COBAS® TaqMan® MTB Test IN VITRO DIAGNOSZTIKAI CÉLRA. COBAS® TaqMan® MTB Test
CTM MTB
48 Tests
P/N: 04803531 190
AMPLICOR® Respiratory Specimen Preparation Kit
RSP PREP
100 Tests
P/N: 20756903 122 ART: 07 5690 3 US: 83267
FELHASZNÁLÁS MÓDJA A COBAS® TaqMan® MTB teszt egy in vitro nukleinsav-amplifikációs vizsgálat a Mycobacteria tuberculosis (MTB) komplex DNS kvalitatív kimutatására elfolyósított, dekontaminált és koncentrált humán légúti mintákban, pl. köpetben és bronchoalveoláris lavázsban (BAL). A vizsgálat a manuális minta-előkészítést az AMPLICOR® Respiratory Specimen Preparation Kit segítségével végzi, az automatikus amplifikáláshoz és kimutatáshoz pedig a COBAS® TaqMan® 48 analizátort alkalmazza. A VIZSGÁLAT ÖSSZEGZÉSE ÉS MAGYARÁZATA A Mycobacterium nemzetség tagjai saválló, nem mozgó, pálcika alakú aerob baktériumok, amelyek nem képeznek spórát. Számos emberi kórokozó faj található közöttük. Sok mycobacterium faj talajban és vízben élő szaprofita. Az elsődleges humán patogének a következő fajok: M. tuberculosis komplex (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum és M. microti) és M. leprae. A M. tuberculosis a legfontosabb kórokozó mycobacterium, és csak emberekben található meg. A tuberkulózis (TBC) ragályos megbetegedés. A közönséges náthához hasonlóan a levegőn keresztül terjed. Csak a tüdő-TBC-ben szenvedő emberek fertőznek. A fertőző személyek köhögés, tüsszentés, beszéd vagy köpetürítés alkalmával TBC baktériumokat juttatnak a levegőbe. A fertőződéshez csak kis csíraszám belégzése szükséges. Összességében jelenleg a Föld lakosságának egyharmada fertőzött TBC bacilussal. A TBC bacilussal fertőzött emberek 5-10%-a betegszik meg vagy válik fertőzővé valamikor élete során. Becslések szerint 2004-ben mintegy 1,7 millióan haltak meg TBC-ben. A becsült legmagasabb számú haláleset a délkelet-ázsiai régióban van, ahol a megbetegedések száma is a legmagasabb, ugyanakkor az egy főre jutó mortalitás az afrikai régióban a legnagyobb, ahol a HIV a TBC előfordulásának és a TBC-s megbetegedettek elhalálozási valószínűségének gyors növekedéséhez vezetett. A WHO célkitűzései, ahogy azokat az Egészségügyi Világszervezet közgyűlése 1991-ben ratifikálta, a következők: az új TBC-fertőzések 70%-ának kimutatása, és a kimutatott fertőzések 85%-ának meggyógyítása 2005-re. Tizennyolc ország fogadta el ezeket a célkitűzéseket 2002-re1-5. A betegség terjedési kockázata, a gyógyszerrezisztens törzsek felbukkanásának lehetősége és a HIV-1 fertőzöttek betegségének súlyossága következtében a M. tuberculosis komplex gyors diagnózisa rendkívül fontos. A tuberkulózis definitív diagnózisához a M. tuberculosis komplex egy organizmusának az izolálása szükséges. A rutintenyésztések időigényesek, és akár nyolc hétig is eltarthatnak. A mycobacteriumok kimutatásának leggyorsabb módszere a saválló kenetek mikroszkópos vizsgálata, de az nem elég érzékeny, és nem specifikus. Az immunológiai és szerológiai technikák korlátozottak, általában a gyenge érzékenységnek és/vagy specificitásnak köszönhetően6,7. A mycobacteriumokra specifikus PCR-alapú vizsgálatok fejlesztése tovább javítja a tuberkulózis gyors diagnosztikáját azáltal, hogy lehetővé teszi a mycobacteriumok közvetlen kimutatását klinikai mintákban8-14. AZ ELJÁRÁS ALAPELVEI A COBAS® TaqMan® MTB teszt két fő lépésből épül fel: (1) manuális minta-előkészítés az MTB DNS izolálására; (2) target DNS szimultán PCR-amplifikálása komplementer primerek segítségével, és a target DNS kimutatása fluoreszcensen kettősen jelölt oligonukleotid próbák hasítása révén15,16. Ezek a folyamatok együttesen lehetővé teszik az MTB target amplifikált termék (amplikon) és a (mintával egyidejűleg amplifikált és detektált) MTB belső kontroll DNS kimutatását. A master mix reagens egy primer párt tartalmaz, amely a kromoszóma nemzetségspecifikus régiójának amplifikálására szolgál, és a M. tuberculosis komplex (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum és M. microti) fajokra való specificitást egy kettősen jelölt target kimutatási próba biztosítja. A belső kontroll DNS amplifikálása ugyanazzal a primer párral történik. Az amplifikált DNS kimutatása targetspecifikus és belsőkontroll-specifikus kettősen jelölt oligonukleotid próbák segítségével történik, amelyek lehetővé teszik az MTB amplikon és a mycobacterium belső kontroll amplikon független azonosítását. 1
A minta előkészítése NALC/NaOH17 módszerrel elfolyósított, dekontaminált köpet és BAL minták mosása légúti minta mosóoldattal történik. Az organizmusok roncsolása légúti minta roncsoló reagensben való inkubálással történik, és a minta légúti minta semlegesítő reagens hozzáadását követően lesz amplifikálásra kész. PCR-amplifikáció A targetszekvencia kiválasztása A Mycobacterium genom tartalmaz egy megközelítőleg 1500 nukleotid hosszúságú, nagy fokban konzervált régiót, amely a 16S rRNS génjét kódolja. A COBAS® TaqMan® MTB teszt Mycobacterium nemzetségre specifikus primereket használ a régión belüli szekvenciák meghatározásához18. Targetamplifikáció A PCR-amplifikáció K-csövekben vagy K-tálcákon történik, melyekben a feldolgozott mintákat az amplifikáló elegyhez adják. Az kettős szálú DNS denaturálása és a primer targetszekvenciák szabaddá tétele végett a reakcióelegyet fel kell melegíteni. Az elegy kihűlésével a primerek a targetszekvenciáikhoz kötnek. A Z05 DNS-polimeráz Mg2+ és feleslegben lévő dezoxinukleotid-trifoszfátok (dNTP-k) jelenlétében a kötött primereket a targettemplátok mentén meghosszabbítva egy kettős szálú DNS molekulát szintetizál, amelyet amplikonnak neveznek. A COBAS® TaqMan® 48 analizátor a folyamatot adott számú cikluson keresztül automatikusan ismétli, hogy az amplikon DNS-mennyisége ciklusonként megduplázódjon. A szükséges számú ciklus a COBAS® TaqMan® 48 analizátorba előre be van programozva. Az amplifikálás az MTB genomnak csak a primerek közötti régiójában zajlik; a teljes MTB genom nem amplifikálódik. Belső kontroll amplifikálása Az enzimreakción alapuló amplifikálási műveletek során, amilyen a PCR is, a klinikai mintákban jelen lehetnek gátlóanyagok, amelyek csökkenthetik a hatékonyságot. A belső kontroll lehetővé teszi az olyan feldolgozott minták azonosítását, amelyekben a PCR-amplifikációt esetleg zavaró anyagok vannak jelen. A Mycobacterium belső kontroll egy nem fertőző, rekombináns, linearizált plazmid DNS a M. tuberculosis targetszekvenciával identikus primerkötő helyekkel, a M. tuberculosis targetszekvenciához hasonló hosszúságú és bázisösszetételű random belső szekvenciával, és egy egyedi próba kötő régióval, amely elkülöníti a Mycobacterium belső kontrollt a target amplikontól. Ezeket a jellemzőket azért választották ki, hogy biztosítsák mind a Mycobacterium belső kontroll, mind a M. tuberculosis target DNS ekvivalens amplifikálását. A COBAS® TaqMan® MTB teszt tartalmazza a Mycobacterium belső kontroll reagenst, és a reagens a klinikai mintából származó MTB DNS-sel való egyidejű amplifikálás céljából minden egyes amplifikálási reakcióhoz hozzáadandó. A Mycobacterium belső kontrollt az MTB targetszekvencia amplifikálását és kimutatását gátló anyagokat tartalmazó minták azonosítására tervezték. Szelektív amplifikálás A COBAS® TaqMan® MTB teszt a targetnukleinsav szelektív amplifikálását a mintából