Katholieke Universiteit Leuven
Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen
Ontwikkeling van selectieve antivirale middelen tegen Flaviviridae
Promotor: Prof. Dr. Bruno GODDEERIS Departement Dierproductie Laboratorium voor Fysiologie en Immunologie der Huisdieren Tweede Promotor: Prof. Dr. Johan NEYTS Faculteit Geneeskunde Rega Instituut Departement Microbiologie en Immunologie Laboratorium voor Virologie en Chemotherapie
Eindwerk voorgedragen tot het behalen van de graad van Bio-ingenieur in de Cel- en Genbiotechnologie NGUYEN PHAM Anh Dao
Juni – 2007
Dit proefschrift is een examendocument dat na de verdediging niet meer werd gecorrigeerd voor eventueel vastgestelde fouten. In publicaties mag naar dit proefwerk verwezen worden mits schriftelijke toelating van de promotoren, vermeld op de titelpagina.
Katholieke Universiteit Leuven
Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen
Ontwikkeling van selectieve antivirale middelen tegen Flaviviridae
Promotor: Prof. Dr. Bruno GODDEERIS Departement Dierproductie Laboratorium voor Fysiologie en Immunologie der Huisdieren Tweede Promotor: Prof. Dr. Johan NEYTS Faculteit Geneeskunde Rega Instituut Departement Microbiologie en Immunologie Laboratorium voor Virologie en Chemotherapie
Eindwerk voorgedragen tot het behalen van de graad van Bio-ingenieur in de Cel- en Genbiotechnologie NGUYEN PHAM Anh Dao
Juni – 2007
DANKWOORD
"Wie een weldaad niet met dankbaarheid vergeldt, vertroebelt de bron, die zijn dorst heeft gestild." (J. Hammer)
‘Cam on’ woorden zullen mij te kort schieten… ruimte voor eens eindig... mijn dankbaarheid voor u allen duurt langer dan het geschenk... Mijn eerste woord van dank gaat uit naar mijn promotor Prof. Dr. Bruno Goddeeris. Uw raad, spontaneïteit en enthousiasme zijn de bron van mijn opleiding tot bio-ingenieur. Mijn copromotor Prof. Dr. Johan Neyts ben ik erg dankbaar voor de kans die ik kreeg om dit onderzoekswerk bij u te mogen uitvoeren. Eveneens bedank ik Prof. Dr. Guido Volckaert voor uw bereidwilligheid om te fungeren als jurylid. Veel dank aan Prof. Dr. Erik De Clercq voor alle kansen en mooie momenten die Ward en ik dankzij u mochten/mogen beleven en dat we steeds welkom zijn voor een “korte” babbel. Dank je wel, Pieter Leyssen, dat je altijd mijn begeleider wou zijn. Suzanne Kaptein, dank je dat je er bent! Annie, Armando, Carolien, Christiane, Damien, Dominique, Els, Hendrik, Inge, Jan, Katrien, Leen, Lotte, Miette, Miyeon, Sofie, Susan, Tine, Qiuya dank voor jullie gezelschap, de aangename babbels en collegialiteit en Nathalie, welbedankt voor de primers. Mijn laatste woord van dank is voor mijn familie en voor Elisabeth Provoost, voor jullie voortstuwende steun! Waar, wie zou ik zonder jullie zijn? En jij, mijn Ward... Dank u
i
SAMENVATTING Flavivirussen, zoals het gele koorts en dengue koorts virus, zijn ‘emerging infections’ en vormen wereldwijd een ernstige bedreiging voor de volksgezondheid. De ontwikkeling van antivirale middelen tegen deze virussen staat nog in zijn kinderschoenen. Moleculen, behorende tot de GPC-N en GPYA reeks (gesynthetiseerd door Prof. Dr. G. Pürstinger), vertonen selectieve anti-flavivirus activiteit. Het werkingsmechanisme is echter nog niet gekend. Dit eindwerk heeft tot doel bij te dragen tot de ontrafeling hiervan. Voor fenotypische karakterisering van virus isolaten wordt onder andere gebruik gemaakt van ‘plaque forming assays’ met agar als ‘overlay’-medium. Omdat aan het gebruik van agar talrijke nadelen verbonden zijn, werd eerst een eenvoudig bruikbare ‘plaque forming assay’ op punt gesteld met Avicel als ‘overlay’-medium. Deze assay werd vervolgens gebruikt voor de karakterisatie van virus dat voor 26 passages opgegroeid werd in aanwezigheid van een selectie van moleculen behorende tot bovenstaande reeksen (resistentiekweek uitgevoerd door Dr. S. Kaptein). Na kwantificatie van de hoeveelheid virus in de respectievelijke virusisolaten, werden ‘plaque reduction assays’ en ‘virus yield assays’ uitgevoerd om te evalueren of het virus tekenen van resistentie tegen de betreffende inhibitoren vertoonde. Voor het gele koorts virus werd een sterke indicatie van resistentie waargenomen voor GPYA-4 en GPYA-18; voor het dengue koorts virus werden gelijkaardige observaties gedaan voor GPC-N20 en GPC-N32.
ii
SUMMARY Flaviviruses, such as yellow fever virus and dengue fever virus, are emerging pathogens. Both viruses have a significant impact on human health world-wide. At present, there are still no selective drugs available for the treatment of these infections. Compounds, that belong to the GPC-N and GPYA series (synthesized by Prof. Dr. G. Pürstinger), have proven to inhibit flavivirus replication. This research work aims to contribute to the unraveling of their mechanism of action. Plaque forming assays, often employing agar as an overlay, are a basic virological method for phenotypical characterization of virus isolates. The use of agar, however, has many disadvantages. The first part of this work was dedicated at establishing a convenient plaque forming assay for the characterization of flavivirus isolates employing Avicel as overlay. This assay was subsequently used to characterize virus that has been allowed to replicate for 26 passages in the presence of a selection of the above-mentioned compounds (passaging done by Dr. S. Kaptein). Following quantification of the virus in the different isolates, plaque reduction assays and virus yield assays were performed to assess the virus for signs of resistance against the respective inhibitors. A strong indication of the presence of resistant yellow fever virus against GPYA-4 and GPYA-18 was obtained, as well as resistant dengue fever virus against GPC-N20 and GPC-N32.
iii
INHOUDSTAFEL Dankwoord .................................................................................................................................. i Samenvatting.............................................................................................................................. ii Inhoudstafel............................................................................................................................... iv Lijst met gebruikte afkortingen ................................................................................................. vi 1. Inleiding ......................................................................................................................... 1 2. Literatuurstudie .............................................................................................................. 2 2.1. De Flavivirussen .......................................................................................................... 2 2.1.1. Taxonomie............................................................................................................... 2 2.1.2. Fylogenie ................................................................................................................. 2 2.2. Het Gele Koorts Virus.................................................................................................. 3 2.2.1. Epidemiologie ......................................................................................................... 3 2.2.2. Pathogenese, Pathologie en Behandeling................................................................ 7 2.2.3. Impact...................................................................................................................... 9 2.2.4. GKV 17D Vaccinstam, merknaam Stamaril van Aventis Pasteur ........................ 10 2.3. Het Dengue Koorts Virus........................................................................................... 11 2.3.1. Epidemiologie ....................................................................................................... 11 2.3.2. Pathogenese, Pathologie en Behandeling.............................................................. 14 2.3.3. Impact.................................................................................................................... 17 2.3.4. DENV Serotype 2 New Guinea Stam, Gift Vincent Deubel................................. 18 2.4. De Moleculaire Biologie van Flavivirussen............................................................... 19 2.4.1. Morfologie............................................................................................................. 19 2.4.2. Structuur van het Flavivirus Genoom ................................................................... 19 2.4.3. De Structurele Proteïnen ....................................................................................... 20 2.4.4. Niet-Structurele Proteïnen..................................................................................... 23 2.5. Replicatiecyclus van de Flavivirussen ....................................................................... 25 2.6. Antivirale Therapeutica.............................................................................................. 27 2.6.1. Inleiding................................................................................................................. 27 2.6.2. Selectieve Inhibitoren van Virale Enzymes .......................................................... 27 2.6.3. Breedspectrum Inhibitoren van Virale en/of Cellulaire enzymes ......................... 31 2.6.4. Inhibitoren van Cellulaire Enzymes ...................................................................... 35 2.6.5. Andere Strategieën voor de Behandeling van Flavivirus Infecties ....................... 38 2.7. Samenvatting.............................................................................................................. 41 3. Materiaal & Methoden ................................................................................................. 42 3.1. Materiaal .................................................................................................................... 42 3.1.1. Virus en Cellen...................................................................................................... 42 3.1.2. Media en bereidingen ............................................................................................ 42 3.1.3. Antivirale Moleculen............................................................................................. 43 3.2. Methoden ................................................................................................................... 43 3.2.1. Subcultiveren van Vero cellen .............................................................................. 43 3.2.2. Opkweken van (resistente) flavivirussen .............................................................. 44 3.2.3. Opzuivering van virussen door uitverdunning ...................................................... 44 3.2.4. Plaque assays......................................................................................................... 45 3.2.5. Real-time RT-qPCR .............................................................................................. 46 3.2.6. Virus Yield ............................................................................................................ 47 3.2.7. Sequenering ........................................................................................................... 47 4. Resultaten ..................................................................................................................... 50 4.1. Optimalisatie van een eenvoudig bruikbare ‘plaque forming assay’ voor Flavivirussen ............................................................................................................................ 50 iv
4.1.1. Situering ................................................................................................................ 50 4.1.2. Vergelijking van Agar versus Avicel als ‘Overlay’-Medium ............................... 51 4.1.3. Evaluatie agar en Avicel als flavivirus plaquing media ........................................ 53 4.2. Fenotypische evaluatie van resistentie van het gele koorts virus en dengue virus tegen moleculen van de GPYA-serie ....................................................................................... 55 4.2.1. Voorgeschiedenis van de GPYA-serie .................................................................. 55 4.2.2. Karakterisatie van de verschillende virusisolaten ................................................. 56 4.2.3. Evaluatie van Resistentie....................................................................................... 59 4.3. Genotypische evaluatie van resistentie van het gele koorts virus en dengue virus.... 65 4.3.1. Opzuivering van Plaques....................................................................................... 65 4.3.2. Sequenering van de opgezuiverde virusisolaten ................................................... 67 5. Algemene Bespreking & Besluit.................................................................................. 68 Literatuurlijst............................................................................................................................ 71 Addendum I.................................................................................................................................I
v
LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN ADE
‘antibody-dependent enhancement’
C-proteïne
capsideproteïne
DENV
dengue koorts virus
DHK
dengue hemorragische koorts
DK
dengue koorts
dpi
dagen na infectie
DSS
dengue shock syndroom
CPE
cytopathogeen effect
EC50
50% effectieve concentratie
E-proteïne
enveloppeproteïne
ER
endoplasmatisch reticulum
FCS
foetaal kalfsserum
FSB
fluorosulfonylbenzoyl
GK
gele koorts
GKV
gele koorts virus
IMP
inosine monofosfaat
IMPDH
inosine monofosfaat dehydrogenase
MEM
‘Minimum Essential Medium’
M-proteïne
membraanproteïne
NS-proteïne
niet-structurele proteïne
P15
passage 15
P26
passage 26
PFU
‘plaque forming units’
prM-proteïne
pre-membraanproteïne
RaRp
RNA-afhankelijke RNA-polymerase
RMP
ribavirine 5’-monofosfaat
rpm
rotaties per minuut
RTP
ribavirine 5’-trifosfaat
VC
viruscontrole
WHO
World Health Organisation
WT
wildtype vi
DEEL I INLEIDING
1. INLEIDING Het gele koorts en dengue koorts virus behoren tot het genus Flavivirus (familie Flaviviridae). Beide virussen worden overgedragen door de beet van een mug (in hoofdzaak Aedes aegypti). De klinische symptomen variëren van milde koorts en malaise, tot (vaak fatale) hemorragische koorts. Vooral dengue is een “emerging infection”: de incidentie en geografische spreiding neemt de laatste jaren zeer sterk toe: meer dan 2,5 miljard mensen (40% van de wereldbevolking) lopen risico op infectie met het dengue virus. Globalisering en opwarming van de aarde blijken de stuwende krachten achter deze tendens te zijn. Globaal schat de ‘World Health Organization’ het aantal gele koorts virus infecties jaarlijks op 200 000, waarvan meer dan 20% met fatale afloop, en op meer dan 50 miljoen gevallen voor het dengue koorts virus. In het geval van dengue koorts virus kan secundaire infectie met een ander serotype dengue hemorragische koorts veroorzaken, met jaarlijks meer dan 500 000 gevallen wereldwijd. Anno 2007 woekeren deze infecties ongestoord verder; absolute vectorcontrole is geen haalbare kaart, vaccinontwikkeling is zeer moeilijk omdat voor het dengue koorts virus een heel efficiënt tetravalent vaccin nodig is, en de ontwikkeling van selectieve antivirale middelen staat nog in zijn kinderschoenen. In het Rega Instituut werd in 2005 een klasse van moleculen geïdentificeerd (gesynthetiseerd door Prof. Dr. G. Pürstinger, Universisteit Innsbruck) die selectieve antivirale activiteit vertoont tegen flavivirussen. Een aantal moleculen uit deze klasse (GPYA-4, GPYA-14, GPYA-18 voor het gele koorts virus en GPYA-14, GPC-N20, GPC-N32 voor het dengue koorts virus) werden voldoende actief en selectief bevonden om de zoektocht naar het werkingsmechanisme van deze potentiële antivirale middelen te starten. Het herhaald opkweken van beide virussen in aanwezigheid van de respectievelijke moleculen (werk uitgevoerd door Dr. S. Kaptein) had als doel resistentie te induceren tegen deze inhibitoren. Het voorwerp van dit onderzoekswerk is het fenotypisch (en genotypisch) karakteriseren van deze virusisolaten. Voor deze experimenten, is het noodzakelijk om eerst een eenvoudig bruikbare ‘plaque assay’ voor flavivirussen te ontwikkelen. Vooraleer over te gaan tot het experimenteel werk, wordt eerst de achtergrond van het gele koorts en dengue koorts virus toegelicht, alsook mogelijke antivirale therapeutica, die momenteel nog in de onderzoeksfase zitten.
Inleiding
1
DEEL II LITERATUURSTUDIE
2. LITERATUURSTUDIE 2.1. DE FLAVIVIRUSSEN 2.1.1. Taxonomie Het genus Flavivirus behoort, samen met het genus Hepacivirus (bijvoorbeeld het hepatitis C virus) en Pestivirus (bijvoorbeeld het boviene viraal diarree virus) tot de familie van de Flaviviridae. De genetische informatie van het virus wordt gecodeerd in een positief enkelstrengig RNA genoom en de virions zijn omgeven door een dubbellipidenmembraan. Belangrijke vertegenwoordigers van het genus Flavivirus zijn het gele koorts virus (GKV) en het dengue koorts virus (DENV) (overzichtsartikel door Mackenzie et al., 2004). Het genus van de flavivirussen heeft zijn naam ontleend aan het Latijnse ‘flavus’, wat geel betekent, en verwijst naar geelzucht die wordt veroorzaakt door het gele koorts virus (overzichtsartikel door Mukhopadhyay et al., 2005). Daar de meeste flavivirussen worden overgebracht door muggen of teken, worden ze (samen met de Alfavirussen, Bunjavirussen en Arenavirussen) soms ook wel geklasseerd in de groep van de ‘arthropod-borne viruses’ of kortweg arbovirussen (overzichtsartikel door Bray en Huggins, 1998).
2.1.2. Fylogenie Het
genus
omvat
meer
Flavivirus dan
70
species, die nog eens worden onderverdeeld in drie
clusters:
de
flavivirussen die worden overgedragen muggen
door (‘mosquito-
borne’), deze die worden overgedragen door teken Figuur 2-1 – Classificatie van de meest belangrijke humane flavivirussen. De relatie tussen de verschillende flavivirussen is in het dendrogam aan de linkerkant weergegeven. De evolutionaire afstand wordt niet vermeld. De serologische (serocomplex) en fylogenetische (clade en cluster) klassificaties staat aan de rechterzijde vermeld (overzichtsartikel door Mukhopadhyay et al., 2005).
(‘tick-borne’) en virussen waarvoor (tot nog toe) geen arthropood vector
kan worden aangetoond (‘no known vector’, Figuur 2-1). Dit classificatiesysteem, gebaseerd op serologische data, werd in 1998 verfijnd door genetische studies van Kuno et al. Deze drie clusters worden verder opgedeeld in verschillende ‘clades’: respectievelijk 9, 2 en 3 ‘clades’ Literatuurstudie
2
(Kuno et al., 1998). Virussen uit de ‘mosquito-’ en ‘tick-borne’ clusters hebben een complexe natuurlijke transmissiecyclus. Ze zijn in staat verscheidene gastheren te infecteren, meestal zoogdieren en vogels. Voor transmissie tussen gastheren zijn ze afhankelijk van een vector, meestal bloedzuigende insecten zoals muggen en teken. Ongeveer de helft van de reeds geïdentificeerde flavivirussen die tot deze clusters behoren, zijn pathogeen voor de mens (Tabel 2-1) (Solomon en Mallewa, 2001).
Tabel 2-1 – Medisch belangrijke flavivirussen met de belangrijke klinische symptomen, vector(en) en natuurlijke gastheren (Solomon en Mallewa, 2001).
2.2. HET GELE KOORTS VIRUS 2.2.1. Epidemiologie 2.2.1.1.
Epidemiologie: gisteren, vandaag en morgen
Een eerste beschrijving van de klinische symptomen veroorzaakt door het gele koorts virus dateert van 1498, in Centraal-Amerika. De eerste vermelding van deze ziekte in West-Afrika werd gemaakt in 1585. De verwijzing uit 1498 suggereert dat GKV zijn oorsprong vond in Amerika. Fylogenetische analyse van het genus Flavivirus ondersteunt echter de ‘Out of Africa’ origine, waarbij het virus eerst evolueerde naar een West- en Oost-Afrikaanse subspecies, waarna uit de eerste een Zuid-Amerikaanse variant is geëvolueerd (overzichtsartikel door Barrett & Monath, 2003). Het gele koorts virus maakte waarschijnlijk zijn intrede in de Nieuwe Wereld honderden jaren geleden toen geïnfecteerde muggen in watercontainers van slavenschepen werden verscheept vanuit West-Afrika.
Literatuurstudie
3
Pas in de achttiende eeuw werd GKV erkend als een infectie met een grote impact op de volksgezondheid. GKV-gerelateerde grote epidemieën werden gerapporteerd zowel in de Oude als in de Nieuwe Wereld, tot in Europa toe waar het virus via handelsschepen werd geïmporteerd. Rond 1900, tijdens de bouw van het Panamakanaal, vielen duizenden slachtoffers door infectie met GKV. Het was toen dat Walter Reed aantoonde dat GKV werd veroorzaakt door een filtreerbaar agens dat door de beet van de Aedes aegypti mug werd overgebracht. Hiermee werd het mysterie van deze ziekte opgelost, ook wel de Panamapuzzel genoemd, en was er ook voor het eerst het bestaan van een virus aangetoond. Eenmaal de transmissiecyclus was beschreven, werden preventie- en controleprogramma’s overal in ZuidAmerika geïmplementeerd. Dit resulteerde in een drastische daling van het aantal epidemieën en gele koorts (GK) gevallen. In gebieden waar de vectorcontrole zwakjes was, dook de ziekte weer op. Na de Tweede Wereldoorlog en met de komst van dichloor-difenyltrichloorethaan (DDT) voor de bestrijding van muggen leek het een feit dat GK in stedelijke gebieden kon worden voorkomen door de bestrijding van de vector. De laatste stedelijke epidemie van GK in Zuid-Amerika dateert uit 1942. Toch is het aantal GK-gevallen sinds 1985 tot op heden gestegen. In 1995 was er in Peru een uitbraak met minstens 790 gevallen waarbij de mortaliteit 38% bedroeg. Ae. aegypti heeft de laatste jaren veel terrein herwonnen onder andere in Zuid-Amerika, met een potentiële migratie naar Noord-Amerika en nieuw geografische gebieden tot gevolg (Solomon en Mallewa, 2001; overzichtsartikel door Barrett en Monath, 2003; Gubler, 2004). Over het algemeen worden in Afrika meer GK-gevallen gerapporteerd dan in Zuid-Amerika. Het virus is endemisch in grote delen van West-, Centraal- en Oost-Afrika, voornamelijk gelegen tussen 15° noorderbreedte en 15° zuiderbreedte, waar het regenwoud of de vochtige savanne gelokaliseerd zijn. Hoewel er al in de vijftiende eeuw GK-epidemieën beschreven waren, zijn deze uit de 20ste eeuw van groot belang in de epidemiologie van GKV. De epidemie van 1927-1928 in West-Afrika was een grote mijlpaal. Toen werden de Asibi en de Franse viscerotrope stam van het virus voor het eerst geïsoleerd. Deze stammen vormden de basis voor de ontwikkeling van de levende geattenueerde vaccins, namelijk respectievelijk 17D en het Franse neurotrope vaccin. Vaccinatie samen met vectorcontroleprogramma’s resulteerden in een enorme reductie van het aantal GK-gevallen tot enkele sporadische gevallen. In de beginjaren van 1960 waren vaccinatieprogramma’s echter beperkt omdat de indruk rees dat GK onder controle was en er meer aandacht ging naar veiligheidsproblemen van vaccins. De nevenwerking van het Franse neurotrope vaccin, met name post-vaccinatie Literatuurstudie
4
encefalitis, was beschreven maar werd aanvankelijk genegeerd omwille van de dringende noodzaak om de populatie tegen GK te beschermen. Het verlaagde vaccingebruik in het Franstalige West-Afrika bracht een heropflakkering van GK met zich mee. In het Engelstalige West-Afrika daarentegen was het Franse neurotrope vaccin omwille van veiligheidsredenen nooit geaccepteerd en was het GK 17D-vaccin niet algemeen beschikbaar. Het gevolg was dat de populatie in de loop der jaren talrijke GK-uitbraken moest doorstaan. Centraal- en OostAfrika kenden in het algemeen minder GK-epidemieën dan West-Afrika (overzichtsartikel door Monath, 2001; overzichtsartikel door Barrett en Monath, 2003).
2.2.1.2.
Vectorcontrole en Virusbestrijding
Muggen zijn gevoelig aan weerextremiteiten. Daarom is het ook niet verrassend dat arbovirale infecties doorheen heel het jaar in de tropen en subtropen voorkomen maar alleen in de zomer in gematigde klimaten worden waargenomen (Wagner en Hewlett, 2004). Er zijn drie transmissiecycli voor GKV gekend: de jungle (sylvatische), savanne (intermediaire) en stedelijke (urbane) cyclus. Elke cyclus komt in een bepaalde ecologische niche voor en vereist welbepaalde species van muggenvectoren. In Afrika komen de drie transmissiecycli voor, in Zuid-Amerika is de intermediaire cyclus niet aanwezig. In de jungle wordt de transmissiecyclus van GKV onderhouden door transmissie tussen apen. Aedes albopictus speelt een belangrijke rol bij het onderhouden van deze sylvatische cyclus en transmissie naar de mens omdat deze mug geen voorkeur vertoont voor een welbepaalde voedselbron. (WHO, 1997; overzichtsartikel door Mackenzie et al., 2004). Mensen die zich in de jungle begeven en toevallig door deze mug geïnfecteerd raken, ontwikkelen ‘jungle yellow fever’. De vochtige savanne schept de meest ideale condities voor virustransmissie door het frequent en gelijktijdig aanwezig zijn van zowel de natuurlijke gastheer, de vector, als de mens. Deze intermediaire cyclus verbindt dan ook de sylvatische met de urbane: geïnfecteerde personen brengen het virus in een stedelijke context, waar het virus door Aedes aegypti van mens tot mens wordt overgebracht. Aedes aegypti is een kleine, zwart-witte mug, die zich sterk heeft aangepast aan de mens als voedselbron en die zeer vlug gestoord is tijdens het voeden. Tijdens één maaltijd kan dezelfde mug dus meerdere personen, meestal van hetzelfde gezin, infecteren (dit gebeurt tijdens de speekselinjectie, dus zelfs zonder effectief bloed te zuigen) (overzichtsartikel door Mackenzie et al., 2004; Gubler, 2006). Hiermee is dan ook de basis voor grote stedelijke epidemieën gelegd. In dit geval spreekt men over ‘urban yellow
Literatuurstudie
5
fever’ (overzichtsartikel door Mutebi en Barrett, 2002; overzichtsartikel door Barrett en Monath, 2003). Aedes aegypti legt zijn eieren bij voorkeur in artificiële containers met stilstaand water die (talrijk) voorkomen in en rond huizen in de tropen. Daar mensen zich zelden bewust zijn van de aanwezigheid van de vector en ook moeilijk de link leggen tussen vector en ziekte, wordt de vectorcontrole sterk bemoeilijkt. Luchtsprays
met
insecticide
om
volwassen muggen te bestrijden
zijn
gewoonlijk inefficiënt, tenzij ze binnenshuis worden aangewend. De meest efficiënte manier is het elimineren van potentiële
Figuur 2-2 – Geografische verspreiding van Aedes aegypti in Amerika in 1930, 1970 en 2006 (in het grijs aangeduid). In 1946 werd een vectorcontroleprogramma opgestart, dat in 1970 werd stopgezet wegens schijnbaar succes. Anno 2006 heeft de mug terrein herwonnen en zich naar nieuwe regio’s verspreid (Gubler, 2006).
broeihaarden, namelijk waterhoudende containers (Gubler, 2006). Bestrijding van wilde muggen in bosrijke gebieden om de sylvatische cyclus te doorbreken, is onpraktisch en zeer kostelijk (WHO, 2001). Controleprogramma’s in landen die toch een inspanning leveren, zijn gedoemd te falen indien de naburige landen niks ondernemen. Tussen 1946 en 1970 werd in Centraal- en ZuidAmerika op zeer grote schaal een vectorcontrole en -bestrijdingsprogramma georganiseerd door de ‘Pan American Health Organization’. Deze werd officieel stopgezet wegens het behaalde succes (overzichtsaratikel door Solomon en Mallewa, 2001; Gubler, 2006). In 1990 won Ae. aegypti hier weer terrein en in 2006 was het verspreidingsgebied zelf nog meer uitgestrekt dan vóór het eradicatieprogramma (Figuur 2-2). Momenteel wonen er in de gebieden waar Ae. aegypti muggen voorkomen 2,5 miljard mensen. Om efficiënt te zijn, vereist vectorbestrijding naast een regionale samenwerking ook aanhoudende inspanningen (Gubler, 2006).
