Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen Academiejaar 2010 – 2011
Opname van microplastics door de wadpier (Arenicola marina): selectieve opname en biologische effecten Sofie Vincent
Promotor: Prof. dr. ir. Colin Janssen Tutor: Michiel Claessens
Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master na Master in de Milieusanering en het Milieubeheer
Toestemming tot bruikleen
De auteur en de promotor geven de toelatingdeze scriptie voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie. The author and promotor give the permission to use this thesis for consultation and to copy parts of it for personal use. Every other use is subject to the copyright laws, more specifically the source must be extensively specified wheii usiiig frorn this thesis. Gent, 16 Mei 2011 De promotor
f. dr. C. Janssen
De begeleider
Michiel Claessens
De auteur
Sofie Vincent
© Juin 10 Faculty of Bioscience Engineering – Laboratory for Environmental Toxicology All rights reserved. This thesis contains confidential information and confidential research results that are property to the UGent. The contents of this master thesis may under no circumstances be made public, nor complete or partial, without the explicit and preceding permission of the UGent representative, i.e. the supervisor. The thesis may under no circumstances be copied or duplicated in any form, unless permission granted in written form. Any violation of the confidential nature of this thesis may impose irreparable damage to the UGent. In case of a dispute that may arise within the context of this declaration, the Judicial Court of Gent only is competent to be notified. Deze masterproef bevat vertrouwelijk informatie en vertrouwelijke onderzoeksresultaten die toebehoren aan de UGent. De inhoud van de masterproef mag onder geen enkele manier publiek gemaakt worden, noch geheel noch gedeeltelijk zonder de uitdrukkelijke schriftelijke voorafgaandelijke toestemming van de UGent-vertegenwoordiger, in casu de promotor. Zo is het nemen van kopieën of het op eender welke wijze dupliceren van het eindwerk verboden, tenzij met schriftelijke toestemming. Het niet respecteren van de confidentiële aard van het eindwerk veroorzaakt onherstelbare schade aan de UGent. Ingeval een geschil zou ontstaan in het kader van deze verklaring, zijn de rechtbanken van het arrondissement Gent uitsluitend bevoegd daarvan kennis te nemen.
Faculteit Bio-Ingenieurswetenschappen Vakgroep Toegepaste Ecologie en Milieubiologie Laboratorium Milieutoxicologie en Aquatische Ecologie
Academiejaar 2010-2011
Opname van microplastics door de wadpier (Arenicola marina): selectieve opname en biologische effecten Vincent Sofie
Promotor: Prof. Dr. Colin Janssen Begeleider: Michiel Claessens
Scriptie voorgelegd tot het behalen van de graad van Master na Master in de Milieusanering en Milieubeheer
Dankwoord
Woord vooraf Nog maar net de studie Biologie afgerond of ik had besloten om nog een jaar extra te studeren. Deze keer werd er gekozen voor de Master na Master Milieusanering en milieubeheer en wat een jaar werd het. In het begin was het wel wennen aan de nieuwe gezichten en het bomvolle lessenrooster. Natuurlijk hoorde bij een jaar extra studeren ook de keuze van een nieuw thesisonderwerp. Deze thesis kon enkel tot stand komen door de steun en hulp van vele mensen. Natuurlijk ben ik elk van hen veel dank verschuldigd en graag wil ik van deze gelegenheid gebruik maken om een aantal mensen te bedanken. Allereerst wil ik mijn begeleider Michiel Claessens bedanken voor de hulp en begeleiding tijdens de uitvoering van deze thesis. Bedankt voor de uitleg en tips gaande van de interpretatie en analyse van de resultaten tot het nalezen van de teksten. De tweede persoon die ik wil bedanken is Emmy. Bedankt voor de begeleiding bij de praktische kant van het experiment zoals onder andere de staalname en het begeleiden bij de proefopzet. Graag wil ik ook Nancy en al de andere mensen van het labo bedanken. Bij hun kon je altijd terecht met je twijfels en vragen over de werking van het labo zoals de juiste omgang met apparaten. Ook wil ik mijn klasgenoten bedanken voor de mooie momenten die we het afgelopen jaar hebben meegemaakt. Tenslotte wil ik mijn ouders, broers, zus, andere familieleden en vrienden bedanken voor de steun en het vertrouwen die ze me geboden hebben tijdens mijn studies. Mijn ouders ben ik zeer dankbaar voor hun steun, toeverlaat en de kansen die ze me boden tijdens mijn studiejaren. Zij stonden altijd voor me klaar om me te helpen indien mogelijk en raad te geven wanneer ik behoefte had aan een luisterend oor.
Bedankt aan iedereen!!
Inhoudsopgave
Inhoudsopgave Dankwoord Inhoudsopgave 1.
Inleiding ............................................................................................................................ 2
1.1
Bronnen van plastic en accumulatie/verspreiding ......................................................... 2
1.1.1.
Productie van plastic ................................................................................................ 2
1.1.2.
Oorsprong van plastic .............................................................................................. 3
1.1.3.
Degradatie van plastic.............................................................................................. 4
1.2
Impact voor het mariene ecosysteem ............................................................................ 4
1.2.1.
Verstikking en ‘ghost fishing’ ................................................................................... 5
1.2.2.
Verstoring van de vertering ..................................................................................... 5
1.2.3.
Toxiciteit ................................................................................................................... 7
1.2.4.
Invasieve soorten ..................................................................................................... 9
1.3
Het gebruik van biomerkers bij de opsporing van vervuiling ....................................... 10
1.4
Oplossingen voor de vervuiling ..................................................................................... 11
1.5
Doelstellingen ................................................................................................................ 12
2.
Materiaal en Methode ................................................................................................... 14
2.1.
Bespreking van de studiesoort, Arenicola marina......................................................... 14
2.1.1.
Ecologie .................................................................................................................. 14
2.1.2.
Morfologie.............................................................................................................. 14
2.1.3.
Plaats in het voedselweb ....................................................................................... 15
2.1.4.
Levenscyclus ........................................................................................................... 14
2.2.
Experimentele design .................................................................................................... 16
2.2.1.
Staalname en proefopzet ....................................................................................... 16
2.2.2.
Destructie en onttrekken van coeloomvocht ........................................................ 18
2.2.3.
NaI extractie ........................................................................................................... 18
2.2.4.
Biomerkerbepaling ................................................................................................. 18
2.3.
Dataverwerking – Statistische analyse .......................................................................... 21
3.
Resultaten ...................................................................................................................... 23
3. 1.
Analyse van de biomerkers ........................................................................................... 23
Inhoudsopgave 3.1.1.
Proteïnen/Eiwitten ................................................................................................. 23
3.1.2.
Suikers/Carbohydraten .......................................................................................... 24
3.1.3.
Lipiden/Vetten ....................................................................................................... 24
3.1.4.
ETS/Energieconsumptie ......................................................................................... 25
3.1.5.
Cellulaire energie allocatie (h-1) ............................................................................. 25
3. 2.
Analyse van de snelheid van ingraven .......................................................................... 26
3. 3.
Analyse van het natgewicht .......................................................................................... 27
3. 4.
Analyse van het drooggewicht van de faeces ............................................................... 28
3. 5.
Analyse van de microplastic fracties in de faeces ......................................................... 29
3. 6.
Tellingen van de sediment- en waterstalen .................................................................. 30
3. 7.
Destructie ...................................................................................................................... 31
3. 8.
Coeloomvocht ............................................................................................................... 32
4.
Discussie ......................................................................................................................... 33
4.1
De opname van microplastics ....................................................................................... 33
4.2
De impact van microplastics op fysiologische en biochemische parameters ............... 36
4.3
Potentieel toekomstig onderzoek ................................................................................. 39
4.4
Conclusie ....................................................................................................................... 39
5.
Samenvatting ................................................................................................................. 41
6.
Referenties ..................................................................................................................... 43
7.
Bijlage - Protocol ............................................................................................................ 46 1.
Homogenisation of the organism.................................................................................. 46
2.
Protein and carbohydrate measurement...................................................................... 46 2.1.
Protein analysis ...................................................................................................... 47
2.2.
Carbohydrate analysis ............................................................................................ 49
3.
Lipid measurement........................................................................................................ 50
4.
Electron Transport System (ETS) measurement ........................................................... 52
5.
Calculations of Ea and Ec ............................................................................................... 53 5.1.
Calculation of Ea (Energy available) ....................................................................... 53
5.2.
Calculation of Ec (Energy consumed)..................................................................... 54
5.3.
Calculate time to survive ....................................................................................... 55
Inleiding
1. Inleiding In de laatste 2 decennia van de 20ste eeuw zijn plastic materialen één van de meest algemene en hardnekkige verontreinigende stoffen in de oceanische ecosystemen, met een significante toename in de hoeveelheid van plastic gedurende de laatste 40 jaar. De dag van vandaag wordt plastic bijna in alle mariene stalen teruggevonden. Dit leidt tot de indruk dat de oceanen en kustzones een plastic landschap zijn. Dr. Curtis Ebbesmeyer schat dat de afbraak van één enkele 1l wegwerpfles met behulp van fotodegradatie genoeg kleine stukjes oplevert om 1 stuk te voorzien voor elke mijl strand (Moore, 2008). De stijgende productie van plastic producten en materialen is de oorzaak van een enorme mariene vervuiling en zorgt er voor dat de plasticvervuiling van de oceanen een aanslepend karakter krijgt waarvoor niet direct een oplossing bestaat. Er werd uitgerekend dat het gewicht aan plastic afval in een gebied van de Noord Pacifische Centrale gyre, gekend als de ‘Eastern Garbage Patch’, ongeveer 3 miljoen ton is. Deze schatting werd uitgevoerd over een gebied van 1000km in diameter. Dit levert dus een gemiddelde van 5 114 g/km2 op (Moore, 2008). De vervuiling van de oceanen met plastic neemt dus enorme proporties aan en blijft nog steeds stijgen. Het standpunt tegenover plastic afval nu en 30 jaar geleden heeft een hele evolutie doorgemaakt. 30 jaar geleden was men van mening dat de vervuiling met plastic eerder een doorn in het oog was aangezien het maar handelde over een redelijk kleine hoeveelheid. In de huidige samenleving is deze opvatting veel veranderd door de ontdekking van verscheidene schadelijke effecten voor dierlijke organismen als gevolg van de blootstelling aan plastic partikels. De continue en snelle stijging van de inlandse plastic productie, de lange levensduur van plastic in de omgeving en het wegwerpbare karakter van vele plastic materialen verstoort het mariene ecosysteem. Dit alles zorgt er voor dat de vervuiling van de oceanen met plastic nog steeds toeneemt (Thompson et al., 2004). Jaarlijkse studies op zee hebben aangetoond dat de toename van de hoeveelheid mega- en macroplastic een verandering ondergaan heeft en nu eerder stabiliseert, nog maar licht toeneemt of zoals op sommige plaatsen zelfs een daling ondergaat. Wat er wel uit de studies kon geconcludeerd worden is dat de gemiddelde diameter van de plastic partikels afneemt en dat de ophoping en verspreiding van microplastics aan belang wint (Barnes, 2009). De schadelijke effecten van macroplastic (> 20mm) op macro-organismen zoals vogels, vissen, schildpadden en vele andere gewervelde dieren (= vertebraten) is al goed bestudeerd en beschreven. Het is gekend dat 44% van alle zeevogels en -schildpadden plastiek opnemen in hun spijsverteringsstelsel. Er is echter een veelbeduidende toename in de hoeveelheid microplastic (< 1mm) aanwezig in de oceanen. De effecten van dit type plastic op kleinere organismen zoals mosselen, wormen en andere ongewervelde dieren (=invertebraten) is
1
Inleiding minder goed gekend en vereist meer onderzoek. Wereldwijd is geweten dat 267 mariene soorten beïnvloed worden door plastic en men is er zeker van dat dit aantal nog zal stijgen wanneer ook de kleinere organismen onderzocht worden (Moore, 2008). Het onderzoek van deze thesis handelt dan ook over de effecten van microplastics op de invertebrate wadpier, Arenicola marina.
1.1
Bronnen van plastic en accumulatie/verspreiding
Wereldwijd worden er jaarlijks meerdere miljoenen tonnen plastic geproduceerd waarvan het merendeel over een rechtlijnige levenscyclus beschikken bestaande uit productie, gebruik en verwijdering met een recyclagepercentage van minder dan 5%. In 2007 werd in de VS alleen al 58 miljoen ton plastic geproduceerd waarvan meer dan de helft wordt weggeworpen (Tamanaha & Moore, 2010). De hoge productie heeft geleid tot een verspreiding van zowel macro- als microscopische plastic fragmenten van de polen tot aan de evenaar en de accumulatie ervan in de diepe zee en sedimentaire leefgebieden van de kustzone (Thompson et al., 2004; Barnes, 2009). In het algemeen bestaat het mariene afval voor 60-80% uit plastic componenten en op sommige plaatsen kan dit percentage oplopen tot 90-95% (Derraik, 2002). Exacte cijfers van de hoeveelheden aan plastic aanwezig in de mariene ecosystemen zijn moeilijk te verkrijgen, maar over het algemeen wordt er geschat dat ongeveer 10% van al het plastic afval in de oceanen terechtkomt (Thompson, 2006). In sommige regionen, bvb. de Noord Pacifische Centrale gyre, worden er hoeveelheden opgemeten van 960 000 fragmenten per km2.
1.1.1.
Productie van plastic
Plastic verpakkingen en andere materialen worden geproduceerd met behulp van kleine, van petroleum afgeleide korreltjes. Deze zogenaamde ‘pellets’ zijn lichtgewichten en worden makkelijk getransporteerd door wind en water wanneer ze toevallig in het milieu terechtkomen. Tijdens het productieproces van de korreltjes tot de grotere synthetische polymeren worden verschillende additieven toegevoegd om de bruikbaarheid van de materialen te verhogen. Deze additieven, waarvan vele toxisch zijn bij bepaalde concentraties, omvatten onder andere weekmakers, vlamvertragers, anti-oxidanten en antimicrobiële agentia. Er kan een onderscheid gemaakt worden tussen verschillende soorten polymeren zoals onder andere polyester, polyethyleen, polypropyleen, polyvinylalcohol, polyamide (nylon),… (Thompson et al., 2004). De grootste bestemming van plastic in de huidige maatschappij is het gebruik ervan voor wegwerpmaterialen zoals verpakkingen, waarvan de meeste voor eenmalig gebruik zijn en afgedankt worden binnen een jaar na productie (Barnes et al., 2009).
2
Inleiding 1.1.2.
Oorsprong van plastic
De distributie van plastic afval overheen de oceanen en kustzones is wereldwijd ongelijk verdeeld als gevolg van beïnvloeding door de lokale winden, de hydrodynamica, de geografie en de plaats waar het plastic in de oceanen binnenkomt (Barnes, 2009). Er kan een voornamelijk seizoenale variatie in distributie en densiteit onderscheiden worden die een tendens vertoont voor accumulatie en concentratie van het plastic afval langsheen de geografische regio’s. De oorzaak van deze variatie is voornamelijk terug te vinden in de veranderingen in stroomsnelheden van rivieren, de ligging van waterwegen aan vervuilende gebeurtenissen, de intensiteit van stromingen en winden en de opwelling van het dieptewater. Eens het plastic de oceaan bereikt kan het op verschillende manieren verspreid worden. Een zeewind zal ervoor zorgen dat het afval terug naar de kust drijft terwijl een landwind het afval naar de voornaamste oceaanstromen stuurt waarna het al rondcirculerend de zeeën doorkruist. In de diepe oceaan zal de aanwezigheid van grote hoge druk systemen, gyren, het afval concentreren terwijl lage druk systemen het tegenovergestelde tot stand brengen en voor een verspreiding van het afval zorgen (Moore, 2008). Het aanwezige plastic in de oceanen is afkomstig van 2 verschillende bronnen. 20% van het plastic aanwezig in het zeewater heeft een oceanische oorsprong. De bronnen van dit plastic zijn drijvende en achtergelaten visnetten, afval van schepen,… afkomstig van vissersboten en cruiseschepen. De overgrote meerderheid van het plastic is afkomstig van het land. Er wordt geschat dat ongeveer 80% van het plastic aanwezig in de oceanen afkomstig is van het land (Moore, 2008; Gregory, 2009). De aanvoer van het plastic vanaf het land gebeurt door de vele waterwegen waarin het met de stroming meegevoerd wordt om zo uit te monden in de oceanen. Aangezien oceanen berg- en stroomafwaarts gelegen zijn van alle menselijke nederzettingen is men zeker dat het plastic meegevoerd wordt naar de oceanen toe. De indeling van het plastic in de oceanen zal gebeuren over verschillende grootteklassen: mega- (> 100mm), macro- (> 20mm), meso- (1-20mm) en microplastic (< 1mm). De focus van deze thesis ligt enkel op microplastic. Als achterliggende motivatie van dit focuspunt kan men stellen dat de laatste jaren deze grootteklasse een steeds groter aandeel verkregen heeft in de samenstelling van het aanwezige plastic afval in de oceanen. De reden van deze toename is niet eenduidig en heeft een aantal oorzaken aan de grondslag liggen. Ten eerste is er de natuurlijke bron door fragmentatie van grotere componenten in kleinere partikels. Bovendien werd er gesuggereerd dat plastic materialen opzettelijk versnipperd worden aan boord van schepen zodat het plastic afval mee met het visafval gedumpt kan worden op zee. De ophoping van microplastic neemt verder toe door het gebruik van plastic partikels als schurend bestanddeel in bepaalde verzorgings- en schoonmaakmiddelen en door de onopzettelijke lozing van preproductieve korrels en poeders (Barnes, 2009). Hun belang wordt nog eens extra benadrukt doordat microplastics beschikbaar zijn voor een bredere
3
Inleiding waaier aan mariene organismen in vergelijking met macroplastics en moeilijk te verwijderen zijn uit de omgeving.
1.1.3.