az AmpErase (uracilN-glikoziláz) enzim19 és dezoxiuridin-trifoszfát (dUTP) használatával éri el. Az AmpErase enzim felismeri és katalizálja a dezoxiuridin tartalmú DNS-szálak megsemmisítését, a timidint tartalmazó DNS-ét viszont nem. A dezoxiuridin a természetes DNS-ben nincs jelen, ugyanakkor az amplikonban mindig megtalálható, mivel a master mix reagens a dNTP-ok egyikeként dezoxiuridin-trifoszfátot használ; így csak az amplikon tartalmaz dezoxiuridint. A dezoxiuridinnak köszönhetően a szennyező amplikont az AmpErase enzim még a target DNS amplifikálását megelőzően lebontja. Bármilyen nem specifikus terméket, amely a master mix magnézium okozta kezdeti aktiválódása után képződik, az AmpErase enzim lebont. A master mix reagensben lévő AmpErase enzim katalizálja a dezoxiuridint tartalmazó DNS hasítását a dezoxiuridin-csoportoknál úgy, hogy a dezoxiribóz lánc felnyílását okozza a C1 helyen. Az első hevítési lépésben a master mix reagens bázikus pH-ján az amplikon DNS-lánc eltörik a dezoxiuridin helyén, tehát a DNS nem lesz amplifikálható. Az AmpErase enzim 55 °C felett, azaz a hevítési lépések során inaktív, így nem bontja le az amplifikálás során képződött target amplikont. PCR-termékek kimutatása COBAS® TaqMan® vizsgálat során A COBAS® TaqMan® MTB teszt valós idejű PCR-technológiát alkalmaz. A kettősen jelölt fluoreszcens próbák használata lehetővé teszi a PCR-termék halmozódásának valós idejű detektálását az amplifikálási folyamat során felszabaduló fluoreszcens jelzőfestékek emissziós intenzitásának monitorozása révén. Az MTB-re és a Mycobacterium belső kontrollra specifikus oligonukleotidokból álló próbák egy jelző (reporter) és egy blokkoló (quencher) festékkel jelöltek. A COBAS® TaqMan® MTB teszt során az MTB és Mycobacterium belső kontroll próbák különböző fluoreszcens jelzőfestékkel vannak jelölve. Amíg a fluoreszcens festékkel kettősen jelölt próbák érintetlenek, a jelzőfesték fluoreszcenciája a Förster-féle energiatranszfer jelenség révén a blokkoló festék közelsége miatt gátolt. A PCR során a próba egy targetszekvenciához hibridizál, és az 5'-3' exonukleáz aktivitású hőstabil Z05 DNS-polimeráz hasítja. Amikor a jelző és blokkoló festékek felszabadulnak és különválnak, megszűnik a blokkolás, és a jelzőfesték fluoreszcens aktivitása megnő. Az MTB DNS és a Mycobacterium belső kontroll DNS amplifikációjának mérése egymástól függetlenül, különböző hullámhosszokon történik. Ez a folyamat adott számú cikluson keresztül ismétlődik, minden ciklusban jelentősen megnövelve az egyes jelzőfestékek emissziós intenzitását, ezáltal lehetővé téve az MTB DNS és a belső kontroll DNS független azonosítását. 2
REAGENSEK AMPLICOR® Respiratory Specimen Preparation Kit AMPLICOR® légúti minta előkészítő készlet (P/N: 20756903 122; ART: 07 5690 3; US: 83267)
RSP PREP 100 teszt
RW (légúti minta mosófolyadék) tris-HCl puffer < 1% szolubilizáló szer EDTA 0,05% nátrium-azid
2 x 25 ml
RL (légúti minta roncsoló reagens) 0,2% nátrium-hidroxid < 1% szolubilizáló szer EDTA 0,05% nátrium-azid
3 x 6 ml
RN (légúti minta semlegesítő reagens) trisz-HCl puffer magnézium-klorid 0,05% nátrium-azid
2 x 5 ml
CTM MTB
COBAS® TaqMan® MTB Test (P/N: 04803531 190)
48 teszt
Kontrollreagensek MYCO IC (Mycobacterium belső kontroll)
4 x 0,1 ml
trisz-HCl puffer < 0,001% nem fertőző plazmid (mikrobiális) DNS, amely Mycobacterium primer kötő szekvenciákat és egy egyedi próba kötő régiót tartalmaz < 0,005% poli-rA RNS (szintetikus) EDTA amarántvörös festék 0,05% nátrium-azid MTB (+) C [M. tuberculosis pozitív kontroll]
1 x 0,75 ml
trisz-HCl puffer < 0,001% nem fertőző plazmid DNS (mikrobiális), amely MTB-szekvenciát tartalmaz < 0,005% poli-rA RNS (szintetikus) EDTA 0,05% nátrium-azid MYCO (–) C [Mycobacterium negatív kontroll]
1 x 0,75 ml
trisz-HCl puffer < 0,005% poli-rA RNS (szintetikus) EDTA 0,05% nátrium-azid
3
Amplifikációs és kimutatási reagensek MTB MMX (COBAS® TaqMan® MTB Master Mix)
4 x 12 teszt
tricin puffer kálium-acetát kálium-hidroxid dimetil-szulfoxid glicerin < 0,001% dATP, dCTP, dGTP, dUTP < 0,001% MTB primerek < 0,001% fluoreszcensen jelölt oligonukleotid próba, amely specifikus MTB-ra és a Mycobacterium belső kontrollra < 0,001% oligonukleotid aptamer < 0,05% Z05 DNS-polimeráz (mikrobiális) < 0,1% AmpErase (uracil-N-glikoziláz) enzim (mikrobiális) 0,09% nátrium-azid MYCO Mg2+ (Mycobacterium magnézium reagens)
4 x 0,46 ml
4 x 12 teszt
<1,0% magnézium-acetát 0,09% nátrium-azid
4 x 0,2 ml
FIGYELMEZTETÉSEK ÉS ÓVINTÉZKEDÉSEK
IN VITRO DIAGNOSZTIKAI CÉLRA. Ez az eljárás csak NALC-NaOH17 módszerekkel elfolyósított, dekontaminált és koncentrált köpet vagy BAL minták vizsgálatára használható. C. Ne pipettázzon szájjal. D. Ne egyen, igyon vagy dohányozzon a laboratórium területén. Viseljen egyszer használatos védőkesztyűt, védőruhát és szemvédőt a minták és tesztreagensek kezelése közben. A minták és tesztreagensek kezelését követően gondosan mosson kezet. E. A reagensflakonokból való anyagkivétel során kerülje el a reagensek mikrobiális szennyezését. F. Steril, egyszer használatos pipetták és pipettahegyek használata javasolt. G. Ne öntsön össze különböző tételekből, vagy azonos tételből, de különböző flakonokból származó reagenseket. H. Ne keverje a különböző készletekből származó reagenseket. I. A fel nem használt reagensek, hulladék és minták kezelésének összhangban kell lennie a megfelelő országos, szövetségi, állami és helyi szabályozásokkal. J. Ne használja a készletet a lejárati idő után. K. Az anyagok biztonsági adatlapjai (MSDS) igény esetén hozzáférhetők a helyi Roche irodában. L. A mintákat és kontrollokat fertőzőként kell kezelni a Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories20 és az CLSI Document M29-A321 előírásoknak megfelelő biztonságos laboratóriumi eljárásokat alkalmazva. Gondosan tisztítson meg, és ioncserélt vagy desztillált vízzel frissen készített 0,5% nátrium-hipoklorit oldattal fertőtlenítsen minden munkaterületet. MEGJEGYZÉS: A kereskedelemben kapható háztartási fehérítő rendszerint 5,25%-ban tartalmaz nátrium-hipokloritot. Az 1:10 arányban hígított háztartási fehérítő felel meg 0,5%-os nátriumhipoklorit oldatnak. M. Az RW, RL, RN, MTB MMX, MYCO Mg2+, MYCO IC, MTB (+) C és MYCO (–) C nátrium-azidot tartalmaz. A nátrium-azid ólom- és rézcsövekkel erősen robbanékony fém-azidokat képezve reakcióba léphet. Amikor nátrium-azid tartalmú oldatot önt ki a laboratóriumi mosogatóba, nagy mennyiségű vízzel öblítse ki a lefolyót az azidlerakódás megakadályozására. N. A minták kifröccsenését és a keresztszennyeződését megelőzendő a minta- és kontrollelőkészítéshez csavarókupakos csöveket kell használni. Ne használjon pattintókupakos csöveket. O. Viseljen szemvédőt, védőruhát és egyszer használatos védőkesztyűt bármely reagens kezelése közben. Ezen anyagok bőrrel, szemmel és nyálkahártyákkal való érintkezése kerülendő. Ha mégis előfordul érintkezés, azonnal öblítse le nagy mennyiségű vízzel. Ellenkező esetben égető érzés jelentkezhet. Ezen reagenseket kiömlés esetén szárazra törlés előtt vízzel hígítsa. P. Ha egy K-cső vagy K-tálca amplifikáció után kinyílna, kezelje a K-hordozót, a lyukakat és a kijutott folyadékot egy éjszakán át hipóval (a hatékony koncentráció 5000 ppm; 0,5%), hogy a kijutott amplikont elroncsolja.
