MLPA bij borsttumoren De toepassing van MLPA in de diagnostiek van het mammacarcinoom
Multiplex Ligationigation-dependent Probe Amplification
C.B.Moelans, C.B.Moelans, UMCU
MLPA voor HER2 amplificatie detectie MLPA voor gelijktijdige kopie aantal bepaling van meerdere genen Polysomie 17: wel of niet?
2929-0101-2010
MLPA HER2 amplificatie detectie
HER2/neu, c-erbB2, ERBB2
HER2 is een groeifactor receptor (onco)gen onco)gen op chromosoom 17q1217q12-q21 HER2 codeert voor een transmembraan eiwit P185 of erbB2 of neu HER2 regelt celgroei/celdood via PI3K en MAPK pathway
1
HER2 diagnostiek Normale cel
HER2 status bepaling
Tumor cel
DNA niveau – FISH – CISH – SISH – MLPA (PCR) – Southern Blot RNA niveau – TargetPrint – RTRT-PCR Proteine niveau – IHC (Hercep (Hercep test) – ELISA
Tumor cel
Trastuzumab (Herceptin)
HER2 DNA (ISH)
HER2 receptor (IHC)
HER2 receptor
15-25%
Trastuzumab (Herceptin)
HER2 DNA (ISH)
HER2 receptor (IHC)
IHC (Hercep test)
Immuunhistochemie 0
1+
2+
3+
FISH
Eenvoudig Snel Goedkoop
HER2
MAAR
CEN17
2 HER2 kopieën 2 CEN17 kopieën HER2/CEN17 ratio <1.8
Geen amplificatie
Veel HER2 kopieën 2 CEN17 kopieën HER2/CEN17 ratio ≥2.2
Verschillende uitslagen op verschillende labs door proces variabiliteit en interpretatie verschillen
Amplificatie
2
Immuunhistochemie Procesvariabiliteit
SKML 2009: 47 labs 10 ≠ antilichamen, antilichamen, 9 ≠ voorbehandelingen, voorbehandelingen, 12 ≠ afwerkingsmethoden
Fixatietijden
CISH
FISH Kwantitatiever MAAR Fluorescentie microscoop Slechte morfologie Autofluorescentie Fluorescentie uitdoving Sterke vergroting, olie Duur (160€ (160€/coupe) Tijdsrovend
SISH
DAB
HRP-anti-Mo
Muis-anti DIG
Probe-DIG
3
MLPA
CISH/SISH
Multiplex Ligationigation-dependent Probe Amplification
Geen uitdoving permanent bewaren Betere morfologie Geen fluorescentie microscoop Sneller scoren Minder duur (100€ (100€/coupe)
Maar: Geen CEP17 informatie Nog steeds semisemi-kwantitatief
Hemiprobe paar
MLPA
PCR product bevat amplificatieproducten van 4040-50 probes (130(130-500 bp) bp)
Capillaire elektroforese met fragment analyse (Genescan) Genescan) software piekenpatroon
Hybridisatie HER2
MLPA kit (MRC Holland, Amsterdam) 4040-50 probes gericht tegen een groot aantal genen 5050-200 ng DNA geï geïsoleerd uit paraffine (of vries) materiaal Probe hybridisatie Ligatie “kwantitatieve PCR” PCR”
Controle gen
Ligatie
PCR: Een universeel primer paar wordt gebruikt om alle geligeerde probes te amplificeren. Het amplificatie product van elke probe heeft een unieke lengte (130-500 bp).