Degradatie van plastic
De meest voorkomende vorm van microplastics zijn onregelmatige vormen zoals dunne vezels. De snelheid van afbraak is zeer traag waardoor de toekomstige verblijftijd van plastic in onze oceanen kan oplopen tot de omvang van decennia en eeuwen. De verblijftijd is afhankelijk van de chemische en fysische eigenschappen van de eenheidsbestanddelen waaruit het plastic is samengesteld. Deze al redelijk hoge leeftijd ligt waarschijnlijk nog hoger in de diepzee en de niet oppervlakkige polaire regio’s. De oorzaken hiervoor zijn de lage zuurstofcondities en de verminderde blootstelling aan UV-straling (Barnes, 2009). Als voorbeeld kan gesteld worden dat de finale degradatie van een wegwerpfles ongeveer 450 jaar in beslag zal nemen (Tamanaha & Moore, 2010). De oorzaak van deze hoge leeftijd is het gevolg van de hoge resistentie van het synthetische materiaal tegen biodegradatie (Thompson et al., 2004). De afbraak van plastic in het milieu tot kleinere partikels gebeurt door een combinatie van fotodegradatie, oxidatie en mechanische schuring (Ryan et al., 2009). In het proces van fotodegradatie zal het plastic afgebroken worden als gevolg van de blootstelling aan UV-straling en dit tot microscopische partikels van 1,6 µm (Tamanaha & Moore, 2010). De fragmentatie, met een toenemende hoeveelheid aan microscopische plastics als gevolg, zal er toe leiden dat een groter aantal soorten risico’s lopen op nadelige effecten als gevolg van de blootstelling aan plastic partikels. De degradatie van plastic in mariene ecosystemen verloopt trager dan in het terrestrische milieu. De achterliggende reden hiervoor is dat de temperatuur van het oceaanwater relatief laag is waardoor de vereiste accumulatie van hitte, noodzakelijk voor de afbraak, verhinderd wordt (Tamanaha & Moore, 2010). Een andere oorzaak van de vertraagde afbraak is de aangroei van organismen aan het oppervlak van de plastic fragmenten. Deze aangroei zal een deel van het partikel afschermen voor de UV-stralen (Barnes, 2009). De additionele massa zorgt ervoor dat het partikel zinkt waardoor UV-stralen het plastic partikel niet meer bereiken en zal er dus ook geen afbraak van het plastic plaatsvinden. Dit leidt tot de vervuiling van de zeebodem of kustsediment met plastic.
1.2
Impact voor het mariene ecosysteem
Plastic fragmenten kunnen de achterliggende oorzaak zijn voor een verzameling aan nadelige effecten zoals het veroorzaken van zowel uitwendige als inwendige wonden, maagzweren, een reductie van de levenskwaliteit en de reproductieve capaciteit en het ontsnappen aan predatoren benadeelt. Het grootste gevaar van plastic is echter het gevolg van de consumptie van dit materiaal door de mariene organismen. Een groot aantal van zeeorganismen zijn niet selectieve eters en maken geen onderscheid tussen een plastic of
4
Inleiding een voedselpartikel. Het verkeerdelijk aanzien van dit plastic als voedsel zal dus leiden tot de opname van deze partikels in het spijsverteringsstelsel. De opname en het transport van het plastic brengt dus een aantal risico’s met zich mee. De reeds gekende problemen zijn verstikking, verwikkeling en verzwakking van het organisme (Gregory, 2009). De bovenstaande problemen zijn reeds bestudeerd bij de grotere organismen zoals de vertebraten. Hieronder wordt een selectie gegeven van een aantal potentieel schadelijke effecten.
1.2.1.
Verstikking en ‘ghost fishing’
Gedurende de laatste 50 jaar werd steeds meer vismateriaal van natuurlijke oorsprong systematisch vervangen door nylon en andere synthetische materialen die duurzamer zijn en over een groter drijfvermogen beschikken. Net deze kwaliteiten die de aandacht getrokken hadden van de amateurs- en beroepsvissers zijn de redenen dat plastic afval een groot gevaar vormt voor het mariene leven (Gregory, 2009). Achtergebleven netten, lijnen en sleepnetten strikken vele onwetende mariene organismen zoals schildpadden, vissen, mariene zoogdieren, schaaldieren en vogels met als resultaat een verstikkings- of verdrinkingsdood (Derraik, 2002). Deze manier van vissen (ghost fishing) vindt niet alleen plaats aan het wateroppervlak, maar wordt gevonden tot op dieptes van 2000m (Murray, 2009).
1.2.2.
Verstoring van de vertering
Door het hoge moleculaire gewicht en de aard van de chemische bindingen van het plastic zal dit nooit verteerd worden. Het opnemen van deze plastic materialen voorziet dus geen nutriënten aan het organisme, maar toch ervaren ze een verzadigingsgevoel. Opname van plastic kan leiden tot irritatie van de maag (door scherpe randen), blokkeren van het spijsverteringsstelsel en het falen in het voorzien van de noodzakelijke vetreserves voor migratie en reproductie (Moore, 2008). Er is een stijging opgemerkt in de frequentie van opname naarmate de concentratie aan plasticvervuiling stijgt in de tijd. Uiteindelijk zal accumulatie van het plastic in de maag leiden tot een verhongeringsdood (Tamanaha & Moore, 2010). De hierboven beschreven effecten zijn voornamelijk het gevolg van de opname van de grotere plastic partikels door vogels, vissen, zeeschildpadden,… en zijn voornamelijk beschreven voor de vertebrate soorten. De toenemende hoeveelheden aan micropartikels zorgt er voor dat deze aan belang winnen in het mariene ecosysteem. Microplastics kunnen biofilms accumuleren, zinken en vermengen met het sediment waar bodembewonende invertebraten ze als voedsel aanzien en opeten (Graham & Thompson, 2009). Het toenemende belang is echter een rechtstreeks gevolg van hun beschikbaarheid voor een bredere waaier aan invertebraten die zich voornamelijk aan de basis van de voedselketen
5
Inleiding bevinden als primaire en secundaire consumenten. Het betreft invertebraten zoals zeepokken (filtervoeders), wadpieren (surface deposit feeder) en amfipoden (detritivoren) die de microplastics kunnen opnemen vanuit het water of sediment via een niet-selectieve methode van voeden (Thompson et al., 2004). Er kan zelfs gesuggereerd worden dat de opname van microplastics door de bodembewonende soorten een manier van herintroductie in de voedselketen is van reeds bezonken plastic materiaal. Eens microplastics opgenomen worden door het organisme kunnen ze ofwel opgehouden worden in het spijsverteringskanaal, ontlast worden met de faeces of getransfereerd worden over het epitheliale membraan heen naar andere weefsels (translocatie). Er zijn al een aantal studies uitgevoerd in verband met de opname van microplastics door invertebraten. Voorgaand onderzoek met als studiesoort de mossel heeft reeds aangetoond dat dit organisme microplastic partikels opneemt (Browne et al., 2008). In een andere studie werden 4 soorten zeekomkommers getest die 2 verschillende manieren van voedselvergaring hadden. In deze studie werd bewezen dat mariene vertebraten microplastics van verschillende groottes en vormen opaten op voorwaarde dat ze klein genoeg waren om in hun mond te passen (Graham & Thompson, 2009). Nog een andere studie toonde aan dat filtervoedende borstelwormen, tweekleppigen, stekelhuidigen en mosdiertjes 10 µm polystyrene microplastics opnamen (Ward & Shumway, 2004). Het is dus waarschijnlijk dat de meeste bodembewonende soorten microplastics opnemen zolang deze vergelijkbaar zijn in grootte met andere voedselpartikels. De effecten van de micropartikels (< 1mm) zijn minder goed gekend (Thompson, 2006; Browne et al., 2008) en vereisen dus gedetailleerder onderzoek. Het is mogelijk dat de opname van microplastic een fysische bedreiging vormt gelijkaardig aan macroplastic en dit door het verstoppen van het spijsverteringskanaal. Microplastic bezit de mogelijkheid om opgenomen te worden vanuit het darmkanaal en zich zo in andere lichaamsweefsels te nestelen (Derraik, 2002; Browne et al., 2008). Een studie met betrekking tot de mossel Mytilus edulis toonde aan dat de mogelijkheid tot accumulatie in het weefsel toenam naarmate de diameter van de microplastic partikels afnam (Browne et al., 2008). Het is nog niet echt duidelijk of microplastic partikels translocatie kunnen ondergaan waardoor ze in het circulatorisch systeem van het organisme terecht komen. Een studie over de mossel heeft echter aangetoond dat microplastic partikels kleiner dan 10 µm translocatie kunnen ondergaan naar het hemolymfe. Translocatie naar het circulatorisch systeem is afhankelijk van de grootte van de partikels en partikels met een diameter groter dan 10 µm worden waarschijnlijk niet opgenomen. Als deze translocatie kan gebeuren voor de mossel, is het mogelijk dat microplastic opgenomen door de wadpier ook getransporteerd wordt naar het circulatorisch syteem van het organisme. De mogelijke accumulatie en persistentie van deze partikels in het circulatorisch systeem kan gevolgen hebben voor predatoren die deze partikels opnemen via hun prooidieren. Een reden tot ongerustheid is de mogelijke overdracht van microplastic van het ene organisme naar het
6
Inleiding andere bij de consumptie hiervan. Murray & Cowie (2011) toonden in hun studie aan dat plastic afval werd gevonden in de maag van de kreeftachtige Nephrops norvegicus. De meest waarschijnlijke route van opname is via gecontamineerd voedsel of sediment. N. norvegicus eet een verscheidenheid aan organismen zoals schaaldieren, tweekleppigen, borstelwormen en stekelhuidigen. Teuten et al. (2009) leverde bewijs van de implicatie van microplastics op de voedselketen door zijn onderzoek met kuikens van stormvogels die hij vissen voerde die gecontamineerd waren met microplastics die op hun beurt met PCB’s bezet waren. De concentratie aan PCB’s in de kuikens die met de gecontamineerde vis gevoerd werden was ongeveer 3 maal hoger dan in kuikens die gewone vissen te eten kregen. Er trad dus transfer op van PCB’s vanaf microplastics in de vis naar de kuikens. Er is meer werk vereist om vast te stellen of microplastics doorheen het darmkanaal passeren zonder schade aan te richten of dat er een mogelijk risico bestaat dat deze partikels ophopen in de darm met een verminderde efficiëntie in voedingsopname en een incorporatie in de lichaamsweefsels tot gevolg.
1.2.3.
Toxiciteit
Plastic materialen kunnen dienen als opslagplaats voor persistente organische polluenten (POP’s) en beschikken dus over het potentieel om chemicaliën te absorberen, te transporteren en vrij te stellen (Moore, 2008; Thompson et al., 2004; Mato et al., 2001). De accumulatie van persistente organische chemicaliën en andere verontreinigende stoffen op het oppervlak van het plastic fragment kan leiden tot een verhoging van de concentratie die verschillende malen groter is dan de achtergrondconcentratie van het zeewater. Deze concentratie is soms 1 000 000 maal hoger dan de achtergrondconcentratie van de oceanen (Tamanaha & Moore, 2010; Mato et al., 2001). Zo hebben studies al aangetoond dat plastic polychloorbifenyl (PCB’s) absorberen vanuit het omringende zeewater. De mate van absorptie is afhankelijk van de plasticsoort, zo zal polyethyleen over een hogere opnamecapaciteit beschikken dan andere plastics zoals polypropyleen en PVC. Voorbeelden van chemicaliën zijn onder andere hydrofobe polluenten zoals PCB’s, petroleum koolwaterstoffen, pesticiden (DDT,…) en bisfenol A (Teuten et al., 2009). Deze chemicaliën kunnen in 2 groepen geclassificeerd worden: een eerste groep van hydrofobe chemicaliën wordt geabsorbeerd vanuit het omgevende zeewater als gevolg van de affiniteit van de chemicaliën voor het hydrofobe oppervlak van de plastic partikels. Een tweede groep van chemicaliën zijn de additieven toegevoegd tijdens het productieproces en de componenten waaruit het plastic is opgebouwd. De concentraties van de contaminanten die geabsorbeerd zijn aan plastics vertonen een hoge variabiliteit en zijn oneven verdeeld (Endo et al., 2005). Een belangrijke opmerking hierbij is dat de concentraties van bepaalde toxische stoffen afhankelijk zijn van de leeftijd van het plastic (Rios et al. 2007). Aangezien de afbraak van plastics een aantal decennia of eeuwen kan duren kunnen deze concentraties hoog worden. Dit vormt een groot gevaar bij
7
Inleiding de blootstelling aan plastics in het mariene milieu. Ook metalen kunnen geassocieerd zijn met plastic partikels (Ashton et al., 2010). Deze metalen zijn waarschijnlijk aanwezig in een beschikbare vorm voor opname door de fauna. Wanneer de plastics dan opgenomen worden is het mogelijk dat de geassocieerde metalen overgedragen worden aan het organisme wat kan leiden tot een metaalvergiftiging. Andere chemische stoffen die geabsorbeerd zijn aan het plasticoppervlak zijn het pesticide DDT met een concentratie tussen 22 en 7100 ng/g, PCB’s met concentraties van 27 tot 980 ng/g plastic, PAK’s met concentraties van 39 tot 1200 ng/g en alifatische koolwaterstoffen met concentraties van 1.1 tot 8600 µg/g (Rios et al., 2007). De directe effecten van de chemicaliën op het organisme zijn vaak niet geweten, maar ze kunnen een impact hebben op de groei en de reproductie als de concentratie hoog genoeg is (Murray & Cowie, 2011). Wat wel zeker gezegd kan worden is dat door de toenemende abundantie van plastic partikels steeds meer microplastics worden opgenomen. Hierdoor stijgt de blootstellingsgraad van de organismen aan de chemische stoffen geassocieerd met het plasticoppervlak. Elk van deze verontreinigende stoffen vormt een ander risico voor de gezondheid van de mariene organismen met een verzameling aan biologische effecten tot gevolg. Zo kunnen vele van deze polluenten geclassificeerd worden onder de noemer ‘endocriene verstoorders’. Bisfenol A bijvoorbeeld, beïnvloedt de sekshormonen en verstoort de groei, de beenderontwikkeling, de insuline signaalpathway en de hersenontwikkeling (Oehlmann et al., 2008). Deze verontreinigende stoffen kunnen dan bioaccumuleren in het vetweefsel van de organismen en hogere trofische niveaus zoals zeevogels, vissen en mariene zoogdieren worden beïnvloed als gevolg van biomagnificatie van de vervuilende stof doorheen de voedselketen. Marien plastic is de drager voor chemicaliën van kleiner moleculair gewicht en voor de meeste soorten zal de dominerende route van transfer van chemicaliën afkomstig van het plastic gebeuren via de opname van de plastic partikels. Er wordt gespeculeerd dat de geabsorbeerde chemicaliën aan het plastic fragment vrijgesteld worden bij blootstelling van het plastic aan de maagcondities. Daarna kunnen deze chemicaliën de cellen penetreren en chemisch inwerken op biologisch belangrijke moleculen. Absorptie van de chemicaliën aan het plasticoppervlak kan ook de biodegradatie van de verontreinigende stof verhinderen waardoor de verblijftijd in de omgeving verhoogd wordt. Teuten et al. (2007) vond dat een verontreinigende stof, fenantreen, werd overgebracht naar de wadpier, Arenicola marina. De vervuilende stof bleek afkomstig te zijn van polyethyleen fragmenten aanwezig in het sediment waar de worm in leefde en waar de stof aan geabsorbeerd was. Voor ‘surface deposit feeders’ zoals de wadpier is de opname van sediment gecontamineerd met verontreinigende stoffen de primaire bron voor de accumulatie van hydrofobe toxische stoffen. In de darm treedt er desorptie op van de contaminanten vastgehecht aan de dragers en dan transport overheen de darmwand (Wenston et al., 2000).
8
Inleiding Recente in vivo modellerende studies hebben aangetoond dat zelf kleine hoeveelheden van microplastic over het potentieel beschikken om het transport van fenantreen naar A. marina beduidend te verhogen (Teuten et al., 2007). Het is ook aangetoond dat digestieve surfactantia, geïsoleerd uit detritivoren, de desorptie van zowel PCB’s als PAK’s (polycyclische aromatische koolwaterstoffen) verhogen. Microplastics vormen een meer waarschijnlijke route voor de transfer van chemicaliën dan het macroplastic vanwege hun groter oppervlakte-volume ratio (Barnes, 2009). Dit gekoppeld met hun stijgende hoeveelheden, het toevallig aanzien als voedsel en het groter aantal organismen dat microplastics kunnen opnemen, inclusief Arenicola marina, zorgt er voor dat microplastics een groot gevaar vormen voor het mariene leven. Maar niet alleen voor de lagere trofische niveaus vormen microplastics een risico. Ook voor de hogere trofische niveaus (= roofdieren) is er een bedreiging. Het prooidier kan in zijn weefsels een bepaalde concentratie aan hydrofobe en slecht gemetaboliseerde verontreinigende stoffen zoals PCB’s geaccumuleerd hebben als gevolg van de transfer van deze chemicaliën vanaf het plastic. Hogere trofische niveaus beperken zich niet tot de consumptie van slechts één enkel dier, maar voeden zich met meerdere prooien. Dit zorgt dat de concentratie aan hydrofobe contaminanten in hun weefsels accumuleren en verhogen overheen de verschillende trofische niveaus van het voedselweb (biomagnificatie). Ondanks vele speculatie is de omvang van het toxisch risico van plastiek in de mariene omgeving nog niet bekend (Thompson, 2006).
1.2.4.
Invasieve soorten
Bij het transporteren van plastic fragmenten overheen de oceaanstromingen kunnen bacteriën, planten en dierlijke organismen zoals mosdiertjes, algen, zeepokken, molluscen,… zich vasthechten aan deze fragmenten en meeliften naar nieuwe gebieden. In deze context kunnen de plastic partikels aanzien worden als drijvende eilandjes waarvan de inwoners zich als invasieve soorten kunnen gedragen bij de introductie in een nieuw habitat en de inheemse soorten verdringen. Hierbij vormen de invasieve soorten een gevaar voor de mariene biodiversiteit door de verstoring van de structuur en evenwicht van het inheemse habitat en bedreiging van de endemische biota (Murray, 2009; Moore, 2008; Gregory, 2009). De combinatie van de stijgende hoeveelheden van synthetische materialen aanwezig in de oceanen en de enorme afstanden die deze eilanden van biodiversiteit afleggen zorgt er voor dat dit een grote bedreiging vormt voor de natuurlijke fauna en flora wereldwijd (Gregory, 2009).