Literatuurstudie
6
2.2.2. Pathogenese, Pathologie en Behandeling 2.2.2.1.
Pathogenese
De infectie start met lokale virusreplicatie in witte bloedcellen en lymfatische weefsels ter hoogte van de plaats waar een geïnfecteerde mug tijdens het voeden
met
geïnjecteerd.
zijn
speeksel Deze
het
virus
heeft
asymptomatische
incubatieperiode duurt 3 tot 14 dagen (gemiddeld 4 à 7 dagen). De eerste symptomen zijn meestal een acute aanval van (hoge) koorts gevolgd door een periode van 3 tot 10 dagen (gemiddeld 5 dagen)
Figuur 2-3 – Een patiënt met een symptomatische gele koorts infectie (overzichtsartikel door Monath, 2001).
waarin de patiënt een waaier van aspecifieke symptomen vertoont, zoals malaise, hoofdpijn, lage rug- en spierpijn, algemene spierpijnen (myalgia), onvermogen om de polsfrequentie te verhogen met de temperatuur (‘Faget’s signs’), rode ogen (congestie van de conjunctivae) (Figuur 2-3), misselijkheid en duizeligheid (CDC, 2002; Gubler, 2006). Tijdens deze periode circuleert het virus in het perifere bloed en kunnen niet-geïnfecteerde muggen, die zich voeden met het bloed van deze patiënt, worden geïnfecteerd (Gubler, 2006). De viremie wordt vervolgens snel onderdrukt door het ontwikkelen van een sterke immuunrespons. Voor de meeste patiënten volgt dan ook een vlug herstel (overzichtsartikel door Mutebi en Barrett, 2002). In 15 tot 25% van de gevallen ontwikkelt de infectie zich echter tot klinische GK. Deze bestaat uit twee fasen: een (korte) pseudoremissiefase (ongeveer 1 dag), waarin het lijkt alsof de infectie bedwongen is, gevolgd door de toxische fase, gekenmerkt door hoge koorts, braakneigingen, epigastrische pijn, geelzucht, afwijkende nierfunctie en hemorragische diathese (hematemesis) (Figuur 2-4). Daarnaast kunnen tijdens deze periode hevige razernij, coma, apathie, Cheyne-Stokes ademhaling, metabole acidose, hyperkalemie, hympglycemie en hypothermie worden waargenomen. De mortaliteit in deze laatste fase bedraagt 20-50%, gemiddeld 7 tot 10 dagen na het optreden van de eerste symptomen van de klinische fase. GKV-geassocieerde encefalitis, met een stijging van het albuminegehalte in het cerebrospinaal vocht en verhoogde intraventriculaire druk door cerebrale oedeemvorming, is eerder zeldzaam (overzichtsartikel door Monath, 2001). Patiënten die de infectie overleven zijn immuun voor heel hun leven (overzichtsartikel door Mutebi en Barrett, 2003).
Literatuurstudie
7
Figuur 2-4 – De pathogenese van gele koorts bestaat uit vier fasen. De ononderbroken lijn geeft een indicatie van de lichaamstemperatuur, onder de stippellijn worden de klinische symptomen alsook de fase van de infectie en de toestand van de immuunrespons weergegeven (aangepast volgens overzichtsartikel door Monath, 2001).
2.2.2.2.
Pathologie
Het ziekteverloop van gele koorts werd in detail bestudeerd bij experimenteel geïnfecteerde primaten. Reeds 24 uren na inoculatie met het virus wordt infectie van de lever waargenomen, gevolgd door detectie van het virus in de nieren, beenmerg, milt en lymfeknopen. Geïnfecteerde hepatocyten vertonen eosinofiele degeneratie met gecondenseerd nucleair chromatine, wat typisch is voor apoptosis (en dit in tegenstelling tot opzwelling en necrosis, karakteristiek voor virale hepatitis). De renale pathologie wordt gekenmerkt door eosinofiele degeneratie en veranderingen in het tubulaire epitheel, niet door ontstekingen. Oligurie wordt veroorzaakt door nierfalen en gaat gepaard met hypotensie, tubulaire necrose en albuminurie. Daarnaast wordt necrose van de germinale centra van de milt, de lymfeknopen, de amandelklieren en de Peyerse platen waargenomen. De ernstige symptomen, zoals hemorragie en shock, worden pas waargenomen nadat de viremische fase is verlopen. Hoewel het exacte mechanisme nog steeds niet is gekend, wordt Literatuurstudie
8
verondersteld dat Kupffercellen en macrofagen in de milt tumor necrotische factor alfa (TNFα) en andere cytokines produceren, ook wel een ‘cytokine storm’ genoemd. Deze stoffen zetten een cascade in gang met celschade, vrijzetting van vrije zuurstof-radicalen, endotheelschade en microtrombosis, uitzaaiing van intravasculaire coagulatie, weefsel anoxie, oliguria en shock tot gevolg (overzichtsartikel door Monath, 2001).
2.2.2.3.
Behandeling
Momenteel bestaat er geen enkele specifieke behandeling voor GK. In een ‘intensive care’ setting kan aan de patiënt enkel ondersteunende hulp worden geboden ter bestrijding van de symptomen en ter verhoging van het algemene comfort. Electrolytenoplossingen worden toegediend ter behandeling van dehydratatie en paracetamol wordt gegeven tegen de koorts. Aspirine dient ten stelligste te worden vermeden omwille van het anticoagulerend effect en de verhoging van het risico op het Reye’s syndroom. Een dergelijke intensieve behandeling is echter meestal niet haalbaar in derdewereldlanden, waar complicaties juist het meest frequent voorkomen (WHO, 2001; overzichtsartikel door Monath, 2001).
2.2.3. Impact 2.2.3.1.
De
Klinische Impact
‘World
Health
Organisation’
(WHO)
heeft
een
wereldwijd
netwerk
van
referentielaboratoria opgezet om op wekelijkse basis een indicatie te krijgen van de GKVactiviteit (‘Weekly Epidemiological Record’). De gerapporteerde gevallen zijn meer dan waarschijnlijk een onderschatting, met een factor 10 tot zelfs 500, van het reële aantal infecties omdat enkel laboratoriumgeconfirmeerde gevallen worden geregistreerd. De meeste GK-uitbraken
komen
voor
in
verafgelegen
gebieden,
zonder
enige
vorm
van
gezondheidsinfrastructuur, waar de ziekte dus slechts laat in de uitbraak, erna of nooit wordt geïdentificeerd. Daarnaast zijn er nog een groot aantal milde gevallen waaraan helemaal geen gevolg wordt gegeven. Globaal schat de WHO het aantal GK-gevallen jaarlijks op 200 000 met meer dan 20% sterfgevallen (overzichtsartikel door Mutebi en Barrett, 2002; overzichtsartikel door Barrett en Monath, 2001; Pugachev et al., 2005).
2.2.3.2.
Sociale en Economische Impact
Meer dan 90% van de gevallen van gele koorts doen zich voor in Afrika (Tomori, 2002; overzichtsartikel door Barrett en Monath, 2003; Pugachev et al., 2005). GK vormt daarom een Literatuurstudie
9
belangrijk struikelblok voor de ontwikkeling van dit continent. Regelmatig terugkerende uitbraken van GK en de daarmee gepaard gaande controlemaatregelen overbelasten de gezondheidsinstellingen en veroorzaken een schaarste aan hulpmiddelen, in het bijzonder van vaccins, zeker in panieksituaties. Omwille van de kostprijs van het vaccin en de vereiste van een koudeketting om vaccinatiecampagnes te kunnen uitvoeren, is algemene vaccinatie geen optie (Tomori, 2002). Jaarlijks reizen negen miljoen mensen, waarvan 3 miljoen Europeanen, naar GKVendemische regio’s. Vaccinatie van handelsreizigers en eco-toeristen wordt vaak aangeraden, maar is niet altijd verplicht. (Monath, 2001). De laatste 10 jaren zijn er minstens 10 gevallen gemeld van ernstige gele koorts infectie bij reizigers (Pugachev et al., 2005).
2.2.4. GKV 17D Vaccinstam, merknaam Stamaril van Aventis Pasteur Het gele koorts vaccin bestaat uit een levende, geattenueerde stam van het virus. Het wordt goed getolereerd, heeft een hoge effectiviteit en werd bijgevolg over meer dan 60 jaar aan ongeveer 400 miljoen mensen toegediend. Het vaccin werd ontwikkeld door seriële passage in bebroede eieren en wordt geproduceerd volgens specifieke WHO-standaarden (Pugachev et al., 2005). Momenteel wordt het vaccin geproduceerd in Frankrijk (17D, Sanofi Pasteur, Stamaril), VSA (GK-VAX), Brazilië (17DD Bio-Manguinos, Oswaldo Cruz Foundation), Senegal (Pasteur Instituut), Rusland (Instituut voor Poliomyelitis en Virale Encefalitis) en Verenigd Koninkrijk (Chiron, Arilvax) (Pugachev et al., 2005). Voldoende neutraliserende antilichamen worden in 90% van de gevaccineerden na 10 dagen en in 99% 30 dagen na toediening teruggevonden. De immuniteit is zeer duurzaam en kan tot levenslange immuniteit leiden na één enkele dosis. Het toedienen van boostervaccins wordt om de 10 jaar aanbevolen door het ‘International Health Regulations’ aan mensen die regelmatig of voor lange tijd in risicogebieden verblijven (overzichtsartikel door Monath, 2001).
Literatuurstudie
10
2.3. HET DENGUE KOORTS VIRUS Dengue is een Spaans homoniem voor het Swahileense ‘ki denga pepo’ dat een plotse krampachtige aanval beschrijft, veroorzaakt door kwade geesten. Tevens wordt aangenomen dat dengue voor het eerst beschreven staat in een Chinese medische encyclopedie uit de Chin -dynastie (264-420 AD). De Chinezen noemden dengue een ‘watervergif’ en wisten dit reeds te associëren met vliegende insecten (overzichtsartikel door Thomas et al., 2003; Gubler, 2006; Ooi et al., 2006).
2.3.1. Epidemiologie 2.3.1.1.
Epidemiologie: gisteren, vandaag en morgen
De eerste beschrijvingen van grote epidemieën, die vermoedelijk door het dengue koorts virus werden veroorzaakt, zijn teruggevonden in geschriften van David Bylon die dateren uit de jaren 1779-1780. Er werd melding gemaakt van deze infectie op drie continenten: Azië, Afrika en Noord-Amerika. Tevens wordt aangenomen dat een op dengue koorts lijkend ziektebeeld voor het eerst werd beschreven in een de Chin-dynastie (264-420 AD) (overzichtsartikel door Solomon en Mallewa, 2001; overzichtsartikel door Thomas et al., 2003). Een ziektebeeld dat overeenstemt met dengue hemorragische koorts (DHK) werd slechts sporadisch gemeld en was meestal geassocieerd met deze grote epidemieën. Omwille van de relatieve zeldzaamheid van dit ziektebeeld werd dit afgedaan als eenmalig en als een onbelangrijk gezondheidsprobleem (Gubler, 2006). Het gelijktijdige voorkomen van uitbraken op drie verschillende continenten toont aan dat dengue en zijn muggenvector al meer dan 200 jaar wereldwijd voorkomen in tropische gebieden. Aanvankelijk waren er lange intervallen (10-40 jaar) tussen de grote epidemieën omdat elk van de verschillende DENVserotypes slechts endemisch was in een welbepaalde, geografisch goed afgelijnde locatie. Introductie van een nieuw serotype in een ander geografisch gebied met een gevoelige populatie werd bijvoorbeeld mogelijk door de slavenhandeltransporten tussen de verschillende continenten (CDC, 2005). Een eerste dengue virus pandemie brak uit in Zuidoost-Azië tijdens de Tweede Wereldoorlog. Dengue koorts (DK) was een belangrijke oorzaak van morbiditeit onder de Geallieerden en Japanse soldaten in Azië en aan de Stille Zuidzee. Snelle urbanisatie, grote mensenstromen binnen en tussen landen en een povere controle van de muggenvector leidden tot verhoogde transmissie en uiteindelijk tot hyperendemiciteit (dit is het voorkomen van meerdere DENV Literatuurstudie
11
serotypes in éénzelfde vectorpopulatie). De eerste grote epidemie waarbij DHK en dengue shock syndroom (DSS) zeer frequent werden waargenomen, was rond 1950 in Zuidoost Azië (de Filippijnen en Thailand). Vóór 1970 waren er maar negen landen met DHK. Vanaf 1980 is DENV-transmissie sterk toegenomen en is epidemische DHK frequenter de oorzaak van hospitalisatie en sterfte bij kinderen (Gubler, 2006). In Amerika kenden landen, die voor 35130 jaar vrij waren van DK, grote epidemieën, zoals de Cubaanse DHK-uitbraak in 1981 met 344 000 gevallen van dengue (10 300 hospitalisaties en 158 doden) (overzichtsartikel door Thomas et al., 2003). Vervolgens werden meer dan 10 landen op het Amerikaanse continent hyperendemisch. Van 1981 tot 2006 hebben reeds 28 Amerikaanse landen DHK-gevallen, bevestigd door labo’s, gemeld. In Afrika was er echter weinig kennis over de verspreiding van DENV vóór 1980. Opvallend is dat in de laatste 25 jaar een sterkte toename van DK waargenomen wordt en er steeds meer grote epidemieën van DHK, veroorzaakt door alle vier serotypes, gemeld worden in zowel Oost- als West-Afrika. Het wereldwijd voorkomen van DENV kent de laatste decennia een opmerkelijke groeischeut: in de laatste 50 jaar is de incidentie met factor 30 toegenomen. Tijdens de pandemie in 1998 werden er 1,2 miljoen gevallen van DK/DHK gemeld in 56 landen wereldwijd. Dit was een nog nooit eerder geziene incidentie. In 2001 meldde Amerika alleen al meer dan 652 212 gevallen van dengue, waarvan 15 500 DHK. Dit is ongeveer het dubbele van het aantal gevallen gerapporteerd voor dezelfde regio in 1995. Momenteel is DENV endemisch in meer dan 100 landen in Afrika,
Figuur 2-5 – Regio’s waar het dengue virus met zijn vector endemisch is, worden in het rood weergegeven. In het oranje worden landen gevisualiseerd waar Aedes aegypti zich bevinden, waar er momenteel ongeveer 2,5 biljoen mensen leven en waar er dus een groot risico op dengue introductie is (overzichtsartikel door Mackenzie et al., 2004).
Literatuurstudie
12
Amerika, Zuidoost-Azië, ten oosten van de Middellandse Zee en ten westen van de Stille Zuidzee (Figuur 2-5) (WHO, 2001; CDC, 2005; Gubler, 2006). In de hele tropische wereld is DHK de laatste decennia hyperendemisch geworden, vooral in Azië (Figuur 2-6), waardoor er frequentere en intensere DENV-epidemieën zijn en er meer kans op DHK en DSS is (overzichtsartikel door Mackenzie et al., 2004, Pugach et al., 2005). De grootste uitdaging voor nationale en internationale gezondheidsorganisaties ligt momenteel in het afremmen (en omkeren) van de stijgende tendens van de epidemische dengue-activiteit en de frequentere incidentie van DHK. Epidemische DK/DHK wordt dan ook als één van de belangrijkste infectieziekten in de 21e eeuw beschouwd (WHO, 2001).
Figuur 2-6 – Verandering in geografische distributie van dengue virus serotypes in de laatste 30 jaren: 1970 en 2006. Demografische en sociale veranderingen in de laatste decennia, gebrek aan effectieve muggenvectorcontrole in dengue endemische regio’s, globalisering en verhoogde transportfrequentie van mens en dier leiden tot epidemiologische veranderingen. Dit resulteert in verhoogde epidemische activiteit, ontwikkeling van hyperendemiciteit en de wederopkomst van epidemische dengue hemorrhagische koorts (aangepast volgens Overzichtsartikel door Mackenzie et al., 2004 gebaseerd op Gubler, 2006).
2.3.1.2.
Vectorcontrole en Virusbestrijding
Voor het dengue virus is de transmissiecyclus veel eenvoudiger dan voor het gele koorts virus: het virus circuleert voornamelijk in de urbane cyclus (mens-mug transmissie en vice versa). Naast Aedes aegypti als voornaamste vector, worden DENV-uitbraken ook veroorzaakt en onderhouden door Ae. albopictus, Ae. polynesiensis en verschillende species van het Ae. scutellaris complex (overzichtsartikel door Mackenzie et al., 2004). Momenteel zijn de enige methodes om dengue transmissie tegen te gaan reductie van het mens-vectorcontact en de controle van de muggenpopulatie. Daar GKV en DENV door eenzelfde vector kunnen worden overgebracht, kunnen beide virussen gelijktijdig bestreden worden. Weerom is het belangrijk een regionale samenwerking en aanhoudende inspanningen voor muggencontrole niet te onderschatten. De pandemie in 1981 in Cuba illustreert dit. In Literatuurstudie
13
deze periode werd gebruik gemaakt van intensieve insecticidenbehandeling gepaard gaande met reductie van beschikbare larvale habitats. Geen enkel van deze twee programma’s werd echter volgehouden zodat er geen langetermijneffect werd bekomen (Ooi et al., 2006). Ook voor dengue werd een globaal systeem voor gestandaardiseerde epidemiologische en virologische surveillance geïmplementeerd, namelijk DengueNet. Deze continu bijgewerkte database is van onschatbare waarde voor tijdelijke controlemaatregelen en epidemiologisch onderzoek (Anonymous, 2004).
2.3.2. Pathogenese, Pathologie en Behandeling 2.3.2.1.
Pathogenese
Dengue bestaat uit vier antigenisch sterk verwante serotypes: DENV-1, DENV-2, DENV-3 en DENV-4. Ze vertonen 60-80% homologie maar bezitten subtiele verschillen in de oppervlakteproteïnen. Hoewel er in serologische testen kruisreactiviteit is tussen deze virussen, treedt er echter geen kruisimmuniteit op. Infectie met één van de vier DENVserotypes biedt levenslange immuniteit voor dat serotype, niet voor de drie overige. Een persoon in een hyperendemisch gebied kan dus gedurende zijn leven vier DENV-infecties oplopen: één van elk serotype. Tevens suggereren epidemiologische observaties dat primaire infecties het risico verhogen op de ontwikkeling van DHK en DSS bij een volgende infecties (Ooi et al., 2006). DENV-infectie kan zich op verschillende manieren manifesteren (in volgorde van de ernst van de symptomen): subklinische infecties, ongedifferentieerde milde koortssyndromen, de klassieke dengue koorts en de soms fatale hemorrhagische koorts en dengue shock syndroom (overzichtsartikel door Mackenzie et al., 2004). De meeste infecties, vooral bij kinderen onder de 15 jaar, zijn asymptomatisch of paucisymptomatisch (overzichtsartikel door Thomas et al., 2003). Oudere kinderen en volwassenen daarentegen ontwikkelen vaak een mild koortssyndroom of een zelflimiterende maar invaliderende ziekte, dengue koorts genoemd. DK wordt gekarakteriseerd door koorts (2-7 dagen), myalgia, frontale hoofdpijn, retroorbitale pijn, huiduitslag, spier- en gewrichtspijn, misselijkheid, braakneigingen, anorexia, malaise, veranderde smaak- en reukperceptie. DK duurt enkele weken maar kan verlengd worden door vermoeidheid (asthenie) (overzichtsartikel door Thomas et al., 2003; overzichtsartikel door Mackenzie et al., 2004). Fysisch onderzoek kan paradoxale bradycardie, lymfadenopathie, conjunctivale injectie, ontstoken pharynx, vroeg- of laattijdige huiduitslag en ‘flushing’ in het gelaat aantonen. Het snel ontwikkelen van blauwe plekken, Literatuurstudie
14
een positieve tourniquettest (Figuur 2-7) (hierbij ontstaan 20 of meer petechiae per 2,5 cm² huid op de onderarm na het opblazen en 5 minuten opgeblazen houden van een bloeddrukmanchette
tot
halfweg
de
systolische
en
diastolische druk (Solomon, 2001)) en het voorkomen van petechiën samen met hemorragie, zijn suggestief voor een dengue infectie. De aanwezigheid van hepatomegalie ondersteunt de diagnose (overzichtsartikel door Thomas et
Figuur 2-7 – Foto van een positieve tourniquet test bij een patiënt met dengue virus infection (CDC, 2002)
al., 2003). Na het acute koorts stadium (eerste 3-5 dagen) kunnen de symptomen verergeren met de ontwikkeling van vasculaire lekkage, met of zonder significante hemorragie (DHK). Dit kan uiteindelijk resulteren in shock (DSS), met een hoge mortaliteit (overzichtsartikel door Thomas et al., 2003). Ondanks zijn naam is het belangrijke pathofysiologische proces in DHK een verhoogde vasculaire permeabiliteit die leidt tot plasmalekkage naar de omliggende weefsels. De patiënten zijn vaak rusteloos of lethargisch, koud, zweterig en klam. Ze vertonen milde hepatomegalie of abdominale pijnen. Een laterale thorax radiografie vertoont vaak een pleurale effusie. Echografisch kunnen daarnaast ook pericardiale effusies, ascites en galblaaswandverdikking worden aangetoond (overzichtsartikel door Solomon en Mallewa, 2001). Voortekens voor dreigende shock zijn intense aanhoudende abdominale pijn, voortdurende braakneigingen, rusteloosheid of juist lethargie, een plotse omwisseling van koorts naar hypothermie met transpiratie en prostratie, koude extremiteiten, een snelle maar zwakke pols en hypotensie. Een vermindering in bloedplaatjes met een gelijktijdige stijging van hematocrietwaarde is kenmerkend voor de progressie van DHK. Serumproteïnen en albuminen zijn laag in sommige DHK-patiënten. Ascites en rechtsgelegen pleurale effusies komen bijna in alle shockgevallen voor. Petechiae, het snel ontwikkelen van blauwe plekken, bloedingen op de plaats van venapuncties, en ‘purpura/ecchymosen’ manifesteren zich gewoonlijk bij hemorragie. Gastrointestinale hemorragie komt eveneens voor en kan fataal zijn. Het ziektespectrum van DHK is opgedeeld in vier graden (I tot IV), gebaseerd op de graad van de ernst van de infectie en het voorkomen van hemorragie en/of shock, waarbij graden III en IV als DSS omschreven worden (WHO, 1997; overzichtsartikel door Thomas et al., 2003).
Literatuurstudie
15
Atypische manifestaties van DENV infectie zijn fulminante hepatitis, cardiomyopathie, acute renale schade, orchitis, ovaritis, keratitis, retinitis, akoestische storingen en encefalopathie. Dit laatste uit zich in een veranderd bewustzijn, slappe verlamming, cerebraal oedeem en convulsies (Overzichtsartikel door Thomas et al., 2003).
2.3.2.2.
Pathologie
DHK en DSS worden niet zozeer veroorzaakt door rechtstreekse virusschade maar eerder door een serieuze ontsporing van het immuunsysteem. Een belangrijke theorie hieromtrent is de ‘antibody-dependent enhancement’ theorie (ADE) van Scott Halstead. Slechts 10% van de DHK-gevallen is te wijten aan een primaire infectie, terwijl 90% geassocieerd is met een secundaire heterologe DENV infectie. Na een eerste infectie met één van de vier DENVserotypes ontstaat een kruisreactieve protectieve immuniteit die echter na zes maanden afneemt. Op dat ogenblik is de gastheer gevoeliger voor de resterende drie heterologe serotypes. Volgens de ADE-theorie helpen de kruisreactieve niet-neutraliserende antilichamen geïnduceerd door het primair infecterende serotype het virus van één van de drie andere serotypes om aan Fc-receptoren van doelwitcellen te binden en zo binnen te dringen. De belangrijkste doelwitten voor het virus zijn monocyten en macrofagen, lymfocyten en Kupffercellen in de lever. In vergelijking met een primaire infectie wordt tijdens een secundaire infectie sneller en zeer selectief een groter aantal cellen geïnfecteerd. Het exacte mechanisme van ADE en de link met een verhoogde kans op DHK is nog steeds niet ontrafeld (Green et al., 2006). De aanwezigheid van circulerende antilichamen, of deze nu werden geïnduceerd door een primaire infectie met om het even welk serotype of door passieve immunisatie, verhoogt dus het risico op DHK aanzienlijk (overzichtsartikel door Solomon en Mallewa, 2001). Dit is ook het kernprobleem bij de ontwikkeling van een dengue virus vaccin: het vaccin moet in één keer even goed beschermen tegen alle vier serotypes, anders heeft vaccineren, vooral in een hyperendemische regio, geen enkele zin (overzichtsartikel door Mackenzie et al., 2004).