4
MLPA kit (P004-A1)
Coffalyser controle
tumor
Controle samples
Coffalyser software vergelijkt test samples met negatieve controle samples
Een verschil in relatieve piekoppervlakte/hoogte geeft een verandering aan in het kopie aantal van de probe target sequentie – – – –
Ratio HER2/controle <0.7 loss Ratio HER2/Controle <1.3 <1.3 geen amplificatie Ratio HER2/Controle 1.31.3-2.0 gain Ratio HER2/Controle >2.0 >2.0 amplificatie
06 06--152.3 152.3 ESR1 ESR1 06 06--152.3 152.3 ESR1 ESR1 06 06--152.3 152.3 ESR1 ESR1 0707-055.2 EGFR 0707-055.2 EGFR 0707-055.2 EGFR 0808-0338.4 FGFR1 0808-0338.4 FGFR1 0808-039.0 ADAM9 0808-042.3 IKBKB 0808-042.3 IKBKB 0808-071.1 PRDM14
08-128.8 MYC 08-128.8 MYC 08-128.8 MYC 1111-069.2 CCND1 1111-069.2 CCND1 1111-069.2 CCND1 1111-075.9 C11ORF30 1111-075.9 C11ORF30 1616-067.4 CDH1 1616-067.4 CDH1 1616-067.4 CDH1 1717-023.1 NOS2A 1717-024.1 TRAF4 1717-025.8 CPD 1717-034.3 LASP1 1717-034.8 MED1
17-035.1 ERBB2 17-035.1 ERBB2 17-035.1 ERBB2 17-035.1 ERBB2 17-035.1 ERBB2 1717-035.7 CDC6 17 17--035.8 035.8 TOP2A TOP2A 17 17--035.8 035.8 TOP2A TOP2A 17 17--035.8 035.8 TOP2A TOP2A 1919-035.0 CCNE1 1919-035.0 CCNE1 1919-035.0 CCNE1 2020-054.4 AURKA c c c c c c c c
1,51 1,46 1,31 0,93 1,06 1,16 0,87 0,98 1,26 1,02 0,96 1,1 0,86
0,97 1,13 1,05 1,06 1,17 1,14 0,80 1,08 1,21 0,96 0,80 0,89 1,46
1,14
1,65
1,3 1,04 0,7 1,03 1,05 1,13 0,85 1,07 1,11 1,13 1,03 1,1 0,89 8,28 5,12
1,57 1,05 0,86 1,15 1,09 1,08 0,74 0,94 0,84 3,45 2,68 0,95 0,75 0,93 3,72
9,2 10,41 6,29
3,50 3,23
10,95 1,42 1,7 1,76 1,56 1,11 1,04 1 0,83 0,97 1,01 1,11 1,13 0,99 0,86 1,12 0,96
3,10 1,11 1,04 1,16 1,19 0,87 0,93 0,97 1,16 1,15 0,95 1,19 0,91 1,29 0,74 0,94 1,08
3,59
5
MLPA
Verbeterde kwantitativiteit Goedkoop (40€ (40€/sample, als 5 borsttumor samples en 4 negatieve control samples in duplo/ analyse) Polysomie informatie Meer genen (probes) gelijktijdig analyseren
Maar: Geen morfologie – Heterogeniteit – DCIS (ductal (ductal carcinoma in situ)
MLPA-IHC-CISH n=518 Overeenkomst IHCIHC-CISH
88%
MLPAMLPA-CISH
94%
IHCIHC-MLPA
90%
Sensitiviteit
Specificiteit
PPV
NPV
IHC
73
92
94
97
MLPA
90
97
90
98
Tumor percentage Cellular Oncology 2009,31:1-10
MLPA Gelijktijdig bepalen van de amplificatie status van meerdere genen
MLPA (P078-A1)
HER2 TOP2A ESR1 …
6
Prognose
Predictief (Therapie Respons) Respons)
% Amplificatie bij borstkanker (range)
Functie
HER2
JA
Herceptin, Herceptin, AC, Taxanen
1515-30 %
Receptor
TOP2A
JA
AC
5-10 %
Celdeling
MYC
JA
Herceptin, Herceptin, Tamoxifen
9-15 % (1(1-94)
Celdeling
CCND1
JA
Tamoxifen
15 % (0(0-27)
Celdeling
CCNE1
JA
Tamoxifen, Tamoxifen, Aromatase Inhibitoren
6%
Celdeling
ESR1
controversieel
Tamoxifen
20.6 % (0(0-10?)
