De detectie van de ALK-translocatie in de diagnostiek van longkanker
Effect van crizotinib bij patiënt met FISH positieve EML4-ALK translokatie
hoe kunnen we dat nu het beste doen ?
Ed Schuuring (klinisch) moleculair bioloog Hoofd Moleculaire Diagnostiek Laboratorium voor Moleculaire Pathologie Afdeling Pathologie van UMCG
[email protected] Voor start crizotinib
Na 6 weken crizotinib Groen NTvG 155; 2032: 2011
Respons op crizotinib van 31 EML4-ALK-positieve niet-kleincellige longcarcinoompatiënten is indrukwekkend
Respons op crizotinib van 143 EML4-ALK-positieve niet-kleincellige longcarcinoompatiënten (update 2012)
Resultaten in 2012: pretreatment Kwak NEJM 2010
After 2 cycles
Tumor respons > 60% Median PFS > 2 jaar
Camidge Lancet Oncol 2012
Wat is de beste ALK-detectie test ?
EML4EML4-ALK translocaties/inversies in NSCLC
Soda et al., Nature 448: 561-566, 2007
Hirsch CCR 2010
ALK-translocatie: feiten •
EML4EML4-ALK translocaties/inversies in NSCLC
EML4-ALK translocaties in 3.8% van ongeselecteerd NSCLC. ALK-gen
•
De ALK-EML4 translocatie komt vaker voor: * in (signet cell) adenocarcinomas * jong-volwassenen * never-smokers (< 100 cigarettes in lifetime) * light-smokers (< 15 pack-years) * tumoren zonder EGFR en KRAS mutatie (geen overlap)
EML4 EML4-gen
Aanbeveling: adenocarcinoom zonder EGFR en KRAS mutatie
Sasaki Eur J Cancer 2010 Solomon J Thor Oncol 2009
inversie
•
EML4/ALK fusie-produkt
13.14 Mb
ALK fusie-genen: 14 partners ?
EML4EML4-ALK translocaties/inversies in NSCLC
In longkanker: 5 ALK-fusie-partners: ALK-gen EML4/ALK fusie-produkt
13.14 Mb
EML4-gen
Sasaki Eur J Cancer 2010
inversie
EML4
Jung GCC 2012
Soda et al., Nature 448: 561-566, 2007 Takeuchi CCR 2011
VCL-ALK in renal cell carcinoma (Debelenko Mod pathol 2011) ALK-C2orf44 in colonkanker (Lipson Nat Med 2012) NPM1-ALK (classical example), ALK-MSN and ALK-MYH9 in ALCL Sasaki Eur J Cancer 2010
ALK-RANBP2, ALK-SEC31L1, ALK-CARS and ALK-CLTC in inflammatory myofibroblastic tumors)
De detectie van breuken in het ALK gen
De detectie van breuken in het ALK gen
in-situ-hybridizatie voor de detectie van translocaties/inversies mbv Abbott LSI-ALK
in-situ-hybridizatie voor de detectie van translocaties/inversies mbv Abbott LSI-ALK
13.14 Mb
EML4
13.14 Mb
EML4
• Normaal Commerciële ALK-in-situ-hybridisatie-probes:
• Vysis LSI ALK FISH break apart (Abbott) • LPS ALK FISH break apart (Cytocell) • Zytolight SPEC ALK/EML4 TriCheck (ZytoVision) • Poseidon ALK FISH break apart (Kreatech) • Ventana ALK BRISH break apart (Roche)
• Translocatie en Inversie
ALK Break Apart Probe Vysis FDA-approved assay (Pfizer-trial)
Interfase (kern) segregatie FISH assay break apart FISH assay
FISH als gouden standaard FISH segregatie assay (klassiek) 14
• Normaal
14 Interphase
Interphase
nucleus
nucleus
11
• Translocatie en Inversie
Sasaki EJC 2010
11
FISH segregatie assay (inversie) Interphase nucleus 2
Normal tissues (tonsil) Sample N nuclei Tonsil 39B 100
76
24
0
Tonsil 37A 100
70
30
0
Tonsil 36D 100
93
7
0
Tonsil 24E 100
95
5
0
ALK breakpoint apart FISH (VYSIS) on 4 independent reactive tonsils:
Segregation of one signal (signals closer than one single signal) in considerable number of cases
Interphase 2