9
Inleiding 1.3
Het gebruik van biomerkers bij de opsporing van vervuiling
Mariene en kustsedimenten hebben in de loop der tijden aanzienlijke hoeveelheden aan vervuilende stoffen geaccumuleerd. De vervuiling van de mariene sedimenten is een combinatie van verschillende verontreinigende componenten zoals oliën, metalen, koolwaterstoffen en in dit geval plastic. Blootstelling aan vervuiling kan leiden tot nadelige effecten voor de bewoners van het sediment. De concentratie aan vervuilende stoffen en zeker in het geval van plastic is de laatste decennia toegenomen en stijgt nog altijd. Door de verhoging van de concentraties van blootstelling moet er op zoek gegaan worden naar effectieve middelen om de impact en de draagwijdte van de vervuiling aan te tonen voor het ecosysteem en zijn aanwezige biodiversiteit. Een geschikte methode voor de beoordeling van het effect van pollutie op ecosystemen ligt in het gebruik van biomerkers om de biologische schade veroorzaakt door de blootstelling aan de verontreinigende stoffen op te meten. Biomerkers kunnen gedefinieerd worden als kwantitatieve metingen van veranderingen in biologische systemen als gevolg van blootstelling aan een bestanddeel met biologische effecten tot gevolg (Picado, 2007). Het algemeen principe achter dit hulpmiddel is dat er een aantal organismen; die in direct contact stonden met de vervuiling via sediment, water of lucht; worden gesurveilleerd. De soorten die in aanmerking komen voor de analyse met biomerkers moeten voldoen aan een aantal criteria zoals rijkelijk aanwezig zijn in het milieu, het potentieel om de verontreinigende stof te accumuleren en de geschiktheid van de weefsels voor de analyse (Hingston et al., 2002). De analytische resultaten van de biomerkers tussen blootgestelde en controleorganismen worden vergeleken om de schade en ernst van de vervuiling te beoordelen en zo eventueel beslissingen in verband met preventie- of herstellingsmaatregelen te ondersteunen. Het gebruik van biomerkers is nuttig in de ecologische risicoschatting om accurate informatie te verschaffen over de gezondheid van mariene ecosystemen. De combinatie van chemische en biologische beoordelingstechnieken laat toe om de impact van de verontreiniging op een organisme of ecosysteem te beoordelen. Biomerkers zijn functionele metingen om blootstelling aan een verontreinigende stof op sub-organismaal, fysiologisch en gedragsniveau te beoordelen en kunnen dus dienen als vroege waarschuwingssignalen voor de aanwezigheid van potentieel vervuilende stoffen (Picado, 2007). Het gebruik van biomerkers als middel om verontreiniging te beoordelen wint daarom steeds meer aan belang in de risicoschatting. In deze studie wordt de wadpier, Arenicola marina, gebruikt als studieorganisme om de impact van de pollutie van met microplastics gecontamineerd sediment te beoordelen voor de sedimentbewoners. Het gebruik van dit organisme voor de evaluatie van de vervuiling met microplastic is geen ongewone keuze ook al zijn er weinig voorafgaande biomerkerstudies die A. marina als studieorganisme gebruiken. A. marina is zeer geschikt voor de biologische opvolging van de impact van vervuiling voor de sedimentbewoners
10
Inleiding (Morales-Caselles, 2009). Als gevolg van zijn wijze van voeding passeren er door de darm van de wadpier grote volumes sediment per dag en wordt A. marina dus continue blootgesteld aan de verontreinigende stoffen aanwezig in het sediment. Naast deze blootstelling is de wadpier ook een belangrijke schakel in de voedselketen van de kustzones. De geschiktheid van A. marina voor de analyse met behulp van biomerkers zal helpen in de ecologische risico-evaluatie voor de sedimentbewoners aan de blootstelling met microplastics, net als de evaluatie van de sedimentkwaliteit. De vraag kan dus gesteld worden of er een betekenisvolle relatie gevonden kan worden tussen de blootstelling van A. marina aan het microplastic en een biologische respons van het organisme als gevolg van de blootstelling.
1.4
Oplossingen voor de vervuiling
De meerderheid van plastics die vrijgesteld worden in het milieu is het resultaat van niet efficiënt afvalbeheer en ongepast menselijk gedrag zoals het onverantwoord weggooien van afval met de vorming van zwerfvuil tot gevolg (Barnes, 2009). Een aantal mogelijke oplossingen voor de vervuiling van de oceanen met plastics zijn het toenemen van de recyclering, het gebruiken van biodegradeerbaar plastic, de reductie van de afvalstroom en het bewust maken van de gebruikers van het probleem. Op lange termijn lijkt het aanpakken van het probleem aan de bron de enige effectieve oplossing. Het reduceren van de afvalstroom wordt verwezenlijkt door de reductie van de vraag door de gebruiker of door het gebruiken van duurzamere plastics. Deze oplossing leidt tot een afname van de snelheid van accumulatie van plastics in het zeewater en sediment, maar zal niets veranderen aan de huidige concentratie van afval dat zich al in de oceanen bevindt. Plastics staan bekend als het materiaal dat het minst gerecycleerd wordt met percentages die lager liggen dan 5% (Werthmann, 2007). Er is dus dringend nood aan een verhoging van dit recyclagepercentage. Dit kan gebeuren met behulp van geavanceerde recyclagetechnologieën of door een toenemend bewustzijn bij het grote publiek. Voor het onderwijzen van de gewone mens over het probleem van plasticvervuiling is de media een handig hulpmiddel. De media kan het gevaar van toxische chemicaliën in plastic producten onderwijzen net als de gevaren van deze materialen voor het milieu. Hoe meer het publiek weet over de schadelijke effecten van plastics in de omgeving, hoe actiever het publiek wordt in de regulatie van deze verontreinigende materialen. Een andere oplossing is het gebruik van biodegradeerbaar plastic dat sneller afgebroken wordt en omgezet wordt tot CO2, methaan, water, anorganische componenten en biomassa. Dit biodegradeerbaar plastic bestaat uit cellofaan, rayon, polylactaatzuur en
11
Inleiding polyhydroxylalkanoaat. Een nadeel echter is de hogere kostprijs van dit plastic dat 5 tot 10 maal duurder is dan van petroleum afgeleide plastics.
1.5
Doelstellingen
Het onderzoek van deze thesis kadert in een blootstellingsstudie met als studiesoort Arenicola marina. Het onderwerp van deze thesis spitst zich toe op het onderzoeken van de potentiële effecten van microplastics op het organisme Arenicola marina. Hierbij wordt specifiek onderzocht of de microplastic partikels opgenomen worden in de lichaamsweefsels en het coeloomvocht. De studie houdt in dat er een twee weken durend experiment wordt opgezet waarbij de testorganismen worden blootgesteld aan relatief lage concentraties microplastics. De verontreinigende stof bestaat uit polystreen partikels van drie groottes, respectievelijk 10, 30 en 90 µm in diameter. In totaal worden voor het experiment 30 wormen gebruikt, waarvan 20 worden blootgesteld en 10 als controleorganismen dienen. De blootstellingsstudie van Arenicola marina aan “latex beads” werd opgesteld om antwoorden te vinden op een aantal onderzoeksvragen in verband met de vervuiling van het sediment in de oceanische zones met microplastics. Er zijn een viertal onderzoeksvragen waarop getracht werd een antwoord te vinden: Heeft de aanwezigheid van microplastics in het sediment een effect op het gedrag en de voedselopname van het testorganisme? Het effect van microplastics op het gedrag van Arenicola marina wordt onderzocht door een klein gedragsexperiment uit te voeren. Er wordt voor de start van het experiment een meting gemaakt van de tijdsduur van ingraven. Tijdens de verversing van het sediment wordt deze handeling herhaald en er wordt onderzocht of deze tijdsduur beduidend van elkaar verschillen voor de twee metingen. Het onderzoeken van het effect van microplastics op de voedselopname zal gebeuren door de opvolging van het drooggewicht van de faeces tijdens de loop van het experiment. Er wordt gezocht naar een verband tussen een potentieel aangetaste voedselopname (verandering gewicht faeces) en de microplastics. Naast de opvolging van het gewicht van de faeces gedurende de studie, wordt ook het gewicht van de worm bepaald vóór, tijdens en na het experiment. Is er een effect op het gewicht van de wormen als gevolg van de aanwezigheid van microplastics in hun leefmilieu? Is er opname van plastics en worden deze dan weer uitgescheiden? Om te onderzoeken of de wormen microplastics opnemen en weer uitscheiden worden de faeces van de blootgestelde wormen verzameld en de microplastics worden eruit geëxtraheerd met behulp van NaI. De geëxtraheerde microplastics worden dan geteld waarbij een onderscheid gemaakt wordt tussen de verschillende
12
Inleiding groottes om na te gaan of er een bepaalde fractie achterblijft in het organisme. Deze achtergebleven fractie wordt dan mogelijk in de weefsels opgenomen of getransporteerd naar het coeloomvocht. Wordt er een bepaalde groottefractie opgenomen in de weefsels? Als uit de analyse van de faeces blijkt dat een bepaalde fractie van het microplastic zou verdwijnen zou dit een indicatie kunnen zijn dat dit type van plastic opgenomen wordt in het weefsel van het testorganisme. Een antwoord op de vraag wordt onderzocht door het onttrekken van coeloomvocht voor een deel van de blootgestelde organismen. Daarna worden ze gedestrueerd en gefiltreerd om te onderzoeken of er bepaalde microplastics aanwezig zijn in het weefsel. Er wordt dan onderzocht welke groottefracties aanwezig zijn in circulatorisch systeem door de studie van het coeloomvocht. Heeft de aanwezigheid van de microplastics in het sediment een invloed op de energiereserves van de wormen? Om de impact van vervuiling op het organisme na te gaan worden enkele biologische biomerkers bepaald en in dit geval zijn dit de concentraties aan vetten, suikers en eiwitten. Als laatste biomerker wordt ook de energieconsumptie gemeten (ETS). De analyse van de biomerkers tussen controle- en blootgestelde organismen zal een beeld geven van de inwerking van microplastics op het organisme.
13
Materiaal & Methode
2. Materiaal & Methode 2.1. Bespreking van de studiesoort, Arenicola marina 2.1.1.
Ecologie
Arenicola marina is een zeer algemeen voorkomende soort en leeft ingegraven in het sediment van kustzones waar hij voornamelijk voorkomt in de intergetijdenzone (Bijkerk & Dekker, 1991). Hun leefmilieu van voorkeur bestaat uit zandige tot gemengde modder- of zandplaten (=wad) met fijne tot middelfijne korrelgrootte. In deze levensomstandigheden kan de densiteit aan volwassen wadpieren oplopen tot 20 à 70 dieren per m 2. Ook al leeft de wadpier in de dieptelagen van het sediment, toch voeden ze zich met materiaal van het sedimentoppervlak (surface deposit feeder). Ze voeden zich met de organische fractie van het sediment waarbij hun belangrijkste voedselbronnen bestaan uit micro-organismen zoals bacteriën en benthische diatomeeën (Bijkerk & Dekker, 1991). Het opnemen van sedimentdeeltjes gebeurt met behulp van de uitstulpbare, met papillen bezette proboscis. Uit het sediment worden voornamelijk partikels kleiner dan 300 µm opgenomen. In het sediment leeft de volwassen wadpier tot op een diepte van 15 tot 40 cm in een L- tot J-vormige gang waarvan de wand bekleed is met slijm (zie figuur 1). Het dier bevindt zich vooral in het horizontale gedeelte van de gang met de kop gericht naar het blinde uiteinde (Bijkerk & Dekker, 1991). Vanaf het sedimentoppervlak zal constant vers sediment zakken in een dunne kolom ( de ‘quicksand column’) naar het blinde einde van de leefgang. Hier wordt het sediment door de wadpier opgenomen. Door het continue wegzakken van sediment zal aan het blinde einde van de gang een trechter ontstaan aan het oppervlak. Aan het open einde van de buis zal defaecatie plaatsvinden en wordt dus gekenmerkt door snoervormige, licht verslijmde faeceshoopjes. Langs deze opening verloopt ook de toevoer van water waaruit de wadpier zuurstof haalt. Figuur 1: Leefmilieu A. marina (bron: Bijkerk & Dekker, 1991)
2.1.2.
Morfologie
De wadpier, A. marina, is een borstelworm (Polychaeta) met een lichaamslengte van doorgaans 10 à 20 cm, die een leeftijd van 6 jaar kan bereiken. Jonge dieren zijn meestal vleeskleurig terwijl volwassen wadpieren roodbruin of zwartbruin zijn (Bijkerk & Dekker,
14
Materiaal & Methode 1991). Er kunnen drie delen onderscheiden worden aan het lichaam van de wadpier: (1) een relatief klein kopgedeelte zonder kieuwen, (2) een dikkere romp dat borstels en kieuwen draagt en (3) het dunne, borstelloze staartdeel (zie figuur 2). Prostomium, buccaalsegment en het daaropvolgende, borstelloze segment vormen samen de kop. De volgende 19 segmenten bezitten borstels. Elk segment beschikt over één paar notopodia met lange borstels en één paar neuropodia met kleinere, gebogen chaetae (haren). De borsteldragende segmenten 7 tot 19 dragen een paar kieuwen. De voorste kieuwen kunnen kleiner zijn of ontbreken bij jonge wadpieren.
Figuur 2: Morfologie A. marina (bron: Bijkerk & Dekker, 1991)
2.1.3.
Plaats in het voedselweb
Predatie door andere dieren lijkt de voornaamste doodsoorzaak te zijn voor A. marina. De wadpier dient als voedsel voor een aantal andere dieren afhankelijk van de getijden (Bijkerk & Dekker, 1991). Bij laag water dient het gehele organisme als voedsel voor een aantal vogels zoals onder andere de scholekster, de wulp, de zilverplevier, de bontbekplevier, het visdiefje en de rosse grutto. Bij hoog water dient de wadpier als voedsel voor platvissen zoals schol en bot. In de meeste gevallen wordt slechts een deel van A. marina opgegeten en happen de platvissen enkel maar het staarteinde af. Het verloren gaan van het staarteinde wordt makkelijk hersteld door de vorming van nieuw staartweefsel door de verlenging van overgebleven staartsegmenten. Het opeten van de staarteinden zou een oorzaak kunnen zijn van de gemiddelde levensverwachting van 6 jaar voor de wadpier. Bij een jaarlijks verlies van gemiddeld 24 segmenten per individu zal na 5 tot 6 jaar het aantal staartsegmenten verminderd zijn tot het minimumaantal van 3. Het bezitten van maar 3 staartsegmenten is dodelijk voor de wadpier (Bijkerk & Dekker, 1991). Ook de juveniele wormen worden opgegeten. De vroege stadia (0,5-3 mm) worden gegeten door carnivore platwormen zoals Monocelis fusca. Oudere stadia (15-30 mm) worden geconsumeerd door de zeeduizendpoot (Nereis diversicolor).
2.1.4.
Levenscyclus
A. marina zijn éénslachtig wat wil zeggen dat de geslachten gescheiden zijn. Op tweejarige leeftijd is de wadpier geslachtsrijp. Vanaf dan gaan de individuen zich één maal per jaar voortplanten. De voortplantingsperiode valt in de maanden augustus en september (Bijkerk & Dekker, 1991). Mannelijke dieren stellen hun spermacellen vrij in het water waardoor ze
15
Materiaal & Methode samen met het water meegevoerd worden tot in de gangen van de vrouwelijke dieren. De eicellen worden bevrucht in de leefgang van het vrouwelijke dier en worden dan onderin de leefgang afgezet. Na vier of vijf dagen komen de larven uit. Het trochophora stadium wordt doorgebracht in de gang van de moeder. Na drie tot vier weken hebben de larven 3 borsteldragende segmenten verkregen en zal een eerste migratie plaatsvinden waarbij de larven uit het sediment kruipen om zich daarna met de getijdenstromen te laten meevoeren. Hierna overwinteren ze op een beschutte plek in de intergetijdenzone en ontwikkelen zich tot het zogenaamde Benhamstadia. In dit stadia zijn de wormpjes enkele mm groot en bezitten ze nog geen volledig ontwikkelde kieuwen. In maart tot juni zijn de wormpjes 6 mm lang en zal een tweede migratie plaatsvinden. Een groot deel van de postlarvale stadia zal zich vestigen op sedimenten met een relatief hoog slibgehalte vlak onder de hoogwaterlijn (broedwadden). Op deze wadden ontbreken volwassen wadpieren. Na een jaar zijn de juveniele wormen ongeveer 5 tot 6 cm in lengte. Een derde migratie vindt plaats in de winter waarbij de jongere wormen zich bewegen naar lager gelegen plaatsen om zich uiteindelijk te vestigen tussen de volwassen individuen. Plotseling invallende koude met temperaturen rond of beneden het vriespunt leidt tot een trek van volwassen wadpieren naar plaatsen lager gelegen in de intergetijdenzone. Hierdoor ontstaat een lege ruimte hoger op het wad die kan dienen voor de vestiging van de jonge wadpieren, hetzij in het late voorjaar, hetzij in de daaropvolgende winter (Bijkerk & Dekker, 1991).