Receptor
EMSY
JA
-
13 %
08-128.8 MYC 08-128.8 MYC 08-128.8 MYC 1111-069.2 CCND1 1111-069.2 CCND1 1111-069.2 CCND1 1111-075.9 C11ORF30 1111-075.9 C11ORF30 1616-067.4 CDH1 1616-067.4 CDH1 1616-067.4 CDH1 1717-023.1 NOS2A 1717-024.1 TRAF4 1717-025.8 CPD 1717-034.3 LASP1 1717-034.8 MED1
17-035.1 ERBB2 17-035.1 ERBB2 17-035.1 ERBB2 17-035.1 ERBB2 17-035.1 ERBB2
DNA herstel
FGFR1
JA
-
8.7 %
Receptor
EGFR
JA
Tamoxifen Gefitinib
5-10 % (7(7-65)
Receptor
CDH1
JA
-
Loss: 15% IDC, 83% ILC
Metastase
MLPA: P078-A1
06 06--152.3 152.3 ESR1 ESR1 06 06--152.3 152.3 ESR1 ESR1 06 06--152.3 152.3 ESR1 ESR1 07055.2 EGFR 07 0707-055.2 EGFR 0707-055.2 EGFR 0808-0338.4 FGFR1 0808-0338.4 FGFR1 0808-039.0 ADAM9 0808-042.3 IKBKB 0808-042.3 IKBKB 0808-071.1 PRDM14
1717-035.7 CDC6 17 17--035.8 035.8 TOP2A TOP2A 17 17--035.8 035.8 TOP2A TOP2A 17 17--035.8 035.8 TOP2A TOP2A 1919-035.0 CCNE1 1919-035.0 CCNE1 1919-035.0 CCNE1 2020-054.4 AURKA c c c c c c c c
1,51 1,46 1,31 0,93 1,06 1,16 0,87 0,98 1,26 1,02 0,96 1,1 0,86
0,97 1,13 1,05 1,06 1,17 1,14 0,80 1,08 1,21 0,96 0,80 0,89 1,46
1,14 1,3 1,04 0,7 1,03 1,05 1,13 0,85 1,07 1,11 1,13 1,03 1,1 0,89 8,28 5,12
1,65 1,57 1,05 0,86 1,15 1,09 1,08 0,74 0,94 0,84 3,45 2,68 0,95 0,75 0,93 3,72
9,2 10,41 6,29
3,50 3,23
10,95 1,42 1,7 1,76 1,56 1,11 1,04 1 0,83 0,97 1,01 1,11 1,13 0,99 0,86 1,12 0,96
3,10 1,11 1,04 1,16 1,19 0,87 0,93 0,97 1,16 1,15 0,95 1,19 0,91 1,29 0,74 0,94 1,08
3,59
Co-amplificaties 90% 80% 70% HER2 60%
TOP2A
50%
MYC
40%
CCND1
30%
CCNE1
20% 10% 0%
HER2 (n=27)
TOP2A (n=31)
MYC (n=49)
CCND1 (n=27)
CCNE1 (n=12)
7
BCIRG 006 trial
MLPA N=3222
AC T AC TH (verhoogde cardiotoxiciteit: 2x zoveel patienten (2,3%)! TCH
Polysomie 17
“BCIRG-006 demonstrates that the incremental benefit conferred by AC that is known for HER2-positive breast cancers is restricted to TOP2A co-amplified malignancies which constitute a subset (35%) of these cancers”
BCIRG 006, Slamon D, SABCS 2009
Polysomie 17: Herceptin? -
Extra kopieën van chromosoom 17 leidend tot extra kopieën van HER2
- Indien polysomie 17: geen/slechtere respons op Herceptin
Polysomie 17: controversieel: 1.Hofmann M, Stoss O, Gaiser T, et al. Central ERBB2 IHC and FISH analysis in a trastuzumab (Herceptin(R)) Phase II monotherapy study: assessment of test sensitivity and impact of chromosome 17 polysomy. J Clin Pathol 2007; 1: 89–94. 2.Kaufman PA, Broadwater G, Lezon–Geyda K, et al. CALGB 150002: correlation of ERBB2 and chromosome 17 (ch17) copy number with trastuzumab (T) effi cacy in CALGB 9840, paclitaxel (P) with or without T in ERBB2+ and ERBB2– metastatic breast cancer (MBC). J Clin Oncol 2007; 25: 1009. 3.Risio M, Casorzo L, Redana S, Montemurro F. ERBB2 gene–amplified breast cancers with monosomy of chromosome 17 are poorly responsive to trastuzumab–based treatment. Oncol Rep 2005; 13: 305–09.