A. B.
4
TÁROLÁSI ÉS KEZELÉSI KÖVETELMÉNYEK
A reagenseket és kontrollokat tilos lefagyasztani. A.
Az RW, RL és RN 2–25 °C-on tárolandó. Felbontás nélkül ezek a reagensek a jelölt lejárati időn belül stabilak.
B.
Az MTB MMX, MYCO Mg2+, MYCO IC, MTB (+) C és MYCO (–) C 2–8 °C-on tárolandó. Felbontás nélkül ezek a reagensek a jelölt lejárati időn belül stabilak.
C.
A részben felhasznált MTB (+) C és MYCO (–) C 2–8 °C-on tárolandó két gépi ciklus között. Használat előtt ellenőrizze a felnyitott kontrollok lejárati idejét. Az MTB (+) C és MYCO (–) C legfeljebb négy alkalommal használható fel. Felbontást követően az MTB (+) C és MYCO (–) C 4 héten vagy a lejárat időn belül stabil, amelyik előbb következik.
D.
Az MTB MMX, MYCO Mg2+ és MYCO IC egyszer használatos, 12 reakcióra elegendő csövekben vannak. Minden fel nem használt anyagot ki kell dobni.
E.
A master mix munkareagens (mely a MYCO Mg2+ és MYCO IC MTB MMX-hez való hozzáadásával készül) 2–8 °C-on sötétben, legfeljebb 2 órán át tárolható.
F.
Az előkészített mintákat és kontrollokat szobahőmérsékleten tárolva 2 órán belül, 2–8 °C-on tárolva 8 órán belül hozzá kell adni a master mix munkareagenshez.
G.
Az amplifikálást a minták és a kontrollok master mix munkareagenshez való hozzáadásától számított 90 percen belül meg kell kezdeni.
A KÉSZLET TARTALMA Minta-előkészítő reagensek A.
AMPLICOR® Respiratory Specimen Preparation Kit AMPLICOR® légúti minta előkészítő készlet (P/N: 20756903 122; ART: 07 5690 3; US: 83267)
RSP PREP
RW (légúti minta mosófolyadék) RL (légúti minta roncsoló reagens) RN (légúti minta semlegesítő reagens) Amplifikációs és kimutatási reagensek B.
COBAS® TaqMan® MTB Test (P/N: 04803531 190)
CTM MTB
MYCO IC (Mycobacterium belső kontroll) MTB (+) C [M. tuberculosis pozitív kontroll] MYCO (–) C [Mycobacterium negatív kontroll] MTB MMX (COBAS® TaqMan® MTB Master Mix) MYCO Mg2+ (Mycobacterium magnézium reagens)
5
SZÜKSÉGES, DE NEM BIZTOSÍTOTT ANYAGOK Műszerezettség és szoftver • • • • •
• • • •
COBAS® TaqMan® 48 analizátor AMPLILINK szoftver Az AMPLILINK szoftverhez készült adatállomás COBAS® TaqMan® 48 analizátor Felhasználói kézikönyv az AMPLILINK szoftver 3.2-es verziójú sorozatának Alkalmazási kézikönyvével való együttes használatra AMPLILINK szoftver (3.2 verzió) alkalmazási kézikönyv a COBAS® AmpliPrep készülékkel, COBAS® TaqMan® Analizátorral, COBAS® TaqMan® 48 analizátorral és COBAS® AMPLICOR® analizátorral való együttes használatra K-cső kupakrögzítő (P/N: 03516539001) K-tálca kupakozó eszköz (P/N: 03339904001) COBAS® TaqMan® 48 analizátor K-hordozó (P/N: 28150397001) COBAS® TaqMan® 48 analizátor K-tálca hordozó (P/N: 03341488001)
Egyszer használatos anyagok • •
K-csövek (P/N: 03137082001) COBAS® TaqMan® 48 analizátor K-tálcák (P/N: 03343146001)
EGYÉB SZÜKSÉGES, DE NEM BIZTOSÍTOTT ANYAGOK • • •
• • • •
Vortex keverő Pipetta segédeszköz: Drummond (P/N: 4-000-100) vagy ekvivalens 1,5 ml polipropilén csavarókupakos csövek, steril, nem szilikonozott, kúpos (Sarstedt 72.692.105 vagy ekvivalens)** Csőtartó állványok (Sarstedt 93.1428 vagy ekvivalens) Pipettorok (50 µl, 100 µl, 200 µl, 250 µl, 500 µl és 1000 µl térfogatú)* aeroszol barrieres (szűrős) vagy pozitív kiszorításos (dugattyús) hegyekkel Steril, finomhegyű transzferpipetták Mikrocentrifuga (max. RCF 16 000 x g, min. RCF 12 500 x g); Eppendorf 5415C, HERMLE Z230M, vagy ekvivalens 60 °C ± 2 °C fűtőblokk Hőmérő Szűrőpapír Egyszer használatos kesztyűk, púdermentes
•
Negatív nyomású biztonsági fülke
• • • •
*
A pipetták pontossága a megadott térfogathoz képest 3%-on belül legyen. Szűrős vagy dugattyús DNáz-mentes (illetve nukleáz-mentes) pipettahegyeket kell használni ott, ahol alapvető a minta és az amplikon keresztszennyeződésének megelőzése.
**
A minta és a kontroll előkészítéséhez csavarókupakos csöveket kell használni, megelőzendő a minták és kontrollok kifröccsenését és az esetleges keresztszennyeződést. Ne használjon pattintókupakos csöveket.
A MINTA LEVÉTELE, TRANSZPORTJA ÉS TÁROLÁSA
MEGJEGYZÉS: Valamennyi mintát és kontrollt fertőző ágensek átvitelére alkalmasként kell kezelni. A.
Minta levétele
Az elfogadható légúti minták csak az expektorált, az indukált köpet, illetve a BAL. A mintát el kell folyósítani, dekontaminálni és koncentrálni a NALC-NaOH17 módszerek segítségével. B.
Minta transzportja
A dekontaminált mintákat 2–25 °C között kell a laboratóriumba szállítani a levételtől számított 24 órán belül. Amennyiben a mintákat nem szállítják 24 órán belül a laborba, -70 °C-on kell tárolni és szállítani azokat. A minták szállítása meg kell, hogy feleljen a kóroki ágensek transzportjára vonatkozó valamennyi országos, szövetségi, állami és helyi szabályozásnak22. C.
Minta tárolása
A dekontaminált minták -20 °C-on legfeljebb 2 hétig tárolhatóak. A feldolgozott minták -70 °C-on legfeljebb 6 hónapig, 2 °C és 8 °C között legfeljebb 4 napig tárolhatóak. 6
HASZNÁLATI UTASÍTÁS
MEGJEGYZÉS: A részletes üzemeltetési utasításokért, az eredmények kinyomtatásáért és a jelzők, megjegyzések és hibaüzenetek értelmezéséért forduljon a következő kézikönyvekhez: COBAS® TaqMan® 48 analizátor felhasználói kézikönyve az AMPLILINK szoftver 3.2 verziójú sorozatával való használathoz, és az AMPLILINK szoftver 3.2 verziójú sorozatának alkalmazási kézikönyve a COBAS® AmpliPrep készülék, COBAS® TaqMan® analizátor, COBAS® TaqMan® 48 analizátor és COBAS® AMPLICOR® analizátor használatához. MEGJEGYZÉS: Ha a mintafeldolgozás, amplifikálás és kimutatás egyetlen munkanapon történik, kövesse az alábbiakban leírt vizsgálati eljárást. Ha a minta-előkészítés más napon történik, mint az amplifikálás és a kimutatás, a reagens-előkészítést végezze azonos napon az amplifikálással és a kimutatással. MEGJEGYZÉS: Valamennyi amplifikációs és kimutatási reagensnek használat előtt környezeti hőmérsékletűnek kell lennie; legalább 30 perccel használat előtt vegye ki azokat a tároló 2–8 °C-ról. MEGJEGYZÉS: A mintákat ki kell olvasztani (ha fagyottak), 15–30 percig egyenletes környezeti hőmérsékletűre hozni és összekeverni felhasználás előtt. MEGJEGYZÉS: Ahol előírt, használjon szűrős vagy dugattyús hegyeket a pipettákhoz. A szennyeződés elkerülésének érdekében rendkívüli gondossággal járjon el. Futtatási mennyiség: Valamennyi COBAS® TaqMan® MTB teszt készlet elegendő reagenst tartalmaz négy darab 12 mintás futtatáshoz, amelyek kivitelezhetőek külön-külön vagy párhuzamosan. Valamennyi, legfeljebb 48 mintát és kontrollt tartalmazó futtatásnak egy MYCO (–) C és MTB (+) C kontrollt kell tartalmaznia (lásd „Minőségellenőrzés” rész). Az amplifikációs és kimutatási reagensek 12 tesztre elegendő egyszer használatos fiolákban vannak. A reagensek leghatékonyabb felhasználása céljából a mintákat és a kontrollokat a 12 többszörösének megfelelő tételekben kell feldolgozni. A.