2.2. Experimentele design 2.2.1.
Staalname en proefopzet
A. marina testorganismen en sediment zijn afkomstig uit een kuststrook ter hoogte van Middelkerke en werden verzameld op 16 maart, 2011. De testorganismen worden verzameld door het sediment om te woelen met een spade en de wormen te collecteren met de hand (pierenspitten). A. marina worden na verzameling per 10 geplaatst in aquariums van 10 L met zuiver artificieel zeewater en ongezeefd sediment afkomstig van dezelfde staalnameplaats. De aquaria worden gehouden onder gecontroleerde omstandigheden van 15°C waarin de wormen voor 7 dagen acclimatiseren aan de omgevingstemperatuur. Beluchting wordt voorzien met een 12:12 licht/donker fotoperiode. Het verzamelde sediment is afkomstig van de bovenste strandlagen (0-50 cm diepte). Na transport naar het labo wordt het sediment gezeefd over een zeef met meshgrootte van 600 µm. Het sediment wordt opgeslagen in een donkere koelcel bij 4°C om vergisting van het sediment te verhinderen. Voor de controlewormen wordt er 14 kg sediment afgewogen. Voor de blootgestelde wormen van het experiment wordt 28 kg sediment afgewogen. Deze hoeveelheden zijn genoeg voor de vulling van de weckpotten vóór de aanvang van het experiment en voor een verversing van het sediment na de eerste week. Het sediment bedoelt voor de blootgestelde
16
Materiaal & Methode wormen wordt voor aanvang van het experiment gecontamineerd met microplastics van 3 verschillende korrelgroottes; 10, 30 en 90 µm in diameter. Het toevoegen van de microplastics zal gebeuren uit 3 stockoplossingen van micropartikels met concentraties van: 10 µm: 2,756*105 partikels/ml 30 µm: 1,035*105 partikels/ml 90 µm: 6,56*104 partikels/ml Vanuit de stockoplossingen worden microplastics aan het sediment toegevoegd zodat in het sediment een bepaalde concentratie voor ieder fractie bekomen wordt: 10 µm: 50 partikels/g sediment (~35 000 partikels per worm per periode) 30 µm: 50 partikels/g sediment (~35 000 partikels per worm per periode) 90 µm: 10 partikels/g sediment (~7 000 partikels per worm per periode) In totaal wordt aan 28 kg sediment respectievelijk 5,1 ml van de stockoplossing van 10 µm, 13,5 ml van de stockoplossing van 30 µm en 4,3 ml van de stockoplossing van 90 µm toegevoegd. Na de toevoeging van de microplastics wordt het sediment gemixt voor ongeveer 15 minuten om er voor te zorgen dat de microplastics gelijk verdeeld zijn overheen de gehele hoeveelheid sediment. Het mixen van sediment gebeurt ook voor het sediment bestemd voor de controlewormen zodat het sediment voor beide groepen een gelijke behandeling ondergaat. Het 2 weken durende blootstellingsexperiment startte op 23 maart, 2011 (dag 1). De testopzet bestaat uit 30 weckpotten van 1,5 L. Elke weckpot wordt gevuld met 700 g sediment en 350 ml artificieel zeewater en van beluchting voorzien. Het sediment wordt vóór de vulling van de potten nog eens gemixt voor 15 minuten. 10 weckpotten worden gevuld met niet gecontamineerd sediment en 20 potten worden gevuld met sediment gecontamineerd met microplastics. Elke weckpot zal dienen voor 1 testorganisme. In totaal zijn er 30 testorganismen met 10 controlewormen en 20 aan microplastics blootgestelde wormen. Het natgewicht en de lengte van iedere worm wordt bepaald waarna ze één voor één in hun respectievelijke pot overgebracht worden. Hierbij wordt de tijd genoteerd die elke worm nodig heeft om zich volledig in te graven in het sediment. De weckpotten worden gehouden in een koelcel bij 15°C gedurende de blootstellingsperiode van 2 weken. Gedurende 14 dagen worden dagelijks de faeces verzameld en genoteerd welke worm faeces produceerde en welke niet. Het verzamelen van de faeces in een plastic borrelglaasje gebeurt met behulp van een pipet. De faeces worden gedroogd bij 40°C en na droging wordt het drooggewicht bepaald. Later worden op de faeces van 3 dagen een NaI extractie uitgevoerd waarna de hoeveelheid plastics erin geteld wordt. Na één week (dag 8) is er de volledige verversing van het sediment om de plastics en het voedsel terug aan te vullen. Voor de verversing worden eerst de faeces verzameld en worden zowel het blanco als het gecontamineerde sediment nog eens gemixt. De nieuwe weckpotten worden op voorhand gevuld met 700 g sediment en 350 ml artificieel zeewater
17
Materiaal & Methode en voorzien van beluchting. Het bovenstaande zeewater van de blootgestelde wormen wordt voorzichtig afgegoten en gefiltreerd over een membraanfilter van 5 µm. Dit dient ter controle om na te gaan of er niet teveel partikels in suspensie zijn gegaan. Van het onverteerde sediment van de blootgestelde wormen wordt een sedimentstaal genomen. Dit staal wordt gedroogd bij 40°C en het drooggewicht bepaald. Later wordt hierop een NaI extractie toegepast voor de bepaling van het aantal microplastics. Om de wormen uit de pot te halen wordt het sediment voorzichtig uitgegoten over een zeef van 1 mm. Wanneer een worm uit zijn weckpot gerecupereerd is, wordt het natgewicht en de lengte bepaald en wordt de worm zo snel mogelijk in zijn nieuwe pot overgebracht. De tijd die de worm nodig heeft om zich in te graven wordt genoteerd. Na 14 dagen wordt het experiment stopgezet. De helft van de blootgestelde wormen en alle controlewormen worden gebruikt voor de bepaling van de biomerkers. De andere helft van de blootgestelde wormen wordt gebruikt voor de onttrekking van coeloomvocht en uiteindelijk gedestrueerd. Na verzameling van de faeces wordt het bovenstaande zeewater van de blootgestelde wormen gecollecteerd en gefiltreerd over een membraanfilter van 5 µm. Van het onverteerde sediment wordt een sedimentstaal genomen, gedroogd en onderworpen aan NaI extractie. Om de wormen uit de pot te halen wordt het sediment voorzichtig uitgegoten over een zeef van 1 mm. Wanneer een worm uit zijn weckpot gerecupereerd is, wordt het natgewicht en de lengte bepaald. Daarna wordt de worm zo snel mogelijk in zuiver zeewater overgebracht. Deze stap duurt 24 uur voor de wormen bedoeld voor de bepaling van de biomerkers en 48 uur voor de blootgestelde wormen bedoeld voor destructie. Gedurende de 24 of 48 uur wordt het water een aantal keren ververst om de wormen van verse zuurstof te voorzien.
2.2.2.
Destructie en onttrekken van coeloomvocht
Na 48 uur in zuiver zeewater hebben de wormen bedoeld voor destructie voldoende tijd gekregen om de plastics uit hun spijsverteringssysteem uit te scheiden. De plastics die na destructie overblijven zaten wellicht in het weefsel of in het resterende coeloomvocht. Voordat destructie gebeurt, wordt er eerst voorzichtig coeloomvocht onttrokken van 8 blootgestelde A. marina met behulp van een injectiespuit waarna het bewaard wordt in een koelcel bij 4°C. Om het coeloomvocht te onderzoeken wordt het eerst gefiltreerd over een membraanfilter van 5 µm. Het bekijken van de filters gebeurt onder een microscoop bij een vergroting van 40x om het aantal aanwezige microplastics te tellen. Nadat het coeloomvocht onttrokken is, worden de wormen in een erlenmeyer van 100 ml overgebracht. Om de wormen te destrueren wordt 10 ml salpeterzuur (HNO 3) toegevoegd. Na toevoeging van HNO3 worden de opgeloste wormen gekookt voor ongeveer 2 uur. Op hetzelfde moment wordt een hoeveelheid gefiltreerd, gedestilleerd water opgewarmd. Wanneer de opgeloste wormen gekookt zijn en het gefiltreerde water een temperatuur van 75°C bereikt heeft, wordt de zuuroplossing aangelengd met het gefiltreerd water. Deze
18
Materiaal & Methode oplossing wordt warm gefilterd over een membraanfilter van 5 µm. De filters worden gedroogd in een oven bij 40°C. Na droging wordt het aanwezige microplastic op de filter geteld onder een microscoop bij een vergroting van 40x. De plastics die geteld zijn bevonden zich wellicht in het resterende coeloomvocht of in de weefsesl van A. marina.
2.2.3.
NaI extractie
Om het aantal microplastics te tellen in de faeces en sedimentstalen wordt een NaI extractie uitgevoerd. De uitvoering van de NaI extractie gebeurt op de verzamelde faeces van dag 3, dag 8 en dag 15 en sedimentstalen van dag 8 en dag 15 van de blootgestelde wormen. Het sediment en de faeces van iedere worm worden overgebracht in een afzonderlijke falcon tube van 50 ml. Hier wordt 30 tot 40 ml NaI met een densiteit van ongeveer 1,6 (500g/L) aan toegevoegd waarna goed geschud wordt zodat het microplastic in suspensie gaat. De tubes worden een eerste keer gecentrifugeerd aan 3000 toeren per minuut gedurende 3 minuten. De zandkorrels bevinden zich in de pellet en de microplastics bevinden zich in het supernatans. Het supernatans met de microplastics wordt gefiltreerd over een membraanfilter van 5 µm. Aan de pellet wordt opnieuw 30 tot 40 ml NaI toegevoegd en geschud. Daarna worden de falcon tubes gecentrifugeerd aan 2500 toeren per minuut gedurende 3 minuten. De filters worden bekeken onder een microscoop waarna telkens voor een kwart van de filters de fracties aan microplastics van 10, 30 en 90 µm worden geteld. In totaal worden tellingen van microplastics gedaan voor de faeces en sedimentstalen van 8 blootgestelde wormen.
2.2.4.
Biomerkerbepaling
Na 24 uur in zuiver zeewater hebben de wormen voldoende tijd gekregen om al het sediment aanwezig in het spijsverteringsstelsel uit te scheiden. Deze stap is noodzakelijk omdat anders het aanwezige zand de metingen verstoord. Van 9 blootgestelde en 7 controlewormen wordt de beschikbare energie (eiwitten + suikers + vetten) en energieconsumptie (ETS) bepaald. De bepaling van de biomerkers wordt uitgevoerd op het gehele dier met behulp van het protocol opgesteld door Stomperudhaugen et al. (2009) als basis. In de bijlage vindt men het volledig gedetailleerde protocol terug. Homogenisatie van A. marina Individuele wormen worden gehomogeniseerd in 5 ml homogeniseringsbuffer per g worm (0,1 M Tris-HCl buffer; pH 7,5; 0,4 M MgSO4; 15% polyvinylpyrrolidon PVP en 0,2% Triton X100) met behulp van een mixer. Van het resulterende homogenaat worden 3 substalen genomen: 200 µl voor eiwitten- en suikeranalyse, 200 µl voor vettenanalyse en 400 µl voor de meting van ETS activiteit. De stalen voor analyse van eiwitten, suikers en vetten kunnen eventueel ingevroren worden met behulp van vloeibare stikstof en bewaard bij -80°C. ETS analyse moet onmiddellijk na homogenisatie gebeuren.
19
Materiaal & Methode Eiwitten en Suikers Het scheiden van de fracties voor eiwitten- en suikeranalyse gebeurt door toevoeging van 100 µl 15% trichloorazijnzuur (TCA). De eiwitten slaan neer bij toevoeging van TCA. Na centrifugatie van het staal voor 10 minuten aan 3500 toeren per minuut verkrijgt men een scheiding van de 2 fracties voor eiwitten- en suikeranalyse. Het supernatans wordt in een nieuw eppendorfje geplaatst. De overblijvende pellet wordt gewassen met 200 µl 5% TCA en gecentrifugeerd. Het supernatans van elke centrifugatie wordt samengevoegd en gebruikt voor suikeranalyse. De pellet zal gebruikt worden voor eiwitanalyse. De totale eiwitinhoud wordt bepaald op de overgebleven pellet. De pellet wordt opgelost in 1 M NaOH en geplaatst in een warmwaterbad van 60°C voor 30 minuten. Na deze stap wordt het opgeloste pellet geneutraliseerd met 1 M HCl. Het is mogelijk dat een verdunning van de stalen noodzakelijk is. Een verdunning van 1:5 wordt uitgevoerd met gedestilleerd water. 3 replicaten van 25 µl van de verdunning worden toegevoegd aan een 96 microtiter plaat. Een standaardreeks van het rund albumineserum (BSA) wordt aangemaakt in de plaat met concentraties 0,4 mg/ml; 0,2 mg/ml; 0,1 mg/ml; 0,05 mg/ml; 0,025 mg/ml en 0 mg/ml. Aan ieder well wordt 250 µl Bradford reagens toegevoegd. De well wordt geplaatst in het donker voor 15 minuten bij kamertemperatuur. Met behulp van een spectrometer wordt de optische densiteit gemeten bij 595 nm. Met behulp van de standaardreeks wordt dan de eiwitconcentratie van de worm uitgerekend. De totale suikerinhoud wordt bepaald op het overgebleven supernatans na scheiding van de fracties. Het kan noodzakelijk zijn om het supernatans te verdunnen. Hier wordt een verdunning van 1:2 uitgevoerd. De suikerinhoud wordt geanalyseerd door gebruik te maken van een fenol/zwavelzuur mengsel. Aan de stalen en standaarden wordt 250 µl fenol en 1 ml zwavelzuur toegevoegd. Glucose wordt gebruikt als standaard met concentraties van 0,5 mg/ml; 0,25 mg/ml; 0,125 mg/ml; 0,0625 mg/ml; 0,031 mg/ml; 0,016 mg/ml en 0 mg/ml. Van elk staal en standaardconcentratie worden 3 replicaten van 300 µl toegevoegd aan een 96 microtiter plaat. De plaat wordt voor 15 minuten geplaatst in het donker bij kamertemperatuur. Met behulp van de spectrometer wordt de optische densiteit gemeten bij 492 nm. Aan de hand van de standaardreeks wordt dan de suikerconcentratie berekend van de worm. Vetten Aan het 200 µl homogenaat substaal wordt 500 µl chloroform, 500 µl methanol en 250 µl gedestilleerd water toegevoegd. Dit mengsel wordt gemengd met behulp van een vortexmixer en gecentrifugeerd voor 10 minuten bij 3000 toeren per minuut. Er wordt 300 µl van de onderste laag weggenomen en verdund met chloroform tot een factor 1:2. 3 replicaten van 100 µl worden in een proefbuis van 5 ml gedroogd bij 60°C voor 30 minuten. Na het drogen wordt 500 µl zwavelzuur toegevoegd. De oplossingen worden verkoold bij 200°C gedurende 15 minuten. De stalen worden 15 minuten afgekoeld waarna 1,5 ml
20
Materiaal & Methode gedestilleerd water wordt toegevoegd. Van elk replicaat wordt 250 µl genomen en in een 96 microtiter plaat geplaatst. Met een spectrometer wordt de optsiche densiteit bij 340 nm afgelezen. Tripalmitine wordt gebruikt als standaard met concentraties van 6,25 mg/ml; 3,12 mg/ml; 1,56 mg/ml; 0,78 mg/ml; 0,39 mg/ml; 0,19 mg/ml; 0,09 mg/ml en 0 mg/ml. ETS/Energieconsumptie De energieconsumptie wordt gemeten door de activiteit te meten van de elektronentransportketen (ETS). De homogenaatstalen worden gecentrifugeerd voor 10 minuten bij 3000 toeren per minuut. 100 µl van een gebufferde substraatoplossing (0,1 M Tris-HCl buffer; pH 7,5; 0,3% Triton X-100) wordt toegevoegd aan een 96 microtiter plaat. 3 replicaten van 50 µl van het homogenaat worden toegevoegd aan de gebufferde substraatoplossing in de plaat. Deze additie wordt gevolgd door een toevoeging van 50 µl NADH/NADPH oplossing (1,7 mM NADH en 0,25 mM NADPH). De colometrische reactie wordt gestart door toevoeging van 100 µl p-oidonitrotetrazolium (INT) en de optische densiteit wordt gemeten elke 7 seconden bij 490 nm met behulp van een spectrometer. INT vervangt zuurstof als elektronenacceptor in de mitochondriën. Cellulaire energie allocatie Met behulp van de standaarden wordt de concentratie aan eiwitten, suikers en vetten berekend per mg van de massa van de worm. De berekende concentraties aan eiwitten, suikers en vetten worden omgezet naar energie-equivalenten. Deze omzettingen gebeuren door de concentratiewaarden te vermenigvuldigen met een correctiefactor; respectievelijk 24 J/mg, 17,5 J/mg en 39,5 J/mg. De totale energie opgeslagen in de eiwitten, suikers en vetten wordt gesommeerd en dient als een maat voor de totale beschikbare energie van het organisme (Ea). De totale energieconsumptie (Ec) wordt berekend aan de hand van de data van de ETS activiteit door gebruik te maken van een stoichiometrische relatie van 2 moleculen INT voor 1 molecule O2 om zo zuurstofconsumptie te berekenen. De cellulaire energie allocatie wordt berekend door de totale beschikbare energie (Ea) te delen door de energieconsumptie (Ec).
2.3. Dataverwerking – Statistische analyse Het tellen van de microplastics aanwezig in de faeces en de sedimentstalen gebeurt met behulp van een microscoop op vergrotingen 20x en 40x. Na het tellen worden de waarden uitgerekend per gram faeces of per gram sediment. Uit deze resultaten wordt een indicatie gezocht of dat een bepaalde fractie van microplastics opgenomen wordt door de worm. De tellingen van de gedestrueerde wormen en het coeloomvocht zal aantonen welke microplastics opgenomen kunnen worden in de weefsels en het circulatorische systeem van de worm. De tellingen van de microplastics van de waterstalen worden uitgedrukt als aantal
21
Materiaal & Methode microplastics in suspensie per milliliter zeewater. Deze tellingen dienen als controle om te zien of een bepaalde fractie microplastics in suspensie gegaan zijn. Voor de start van de statistische analyse van de metingen van de biomerkers werden eerst de variabelen onderzocht op homogene varianties door middel van een Levene-test. Voor alle variabelen zijn de varianties homogeen en er wordt een t-test uitgevoerd om significante verschillen te bepalen tussen de controlegroep en de blootgestelde wormen. Alleen voor de analyse van de suikers werd de niet-parametrische Wilcoxon-Mann-Withney test gebruikt vanwege het niet normaal verdeeld zijn van de data. Het significantieniveau werd vastgezet op 0,05. Bij een lagere p-waarde wordt de nulhypothese, dat er geen verschil is tussen de controles en blootgestelde wormen, verworpen. Voor de analyse van de productie van de faeces werd zowel voor week 1 als voor week 2 de gemiddelde faecesproductie berekend voor iedere worm. De analyse van de faecesproductie gebeurde aan de hand van een t-test. Voor elke week werd een t-test uitgevoerd om een verschil in faecesproductie te bepalen tussen de controlegroep en de blootgestelde wormen. Het natgewicht van de individuele wormen, dat gewogen werd vóór en na het experiment, wordt gebruikt voor de bepaling van de verandering in biomassa voor de controlegroep en de blootgestelde wormen. De data van de biomassa werd voor iedere groep afzonderlijk geanalyseerd waarbij een vergelijking werd gemaakt tussen de 2 metingen. Voor de analyse werd een gepaarde t-test gebruikt. Een andere variabele die gemeten werd is de tijd van ingraven aan het begin van het experiment en tijdens de verversing van het sediment. Voor de analyse van de data voor beide groepen werd een gepaarde t-test uitgevoerd om een verschil in de tijd van ingraven te bepalen.
22
Resultaten
3. Resultaten 3. 1. Analyse van de biomerkers Voor de analyse van de impact van microplastics op het organisme Arenicola marina werden vier biomerkers onderzocht: de concentraties aan (1) vetten, (2) eiwitten en (3) suikers werden bepaald net als (4) de energieconsumptie. De resultaten van deze biomerkers werden dan gebruikt om de cellulaire energie allocatie (h-1) van het organisme te bepalen. Op de bekomen resultaten van de biomerkers werd vervolgens een statistische analyse uitgevoerd waarbij specifiek gezocht werd naar een effect van de behandeling op het organisme. De testorganismen werden ingedeeld in 2 groepen: groep 1 zijn de controleorganismen en groep 2 zijn de aan microplastics blootgestelde wormen. In totaal werden van 7 controles en 9 blootgestelde organismen de biomerkers bepaald. Het analyseren van de resultaten van deze biomerkers gebeurde met behulp van een t-test of een niet-parametrisch alternatief.