2.3.2.3.
Behandeling
De meeste DK-gevallen zijn zelflimiterend; hospitalisatie is niet noodzakelijk. Patiënten worden aangemoedigd om veel te drinken en paracetamol wordt gegeven om de symptomen te verlichten. Hoewel de koorts na enkele dagen zakt, ondervinden vele patiënten aanslepende lethargie en depressie (overzichtsartikel door Solomon en Mallewa, 2001). Met de passende Literatuurstudie
16
intensieve, ondersteunende zorgen (zoals bij de behandeling van GK) zou de mortaliteit tot minder dan 1% kunnen worden gereduceerd (CDC, 2005). Behandeling van DHK is een combinatie van een snelle en juiste diagnose, een regelmatige opvolging van intra- en extravasculaire volumestatus en het inzetten van alle mogelijke klinische zorgen om hemorragische en hemodynamische complicaties te bestrijden. Vloeistoftoediening om plasmalekkage te compenseren is de voornaamste behandeling. Vroege en adequate opvang van plasmaverliezen resulteren meestal in meer gunstige overlevingskansen (overzichtsartikel door Thomas et al., 2003).
2.3.3. Impact 2.3.3.1.
Sociale Impact
Op sociaal vlak leiden de gevolgen van DK/DHK tot ontwrichting van het familieleven (een mug infecteert vaak meerdere leden van hetzelfde gezin), school- of werkverlet en in het algemeen een reductie van de levenskwaliteit en -verwachting (CDC, 2002; WHO, 2005). Bij grote uitbraken ontstaat er vaak chaos en verwarring onder de bevolking. De overheid wil verantwoordelijkheidsbewust overkomen en treft zichtbare maatregelen die echter geen resultaten opleveren, zoals het gebruik van ultraverdunde en kostelijke insecticiden, de zogenaamde ‘space sprays’. De onwetende bevolking voelt zich veilig en gerustgesteld en noch de bevolking noch de overheid ondernemen verdere maatregelen om de muggenvector uit te roeien. Hierdoor leeft men van de ene epidemie naar de andere met het misleidende geloof dat DK/DHK onder controle is. De meeste landen endemisch voor dengue virus hebben een povere surveillance en ondermaats klinisch management voor DK/DHK, met overbelasting van de gezondheidsinstellingen en subgestandaardiseerde zorgen voor de denguepatiënten met levensbedreigende DHK of DSS tot gevolg (Gubler 2002).
2.3.3.2.
Economische Impact
Het is moeilijk om de totale economische impact van DK/DHK op een gemeenschap in te schatten. De meeste studies baseren zich op één enkele epidemie. Het is tevens moeilijk om dit uit te drukken in USA-dollar omdat DK een relatief trage ‘case fatality rate’ heeft. De epidemie van 1977 in Puerto Rico werd geschat tussen 6-16 miljoen USA-dollar aan medische kosten en controlemaatregelen. De epidemie van 1994 verteerde 12 miljoen USAdollar en dit enkel voor medische kosten. In de laatste tien jaar liepen de kosten voor Puerto Rico op tot ongeveer 250 miljoen USA-dollar (CDC, 2003). De epidemie van 1981 in Cuba Literatuurstudie
17
had een impact van ongeveer 103 miljoen USA-dollar, waarvan bijna de helft aan muggencontrole werd besteed. In Thailand worden de jaarlijkse uitgaven voor DHK geschat tussen 31,5 en 51,5 miljoen USA-dollar, afhankelijk van de epidemische activiteit. Maar ongeveer 45% van deze kosten wordt betaald door de patiënten en hun familie. Deze financiële last op de bevolking draagt in sterke mate bij tot de sociale impact van DK/DHK (Gubler, 2002). Deze schattingen zijn sterke onderschattingen van de werkelijke totale economische impact van dengue omdat ze de onrechtstreekse kosten op de economie in de interepidemische periodes volledig negeren wegens de povere surveillance. Deze kosten doen zich voor als werkloosheid, productiedaling, schoolverzuim, verlies in de toeristische sector en sociale verstoring (WHO, 2005). DK/DHK heeft een totale impact in dezelfde grootteorde als andere belangrijke ziektes zoals malaria, tuberculose, hepatitis, bacteriële meningitis en dergelijke. Deze ziektes krijgen, in tegenstelling tot dengue, veel aandacht en financiële steun van internationale fondsen. In bijvoorbeeld 1998 werd ruim 84 miljoen USA-dollar aan alleen malaria besteed, amper 5 miljoen USA-dollar werd geïnvesteerd in de bestrijding van DK/DHK. Momenteel bestaat deze kloof nog altijd en wordt deze ongelijkheid jammer genoeg steeds groter (Gubler, 2002).
2.3.4. DENV Serotype 2 New Guinea Stam, Gift Vincent Deubel De eerste dengue virussen werden geïsoleerd tijdens de Tweede Wereldoorlog. Sommige stammen, geïsoleerd uit patiëntenstalen afkomstig uit drie geografisch verschillende locaties (Hawaï, New-Guinea en Indië) waren antigenisch verwant. Deze viruslijnen worden ingedeeld volgens antigenisch te onderscheiden groepen: DENV-1 met de Hawaï-stam (HawDENV-1) als prototype, DENV-2 met de New Guinea-stam (NGC-DENV-2) als prototype, DENV-3 en DENV-4. De twee laatste serotypes werden op een later tijdstip dan serotypes 1 en 2 geïsoleerd uit het bloed van patiënten met DHK tijdens een epidemie in Manilla in 1956. Sindsdien zijn er duizenden isolaten van DENV van over heel de wereld bekend, die allemaal in deze classificatie van vier serotypes passen (Gubler, 2006).
Literatuurstudie
18
2.4. DE MOLECULAIRE BIOLOGIE VAN FLAVIVIRUSSEN 2.4.1. Morfologie Een matuur flavivirus virion bestaat uit twee lagen en heeft een diameter van ongeveer 50nm (Patkar en Kuhn, 2006) (Figuur 2-8). De binnenste schil of nucleocapside, die het enkelstrengig virale RNA genoom van positieve polariteit omgeeft, is opgebouwd uit capside (C) proteïnen en heeft een eicosahedrale structuur (~30 nm diameter). De buitenste schil of enveloppe is een dubbellipidenlaag, afkomstig van het intracellulaire membraan van het endoplasmatisch reticulum (ER) van de gastheercel en bevat twee structurele virale proteïnen: de enveloppeproteïne (E, 180 eenheden)
en
de
membraanproteïne (prM/M, 180 eenheden). De enveloppe is van groot belang om het viraal RNA genoom te beschermen omdat de nucleocapside permeabel is voor RNasen. Tussen de enveloppe en het nucleocapside kan met electronenmicroscopie
een
ruimte van ongeveer 30 Å worden
onderscheiden,
die
Figuur 2-8 – Ingekleurde transmissie electronenmicrografische foto van het dengue virus. Het nucleocapside is in het oranje afgebeeld, het enveloppe proteïne in het rood en de tussenliggende ruimte in het blauw (Rigau-Pérez, 2006)
slechts door weinig of geen connecties wordt overbrugd (Figuur 2-8) (overzichtsartikel door Henchal & Putnak, 1990; overzichtsartikel door Mukhopadhyay et al., 2005; Patkar en Kuhn., 2006).
2.4.2. Structuur van het Flavivirus Genoom De virale proteïnen worden gecodeerd in een enkelstrengig RNA genoom van positieve polariteit. Het genoom is gemiddeld 10 000 tot 12 000 nucleotiden lang. Het 5’-uiteinde is voorzien van een type I CAP structuur (m7GpppNmpN), het 3’-uiteinde bevat géén poly-A staart (Figuur 2-9) (overzichtsartikel door Mukhopadhyay et al., 2005; Harris et al., 2006). Aan beide uiteinde van het RNA bevindt zich een onvertaalde, niet-coderende regio (UTR): respectievelijk de 5’-UTR en de 3’-UTR. Deze regio’s zijn in staat om met elkaar te interageren ter vorming van een complexe tertiaire structuur waarvan wordt verondersteld dat deze, als plaats voor interactie met cellulaire en virale factoren, een belangrijke functie Literatuurstudie
19
uitoefent tijdens de translatie en replicatie van het virale RNA (Lindenbach en Rice, 2001; Harris et al., 2006). Alle virale proteïnen worden gecodeerd onder de vorm van een polyproteïne in één open leesraam. Dit polyproteïne wordt co- en posttranslationeel opgesplitst tot drie structurele proteïnen (C, prM/M en E) en zeven niet-structurele (NS) proteïnen (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5), en dit zowel door virale als gastheer proteasen (overzichtsartikel door Mukhopadhyay et al., 2005).
Figuur 2-9 – Een schematisch diagramma van het flavivirus genoom. De amino-terminus van de polyproteïne codeert voor drie structurele proteïnen (C = capside, M = membraan welke als prM gesynthetiseerd wordt en vervolgens gesplitst tot M, en E = enveloppe proteïne). Het (overgrote) C-terminale gedeelte van de polyproteïne codeert voor de nietstructurele proteïnen die essentieel zijn voor de virale replicatie. Het 5’-uiteinde heeft een CAP structuur, het 3’-uiteinde géén poly-A staart. De complexe secundaire structuur van de 5’- en 3’-onvertaalde gebieden (UTR) met 3’-stamlus (SL), en de ‘capsid coding region hairpin (cHP)’, vervullen een essentiële functie tijdens de translatie en replicatie van het virale genoom (Harris et al., 2006).
2.4.3. De Structurele Proteïnen 2.4.3.1.
De Capsideproteïne (C)
De monomeer capsideproteïne bestaat uit vier helices (α1-α4) die via korte loops met elkaar verbonden zijn. De C-proteïne vormt dimeren die op hun beurt als bouwsteen voor het nucleocapside dienen. Het nucleocapside is opgebouwd uit 180 capsideproteïnen.
2.4.3.2.
De Membraanproteïne (prM/M)
De membraanproteïne komt onder twee vormen voor. De pre-membraan proteïne (prM) wordt teruggevonden in immature virions en speelt waarschijnlijk een belangrijke rol als chaperone bij het correct vouwen van de E-proteïne. Deze virions zijn voornamelijk intracellulair terug te vinden en zijn niet infectieus. Door de proteolytische activiteit van de furine protease wordt het reeds geglycosyleerde prM gesplitst tot de mature M-proteïne, wat resulteert in de vorming van infectieuze virions tijdens de laatste fase van de virussecretie. Deze proteolytische splitsing is cruciaal en induceert een aanzienlijke reorganisatie van de structuur van het virusoppervlak (cf infra). Deze rijpingsstap treedt enkel op indien het virus aan lage Literatuurstudie
20
pH-condities wordt onderworpen. Dat wijst op de noodzakelijkheid van een conformationele verandering in prM om furine splitingsplaatsen bloot te leggen. Indien de splitsing van prM tot M wordt verhinderd, worden niet-infectieuze, immature viruspartikels vrijgezet (Henchal & Putnak, 1990; Overzichtsartikel door Mukhopadhyay et al., 2005; Pathkar & Kuhn, 2006).
2.4.3.3.
De Enveloppeproteïne (E)
De C-terminus van de E-proteïne bevat twee geconserveerde helices waarmee het in een membraan kan worden verankerd (Figuur 2-10). De rest (het N-terminale gedeelte) van de proteïne vormt een driedimensionale structuur die uitsteekt in het lumen van het ER (ectodomein). In deze structuur kunnen drie domeinen worden onderscheiden, waaraan
Figuur 2-10 – Membraantopologie van de structurele proteïnen van flavivirussen. De oriëntatie van de structurele proteïnen, zoals ze zich bevinden in de polyproteïne, wordt ten opzichte van de membraan van het endoplasmatisch reticulum (ER) weergegeven. Transmembranaire helices zijn als cilinders voorgesteld. De pijlen duiden de posities aan van posttranslationele knipplaatsen. De hiervoor verantwoordelijke enzymes zijn door verschillende kleuren in de legende aangegeven. Capsid proteïne (rood), prM = precursor van membraanproteïne (blauw), E = enveloppeproteïne (groen), NSI = niet-structurele proteïne 1 (oranje) (overzichtsartikel door Mukhopadhyay et al., 2005).
specifieke functies worden toegekend. Domein II is een zeer uitgestrekt domein en bevat het dimerisatiedomein en meer distaal het fusiepeptide. Domein III is een immunoglobulineachtig domein waarvan wordt vermoed dat het de receptorbindingsplaatsen bevat. Domein I omvat de N-terminus van de proteïne en wordt geflankeerd door domein II en domein III. Structureel zijn domeinen I en II met elkaar verbonden via vier polypeptideketens, tussen domein I en III bevindt zich één enkele polypeptidebrug.
Literatuurstudie
21
Zoals eerder aangegeven, maken M en E samen deel uit van het virusoppervlak en heeft virusrijping een aanzienlijke wijziging van de oppervlaktestructuur tot gevolg. Een immatuur virion is aanzienlijk groter (~60nm in diameter) en vertoont opvallende uitsteeksels aan het enveloppeoppervlak zoals in Figuur 2-11 weergegeven. Deze uitsteeksels zijn opgebouwd uit een trimeer van prM-E-heterodimeren. In deze structuur bedekken de drie prM-proteïnen het fusiepeptide van de drie overige E-proteïnen ter preventie van vroegtijdige fusie. Splitsing van prM tot M tijdens de laatste maturatiestappen in het Golgi-apparaat leidt tot een herschikking van de E-proteïnen in de prM-E-heterodimeren: de E-proteïnen reorganiseren zich tot Ehomodimeren, die zich nagenoeg evenwijdig met het virion oppervlak oriënteren. Dit leidt tot het ontstaan van een glad virion oppervlak (en een viruspartikel met een kleinere diameter). Domein III van de E-proteïne, dat de receptorbindingssite bevat, steekt hierbij lichtjes uit zodat binding aan cellulaire receptoren wordt vergemakkelijkt (overzichtsartikel door Mukhopadhyay et al., 2005; Patkar en Kuhn, 2006).
Figuur 2-11 – Schematische voorstelling van de structurele organisatie van een flavivirus partikel. Het virale RNAgenoom (niet weergegeven) is omgeven door een nucleocapside, dat op zijn beurt omgeven is door een dubbellipide membraan dat enveloppeproteïnen (E), en prM (precursor van de membraanproteïne bij onrijpe partikels) of de membraanproteïne (M bij mature virions) bevat. A = immature virions zijn gekarakteriseerd door de aanwezigheid van trimeren van prM-E-homodimeren, waarvan de fusiepeptiden niet toegankelijk zijn, wat vroegtijdige fusie belet. Die trimeren vormen uitsteeksels ten opzichte van het virionoppervlak. B = matuur virion met E-homodimeren, die evenwijdig met het oppervlak liggen, gevormd als gevolg van splitising van prM tot M. In een E-monomeer zijn domeinen I, II, III respectievelijk rood, geel en blauw gekleurd en het fusiepeptide in het groen (aangepast volgens Stiasny et al., 2006). C = oppervlak beschaduwde cryo-elektronenmicroscopische constructie van een immatuur dengue-2 virion bij 14 Å resolutie. D = oppervlak beschaduwde cryo-elektronenmicroscopische constructie van een matuur dengue-2 virion bij 14 Å resolutie (aangepast volgens Patkar en Kuhn, 2006).
Literatuurstudie
22
2.4.4. Niet-Structurele Proteïnen De niet-structurele proteïnen zijn betrokken bij de replicatie van het virus en zijn, in volgorde van voorkomen in de polyproteïne, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B en NS5.
2.4.4.1.
NS1: intra-, extracellulaire en membraangebonden vorm
NS1 is een sterk geconserveerde glycoproteïne van 48 kDa (Chung et al., 2006) die essentieel is voor de viabiliteit van een flavivirus (Alcon-LePoder et al., 2006). NS1 wordt initieel in het lumen van het endoplasmatisch reticulum geïnsereerd via een signaalpeptide dat vervolgens wordt afgesplitst door het cellulaire signalase ter vorming van de mature NS1-proteïne (Chung et al., 2006). In geïnfecteerde cellen fungeert NS1 als co-factor bij de virale RNA replicatie: het NS1 komt voor in associatie met dubbelstrengig RNA/replicatief intermediair RNA. De exacte functie van NS1 in het replicatiecomplex is echter nog niet achterhaald. NS1 kan als membraangebonden vorm ook naar het oppervlak van de gastheercel worden getransporteerd, waar het een nog onbekende functie uitoefent. Daarnaast kan NS1 ook als vrij proteïne worden gesecreteerd door flavivirus geïnfecteerde cellen. De functie van gesecreteerd en celgeassocieerd NS1 in de pathogenese van flavivirus infecties blijft voorlopig nog een raadsel hoewel hypotheses bestaan zoals (i) participatie in de immuuncomplexvorming en (ii) generatie van autoantilichamen die reageren met T-cellen en matrixproteïnen als complementactivatiesysteem. Hoewel NS1 geen deel uitmaak van het virion, zijn anti-NS1 antilichamen toch in staat om de infectie te onderdrukken (AlconLePoder et al., 2006; Calvert et al., 2006; Chung et al., 2006).
2.4.4.2.
Drie enzymatische activiteiten geassocieerd met NS3
Studies gebaseerd op sequentiehomologie brachten aan het licht dat NS3 (moleculair gewicht van 70 kDa) op zijn minst instaat voor drie duidelijk omschreven enzymatische functies: helicase, serine protease en 5’-RNA trifosfatase. Deze proteïne is dan ook een belangrijk potentieel doelwit voor de ontwikkeling van inhibitoren. De virale helicase activiteit is essentieel voor het ontwinden van de plus en min RNA strengen tijdens de virale replicatiecyclus. Deze functie is gelegen in het C-terminale drie vierde van de NS3-proteïne en is gekarakteriseerd door zeven geconserveerde domeinen waarbij het NTPbindingsmotief in domein I (‘A-site’) en domein II (‘B-site’) gelegen is (Gorbalenya et al, 1989a) (Figuur 2-12). Literatuurstudie
23
De NS3-protease is een serineprotease (Bazan en Fletterick, 1989; Gorbalenya et al., 1989b). Voor optimale functie vereist de NS3-serineprotease de NS2B-proteïne als cofactor. Het NS2B-NS3 protease complex is verantwoordelijk voor het verknippen van de polyproteïne op de juncties tussen NS2A/NS2B, NS2B/NS3, NS3/NS4A, NS4A/NS4B en NS4B/NS5 maar ook in de C-, NS2A-, NS4A-proteïne en in het C-terminus deel van NS3 zelf Figuur 2-12 – Kristalstuctuur van het NS3 RNA-helicase van het hepatitis C virus (Borowski et al., 2002), dat, net zoals de flavivirussen, behoort tot de familie van de Flaviviridae.
(Valle en Falgout, 1998; Niyomrattanakit et al., 2004).
Autoproteolytische splitsing van NS3 geeft aanleiding tot de vorming van de RNA trifosfataseproteïne (moleculair gewicht 50 kDa). Deze virale proteïne komt tussen in de vorming van de CAP-structuur aan de 5’-terminus van het virale RNA (Wengler en Wengler, 1993).
2.4.4.3.
NS5: methyltransferase en RNA-polymerase
Zoals weergegeven in Figuur 2-13 A codeert het N-terminale uiteinde van NS5 voor de methyltransferase activiteit, die eveneens betrokken is bij de ‘capping’ van het virale RNA. Twee
geconserveerde
domeinen
in
dit
methyltransferase
suggereren
dat
S-
adenosylmethionine (SAM) vereist is als methyldonor (Koonin, 1993). De C-terminus van NS5 omvat G-D-D-motiefsequenties die karakteristiek zijn voor het virale RNA-afhankelijke RNA polymerase (RaRp) (Bruenn, 1991). De kristalstructuur van RaRp van flavivirussen is nog steeds niet achterhaald ondanks de vele informatie afkomstig van het hepatitis C virus. Zoals de meeste andere RNA en DNA polymerasen ziet de driedimensionale structuur van het hepatitis C virus er als een rechterhand uit: het katalytische domein is in de palm gepositioneerd en de subdomeinen heten palm, vingers en duim (Bressanelli et al., 1999). Er zijn acht motieven in het polymerase domein gedetermineerd waarvan er vier voorkomen in alle klassen van RNA polymerasen en gelegen zijn in het Literatuurstudie
24
katalytische deel van de palmdomein. Ze zijn betrokken in de nucleotiden- en templaatbinding en de polymerase activiteit (Poch et al., 1989; Bruenn, 1991). Omdat het NS5, net zoals het NS3 heel duidelijk omschreven is en gekarakteriseerde
enzymatische
functies bevat, is ook deze virale proteïne een belangrijk doelwit voor de
ontwikkeling
van
antivirale
middelen. 2.4.4.4.
Overige niet-structurele
proteïnen Kennis omtrent de functie van de Figuur 2-13 – Schematische weergaven van dengue NS5: (A) domeinstructuur van het proteïne. Het N-terminale methyltransferase (MTase) domein bevat het S-adenosyl-Lmethionine(AdoMet)-bindingsmotief I (zwarte balkjes). Het C-terminale polymerase (Pol) domein met motief I tot VIII bevat de zeer sterk geconserveerde motieven A tot D (zwarte balkjes). NLS = nucleaire lokalisatie sequentie. (B) Kristalstructuur van het dengue NS5 methyltransferase in complexvorming met S-adenosyl-L-homocysteïne (AdoHcy). Het N-terminale subdomein van het enzyme is in het rood weergegeven, de C-terminus in het blauw en het kernsubdomein met de typische AdoMet-afhankelijke MTase topologie in het geel (Egloff et al., 2002).
overige proteïnen, namelijk NS2A, NS4A en NS4B, is nog steeds zeer schaars omdat deze proteïnes geen duidelijk af te lijnen katalytische motieven bevatten. Men veronderstelt dan ook dat deze proteïnen als cofactoren interageren met virale en/of cellulaire proteïnen.
2.5. REPLICATIECYCLUS VAN DE FLAVIVIRUSSEN De replicatiecyclus van de flavivirussen (Figuur 2-14) start met het binnendringen van de gastheercel via receptor-gemedieerde endocytose. De exacte receptor is momenteel nog niet gekend, hoewel er sterke indicaties bestaan dat ‘dendritic-cell-specific ICAM-grabbing nonintegrin’ (DC-SIGN), ‘glucose-regulating protein 78’ (GRP78/BiP), CD14-geassocieerde molecules, heparine en andere glycosaminoglycanen hierbij betrokken zouden zijn. Door een stijging van de intravesiculaire pH ondergaat het fusiedomein van de E-proteïne een conformatieverandering waarop de enveloppe van het virus versmelt met het membraan van de vesikel en het nucleocapside wordt vrijgezet in het cytoplasma. Na ‘uncoating’ van het virale RNA kan dit, net zoals cellulair mRNA, onmiddellijk door de ribosomen op het ER Literatuurstudie
25
worden vertaald tot een polyproteïne. De polyproteïne wordt tijdens de translatie in de membraan van het ER ingebed: de hydrofobe aminozuren die de N-terminus van prM, E, NS1 en NS4B voorafgaan, fungeren als signaalsequentie voor insertie van deze proteïnen in de ER-membraan. De polyproteïne wordt co- en posttranslationeel verknipt ter vorming van de verschillende virale proteïnen en dit zowel door virale als cellulaire proteasen (cf supra). De niet-structurele proteïnen, waaronder de NS5-proteïne, groeperen zich waarschijnlijk na associatie met nog steeds niet gekende cellulaire factoren, tot membraangeassocieerde replicatiecomplexen waarin de replicatie van het virale genoom start. Hiertoe worden antigenomen van negatieve polariteit gevormd die dienst doen als templaat voor de aanmaak van nieuwe genomen. (Henchal en Putnak, 1990; overzichtsartikel door Mukhopadhyay et al., 2005; Harris et al., 2006; Patkar en Kuhn, 2006). Terwijl de prM- en de E-proteïne waarvan het grootste gedeelte zich aan de kant van het lumen van het ER bevindt verschillende
Figuur 2-14 – Replicatiecyclus van flavivirussen. 1 = receptor-gemedieerde endocytose; 2 = lage pH-fusie in de endosomen/lysosomen en ontmanteling van het virion; 3 = CAP-gemedieerde initiatie van translatie van viraal RNA ter vorming van het virale precursor polyproteïne, co- en posttranslationele proteolytische splitsing van het polyproteïne door cellulaire en virale proteasen, en transfer naar het ER; 4 = virale replicatie met de vorming van negatieve enkelstrengige RNA templaten gebeurt in associatie met intracellulaire membranen in het cytoplasma; 5 = assemblage van het virus ter hoogte van de membraan van het endoplasmatisch reticulum (ER); 6 = transport en maturatie van het virion in het ER, Golgi-apparaat en trans-Golgi-membraancomplex; 7 = vesikelfusie en vrijzetting van het mature virion door exocytose. vRNA = viraal RNA (rood) (aangepast volgens overzichtsartikel door Mukhopadhyay et al., 2006).
Literatuurstudie
26
glycosylatiestappen ondergaan, wordt het nieuwe virale RNA in het cytoplasma ingekapseld door capsideproteïnen, die eveneens nauw geassocieerd blijven met het ER-membraan. Nieuwe, maar alsnog immature virions komen in het lumen van het ER terecht door knopvorming (‘budding’). Vervolgens ondergaan deze virions een aantal maturatiestappen (cf supra) waarna ze als infectieuze deeltjes door exocytose in het extracellulaire milieu worden vrijgezet (overzichtsartikel door Mukhopadhyay et al., 2005; Harris et al., 2006; Patkar en Kuhn, 2006).