Minta és kontroll előkészítése
Munkaterület: Preamplifikálás - minta és kontroll előkészítő terület 1.
Határozza meg a vizsgálandó minták és kontrollok számát, és rendezze el a szükséges 1,5 ml-es polipropilén csavarókupakos csöveket a munkaterületen úgy, hogy minden egyes mintára és kontrollra jusson egy-egy cső. Ne használjon pattintókupakos csöveket. Nézze meg a “Figyelmeztetések és óvintézkedések” részt. Jelöljön meg minden minta előkészítő csövet a minta azonosító számával.
2.
Mérjen be 500 µl RW-t minden minta csőbe.
3.
Pipettázon szűrös pipettahegyet használva 100 µl elfolyósított, dekontaminált és koncentrált légúti mintát a megfelelően jelölt, RW-t tartalmazó csövekbe. Minden mintához új szűrős pipettahegyet használjon. Csavarja a csövekre a kupakot, és vortexeljen 5 másodpercig.
4.
Centrifugálja 12 500 g-n 10 percen át.
5.
Finomhegyű transzferpipettával szívja le a felülúszót, és adjon 100 µl RL-t a sejtüledékhez, minden minta esetén új szűrős pipettahegyet használva. Reszuszpendálja az üledéket 5 másodperces vortexeléssel.
6.
Készítse el a kontroll munkaoldatokat a következők szerint:
MEGJEGYZÉS: A kontroll munkareagenseket a vizsgálat napján frissen kell elkészíteni, és a nap végén kidobni. MEGJEGYZÉS: A COBAS® TaqMan® MTB teszt készletben lévő MTB (+) C és MYCO (–) C reagenseket az MTB (+) és MYCO (–) kontroll munkaoldatok készítéséhez legfeljebb négy alkalommal való felhasználásra tervezték. A felbontást követően az MTB (+) C és MYCO (–) C 4 héten vagy a lejárati időn belül stabil, amelyik előbb következik. a. Vortexelje a MYCO (–) C csövet 5 másodpercig. Mérjen 50 µl MYCO (–) C kontrollt egy 1,5 ml-es polipropilén csavarókupakos csőbe szűrős heggyel ellátott pipetta segítségével. Mérjen hozzá 200 µl RL-t. Vortexelje 5 másodpercig. Ez a Mycobacterium (–) kontroll munkaoldat. b.
Vortexelje a MTB (+) C csövet 5 másodpercig. Mérjen 50 µl MTB (+) C kontrollt egy 1,5 ml-es polipropilén csavarókupakos csőbe szűrős heggyel ellátott pipetta segítségével. Mérjen hozzá 200 µl RL-t. Vortexelje 5 másodpercig. Ez a M. tuberculosis (+) kontroll munkaoldat.
c.
Pipettázzon 100 µl-t mindegyik kontroll munkaoldatból egy 1,5 ml-es polipropilén csavarókupakos csőbe a klinikai mintákkal való párhuzamos feldolgozáshoz. 7
7.
Inkubálja a mintákat és kontrollokat 60 °C ± 2 °C-on 45 percig száraz fűtőblokkban.
8.
Vegye ki a csöveket a fűtőblokkból és centrifugában pörgesse le 5 másodpercig azokat, hogy eltávolítsa a kupakból a kondenzátumot.
9.
Szűrős hegy használatával pipettázzon 100 µl RN-t minden minta és kontroll csőbe. Vortexelje 5 másodpercig félsebességen. Használjon új szűrős pipettahegyet minden egyes mintához és kontrollhoz.
10.
Vigye át az előkészített betegmintákat és kontrollokat az amplifikálási/kimutatási területre.
B.
Reagens előkészítése és K-hordozó betöltése
Munkaterület: Preamplifikálási - Reagens-előkészítő terület
MEGJEGYZÉS: A COBAS® TaqMan® MTB master mix (MTB MMX), a „master mix munkareagens” (MMX munkareagens), valamint a feldolgozott mintákat és kontrollokat tartalmazó MMX munkareagens fényérzékeny. Ezek a reagensek fénytől védve tartandók. MEGJEGYZÉS: A COBAS® TaqMan® MTB master mixet (MTB MMX), COBAS® TaqMan® Mycobacterium belső kontrollt (MYCO IC) és COBAS® TaqMan® Mycobacterium magnézium reagenst (MYCO Mg2+) azonos hőmérsékletűre kell hozni legalább 30 percig szobahőmérsékleten hagyva a master mix munkareagens elkészítése előtt. MEGJEGYZÉS: A MMX munkareagenst a minta és kontroll előkészítés befejeztével készítse el. MEGJEGYZÉS: Az előkészített minták szobahőmérsékleten 2 órán át, vagy 2–8 °C-on 8 órán át stabilak a master mix munkareagenshez való hozzáadás előtt. MEGJEGYZÉS: A MMX munkareagenst 2–8 °C-on kell tárolni és elkészítés után 2 órán belül fel kell használni. MEGJEGYZÉS: Ha egyszer a feldolgozott mintákat és kontrollokat a MMX munkareagenshez hozzámérte, az amplifikálást 90 percen belül meg kell kezdeni. 1.
Hagyjon egy fiola MTB MMX, egy fiola MYCO Mg2+ és egy fiola MYCO IC oldatot legalább 30 percig állni, hogy felvegyék a szobahőmérsékletet.
2.
Helyezzen egy K-hordozót egy K-hordozó tartóba.
3.
Helyezzen új K-csöveket a K-hordozóba úgy, hogy ne érjen hozzá a K-csövek falához.
MEGJEGYZÉS: Ha 24-nél kevesebb mintát futtat, akkor ahhoz, hogy a PCR-készülékben a K-hordozó ki legyen egyensúlyozva, az 1, 2, 5, 20, 23 és 24 pozíciókban csőnek kell lennie. 4.
Távolítsa el a K-csövek kupakját, ha rendelkezésre áll, a K-cső kupakrögzítő segítségével. Helyezze a kupakokat a K-cső tárolóhelyén a tartóba.
5.
Készítse el az MMX munkareagenst a következők szerint: Adjon 200 µl MYCO Mg2+ és 50 µl MYCO IC oldatot egy cső MTB MMX reagenshez. Csavarja rá a kupakot az csőre, majd 10-szeri átforgatással keverje jól össze. Az MMX munkareagenst ne vortexelje. A master mix munkareagens fénytől védve tartandó, és 2 órán belül fel kell használni.
6.
Pipettázzon 50 µl MMX munkareagenst minden K-csőbe, vagy a K-tálca megfelelő lyukaiba.
MEGJEGYZÉS: A MMX munkareagens nagyon fényérzékeny. A MMX munkareagenst tartalmazó K-csöveket vagy K-tálcákat minél kevesebb fényhatásnak tegye ki. 7.
Mérjen szűrős vagy pozitív dugattyús heggyel ellátott mikropipettával minden egyes mintából vagy kontrollból 50 µl-t a megfelelő, MMX munkareagenst tartalmazó K-csőbe vagy a K-tálca lyukaiba. Minden mintát és kontrollt mikropipetta segítségével háromszori fel-le pipettázással óvatosan keverjen össze anélkül, hogy buborékokat csinálna.
8.
Ismételje meg a 7. lépést minden egyes feldolgozott mintára és feldolgozott kontrollra, amíg az összeset át nem vitte a K-csövekbe, vagy a K-tálca megfelelő lyukaiba. Használjon új hegyet minden egyes mintához és kontrollhoz. Szemmel ellenőrizze, hogy nincsenek-e buborékok, és szükség esetén távolítsa el azokat. Zárja le a K-csöveket/K-tálcát a K-cső kupakrögzítő/K-tálca kupakozó eszköz segítségével. Szemmel ellenőrizze, hogy valóban a megfelelő térfogatok lettek összemérve.
9.
Ha nem kezdi el azonnal az amplifikálást, a PCR-kész K-hordozót sötétben, 15–30 °C között tárolja. Az amplifikálást a feldolgozott mintáknak és kontrolloknak az MMX munkareagenst tartalmazó K-csövekbe vagy K-tálcákba való bemérésétől számított 90 percen belül meg kell kezdeni.
8
C.
Amplifikáció és kimutatás
Munkaterület: Posztamplifikálás – Amplifikálási/Kimutatási terület A COBAS® TaqMan® 48 analizátor betöltése és működtetése 1.
Kapcsolja be a számítógépes munkaállomást, majd jelentkezzen be a Windows XP-be a megfelelő felhasználónévvel és jelszóval.
2.