MAAR >>>
4.Reinholz M, Jenkins RB, Hillman D, et al. The clinical significance of polysomy 17 in the ERBB2+ N9831 intergroup adjuvant trastuzumab trial. Breast Cancer Res Treat 2007; 106 (supp 1): 11.
8
Polysomie 17: prognose?
Reinholz et al, Lancet Oncol 2009; 10: 267–77
Polysomie 17: AC ? SABCS 2008 Chromosome 17 polysomy (Ch17) as a predictor of anthracycline response: emerging evidence from the UK NEAT adjuvant breast cancer trial. Bartlett JMS, Munro A, Dunn JA, Hiller L, Jordan S, Twelves CJ, Cameron DA, Thomas J, Campbell F, Rea DW, Provenzano E, Pharoah P, Caldas C, Earl H, Poole CJ
Om polysomie 17 te bepalen wordt de amplificatie van het centromeer (CEP17 probe) gebruikt: representatief voor het hele chromosoom Klopt dit wel???????
9
MLPA: P004-B1
MLPA: P004-B1
• 17 chromosoom 17 probes (op 17p, 17cen en 17q) • BRCA1, BRCA2 • HER2, ESR1, EGFR, TOP2A • 2 of 3 probes per gen • 15 referentie probes
3 WSB1 probes: 17q11.1 (22,645,233 - 22,664,772 bp from pter), pter), als alternatief voor CEP17 bij MLPA analyse CEP17 CISH
Normaal q23
q24
17q25 METRNL
GH1
BRCA1
TOP2A RARA
q22 SGCA
q21
q12 PEX12 NEUROD2 ERBB2
q11.2 TRAF4 CPD RNF135
p12 p11.2 PMP22
PAFAH1B1
17p13
TOM1L2 p11.1 WSB1 q11.1 NOS2A
CEP17
WSB1 MLPA
MLPA: P004-B1 CEP17 CISH
HER2 status
WSB1 MLPA
2 kopieën
> 2 kopieën
Normaal
Verhoogd
Normaal
74
8
74
8
Amplificatie
10
12 55%
14
8 36%
60%
50%
CEP17 CISH
Verhoogd
2 kopieën
82
2
> 2 kopieën
6
14
19%
16%
92 % concordantie
0606-152.3 ESR1 0606-152.3 ESR1 0707-055.2 EGFR 0707-055.2 EGFR 1313-031.8 BRCA2 1313-031.8 BRCA2 1414-038.5 BRCA1 1414-038.5 BRCA1
0,99 1,08 0,87 1,09 1,37 1,32 1,01 0,81
1717-002.5 PAFAH1B1 1717-015.1 PMP22 1717-017.8 TOM1L2 17-022.7 WSB1 17-022.7 WSB1 17-022.7 WSB1 17-023.1 NOS2A 1717-024.1 TRAF4 1717-025.8 CPD 1717-026.3 RNF135 1717-030.9 PEX12 1717-035.0 NEUROD2 17-035.1 ERBB2 17-035.1 ERBB2 17-035.1 ERBB2 1717-035.7 RARA 17-035.8 TOP2A 17-035.8 TOP2A 17-035.8 TOP2A 1717-045.6 SGCA 1717-059.3 GH1 1717-078.6 METRNL
1,08 0,83 0,95 1,76 1,46 1,69 1,61 1,89 0,98 1,05 0,96 0,78 1,86 1,89 2,1 1,3 1,88 1,35 1,78 1,2 1,58 1,4
c c c c c c c c c c c
1,14 1,12 1 0,93 1,04 0,97 1,01 0,94 0,99 1,07 0.93
10
P004-B1 CEP17 amplificatie (WSB1) ≠ gehele CHR17 amplificatie!
Bij 2/111 tumoren was heel 17q geamplificeerd, incl WSB1 en CEP17 Polysomie van chromosoom 17 is erg zeldzaam
Chromosoom 17 vertoont gains en losses onafhankelijk van de centromeer status met als gevolg dat, tenminste in sommige gevallen, correctie met CEP17 probes misleidende HER2 gen status resultaten kan opleveren.
MLPA Breast Cancer Res Treat (2009)
J Pathol (2009)
Goede overeenkomst IHC, ISH Polysomie is erg zeldzaam Correctie met CEP17? Informatie over meer genen dan alleen HER2
Modern Pathology (2009)
11
12