3.1.1.
Proteïnen/Eiwitten
De statistische analyse van het verschil in eiwitconcentratie tussen controle en blootgestelde wormen zal gebeuren via de uitvoering van een t-test. De analyse van de resultaten voor de biomerker eiwitten toont aan dat er een significant effect (p-waarde < 0,05) is van de blootstelling aan microplastics op de eiwitconcentratie van de wormen (zie tabel 1). De blootstelling aan microplastics heeft een beduidende invloed op de eiwitconcentratie van A. marina dat leidt tot een verschil in concentratie tussen controles en blootgestelde wormen. Tabel 1: Resultaten afkomstig van de t-test analyse betreffende het verband tussen eiwitconcentratie en blootstelling aan microplastics (* is significant) Source Behandeling
DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F 1 0.00007584 0.00007584 7.71 0.0149 *
Om een idee te krijgen van het verschil in eiwitconcentraties wordt het gemiddelde geschat voor zowel de controles (1) als de blootgestelde (2) groep. De schatting van de gemiddelde eiwitconcentratie per groep vindt men terug in tabel 2. Uit onderstaande tabel vindt men dat de eiwitconcentratie van de blootgestelde groep (0,0291 mg per mg worm) gemiddeld hoger ligt dan deze van de controlegroep (0,0247 mg per mg worm). Tabel 2: Schattingen van de gemiddelde eiwitconcentraties (mg per mg worm) voor controle (1) en blootgestelde (2) wormen.
23
Resultaten Groep LSMEAN 1 0.02479303 2 0.02918163
3.1.2.
St. Error 0.00118573 0.00104572
Pr > |t| <.0001 <.0001
Suikers/Carbohydraten
Bij het controleren van de assumpties voor de t-test bleken de data van de variabele niet normaal verdeeld te zijn. Bijgevolg werd een niet-parametrische test uitgevoerd, namelijk de Wilcoxon-Mann-Whitney test. De output van de test toonde aan dat de blootstelling aan microplastics geen significant effect (p-waarde > 0,05) heeft op de suikerconcentratie van A. marina (zie tabel 3). De blootstelling aan microplastics heeft geen beduidend effect op de suikerconcentratie van de worm. Er is geen overheersend verschil gevonden in suikerconcentratie tussen de controles en de blootgestelde wormen.
Tabel 3: Resultaten afkomstig van de Wilcoxon-Mann-Whitney test betreffende het verband tussen suikerconcentratie en blootstelling aan microplastics.
Groep 1 2
Sum of Expected Std Dev Mean N Scores Under H0 Under H0 Score 7 61.0 59.50 9.447222 8.714286 9 75.0 76.50 9.447222 8.333333 Wilcoxon Two-Sample Test Statistic 61.0000 Normal Approximation Z 0.1059 One-Sided Pr > Z 0.4579 Two-Sided Pr > |Z| 0.9157 t Approximation One-Sided Pr > Z 0.4586 Two-Sided Pr > |Z| 0.9171
3.1.3.
Lipiden/Vetten
Bij de controle van de assumpties voor een t-test (gelijke varianties en normaal verdeelde data) bleek dat deze voldaan waren. Het analyseren van het effect van blootstelling op de vetconcentratie van de 2 groepen zal gebeuren via een t-test. De resultaten van de analyse vindt men terug in tabel 4. Uit de analyse van de output blijkt dat er geen significant effect (p-waarde > 0,05) is van de blootstelling aan microplastics op de vetconcentratie van A. marina. De blootstelling aan microplastics zal geen beduidend effect uitoefenen op de vetconcentratie van A. marina.
24
Resultaten Tabel 4: Resultaten afkomstig van de t-test betreffende het verband tussen vetconcentratie (mg per mg worm) en blootstelling aan microplastics. Source Behandeling
DF 1
Groep 1 2
Type III SS 8.7091941E-7
Mean Square 8.7091941E-7
LSMEAN 0.00705206 0.00752237
F Value Pr > F 2.25 0.1562
St. Error 0.00023538 0.00020759
Pr > |t| <.0001 <.0001
Uit de resultaten van de analyse verkreeg men ook de schatting van de gemiddelde vetconcentraties voor zowel controles (1) als blootgestelde (2) wormen. Deze schatting geeft respectievelijk een waarde van 0,00705 mg/mg worm voor controles en 0,00752 mg/mg worm voor de blootgestelde wormen. De blootgestelde wormen lijken dus over een iets hogere vetconcentratie te beschikken maar dit effect werd niet significant bevonden.
3.1.4.
ETS/Energieconsumptie
Bij het controleren van de voorwaarden voor een t-test bleek dat aan beide voorwaarden voldaan was. Er wordt een t-test uitgevoerd voor de statistische analyse van de snelheid van energieconsumptie. Uit de resultaten van de analyse (zie tabel 5) is gebleken dat de blootstelling aan microplastics geen significant effect (p-waarde > 0,05) heeft op de snelheid waarmee A. marina haar energie zal opgebruiken. Samen met de analyse van de impact van de blootstelling is ook een schatting van het gemiddelde gegeven voor beide groepen (zie tabel 5). Uit de schatting wordt afgeleidt dat groep 2 (blootgestelde) over een iets hogere snelheid van energieconsumptie beschikt dan groep 1 (controles), maar dit verschil bleek niet significant te zijn. Tabel 5: Resultaten afkomstig van de t-test betreffende het verband tussen snelheid van energieconsumptie en blootstelling aan microplastics. Source
DF Type III SS
Behandeling 1 Groep 1 2
3.1.5.
Mean Square
8.709104E-13 8.709104E-13 ETS LSMEAN 7.0520629E-6 7.5223644E-6
St. Error 2.3538138E-7 2.0758686E-7
F Value Pr > |t| 2.25
0.1562
Pr > |t| <.0001 <.0001
Cellulaire energie allocatie (h-1)
De laatste parameter die bepaald werd met behulp van de geteste biomerkers was de cellulaire energie allocatie (h-1) van A. marina. De resultaten van de statistische analyse vindt
25
Resultaten men terug in tabel 6. Uit de output van de analyse is naar voren gekomen dat de blootstelling aan microplastics geen significant effect (p-waarde > 0,05) heeft op de cellulaire energie allocatie van het organisme. Er is dus geen beduidend verschil in cellulaire energie allocatie tussen beide groepen wormen. Als er gekeken wordt naar de schatting van het gemiddelde voor beide groepen merkt men op dat groep 2 (blootgestelde) een iets hogere cellulaire allocatie bezitten dan groep 1. Tabel 6: Resultaten afkomstig van de t-test betreffende het verband tussen cellulaire energie allocatie (h-1) en blootstelling aan microplastics. Source DF Type III SS Mean Square F Value Behandeling 1 439520.9779 439520.9779 0.93 Groep 1 2
Pr > F 0.3517
Tijd LSMEAN St. Error Pr > |t| 3655.83073 260.07745 <.0001 3989.93307 229.36675 <.0001
3. 2. Analyse van de snelheid van ingraven Op twee tijdstippen, vóór de aanvang van het experiment en bij de verversing van het sediment, is de snelheid van ingraven gemeten voor alle testorganismen. Van deze 2 waarden werd het verschil in tijd van ingraven berekend voor ieder organisme. Een primaire analyse van de resultaten toonde aan dat ongeveer 47% van de blootgestelde wormen een vertraging vertoonden in hun snelheid van ingraven tegenover 22% van de controleorganismen. De statistische analyse van het verschil in de tijd van ingraven tussen de 2 metingen gebeurde aan de hand van een gepaarde t-test. Deze test werd voor elke groep wormen afzonderlijk uitgevoerd. Het verschil in tijd werd berekend door de ingravingstijd tijdens de verversing (ingraven 2) af te trekken van de ingravingstijd vóór de start van het experiment (ingraven 1). De output van de analyse voor de controlegroep vindt men terug in tabel 7 en tabel 8 bevat de resultaten voor de blootgestelde wormen. Tabel 7: Resultaten afkomstig van de gepaarde t-test betreffende het verschil in tijd van ingraven tussen de 2 metingen voor de controlewormen. N Mean Std Dev Std Err Minimum Maximum 9 29.3333 56.6745 18.8915 -96.0000 87.0000
DF 8
t Value Pr > |t| 1.55 0.1591
Uit tabel 7 kunnen we afleiden dat er geen significant verschil (p-waarde > 0,05) is in de tijd van ingraven voor de controlewormen. Er werd wel geschat dat de controlewormen zich over het algemeen met gemiddeld 29,3 seconden sneller gaan ingraven.
26
Resultaten Tabel 8: Resultaten afkomstig van de gepaarde t-test betreffende het verschil in tijd van ingraven tussen de 2 metingen voor de blootgestelde wormen (* is significant). N
Mean
19
Std Dev
Std Err
Minimum Maximum DF t Value Pr > |t|
30.6316 43.8231 10.0537 -28.0000
136.0
18
3.05
0.0069 *
Uit tabel 8 kan men afleiden dat er wel een significant verschil bestaat in de tijd van ingraven voor de blootgestelde wormen (p-waarde < 0,05). Tijdens de verversing van het sediment gaan de blootgestelde wormen zich met gemiddeld 30,6 seconden sneller gaan ingraven.
3. 3. Analyse van het natgewicht Gedurende de loop van het experiment werden op 3 tijdstippen; vóór, tijdens en bij afronding van het experiment; het natgewicht van de worm bepaald. Het analyseren van de resultaten gebeurde aan de hand van een gepaarde t-test. Er werd onderzocht of dat er een significant verschil was in het natgewicht bij aanvang en op het einde van de proef (zie tabel 9 en 10). Tabel 9: Resultaten afkomstig van de gepaarde t-test betreffende het verschil in natgewicht tussen dag 1 en dag 15 voor de controlewormen. N 9
Mean Std Dev Std Err Minimum 0.0901 0.1678 0.0559 -0.1060
Maximum DF t Value Pr > |t| 0.3730 8 1.61 0.1457
Uit de resultaten kan men afleiden dat de controlewormen geen significant massaverlies (pwaarde > 0,05) ondergaan in de loop van het experiment. Tabel 10: Resultaten afkomstig van de gepaarde t-test betreffende het verschil in natgewicht tussen dag 1 en dag 15 voor de blootgestelde wormen (* is significant). N Mean Std Dev Std Err Minimum Maximum 17 0.1545 0.1107 0.0269 -0.0840 0.3600
DF t Value 16 5.75
Pr > |t| <.0001 *
Er is een significant massaverlies (p-waarde > 0,05) voor de blootgestelde wormen gedurende de proefuitvoering. De blootgestelde wormen hebben op het einde van het experiment gemiddeld 0,1545g massa verloren.
27
Resultaten 3. 4. Analyse van het drooggewicht van de faeces Gedurende de loop van het experiment werd iedere dag de geproduceerde faeces verzameld, gedroogd en gewogen. Voor de analyse van de resultaten werd er telkens een gemiddelde faecesmassa berekend overheen 7 dagen. De uitgevoerde statistische analyse zoekt een verband tussen de massa van de geproduceerde faeces per gram worm gemiddeld overheen 7 dagen en de blootstelling aan microplastics. Er worden dus in totaal 9 controles en 16 blootgestelde wormen met elkaar vergeleken en dit voor 2 weken. Een eerste statistische analyse tracht een verband te zoeken tussen de geproduceerde faeces in week 1 en de blootstelling. Uit de analyse van de t-test is gebleken dat er geen significant effect (p-waarde > 0,05) bestaat tussen de blootstelling van de wormen aan microplastics en de hoeveelheid faeces dat de wormen gemiddeld produceerde per dag (zie tabel 11). Schattingen van de gemiddelde faecesproductie voor beide groepen tonen aan dat zowel controles als blootgestelde wormen ongeveer dezelfde hoeveelheid faeces produceren per gram lichaamsgewicht gedurende de eerste week. Tabel 11: Resultaten afkomstig van de t-test betreffende het verband tussen faecesproductie per gram worm tijdens week 1 en blootstelling aan microplastics. Source DF Behandeling 1
Groep 1 2
Type III SS 0.24035060
Mean Square 0.24035060
F Value Pr > F 0.02 0.9009
Gem28 LSMEAN St. Error Pr > |t| 9.57705553 1.29765182 <.0001 9.78132872 0.97323886 <.0001
Dezelfde analyse wordt uitgevoerd met de gemiddelde, dagelijks geproduceerde faecesmassa per dag gedurende de tweede week van het experiment. De analyse van deze statistische test levert gelijkaardige resultaten op als voor week 1 (zie tabel 12). Er is geen significant effect van de behandeling op de productie van faeces door A. marina. De schattingen van de gemiddelde massa faeces geproduceerd per gram worm verschillen niet veel tussen controles en blootgestelde wormen. Tabel 12: Resultaten afkomstig van de t-test betreffende het verband tussen faecesproductie per gram worm tijdens week 2 en blootstelling aan microplastics. Source Behandeling
DF 1
Type III SS Mean Square 0.76204078 0.76204078
Behandeling 1 2
F Value 0.05
Pr > F 0.8325
LSMEAN St. Error Pr > |t| 11.0833978 1.3600290 <.0001 11.4471267 1.0200217 <.0001
28
Resultaten
3. 5. Analyse van de microplastic fracties in de faeces Bij de opzetting van het experiment werd het sediment gecontamineerd met een kenmerkende nominale verhouding aan microplastics. Aan het sediment werden microplastic bolletjes toegevoegd met 3 verschillende diameters; namelijk 10, 30 en 90 µm. De ratio waarin deze microplastics zich ten opzichte van elkaar verhouden in het sediment is 5:5:1. Tellingen van microplastics gebeuren voor 8 van de blootgestelde wormen en voor 3 faecesstalen (dag 3, dag 8 en dag 15). De resultaten van de fracties van aanwezige microplastics per gram geproduceerde faeces vindt men terug in tabel 13 en figuur 3. Bij de analyse van de resultaten is naar voren gekomen dat over het algemeen de 5:1 nominale verhouding tussen 30 en 90 µm plastic teruggevonden wordt. De 1:1 verhouding tussen 10 en 30 µm wijkt sterk af en is in de tellingen niet meer terug te vinden. De gevonden nominale verhouding tussen 10 en 30 µm microplastics ligt echter tussen 1:2 en 2:3. De 10 µm fractie is ondervertegenwoordigd in de stalen van de faeces. Het verdwijnen van een deel van deze fractie zou een indicatie kunnen zijn dat dit type van microplastic opgenomen wordt door A. marina. De resultaten van de tellingen geven geen duidelijkheid over de snelheid van opname van de microplastics vanwege een te grote variatie in de hoeveelheden van het microplastic. Tabel 13: Resultaten van de tellingen van microplastics per gram geproduceerde faeces van dag 3, 8 en 15. Dag 3
Dag 8
Dag 15
10 µm 30 µm 90 µm 10 µm 30 µm 90 µm 10 µm 30 µm 90 µm Plastic 1
15,36
23,46
4,36
15,63
47,51
12,50
9,90
19,38
4,12
Plastic 7
7,91
11,77
2,31
17,73
44,62
12,59
18,16
27,56
5,01
Plastic 9
11,72
17,41
2,84
11,05
25,42
4,05
5,11
10,68
1,35
Plastic 11
10,24
22,78
3,96
7,94
14,95
4,20
9,88
19,76
3,80
Plastic 12
15,43
23,57
4,21
15,80
36,63
5,71
13,48
27,66
4,97
Plastic 13
8,70
13,85
2,66
21,76
39,68
7,25
10,80
23,59
5,29
Plastic 14
20,23
31,89
4,93
12,74
21,87
5,52
12,29
21,85
5,46
Plastic 20
9,90
17,92
6,13
13,85
17,88
3,58
20,09
38,51
6,70
A
B
29
Resultaten Figuur 3: Microplastic gevonden in de faeces: 10 en 30 µm (a) 30 en 90 µm (b)
3. 6. Tellingen van de sediment- en waterstalen Op twee tijdstippen tijdens het experiment werden er sedimentstalen genomen, tijdens de verversing op dag 8 en op het einde van het experiment dag 15. Ook van deze stalen werden de hoeveelheden microplastics geteld (zie tabel 14). De hoeveelheden van microplastics staan uitgedrukt per gram sediment. Voor de fracties van 30 en 90 µm vindt men net zoals bij de tellingen van de faeces over het algemeen de 5:1 verhouding terug. De 1:1 verhouding tussen 10 en 30 µm microplastic wijkt net zoals voorgaand sterk af en werd niet teruggevonden. Ook hier schommelt de nominale verhouding voor de 10 en 30 µm fractie tussen 1:2 en 2:3. Dit kan een indicatie zijn dat een deel van de 10 µm fractie in suspensie gaat in het zeewater. Tabel 14: Resultaten tellingen van microplastics per gram sediment op dag 8 en dag 15. Dag 8
Dag 15
10 µm 30 µm 90 µm 10 µm 30 µm 90 µm Plastic 1
16,31
26,62
5,58
4,21
11,80
2,11
Plastic 7
14,77
26,49
5,60
8,31
15,04
3,56
Plastic 9
14,15
23,28
5,48
6,82
14,35
4,66
Plastic 11
7,63
11,22
2,24
4,16
14,15
2,08
Plastic 12
15,00
20,46
5,00
6,81
12,25
3,63
Plastic 13
8,68
14,88
2,89
6,73
17,00
4,61
Plastic 14
16,31
29,89
4,98
3,21
8,93
1,79
Plastic 20
14,58
29,91
4,86
11,24
27,93
4,77
Om te controleren dat er niet te veel partikels in suspensie gaan werd het zeewater van een aantal testorganismen bijgehouden. Uit analyse van de filters (zie tabel 15) bleek dat van alle 3 de fracties partikels in suspensie gegaan zijn en voornamelijk van de 10 µm fractie. De hoeveelheden gesuspendeerd plastic vermeld in tabel 15 zijn uitgedrukt per ml zeewater. Er wordt opgemerkt dat het aantal plastic bolletjes die in suspensie gegaan zijn van de fracties 30 en 90 µm relatief klein zijn in vergelijking met de hoeveelheid microplastic van 10 µm dat in suspensie was. De verhouding 10 en 30 µm microplastic schommelt tussen 6:1 en 11:1. Tabel 15: Resultaten tellingen waterstalen dag 8 en 15: plastic partikels in suspensie per ml water. Dag 8 10 µm 30 µm
Dag 15 90 µm
10 µm
30 µm
90 µm
Plastic 1
/
/
/
1,87
0,16
0,03
Plastic 7
/
/
/
1,20
0,06
0,08
30
Resultaten Plastic 9
1,46
0,18
0,00
/
/
/
Plastic 11
1,37
0,13
0,03
/
/
/
Plastic 13
/
/
/
1,30
0,02
0,00
Plastic 20
1,35
0,22
0,03
/
/
/
3. 7. Destructie 8 testwormen werden gebruikt voor de bepaling van het aantal microplastics aanwezig in de weefsels of het circulatorisch systeem. De filters van de gedestrueerde wormen werden onderzocht op de aanwezigheid van micropartikels. De resultaten van de tellingen voor de aanwezigheid in de weefsels of het resulterende coeloomvocht na onttrekking kan men terugvinden in tabel 16. Tabel 16: Resultaten van de tellingen van de gedestrueerde weefsels. Testworm Microplastic 10 µm Microplastic 30 µm Plastics 2 11 2 Plastics 3 15 1 Plastics 9 12 1 Plastics 10 16 0 Plastics 12 14 1 Plastics 13 9 0 Plastics 15 15 1 Plastics 18 10 3 Uit tabel 16 kan men afleiden dat er microplastic partikels opgenomen worden in de weefsels of het circulatorisch systeem van A. marina. De fracties die men terugvindt zijn de kleinste microplastics van 10 µm en heel sporadisch worden voor enkele wormen ook microplastics van 30 µm geteld (zie figuur 4).