Kapcsolja be a COBAS® TaqMan® 48 analizátort legalább 30 perccel a futás elindítása előtt. Ellenőrizze, hogy a készülék inicializálódik-e és használatra kész-e. Ha az előző futtatásokból K-hordozók maradtak bármelyik PCR-készülékben, távolítsa el azokat a K-hordozó transzporter segítségével.
3.
Indítsa el az AMPLILINK szoftvert a számítógépen. A megfelelő felhasználóazonosítóval és jelszóval jelentkezzen be.
4.
Hogy megadja a K-hordozó vizsgálandó mintáinak sorrendjét, kattintson az Orders ikonra. Válassza ki a Sample fület, majd kattintson az New gombra és a billentyűzet vagy vonalkód-leolvasó segítségével vigye be minden minta sorszámát. Válassza ki a COBAS® TaqMan® MTB teszt vizsgálatdefinícióját. Ismételje meg ezt mindegyik minta esetében. Kattintson a Save gombra.
MEGJEGYZÉS: Ha 24-nél kevesebb mintát futtat, akkor ahhoz, hogy a PCR-készülékben a K-hordozó ki legyen egyensúlyozva, az 1, 2, 5, 20, 23 és 24 pozíciókban csőnek kell lennie. 5.
A minőség-ellenőrzési adatok beviteléhez kattintson az Orders ablakban a Quality Control fülre. Kattintson a New gombra, és a billentyűzet vagy vonalkód-leolvasó segítségével vigye be a készlethez biztosított COBAS® TaqMan® MTB teszt adatkártyáról a vonatkozó adatokat. Adja meg a megfelelő mezőkbe a COBAS® TaqMan® MTB teszt tételszámát, lejárati dátumát, az alacsony (+) kontroll tartományát, valamint a kalibrációs együtthatókat. Kattintson az „OK” gombra.
6.
Az Orders ablakban a K-Carrier fülre kattintva rendeljen a futtatáshoz egy K-hordozó számot. A K-Carrier ablakban kattintson a New gombra. A „K-Carrier ID” jobb oldalán lévő cellában a billentyűzet vagy vonalkód-leolvasó segítségével adja meg a K-hordozón vagy K-tálcán lévő vonalkódból a K-hordozó számát. Válassza ki a COBAS® TaqMan® MTB teszt vizsgálatdefinícióját az ablak alsó részén lévő vizsgálati panelből.
7.
A Worklist listában jelölje ki a Type (T) oszlop első sorát. Jelölje ki ezt a mezőt, majd a megjelenő legördülő listából válassza ki a kívánt kontrolltípust. Ezután kattintson duplán ugyanezen sorban a minta azonosító mezőre; a LookUp Control ablak jelenik meg valamennyi lehetséges kontrollt feltüntetve. Amikor a kontrollt kiválasztja, a megfelelő kalibrációs és kontroll értékek megjelennek a jobb alsó információs mezőben. Ismételje meg ezt a folyamatot valamennyi szükséges kontroll esetén.
8.
Ha mintákat akar a Worklist listához adni, kattintson kétszer az első pozícióra (sorra) a minta beviteléhez. Ekkor megjelenik a bevitt minták sorrendjét tartalmazó Lookup Sample ablak. használja a Shift + Arrow gombokat egynél több sorszám kijelölésére. Ellenőrizze, hogy minden sorszámhoz hozzárendelte-e a COBAS® TaqMan® MTB teszt vizsgálatdefiníciót.
9.
A K-hordozóhoz rendelt sorszámok mentéséhez kattintson a Save gombra.
10.
Válassza ki a System fül Systems ikonját; a PCR-készülék kinyitásához kattintson az Open gombra. Mikor a PCR-készülék teteje teljesen nyitva van, és a Systems ablakban a „Ready to Load” felirat látható, emelje meg és nyissa ki a PCR-készülék fedelét. A K-hordozó transzporter segítségével vigye át a kupakkal lezárt master mix munkareagenst és mintákat, illetve kontrollokat tartalmazó K-csövekkel betöltött K-hordozót a PCR-készülékbe. Csukja le a készülék fedelét.
11.
A PCR-készülék tetejének zárásához és a futtatás elindításához kattintson a Start gombra a Systems ablakban a TC ikon alatt.
12.
A COBAS® TaqMan® 48 analizátor az amplifikálást és kimutatást automatikusan elvégzi.
EREDMÉNYEK Eredmények kiszámítása A COBAS® TaqMan® 48 analizátor automatikusan meghatározza, hogy kimutatható-e MTB DNS a mintából vagy a kontrollból. A COBAS® TaqMan® 48 analizátor: • • •
Meghatározza az MTB DNS és a Mycobacterium IC DNS ciklus küszöbértékét (Ct). Meghatározza, hogy van-e kimutatható MTB DNS az MTB DNS és a MYCO IC DNS ciklus küszöbértékei alapján. Meghatározza, hogy az MTB (+) C és MYCO (–) C értékelhetőek-e.
9
Futtatás validálása Ellenőrizze az AMPLILINK eredmény ablakban vagy a kinyomtatott eredménylapon a jelzőket és megjegyzéseket, hogy meggyőződjön arról, hogy a futtatás értékelhető(valid)-e. A futtatás akkor értékelhető, ha a COBAS® TaqMan® MTB kontrollok egyikénél sincs jelző. A következő eredmények kaphatóak értékelhető futáskor: Kontroll
Eredmény
Magyarázat
Negatív kontroll
Target Not Detected
Kontroll a tartományon belül
Pozitív kontroll
1 Positive
Kontroll a tartományon belül
A futtatás nem értékelhető, ha a COBAS® TaqMan® MTB kontrollok az alábbi jelzők bármelyikét kapják: MYCO negatív kontroll: Jelző
Eredmény
Magyarázat
_N_NC_INVALID
Invalid
Szennyeződés, vagy nincs IC-jel
Jelző
Eredmény
Magyarázat
_L_LPC_INVALID
Invalid
Kontroll a tartományon kívül, nincs targetjel vagy IC-jel MEGJEGYZÉS: MTB PC a továbbiakban alacsony pozitív kontroll (LPC)
MTB pozitív kontroll:
Ha a futtatás nem értékelhető (invalid), ismételje meg a teljes futtatást, a minta és kontroll előkészítését, amplifikálást és kimutatást is beleértve. Eredmények értelmezése: Értékelhető futtatáshoz ellenőrizzen minden mintát az eredménylapon, hogy kapott-e jelzőt vagy megjegyzést. Az alábbiak szerint értelmezze az eredményeket : •
Egy értékelhető futtatás mind értékelhető, mind nem értékelhető mintaeredményeket is tartalmazhat, az egyes mintákra vonatkozó jelzőktől és/vagy megjegyzésektől függően.
A mintaeredmények az alábbiak szerint értelmezendőek: Jelző
Eredmény
Magyarázat
M. tuberculosis DNS nem mutatható ki. A minta feltételezhetően negatív M. tuberculosis-ra. A negatív eredmény nem zárja ki a M. tuberculosis fertőzést, mivel az eredmények a minta megfelelő levételétől, inhibitorok hiányától és elegendő mennyiségű DNS jelenlététől is függenek.