nucleus
ALK break-apart FISH (VYSIS) on cell lines pos/neg for EML4-ALK
Sample
N kernen
H460 (pos)
100
74
23
3
H1650 (neg)
100
95
5
0
H1975 (pos)
100
89
9
2
HT29 (neg)
100
90
10
0
A375 (neg)
100
93
7
0
ZR-75 (pos)
100
87
13
0
ZR-75 FFPE
100
97
3
0
> EML4-ALK pos/neg based on RT-PCR (Lin Mol Cancer Res 2009) None is convincing positive with FISH break apart In none of these cell lines we detected a specific EML4-ALK-RT-PCR product None of the 3 NSCLC cell lines was positive in the study of Koivunen (CCR 2009) H2228/H3122 (reported later) are the only 2 cell lines with ALK-translocation
H460 H460
ALK breakapart FISH (VYSIS) on two NSCLC with EML4-ALK inversion (Cappuzzo’s lab)
1975
Sample N kernen Ital 1
100
64
21
15
Ital 2
100
89
9
2
Both cases should be positive Any segregation is considered pos in Cappuzzo’s lab
Sample N kernen
H1975
ALCL pos control
100
41
19
40
De detectie van ALK-EML4-translocatie naast klassieke segregatie, ook alternatieve patronen
FISH-ALK-positief
FISH-ALK-negatief Camidge CCR 2010
EML4-ALK FISH op paraffine coupes Meer complexe patronen (D-H) dan klassiek (C)
Guidelines on scoring FISH-ALK
Lastige moleculaire test ! A
B
C
A sample is considered negative if < 5 cells out of 50 (< 5/50 or < 10%) are positive.
D Klassiek translocatie patroon C in ALK-positieve tumoren is NIET zichtbaar
A sample is considered positive if > 25 cells out of 50 (> 25/50 or > 50%) are positive. A sample is considered equivocal if 5 to 25 cells (10 to 50%) are positive. If the sample is equivocal, a second reader should evaluate the slide: The first and second cell count readings are added together and a percent is calculated out of 100 cells (average percent of positive cells) If the average percent positive cells is < 15% (< 15/100), the sample is considered negative If the average percent positive cells is > 15% (> 15/100), the sample is considered positive Abbott/Vysis package insert including guideline for scoring
UMCG: 2 analisten scoren onafhankelijk van elkaar 100 kernen (vanaf 01012013 50 kernen elk) 3de analist als score discordant is
E
F
G
H
gedefinieerd welke patronen als positief of negatief gescoored worden ook polysomie wordt geteld en geregistreerd Yoshida J Thor Oncol 2011
A
B
C
D
E
F
G
H
Camidge Clin Canc Res 2010
Complexe patronen met de ALK-segregatie assay A
B
D
C
Bright-field in-situ-hybridizatie helderveld-ISH, automatisering en standarisatie voor ALK-segregatie (R&D; nog niet-commercieel)
Yoshida J Thor Oncol 2011
Fused pattern
Split pattern
Single red (3’)
Copy number gain of
(negative)
(positive)
pattern (positive)
fused, isolated red and/or isolated green
Goede training van de analisten
signals common
Meerdere analisten die elke casus beoordelen
Camidge et al, CCR 2010
Veel kijken/scoren
KimJ Thor Oncol 2011
Uitwisseling met andere expertise-labs SOP met gedefinieerde criteria voor scoren/interpretatie Optimale positieve en negatieve controles
Samenwerking UMCG met Ventana/Roche: validatie BRISH versus FISH (ongoing)
Door FDA goedgekeurd alleen in combinatie met FDA approved test Abbott/Vysis ALK-SA FISH test
De selectie van patiënten die in aanmerking komen voor behandeling met crizotinib: ALK immunohistochemie ?