2.6. ANTIVIRALE THERAPEUTICA 2.6.1. Inleiding Er zijn drie strategieën die kunnen worden aangewend ter bestrijding van flavivirus infecties: vectorcontrole, vaccinatie en therapie. Van vectorcontrole werd in het verleden aangetoond dat hiermee een significant effect kan worden bekomen maar dit vereist volharding en vooral een internationale (nu globale) aanpak. Vaccinatie tegen gele koorts werd mogelijk en bleek succesvol na de ontwikkeling van het GKV 17D-vaccin maar botst op tal van praktische problemen (zoals logistieke, financiële, religieuze, etc.) en komt dus eigenlijk niet de mensen ten goede die het nodig hebben. Vaccinontwikkeling in het geval van dengue koorts wordt zeer sterk bemoeilijkt omdat een zeer werkzaam tetravalent vaccin vereist is om een langdurige immuniteit tegen alle vier DENV-serotypes te verzekeren om zo het ADEfenomeen te omzeilen. De derde strategie is de ontwikkeling van antivirale middelen (Patkar en Kuhn, 2006; Mateu et al., 2007). Hieronder worden verschillende moleculen besproken die de replicatie van flavivirussen remmen (in vitro of in vivo).
2.6.2. Selectieve Inhibitoren van Virale Enzymes Ondanks hun impact hebben flavivirus infecties nooit echt veel aandacht gekregen als een ziekte die kon worden behandeld met een antiviraal middel. Daarom staat het onderzoek naar selectieve inhibitoren van de virale enzymes nog in zijn kinderschoenen.
2.6.2.1.
1H-benzotriazool en 1H-benzimidazool analogen
Vooral de N-alkyl derivaten van 1H-benzotriazool en 1H-benzimidazool (Figuur 2-15) blijken een sterke activiteit te ontplooien tegen opgezuiverde helicasen van een selectie Flaviviridae (waaronder het West Nijl virus, dengue virus, Japanse encefalitis virus en zelfs het hepatitis C virus). De antivirale activiteit van deze moleculen werd bevestigd in Vero en Hela cellen. Literatuurstudie
27
Over de in vivo activiteit van deze stoffen is momenteel nog niets geweten (Bretner et al., 2005).
Figuur 2-15 – Structuurformule van N-alkyl derivaten van (A) 4,5,6,7-tetrabromo 1H-benzotriazool en (B) 4,5,6,7-tetrabromo 1H-benzimidazool (aangepast volgens Bretner et al., 2005).
2.6.2.2.
5’-O-(4-F-sulfonylbenzoyl)-esters van nucleosiden Een aantal 5’-O-(4-fluorosulfonylbenzoyl (FSB))-esters van nucleosiden (adenosine: FSBA, guanosine: FSBG, inosine: FSBI) en hetzelfde derivaat van ribavirine (FSBR) (Figuur 216) werden geëvalueerd op antivirale activiteit tegen verschillende virussen uit de Flaviviridae familie, waaronder
Figuur 2-16 – Structuurformule van 5’-O-(4-fluorosulfonylbenzoyl)esters. R1 = ribavirine (FSBR); R1 = adenosine (FSBA); R1 = guanosine (FSBG); R1 = hypoxanthine (FSB-inosine) (Bretner et al., 2004).
dengue virus. Enzymatische testen toonden aan dat deze moleculen
vooral
het
nucleoside
trifosfatase/helicase
inhiberen,en dat er daarnaast ook inhibitie van het virale polymerase optreedt. De preïncubatie met deze producten lokte een veel sterker helicase-inhiberend effect uit terwijl
preïncubatie geen invloed had op het polymerase-inhiberend effect. Omdat FSB-esters van nucleosiden eveneens de NTP bindingsplaats van verschillende cellulaire enzymes blokkeren, zijn dergelijke derivaten niet echt klinisch toepasbaar. Verder onderzoek wees ook uit dat vooral het FSB-gedeelte van de molecule aan de basis lag van de inhiberende activiteit. FSBI, de krachtigste van deze vier molecules, zou evenwel als vertrekpunt kunnen dienen voor de ontwikkeling van minder toxische en meer selectieve analogen (Bretner et al., 2004).
2.6.2.3.
Ring-geëxpandeerde nucleoside en nucleotide analogen
Ring-geëxpandeerde heterocyclische nucleoside en nucleotide analogen hebben een dubbel werkingsmechanisme op de activiteit van het NS3 helicase/NTPase: (i) deze moleculen zijn in staat om te intercaleren in de grote of kleine groeve van een dubbelhelix en interfereren op deze manier met de interactie tussen enzyme en het te ontwinden substraat; (ii) inhiberen onder de 5’-trifosfaatvorm de NTPase activiteit. Dit laatste mechanisme is echter sterk Literatuurstudie
28
afhankelijk van de ATP-concentratie, het natuurlijke substraat van dit enzyme. Bij hoge concentraties van ATP (>10 x Km) en van ring-geëxpandeerde heterocyclische nucleoside en nucleotide analogen (> 500 µM) wordt er een activerend effect waargenomen (Zhang et al., 2003).
2.6.2.4.
NTPase/helicase modulatoren
1-(2’-O-methyl-β-D-ribofuranosyl)imidazo[4,5-d]pyridazine-4,7(5H,6H)-dione (HMC-HO4) (Figuur 2-17), 1-(β-D-ribofuranosyl)imidazo[4,5-d]pyridazine-4,7(5H,6H)-dione, en 1-(2’deoxy-α-D-ribofuranosyl)imidazo[4,5-d]pyridazine-4,7(5H,6H)dione door
een
imidazo[4,5-d]pyridazine
worden
gekenmerkt
ringsysteem.
Borowski en collega’s (2002) namen een stimulerende werking van deze moleculen waar op de NTPase activiteit van het West Nijl virus (en hepatitis C virus) NTPase/helicase, terwijl een inhiberende activiteit werd aangetoond op de helicase activiteit van hetzelfde enzyme met dezelfde moleculen. De NTPase en helicase activiteit van dit enzyme zijn dus voor hun functie niet noodzakelijk onderling afhankelijk. Een analoog effect werd bijvoorbeeld ook waargenomen
Figuur 2-17 – Structuurformule van 1-(2’-Omethyl-β-D-ribofuranosyl)imidazo[4,5d]pyridazine-4,7(5H,6H)-dione (HMCHO4) (Borowski et al., 2002).
met 5-fluoro-2-cytosine of O6-benzylguanine chloroethylguaninederivaten die daarentegen de helicase activiteit stimuleren zonder een effect te hebben op de ATPase activiteit van het enzyme (Borowski et al., 2001; Borowski et al., 2002).
2.6.2.5.
Synthetische peptiden
Naar analogie met de studies van Steinkuhler et al. (1998) met het hepatitis C virus protease, bestudeerden Chanprapaph et al. (2005) de gevoeligheid van DENV type 2 NS3 protease voor competitieve inhibitie met synthetische peptiden. De peptiden die werden geëvalueerd, werden gesynthetiseerd op basis van de aminozuursequenties van de virale polyproteïne die door NS3 worden gesplitst. De resultaten zijn erg gelijkaardig aan wat werd waargenomen met het hepatitis C virus protease. Omwille van de hoge affiniteit van het DENV NS3 protease voor deze peptideninhibitors en de bevinding dat het enzym zelfs geïnhibeerd wordt door dipeptiden, maakt de ontwikkeling van efficiënte anti-DENV middelen gebaseerd op peptidomimetica design aantrekkelijker (Chanprapaph et al., 2005). Literatuurstudie
29
2.6.2.6.
Inhibitoren van NS2B/NS3 protease interactie
Ganesh en collega’s (2005) ontdekten drie klassen van moleculen die in staat zijn om te interfereren met de interactie tussen het NS3 serine protease en zijn NS2B-cofactor. Zoals in Figuur 2-18 wordt weergegeven, heeft compound 1 twee guanidinoarmen; dit in tegenstelling tot compound 4 en compound 5. Eén enkele guanidino-arm resulteerde echter in sterkere inhibitie. Er werd aangetoond dat de centraal gelegen dubbelgebonden zuurstof waterstofbruggen kan vormen met de actieve site (Ser 135) van het DENV type 2 NS3protease. Dergelijk interactie werd in alle proteïne/inhibitor-complexen waargenomen. De tweede guanidinoarm van compound 1 speelt mogelijk een rol in de specificiteit voor het dengue protease. Daar alle flavivirus NS2B/NS3-proteasen significante sequentiegelijkenissen met elkaar vertonen, is het dus niet onwaarschijnlijk dat een inhibitor van het ene flavivirus protease ook actief is tegen dat van andere flavivirussen, al dan niet in gelijke mate (Ganesh et al., 2005).
Figuur 2-18 – Structuurformule van (A) compound 1, (B) compound 4 en (C) compound 5 (Ganesh et al., 2005).
2.6.2.7.
Parazolotrahydrothophenen en Pyrozolopyrimidines
High-throughput screening in een West Nijl virus replicon systeem leidde tot de identificatie van parazolotrahydrothophenen en pyrozolopyrimidines (Figuur 2-19) als inhibitoren van de flavivirus replicatie. Het werkingsmechanisme van deze klasse van moleculen werd echter nog
niet
ontrafeld.
Evaluatie van de antivirale activiteit van het analoog 18-B3 in het infectieus virussysteem, echter
geen
vertoonde significante
antivirale activiteit en dit in tegenstelling
tot
de
Figuur 2-19 – Structuurformule van (A) parazolotrahydrothophenen en (B) pyrozolopyrimidines (Gu et al., 2006).
resultaten bekomen in het repliconsysteem. (Gu et al., 2006). Literatuurstudie
30
2.6.3. Breedspectrum Inhibitoren van Virale en/of Cellulaire enzymes Nucleosiden zijn essentiële bouwstenen van zowel viraal als cellulair RNA. Het is dan ook begrijpbaar dat nucleosideanalogen vaak een breedspectrum antivirale activiteit vertonen, rechtstreeks, door één of meerdere virale enzymes te remmen maar ook onrechtstreeks, door een cellulair biosynthetisch pad te inhiberen waarvan het virus rechtstreeks afhankelijk is.
2.6.3.1.
Ribavirine
Ribavirine
(1-(-D-ribofuranosyl-1,2,4-triazole-3-carboxamide), een triazool nucleoside
(Virazole®, Virazid®) werd rond 1970 gesynthetiseerd (Figuur 2-20). Dit breedspectrum antiviraal middel blijft op heden bruikbaar voor een selectie DNA en RNA virale infecties. Het is één van de weinige middelen die momenteel in de handel zijn voor de behandeling van virale infecties. Het wordt ondermeer als monotherapeuticum gebruikt voor de behandeling van infecties met het respiratoir syncytiaal virus en het Lassa koorts virus, en in combinatie met gepegyleerd interferon-α (IFN-α) tegen chronische hepatitis C virus infecties. Hoewel ribavirine in celcultuur enige anti-flavivirus activiteit vertoont, is de effectieve concentratie in celcultuur redelijk hoog. Daarnaast werd aangetoond dat het niet werkzaam is in diermodellen van flavivirus infecties (overzichtsartikel door Tam et al., 2002; Patkar en Kuhn, 2006). Malinoski en collega’s (1990) toonden aan dat er geen significant effect is op viremie, morbiditeit
en
mortaliteit
in
een
DENV/rhesus apen model; Leyssen en collega’s
rapporteerden
vergelijkbare
observaties in het Modoc virus / ‘severe combined immunodefficiency’ (SCID) muismodel (Leyssen et al., 2001). Intensief onderzoek naar de werking van Figuur 2-20 – Ribavirine, een synthetische nucleoside analoog met een gelijkaardige chemische structuur als guanosine (aangepast volgens overzichtsartikel door De Clercq, 2004).
deze molecule heeft echter een heel spectrum van mechanismen aan het licht gebracht, zowel cellulaire als virale en dit sterk afhankelijk van virus tot virus.
Literatuurstudie
31
Het eerste beschreven mechanisme is inhibitie van inosine-monofosfaat dehydrogenase (IMPDH). Ribavirine gedraagt zich als een guanosine analoog (Figuur 2-20) en wordt zoals andere nucleosiden gefosforyleerd aan de 5’ hydroxylgroep tot een monofosfaat door fosfokinase (overzichtsartikel door Tam et al., 2002). Ribavirine 5’-monofosfaat (RMP) is een belangrijke competitieve inhibitor van IMPDH, die betrokken is in de novo synthese van GTP (Figuur 2-21). Zimmerman en collega’s (1978) toonden aan dat de GTP-pool ongeveer gehalveerd werd in cellen die met ribavirine werden behandeld. Aangezien GTP een essentiële bouwsteen is van viraal (en cellulair) RNA, leidt reductie in de beschikbaarheid van GTP tot inhibitie van virale replicatie (overzichtsartikel door Graci en Cameron, 2006).
Figuur 2-21 – Het werkingsmechanisme van ribavirine (en mycofenolzuur, zie verder) in de novo cellulaire guanine nucleotide biosynthese. De reactie is NAD+-afhankelijk. Inosine monofosfaat dehydrogenase (IMPDH) zet inosine monofosfaat (IMP) om tot xanthosine monofosfaat (XMP). XMP kan geamineerd worden tot guanosine monofosfaat (GMP) en verder worden omgezet tot guanine metabolieten die als precursoren dienen voor o.a. RNA-synthese. Wegens de structurele gelijkenis tussen GMP en ribavirine monofosfaat kan deze als competitieve inhibitor van IMPDH fungeren. Dit blokkeert de conversie van IMP tot XMP en remt daarmee de aanmaak van guanine metabolieten. Dit resulteert in inhibitie van RNA-synthese (aangepast volgens overzichtsartikel door De Clercq, 2004).
Een tweede potentieel doelwit voor ribavirine, maar dan als ribavirine trifosfaat metaboliet (RTP), is het virale polymerase. RTP inhibeert in vitro het RNA-afhankelijke RNA polymerase van het influenzavirus (Erikson et al., 1977; Wray et al., 1985), La Crosse virus (Toltzis et al., 1988) en vesiculaire stomatitis virus (Toltzis en Huang, 1986; Toltzis et al., 1988). Intracellulaire fosforylatie van RMP leidt tot accumulatie van RTP, dat als competitieinhibitor gaat optreden van het polymerase. Omdat deze competitieve inhibitie echter onafhankelijk blijkt te zijn van de concentratie van de natuurlijke nucleotiden (ATP en GTP), suggereert dit dat RTP kan binden op een plaats dichtbij de actieve site. Deze binding induceert een conformationele verandering waardoor de enzymatische activiteit sterk wordt geremd of verloren gaat (overzichtsartikel door Graci en Cameron, 2006). Een derde mogelijk doelwit is het virale helicase/NTPase. In het geval bij reovirussen bindt RTP op een plaats nabij het katalytische domein van het transcriptase die door Literatuurstudie
32
conformationele veranderingen resulteert tot inhibitie van de helicaseactiviteit. De binding van RTP verlaagt de affiniteit van het transcriptase voor het templaat met verhoogde kans op vroegtijdige transciptieterminatie als gevolg (Rankin et al., 1989). Ook inhibitie van RTP op de helicase van het hepatitis C virus werd in vitro aangetoond (Borowski et al., 2000). De blokkage van de NTP-site van de helicase door RTP binding remt de ATP-hydrolyse. De energie gegenereerd uit de ATP-hydrolyse is echter noodzakelijk voor het ontwinden van de dubbelstrengige RNA. Dit is vereist tijdens de transcriptie/translatie. Door deze hydrolyse te blokkeren,
wordt
tevens
de
helicaseactiviteit
geremd
met
alle
gevolgen
ervan
(overzichtsartikel door Leyssen et al., 2003). Een vierde mogelijke werkingmechanisme is interferentie met het virale RNA ‘capping’mechanisme. Aan het 5’-uiteinde van de meeste cellulaire RNA’s en van sommige virale RNA’s hangt een 7-methylguanosine CAP-structuur die essentieel is voor RNA stabiliteit en translatie. Er werd aangetoond dat ribavirine kan interageren met enzymes die verantwoordelijk zijn voor de opbouw van deze CAP-structuur (RNA trifosfatase, RNA guanylyltransferase en RNA methyltransferase) of dat het zelf kan worden ingebouwd in de 5’ CAP-structuur (overzichtsartikel door Graci en Cameron, 2006). Daarnaast wordt ribavirine ook als een mutageen effect toebedeeld en dit doordat de molecule kan worden ingebouwd in viraal RNA en hierbij kan baseparen met zowel cytidine als uridine (Figuur 222). Het promiscue aspect is te wijten aan rotatie van het carboxamide deel van ribavirine, wat gunstige acceptor/donorplaatsen
genereert
voor
waterstofbrugvorming met de pyrimidine basen C en U (Crotty et al., 2000; overzichtsartikel door Graci en Cameron,
2006).
Dit
proces
van
verhoogde
mutatiefrequentie wordt in het bijzonder bij RNAvirussen beschreven en resulteert in een verschuiving van de normale viruspopulatie naar een gemuteerde
Figuur 2-22 – Rotatie van het carboxamide deel van ribavirine kan resulteren in baseparing met zowel cytidine als uridine (overzichtsartikel door Graci en Cameron, 2006).
populatie waarbij de meerderheid van de virions een lethaal gemuteerd viraal genoom bezit (Crotty et al., 2001). Over dit mechanisme bestaat nog steeds veel controverse en afhankelijk van virus tot virus, zelfs al behoren ze tot dezelfde virusfamilie, worden andere observaties Literatuurstudie
33
gerapporteerd: ‘error’-catastrofe wordt naar voor geschoven als werkingsmechanisme van ribavirine tegen West Nijl virus (Day et al., 2005), terwijl Leyssen en collega’s hebben aangetoond dat GKV hieraan niet onderhevig is (Leyssen et al., 2006). Een ander potentieel antiviraal mechanisme, dat zich afspeelt op een heel ander niveau, is een immunomodulerend effect. Ribavirine stimuleert T-helper 1 en remt de T-helper 2 respons door selectief type 1 en type 2 cytokine expressie van T-cellen te alterneren. Daarnaast is inhibitie van de productie van pro-inflammatoire mediatoren door viraal geactiveerde macrofagen ook toegeschreven aan ribavirine (overzichtsartikel door Tam et al., 2002; Patkar en Kuhn, 2006). Ondanks of dankzij het grote aantal potentiële werkingsmechanismen blijft het dus nog steeds onduidelijk in welke mate en welk mechanisme(n) tot de (eerder zwakke) anti-flavivirus activiteit bijdraagt/bijdragen. Een aantal ‘prodrug’-strategieën zijn reeds ondernomen als poging om de antivirale werking van ribavirine te verhogen. Het gebrek aan in vivo antivirale activiteit is mogelijk te wijten aan de relatief zwakke anti-flavivirus activiteit, de suboptimale orale biobeschikbaarheid en, in geval van encefalitis, de ongeschiktheid om de bloedhersenbarrière te passeren. Een lipofiele derivaat, ribavirine-2’,3’,5’-triacetaat, vertoont een verhoogde activiteit vergeleken met niet-gemodificeerde ribavirine in muizen die intracraniaal geïnoculeerd zijn met DENV. Andere voorbeelden zijn ribavirine gemodificeerd met een dihydropyridine eenheid en een gelactosamineerd poly-L-lysine derivaat. Het ribavirine analoog EICAR (5-ethynyl-1-β-Dribofuranosylimidazole-4-carboxamide)
vertoont
eveneens activiteit tegen flavivirussen (Figuur 2-23) (overzichtsartikel door Leyssen et al., 2003), maar wordt verondersteld zijn werking uit te oefenen als competitieve inhibitor van het IMPDH, een van de potentiële werkingsmechanismen van ribavirine zelf. Figuur 2-23 – Chemische structuur EICAR (De Clercq et al., 1991).
Literatuurstudie
34
2.6.3.2.
ZX-2401 ZX-2401 of 2-amino-8-(β-D-ribofuranosyl) imidazo [1,2-a]-striazine-4-one of 5-aza-7-deazaguanosine (Figuur 2-24) was oorspronkelijk gesynthetiseerd als inhibitor van de replicatie van picornavirussen. Uit onderzoek uitgevoerd door Kim en collega’s (1978) bleek dat deze molecule opmerkelijk actief was tegen vesiculaire stomatitis, coxsackie B-1 en Echo-6, maar
slechts
matige
activiteit
vertoonde
tegen
vijf
rhinovirussen. Deze resultaten spoorde Ojwang et al. (2005) aan om ZX-2401 te evalueren tegen andere RNA virussen. In Figuur 2-24 – Chemische structuur van 5-aza-7deazaguanosine (ZX-2401) (Ojwang et al., 2005).
celcultuur inhibeert ZX-2401 met minimale cytotoxiciteit de replicatie van minstens vijf leden van de Flaviviridae familie. De activiteit van ZX-2401 is vergelijkbaar met deze van
ribavirine tegen GKV, bovien viraal diarree virus, maar is meer actief tegen banzi virus, West Nijl virus en DENV. Opmerkelijk is dat ZX-2401 ongeveer tien keer actiever is dan 6azauridine. Het werkingsmechanisme van ZX-2401 is momenteel nog niet achterhaald. Hoewel het een nucleosideanaloog is met een breedspectrum antivirale activiteit, is het aannemelijk dat ZX-2401 zijn antivirale activiteit uitoefent via sommige, maar misschien niet alle werkingsmechanismen van ribavirine. Daarbij heeft ZX-2401, in tegenstelling tot ribavirine, een sterke antivirale activiteit tegen het West Nijl virus, wat een ander of additioneel werkingsmechanisme suggereert. Dit kenmerk en het gebrek aan cytotoxiciteit in celcultuur suggereren dat ZX-2401 mogelijk ontdaan is van sommige ongewenste effecten die met ribavirine geassocieerd zijn. Verder onderzoek is noodzakelijk om het verschil in het werkingsmechanisme tussen ribavirine en ZX-2401 op te helderen maar ook voor de ontwikkeling van gelijkaadige antivirale middelen (Ojwang et al., 2005).
2.6.4. Inhibitoren van Cellulaire Enzymes De replicatie van flavivirussen, zoals in hoofdstuk 1.5 aangehaald, kan worden geremd door cellulaire proteïnen te inhiberen. Deze inhibitie kan een rechtstreeks effect hebben op de aanmaak van nieuwe virions, bijvoorbeeld glycosylatie-inhibitoren, of onrechtstreeks, door de aanvoer van bijvoorbeeld bouwstenen voor de aanmaak van virale genomen te remmen.
Literatuurstudie
35
Interferentie met biosynthesewegen: Azauridine, Pyrazofurine en Mycofenolzuur
2.6.4.1.
Cyclopentenylcytosine,
6-
Moleculen, die interfereren met het nucleosiden- of nucleotidenmetabolisme, zoals hierboven beschreven voor ribavirine, kunnen een significant impact hebben op virusreplicatie door het natuurlijke nucleotide/nucleoside-evenwicht in de cel te verstoren. Cyclopentenylcytosine is een inhibitor van het CTP-synthetase met een antivirale activiteit tegen een brede waaier aan DNA- en RNA-virussen, hoewel de antivirale activiteit nog niet in diermodellen werd bevestigd (Neyts et al., 1996; Morrey et al., 2002). 6-Azauridine en pyrazofurine remmen het orotidine monofosfaat decarboxylase dat bij de GTP-, UTP- en TTP-synthese betrokken is (De Clercq, 1993). Het eerste molecule is zeer actief tegen GKV in celcultuur (Neyts et al., 1996). 6-Azauridine triacetaat wordt al sinds enige tijd gebruikt voor de behandeling van een brede waaier van ziektes, inclusief psoriasis. Deze molecule kan in zeer hoge concentratie worden toegediend en zou plasmaconcentraties bereiken die hoger zijn dan nodig voor een efficiënte inhibitie van flavivirus replicatie in vitro. De molecule vertoont een zeer lage toxiciteit in proefdieren en dat wordt bevestigd door testen in mensen. Het is nog niet geweten of de molecule activiteit vertoont in proefdiermodellen voor flavivirus infecties (Morrey et al., 2002; Crance et al., 2003). Pyrazofurine heeft een breedspectrum antivirale activiteit, zowel in vitro als in vivo, maar vertoont echter een aanzienlijke toxiciteit (Wyde et al., 1989). Mycofenolzuur is in tegenstelling tot ribavirine een allosterische inhibitor van IMPDH maar veroorzaakt net zoals ribavirine een depletie van de intracellulaire guanosine beschikbaarheid, wat de processiviteit van het virale RNA polymerase aanzienlijk remt. Mycofenolzuur wordt momenteel gebruikt als tweedelijns immunosuppressief middel ter preventie van afstoting van getransplanteerde organen. In celcultuur is mycofenolzuur in staat om bij zeer lage concentraties (lager dan de plasmaconcentraties die worden bereikt bij gebruik als immunosuppressief middel) de replicatie van flavivirussen te inhiberen (Neyts et al., 1996; Diamond et al., 2002; Takhampunya et al., 2006).
Literatuurstudie
36
Interferentie met de maturatie en posttranslationele modificatie van virale proteïnen: iminosuikerderivaten en castanospermine
2.6.4.2.