Nincs jelző
Target Not Detected
Nincs jelző
1 Positive
M. tuberculosis DNS kimutatható. A minta pozitív M. tuberculosis-ra.
_Q_RFITOOLOW vagy Nincs jelző
> 1 Positive
M. tuberculosis DNS kimutatható. A minta pozitív M. tuberculosis-ra.
_Q_QS_INVALID
Invalid
Gátolt minta. M. tuberculosis DNS, ha jelen is van, nem mutatható ki. Dolgozza fel újra az eredeti mintát, és ismételje meg a vizsgálatot. A gátlóanyagok gyakran labilisak, és az eredetileg ilyen tartalmú minták az ismétléskor nem mutatnak gátlást. Ha az eredeti minta nem érhető el, új mintát kell venni. Megjegyzés: AMPLILINK szoftver a belső kontroll (IC) hibáját értékelhetetlen QS-ként jelzi (_Q_QS_INVALID)
10
MINŐSÉG-ELLENŐRZÉS Valamennyi futtatásnak kell tartalmaznia egy MYCO (–) kontrollt és egy MTB (+) kontrollt. Mint minden új laboratóriumi eljárás esetében a vizsgálatot végző személy fontolja meg további kontrollok használatát minden méréshez, amíg az eljárás kivitelezését nagyfokú biztonsággal el nem képes végezni. Nincs előírás a kontrollok K-hordozóban való elhelyezkedését illetően. Ellenőrizze a kinyomtatott eredménylapon a jelzőket és megjegyzéseket, hogy meggyőződjön a futtatás értékelhetőségéről. Negatív kontroll A MYCO (–) C kontrollnak a „Target Not Detected” eredményt kell kiadnia, azaz az MTB DNS ciklus küszöbértéke a vizsgálati határ fölött volt, vagy pedig az MTB DNS küszöbérték nem lett meghatározva, de a Mycobacterium belső kontroll DNS küszöbértéke igen. Ha a MYCO (–) C kontroll nem felel meg ennek a feltételnek, a teljes futtatás értékelhetetlen. A teljes eljárást (minta és kontroll előkészítése, amplifikálás és kimutatás) meg kell ismételni. Ha a MYCO (–) C kontroll következetesen értékelhetetlen, technikai segítségért vegye fel a kapcsolatot a helyi Roche irodával. Pozitív kontroll Az MTB (+) C kontrollhoz tartozó kijelölt tartomány a COBAS® TaqMan® MTB Test Value Card adatkártyán van feltüntetve. Az MTB (+) C kontroll eredményének COBAS® TaqMan® MTB Test Value Card adatkártyán feltüntetett tartományba kell esnie. A helyes eredmény „1 Positive”-ként jelenik meg. Ha a pozitív kontroll nem felel meg ennek a feltételnek, a teljes futtatás nem értékelhető. A teljes eljárást (minta és kontroll előkészítése, amplifikálás és kimutatás) meg kell ismételni. Ha a pozitív kontroll eredménye rendszeresen kívül esik a kijelölt tartományon, kérjen technikai segítséget a helyi Roche irodától. Az MTB (+) kontroll megközelítően 20 kópia/teszt M. tuberculosis plazmid DNS-szekvenciát tartalmaz. Ez körülbelül a vizsgálat Poisson-analízissel meghatározott alsó kimutatási szintjének a négyszerese. Az MTB (+) kontroll amplifikálása és kimutatása biztosítja, hogy az amplifikálás megtörtént. Az MTB (+) kontroll ugyanakkor nem mutatja az amplifikálás hatékonyságát vagy a vizsgálat kimutatási szintjét. Belső kontroll A belső kontroll feladata a polimerázinhibitorokat tartalmazó minták azonosítása. A belső kontroll használata ugyanakkor nem zár ki minden álnegatív vizsgálati eredményt. ELJÁRÁSSAL KAPCSOLATOS ÓVINTÉZKEDÉSEK Mint minden vizsgálati eljárásnál, a helyes laboratóriumi technika alapvető a vizsgálat megfelelő kivitelezéséhez. A vizsgálat magas analitikai érzékenysége miatt rendkívüli gondossággal kell ügyelni a reagensek, illetve az amplifikálási elegyek tisztaságának megőrzésére. Minden reagens tisztaságát szorosan monitorozni kell. Dobjon ki bármilyen gyanús reagenst. ELJÁRÁSSAL KAPCSOLATOS KORLÁTOZÁSOK 1. Ez a vizsgálat kizárólag NALC-NaOH módszerrel elfolyósított, dekontaminált és koncentrált expektorált és indukált köpet és BAL minták felhasználására lett validálva. Más típusú minták vizsgálata álnegatív vagy álpozitív eredményhez vezethet. 2. A M. tuberculosis kimutatása függ a mintában jelen lévő organizmusok számától, ezért a mintalevételi módszerek, betegfaktorok (azaz kor, tünetek megléte) és/vagy a M. tuberculosis fertőzés stádiuma befolyásolhatja azt. 3. Álnegatív eredmények polimerázgátlás miatt is előfordulhatnak. A Mycobacterium belső kontroll azért lett hozzáadva a COBAS® TaqMan® MTB teszthez, hogy lehetővé tegye az olyan feldolgozott minták azonosítása, amelyekben a 20 kópia/tesztnél nagyobb PCR-amplifikációt esetleg zavaró anyagok vannak jelen. 4. Álnegatív eredményt okozhat az egyéb, M. tuberculosis (MTB) komplextől eltérő Mycobacterium fajok magas csíraszámú jelenléte, amikor az MTB alacsonyabb csíraszámban fordul elő, mint a zavaró Mycobacterium faj. 5. A megbízható eredmény a mintalevételen, -transzporton, -tároláson és -feldolgozáson múlik. A tárolásból származó eltéréseket nem határozták meg maradéktalanul. 6. Az AmpErase enzim hozzáadása a master mixhez lehetővé teszi a target DNS szelektív amplifikálását; ugyanakkor a reagensek szennyeződésének elkerüléséhez helyes laboratóriumi gyakorlat és ezen Használati utasításban meghatározott eljárások gondos betartása szükséges. 7. A vizsgálat segítségével terápiás siker vagy kudarc nem határozható meg. 8. Mint minden diagnosztikus vizsgálat esetén, a COBAS® TaqMan® MTB teszt eredményeinek értékelését a klinikai és laboratóriumi leletekkel együtt kell megtenni. 9. A terméket a PCR-technikák terén képzett személy használhatja. 10. A COBAS® TaqMan® MTB teszt minőségi eredményeket szolgáltat. Semmilyen korreláció nem állítható fel egy pozitív COBAS® TaqMan® MTB teszt könyökértéke és egy fertőzött mintában lévő M. tuberculosis sejtek száma között. 11
11. 12. 13.
14.
Ez a termék csak a COBAS® TaqMan® 48 analizátorral használható. PCR-inhibitorok jelenléte álnegatív vagy nem értékelhető eredményeket okozhat. Ritkán bár, de előfordulhat, hogy a vizsgálat primerei és/vagy próbája által lefedett bakteriális genom nagyfokban konzervált régiójában bekövetkezett mutációk következtében a baktérium kimutatása sikertelen lesz. A technológiák különbözősége miatt javasolt, hogy az egyik technológiáról a másikra való áttéréskor a felhasználók végezzenek korrelációs laboratóriumi vizsgálatokat, hogy a technológiák közötti különbség minősíthető legyen.
NEM KLINIKAI ÉRTÉKELÉS Analitikai specificitás A COBAS® TaqMan® MTB teszt analitikai specificitását az alábbi baktériumok, vírusok és gombák vizsgálatával értékelték, amelyek közül sok a légutak normál flórájának a tagja vagy gyakori kórokozója. Az alább felsorolt organizmusok közül egy sem mutatott reaktivitást a COBAS® TaqMan® MTB teszttel. Mycobacterium fajok
Mycobacterium Mycobacterium Mycobacterium Mycobacterium Mycobacterium Mycobacterium Mycobacterium Mycobacterium Mycobacterium Mycobacterium Mycobacterium Mycobacterium Mycobacterium Mycobacterium Mycobacterium
abscessus asiaticum avium chelonae chitae fallax flavescens fortuitum gastri gordonae intracellulare kansasii komassense malmoense marinum
Mycobacterium Mycobacterium Mycobacterium Mycobacterium Mycobacterium Mycobacterium Mycobacterium Mycobacterium Mycobacterium Mycobacterium Mycobacterium Mycobacterium Mycobacterium Mycobacterium Mycobacterium
neoaurum nonchromogenicum phlei scrofulaceum senegalens shimoidei simiae smegmatis sphagni szulgai terriae thermoresistibile triviale vaccae xenopi
Nem mycobacterium fajok
Acinetobacter calcoaceticus Actinomadura madurae Actinomyces pyogenes Actinoplanes italicus Aeromonas hydrophila Arthrobacter oxydans Bacillus subtilis Bacteroides fragilis Blastomyces dermatitidis Bordetella parapertussis Bordetella pertussis Branhamella (Moraxella) catarrhalis Brevibacterium linens Campylobacter jejuni Candida albicans Chlamydia trachomatis Chromobacterium violaceum Citrobacter freundii Clostridium perfringens Coccidioides immitis Corynebacterium aquaticum Corynebacterium diphtheriae Corynebacterium flavescens Corynebacterium glutamicum Corynebacterium jeikeium Corynebacterium minutissimum Corynebacterium pseudodiphtheriticum Corynebacterium pseudotuberculosis Corynebacterium renale Corynebacterium striatum
Corynebacterium xerosis Cryptococcus neoformans Deinococcus radiodurans Dermatophilus congolensis Derxia gummosa Eikenella corrodens Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Escherichia coli Fusobacterium nucleatum Gordona sputi Haemophilus influenzae Herpes simplex virus type 1 Histoplasma capsulatum Human adenovirus Human cytomegalovirus Human enterovirus Human rhinovirus 14 Influenza virus B Klebsiella pneumoniae Klebsiella pneumoniae subsp. ozaenae Lactobacillus casei Legionella micdadei Legionella pneumophila Mycoplasma hominis Mycoplasma pneumoniae Neisseria gonorrhoeae Neisseria lactamica 12
Neisseria meningitidis Nocardia asteroides Nocardia brasiliensis Nocardia farcinica (W5218) Nocardia nova (W5194) Nocardia otitidiscaviarum Nocardia transvalensi Oerskovia turbata Parainfluenza 2 virus Peptococcus niger Peptostreptococcus anaerobius Peptostreptococcus magnus Porphyromonas asaccharolytica Porphyromonas gingivalis Prevotella melaninogenica Propionibacterium acnes Proteus mirabilis Pseudomonas aeruginosa
Respiratory syncytial virus Rhodococcus aichiensis Rhodococcus chubuensis Rhodococcus equi Salmonellacholeraesus subsp Choleraesuis Serratia marcescens Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Streptococcus agalactiae Streptococcus gordonii Streptococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes Streptomyces griseinus Veillonella atypica Veillonella parvula Vibrio parahaemolyticus Xanthomonas maltophilia Yersinia enterocolitica
Analitikai érzékenység: M. tuberculosis sejtek A COBAS® TaqMan® MTB teszt kimutatási határát úgy állapították meg, hogy meghatározták a M. tuberculosis azon legkisebb telepképző egységeinek (CFU) számát, amely még reprodukálhatóan kimutatható (≥ 95%-os pozitív eredmény) a COBAS® TaqMan® MTB teszttel. Egy dekontaminált MTB tenyészetet mostak bele a NALC/NaOH-val elfolyósított negatív köpetbe, hogy kiadjon egy olyan 7 szintű panelt, mely 10, 5, 1, 0,5, 0,25, 0,1 és 0 MTB CFU/PCR egységet tartalmaz. Ezt a panelt külön-külön, három napon át minden egyes nap elkészítették. Mindegyik panel szintet ötvennégyszer ismételve vizsgálták három, különböző tétel COBAS® TaqMan® MTB teszt reagenssel. A probit analízis eredmények alapján (1. táblázat) a COBAS® TaqMan® MTB teszt kimutatási határa köpetmintákban 0,46 CFU/PCR, illetve megközelítőleg 18 CFU/ml.