A B Figuur 4: Microplastic 10 µm (a) en 30 µm (b) in destructie
31
Resultaten 3. 8. Coeloomvocht Voor het controleren van de aanwezigheid van microplastics in het circulatorisch systeem werd er van 8 wormen het coeloomvocht onttrokken voor destructie. De inhoud van 100 à 250 µl coeloomvocht werd gecontroleerd op de aanwezigheid van microplastics. De resultaten van de tellingen vindt men terug in tabel 17. Tabel 17: Resultaten tellingen microplastics coeloomvocht. Testworm Plastics 2 Plastics 3 Plastics 9 Plastics 10 Plastics 12 Plastics 13 Plastics 15 Plastics 18
Microplastic 10 µm 3 6 11 4 10 4 5 5
Uit de resultaten van tabel 17 kan besloten worden dat microplastics vanuit de darm getransporteerd worden naar het circulatorische systeem van A. marina. De fractie die men aantreft in het coeloomvocht zijn microplastic bolletjes van 10 µm (zie figuur 5).
Figuur 5: Microplastic van 10 µm in coeloomvocht
32
Discussie
4. Discussie De eerste beschrijving van kleine stukjes plastic aangetroffen in het mariene milieu, dateert al van meer dan 35 jaar geleden (Carpenter et al., 1972). Het wereldwijde karakter en de steeds toenemende hoeveelheden plastics in de oceanen zorgen ervoor dat deze vorm van vervuiling een problematische impact kent met honderden soorten die gevaar lopen om schadelijke effecten te ondervinden. Voorgaande studies hebben aangetoond dat microplastics regelmatig worden aangetroffen in het spijsverteringsstelsel van zeevogels, zeeschildpadden en mariene zoogdieren. Microscopische partikels kunnen echter ook opgenomen worden door kleinere organismen zoals week- en schaaldieren. Dit leidt tot het verhoogd risico dat klein plastic en ermee geassocieerde chemicaliën worden geïntroduceerd in de voedselketen (Arthur et al., 2008). Ondanks de toegenomen interesse in de effecten en impact van plastic afval op het mariene ecosysteem, bestaat er nog steeds een gelimiteerde kennis over het belang, de verspreiding en bovenal de effecten van het microscopische plastic op mariene organismen. De focus van de meeste studies ligt immers nog vooral op het bestuderen van de impact van macroplastics. Om die reden werd in deze studie het effect van microplastics op de wadpier (Arenicola marina) onderzocht.
4.1
De opname van microplastics
Microplastics kunnen mariene organismen op verschillende manieren beïnvloeden: (1) indirect, door verstoring van het voedingsgedrag, (2) direct, door bijvoorbeeld het blokkeren van de voedingsstructuren of irritatie van het spijsverteringsstelsel en (3) chemisch, door de verandering in blootstelling aan chemische contaminanten geassocieerd met de microplastics (Arthur et al., 2008). Eén van de doelstellingen van dit onderzoek was het beantwoorden van de vraag of microplastics effectief worden opgenomen door de wadpier. Uit de tellingen van microplastics in de faeces, werd afgeleid dat de partikels van 10 µm zich niet in de juiste verhouding tot de microplastics van 30 µm gedroegen. Aan het begin van het experiment werd een bepaalde hoeveelheid microplastics aan het sediment toegevoegd zodat de nominale verhouding tussen de 10 µm, de 30 µm en de 90 µm fractie 5:5:1 bedroeg in het sediment. De tellingen gaven echter aan dat er minder microplastics van 10 µm aanwezig waren in de faeces en sedimentstalen dan deze die volgens de verdeling in het sediment aanwezig moesten zijn (zie tabel 13 en 14). De nominale verhouding van het 10 µm microplastic met het 30 µm microplastic lag eerder tussen 1:2 en 2:3 in plaats van de verwachte 1:1 verhouding. De nominale verhouding tussen de partikels van 30 en de 90 µm (1:5) bleef wel gehandhaafd in de faeces. De lagere
33
Discussie waarden van de 10 µm fractie zou een indicatie kunnen zijn dat deze plastics opgenomen werden door het testorganisme en in de weefsels of circulatorisch systeem verzeild geraken. Echter, uit tellingen van microplastics in het bovenliggende water, bleek dat een groot deel van de 10 µm fractie in suspensie is gegaan. De nominale verhouding tussen de 10 µm en de 30 µm fractie in het zeewater schommelde tussen 6:1 en 11:1. Het in suspensie gaan van de microplastics in het zeewater is dus een oorzaak van de lagere nominale verhouding tussen 10 en 30 µm microplastic in de faeces en sediment dan verwacht op basis van de toegevoegde hoeveelheden microplastics aan het sediment. De resultaten van de tellingen van microplastics in de faeces kunnen bijgevolg geen indicatie geven over de mogelijke opname van partikels in het weefsel van A. marina. Om te bewijzen of de testorganismen wel degelijk microplastic partikels opnemen in de weefsels of het circulatorisch systeem, werd van een achttal wormen coeloomvocht onttrokken waarna de wormen gedestrueerd werden. Uit de tellingen is gebleken dat partikels van de 10 µm fractie opgenomen waren in de weefsels en coeloomvocht van het testorganisme. Heel sporadisch werden er zelfs microplastics van 30 µm teruggevonden in de gedestrueerde organismen. Bij het bestuderen van het coeloomvocht kwam men tot de conclusie dat 10 µm microplastics vanuit de darm tot in het circulatorisch systeem of de weefsels getransporteerd worden.
In de literatuur is er een overvloed aan informatie over de opname van plastics door zeevogels, schildpadden en mariene zoogdieren, maar voor de kleinere invertebraten is er nog maar weinig onderzoeksliteratuur beschikbaar. Tot op heden bestaan er weinig studies die een interactie tussen microplastics en kleine mariene invertebraten gedemonstreerd hebben. Eén van deze studies werd uitgevoerd door Browne et al. (2008) die aantoonde dat microplastics opgenomen werden door de mossel, Mydilus edulis. Uit deze studie is ook gebleken dat microplastics getransporteerd werden naar het circulatorisch systeem en hier aanwezig waren voor 48 dagen. Browne et al. (2008) kwamen tot de conclusie dat de grootte van het plastic partikel een rol speelde in de capaciteit tot opname in het circulatorisch systeem. In het hemolymfe van de mossel werd 60% meer plastic aangetroffen van 3 µm dan van 9,6 µm. Kleinere partikels zullen dus makkelijker getransporteerd worden naar het circulatorisch systeem. Dit zou een verklaring kunnen zijn voor de afwezigheid van de 90 µm fractie en het sporadisch voorkomen van de 30 µm fractie in de weefsels of het coeloomvocht van A. marina. Alleen de 10 µm fractie is klein genoeg om getransporteerd te worden doorheen de darmwand met af en toe toch opname van een 30 µm partikel. De grotere accumulatie van kleinere partikels suggereert dat bij de afbraak van een groter plastic partikel in kleinere fragmenten er een stijging is in de mogelijkheid tot accumulatie en translocatie binnenin het weefsel van het organisme (Browne et al., 2008). Dit zal in de toekomst meer problemen met zich meebrengen wanneer de microplastics aan belang winnen en
34
Discussie de zeer kleine fracties in hoeveelheden stijgen door de continue afbraak van de grotere partikels. Hierdoor kan de accumulatie van microplastics in de weefsels of het circulatorisch systeem stijgen met mogelijk negatieve effecten tot gevolg. Andere studies in verband met de opname van microplastics door mariene invertebraten waren deze met als studiesoorten amfipoden, wadpieren, zeepokken, borstelwormen, tweekleppigen, stekelhuidigen, mosdiertjes en zeekomkommers (Thompson et al., 2004; Ward & Shumway, 2004; Graham & Thompson, 2009). Uit de studies kon geconcludeerd worden dat mariene invertebraten microplastics opnamen ondanks hun verschillende voedingswijze en op voorwaarde dat ze klein genoeg waren om in hun mond te passen. Een verklaring voor de opname van plastic partikels werd gezocht in het niet selectieve eetgedrag van deze organismen. A. marina maakt net zoals deze studiesoorten geen onderscheid tussen plastic en voedsel en kan partikels opnemen met een korrelgrootte van 300 µm. Als gevolg van het niet selectieve voedingsgedrag vindt men dus de 3 fracties aan microplastics terug in de faeces. Een bijkomende reden voor de opname is dat het gladde oppervlak van de plastic partikel s verhindert dat zandkorrels hieraan vastplakken waardoor het dus makkelijker is om plastic te scheiden van sediment (Graham & Thompson, 2009). Dit is niet het geval voor het andere organische materiaal aanwezig in het sediment dat samengepakt zit in een bol van zand en voedsel. De aanwezigheid van microplastics in het circulatorisch systeem vormt een gezondheidsrisico en kan de bloedstroom verhinderen, schade veroorzaken aan vasculaire weefsels en de hartfunctie veranderen (Browne et al., 2008). De accumulatie van niet voedzame elementen kan leiden tot ondervoeding en uiteindelijk een verhongeringsdood (Boerger et al., 2010). In de blootstellingstudie van A. marina werd het natgewicht van alle testorganismen opgevolgd om te achterhalen of er een significant verband is tussen verandering in biomassa en blootstelling aan microplastics (zie tabel 9 en 10). De blootgestelde wormen ondervonden een significant massaverlies en dit in tegenstelling tot de controlewormen waarvan de biomassa ongeveer gelijk bleef. Na afloop van het experiment hadden de blootgestelde wormen gemiddeld 0,15g van hun biomassa verloren. Het verlies van massa kan een indicatie zijn van de lagere voedingswaarde van het sediment. Een mogelijk andere verklaring kan zijn dat de opname van microplastics een soort verzadigingsgevoel geeft aan het organisme. De assumptie over het verzadigingsgevoel wordt echter niet ondersteund omwille van de gelijke faecesproductie tussen de controles en blootgestelde wormen gedurende het experiment (zie tabel 11 en 12). Bij een verzadigingsgevoel zou men verwachten dat de worm minder sediment opeet en dus ook minder faeces produceert. Er is echter geen significant verschil tussen faecesproductie voor beide groepen wormen. Blootstelling aan microplastics zal geen remming van het voedingsgedrag veroorzaken. Waarschijnlijk is een tekort aan essentiële voedingsbestanddelen door de lagere voedingswaarde van het sediment de achterliggende
35
Discussie oorzaak van het gewichtsverlies. Het is mogelijk dat de wormen de lage voedingswaarde van het sediment niet opmerken en daarom hun voedselopname niet aanpassen om deze lagere voedingswaarde te compenseren. Een ander gezondheidsrisico staat in verband met de interactie tussen plastic en chemische contaminanten. Het plastic afval in de oceanen kan chemische contaminanten absorberen aan hun oppervlak, afhankelijk van het type plastic en de eigenschappen van de contaminant (Arthur et al, 2008). Andere stoffen zoals micropolluenten kunnen geabsorbeerd worden binnenin het plastic. De plastic partikels kunnen dan als transportmiddel dienen voor de verontreinigende stoffen (Teuten et al., 2007; Mato et al., 2001; Endo et al., 2005). Plastics kunnen ook een omgekeerde rol vervullen waarbij er desorptie optreedt van de chemicaliën bij opname van het plastic door een organisme. De blootstelling van het plastic aan verteringssappen zal de beschikbaarheid van chemische stoffen verhogen. Teuten et al. (2007) heeft via blootstellingmodellen geschat dat de concentratie aan fenantreen met 80% zal toenemen in A. marina bij additie van 1 ppm gecontamineerd polyethyleen of 14 ppm gecontamineerd polypropyleen aan plastic vrij sediment. A. marina wordt in het thesisexperiment blootgesteld aan veel hogere plasticconcentraties met een grotere opname van microplastics tot gevolg. Deze hogere blootstellingsconcentratie houdt dus theoretisch gezien een enorm toxisch risico met zich mee indien deze plastic partikels ook met fenantreen of andere chemicaliën gecontamineerd zouden zijn. A. marina is een vrij algemeen voorkomende soort en zal doordat ze microplastics opneemt blootgesteld worden aan verscheidene chemische contaminanten geassocieerd met de microplastics. Browne et al. (2008) bewezen dat microplastics tot 48 dagen aanwezig konden zijn in het circulatorisch systeem van de mossel. Deze hoge verblijftijd zorgt voor de reële kans dat de toxische stoffen geabsorbeerd aan de microplastics gemobiliseerd worden en zo verschillende weefsels binnenin het organisme bereiken. A. marina neemt net zoals de mossel microplastics op in het circulatorisch systeem en als deze tijdsfactor ook zou gelden voor A. marina en andere organismen vormen microplastics dus een groot gezondheidsrisico inzake toxische stoffen. De opname van plastic partikels in het lichaam van A. marina kan leiden tot een overdracht van plastic naar een hoger trofisch niveau in de voedselketen en vormt een gevaar voor de transfer van toxische stoffen naar hogere diersoorten. Ook A. marina dient als voedsel voor verschillende soorten vogels en platvissen. Dit maakt de transfer van opgenomen microplastics doorheen de voedselketen een reëel risico.
4.2 De impact van microplastics op fysiologische en biochemische parameters Een combinatie van biochemische en fysiologische parameters zoals eiwit- en suikerconcentratie, tijd van ingraven en snelheid van voedselopname zijn een praktisch
36
Discussie hulpmiddel voor de beoordeling van de effecten van de blootstelling aan lichaamsvreemde stoffen (=xenobiotica) op een organisme. Er wordt verwacht dat de organismen op de vervuiling met microplastics gaan reageren en dat er een verandering in de parameterwaarden voor de blootgestelde organismen werd opgewekt. De tijd van ingraven is een relevante ecologische parameter en heeft een directe relatie met de overleving van het organisme en het vermijden van predatie. Voor de controlewormen werd er geen significant verschil gevonden in de tijd van ingraven tussen de meting bij aanvang van het experiment en bij de verversing van het sediment (zie tabel 7). Voor de groep van de blootgestelde wormen werd er echter wel een significant verschil gevonden in de tijd van ingraven (zie tabel 8). In het algemeen gingen de blootgestelde wormen zich sneller ingraven bij de verversing van het sediment met een gemiddelde van ongeveer 30 seconden. Deze resultaten staan in contrast met wat er verwacht werd. De verwachte respons was een daling in de tijd van ingraven. In een studie waarbij de vervuilende stoffen PAH’s en PCB’s waren, werd er wel een stijging in de tijd van ingraven gevonden (MoralesCaselles et al., 2009). Dit is suggestief voor een chemosensorische respons op de vervuiling. In dit onderzoek echter werd net de tegenovergestelde respons op vervuiling gevonden. Er is dus meer onderzoek nodig om het precieze verband tussen de tijd van ingraven en de vervuiling met microplastics te achterhalen. Een andere fysiologische parameter die kan dienen voor de bepaling van de impact van vervuiling is de voedselopname. Om een idee te krijgen van de voedselopname werd de faecesproductie per gram worm bijgehouden gedurende de loop van het experiment. Bij analyse van de gemiddelde faecesproductie tijdens week 1 en 2 is er geen verschil gevonden in de hoeveelheid geproduceerde faeces tussen de controlegroep en de blootgestelde wormen (zie tabel 11 en 12). De vervuiling van het sediment met microplastics zal dus geen remming uitoefenen op het voedingsgedrag van de blootgestelde worm. Deze resultaten staan weer in contrast met resultaten bekomen in een blootstellingsstudie met PAH’s en PCB’s (Morales-Caselles et al., 2009). In deze studie werd er wel een aantasting van het voedingsgedrag bemerkt als gevolg van de blootstelling aan PAH’s en PCB’s. Deze aantasting van het voedingsgedrag uitte zich in een daling in de productie van de hoeveelheid faeces. Voor vele sedimentaire organismen werden verbanden gevonden tussen een verzwakking van de fysiologische parameter en verontreinigende stoffen zoals PAK’s en PCB’s. Verder werden er verbanden gezocht tussen de vervuiling met microplastics en de biochemische parameters, de gemeten biomerkers. Uit de analyse van de resultaten van de biomerkers is gebleken dat enkel de concentratie aan eiwitten een significant verschil vertoont tussen de controles en de blootgestelde wormen waarbij de blootgestelde groep over een gemiddeld hogere eiwitconcentratie beschikt (zie tabel 1 en 2). Dit lijkt het tegenovergestelde van wat verwacht wordt. Er wordt verwacht dat de blootstelling aan microplastics een negatief effect heeft op het organisme en dus een daling in de
37
Discussie eiwitconcentratie veroorzaakt. Een mogelijke verklaring voor deze onverwachte verhoging is dat de blootstelling aan microplastics een stressrespons kunnen activeren in het lichaam van A. marina. Deze stressrespons zal leiden tot de expressie van een stressproteïne met een verhoging van de eiwitconcentratie tot gevolg. Dit type van respons werd ook geobserveerd in Smolders et al. (2003) die stelde dat lage tot intermediaire concentraties van vervuiling een verhoogde eiwitsynthese activeert in Danio rerio. Bij het analyseren van de overige biomerkers (vetten, suikers, ETS en cellulaire energie allocatie) vond men geen significant verband tussen de plasticvervuiling en het verschil in waardes tussen de controles en de blootgestelde wormen. Met ander woorden er is geen of weinig impact van de plasticvervuiling op het vet- en suikergehalte van A. marina (zie tabel 3 en 4). Verder is er geen of weinig impact van de vervuiling op de energieconsumptie en de cellulaire energie allocatie van de wadpier (zie tabel 5 en 6). Er worden voor deze biochemische parameters geen echte oorzaak-gevolg relaties gevonden tussen vervuiling en de waarde van de biomerker. De beperkte respons van de geteste biomerkers op A. marina kan een indicatie zijn van het feit dat A. marina een robuuste soort is. Haar robuustheid stelt A. marina in staat om een zeker niveau van omgevingsstress te weerstaan (Hingston et al., 2002). In een 58 dagen durende blootstellingsstudie van Hediste diversicolor aan tributyltin (TBT) en perfluorononanoic zuur (PFNA) werd er ook geen significant verband gevonden tussen blootstelling aan contaminanten en de beschikbare energie (eiwitten, vetten en suikerconcentratie). De enige biomerker in de studie van H. diversicolor waar wel een significant verband met vervuiling voor werd gevonden, was de energieconsumptie (ETS). Deze parameter was lichtjes verhoogd ten opzicht van de controles (Stumperudhagen et al., 2009). Ook in de studie van A. marina was de schatting van de gemiddelde energieconsumptie hoger voor de blootgestelde wormen, maar dit effect werd niet significant bevonden. In andere studies werd er soms wel en soms niet een effect van vervuiling gevonden op de waarden van de biomerkers. Dreissena polymorpha vertoonde een daling in suikerreserves na 7 dagen voor de meest vervuilende situatie van een waterzuiveringsinstallatie (Smolders et al., 2004). In nog andere studies is er dan een daling te bemerken in een andere biomerker als gevolg van de blootstelling aan vervuiling. De statistische zekerheid van de resultaten zal verbeteren naarmate er meer wormen getest worden. De bepaling van de biomerkers gebeurde na een blootstellingsperiode van 2 weken. In de natuurlijke omgeving worden de wormen gedurende hun gehele levenscyclus blootgesteld aan vervuiling met microplastics en andere contaminanten. Het is dus mogelijk dat de resultaten verkregen in deze studie niet voldoende representatief zijn voor de blootstelling in het veld. Een blootstellingstudie over een langere termijn dan 2 weken zal mogelijk meer statistische zekerheid kunnen brengen in verband met de impact van de plasticvervuiling op de gezondheidstoestand van het organisme en meer bepaald op de status van de vet-, suiker- en eiwitconcentratie. Er is dus nood aan chronische experimenten om de impact van vervuiling op A. marina en andere sedimentbewoners te bepalen.