α-Glucosidase inhibitoren vertonen een antivirale activiteit tegen tal van virussen maar in het bijzonder interferentie met virussen die de cellulaire secretieweg (ER-Golgicomplex) doorlopen. Het cellulaire α-glucosidase, dat zijn activiteit uitoefent in het lumen van het ER/Golgicomplex,
is
verantwoordelijk
voor
de
‘trimming-step’
van
N-gelinkte
oligosaccharideketens die als posttranslationele modificaties op zowel virale als cellulaire proteïnen worden vastgehecht. De replicatie van bijvoorbeeld het Japanse encefalitis virus en DENV serotype 2 wordt aanzienlijk geremd door N-nonyl-deoxynojirimycine, een 9-koolstof alkyl iminosuikerderivaat. Dit uit zich in een siginificante reductie van glycoproteïnes E en NS1, alsook een afname van virale replicatie (Wu et al., 2002). Studie van het mechanisme waarop N-nonyl-deoxynojirimycine de replicatie van flavivirussen inhibeert, bracht onder andere aan het licht dat deze molecule de transiënte interactie van de virale prM-, E- en NS1proteïne met calnexine, een chaperone-eiwit van het ER, negatief beïnvloedt (Wu et al., 2002; Liang et al., 2006). In een muismodel van lethale flavivirus infectie met DENV-2 werd aangetoond dat de mortaliteit significant werd gereduceerd na herhaaldelijk oraal toedienen van N-nonyl-deoxynojirimycine (Wu et al., 2002). Net als N-nonyl-deoxynojirimycine, inhibeert castanospermine de replicatie van DENV door het correct plooien van de virale proteïnes prM en E te verhinderen. Er werd echter weinig of geen effect op de replicatie van GKV en West Nijl virus waargenomen (Whitby et al., 2005).
2.6.4.3.
Interferentie met fosforylatie: Dasatinib
Fosforylatie van proteïnes door kinasen is een belangrijke schakel in de transmissie van biochemische signalen. Correcte fosforylatie van bijvoorbeeld het DENV NS5 door cellulaire kinasen reguleert onder andere de subcellulaire lokalisatie en de functie van deze proteïne. Chu en Yang (2007) identificeerden inhibitoren met een laag moleculair gewicht van het cSrc proteïne kinase die eveneens een remmend effect hebben op DENV en modoc virusreplicatie. Mechanistische studies toonden aan dat de niet-selectieve inhibitor c-Src proteïne kinase inhibitor dasatinib de assemblage van dengue virions belet. Deze resultaten suggereren dat c-Src proteïne een rol speelt bij de vorming van infectieuze virale partikels. Het feit dat dasatinib antivirale activiteit vertoont zowel tegen alle vier DENV serotypes als tegen het modoc virus, suggereert dat dit proces sterk geconserveerd is in de Flaviviridae virusfamilie (Chu en Yang, 2007). Literatuurstudie
37
2.6.5. Andere Strategieën voor de Behandeling van Flavivirus Infecties 2.6.5.1.
Invloed op immuunsysteem
2.6.5.1.1. Interferon en Interferon Inducers Cellen produceren interferon als reactie op infectie met een virus. Er zijn drie types van interferonen (IFN-α, IFN-β en IFN-γ) die door verschillende celtypes worden geproduceerd. Ze interageren elk met een verschillende cellulaire receptor en activeren een andere intracellulaire signaaltransductiecascade. Het resultaat is de activering? van intracellulaire antivirale defensiemechanismen zoals bijvoorbeeld dsRNA-specifiek RNasen. (Pre-)klinische studies met IFN als therapie voor flavivirus infecties bleken echter niet veelbelovend. Interferon inducers, zoals polyriboinosine-polyribocytidinezuur [Poly(I:C)], Ampligen, tiloron hydrochloride, carboxymethylacridanon, CL246,738, Poly(ICLC), en het fungale 6mycofenolzuur blijken efficiënter te zijn dan behandeling met IFN zelf, maar alleen wanneer de behandeling vóór of heel kort na infectie wordt gestart (Crance et al., 2003; overzichtsartikel door Leyssen et al., 2003; Patkar en Kuhn, 2006)
2.6.5.1.2. Passieve Immuniteit: Anti-virus Immunoglobuline Oliphant en collega’s hebben aangetoond dat passieve immunisatie van muizen met humane monoklonale antilichamen tegen de E-proteïne van West Nijl virus efficiënt is, zelfs met één enkele dosis na vijf dagen na infectie gegeven (Oliphant et al., 2005; Puig-Basagoiti et al., 2006). Dit is echter één van de weinige rapporten over de effectiviteit van passieve immunisatie bij de behandeling van flavivirus infecties.
2.6.5.2.
Interferentie met virale adsorptie en uncoating
Virussen maken gebruik van de oppervlaktelading van de cel om aan het celoppervlak te adsorberen en zo de kans op interactie met een specifieke oppervlaktereceptor te verhogen. Grote, negatief geladen molecules, over het algemeen gesulfateerde oligosacchariden, neutraliseren de oppervlaktelading van de cel en schermen de plasmamembraan sterisch af. Voorbeelden van dergelijke moleculen zijn galactomannans (BRS en LLS, i.e. plantenextracten), heparansulfaat (een natuurlijke component in de membraan van dierlijke cellen), gesulfateerde synthetische polysacchariden, suramine, pentosan polysulfaat, PI-88 (Lee et al., 2006) en DL-galactan hybriden (Pujol et al., 2002). De klinische toepasbaarheid Literatuurstudie
38
van polysaccharidenderivaten is over het algemeen beperkt omwille van de ermee gepaard gaande immuunrespons, biologische beschikbaarheid, farmacokinetiek en –dynamiek en mogelijke nevenwerkingen (nefrotoxiciteit en coagulerende eigenschappen) (Ono et al., 2003).
2.6.5.3.
Pyrazoline of acridine gebaseerde moleculen
1,3,5-triaryl pyrazolinederivaten (Figuur 2-25, A en B) inhiberen West Nijl virus RNA replicatie zonder te interfereren met translatie van viraal RNA. Een belangrijk voordeel van deze moleculen is hun gemakkelijke synthese. Het exacte werkingsmechanisme is echter nog niet beschreven. Omwille van hun a-planaire structuur, is het onwaarschijnlijk dat deze moleculen fungeren als niet-specifieke inhibitoren zoals bijvoorbeeld intercalerende stoffen. Acridine- (Figuur 2-25, C) en quinolinegebaseerde moleculen inhiberen eveneens de replicatie van het West Nijl virus. Deze moleculen intercaleren echter wel met dubbelstrengig RNA/DNA en beïnvloeden daarmee eveneens cellulaire processen (Goodell et al., 2006).
Figuur 2-25 – Structuurformule van (A) pyrazoline gebaseerde moleculen, (B) gesubstitutioneerde pyrazoline analogen, en (C) acridine-gebaseerde molecule (Goodell et al., 2006).
2.6.5.4.
Nucleïnezuurgebaseerde Antivirale Therapie
2.6.5.4.1. RNA interferentie RNA interferentie (RNAi) is een natuurlijk antiviraal defensiemechanisme dat oorspronkelijk werd ontdekt in planten. Hierbij wordt dubbelstrengig RNA, dat meestal geassocieerd is met de aanwezigheid van een replicerend RNA virus, door DICER verknipt tot ‘small interference RNA’ (siRNA) van 21-23 nucleotiden. SiRNA, in associatie met het multiproteïnecomplex ‘RNA-induced silencing complex’ (RISC), bindt op RNA door complementaire basenparing, waarna het target RNA wordt gedegradeerd. Murakami en collega’s toonden aan dat RNAi in staat is om de replicatie van het Japanse encefalitis virus te remmen, en dit zowel in vitro als in vivo (Murakami et al., 2005). Literatuurstudie
39
2.6.5.4.2. Antisense oligonucleotiden: Morfolino oligomeren Het gebruik van morfolino oligomeren is een ‘antisense’-strategie. Deze oligomeren zijn in staat tot zeer selectieve complementaire baseparing doch zijn resistent tegen RNase Hdegradatie.
Peptide-gebonden
fosforodiamidaat
morpholino
oligomeren
(P-PMOs),
complementair aan de DENV 5’ stem-loop (5’SL), de 3’ cyclisatie sequentie (3’CS) en de top van de 3’ stem-loop (3’SLT) inhiberen dengue virus replicatie door te interfereren met kritische RNA-RNA of RNA proteïne-interacties, essentieel voor virale translatie of virale RNA replicatie. Ondanks hun hoge specificiteit en selectiviteit, is therapeutische ontwikkeling van deze moleculen zeer onwaarschijnlijk. Als onderzoeksstrategie hebben ze echter al wel hun dienst bewezen (Holden et al., 2006).
2.6.5.5.
Salicylaten
Hoewel flavivirussen in het cytoplasma repliceren, is het nog steeds niet duidelijk waarom een geactiveerde nucleaire factor nodig is voor de voltooiïng van de flavivirus replicatiecyclus, die eindigt met de inductie van apoptosis in de gastheercellen. Het is beschreven dat flavivirussen kort na infectie de nucleaire factor kappa B (NF-κB) activeren. Salicylaten blokkeren NF-κB-activatie, wat kan verklaren waarom deze moleculen een antiflavivirus effect induceren. Liao en collega’s (2001) toonden echter ook aan dat salicylaten op een NF-κB-onafhankelijke manier de flavivirus replicatie kunnen inhiberen: een mogelijk werkingsmechanisme zou kunnen bestaan uit inhibitie van het specifiek p38 mitogeengeactiveerd kinase (p38 MAP). Belangrijke nadelen verbonden aan behandeling met salicilaten is hun antistollingseffect met verhoogde kans op Reye-syndroom en bloedingen, wat nefast kan zijn bij DHK of DSS (Liao et al., 2001).
2.6.5.6.
Capside-gerichte virus-inactivatie techniek
Capside-gerichte virusinactivatie (CVTI) is vooralsnog een conceptuele techniek, waarbij op basis van de structuur van virale proteïnes een zeer selectief protease wordt ontwikkeld dat, na intracellulaire expressie, bijvoorbeeld selectief het capside proteïne van flavivirussen afbreekt (Qin et al., 2006).
Literatuurstudie
40
2.7. SAMENVATTING Van de hierboven beschreven moleculen is enkel ribavirine goedgekeurd voor klinisch gebruik en dit voornamelijk bij de behandeling van hepatitis C. Er is geen enkele evidentie dat dit molecule enig effect heeft bij de behandeling van flavivirus infecties. Er is daarom dringend nood aan de ontwikkeling van nieuwe inhibitoren met selectieve activiteit voor behandeling van flavivirus infecties (Chu en Yang, 2007).
Literatuurstudie
41
DEEL III MATERIAAL & METHODEN
3. MATERIAAL & METHODEN 3.1. MATERIAAL 3.1.1. Virus en Cellen De experimenten voor dit eindwerk werden uitgevoerd met het gele koorts virus 17D vaccin stam (Stamaril, Aventis Pasteur MSD, Brussel, België) en het dengue virus serotype 2 NieuwGuinea stam (gift van Prof. Dr. V. Deubel). Alle experimenten werden uitgevoerd met Vero cellen (African green monkey kidney cells).
3.1.2. Media en bereidingen •
Celgroeimedium MEM 10% FCS: 500 ml ‘Minimum Essential Medium’ (MEM, GIBCO Invitrogen Corporation, Paisly, Scotland), 50 ml (10%) foetaal kalfsserum (FCS, Integro) geïnactiveerd gedurende een half uur in een warmwaterbad (Gesellschaft für Labortechnik mbH, Burgwedel, Duitsland) bij 56°C, 5 ml L-Glutamine (200 mM, 100 x, GIBCO, Invitrogen, Paisley, Verenigd Koninkrijk) en 5 ml natriumbicarbonaat (7,5%, GIBCO, Invitrogen, Paisley, Verenigd Koninkrijk)
•
Assaymedium MEM 2% FCS: 500 ml MEM, 10 ml (2%) FCS, 5 ml L-glutamine en 5 ml natriumbicarbonaat.
•
2x MEM 4% FCS: 400 ml steriel milliQ-water, 100 ml 10x MEM, 20 ml FCS, 10 ml LGlutamine en 10 ml natriumbicarbonaat.
•
10x MEM zonder neutraal rood: MEM poeder (MEM +Earle’s +L-Glutamine –NaHCO3, GIBCO, Invitrogen) werd onder voortdurend roeren in 1 liter milliQ-water opgelost tot een homogene oplossing werd bekomen. Vervolgens werd het medium 1 op 5 verdund met milliQ-water en steriel gefiltreerd (Nalgene Filtration Products). Het bekomen 2x MEM medium werd bij 4°C bewaard.
•
1% methyleenblauwoplossing: methyleenblauw werd gebruikt voor een zeer snelle en intense kleuring van gefixeerde celculturen. Tien gram methyleenblauw werd opgelost in 100 ml 96-100% ethanol en overnacht opgeroerd tot een homogene oplossing. Het mengsel werd vervolgens tot 1 liter aangelengd met milliQ-water en op kamertemperatuur bewaard.
•
2% agar-/Aviceloplossing: Om een bepaal % (massa/volume) agaroplossing te bekomen, wordt een hoeveelheid agar (Sigma, Cat #A9915) afgewogen en aan een 2x massa/volume verhouding in milliQ-water geresuspendeerd. Deze wordt vervolgens geautoclaveerd
Materiaal & Methoden
42
gedurende 20 minuten op 120°C (bij 1,5 kPa). Voor onmiddellijk gebruik wordt de agaroplossing onmiddellijk na autoclaveren in een warmwaterbad op 45-50°C geplaatst om stollen tegen te gaan. Indien de agar voor langere tijd op kamertemperatuur wordt bewaard, dient deze eerst te worden gesmolten voor gebruik. Avicel RC/CLTM poeder (FMC BioPolymer, Brussel, België) wordt eveneens aan een 2x massa/volume verhouding geresuspendeerd in milliQ-water. De suspensie wordt overnacht opgeroerd tot er een homogene vloeistof wordt bekomen en vervolgens geautoclaveerd voor 20 minuten op 120°C. De Avicelbereiding kan vervolgens voor lange tijd op kamertemperatuur worden gestockeerd. Net vóór gebruik dient deze goed (gedurende 1 uur) te worden opgeroerd of heel intens worden geschud om terug een goed vloeibaar homogeen mengsel te bekomen.
3.1.3. Antivirale Moleculen GPYA-4, GPYA-14, GPYA-18, GPC-N20 en GPC-N32 werden gesynthetiseerd door Prof. Dr.G. Pürstinger (University of Innsbruck, Innsbruck, Oostenrijk). Van deze moleculen werd een 20 mg/ml stockoplossing gemaakt in dimethylsulfoxide (DMSO p.a., Merck, Darmstadt, Duitsland) en bewaard bij 4°C.
3.2. METHODEN 3.2.1. Subcultiveren van Vero cellen Het medium van een confluente zeven-dagen oude Vero celcultuur, opgegroeid in 75 cm² cultuurflessen (Orange Scientific, MSE S.A., Braine-l’Alleud, België), werd afgezogen, waarna de cellen werden gewassen met 10 ml PBS (BioWhittaker, Verviers, België). Vervolgens werd 3 ml trypsine-EDTA (0.25%, 1 x, GIBCO 25200, Invitrogen, Paisley, Verenigd Koninkrijk) aangebracht, waarin de cellen gedurende een vijftal minuten bij 37°C werden geïncubeerd tot disaggregatie van de monolaag werd waargenomen. De losgekomen cellen werden geresuspendeerd in 3 ml MEM 10% FCS, waarna de celsuspensie werd gecentrifugeerd (1100 rotaties per minuut [rpm], 6 minuten, kamertemperatuur, centrifuge Thermo Electron Corporation). Het supernatans werd verwijderd en de celpellet goed geresuspendeerd in 4 ml MEM 10% FCS. Eén milliliter celsuspensie werd overgebracht naar een nieuwe 75 cm² cultuurfles die 20 ml MEM 10% FCS bevat (subcultiveerratio 1:4), waarna de cellen werden geïncubeerd bij 37°C, 5% CO2 en 99% relatieve luchtvochtigheid (incubator model CB 210, BINDER GmbH, Tuttlingen, Duitsland). In het algemeen werden Materiaal & Methoden
43
de cellen afkomstig van celculturen van 6 tot 8 dagen oud gebruikt voor de aanleg van microtiterplaten waarmee de infectie-experimenten werden uitgevoerd. Voor 6-well platen werd een 1 op 4 oppervlakteratio aangehouden; voor de aanleg van 96-well platen werd een hoeveelheid van 50 000 cellen/well gezaaid. De celtellingen werden uitgevoerd met een Z1 Coulter® Particle Counter (Beckman Coulter TM, Analis, Gent, België).
3.2.2. Opkweken van (resistente) flavivirussen Vero cellen (geoogst volgens het protocol beschreven in 3.2.1.) werden aan een 1:4 ratio gezaaid in 25 cm² cultuurflessen. De confluente cellaag werd één dag na aanleg van de celcultuur gedurende 1 à 2 uur geïnfecteerd met 1 ml onverdund virus. Vervolgens werd het virusinoculum geaspireerd en de cellen driemaal gewassen met MEM 2% FCS om nietgeabsorbeerd virus weg te wassen. Na toevoeging van 5 ml MEM 2% FCS, dat al dan niet een bepaalde concentratie van een antiviraal molecule bevat, werden de celculturen gedurende maximum 7 dagen bij 37°C, 5% CO2 en 99% relatieve luchtvochtigheid geïncubeerd. De culturen werden regelmatig gecontroleerd op het verschijnen van virusgeïnduceerd cytopathogene effect (CPE). Wanneer 90-100% CPE werd waargenomen, werd het supernatans samen met zoveel mogelijke cellen gecollecteerd en krachtig gevortexed om virus, dat aan het celoppervlak geadsorbeerd was, in het medium vrij te zetten. Het celdebris werd van het medium gescheiden door centrifugatie (4000 rpm, 4°C, 10 minuten). Het supernatans werd dan gealiquoteerd in cryotubes (NUNC, Denemarken) en onmiddellijk ingevroren en bewaard bij -80°C.
3.2.3. Opzuivering van virussen door uitverdunning Deze techniek wordt onder meer gebruikt om uit een heterogene viruspopulatie resistente of zeer replicatiecompetente virus fenotypes op te zuiveren. Voordelen van deze methode zijn (1) er kan in 96-well platen worden gewerkt en (2) het gebruik van agar of andere visceuze media is overbodig. Door deze opzuiveringsstap te herhalen, kunnen zeer sterk aangerijkte viruspopulaties worden bekomen. Eén dag voor infectie werden 96-well platen aangelegd a rato van 50 000 Vero cellen per well in MEM 10% FCS. Voor infectie van de cellen werd het medium vervangen door 50 µl MEM 2% FCS. In de eerste well werd 100 µl virus aangebracht, dat vervolgens werd uitverdund volgens een 1 op 1,5-verdunningsreeks. Na een incubatieperiode van 1 à 2 uur bij 37°C werd het supernatans afgeheveld en vervangen door 250 µl MEM 2% FCS, al dan niet Materiaal & Methoden
44
voorzien van een bepaalde concentratie van een molecule met antivirale activiteit. De platen werden geïncubeerd bij 37°C, 5% CO2 en 99% relatieve luchtvochtigheid en dagelijks gecontroleerd op het verschijnen van CPE. Zeven dagen na infectie (7 dpi) werden telkens minstens drie wells geselecteerd in de staart van de verdunningsreeks waarbij één (of enkele) plaques konden worden onderscheiden. 100 µl supernatans van elk geselecteerd welletje werd vervolgens gebruikt als inoculum voor een volgende opzuiveringsstap of, na drie opzuiveringsstappen, de aanleg van een virusstock in 25 cm² cultuurflesjes. De resterende 150 µl supernatans werd telkens ingevroren (-80°C).
3.2.4. Plaque assays 3.2.4.1.
Plaque forming assay
‘Plaque forming assays’ worden gebruikt voor de bepaling van het aantal ‘plaque forming units’ (PFU) en geven een indicatie van het aantal infectieuze eenheden per volume virusinoculum (Matrosovich et al., 2006). Eén dag voor uitvoering van het experiment werden Vero cellen aangelegd (1:4 ratio) in 6-well microtiterplaten. De volgende dag werd het supernatans geaspireerd en vervangen door 2 ml virusinoculum (al dan niet in aanwezigheid van een bepaalde concentratie van een molecule met antivirale activiteit). Exact dezelfde handelingen werden uitgevoerd op controle cellagen, maar dan met medium (al dan niet met een bepaalde concentratie van een molecule met antivirale activiteit). Na 1 à 2 uur incubatie, werden de cellen driemaal gewassen met 2 ml MEM 2% FCS (op kamertemperatuur) teneinde niet-geadsorbeerd virus te verwijderen. Vervolgens werd 1x ‘overlay’-medium bereid door 2x MEM en respectievelijk warme 2x agaroplossing of kamertemperatuur 2x Aviceloplossing aan een 1:1 verhouding te mengen, waarvan 4 ml aan de wells werd toegevoegd. Na zeven dagen incubatie bij 37°C, 5% CO2 en 99% relatieve luchtvochtigheid, werd de ‘overlay’ verwijderd: de platen met een agar ‘overlay’ werden gedurende minstens 4 uren onder de trekkast gefixeerd met 3 ml 3,7% formaldehyde, waarna de agar ‘overlay’ voorzichtig met een spateltje uit de well werd gelepeld. In het geval van de Avicel ‘overlay’ werd deze voorzichtig afgezogen, de restanten weggewassen met PBS en gefixeerd met 75% ethanol. De gefixeerde cellagen werden vervolgens gekleurd met 1% methyleenblauw; de kleurstof werd na vijf tot 30 minuten weggewassen met kraantjeswater waarna de platen aan de lucht werden gedroogd.
Materiaal & Methoden
45
3.2.4.2.
Plaque reduction assay
Met een ‘plaque reduction assay’ wordt de antivirale activiteit van een molecule bestudeerd door de invloed ervan na te gaan op het aantal plaques dat wordt gevormd en door de grootte van deze plaques na te gaan. 1-dag oude confluente Vero cellagen, aangelegd in 6-well platen, werden (met uitzondering van de celcontrole) geïnfecteerd met een voorafbepaalde hoeveelheid PFU in 2 ml MEM 2% FCS. Na 1 uur incubatie bij 37°C werd de cellaag drie keer gewassen met 2 ml MEM 2% FCS. Vervolgens werd aan elke well 4 ml 1% ‘overlay’medium toegevoegd voorzien van een bepaalde concentratie molecule met antivirale activiteit. Na zeven dagen incubatie bij 37°C, 5% CO2 en 99% relatieve luchtvochtigheid werden de cellen gewassen, gefixeerd, gekleurd en gedroogd zoals hierboven reeds werd beschreven.
3.2.5. Real-time RT-qPCR 3.2.5.1.
RT-qPCR
‘Reverse Transcriptase-quantitative Polymerase Chain Reaction’ (RT-qPCR) laat toe om het aantal RNA-kopijen in een staal te kwantificeren. Per te analyseren staal werd (op ijs) het volgende reactiemengsel bereid (25 µl finaal volume): 12,5 µl 2x One-Step Reverse Transcriptase-qPCR Master Mix (Eurogentec, Seraing, België), 6,625 µl DNase/RNasevrij water (ACROS Organics, Geel, België), 2 µl Taqman probe (finale concentratie: 200 nM, zie Tabel 4.1), 0,375 µl forward en 0,375 µl reverse primer (finale concentratie: 900 nM, zie Tabel 4.1), 0,125 µl reverse transcriptase en 3 µl RNA-templaat. De analyse werd uitgevoerd in een SDS7000 ABI Prism toestel (Applied Biosystems, Lennik, België). De hoeveelheid RNA-kopijen werd gekwantificeerd met een 1 op 10-verdunningsreeks van een plasmide als Tabel 3-1 – Overzicht van de gebruikte primers en probes voor het gele koorts virus en dengue virus met hun sequenties. MGB = ‘Minor Groove Binder’, FAM = carboxyfluorescein, en NFQ = non fluorescent quencher.
5'-3'-Sequentie GKV
forward primer
TGG CAT ATT CCA GTC AAC CTT CT
reversed primer 5-carboxyfluoresceinMGB probe
GAA GCC CAA GAT GGA ATC AAC T
DENV forward primer reversed primer 5-carboxyfluoresceinMGB probe
Materiaal & Methoden
TTC CAC ACA ATG TGG CAT G
5'3'Merking Merking
FAM
NFQ
FAM
NFQ
GCC GGA GTT TAC AAA GAA GGA A GCA TTA GAA CAG CGC CTC TTG ATT CCA CAC AAT GTG GCA T
46
referentie, waarin het Taqman amplicon werd gekloneerd. Volgende ‘thermocycling’ profiel werd gebruikt: 30 min bij 45°C, 10 min bij 95°C, 45 cycli van 15 s bij 95°C en de finale elongatie gedurende 1 min bij 60°C.
3.2.6. Virus Yield De ‘virus yield’ methode wordt gebruikt om het effect van een antivirale molecule op de virusproductie na te gaan. 96-well microtiterplaten werden aangelegd a rato van 50 000 cellen per well. De volgende dag werden deze geïnfecteerd met 100 µl virusinoculum (1/1000 voor GKV passage 26 en 1/100 voor DENV passage 26). Na één uur incubatie bij 37°C, 5% CO2 en 99% relatieve luchtvochtigheid werden de cellen drie keer gewassen met 100 µl MEM 2% FCS om niet-geadsorbeerd virusinoculum te verwijderen. Vervolgens werd 100 µl MEM 2% FCS aangebracht. In dit medium werd dan een 1 op 2-verdunningsreeks met de te evalueren molecule uitgevoerd, waarna nogmaals 100 µl MEM 2% FCS per well werd toegevoegd teneinde een finaal volume van 200 te bekomen. De microtiterplaten werden geïncubeerd bij 37°C, 5% CO2 en 99% relatieve luchtvochtigheid tot de eerste duidelijke tekenen van CPE werden waargenomen (respectievelijk 4 en 5 dagen voor DENV en GKV). Elk experiment werd uitgevoerd in tweevoud. Per conditie werd 100 µl supernatans gecollecteerd, gepoold en vervolgens gedurende 3 min bij 13 000 rpm gecentrifugeerd zodat celdebris, dat beladen is met niet-gematureerde virions, werd neergeslagen. Uit 150 µl van het supernatans werd viraal RNA geïsoleerd met behulp van de ‘NucleoSpin® RNA Virus kit’ (Macherey-Nagel, Düren, Duitsland) volgens de instructies van de fabrikant.