1. táblázat A COBAS® TaqMan® MTB teszt kimutatási határa (LOD) M. tuberculosis sejtekre Névleges Tenyészet CFU/PCR bevitel 1 10 2 5 3 1 4 0,5 5 0,25 6 0,1 7 0
Értékelhetetlenek száma 0 0 0 0 0 0 0
Értékel- PoziKísérletek hetők tívak száma száma száma 54 54 54 54 54 54 54 54 54 54 51 54 54 46 54 54 33 54 54 0 54
95% LOD (PROBIT) = 0,46 CFU/PCR
% találat
95% Cl
100,0% 100,0% 100,0% 94,4% 85,2% 61,1% 0,0%
94,6–100% 94,6–100% 94,6–100% 84,6–98,8% 72,9–93,4% 46,9–74,0% 0,0–5,4%
95% konfidenciaintervallum = 0,33–0,83 CFU/PCR
Inkluzivitás A COBAS® TaqMan® MTB teszt az MTB komplexben előforduló valamennyi Mycobacterium fajjal (M. tuberculosis, M. bovis, M. microti, és M. africanum) értékelve lett. Adott mennyiségű genomi DNS preparátumot (10 kópia/PCR) és baktériumtenyészetet vizsgáltak. A 10 kópia/PCR beviteli szintnél az MTB komplex mind a 4 tagja pozitívként lett felismerve. Ezen felül, az MTB komplex fajok 169 tenyészetét (M. tuberculosis = 159, M. bovis = 6, M. microti = 3 és M. africanum = 1) elemezték a COBAS® TaqMan® MTB teszt segítségével. A M. microti egy tenyészete és a M. tuberculosis egy tenyészete negatívnak bizonyult, így a teljes inkluzivitás 99%-os volt. Reprodukálhatóság A COBAS® TaqMan® MTB teszt reprodukálhatóságának kiszámítása az eredmények naponkénti, tételenkénti és vizsgálónkénti értékelésével történt. A naponkénti vizsgálatot (2. táblázat) egy vizsgáló vezette egy tételből származó COBAS® TaqMan® MTB teszt reagenssel 15 napon át, a MYCO negatív kontrollt (NC), az MTB pozitív kontrollt (PC), illetve az MTB pozitív kontroll negatív kontrollal való hígítását (1/2 PC) használva. A tételenkénti vizsgálatot (3. táblázat) egy vizsgáló végezte egy napon három különböző tétel COBAS® TaqMan® MTB teszt reagenssel, a MYCO negatív kontrollt (NC), az MTB pozitív kontrollt (PC), illetve az MTB 13
pozitív kontroll negatív kontrollal való hígítását (1/4 PC és 1/2 PC) használva. A vizsgálónkénti vizsgálatot (4. táblázat) három vizsgáló végezte három különböző napon azonos tétel COBAS® TaqMan® MTB teszt reagenssel, a MYCO negatív kontrollt (NC), az MTB pozitív kontrollt (PC), illetve az MTB pozitív kontroll negatív kontrollal való hígítását (1/2 PC) használva. A három vizsgálatból származó 720 eredményt a 2-4. táblázat foglalja össze. A 132 NC mérése 100%-ban negatív eredményt adott. Mind az 588 pozitív, 20 és 5 között változó MTB target/PCR kópiaszámú minta mérése pozitív eredményt adott. Mindhárom vizsgálatban a %CV értéke 2,4 vagy annál kisebb volt, ez azt mutatja, hogy a minőségi eredmények jól reprodukálhatóak a teszttel.
2. táblázat A COBAS® TaqMan® MTB teszt naponkénti reprodukálhatóságának eredményei MTB target
NC (0 c/PCR)
PC (~20 c/PCR)
1/2 PC (~10 c/PCR)
értékelhető mérések teljes száma
60
60
60
pozitív eredmények %-a
0%
100%
100%
átlag MTB könyök
N/A
39,4
41,1
minimumérték
N/A
38,3
39,9
maximumérték
N/A
40,8
42,8
szórás
N/A
0,5
0,7
variációs koefficiens
N/A
1,3%
1,7%
3. táblázat A COBAS® TaqMan® MTB tételenkénti reprodukálhatóságának eredményei MTB target
NC (0 c/PCR)
PC (~20 c/PCR)
1/2 PC (~10 c/PCR)
1/4 PC (~5 c/PCR)
értékelhető mérések teljes száma
36
36
36
324
pozitív eredmények %-a
0%
100%
100%
100%
átlag MTB könyök
N/A
39,6
40,7
41,6
minimumérték
N/A
38,5
39,1
39,5
maximumérték
N/A
41,3
42,3
48,0
szórás
N/A
0,8
0,7
1,0
variációs koefficiens
N/A
1,9%
1,7%
2,4%
14
4. táblázat A COBAS® TaqMan® MTB vizsgálónkénti reprodukálhatóságának eredményei MTB target
NC (0 c/PCR)
PC (~20 c/PCR)
1/2 PC (~10 c/PCR)
értékelhető mérések teljes száma
36
36
36
pozitív eredmények %-a
0%
100%
100%
átlag MTB könyök
N/A
39,6
40,8
minimumérték
N/A
38,4
39,2
maximumérték
N/A
41,5
42,6
szórás
N/A
0,8
0,8
variációs koefficiens
N/A
1,9%
2,0%
Korreláció A korrelációs tanulmányt a COBAS® TaqMan® MTB teszt és a COBAS® AMPLICOR® MTB teszt összehasonlítására végezték el. A tanulmányban összesen 769 köpetmintát és 186 bronchoalveoláris lavázs (BAL) mintát vizsgáltak meg. Fagyasztva tárolt archív mintákat és frissen levett fagyasztott mintákat is beválogattak. Három egyedi tétel COBAS® TaqMan® MTB teszt reagenst használtak a tanulmány során. A köpetmintákat vizsgálva a pozitív korreláció (5. táblázat) 96,2%, a negatív korreláció 99,1%, a teljes megfelelési arány pedig 98,3% volt a COBAS® TaqMan® MTB teszt és a COBAS® AMPLICOR® MTB teszt között. A BAL mintákat vizsgálva a pozitív korreláció (6. táblázat) 97,1%, a negatív korreláció 99,3%, a teljes megfelelési arány pedig 98,9% volt a COBAS® TaqMan® MTB teszt és a COBAS® AMPLICOR® MTB teszt között.