38
Discussie
4.3
Potentieel toekomstig onderzoek
Er is bewezen dat microplastics van 10 µm getransporteerd worden vanuit de darm naar de het circulatorisch systeem of de weefsels van A. marina. Toekomstige studies kunnen zich eventueel toespitsen op de bepaling van de snelheid van opname van de microplastics in het circulatorisch systeem. Dit zou men kunnen doen door het trekken van het coeloomvocht van het testorganisme voor opeenvolgende dagen van het experiment. De groottes van microplastics waaraan A. marina werd blootgesteld in het experiment waren 10, 30 en 90 µm. Uit het onderzoek kon geconcludeerd worden dat de 10 µm fractie met zekerheid werd opgenomen in het coeloomvocht en de microplastics van 30 µm werden sporadisch teruggevonden in de gedestrueerde organismen. Verder onderzoek is vereist voor de bepaling van de boven- en ondergrens van de partikeldiameter voor opname en translocatie overheen de darmwand. Er moet ook aandacht geschonken worden aan de bepaling van de mogelijke schade aan vitale organen veroorzaakt door de opname van microplastics. In dit onderzoek werden de testorganismen blootgesteld aan 1 soort van plastic partikel (polystyreen) en dit gedurende een korte termijn. In de natuur worden organismen echter aan meerdere soorten plastics (polyethyleen, polyvinylchloride, polypropyleen,…) blootgesteld en dit gedurende hun hele levenscyclus. Er is dus een noodzaak aan lange termijn experimenten die de toxicologische effecten onderzoeken van de blootstelling aan meerdere soorten plastic. Een andere suggestie voor toekomstig potentieel onderzoek legt de focus op de evaluatie van de mogelijke transfer van chemicaliën tussen het microplastic en het testorganisme. Een andere focus is de accumulatie van microplastics in de weefsels met de potentiële transfer naar hogere trofische niveaus overheen de voedselketen. Er moet dus een beter inzicht verkregen worden van de effecten van de interacties op het niveau van het organisme vooraleer men een extrapolatie kan maken van de impact van microplastics op het niveau van het ecosysteem.
4.4
Conclusie
Microplastics worden opgenomen door A. marina waarbij de grootte van het partikel een invloed heeft op de kans dat het partikel opgenomen wordt en de hoeveelheid dat zal accumuleren in het lichaam. Hierbij geldt hoe kleiner het partikel, hoe groter de kans van opname in de weefsels of circulatorisch systeem van het organisme. Vooral
39
Discussie microplastics van 10 µm en kleiner worden opgenomen en getransfereerd naar de weefsels en circulatorisch systeem van A. marina. Er is nog bijkomend onderzoek nodig voor de bepaling van de grenzen in diameter voor de microplastics die opgenomen worden vanuit de darm. De blootstelling aan microplastics heeft een negatief effect op de verandering in biomassa zonder hierbij het voedingsgedrag te beïnvloeden. Een ander verband is de onverwachte daling in de tijd van ingraven bij blootstelling aan microplastics. Overheen de gehele analyse van de biomerkers werd er alleen een significant verband gevonden tussen de blootstelling aan microplastics en het verschil aan eiwitconcentratie tussen de controlewormen en de blootgestelde wormen. Korte termijn blootstelling aan microplastics leidt tot een verhoging in de eiwitsynthese terwijl de energie opgeslagen in de vetten en suikers niet veranderd als gevolg van vervuiling. Tot op heden bestaan er nog grote leemtes inzake de kennis over de effecten van microplastics op de meerderheid van de mariene organismen. Het potentieel van de microplastics om dragers te zijn van chemische contaminanten en het potentieel van transfer van de chemicaliën naar het organisme is nog onvoldoende onderzocht. Plastic afval is een vangnet voor persistente organische polluenten en er kan met zekerheid gesteld worden dat plastics het potentieel bezitten om organische verontreinigende stoffen vanuit het mariene milieu te absorberen om zo als transportmiddel te dienen voor de verspreiding van contaminanten in organismen of over de oceanen heen. Het overvloedig voorkomen van microplastic in de oceanen is een belangrijke introductieweg van verontreinigende stoffen in het mariene milieu en een significante bron van blootstelling voor de mariene invertebraten. Microplastics kunnen een directe en belangrijke route vormen voor de transfer van toxische stoffen naar een hogere diersoort. Plastic afval moet beschouwd worden als een belangrijke vorm van vervuiling van de oceanen door het chronische karakter, de alomtegenwoordigheid en de toename in hoeveelheid. Additionele studies zijn noodzakelijk voor de bepaling van de verblijftijd van het opgenomen plastic in het lichaam en hun effect op de gezondheid van A. marina en de implicaties voor de voedselketen. De focus van de studie lag op de blootstelling van de wormen aan 1 soort verontreinigende stof, maar in de natuur worden de wormen blootgesteld aan een mengsel van verontreinigende stoffen. De effecten van de blootstelling aan meerdere contaminanten kunnen onvoorspelbaar zijn in vergelijking met de beschreven effecten van blootstelling aan 1 verontreinigende stof in gecontroleerde laboratoriumexperimenten, in dit geval microplastics. A. marina wordt in de natuur constant blootgesteld aan verschillende soorten microplastics. Er moet dus verder onderzoek gebeuren voor de studie van de effecten op lange termijn.
40
Samenvatting
5. Samenvatting De constante vervuiling van de oceanen met plastic materialen is een enorm probleem. De biologische effecten van macroplastics op mariene organismen zoals zeevogels, zeeschildpadden en zeezoogdieren is al goed bestudeerd. De laatste jaren is het belang aan microplastics enorm toegenomen vanwege de afbraak van grotere partikels door fotodegradatie en het opzettelijk en onopzettelijk lozen van kleiner plastic materiaal. Er zijn in de literatuur nog maar weinig studies die een verband tussen de opname van microplastics en de effecten ervan op het mariene organisme beschrijven. Tot op heden zijn er al studies uitgevoerd op de tweekleppigen, stekelhuidigen, zeekomkommer, amfipoden en polychaeten zoals de wadpier (Arenicola marina). Plastic afval is een belangrijke vorm van vervuiling vanwege zijn duurzaamheid in het milieu, de wereldwijde verspreiding en de toename in concentratie waardoor plastics beschikbaar zijn voor opname voor een breed gamma aan mariene organismen. De opname van plastic materialen door een marien organisme is vaak een gevolg van een niet selectieve voedingswijze waardoor er geen onderscheid gemaakt wordt tussen een voedselpartikel en een plastic fragment. Het opnemen van plastic kan een verscheidenheid aan nadelige effecten uitlokken. De meest besproken effecten zijn verstikking (ghost fishing), het veroorzaken van interne en externe wonden, blokkage van het spijsverteringsstelsel, verhongeringsdood, de associatie van contaminanten met plastics en het transport van invasieve soorten overheen de oceanen. Deze effecten zijn al uitgebreid beschreven voor de grotere mariene organismen, maar het aantal studies betreffende de kleinere mariene organismen is beduidend kleiner. In dit onderzoek werd er gezocht naar een betekenisvolle relatie tussen de blootstelling van A. marina aan microplastics en de biologische respons als gevolg van de blootstelling. De studiesoort van dit onderzoek Arenicola marina is een veel voorkomende borstelworm (Polychaeta) in de sedimenten van de intergetijdenzones. In deze sedimenten leeft hij in een U- tot L-vormige gang waar hij zich voedt met organisch materiaal afkomstig van het sedimentoppervlak. Door zijn voedingswijze (surface deposit feeder) zal A. marina rechtstreeks in contact komen met de contaminatie van het sediment door microplastics. Het bepalen van fysiologische en biochemische parameters is een goede manier om de impact van blootstelling aan microplastics te bepalen. Biomerkers kunnen dienen als vroege waarschuwingssignalen voor de contaminatie met lichaamsvreemde stoffen (=xenobiotica). De impact van microplastics op A. marina werd onderzocht door de meting van de eiwit-, suiker- en vetconcentratie van de worm, als ook de energieconsumptie (ETS) en de cellulaire energie allocatie. De fysiologische parameters die gemeten werden, zijn het verschil in de tijd van ingraven, de verandering in biomassa en de voedselopname.
41
Samenvatting Uit de analyse van de variabelen zijn een aantal gevolgen van blootstelling aan microplastics opgemerkt. Van al de gemeten biomerkers werd er enkel een significant verband gevonden tussen de eiwitconcentratie en de blootstelling aan microplastics. De vervuiling met microplastics zal leiden tot een verhoging van de eiwitexpressie. Deze stijging in eiwitconcentratie is mogelijk het gevolg van een stressrespons waardoor er stressproteïnen geactiveerd worden in de blootgestelde wormen. Een ander gevolg van de korte termijn blootstelling aan microplastics is de daling van de biomassa op het einde van het experiment. Een mogelijke verklaring voor deze daling is de opname van sediment met een lagere voedingswaarde zonder compensatie in de voedselopname (faecesproductie). Een onverwachte respons werd opgemerkt in de tijd van ingraven voor de blootgestelde wormen. Tijdens de verversing van het sediment gingen de blootgestelde wormen zich sneller ingraven dan bij de start van het experiment. Deze sensorische respons is het tegenovergesteld van wat verwacht werd bij vervuiling van het sediment. Tenslotte kunnen we besluiten dat de 10 µm grote microplastics opgenomen worden in het circulatorisch systeem of de weefsels van A. marina. Heel sporadisch werd er ook microplastic van 30 µm aangetroffen in de gedestrueerde wormen. De opname van microplastics in het lichaam van het organisme is afhankelijk van de grootte van het partikel en vormt een toxicologische bedreiging vanwege de aan het microplastic geabsorbeerde contaminanten. De blootstelling aan microplastics leidt tot een verhoging van de eiwitsynthese terwijl de beschikbare energie opgeslagen in de vetten en suikers ongewijzigd blijft. Er is ook een verandering in de biomassa bij blootstelling en een daling in de tijd nodig voor ingraven. Er is nog additioneel onderzoek nodig voor de bepaling van de verblijftijd van opgenomen microplastics in het lichaam van het organisme, de effecten op de gezondheid geassocieerd met de opname en de implicaties voor de voedselketen. De boven- en ondergrens voor de diameterpartikel voor opname vanuit de darm moet ook nog onderzocht worden. De studie van de effecten van microplastic op A. marina als gevolg van de blootstelling gebeurde op korte termijn. In de natuur worden organismen gedurende hun hele levenscyclus blootgesteld aan een verzameling van contaminanten. Er is dus nood aan blootstellingsstudies op lange termijn om een beter inzicht te verkrijgen van de effecten van microplastics in de natuurlijke omgeving.
42
Referenties
6. Referenties ARTHUR, C., BAMFORD, H., & BAKER, J. (2008). Workshop on the occurence, effects and fate of small plastic debris in the oceans. 3 september , 1-16 NOAA Technical Memorandum. ASHTON, K., HOLMES, L., & TURNER, A. (2010). Association of metals with plastic production pellets in the marine environment. Marine Pollution Bulletin , 60: 2050-2055. BARNES, D. K., GALGANI, F., THOMPSON, R. C., & BARLAZ, M. (2009). Accumulation and fragmentation of plastic debris in global environments. Phil. Trans. R. Soc. B , 364: 1985-1998. BETTS, K. (2008). Why small plastic particles pose a big problem in the oceans? Environ. Sci. Technol. , 42 (24): 8995. BIJKERK, R., & DEKKER, P. I. (1991). De wadpier Arenicola marina (Polychaeta): Ecologisch profiel . Samengesteld in opdracht van de hoofddirectie van de waterstraat, Afdeling Rijkswateren AH , 1-77. BOCKSTIEGEL, E. (2010). The North Pacific Garbage Patch: Problems and potential solutions. SPEA 499 Honors thesis. Indiana University. BOERGER, C. M., LATTIN, G. L., MOORE, S. L., & MOORE, C. J. (2010). Plastic ingestion by planktivorous fishes in the North Pacific Central Gyre. Marine Pollution Bulletin , 60: 2275-2278. BROWN, R. J., GALLOWAY, T. S., LOWE, D., BROWNE, M. A., DISSANAYAKE, A., JONES, M. B., et al. (2004). Differential sensitivity of three marine invertebrates to copper assessed using multiple biomarkers. Aquatic Toxicology , 66: 267-278. BROWNE, M. A., DISSANAYAKE, A., GALLOWAY, T. S., LOWE, D. M., & THOMPSON, R. C. (2008). Ingested microscopic plastic translocates to the circulatory system of the mussel, Mytilus edulis (L.). Environ. Sci. Technol. , 42: 5062-5031. DERRAIK, J. G. (2002). The pollution of the marine environment by plastic debris: a review. Marine Pollution Bulletin , 44: 842-852. ENDO, S., TAKIZAWA, R., OKUDA, K., TAKADA, H., CHIBA, K., KANEHIRO, H., et al. (2005). Concentration of polychlorinated biphenyls (PCBs) in beached resin pellets: Variability among individual particles and regional differences. Marine Pollution Bulletin , 50: 1103-1114.
43
Referenties GRAHAM, E. R., & THOMPSON, J. T. (2009). Deposit- and suspension-feeding sea cucumbers (Echinodermata) ingest plastic fragments. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology , 368: 22-29. GREGORY, M. R. (2009). Environmental implications of plastic debris in marine settings entanglement, ingestion, smothering, hangers-on, hitch-hiking and alien invasions. Phil. Trans. R. Soc. B , 364: 2013-2025. HINGSTONA, J. L., COPPLESTONE, D., McDONALD, P., & PARKER, T. G. (2002). The use of biomarkers in the assessment of biological damage in the lugworm (Arenicola marina) and the lobster (Hamarus gammarus) due to environmental contamination. In Protection of the environment from ionising radiation (pp. 60-68). International Atomic Energy Agency. MATO, Y., ISOBE, T., TAKADA, H., KANEHIRO, H., OHTAKE, C., & KAMINUMA, T. (2001). Plastic resin pellets as a transport medium for toxic chemicals in the marine environment. Environ. Sci. Technol. , 35: 318-324. MOORE, C. J. (2008). Synthetic polymers in the marine environment: A rapidly increasing, long-term threat. Environmental research 108 , 131-139. MORALES-CASELLES, C., LEWIS, C., RIBA, I., DELVALLS, T. Á., & GALLOWAY, T. (2009). A multibiomarker approach using the polychaete Arenicola marina to asses oilcontaminated sediments. Environ. Sci. Pollut. Res. , 16: 618-629. MURRAY, F., & COWIE, P. R. (2011). Plastic contamination in the decapod crustacean Nephrops norvegicus (Linnaeus 1758). Marine Pollution Bulletin, doi: 10.1016/j.marpolbul.2011.03.032. OEHLMANN, J. (2009). A critical analysis of the biological impacts of plasticizers on wildlife. Phil. Trans. R. Soc. B , 364: 2047-2062. PICADO, A., BEBIANNO, M. J., COSTA, M. H., FERREIRA, A., & VALE, C. (2007). Biomarkers: a strategic tool in the assessment of environmental quality of coastal waters. Hydrobiologia , 587: 79-87. RIOS, L. M., MOORE, C., & JONES, P. R. (2007). Persistent oranic pollutants carried by synthetic polymers in the ocean environment. Marine Pollution Bulletin , 54: 12301237. RYAN, P. G., MOORE, C. J., VAN FRANEKER, J. A., & MOLONEY, C. L. (2009). Monitoring the abundance of plastic debris in the marine environment. Phil. Trans. R. Soc. B , 364: 1999-2012.