ALK1-IHC used for the detection of ALK-translocations in anaplastic lymphoma is not suitable for the detection of EML4-ALK inversion in NSCLC
De detectie van ALK-EML4-translocatie Dmv IHC en signaalamplificatie(ALK01 en 5A4)
D5F3 commercieel verkrijgbaar sinds 2012 (Cell Signaling Technology – CTS)
Yoshida J Thor Oncol 2011
Mino-Kenudson Clin Cancer Res 2010
ALK-IHC for the detection of EML4-ALK inversion in NSCLC
ALK-IHC for the detection of EML4-ALK inversion in NSCLC
IHC with ALK-5A4: 4 scoring catagories
IHC with Ventana-ALK-D5F3: binair scoring
Thunnissen Virchow Arch 2012
Ventana ALK-IHC test (D5F3) beschikbaar sinds oct 2012:
CE-IVD in Europa Gestandaariseerde uitvoering (op Benchmark met gevalideerd kit)
Thunnissen Virchow Arch 2012
Ventana package insert 2012
ALK-D5F3-CTS IHC (manueel)
FISH-ALK-positief
FISH-ALK-negatief
Harms, vd Sluis, Menkema, Den Dunnen, Kooistra, Timens, Schuuring Haacke (CTS)
ALK IHC 5A4 vs D5F3
ALK-IHC for the detection of EML4-ALK inversion in NSCLC gestandariseerde test
Ventana ALK-IHC test (D5F3):
CE-IVD in Europa Murakami Front Oncol 2012
14% 5A4-positieve ALK hebben geen breuk in andere 5A4-studies wel goede associatie IHC3+ en FISH-pos (Park, McLeer, Paik, Kim) 6.7% (1/13) D5F3-positiieve is vals-positief
Gestandaariseerde uitvoering (op Benchmark met gevalideerd kit) Binair scoringsalgorithm
UMCG valideert deze test met Ventana op locatie
geen membraan-kleuring, hele hoge concordantie met FISH (ongoing) UMCG (preliminary resultaten): 247 aanvragen voor ALK-FISH hebben we parallel IHC met D5F3 (manual CTS protocol) Frequent membraneuze ALK-kleuring > niet geassocieerd ALK-FISH-segregatie Sterke cytoplasmatisch kleuirng sterk geassocieerd met ALK-FISH-segregatie
Kunnen we ALK IHC gebruiken voor de detectie (of voorscreening) van longtumoren met een ALK-breuk ? 3 verschillende antilichamen: d5F3 (CTS/Ventana); ALK01 (DAKO); 5A4 (Abcam) Verschillende signaalamplificatie methoden Verschillende detectie-systemen Verschillende criteria voor scoren (kwalitatief, semi-kwantitatief en subjectief) Verschillende workflows (voorscreenen, screenen) FISH-ALK-SA-positief
Uitdagingen: Alle ALK-translocatie-positieve cases > ALK-IHC-positief ? Alle ALK-translocatie-negatieve cases > ALK-IHC-negatief ? Klinische validatie (CCKL): we hebben weinig positieve controles ! Eerste europese rondzending laat grote spreiding in performance zien kunnen we leren van HER2-testing in Nederland ???
Nieuw screening algorithme voor ALK-positieve NSCLC ?
• • • • •
Goede training analisten Optimale referenties Concrete definities Uitgebreide validatie Ervaring opbouwen (veel en regelmatig scoren)
Andere methoden om de ALK-activiteit te meten ?
• Detectie van fusie-produkt op RNA-niveau met RT-PCR (multiplex), RNA-seq, targeted RNA-seq • quantitatieve RT-PCR ALK predictief ? • Commerciële kits zijn beschikbaar voor RT-PCR (gevalideerd ?) nu te duur (wel gemakkelijk in te passen in mutatie-profiling) veel splice-varianten, veel partners zelfde procedure voor ROS1-translocatie detectie
Thunnisssen Virch Arch 2012
ROS1-rearrangements in NSCLC
Andere methoden om de ALK-activiteit te meten ?
target for crizotinib VRAAG: welke methode is predictief ?
ROS1-rearrangements in NSCLC: * 9/556 NSCLC (1.6%)
1) Vysis FISH ALK SA (FDA-approved) 2) IHC (voldoende gevalideerd ? Trials FISH-/IHC+ cases) 3) (q)RT-PCR (veel belovend maar geen validatie)
• sensitive to crizotinib • detected by FISH (2012: Kreatech/CytoCell) • detected by IHC (Rimkunas, clin canc res 2012)
VRAAG: wat is praktisch ?
• >7 partners • splicing ?
IHC is goedkoper IHC is te standariseren in routine (in gevalideerde labs) IHC is veel minder bewerkelijk > snellere doorlooptijd Stumpfova CCR 2012, commentary
Dank voor uw aandacht
[email protected]