5. táblázat Korreláció a COBAS® TaqMan® MTB teszt és a COBAS® AMPLICOR® MTB teszt között Köpetvizsgálat eredményei COBAS® AMPLICOR® MTB teszt
köpet eredmények N = 769 COBAS® TaqMan® MTB teszt
összesen
+
–
+
207
5
212
–
8
549
557
215
554
769
összesen arány
megfelelés %-a
95% konfidenciaintervallum
pozitív megfelelési arány
207/215
96,2%
92,8–98,4
negatív megfelelési arány
549/554
99,1%
97,9–99,7
teljes megfelelés
756/769
98,3%
97,1–99,1
15
6. táblázat Korreláció a COBAS® TaqMan® MTB teszt és a COBAS® AMPLICOR® MTB teszt között BAL-vizsgálat eredményei COBAS® AMPLICOR® MTB teszt
BAL eredmények N = 186 COBAS® TaqMan® MTB teszt
összesen
+
–
+
34
1
35
–
1
150
151
35
151
186
összesen arány
megfelelés %-a
95% konfidenciaintervallum
pozitív megfelelési arány
34/35
97,1%
85,1–99,9
negatív megfelelési arány
150/151
99,3%
96,4–99,9
teljes megfelelés
184/186
98,9%
98,9–99,9
Teljes rendszerhiba A COBAS® TaqMan® MTB teszt teljes rendszerhibáját úgy határozták meg, hogy 100 olyan negatív köpet százalékos pozitív eredményét vizsgálták, melyeket 60 CFU/ml végkoncentrációra, illetve a kimutatási határ ~3-szorosának megfelelő csíraszámú MTB tenyészettel oltottak be (lásd fentebb a Kimutatási határ c. részt). Pozitív eredményt 100 mérésből 99 esetben kaptak, eszerint a COBAS® TaqMan® MTB teszt teljes rendszerhibája 1,0%, a rendszer megbízhatósága pedig 99%. Zavarás Az endogén hemoglobin jelenlétének COBAS® TaqMan® MTB tesztre gyakorolt zavaró hatását úgy vizsgálták, hogy negatív köpetet oltottak be MTB pozitív kontrollal (25 kópia/PCR) és hemoglobinnal 0,52-től 5,2 mg/ml koncentrációig. Egyik bevitt hemoglobin szintnél sem volt a COBAS® TaqMan® MTB teszt zavarása tapasztalható. Vizsgálták a terápiában gyakran alkalmazott hat antituberkulotikus hatóanyag COBAS® TaqMan® MTB tesztre gyakorolt zavaró hatását. A hat hatóanyagot (7. táblázat) 1 x CMax és 3 x CMax végkoncentrációkban alkalmazták úgy, hogy a hatóanyagokat az MTB pozitív kontroll plazmidot (~17 kópia/PCR) tartalmazó negatív köpetbe oltották. A COBAS® TaqMan® MTB teszt működését nem befolyásolta a hat hatóanyag 1 x CMax és 3 x CMax szintű beoltása.
7. táblázat Antituberkulotikus hatóanyagok és CMax szintek hatóanyag
kémiai név
rövidítés
CMax (µg/ml)
Isoniazid Ethambutol Rifampicin Pyrazinamid Kanamycin Streptomycin
izonikotinsav-hidrazid ethambutol-dihidroklorid Rifadin, Rimactane pirazinkarboxamid kanamycin-monoszulfát streptomycin-szulfát só
INH ETH RIF PZA KM SM
5–7 1,7 7,99 30–35 2,0 25–30
Gátlás A COBAS® TaqMan® MTB teszt gátlásának mértékét (nem értékelhető belső kontroll) olyan különböző vizsgálatok elemzésével határozták meg, amelyekben a köpet vagy BAL mintákat és MTB tenyészet panel anyagokat is használtak; 1094 adatot összesítettek. A teljes gátlás értéke a COBAS® TaqMan® MTB teszt esetében az összes elemzett vizsgálatra (minták és MTB tenyészet panelek) 0,0% volt (0/1094).
16
HIVATKOZÁSOK 1.
World Health Organization Fact Sheet N° 104 Revised April 2005.
2.
Tuberculosis Elimination Revisited: Obstacles, Opportunities, and a Renewed Commitment— Advisory Council for the Elimination of Tuberculosis (ACET). Morbidity and Mortality Weekly Reports 1999. (RR09): 1-13.
3.
Metchock, B.G., Nolte, F.S. and Wallace, R.J. 1999. Mycobacterium, pp. 339-437: In: Manual of Clinical Microbiology, 7th ed., eds. Murray, P.R., Baron, E.J., Pfaller, M.A. et al. American Society for Microbiology, Washington, D.C.
4.
Bloom, B.R. and Murray, C.J.L. 1992. Tuberculosis: commentary on a re-emergent killer. Science 257:1055-1063.
5.
Böttger, E.C. 1991. Detection, differentiation, and systematics of bacterial pathogens - the family Mycobacteriaceae. Immunitat und Infection 19:143-152.
6.
Daniel, T.M. 1990. The rapid diagnosis of tuberculosis: a selective review. Journal of Laboratory Clinical Medicine 116:277-282.
7.
Hermans, P.W.M., Schuitema, A.R.J., Soolingen, D.V. et al. 1990. Specific detection of Mycobacterium tuberculosis complex strains by polymerase chain reaction. Journal of Clinical Microbiology 28:1204-1213.
8.
CDC. Nucleic Acid Amplification tests for Tuberculosis. MMWR 2000:49.
9.
Pfyffer, G.E., Kissling, P., Jahn, E.M.I. et al. 1996. Diagnostic performance of amplified Mycobacterium tuberculosis direct test with cerebrospinal fluid, other nonrespiratory, and respiratory specimens. Journal of Clinical Microbiology 34:834-841.
10.
Miller, N., Hernandez, S.G. and Cleary, T.J. 1994. Evaluation of Gen-Probe amplified Mycobacterium tuberculosis direct test and PCR for direct detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical specimens. Journal of Clinical Microbiology 32:393-397.
11.
Bergmann, J.S., Keating W.E., Woods G.L. 2000. Clinical evaluation of the BDProbeTec ET system for rapid detection of Mycobacterium tuberculosis. Journal of Clinical Microbiology 38:863-865.
12.
Yuen, K., Yam, W., Wong, L. et al. 1997. Comparison of two automated DNA amplification systems with a manual one-tube nested PCR assay for diagnosis of pulmonary tuberculosis. Journal of Clinical Microbiology 35:1385-1389.
13.
J. C. Palomino. 2005. Nonconventional and new methods in the diagnosis of tuberculosis: feasibility and applicability in the field. European Respiratory Journal 26:339-350.
14.
Ichiyama, S., Iinuma, Y., Tawada, Y. et al. 1996. Evaluation of Gen-Probe amplified Mycobacterium tuberculosis direct test and Roche PCR-microwell plate hybridization method (AMPLICOR® Mycobacterium) for direct detection of mycobacteria. Journal of Clinical Microbiology 34:130-133.
15.
Saiki, R. K., S. Scharf, F. Faloona, K. B. Mullis, G. T. Horn, H. A. Erlich, and N. Arnheim. 1985. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science, 230:1350-1354.
16.
Mullis, K. B. and F. A. Faloona. 1987. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods in Enzymology, 155:335-350.
17.
Kent, P.T. and Kubica, G.P. 1985. US DHHS. Public Health Mycobacteriology. A guide for the level III laboratory. Centers for Disease Control, Atlanta, GA.
18.
Böddinghaus, B., Rogall, T., Flohr, T. et al. 1990. Detection and identification of mycobacteria by amplification of rRNA. Journal of Clinical Microbiology 28:1751-1759.
19.
Longo, M. C., M. S. Berninger, and J. L. Hartley. 1990. Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions. Gene, 93:125-128.
20.
Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 1999. Richmond, J.Y. and McKinney, R.W. eds. 4th Edition. HHS Publication Number (CDC) 93-8395.
21.
Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Protection of Laboratory Workers from Occupationally Acquired Infections. Approved Guideline-Third Edition. CLSI Document M29-A3 Wayne, PA:CLSI, 2005.
22.
International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations, 41st Edition. 2000. 704 pp.
17
18
19
" Distributed by
A COBAS® TaqMan® MTB teszt gyártója: Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ, 08876 USA A Roche csoport tagja
Roche Diagnostics Indianapolis, IN 46256 USA (For Technical Assistance call the Roche Response Center toll-free: 1-800 526 1247)
Roche Diagnostics H7V 4A2 Laval, Québec (For Technical Assistance call: Pour toute assistance technique, appeler le: 1-877 273 3433)
Roche Diagnostics (Schweiz) AG CH-6343 Rotkreuz
Roche Diagnostics F-38240 Meylan
Roche Diagnostics GmbH D-68298 Mannheim, Germany
Distributore in Italia: Roche Diagnostics SpA Piazza Durante 11 I-20131 Milano
Roche Diagnostics S.L. E-08006 Barcelona
Distribuidor em Portugal: Roche Farmacêutica Química, Lda P-2700 Amadora
A ROCHE, az AMPLICOR, az AMPERASE, az AMPLILINK, az AMPLIPREP, a COBAS és a TAQMAN a Roche védjegye. A ROCHE RESPONSE CENTER a Roche szolgáltatási védjegye. A Microsoft és a Windows XP a Microsoft Corporation védjegye, illetve az Egyesült Államokban és/vagy más országokban bejegyzett védjegye.
Copyright 2008, Roche Molecular Systems, Inc. Minden jog fenntartva. 1/2008
(04803566001-02ENGL)
Doc Rev. 2.0
05174988001-02
20