44
Referenties SMOLDERS, R., BERVOETS, L., DeCOEN, W. & BLUST, R. (2004). Cellular energy allocation in zebra mussels exposed along a pollution gradient: Linking cellular effects to higher level of biological organization. Environ. Pollut. , 129: 99-112 SMOLDERS, R., de BOECK, G. & BLUST, R. (2003). Changes in cellular energy budget as a measure of whole effluent toxicity in zebra fish (Danio rerio). Environ. Toxicol. Chem. , 22: 890-899. STOMPERUDHAUGEN, E. S., OVERAS, N. H., LANGFORD, K., DE COEN, W., SMOLDERS, R., & HYLLAND, K. (2009). Cellular energy allocation in Hediste diversicolor exposed to sediment contaminants. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A , 72: 244-253. TAMANAHA, M., & MOORE, C. (2010). Plastic debris from rivers to sea, Plastics are forever. Algalita Marine Research Foundation. http://www.algalita.org/education.html. TEUTEN, E. L., ROWLAND, S. J., GALLOWAY, T. S., & THOMPSON, R. C. (2007). Potential for plastics to transport hydrophobic contaminants. Environ. Sci. Technol. , 41: 77597764. TEUTEN, E. L., SAQUING, J. M., KNAPPE, D. R., BARLAZ, M. A., JONSSON, S., BJÖRN, A., et al. (2009). Transport and release of chemicals from plastics to the environment and to wildlife. Phil. Trans. R. Soc. B , 364: 2027-2045. THOMPSON, R. C. (2006). Plastic debris in the marine environment: consequences and solutions. In J. C. Krause, H. von Nordheim, & S. Bräger, Marine Nature Conservation in Europe 2006: Proceedings of the Symposium, May 2006 (pp. 107-116). Federal Agency for Nature Conservation. THOMPSON, R. C., OLSEN, Y., MITCHELL, R. P., DAVIS, A., ROWLAND, S. J., JOHN, A. W., et al. (2004). Lost at sea: Where is all the plastic? SCIENCE , 304: 838. THOMPSON, R. C., SWAN, S. H., MOORE, C. J., & vom SAAL, F. S. (2009). Our plastic age. Phil. Trans. R. Soc. B , 364: 1973-1976. WESTON, D. P., PENRY, D. L., & GULMANN, L. K. (2000). The role of ingestion as a route of contaminant bioaccumulation in a deposit-feeding polychaete. Arch. Environ. Contam. Toxicol. , 38: 446-454.
45
Bijlage
7. Bijlage – Protocol Protocol voor de bepaling van beschikbare energie (proteïnen, carbohydraten en lipiden) en energieconsumptie (ETS activiteit) – Adaptatie voor Arenicola marina 1. Homogenisation of the organism Specific materials Trizma base (Sigma T-1503) HCl (1M) MgSO4 PVP Triton X-100 Ultra-Turrax grinder T25 10ml glass tube Preparation of the homogenisation buffer For the preparation of 1L of homogenisation buffer (0.1M Tris-HCl buffer, pH 7.5, 0.4M MgSO4, 0.15% PVP [w/v] and 0.2% [w/v] Triton X-100): Dissolve 12.1g of Trizma base in approximately 700ml of deionised water. Add 48.16g of MgSO4 and let it dissolve. Do the same with 1.5g of PVP. Then add 2ml of Triton X-100. Bring to pH 7.5 with 1M HCl and add up to 1L with deionised water. Homogenisation Determine and record the wet weight of the worm prior to homogenisation. Add 5ml of buffer per g of worm (record the added volume of buffer). Use subsample of 200 µl for protein and carbohydrate determination, 200 µl for lipid analysis and 400 µl for ETS measurement. ETS is determined immediately, the other fractions are shock frozen in liquid nitrogen and stored at -80°C until analysis.
2. Protein and carbohydrate measurement Principle: proteins are precipitated by the addition of TCA. Due to the addition of sulphuric acid carbohydrates will react with phenol and this results in an orange colour (492 nm). For proteins: the pellet is resuspended; reaction between the proteins present in the solution and the dye Brilliant Blue G (in Bradford reagent) causes a shift in colour from 465 to 595 nm (blue colour) (Bradford, 1976). Specific materials Bradford reagent (Sigma B6916)
46
Bijlage
Protein Standard Bovine Serum Albumin BSA (Sigma P5619). Add 5ml of deionised water to the vessel (contains 2mg BSA), resulting in 0,4 mg/ml; Take 200 µl samples to freeze (-20°C) in 1ml eppendorfs for future use. These have a lifespan of about 6 months. Multitip pipette + reservoir 5% Trichloro acetic acid (Sigma ultrazuiver T9159): 2.5g in 50ml deionised water (glass volumetric flask). Use gloves. Store in freezer in Schott Duran flasks for ± 1-2 months. 15% Trichloro acetic acid (Sigma ultrazuiver T9159): 15g in 100ml deionised water (glass volumetric flask). Use gloves. Store in freezer in Duran flask for ± 1-2 months. 5% phenol (Sigma P1037 ≥ 99% pure, -20°C): 2.5g in 50ml deionised water (glass volumetric flask). Use gloves. Store in freezer in Schott Duran flask for ± 1-2 months. Concentrated H2SO4 (Prolabo 20692, rectapur 98%) 1M NaOH (dissolve 4g of NaOH pellets in 100ml deionised water) 1M HCl (add 8.4ml of 37% HCl to 80ml of deionised water and fill up to 100ml with deionised water, always work like this, never add water to pure acid) Glucose (Prolabo 24370, normapur) 2ml eppendorfs 2x 10ml tubes
General sample preparation Keep in mind to start cooling the centrifuge 5-10 minutes before use at 4°C. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.
2.1.
Take the samples (in eppendorf tubes) out of the -80°C freezer and put them in a stryrofoam box with crushed ice to thaw slowly. Add 100 µl of 15% TCA for each 200 µl of homogenate buffer and vortex the samples. Leave the samples on ice for 10 minutes. A white precipitate will form – these are the proteins. Centrifuge the samples for 10 minutes at 3500 rpm at 4°C. Put the supernatans into new eppendorfs and leave them on ice. Resuspend the pellets in 200 µl (per 300 µl) of 5% TCA and vortex them. Centrifuge the pellets again for 10 minutes at 3500 rpm at 4°C. Then remove this supernatans and add to the former. Vortex the eppenddorfs. The supernatans is used for carbohydrate analysis. The pellet is used for protein analysis. Protein analysis
Pellet treatment The pellet is dissolved in 400 µl of 1M NaOH, incubated at 60°C for 30 minutes and subsequently neutralized with 400 µl of 1M HCl.
47
Bijlage Depending on the amount of tissue used, it might be necessary to dilute the samples at this point (factor 1/5 or 1/10). The dilution step is performed in eppendorfs tubes using deionised water. Samples should be vortexed before placing them in the multiwall plate. Standards Make a standard concentration range of 0.4, 0.2, 0.1, 0.05, 0.025 mg/ml and 3 blanks (deionised water only). Carry out the 1:2 serial dilutions in the multiwall plate: place 50 µl (of 0.4 mg/ml) in the first well, remove 25 µl and place in 25 µl of deionised water in the next well, mix well by pipetting up and down and repeat. Remove 25 µl from the final dilution to end up with 25 µl. Make 2 sets of standards and 3 blanks. Take 3 replicates of 25 µl from each sample and place in a 96 multiwell plate. Measurement Pour the approximate amount of Bradford reagent needed for the analysis (250 µl x number of wells to be filled) in a glass beaker (if using a normal pipette) or a special reservoir to use with the multitip pipette. This step is performed in order to avoid contamination of the Bradford reagent in the original bottle. Add 250µl of Bradford reagent (normal pipette or multitip pipette) to each well. Do it quickly but avoid contact between the pipette and the samples in the multiwell plate. Incubate the plate in the dark (e.g. in a drawer) for 15 minutes at room temperature. In the meanwhile start the spectrometer and computer: Switch on the plate reader Switch on the computer Select Ascent software Select Session – open Select Bradford Select Measure Select folder to save results Press START This program will shake the plate for 5 seconds and the measure the optical density at 595 nm. Check if the optical density of the samples falls within the range of the standards. If not, repeat this protocol with diluted samples. Remainders of the samples can be stored at -80°C for future use. Pour the content of the multiwell plate in a recipient and discharge it in the correct waste container (‘Waterige chemische oplossingen’). The plate itself has to be put in the container contaminated waste.
48
Bijlage
2.2.
Carbohydrate analysis
Standards Make a 0.5% solution of glucose: 125mg in 25ml deionised water. Take a new 10ml tube and transfer 1 ml of this 0.5% glucose solution. Add 9ml deionised water to get a final concentration of 0.5 mg/ml. Make a standard concentrations range of 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625, 0.031, 0.016 mg/ml and a blank (250 µl deionised water). Carry out 1:2 serial dilutions in 2ml eppendorfs by taking 500 µl of the 0.5 mg/ml solution to the first eppendorf, removing 250 µl and adding to 250 µl deionised water in the next eppendorf, mix by pipetting up and down and repeat. Measurement It might be necessary to dilute the supernatans. The dilution (1:2) is performed in eppendorf tubes using deionised water. Remove 250 µl of the (diluted) sample and standards and put into a new 2ml eppendorf. Then add 250 µl of 5% phenol. Bring the amount of concentrated H2SO4 necessary in a separate recipient (1ml x number of eppendorfs to be filled). Add 1ml concentrated H2SO4 to each eppendorf. Take care doing this and subsequent steps: use gloves and wear protective glasses. Close the eppendorfs and vortex the samples. From each standard add 300 µl to the multiwell plate and make 2 sets of standards and 3 blanks. From each sample take 3x300 µl replicates and place in a multiwell plate. Incubate the plate in the dark for 15 minutes at room temperature (e.g. in a drawer). In the meantime start the spectrometer and computer: Select Ascent software Select Session – open Select sugars Select Measure Select folder to save results Press START This program will shake the plate for 5 seconds and the measure the optical density at 490 nm. This is the best approximation of the 492 nm wavelength that should be used. Check if
49
Bijlage the optical density of the samples falls within the range of the standards. If not, repeat this protocol with diluted samples. Remainders of the sample can be stored at -80°C for future use. Pour the content of the multiwell plate and the content of the eppendorfs in a recipient and discharge it in the correct waste container (‘Anorganische zuren’). The plate itself and the empty eppendorfs have to be put in the container with contaminated waste.
3. Lipid measurement Principle: lipids dissolve in CHCl3. Addition of concentrated acid in combination with heating to 200°C burns the lipids (C-chains) to carbon (C) what results in a black colour (measured at 340 nm). Lipid extraction procedures are based on Bligh and Dyer (1959). Specific materials CHCl3 (Vel 1254) CH3OH (Prolabo 20847) H2SO4 (Prolabo 20692, recapur 98%) Tripalmitin (fatty acid) (C16:0) Sigma T5888, freeze -20°C 5ml glass test tubes Steel test tube rack 10ml volumetric flask Oven at 60°C Oven at 200°C Methods Keep in mind to start cooling the centrifuge 5-10 minutes before use. Make sure that ovens are at the right temperature when needed (60°C and 200°C). Wear protection when working with chloroform, methanol, sulphuric acid. Samples 1. Add 500 µl CHCl3, 500 µl CH3OH and 250 µl of deionised water to the 200 µl homogenate. 2. Vortex the samples. 3. Centrifuge for 10 minutes at 3000 rpm at 4°C. 4. Throw away the top fluid phase. 5. It might be necessary to dilute the samples. Take from each sample 3 times 100 µl from the bottom layer and dilute with an appropriate volume of chloroform (1/2 or 1/4). 6. Vortex the samples. 7. Take 3 replicates of 100 µl from each dilution and put each replicate in 5ml tubes. Dry the tubes at 60°C for 30 minutes – in a metal rack.
50
Bijlage 8. Add 500 µl of H2SO4 and vortex Standards Weigh out 62.5mg of tripalmitin into a 10ml volumetric flask. Do not use plastic recipients (because of the addition of chloroform!); Add 10ml of chloroform and mix. Carry out a 1:2 serial dilution with chloroform in 5ml glass tubes. Place 2ml (6.25 mg/ml) in the first tube. Remove 1ml and add to next tube with 1ml of chloroform. Continue this to achieve the following concentrations: 6.25, 3.12, 1.56, 0.78, 0.39, 0.19, 0.09 mg/ml and a blank with 1ml chloroform. Put stoppers on the tops of the glass tubes and vortex them. Take 100 µl from each concentration and add to a new tube. Dry the tubes at 60°C for 30 minutes – in a metal rack. Add 500 µl concentrated H2SO4 and vortex. Standards and samples 1. Put standards and samples in the oven at 200°C for 15 minutes – in a metal rack. 2. Cool the samples to room temperature for about 15 minutes (important!). 3. When cool add 1.5ml of deionised water and vortex (always use the same pipet). 4. From each dilution take 250 µl and place in a 96 well multiwell plate. 5. Add 2 sets of standards to the plate and 3 blanks. 6. This test does not have to be incubated, thus: a. Switch on the plate reader b. Switch on the computer c. Select Ascent software d. Select Session – open e. Select Testvet f. Select Measure g. Select folder to save results h. Press START This program will shake the plate for 5 seconds and the measure the optical density at 340 nm. Check if the optical density of the samples falls within the range of the standards. If not, repeat this protocol with diluted samples; Remainders of the undiluted samples can be stored at -80°C for future use.
51
Bijlage Pour the content of the multiwell plate in a recipient and discharge it in the correct waste container (‘organische solventen’). The plate itself has to be put in the container with contaminated waste.
4. Electron Transport System (ETS) measurement Principle: INT replaces O2 as electron acceptor in the mitochondria. 2 µmol INT corresponds to 1 µmol of O2. Formazan is formed (red colour). This protocol is based in King and Packard (1975). Specific materials INT (p-iodonitrotetrazolium violet) Sigma I877-IG (fridge) Na2HPO4 (Vel 1770) K2HPO4 (Ucb 1628) Trizma base (Sigma T1503) MgSO4 PVP (Sigma PVP40) Triton X-100 (Fluka 93443) NADPH (Roche, -20°C; cat. no. 10 107824 tetrasodium salt) NADH (Roche, fridge; cat. no. 10 128015 disodium salt grade II) Multitip pipette and reservoir INT (p-iodonitrotetrazolium violet) 40mg INT in 10ml deionised water (Use gloves!). This is very difficult to dissolve and is best done by sonication or heating (70°C) for about two hours. Allow it to cool before use; it should be a yellow colour and a new solution should be used each time the assay is run. Buffered substrate solution (10ml) The buffered substrate solution consists of a 0.1M Tris-HCl buffer at pH 7.5 with 0.3% Triton X-100. Dissolve 12.1g of Trizma base in 700ml of deionised water. Add 3ml of Triton X-100. Bring to a pH of 7.5 with an appropriate HCl solution and add up to 1L with deionised water. Store in Duran flask in fridge. NADH/NADPH solution For 10ml, dissolve the following in deionised water: 1.7 mmol/L NADH (1205.9 mg/L) so add 12.059 mg NADH. 0.25 mmol/L NADPH (208.35 mg/L) so add 2.0835 mg NADPH. The solution is stable if stored at -80°C but it is preferred to prepare it each time the assay is run. The quantity depends on the number of samples.
52
Bijlage Procedure Centrifuge the samples at 3000 rpm for 10 minutes at 4°C. Add 100 µl of buffered substrate solution to a 96 microtiter plate. Then add 50 µl of homogenate (in triplicate) followed by addition of 50 µl of NADH/NADPH solution. Start the colometric reaction by adding 100 µl INT solution to each well. For controls use 50 µl of homogenate buffer, 100 µl buffered substrate solution, 50 µl of NADH/NADPH solution and 100 µl INT solution. As soon as the INT is added, the kinetic reaction needs to be measured every 7 seconds at 490 nm an Vmax (maximal slope; per minute) calculated. Switch on the plate reader Switch on the computer Select Ascent software Session – open Select ETS3 Press results (red button) Process – kinetic processors Average rate calculation/min Max. Rate/min Apply Measure Press Procedure (blue button) Select “Save” After “Sheet name” fill in “Proces1” Select folder to save the results Press START Pour the content of the multiwell plate in a recipient and discharge it in the correct waste container (‘Waterige vloeistoffen’). The plate itself has to be put in the container with contaminated waste.
5. Calculations of Ea and Ec 5.1.
Calculation of Ea (Energy available)
Each energy fraction separately Use the results of the standards to calculate the regression line between standard concentration (mg/ml on X-asis) and measured absorbance (on Y-asis).
53
Bijlage The concentration of protein in a sample can be calculated using the measured absorbance and calculated regression line equation. Don’t forget to take all dilution steps into account when making the calculations. Use this regression to calculate mg/ml in the extraction according to the absorbances measured. Then for each energy fraction separately, calculate mg protein or carbohydrate or lipid in the extraction.
With XDG: protein, carbohydrate or lipid in the organism; VW: the volume of sample (after all homogenisation, extraction and centrifugation steps) you add to the multiwell; DF: dilution factor. For proteins: VW is 0.025ml, DF is 25/200 (25 µl is used in the multiwell out of 200 µl available after centrifugation). For carbohydrates: VW is 0.25ml, DF is 250/500 For lipids: VW is 0.1ml, DF is 100/500 Each energy fraction has to be multiplied with the correct factor. Proteins: 24 J/mg Carbohydrates: 17.5 J/mg Lipids : 39.5 J/mg Then for each energy fraction seperately, calculate mg protein or carbohydrate or lipid per dry weight organism. Energy available (Ea) For the total energy available you have to sum of the arithmetic mean of the proteins, the lipids and the carbohydrates. 5.2.
Calculation of Ec (Energy consumed)
Results of the ETS measurements are used. The Vmax values are measured (V=ΔAbs/Δtime) and used in the following formula:
54
Bijlage With Vwell: total volume in well (300 µl), DF: dilution factor (60/400 = 60 µl used for measurement out of the 400 µl homogenate available), 2:2 mol formazan per mol O 2, 10-6: conversion from µl to l. This formula is based on the formula of Lambert-Beer: A = x I x c with A: absorbance, : extinction coefficient, I: optical length and c: concentration. In our case: for INT-formazan = 15900 x (mol/l)-1 x cm-1 and I = 0.7795 cm, optical length of multiwell filled with 300 µl. For one hour: Mol O2 uur-1 = mol O2 min-1 x 60 Energy value: kJ uur-1 = mol O2 uur -1 x 484 kJ mol O2-1 Per dry weight organism (Ec) 5.3.
Calculate time to survive
Divide the sum of the arithmetic mean of the lipids, carbohydrates and proteins with the energy consumption: Energy Reserve – Energy Consumption Ratio =
55