3.2.7.
Sequenering
3.2.7.1.
Sequencing primers
De sequencing primers (zie Addendum I) werden ontwikkeld door Dr. Suzanne Kaptein en beantwoorden aan volgende voorwaarden: • Per primerpaar kan een fragment van 450-550 nucleotiden worden geamplificeerd; • De amplicons hebben een overlap van minstens 50 nucleotiden; • De smelttemperatuur van de primers is gelegen tussen 58 en 60°C; • De primers mogen nooit driemaal achter elkaar dezelfde base bevatten; • De som van alle G’s en C’s in de laatste 5 nucleotiden mag niet groter zijn dan 2; • De primer mag niet eindigen met een G of een C; • De lengte van de primers moet tussen 18 en 22 nucleotiden zijn. Materiaal & Methoden
47
3.2.7.2.
One-Step RT-PCR
Hiervoor werd per staal 50 µl reactiemix samengesteld met de Qiagen One-Step RT-PCR kit (Qiagen One-Step RT-PCR Mix, Qiagen, Leusden, Nederland) bestaande uit 28,5 µl DNase/RNasevrij water, 10 µl 5x RT-Buffer, 2 µl dNTP, 2 µl Enzyme mix, 1 µl RNasin (Promega, Leiden, Nederland), 0,75 µl 50-60 µM forward en 0,75 µl 50-60 µM reverse primer en 5 µl RNA-templaat. De reactie werd uitgevoerd in een Biometra® T3000 Thermocycler (Biometra, Westburg) waarbij rekening werd gehouden met de lengte van het fragment (elongatiestap à 1 minuut per kb) en de smelttemperatuur van beide primers (de annealing temperatuur werd 5°C lager ingesteld dan de gemiddelde smelttemperatuur van beide primers).
3.2.7.3.
Agarose gelelektroforese, Gelextractie en Concentratiebepaling
Na toevoeging van 10 µl 6x Loading Dye (Promega; tracing dyes bromofenolblauw ≈ 4 kb, xyleen cyanol ≈ 300 bp, en orange G ≈ 50 bp), werden de amplicons gescheiden op een 0,7% agarosegel (Sigma Aldrich) in Tris-Boraat-EDTA-buffer (TBE, Sigma Aldrich) gedurende één uur bij 80 V (Sub-Cell® Agarose Gel Electrophoresis Systems, BioRad, Hertfordshire, England). Als marker werd de 1 kb DNA-Ladder (Promega) gebruikt. Na de gelelektroforese werd het gel in een bad met ethidiumbromide gekleurd gedurende minimum 10 min waarna de bandjes werden gevisualiseerd met het geldocumentatiesysteem (Chemi DocTM XRS systeem, BioRad Laboratories Inc.) en vervolgens uitgesneden. De geselecteerde amplicons werden geëxtraheerd met de ‘QIAquick gelextractiekit’ (Qiagen) waarna de opbrengst werd gekwantificeerd met behulp van de Spectramax (Spectramax System 190, Brussel, België).
3.2.7.4.
Sequentiebepaling van de opgezuiverde amplicons
Voor het bepalen van de sequentie van de opgezuiverde amplicons werd de Big Dye Terminator kit (BigDye Terminator Cycle Sequencing kit; Applied Biosystems) gebruikt. De sequencing primers worden in Addendum I weergegeven. De reactiemix werd samengesteld uit 4 µl Ready Reaction Mix, 1 µl forward of reverse primer aan 5-6 µM en 5 µl DNAtemplaat. De vereiste hoeveelheid DNA-templaat werd berekend volgens de instructies van de fabrikant: voor een amplicon van 1000-2000 bp in lengte diende 10-40 ng DNA-templaat te worden toegevoegd. De ‘cycle sequencing’ reactie werd uitgevoerd met een T3000 thermocycler. Volgende ‘thermocycling’ profiel werd gebruikt: 30 min bij 50°C, 15 min bij
Materiaal & Methoden
48
95°C, 30 cycli van 30 s bij 94°C, 30 s bij 55°C, 60 s bij 72°C (verlengd met 5 s per cyclus) en de finale elongatie gedurende 10 min bij 72°C. Na deze reactie werd een koude ethanolprecipitatie uitgevoerd om niet-geïncorporeerde ddNTP’s weg te wassen. In een eerste stap werd 10 µl DNase/RNasevrij water, 2 µl 3 M NaAc en 50 µl 100% ethanol toegevoegd, waarna het staal overnacht bij –20°C werd bewaard. Na centrifugatie (30 min, 4°C, 13 000 rpm) werd het supernatans verwijderd en vervangen door 150 µl 70% ethanol, gedurende 15 min gecentrifugeerd waarna het supernatans opnieuw werd verwijderd. De pellet werd gedurende een tiental minuten aan de lucht gedroogd en opgelost in 15 µl formamide. Het staal werd gedurende 2 minuten bij 94°C gedenatureerd in een ‘heating block’ en daarna onmiddellijk op ijs geplaatst. De sequentie werd bepaald met een ABI sequencer 373 (Applied Biosystems).
Materiaal & Methoden
49
DEEL IV RESULTATEN
4. RESULTATEN 4.1. OPTIMALISATIE VAN EEN EENVOUDIG BRUIKBARE ‘PLAQUE FORMING ASSAY’ VOOR FLAVIVIRUSSEN
4.1.1. Situering Voor het goede verloop van dit onderzoekswerk, was het noodzakelijk om te beschikken over een eenvoudig bruikbare ‘plaque forming assay’ voor flavivirussen. Tot nu toe werden alle ‘plaque forming assays’ in de onderzoeksgroep uitgevoerd met agar, met alle eraan verbonden nadelen (zie verder). Recent publiceerden Matrosovich en collega’s (2006) het gebruik van Avicel bij het uitvoeren van ‘plaque forming assays’ voor influenzavirus. Indien deze techniek zou kunnen worden toegepast of aangepast voor flavivirus ‘plaque forming assays’, zouden alle nadelen van agar kunnen worden omzeild. Avicel RC/CL is een colloïdale vorm van wateronoplosbare cellulosemicropartikels gemengd met natriumcarboxymethylcellulose om dispersie te vergemakkelijken. Microkristallijn cellulose is afgeleid van natuurlijk cellulose, zoals kan worden teruggevonden in fruit en groenten. Tijdens de verwerking van opgezuiverde plantenvezels, of α-cellulose, worden de amorfe regio’s uit de microfibrillen verwijderd en enkel de kristallijne bundels behouden. Tijdens het drogen aggregeren die bundels ter vorming van zeer poreuze partikels, die als eigenschap hebben dat ze een zeer grote hoeveelheid water kunnen absorberen. In waterige media gaan Avicelmicropartikels in suspensie en reorganiseren zich tot een driedimensionaal netwerk met zwakke waterstofbruggen als bindend element. Het netwerk krijgt aldus een gelstructuur die de moleculen verhindert neer te slaan en gedurende lange termijn stabiel is (er treedt geen faseseparatie op). De manier van opbouw van het netwerk is bepalend voor de eigenschappen van de uiteindelijke structuur; de gel die wordt gevormd is namelijk een thixotrope gel. Door intensief schudden of oproeren kan van een dergelijke gel de netwerkstructuur worden verbroken en wordt wederom een vergietbare vloeistof bekomen. Wordt deze uitgegoten, dan herstructureren de micropartikels zich terug tot een gel. Avicel wordt aangewend in ondere andere bereidingen van farmaceutische suspensies en emulsies (FMC Biopolymer 1995; FMC Biopolymer, 2005a; FMC Biopolymer 2005b; Matrosovich et al., 2006). De goede handelbaarheid alsook de relatief lage viscositeit van Avicel waren belangrijke argumenten om dit ‘overlay’-medium te evalueren op zijn bruikbaarheid voor flavivirus ‘plaque forming assays’. Resultaten
50
4.1.2. Vergelijking van Agar versus Avicel als ‘Overlay’-Medium Hieronder wordt het protocol weergegeven voor het gebruik van respectievelijk agar en Avicel als ‘overlay’-medium: 1. Bereiding 2x agaroplossing •
1. Bereiding 2x Aviceloplossing
Agar afwegen en resuspenderen in
•
milliQ-water
Avicel afwegen en resuspenderen in milliQ-water
•
Minimum 1-3 uur oproeren tot een homogene suspensie
•
•
Autoclaveren (20 min bij 120°C) o Bij voorkeur vers te bereiden
o Langdurig bewaren op kamer-
voor gebruik •
Bij
onmiddellijk
Autoclaveren (20 min bij 120°C) temperatuur is mogelijk
gebruik
in
•
Vóór gebruik hoogvloeibaar maken
warmwaterbad op 50°C bewaren
door intensief op te roeren en/of
om stolling te vermijden
hard te schudden
2. Infectie van de confluente cellaag
2. Infectie van de confluente cellaag
3. Bereiding van de agar ‘overlay’
3. Bereiding van de Avicel ‘overlay’
•
Conditie per conditie 2x agar (1:1
•
v/v) mengen met 2x MEM 4% FCS
Alle condities 2x Avicel (1:1 v/v) mengen met 2x MEM 4% FCS
•
Goed mengen
•
Goed mengen
•
Onmiddellijk op de cellagen aan-
•
‘overlays’ conditie na conditie
brengen om stolling te voorkomen
aanbrengen op de cellagen
4. Incubatie van de culturen
4. Incubatie van de culturen
5. Visualisatie van de plaques (7dpi)
5. Visualisatie van de plaques (7dpi)
•
Cellaag fixeren met 3,7% formaldehyde voor minimum 4 uur onder trekkast
•
Verwijder formaldehyde
•
Lepel ‘overlay’ zéér voorzichtig
•
‘overlay’ voorzichtig afzuigen
•
Restjes wegwassen met PBS
•
Cellaag fixeren met 70% ethanol
weg •
Restjes wegwassen met PBS
6. Drogen, kleuren en kwantificeren
Resultaten
6. Drogen, kleuren en kwantificeren
51
Het vergelijkend protocol, zoals hierboven uitgeschreven, toont aan dat werken met Avicel veel minder tijdsintensief is dan werken met agar. Andere belangrijke voordelen van het gebruik van Avicel ten opzichte van agar zijn: (1) Een 2x agaroplossing dient bij voorkeur telkens vers te worden aangemaakt. Een 2x Aviceloplossing kan dagen op voorhand in grote hoeveelheden worden bereid en op kamertemperatuur worden bewaard wanneer deze niet onmiddellijk wordt gebruikt; (2) Een 2x agaroplossing wordt best onmiddellijk gebruikt na autoclaveren omdat, eens agar gestold is, het moeilijk is om deze terug om te smelten tot een mooi homogene oplossing. Daarentegen kan 2x Aviceloplossing onmiddellijk gebruiksklaar worden gemaakt door deze op te roeren of hard te schudden tot een homogeen, hoogvloeibaar mengsel wordt bekomen; (3) De 2x agaroplossing dient, in tegenstelling tot de 2x Aviceloplossing die op kamertemperatuur kan worden gebruikt, op 50°C te worden geïncubeerd om stolling te vermijden. Indien echter bij het aanmaken van de 1x agar ‘overlay’ de temperatuur van de 2x agaroplossing nog te hoog is, kan dit de cellen beschadigen bij aanbrengen van de agar ‘overlay’; (4) De 1x agar ‘overlay’ moet steeds sequentieel conditie per conditie worden aangemaakt en op de cellen worden aangebracht om vroegtijdig stollen te vermijden. Alle 1x Avicel ‘overlays’ kunnen in één keer worden bereid en vervolgens systematisch op de cellagen worden aangebracht; (5) In tegenstelling tot de Avicel ‘overlays’, die gewoon afgezogen kunnen worden, moet de agar ‘overlay’ zeer voorzichtig met een spatel uit de wells worden gelepeld om de cellaag niet te beschadigen, en (6) de cellaag moet, vóór verwijdering van een agar ‘overlay’, gedurende lange tijd (>4 uur) worden gefixeerd met formaldehyde (een gekend carcinogeen), terwijl in het geval van Avicel 10 minuten fixatie met 70% ethanol volstaat na afzuigen van de ‘overlay’. In vergelijking met agar zijn er toch twee belangrijke nadelen verbonden aan het gebruik van Avicel: (1) de Avicel ‘overlay’ is niet transparant, wat microscopische observatie en evaluatie van het ontstaan van CPE onmogelijk maakt en (2) een Avicel ‘overlay’ heeft een zekere vloeibaarheid, waardoor deze (zeker in combinatie met de ondoorzichtigheid) niet geschikt is voor opzuivering van individuele virusgeïnduceerde plaques (zie verder). Deze nadelen wegen echter niet op tegen de voordelen van Avicel, in het bijzonder de gebruiks- en de tijdsvriendelijkheid, met het oog op het type van experimenten die zullen worden uitgevoerd in het kader van dit onderzoekswerk. Om het gebruik van Avicel als ‘overlay’-medium te valideren, werd eerst een vergelijkende studie uitgevoerd om het effect van beide ‘overlay’media op de vorming van plaques door flavivirussen na te gaan.
Resultaten
52
4.1.3. Evaluatie agar en Avicel als flavivirus plaquing media Eerst werd de invloed van verschillende percentages (0,5; 0,75; 1 en 1,25%) van beide ‘plaquing’ media (agar en Avicel) op de vorming van plaques nagegaan. Confluente cellagen werden geïnfecteerd met een 1 op 10 of een 1 op 2 verdunningsreeks van respectievelijk het gele koorts virus en het dengue virus. Zeven dagen na infectie werden de cellagen gefixeerd en de resulterende plaques geëvalueerd op grootte (zie ‘Plaque forming assay’, Materiaal & Methoden 3.2.4.1.). Zoals kan worden afgeleid uit Figuur 4-1 (zie volgende bladzijde), wordt een effect van een stijgend percentage aan agar in het ‘overlay’-medium op de grootte van de virusgeïnduceerde plaques waargenomen: de kleinste plaques worden bekomen met 1,25% agar in het ‘overlay’medium; de grootste bij 0,5%, en dit zowel bij GKV als bij DENV. Bij het gebruik van Avicel in het ‘overlay’-medium is deze trend minder duidelijk: hoewel de GKV-geïnduceerde plaques bij 0,5% Avicel ‘overlay’ iets groter zijn dan bij de overige percentages Avicel, kan hier zowel bij GKV als bij DENV geen verband worden waargenomen tussen het gebruikte percentage Avicel en de grootte van de plaques (zie Figuur 4-1). Daarnaast is het verschil tussen de grootte van de plaques, geïnduceerd door GKV en DENV, niet significant. Vervolgens werd het effect van beide ‘plaquing’ media op de vorming van het aantal plaques bestudeerd (vergelijking van de gevoeligheid van beide ‘plaque assays’). Hiertoe werden confluente cellagen respectievelijk geïnfecteerd met een 1 op 1,5-verdunning van beide virussen. Van deze verdunningen werd verwacht dat ze, gebaseerd op de hierboven bekomen resultaten, mooi afgelijnde en duidelijk te kwantificeren plaques zouden opleveren. Het experiment werd uitgevoerd in drievoud. Het aantal bekomen plaques werd gekwantificeerd en vervolgens omgerekend naar ‘plaque forming
Tabel 4-1 – Aantal PFU/ml berekend op basis van het aantal plaques geïnduceerd door GKV en DENV bij het gebruik van agar en Avicel als ‘overlay’-media.
units’ (PFU) per ml (zie Tabel 4-1). Bij het gebruik van Avicel werden 3 en 4 keer meer plaques geobserveerd voor respectievelijk het gele koorts virus en dengue virus. Het aantal grote
Agar Avicel
GKV (PFU/ml) 3,67E+06 9,38E+06
DENV (PFU/ml) 1,13E+05 4,14E+05
plaques dat met agar en Avicel wordt waargenomen, is ongeveer gelijk. Het verschil wordt echter gemaakt door de aanwezigheid van duidelijk geïsoleerde kleine plaques die niet
Resultaten
53
GKV 1/1000 %-Agar ‘overlay’: 0,5%
0,75%
1%
1,25%
%-Avicel ‘overlay’: 0,5%
0,75%
1%
1,25%
%-Agar ‘overlay’: 0,5%
0,75%
1%
1,25%
%-Avicel ‘overlay’: 0,5%
0,75%
1%
1,25%
DENV 1/40 000
Figuur 4-1 – Weergave van invloed van verschillende percenten agar en Avicel (0,5; 0,75; 1 en 1,25% massa/volume) als ‘overlay’-medium op plaquevorming in wells van een 6-wellplaat waarvan de Vero cellaag geïnfecteerd zijn met 1/1000 GKV of met 1/40 000 DENV. Er is zowel bij GKV als bij DENV duidelijk waar te nemen dat de grootte van de plaques kleiner wordt naarmate het percentage agar vergroot, terwijl de plaquegrootte nagenoeg onafhankelijk is van het percentage Avicel. De donkergekleurde stukjes zijn gekleurde restjes Avicel ‘overlay’.
verschil wordt echter gemaakt door de aanwezigheid van duidelijk geïsoleerde kleine plaquete Resultaten
54
te zien zijn bij een agar ‘overlay’. Tevens kan uit Tabel 4-1 worden afgeleid dat het aantal PFU/ml bij het gele koorts virus een factor 10 groter is dan bij het dengue virus. Voor het verdere verloop van de experimenten zal dus worden geopteerd voor het gebruik van 1% Avicel als plaquing medium boven agar, niet alleen omwille van het gebruiksgemak, maar ook omdat (1) flavivirussen grotere en beter afgelijnde plaques vormen en (2) met Avicel meer plaques, in het bijzonder kleine plaques, kunnen worden waargenomen, waarschijnlijk geïnduceerd door minder replicatiecompetente virussen.
4.2. FENOTYPISCHE EVALUATIE VAN RESISTENTIE VAN HET GELE KOORTS VIRUS EN DENGUE VIRUS TEGEN MOLECULEN VAN DE
GPYA-SERIE 4.2.1. Voorgeschiedenis van de GPYA-serie In 2005-2006 werd een intensief screening programma opgestart met als doel de identificatie van niet-nucleoside inhibitoren van de flavivirus replicatie. Eén van de klassen van moleculen waarvan de antivirale activiteit werd geëvalueerd, was de GPC- en GPC-N-serie, gesynthetiseerd door Prof. Dr. G. Pürstinger en eerder al actief bevonden tegen de replicatie van picornavirusen. In deze serie werd GPC-N27 geïdentificeerd als inhibitor van de replicatie van het gele koorts virus, en later GPC-N20 en GPC-N32 als inhibitoren van de dengue virus replicatie. Deze moleculen vormden vervolgens de basis voor het opzetten van een structuuractiviteitsrelatie in een poging de activiteit en selectiviteit van deze ‘lead’moleculen op te drijven: de GPYA-serie. Uit deze serie bleken GPYA-4, -14 en -18 voldoende activiteit en selectiviteit te vertonen voor het starten van de zoektocht naar het werkingsmechanisme van deze moleculen tegen het gele koorts virus; hetzelfde werd vastgesteld voor GPYA-14, GPC-N20 en -32 tegen het dengue koorts virus. De 50% effectieve concentratie (EC50) werd enerzijds bepaald met behulp van een ‘CPE reduction assay’ met de volgende resultaten: EC50 GPYA-4 (2,41 ± 10,3 µg/ml), GPYA-14 (4,4 ± 0,1 µg/ml) en GPYA-18 (1,9 ± 0,9 µg/ml) voor het gele koorts virus en GPYA-14 (4,3 ± 0,8 µg/ml), GPC-N20 (3,0 µg/ml) en GPC-N32 (4,2 µg/ml) voor het dengue virus. Anderzijds werd behulp van een RT-qPCR de EC50 bepaald van GPYA-4 (1,6 µg/ml), GPYA-14 (0,6 µg/ml) en GPYA-18 (0,6 µg/ml) voor het gele koorts virus en GPYA-14 (0,2 ± 0,03 µg/ml), GPC-N20 (1,3 ± 1,4 µg/ml) en GPC-N32 (0,8 ± 0,7 µg/ml) voor het dengue virus. Beide
Resultaten
55
virussen werden vervolgens voor in totaal 26 passages opgegroeid bij stijgende concentraties van de respectievelijke antivirale middelen teneinde resistentie te induceren tegen deze moleculen en de resistente viruspopulaties aan te reiken (deze experimenten werden uitgevoerd door Dr. Suzanne Kaptein).
4.2.2. Karakterisatie van de verschillende virusisolaten Om fenotypische evaluatie van resistentie mogelijk te maken, werd eerst een grotere hoeveelheid te fenotyperen virus opgekweekt in aanwezigheid van een zo hoog mogelijke concentratie (enige kristalvorming kan daarbij optreden) van de respectievelijke antivirale moleculen. Dit werd gedaan voor virus afkomstig van passage 15 en passage 26 van de resistentiekweek. De naamgeving van de verschillende virusisolaten, zoals in het verdere verloop van de experimenten zal worden gebruikt, is weergegeven in Tabel 4-2.
Compound
GKVGKVGKVGKVDENVDENVDENVDENV-
Passage nr.
Virus
Tabel 4-2 – Overzicht van de naamgeving van de verschillende virusisolaten van passage 15 en passage 26 met de hoogst mogelijk bruikbare concentratie van het respectievelijke antivirale molecule. GKV = gele koorts virus, DENV = dengue koorts virus, P = passage en WT = wildtype.
Concentratie waarbij het virus wordt opgekweekt
P15P15P15P15P26P26P26P26-
WT GPYA-4 GPYA-14 GPYA-18 WT GPYA-14 GPC-N20 GPC-N32
Wildtype GKV, opgekweekt in afwezigheid van enig molecule GKV, opgekweekt in aanwezigheid van 10 µg/ml GPYA-4 GKV, opgekweekt in aanwezigheid van 20 µg/ml GPYA-14 GKV, opgekweekt in aanwezigheid van 10 µg/ml GPYA-18 Wildtype DENV, opgekweekt in afwezigheid van enig molecule DENV, opgekweekt in aanwezigheid van 20 µg/ml GPYA-14 DENV, opgekweekt in aanwezigheid van 10 µg/ml GPC-N20 DENV, opgekweekt in aanwezigheid van 5 µg/ml GPC-N32
De celculturen werden regelmatig gecontroleerd op tekenen van CPE, zoals cellen die loskomen en het ontstaan van gaten in de confluente cellaag. De ontwikkeling van CPE na infectie met de verschillende isolaten van GKV of DENV, bekomen na 15 passages in aanwezigheid van de respectievelijke moleculen, vertoonde, in vergelijking met onbehandeld wildtype (WT) virus, nog steeds enige mate van inhibitie. GPYA-4 onderdrukte de
Resultaten
56
ontwikkeling van het cytopathogeen effect van het gele koorts virus nog steeds redelijk sterk, terwijl het inhiberend effect van GPYA-14 of -18 minder uitgesproken was. In het geval van DENV werd eveneens nog onderdrukking van CPE waargenomen waarbij GPC-N32 > GPYA-14 > GPC-N20. Voor virus afkomstig van passage 26 werden gelijkaardige observaties gedaan alhoewel het inhiberend effect van alle moleculen minder uitgesproken was. Inhibitie van CPE impliceert echter niet noodzakelijk inhibitie van virusreplicatie (zie verder). Vervolgens werd de hoeveelheid virus in de verschillende isolaten gekwantificeerd door middel van twee complementaire technieken: (1) RT-qPCR werd gebruikt om de hoeveelheid viraal RNA te kwantificeren dat werd vrijgezet onder vorm van virions in het supernatans van geïnfecteerde (en al dan niet behandelde) celculturen (zie Real-time RT-qPCR, Materiaal & Methoden 2.2.5.) en (2) ‘plaque forming assays’ in afwezigheid van enig antiviraal molecule werden gebruikt om de hoeveelheid infectieuze eenheden (PFU) in de verschillende stalen te kwantificeren (uitgevoerd in drievoud). De bekomen resultaten werden omgerekend naar respectievelijk RNA-kopijen/ml en PFU/ml (Tabel 4-3). De resultaten in Tabel 4-3 geven aan dat RT-qPCR een aanzienlijk gevoeligere (factor 2 à 3 log10 voor GKV en 4 à 5 log10 voor DENV) techniek is vergeleken met ‘plaque assays’ voor kwantificatie van de hoeveelheid aanwezig virus en ook dat beide technieken complementair zijn (wat niet noodzakelijk altijd het geval is). Voor het gele koorts virus wordt de inhibitie van de ontwikkeling van CPE in aanwezigheid van de respectievelijke moleculen (cf supra) in deze data (Tabel 4-3) gereflecteerd door een onderdrukking van de vrijzetting van viraal RNA in het supernatans onder de vorm van virions (zoals gekwantificeerd met RT-qPCR) en als infectieuze virusdeeltjes (zoals gekwantificeerd door ‘plaque assays’). In het geval van dengue virus blijkt de hoeveelheid virus, vrijgezet in het supernatans in aanwezigheid van GPC-N32, groter te zijn dan bij de andere moleculen, en zelfs 1,4 à 4 keer groter dan voor het wildtype virus (Tabel 4-3).
