelték: 2 vad típusú minta és 4 mutáns minta (19-es exon deléció, S768I, G719X és 20-as exon inzerció). A mintákat két-két párhuzamos mintaként vizsgálta két vizsgáló két különböző reagenstétel és két cobas z 480 analizátor segítségével 4 napon keresztül. A cobas® EGFR mutációs teszt 98%-os reprodukálhatóságot mutatott (188/192).
06356583001-01HU
21
Doc Rev. 1.0
HIVATKOZÁSOK 1. Sharma SV, Bell DW, Settleman J, Haber DA. Epidermal growth factor receptor mutations in lung cancer. Nature Reviews Cancer. 2007;7:169-181. 2. Paz-Ares L, Soulières D, Melezínek I, et al. Clinical outcomes in non-small-cell lung cancer patients with EGFR mutations: pooled analysis. J Cell Mol Med 2010;14:51-69. 3. Mok TS, Wu Y-L, Thongprasert S, et al. Gefitinib or carboplatin–paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma. New England Journal of Medicine. 2009. 4. Maemondo M, Inoue A, Kobayashi K, et al. Gefitinib or chemotherapy for non–small-cell lung cancer with mutated EGFR. New England Journal of Medicine. 2010;362:2380-2388. 5. Rosell R, Moran T, Queralt C, et al. Screening for epidermal growth factor receptor mutations in lung cancer. New England Journal of Medicine. 2009;361:958-969. 6. Maheswaran S, Sequist LV, Nagrath N, et al. Detection of mutations in EGFR in circulating lung-cancer cells. New England Journal of Medicine. 2008;359:366-377. 7. Lynch TJ, Bell DW, Sordella R, et al. Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non–small-cell lung cancer to gefitinib. New England Journal of Medicine. 2004;350:2129-2139. 8. Jackman DM, Miller VA, Cioffredi L-A, et al. Impact of epidermal growth factor receptor and KRAS mutations on clinical outcomes in previously untreated non–small cell lung cancer patients: Results of an online tumor registry of clinical trials. Clinical Cancer Research. 2009;15:5267-5273. 9. Pao W, Chmielecki J. Rational, biologically based treatment of EGFR-mutant non-small-cell lung cancer. Nat Rev Cancer. 2010;10:760-774. 10. D'Addario G, Fruh M, Reck M, Baumann P, Klepetko W, Felip E. Metastatic non-small-cell lung cancer: ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 2010;21 Suppl 5:v116-119. 11. Keedy VL, Temin S, Somerfield MR, et al. American Society of Clinical Oncology Provisional Clinical Opinion: Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) Mutation Testing for Patients With Advanced Non-Small-Cell Lung Cancer Considering First-Line EGFR Tyrosine Kinase Inhibitor Therapy. J Clin Oncol. 12. Balak MN, Gong Y, Riely GJ, et al. Novel D761Y and common secondary T790M mutations in epidermal growth factor receptor-mutant lung adenocarcinomas with acquired resistance to kinase inhibitors. Clin Cancer Res. 2006;12:64946501. 13. Rosell R, Molina MA, Costa C, et al. Pretreatment EGFR T790M Mutation and BRCA1 mRNA Expression in ErlotinibTreated Advanced Non-Small-Cell Lung Cancer Patients with EGFR Mutations. Clin Cancer Res. 2011;17:1160-1168. 14. International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations, 52nd Edition. 2011. 15. Longo, M.C., Berninger, M.S. and Hartley, J.L. 1990. Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions. Gene. 93:125-128. 16. Chosewood, L.C. and Wilson, D.E. Biosafety and Microbiological and Biomedical Laboratories. HHS Publication Fifth # edition.(CDC) 21-1112. 2009 17. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Protection of Laboratory Workers from Occupationally Acquired Infections. Approved Guideline-Third Edition. CLSI Document M29-A3 Villanova, PA:CLSI, 2005 18. Catalogue of Somatic Mutations in Cancer (COSMIC), 2011, v.51, http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/ 19. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) EP7-A2, Interference Testing in Clinical Chemistry; Approved Guidelines – Second Edition, Appendix D 2005.
06356583001-01HU
22
Doc Rev. 1.0
Dokumentum verzióinformációi Doc Rev. 1.0 10/2011
Első közzététel.
Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ 08876 USA A Roche csoport tagja
Roche Diagnostics (Schweiz) AG Industriestrasse 7 6343 Rotkreuz, Switzerland
Roche Diagnostics 2, Avenue du Vercors 38240 Meylan, France
Roche Diagnostics GmbH Sandhofer Straße 116 68305 Mannheim, Germany
Distributore in Italia: Roche Diagnostics S.p.A. Viale G. B. Stucchi 110 20052 Monza, Milano, Italy
Distributed by
Roche Diagnostics, SL Avda. Generalitat, 171-173 E-08174 Sant Cugat del Vallès Barcelona, Spain
Distribuidor em Portugal: Roche Sistemas de Diagnósticos Lda. Estrada Nacional, 249-1 2720-413 Amadora, Portugal
Roche Diagnostics 201, boulevard Armand-Frappier H7V 4A2 Laval, Québec, Canada (For Technical Assistance call: Pour toute assistance technique, appeler le: 1-877 273 3433)
Roche Diagnostica Brasil Ltda. Av. Engenheiro Billings, 1729 Jaguaré, Building 10 05321-010 São Paulo, SP Brazil
A ROCHE, a COBAS, a COBAS Z, a Z05 és az AMPERASE a Roche védjegye. Az AmpErase enzim átviteli technológiáját az 5,035,996 U.S. szabadalom védi, külföldi megfelelőjét az Invitrogén Corporation birtokolja, és felhasználására a Roche Molecular Systems, Inc. jogosult. Az EPPENDORF az Eppendorf AG védjegye. A PIPET-AID a Drummond Scientific védjegye. A NANODROP a Thermo Scientific védjegye. Copyright 2011 Roche Molecular Systems, Inc. Minden jog fenntartva. 10/2011 Doc Rev. 1.0
06356583001-01HU
23
06356583001-01
Doc Rev. 1.0