Resultaten
57
Tabel 4-3 – Kwantificatie van de hoeveelheid virus in de verschillende virusisolaten van passage 15 en 26 van respectievelijk GKV en DENV met behulp van (1) RT-qPCR (RNA-kopijen/ml) en (2) ‘plaque forming assays’ in afwezigheid van enig antiviraal molecule (PFU/ml). De log10 van de verhouding RNA-kopijen/PFU is een maat voor het verschil in gevoeligheid van beide technieken.
Virus
Virusisolaat
GKV
GKV-P15-WT GKV-P15-GPYA-4 GKV-P15-GPYA-14 GKV-P15-GPYA-18 GKV-P26-WT GKV-P26-GPYA-4 GKV-P26-GPYA-14 GKV-P26-GPYA-18 DENV DENV-P15-WT DENV-P15-GPYA-14 DENV-P15-GPC-N20 DENV-P15-GPC-N32 DENV-P26-WT DENV-P26-GPYA-14 DENV-P26-GPC-N20 DENV-P26-GPC-N32
RNAkopijen/ml 1,04E+09 3,05E+07 9,25E+07 9,88E+07 5,59E+07 1,11E+07 1,09E+07 2,77E+07 1,36E+10 8,96E+09 7,44E+09 3,46E+10 8,17E+09 1,05E+09 1,18E+10 1,27E+10
PFU/ml 8,14E+05 7,35E+05 4,10E+05 4,69E+04 8,25E+05 2,00E+05 2,50E+05 1,50E+05 7,38E+04 3,84E+04 3,88E+04 1,03E+06 6,82E+04 9,06E+04 2,00E+05 2,95E+05
Log10 (RNA-kopijen/PFU) 3,1 1,6 2,4 3,3 1,8 1,7 1,6 2,3 5,3 5,4 5,3 4,5 5,1 4,1 4,8 4,6
In Figuur 4-2 komen ook morfologische verschillen van de plaques geïnduceerd door verschillende virusisolaten op de voorgrond. De plaques geïnduceerd door GKV-P15/26GPYA-18 zijn opmerkelijk groter dan deze van de overige GKV isolaten en hebben bij passage 26 een opmerkelijk ‘omelet’-uitzicht in plaats van het klassieke ‘transparante schijf”uitzicht (reproduceerbaar resultaat). De plaques, geïnduceerd door DENV-P15/26-GPC-N32 A
GKV-P15-
WT
1/100 000
B
GPYA-4 1/100 000
C
GPYA-14 1/100 000
GPYA-18 1/100 000
GKV-P26-
WT
1/5 000
D
DENV-P15-
GPYA-14 1/5 000
GPC-N20
GPC-N32
GPC-N32
1/5 000
1/5 000
DENV-P26-
WT
GPYA-4
GPYA-14
GPYA-18
WT
GPYA-14
GPC-N20
1/100 000
1/10 000
1/10 000
1/10 000
1/5 000
1/5 000
1/5 000
1/5 000
Figuur 4-2 – ‘Plaque forming assay’ uitgevoerd met verschillende virusisolaten afkomstig van passage 15 (A en C, respectievelijk voor GKV en DENV) en 26 (B en D, eveneens respectievelijk voor GKV en DENV) van de resistentiekweek. De verdunning waarmee de assay werd uitgevoerd, is cursief weergegeven.
Resultaten
58
(Figuur 4-2 – C en D), zijn opmerkelijk kleiner dan deze van de overige virusisolaten. De plaque morfologie van het wildtype DENV bij passage 15 is groter dan bij passage 26 (Figuur 4-2 – C en D).
4.2.3. Evaluatie van Resistentie ‘Plaque reduction assays’ laten toe om inhibitie van virusreplicatie te kwantificeren aan de hand van het aantal plaques dat wordt gevormd. De experimenten werden uitgevoerd met een (vooraf bepaalde) virusverdunning waarmee een 20-tal duidelijk afgelijnde plaques per well werd bekomen. Elk experiment werd in zesvoud uitgevoerd bij een concentratiereeks van de antivirale molecule (10; 3; 1; 0,3; 0,1 en 0,03µg/ml; zie Materiaal & Methoden, 2.2.4.2.). Het aantal getelde plaques werd omgerekend naar aantal PFU/ml en de
10
log mediaan werd
vervolgens grafisch uitgezet in functie van de concentratie van het antiviraal molecule (zie Figuur 4-3 voor GKV en Figuur 4-4 voor DENV). Volgende observaties konden worden gemaakt voor GKV: (1) De antivirale activiteit van GPYA-4 tegen het wildtype virus wordt weerspiegeld in een duidelijke dosisafhankelijke afname van de vrijzetting van infectieus virus in het supernatans van behandelde, geïnfecteerde celculturen. Alhoewel de titer van het virus, dat reeds voor 26 passages in aanwezigheid van GPYA-4 werd opgekweekt (GKV-P26GPYA-4), over de ganse lijn ongeveer 1 log10 lager is dan die van het wild-type, wordt er bij toename van de concentratie van GPYA-4 geen inhibitie van plaquevorming waargenomen (Figuur 4-3 – Panel A). (2) Met de molecule GPYA-14 is er geen duidelijk antiviraal effect waar te nemen op de replicatie van het wildtype virus (Figuur 4-3 – Panel B, GKV-P26-WT) of op het virus dat voor 26 passages werd opgegroeid in aanwezigheid van GPYA-14 (GKV-P26-GPYA-14). Opmerkelijk is wel dat de titer van het wildtype virus ongeveer 2 log10 hoger is dan voor GKV-P26-GPYA-14. (3) De resultaten bekomen met GPYA-18 zijn sterk vergelijkbaar met de resultaten bekomen voor GPYA-14: er is geen dosisrespons effect waarneembaar noch bij het wildtype virus noch bij bij GKV-P26-GPYA-18 (Figuur 4-3 – Panel C). Voor dit laatste zijn er geen data beschikbaar bij 10 µg/ml omdat het niet mogelijk was voor deze conditie de plaques duidelijk te onderscheiden. Opmerkelijk is wel dat het aantal PFU/ml voor GKV-P26GPYA-18 ongeveer 10 keer hoger dan bij het wildtype.
Resultaten
59
Observaties die gemaakt zijn voor gelijkaardige experimenten uitgevoerd met DENV zijn: (1) GPYA-14 blijkt niet in staat te zijn om een reductie van het aantal plaques te induceren bij het wildtype virus (DENV-P26-WT) of bij DENV dat voor 26 passages in aanwezigheid van dit molecule werd opgekweekt (Figuur 4-4 Panel A, DENV-P26-GPYA-14). Het aantal PFU/ml dat wordt waargenomen voor beide virusisolaten is van dezelfde grootteorde. (2) Ook in het geval van GPC-N20, en dit zowel voor het DENV-P26-WT als DENV-P26GPC-N20, wordt met de ‘plaque forming assays’ geen dosisresponseffect waargenomen. Echter, in vergelijking met de titer van het wildtype, is deze van het virus dat voor 26 passages werd opgekweekt in aanwezigheid van GPC-N20, bijna 5 log10 lager (Figuur 4-4 – Panel B). (3) De observaties bekomen met GPC-N32 vertonen dezelfde trend, alhoewel met DENVP26-GPC-N32 een subtiele stijging van het aantal PFU/ml waar te nemen valt bij stijgende concentraties van GPC-N32. Het globale verschil in virustiter tussen DENVP26-WT en DENV-P26-GPC-N32 bedraagt ongeveer 1 log10 (Figuur 4-4 Panel C).
Resultaten
60
A Dosisrespons effect van GPYA-4 op GKV-P26-WT en GKV-P26-GPYA-4
7
Log PFU/ml
6 5 4 3 2 1 0 0,03 0,1
0,3
1
3
[] GPYA-4 in µg/ml GKV-P26-GPYA-4
10
GKV-P26-WT
B Dosisrespons effect van GPYA-14 op GKV-P26-WT en GKV-P26-GPYA-14
7
Log PFU/ml
6 5 4 3 2 1 0 0,03 0,1
0,3
1
3
[] GPYA-14 in µg/ml GKV-P26-GPYA-14
10
GKV-P26-WT
C Dosisrespons effect van GPYA-18 op GKV-P26-WT en GKV-P26-GPYA-18
7
Log PFU/ml
6 5 4 3 2 1 0 0,03 0,1
0,3
1
[] GPYA-18 in µg/ml GKV-P26-GPYA-18
3
10
GKV-P26-WT
Figuur 4-3 – Effect van GPYA-4 (Panel A), GPYA-14 (Panel B) en GPYA-18 (Panel C) op de replicatie van wildtype gele koorts virus passage 26 ( ; GKV-P26-WT,) en gele koorts virus dat werd opgegroeid voor 26 passages in aanwezigheid van de verschillende inhibitoren ( ; respectievelijk GKV-P26-GPYA-4, GKV-P26-GPYA-14 en GKV-P26-GPYA-18 voor Panel A, B en C). De mediaan van 6 onafhankelijke experimenten wordt weergegeven.
Resultaten
61
A Dosisresponseffect van GPYA-14 op DENV-P26-WT en DENV-P26-GPYA-14
7
Log PFU/ml
6 5 4 3 2 1 0 0,03 0,1
0,3
1
3
[] GPYA-14 in µg/ml DENV-P26-GPYA-14
10
DENV-P26-WT
B Dosisresponseffect van GPC-N20 op DENV-P26-WT en DENV-P26-GPC-N20
7
Log PFU/ml
6 5 4 3 2 1 0 0,03 0,1
0,3
1
3
[] GPC-N20 in µg/ml DENV-P26-GPC-N20
10
DENV-P26-WT
C Dosisresponseffect van GPC-N32 op DENV-P26-WT en DENV-P26-GPC-N32
7
Log PFU/ml
6 5 4 3 2 1 0 0,03 0,1
0,3
1
[] GPC-N32 in µg/ml DENV-P26-GPC-N32
3
10
DENV-P26-WT
Figuur 4-4 – Effect van GPYA-14 (Panel A), GPC-N20 (Panel B) en GPC-N32 (Panel C) op de replicatie van wildtype dengue koorts virus passage 26 ( ; DENV-P26-WT,) en dengue koorts virus dat werd opgegroeid voor 26 passages in aanwezigheid van de verschillende inhibitoren ( ; respectievelijk DENV-P26-GPYA-14, DENV-P26-GPC-N20 en DENVP26-GPC-N32 voor Panel A, B en C). De mediaan van 6 onafhankelijke experimenten wordt weergegeven.
Resultaten
62
In parallel met de ‘plaque forming assays’, werden ‘virus yield assays’ uitgevoerd waarbij de hoeveelheid viraal RNA, dat wordt vrijgezet onder de vorm van virions in het medium van (al dan niet) behandelde en geïnfecteerde celculturen, wordt gekwantificeerd met real-time quantitatieve RT-qPCR. Zoals eerder werd aangetoond, is RT-qPCR een meer gevoelige techniek dan een ‘plaque forming assay’ (zeker in het geval van DENV). Elk experiment werd in duplo uitgevoerd en de bekomen resultaten werden omgerekend naar het aantal RNAkopijen per milliliter. Volgende resultaten werden bekomen: (1) In tegenstelling tot het wildtype virus, waarvan de virusproductie aanzienlijk wordt geïnhibeerd in aanwezigheid van GPYA-4, blijkt globaal gezien de replicatie van GKV, dat voor 26 passages werd opgegroeid in aanwezigheid van GPYA-4, een factor 20 tot 60 minder gevoelig te zijn aan inhibitie door GPYA-4 (Figuur 4-5 – Panel A). Bij een concentratie van 1,25 µg/ml GPYA-4 wordt voor GPYA-WT meer dan 60% inhibitie waargenomen, terwijl de replicatie van GKV-P26-GPYA-4 onverstoord blijkt verder te gaan (0% inhibitie). (2) In het geval van GPYA-14 zijn de dosisresponscurves die werden bekomen voor GKVP26-WT en GKV-P26-GPYA-14 vergelijkbaar (ze overlappen elkaar) behalve bij de laagste concentraties, waarbij de remming van de replicatie van GKV-P26-GPYA-14 minder uitgesproken is dan die van GKV-P26-WT (Figuur 4-5 – Panel B). (3) Vergelijkbaar
met
de
waarnemingen
voor
GPYA-4,
werd
een
verschil
in
replicatiecompetentie van ongeveer 20% vastgesteld wanneer de replicatie van GKV, dat voor 26 passages werd opgegroeid in aanwezigheid van GPYA-18 (GKV-P26-GPYA18), werd vergeleken met deze van GKV-P26-WT. Bij een concentratie van 1,25 µg/ml bedraagt het verschil zelfs 88,77% (Figuur 4-5 – Panel C). Voor DENV werden de volgende observaties gedaan: (1) Voor GPYA-14 wordt er geen dosisresponseffect waargenomen; er is ook geen aantoonbaar verschil tussen de curves bekomen met DENV-P26-WT en DENV-P26GPYA-14 (Figuur 4-5 – D). (2) Het effect van GPC-N20 op de replicatie van DENV-P26-WT is echter significant groter (60%) dan op de replicatie van DENV dat voor 26 passages werd opgegroeid in aanwezigheid van GPC-N20 (DENV-P26-GPC-N20 14; Figuur 4-5 – E).
Resultaten
63
(3) Analoge waarnemingen werden gedaan wanneer de replicatiecompetentie van DENVP26-WT en DENV-P26-GPC-N32 werd vergeleken in aanwezigheid van GPC-N32: hier werd een verschil van 30% waargenomen (Figuur 4-5 – F). D
A
Dosisresponseffect van GPYA-14 op DENV-P26-WT en DENV-P26-GPYA-14
100
100
80
80
% RNA-kopij tov VC (met VC = 100%)
% RNA-kopij tov VC (met VC = 100%)
Dosisresponseffect van GPYA-4 op GKV-P26-WT en GKV-P26-GPYA-4
60
40
20
60
40
20
0
0 0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0
1
2
3
[] GPYA-4 in µg/ml GKV-P26-WT
4
5
6
7
8
9
10
8
9
10
8
9
10
[] GPYA-14 in µg/ml
GKV-P26-GPYA-4
DENV-P26-WT
B
DENV-P26-GPYA-14
E Dosisresponseffect van GPC-N20 op DENV-P26-WT en DENV-P26-GPC-N20
100
100
80
80
% RNA-kopij tov VC (met VC = 100%)
% RNA-kopij tov VC (met VC = 100%)
Dosisresponseffect van GPYA-14 op GKV-P26-WT en GKV-P26-GPYA-14
60
40
20
60
40
20
0
0 0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0
1
2
3
[] GPYA-14 in µg/ml GKV-P26-WT
4
5
6
7
[] GPC-N20 in µg/ml
GKV-P26-GPYA-14
DENV-P26-WT
C
DENV-P26-GPC-N20
F Dosisresponseffect van GPC-N32 op DENV-P26-WT en DENV-P26-GPC-N32
100
100
80
80
% RNA-kopij tov VC (met VC = 100%)
% RNA-kopij tov VC (met VC = 100%)
Dosisresponseffect van GPYA-18 op GKV-P26-WT en GKV-P26-GPYA-18
60
40
20
60
40
20
0
0
0
1
2
3
4
5
6
7
[] GPYA-18 in µg/ml GKV-P26-WT
GKV-P26-GPYA-18
8
9
10
0
1
2
3
4
5
6
7
[] GPC-N32 in µg/ml DENV-P26-WT
DENV-P26-GPC-N32
Figuur 4-5 – Effect van GPYA-4 (Panel A), GPYA-14 (Panel B) en GPYA-18 (Panel C) op de productie van viraal RNA vrijgezet in het medium van (al dan niet) behandelde en met gele koorts geïnfecteerde celculturen; effect van GPYA-14 (Panel D), GPC-N20 (Panel E) en GPC-N32 (Panel F) op de productie van viraal RNA vrijgezet in het medium van (al dan niet) behandelde en met dengue virus geïnfecteerde celculturen. De mediaan van 2 onafhankelijke experimenten wordt weergegeven
Resultaten
64
4.3. GENOTYPISCHE EVALUATIE VAN RESISTENTIE VAN HET GELE KOORTS VIRUS EN DENGUE VIRUS
4.3.1. Opzuivering van Plaques Zoals eerder werd aangehaald (paragraaf 4.1.3.), is Avicel als ‘overlay’-medium niet bruikbaar voor het isoleren van virus subspecies omwille van de relatieve vloeibaarheid van het medium en het feit dat de ‘overlay’ niet transparant is. Om resistente of zeer replicatiecompetente virussen uit een heterogene populatie op te zuiveren en aan te reiken, wordt daarom een uitverdunningsmethode gebruikt (Opzuivering van virussen door uitverdunning, Materiaal & Methoden, 3.2.3) (voorbeeld zie Figuur 4.6)
Figuur 4-6 – Opzuivering van resistente/replicatiecompetente virussen uit een heterogene viruspopulatie (GKV) in een 96well plaat met behulp van de uitverdunningstechniek. Bij elke well staat de verdunningsfactor van het virusinoculum weergegeven. Donkerblauwe wells duiden op een intacte confluente celmonolaag, terwijl in de lichtblauwe wells plaques waarneembaar zijn.
Resultaten
65
GKV-P261/5000
Deze techniek werd (al dan niet in
aanwezigheid
van
het
antivirale molecule waarbij het virus was opgegroeid tijdens de resistentiekweek) A B C D -WT-1 -GPYA-4-1 -GPYA-14-1 -GPYA-18-1 ---------------------------------------------------------------------DENV-P261/5000
achtereenvolgens
drie
keer
uitgevoerd startend met de virusisolaten
die
werden
bekomen na 15 en 26 passages van de resistentiekweek van zowel het gele koorts als het dengue virus. Na de derde
E -WT-1
opzuiverings-/aanrijkingsstap
F G H -GPYA-14-1 -GPC-N20-1 -GPC-N32-1
werden per conditie in totaal 10
Figuur 4-7 – ‘Plaque forming assays (verdunning 1/5000) uitgevoerd met de 4 geselecteerde virusisolaten van het gele koorts virus en dengue koorts virus, opgegroeid voor 26 passages, opgezuiverd/aangerijkt door drie uitverdunningsrondes en vervolgens opgekweekt in een 25cm² celcultuur, al dan niet in aanwezigheid van een antiviraal molecule.
à 20 aangerijkte/ opgezuiverde virusisolaten
bekomen,
waarvan van een viertal een stock werd aangelegd in 25cm²
cultuurflesjes (weerom al dan niet in aanwezigheid van het respectievelijke antivirale molecule waarbij het virus was opgegroeid). Van die vier werd telkens één isolaat geselecteerd voor
verdere
karakterisatie. Als
Tabel 4-4 – Kwantificatie van de hoeveelheid virus van telkens één van de verschillende opgezuiverde virusisolaten van passage 26 van respectievelijk GKV (A) en DENV (B) met behulp van RT-qPCR (RNA-kopijen/ml) en plaque forming assays in afwezigheid van enig antiviraal molecule (PFU/ml).
eerste
werd
de
10
Virus
RNAOpgezuiverde virusisolaat kopij/ml
GKV
GKV-P26-WT-1
4,24E+07
6,00E+05
1,8
gekwantificeerd
GKV-P26-GPYA-4-1
4,13E+07
1,28E+06
1,5
door
GKV-P26-GPYA-14-1
2,67E+07
1,60E+06
1,2
GKV-P26-GPYA-18-1
6,00E+07
1,55E+06
1,6
DENV-P26-WT-1
4,51E+09
5,13E+04
4,9
(Tabel 4-4 en
DENV-P26-GPYA-14-1
1,01E+09
1,30E+05
3,9
Figuur 4-7).
DENV-P26-GPC-N20-1
6,37E+09
2,00E+05
4,5
DENV-P26-GPC-N32-1
7,79E+09
3,60E+05
4,3
hoeveelheid virus middel
van RT-qPCR en
‘plaque
forming assays’
Resultaten
DENV
PFU/ml
Log(RNAkopij/PFU)
66
4.3.2. Sequenering van de opgezuiverde virusisolaten Met het opzuiveren en isoleren van de hierboven vermelde virussen is het onderzoek op een punt gekomen waarop met de genotypering kan worden gestart (Figuur 4-8, zie Sequenering, Materiaal & Methoden, 3.2.7.). Hiertoe werd reeds een eerste aanzet gegeven in dit onderzoekswerk, doch de reeds bekomen resultaten zijn nog te beperkt om tot conclusies te kunnen komen. Aanleg viruspopulatie na x passages resistentiekweek
Optimalisatie ‘plaque assays’
Kwantificatie viruspopulatie
Evaluatie dosisresponseffect van de molecule op virusreplicatie
Opzuivering van resistente/replicatiecompetente virussen: 1 virus Æ 10 à 20 virusisolaten
Genotypering
Figuur 4-8 – Grafische voorstelling van het uitgevoerde werk. In het eindwerk worden twee virussen bestudeerd, namelijk het gele koorts virus en het dengue koorts virus waarvan er van elk vier vierisolaten worden aangemaakt (3 mutanten die opgegroeid zijn gedurende de resistentiekweek in aanwezigheid van de overeenkomstige molecule en een wildtype). De volle pijl stelt het afgelegde pad voor tijdens de uitvoering van het eindwerk. De gebroken pijl duidt op het vervolg van het vooropgestelde eindwerk teneinde het werkingsmechanisme van selectieve antivirale moleculen te achterhalen.
Resultaten
67
DEEL V ALGEMENE BESPREKING & BESLUIT
5. ALGEMENE BESPREKING & BESLUIT Dit onderzoekswerk is opgebouwd uit twee delen: (1) het op punt stellen van een eenvoudig bruikbare ‘plaque assay’ waarbij agar versus Avicel als ‘overlay’-medium worden geëvalueerd en (2) evaluatie van fenotypische resistentie door middel van ‘plaque reduction’ en ‘virus yield assays’ na opzuivering/aanrijking van virusisolaten, die werden opgegroeid in aanwezigheid van moleculen met selectieve antivirale activiteit. Een ‘plaque forming assay’ is een basis techniek in de virologie waarmee de hoeveelheid infectieuze eenheden in een staal kan worden gekwantificeerd. De essentie van deze techniek ligt in het gebruik van een gelachtig medium dat snelle verspreiding (door diffusie) van nieuw-geproduceerde infectieuze virions belemmert, waardoor de cellaag slechts zeer lokaal wordt aangetast. Deze gelokaliseerde virusreplicatie is zichtbaar als een plaque. Agar wordt veel gebruikt in dergelijke ‘overlays’. Matrosovich en collega’s (2006) publiceerden Avicel als een meer gebruiksvriendelijk alternatief. Tijdens de voor dit onderzoekswerk uitgevoerde experimenten is inderdaad gebleken dat Avicel veel gebruiksvriendelijker is dan agar als ‘overlay’-medium, maar ook dat plaquevorming door het gele koorts en dengue koorts virus gefaciliteerd wordt: (1) in tegenstelling tot agar, is de plaquegrootte onafhankelijk gebleken van het gehalte Avicel in het ‘overlay’-medium en (2) met Avicel worden meer plaques waargenomen dan met agar, in het bijzonder kleine plaques die geïnduceerd zouden kunnen zijn door minder replicatiecompetente virussen. De experimenten met Avicel als ‘overlay’medium zijn dus niet alleen eenvoudiger uit te voeren, de gevoeligheid is beter dan met agar. Deel twee van dit onderzoekswerk werd gestart met het opgroeien van gele koorts en dengue koorts virus bij een hoge concentratie van de respectievelijke antivirale moleculen waarbij hetzelfde virus voor 15 of 26 passages was opgegroeid (resistentiekweek uitgevoerd door Dr. S. Kaptein). Alhoewel toch nog enige remming van de ontwikkeling van CPE werd waargenomen, waren de inhibitoren niet meer in staat om de cellaag volledig te beschermen tegen virusgeïnduceerd cytopathogeen effect (GPYA-4 > GPYA-14 > GPYA-18 voor gele koorts virus en GPC-N32 > GPYA-14 > GPC-N20 voor dengue koorts virus), wat een eerste indicatie was van de mogelijke aanwezigheid van resistent virus. De hoeveelheid virus per conditie werd gekwantificeerd met ‘plaque forming assays’ en ‘real-time quantitative RTPCR’. Beide technieken bleken complementair te zijn; doch de gevoeligheid van RT-qPCR was significant beter. Algemene Bespreking & Besluit
68
Voor resistentie fenotypering werden twee complementaire technieken gebruikt: ‘plaque reduction assays’ en ‘virus yield assays’. ‘Plaque reduction assays’ werden uitgevoerd om na te gaan of er een verschil is tussen het dosisafhankelijk effect van stijgende concentraties inhibitor op het wildtype virus versus het mogelijk resistente virus. Echter, enkel voor GPYA4 werd een (matig) dosisafhankelijk effect waargenomen op de replicatie van het wildtype gele koorts virus dat verdween als hetzelfde experiment werd uitgevoerd met gele koorts virus dat voor 26 passages werd opgekweekt in aanwezigheid van de molecule. Het is niet duidelijk waarom voor het wildtype gele koorts virus of wildtype dengue koorts virus bij behandeling met de respectievelijke inhibitoren geen dosisresponseffect wordt waargenomen met deze techniek. In parallel met de hierboven vermelde experimenten, werd de hoeveelheid viraal RNA in het medium van geïnfecteerde, met verschillende concentraties van inhibitor behandelde celculturen, gekwantificeerd met RT-qPCR. In het geval van het gele koorts virus werden voor het wildtype de verwachte dosisresponscurves bekomen. In vergelijking daarmee blijkt dat de replicatie van het gele koorts virus, dat voor 26 passages werd opgekweekt in aanwezigheid van één van de moleculen, duidelijk minder gevoelig te zijn (GPYA-4 > GPYA-18 > GPYA-14) aan inhibitie door de respectievelijke moleculen, wat wijst op de aanwezigheid van resistent virus. Voor het dengue virus kon hetzelfde worden vastgesteld met GPC-N20 > GPC-N32 > GPYA-14. Ter voorbereiding van de genotypering van de resistente virussen, werden verschillende virusisolaten opgezuiverd en aangerijkt in aanwezigheid van de respectievelijke inhibitoren met behulp van een uitverdunningstechniek. Per conditie werden minstens vier opgezuiverde virusisolaten opgekweekt, die vervolgens met behulp van RT-qPCR en ‘plaque forming assays’ werden gekwantificeerd. De resultaten bekomen in dit onderzoekswerk geven een eerste duidelijke indicatie van resistentie tegen de geselecteerde inhibitoren. Voor het bevestigen van deze resistentie, zal voor elk van de (per virus in totaal 4: 1 wildtype en 3 mutanten) geselecteerde virusisolaten de sequentie van het volledige genoom worden bepaald. Van de mutaties, die ongetwijfeld zullen worden gedetecteerd, zal vervolgens worden nagegaan of ze (1) al dan niet aanleiding geven tot een aminozuur-substitutie en (2) of deze mutatie uniek is vergeleken met sequenties van andere reeds gegenotypeerde virusisolaten. Indien een veelbelovende mutatie wordt Algemene Bespreking & Besluit
69
vastgesteld, zal de sequentie van dezelfde regio van alle andere virusisolaten (10 à 20), opgezuiverd in aanwezigheid van hetzelfde antivirale molecule, worden bepaald om de frequentie van deze mutatie na te gaan. Tegelijkertijd zal ook de sequentie van dezelfde genomische regio van virusisolaten, opgezuiverd in aanwezigheid van de andere antivirale moleculen, worden bepaald om na te gaan of de structuuranalogen eveneens aanleiding geven tot een (of dezelfde) mutatie. Vervolgens zullen ‘reverse genetics’ worden aangewend om te evalueren of dit nieuwe genotype effectief resulteert in het resistente fenotype.
Algemene Bespreking & Besluit
70
LITERATUURLIJST
LITERATUURLIJST Anonymous. (2004). Dengue. Nature Reviews Microbiology: Highlights: disease watch – focus, 2: 360-361. Alcon-LePoder, S., Sivard, P., Drouet, MT., Talarmin, A., Rice, C., Flamand, M. (2006). Secretion of flaviviral non-structural protein NS1 : from diagnosis to pathogenesis. In: New treatment strategies for dengue and other flaviviral diseases. Bock, G., Goode, J. (eds.). John Wiley & Sons Ltd., UK. 233-247. Barrett, A.D.T., Monath, T.P. (2003). Epidemiology and ecology of Yellow fever virus. In: The Flaviviruses: detection, diagnosis and vaccine development. Chambers, T.J., Monath, T.P. (eds). Elsevier Academic Press, USA. 235-289. Bazan, J.F., Fletterick, R.J. (1989). Detection of a trypsin-like serine protease domain in flaviviruses and pestiviruses. Virology, 171: 637-639. Borwski, P., Mueller, O., Niebuhr, A., Kalitzhy, M., Hwang, L.H., Schmitz, H., Siwechka, M.A., Kulikowski, T. (2000). ATP-binding domain of NTPase/helicase as a target for hepatitis C antiviral therapy. Acta Biochimica. Polonica., 47: 173-180. Borowski, P., Niebuhr, A., Mueller, O., Bretner, M., Felczak, K., Kulikowski, T., Schmitz, H. (2001). Purification and characterization of West Nile virus NTPase/helicase. Evidence for dissociation of the NTPase and helicase activities of the enzyme. Journal of Virology, 75: 3220–3229. Borowski, P., Lang, M., Haag, A., Schmitz, H., Choe, J., Chen, HM., Hosmane, R.S. (2002). Characterization of Imidazo[4,5-d]Pyridazine Nucleosides as Modulators of Unwinding Reaction Mediated by West Nile Virus Nucleoside Triphosphatase/Helicase: Evidence for Activity on the Level of Substrate and/or Enzyme. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 46(5): 1231-1239. Bray, M., Huggins, J. (1998). Antiviral therapy of haemorrhagic fevers and arbovirus infections. Antiviral Therapy, 3: 53-79. Bressanelli, S., Tomei, L., Roussel, A., Incitti, I., Vitale, R.L., Mathieu, M., De Francesco, R., Rey, F.A. (1999). Crystal structure of the RNA-dependent RNA polymerase of hepatitis C virus. Proceedings of the National Academy of Sciences, 96: 13034-13039. Bretner, M., Schalinski, S., Haag, A., Lang, M., Schmitz, H., Baier, A., Behrens, SE., Kulikowski, T., Borowski, P. (2004). Synthesis and evalution of ATP-binding site directed potential inhibitors of nucleoside triphosphatases/helicases and polymerases of hepatitis C and other selected Flaviviridae viruses. Antiviral Chemistry & Chemotherapy, 15: 35-52. Bretner, M., Baier, A., Kopanska, K., Najda, A., Schoof, A., Reinholz, M., Lipniacki, A., Piasek, A., Kulikowski, T., Borowski, P. (2005). Synthesis and biological activity of 1H-benzotriazole and 1H-benzimidazole analogues – inhibitors of the NTPase/helicase of HCV and of some related Flaviviridae. Antiviral Chemistry & Chemotherapy, 16: 315-326. Bruenn, J.A. (1991). Relationships among the positive strand and double strand RNA viruses viewed through their RNA-dependent RNA polymerases. Nucleic Acids Research, 19: 217-226.
Literatuurlijst
71
Calvert, A.E., Huan, C.YH., Kinney, R.M., Roehrig, J.T. (2006). Non-structural proteins of dengue 2 virus offer limited protection to interferon-deficient mice after dengue 2 virus challenge. Journal of General Virology, 87: 339-346. Centers for Disease Control (CDC). (2002). Dengue: Clinical and Public Health Aspects [online]. Beschikbaar op http://www.cdc.gov/ncidod/dvbid/dengue/slideset/ [datum van opzoeking: 15/09/2006] Centers for Disease Control (CDC). (2003). Dengue Facts [online].Beschikbaar op http://www.cdc.gov/ncidod/dvbid/dengue/facts.htm [datum van opzoeking: 07/02/2007] Centers for Disease Control (CDC). (2005). Dengue Fever [online]. Beschikbaar op http://www.cdc.gov/ncidod/dvbid/dengue/ [datum van opzoeking: 15/09/2006] Chanprapaph, S., Saparpakorn, P., Sangma, C., Niyomrattanakit, P., Hannongbua, S., Angsuthanasombat, C., Katzenheimer, G. (2005). Competitive inhibition of the dengue virus NS3 serine protease by synthetic peptides representing polyprotein cleavage sites. Biochemical and Biophysical Research Communications, 330: 1237-1246. Chu, J.J.H., Yang, P.L. (2007). c-Src protein kinase inhibitors block assembly and maturation of dengue virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 104(9): 3520-3525. Chung, K.M., Nybakken, G.E., Thompson, B.S., Engle, M.J., Marri, A., Fremont, D.H., Diamond, M.S. (2006). Antibodies against West Nile Virus Nonstructural Protein NS1 Prevent Lethal Infection through Fc γ Receptor-Dependent and –Independent Mechanisms. Journal of Virology: 80(3), 1340-1351. Crance, J.M., Scaramozzino, N., Jouan, A., Garin, D. (2003). Interferon, ribavirin, 6azauridine and glycyrrhizin : antiviral compounds active against pathogenic flaviviruses. Antiviral Research, 58: 73-79. Crotty, S., Maag, D., Arnold, J.J., Zhong, W., Lay, J.Y., Hong, Z., Andino, R., Cameron, C.E. (2000). The broad-spectrum antiviral ribonucleoside ribavirin is an RNA virus mutagen. Nature Medicine, 6: 1375-1379. Crotty, S., Cameron, C.E., Andino, R. (2001). RNA virus error catastrophe: direct molecular test by using ribavirin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 98: 6895-6900. Day, C.W., Smee, D.F., Julander, J.G., Yamshchikov, V.F., Sidwell, R.W., Morrey, J.D. (2005). Error-prone replication of West Nile virus caused by ribavirin. Antiviral Research, 67: 38-45. De Clercq, E., Cools, M., Balzarini, J., Snoeck, R., Andrei, G., Hosoya, M., Shigeta, S., Ueda, T., Minakawa, N., Matsuda, A. (1991). Antiviral Activities of 5-Ethynyl-1-beta-DRibofuranosylimidazole-4-Carboxamide and Related Compounds. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 35(4): 679-684. De Clercq, E. (1993). Antiviral agents: characteristics activity spectrum depending on the molecular target with which they interact. Advances in Virus Research, 42: 1-55. De Clercq, E. (2004). Antivirals and antiviral strategies. Nature Reviews Microbiology, 704 (2): 204-220. Diamond, M.S., Zachariah, M., Harris, E. (2002). Mycophenolic Acid Inhibits Dengue Virus Infection by Preventing Replication of Viral RNA. Virology, 304: 211-221.
Literatuurlijst
72
Egloff, MP., Benarroch, D., Selisko, B., Romette, JL., Canard, B. (2002). An RNA cap (nucleoside-2’-O-)-methyltransferase in the flavivirus RNA polymerase NS5: crystal structure and functional characterization. The EMBO Journal, 21(11): 2757-2768. Erikson, B., Helgstrand, E., Johansson, N.G., Larsson, A., Misiorny, A., Noren, J.O., Philipson, L., Stenberg, K., Stenig, G., Stridh, S., Öberg, B. (1977). Inhibition of influenza virus ribonucleic acid polymerase by ribavirin triphophate. Antimicrob. Agents Chemotherapy, 11: 946-951. CDC.
(2003). Dengue Facts [online].Beschikbaar op http://www.cdc.gov/ncidod/dvbid/dengue/facts.htm [datum van opzoeking: 07/02/2007]
FMC
BioPolymer. (1995). Avicel RC/LC Microcrystalline cellulose and carboxymethylcellulose sodium, NF. Specifications and analytical methods [online]. Beschikbaar op http://www.fmcbiopolymer.com/Portals/bio/Content/Docs/Pharmaceuticals/Avicel%20 RCCL.pdf [datum van opzoeking: 29/04/2007]
FMC Biopolymer. (2005a). FMC Microcrystalline Cellulose/Cellulose gel [online]. Beschikbaar op http://www.fmcbiopolymer.com/PopularProducts/FMCMicrocrystallineCellulose [datum van opzoeking: 26/04/2007] FMC
Biopolymer. (2005b). Avicel RC/CL [online]. Beschikbaar op http://www.fmcbiopolymer.com/Pharmaceuticals/Products/AvicelRCCL/tabid/574/Defa ult.aspx [datum van opzoeking: 29/04/2007]
Ganesh, V.K., Muller, N., Judge, K., Luan, CH., Padmanabhan, R., Murthy, K.H.M. (2005). Identification and characterization of nonsubstrate based inhibitors of the essential dengue and West Nile virus proteases. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 13: 257-264. Goodell, J.R., Puig-Basagoiti, F., Forshey, B.M., Shi, PY., Ferguson, D.M. (2006). Identification of Compounds with Anti-West Nile Virus Activity. Journal of Medical Chemistry, 49: 2127-2137. Gorbalenya, A.E., Koonin, E.V., Donchenko, A.P., Blinov, V.M. (1989a). Two related superfamilies of putative helicases involved in replication, recombination, repair and expression of DNA and RNA genomes. Nucleic Acids Res. 17: 8413-8440. Gorbalenya, A.E., Donchenko, A.P., Koonin, E.V., Blinov, V.M. (1989b). N-terminal domains of putative helicases of flavi-and pestiviruses may be serine proteases. Nucleic. Acids. Res., 17: 3889-3897. Green, S., Rothman, A. (2006) Immunopathological mechanisms in dengue and dengue hemorrhagic fever. Current opinion in Infectious Diseases, 19: 429-436. Graci, J.D., Cameron, C.E. (2006). Mechanisms of action of ribavirin against distinct viruses. Reviews in Medical Virology, 16: 37-48. Gu, B., Ouzunov, S., Wang, L., Mason, P., Bourne, N., Cuconati, A., Block, T.M. (2006). Discovery of small molecule inhibitors of West Nile virus using a high-throughput subgenomic replicon screen. Antiviral Research, 70: 39-50. Gubler, D.J. (2002). Epidemic dengue/dengue hemorrhagic fever as a public health, social and economic problem in the 21st century. Trends in Microbiology, 10 (2): 100103. Gubler, D.J. (2004). The changing epidemiology of yellow fever and dengue, 1900 to 2003: full circle? Comparative Immunology, Microbiology & Infectious Diseases, 27: 319-30. Literatuurlijst
73
Gubler, D.J. (2006). Dengue/dengue haemorrhagic fever: history and current status. In: New treatment strategies for dengue and other flaviviral diseases. Bock, G., Goode, J. (eds.). John Wiley & Sons Ltd., UK. 3-22. Harris, E., Holden, K.L., Edgil, D., Polacek, C., Clyde, K. (2006). Molecular biology of flavivirusses. In: New treatment strategies for dengue and other flaviviral diseases. Bock, G., Goode, J. (eds.). John Wiley & Sons Ltd., UK. 23-40. Henchal, E.A., Putnak, J.R. (1990). The Dengue Viruses. Clinical Microbiology Reviews, 3 (4): 376-396. Holden, K.L., Stein, D.A., Pierson, T.C., Ahmed, A.A., Clyde, K., Iversen, P.L., Harris, E. (2006). Inhibition of dengue virus translation and RNA synthesis by a morpholino oligomer targeted to the top of the terminal 3’ stem-loop structure. Virology, 344: 439452. Kim, S.-H., Bartholomew, D.G., Allen, L.B., Robins, R.K., Revankar, G.R. (1978). Imidazo[1,2-a]-s-triazine nucleosides. Synthesis and antiviral activity of N-bridgedhead guanine, guanosine, and guanosine monophosphate analogues of imidazo[1,2-a]-striazine. Journal of Medical Chemistry, 21: 883–889. Koonin, E.V. (1993). Computer-assisted identification of a putative methyltransferase domain in NS5 protein of flaviviruses and lambda 2 protein of reovirus. Journal of General Virology, 74: 733-740. Kuno, G., Chang, G.J., Tsuchiya, K.R., Karabatsos, N., Cropp, C.B. (1998). Phylogeny of the genus Flavivirus. Journal of Virology, 72: 73-83. Lee, E., Pavy, M., Young, N., Freeman, C., Lobigs, M. (2006). Antiviral effect of the heparan sulfate mimetic, PI-88, against dengue and encephalitic flaviviruses. Antiviral Research, 69: 31-38. Leyssen, P., Van Lommel, A., Drosten, C., Schmitz, H., De Clercq, E., Neyts, J. (2001). A novel model for the study of the therapy of Flavivirus infections using the Modoc virus. Virology, 73: 3108-3116. Leyssen, P., Charlier, N., Paeshuyse, J., De Clercq, E., Neyts, J. (2003). Prospects for antiviral therapy. In: The Flaviviruses: detection, diagnosis and vaccine development. Chambers, T.J., Monath, T.P. (eds). Elsevier Academic Press, USA. 511-553. Leyssen, P., De Clercq, E., Neyts, J. (2006). The Anti-Yellow Fever Virus Activity of Ribavirin is Independent of Error-Prone Replication. Molecular Pharmacology, 69 (4): 1461-1467. Liang, PH., Cheng, WC., Lee, YL., Yu, HP., Wu, YT., Lin, YL., Wong, CH. (2006). Novel Five-Membered Iminocyclitol Derivates as Selective and Potent Glycosidase Inhibitors: New Structures for Antivirals and Osteoarthritis. ChemBioChem, 7: 165-173. Liao, CL., Lin, YL., Wu, BC., Tsao, CH., Wang, MC., Liu, CI., Huang, YL., Chen, JH., Wang, JP., Chen, LK. (2001). Salicylates Inhibit Flavivirus Replication Independently of Blocking Nuclear Factor Kappa B Activation. Journal of Virology, 75(17): 78287839. Lindenbach, B.D., Rice, C.M. (2001). Flaviviridae: The viruses and their replication. In: Fiels Virology. Knipe, D.M., Howley, P.M. (eds). Vol. 1. Lippincott Williams and Wilkins, Philadelphia, 991-1041.
Literatuurlijst
74
Mackenzie, J.S., Gubler, D.J., Petersen, L.R. (2004). Emerging flaviviruses: the spread and resurgence of Japenese encephalitis, West Nile and dengue viruses. Nature Medicine Supplement, 10 (12): S98-S109. Malinoski, F.J., Hasty, S.E., Ussery, M.A., Dalrymple, J.M. (1990). Prophylatic ribavirin treatment of dengue type 1 infection in rhesus monkeys. Antiviral Research, 13(3), 139149. Mateu, G.P., Marchevsky, R.S., Liprandi, F., Bonaldo, M.C., Coutinho, E.S.F., Dieudonné, M., Caride, E., Jabor, A.V., Freire, M.S., Galler, R. (2007). Construction and biological properties of yellow fever 17D/dengue type 1 recombinant virus. Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, 101, 289-298. Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, HD. (2006). New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays. Virology Journal, 3: 63-70. Monath, T.P. (2001). Yellow fever: an update. Lancet Infectious Diseases, 1: 11-20. Morrey, J.D., Smee, D.F., Sidwell, R.W., Tseng, C. (2002). Identification of active antiviral compounds against a New York isolate of West Nile virus. Antiviral Research, 55: 107116. Mukhopadhyay, S., Kuhn, R.J., Rossmann, M.G. (2005). A structural perspective of the Flavivirus life cycle. Nature Reviews, 3: 13-22. Murakami, M., Ota, T., Nukuzuma, S., Takegami, T. (2005). Inhibitory Effect of RNAi on Japanese Encephalitis Virus Replication In Vitro and In Vivo. Microbiological Immunology, 49(12): 1047-1056. Mutebi, JP., Barrett, A.D.T. (2002). The epidemiology of yellow fever in Africa. Microbes and Infection, 4: 1459-1468. Niyomrattanakit, P., Winoyanuwattikun, P., Chanprapaph, S., Angsuthanasombat, C., Panyim, S., Katzenmeier, G. (2004). Identification of Residues in the Dengue Virus Type 2 NS2B Cofactor That Are Critical for NS3 Protease Activation. Journal of Virology, 78(24): 13708-13716. Neyts, J., Meerbach, A., McKenna, P., De Clercq, E. (1996). Use of the yellow fever virus vaccine strain 17D for the study of strategies for the treatment of yellow fever virus infections. Antiviral Research, 30: 125-132. Ojwang, J.O., Ali, S., Smee, D.F., Morrey, J.D., Shimasaki, C.D., Sidwell, R.W. (2005). Broad-spectrum inhibitor of viruses in the Flaviviridae family. Antiviral Research, 68: 49-55. Oliphant, T., Engle, M., Nybakken, G.E., Doane, C., Johnson, S., Huang, L., Gorlatev, S., Mehlop, E., Marri, A., Chung, K.M., Ebel, G.D., Kramer, L.D., Fremont, D.H., Diamond, M.S. (2005). Development of a humanized monoclonal antibody with therapeutic potential against West Nile virus. Nature Medicine, 11: 3944-3953. Ono, L., Wollinger, W., Rocco, I.M., Coimbra, T.L.M., Gorin, P.A.J., Sierakowski, MR. (2003). In vitro and in vivo antiviral properties of sulphated galactomannans against yellow fever virus (BeH111 strain) and dengue 1 virus (Hawaii strain). Antiviral Research, 60: 201-208. Ooi, E., Goh, K., Gubler, D.J. (2006). Dengue Prevention and 35 Years of Vector Control in Singapore. Emerging Infectious Diseases, 12 (6): 887-893.
Literatuurlijst
75
Patkar, C.G., Kuhn, R.J. (2006). Development of novel antivirals against flavivirusses. In: New treatment strategies for dengue and other flaviviral diseases. Bock, G., Goode, J. (eds.). John Wiley & Sons Ltd., UK. 41-56. Poch, O., Sauvaget, I., Delarue, M., Tordo, N. (1989). Identification of four conserved motifs among the RNA-dependent polymerase encoding elements. The EMBO J.ournal, 8: 3867-3874. Pugachev, K.V., Guirakhoo, F., Monath, T.P. (2005). New developments in flavivirus vaccines with special attention to yellow fever. Current Opinion in Infectious Diseases, 18: 387-394. Puig-Basagoiti, F., Tilgner, M., Forshey, B.M., Philpott, S.M., Espina, N.G., Wentworth, D.E., Goebel, S.J., Masters, P.S., Falgout, B., Ren, P., Ferguson, D.M., Shi, P.Y. (2006). Triaryl Pyrazoline Compound Inhibits Flavivirus RNA Replcation, 50 (4): 1320-1329. Pujol, CA., Estevez, JM., Carlucci, MJ., Ciancia, M., Cerezo, AZ., Damonte, EB. (2002); Novel DL-galactan hybrids from the red seaweed Gymnogongrus torulosusi are potent inhibitors of herpes simplex virus and dengue virus. Antiviral Chemistry & Chemotherapy, 13: 83-89. Qin, C.F., Qin, E.D. (2006). Capsid-targeted viral inactivation can destroy dengue 2 virus from within in vitro. Archives of Virology, 151: 379-385. Rankin, J.T.J., Eppes, S.B., Antczak, J.B., Joklik, W.K. (1989). Studies on the mechanism of the antiviral activity of ribavirin against reovirus. Virology, 168: 147-158. Solomon, T., Mallewa, M. (2001). Dengue and Other Emerging Flaviviruses. Journal of Infection, 42: 104-115. Stiasny, K., Kiermayr, S., Heinz, F.X. (2006). Entry functions and antigenic structure of flavivirus envelope proteins. In: New treatment strategies for dengue and other flaviviral diseases. Bock, G., Goode, J. (eds.). John Wiley & Sons Ltd., UK. 57-73. Steinkuhler, C., Biasiol, G., Brunetti, M., Urbani, A., Koch, U., Cortese, R., Pessi, A., De Francesco, R. (1998). Product inhibition of the hepatitis C virus NS3 protease. Biochemistry, 37 : 8899-8905. Tam, R.C., Lau, J.Y.N., Hong, Z. (2002). Mechanisms of action of ribavirin in antiviral therapies. Antiviral Chemistry & Chemotherapy, 12: 261-272. Takhampunya, R., Ubol, S., Houng, HS., Cameron, C.E., Padmanabhan, R. (2006). Inhibition of dengue virus replication by mycophenolic acid and ribavirin. Journal of General Virology, 87: 1946-1952. Thomas, S.J., Strickman, D., Vaughn, D.W. (2003). Dengue Epidemiology: virus epidemiology, ecology, and emergence. In: The Flaviviruses: detection, diagnosis and vaccine development. Chambers, T.J., Monath, T.P. (eds). Elsevier Academic Press, USA. 235-289. Tomori, O. (2002). Yellow fever in Africa: public health impact and prospects for control in the 21st century. Biomedica, 22(2): 178-210. Toltzis, P., Huang, A.S. (1986). Effect of ribavirin on macromolecular synthesis in vesicular stomatitis virus-infected cells. Antimicrob. Agents Chemotherapy, 29: 1010-1016. Toltzis, P., O’Connell, K., Patterson, J.L. (1988). Effect of phosphorylated ribavirin on vesicular stomatitis virus transcription. Antimicrob. Agents Chemotherapy, 32: 492497. Literatuurlijst
76
Valle, R.P.C., Falgout, B. (1998). Mutagenesis of the NS3 Protease of Dengue Virus Type 2. Journal of Virology, 72(1): 624-632. Wagner, E.K., Hewlett, M.J. (2004). Basic Virology. Blackwell Publishing, UK. 440 p. Wengler, G., Wengler, G. (1993). The NS 3 nonstructural protein of flaviviruses contains an RNA triphosphatase activity. Virology, 197: 265-273. Whitby, K., Pierson, T.C., Geiss, B., Lane, K., Engle, M., Zhou, Y., Doms, R.W., Diamond, M.S. (2005). Castanospermine, a Potent Inhibitor of Dengue Virus Infection In Vitro and In Vivo. Journal of Virology, 79(14): 8698-8706. World Health Organisation. (1997). ‘Technical Guide for Diagnosis, Treatment, Surveillance, Prevention, and Control of Dengue Haemorrhagic Fever’. WHO, Geneve. – Dengue haemorrhagic fever – 1997 (bundeltje) World Health Organisation. (2001). Yellow Fever [online].Beschikbaar op [datum van opzoeking: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs100/en/ 18/09/2006] World Health Organisation. (2005). Dengue Bulletin – Volume 29 [online]. Beschikbaar op http://www.searo.who.int/en/Section10/Section332_1097.htm [datum van opzoeking 07/02/2007] Wray, S.K., Gilbert, B.E., Knight, V. (1985). Effect of ribavirin triphophate on primer generation and elongation during influenza virus transciption in vitro. Antiviral Research, 5: 39-48. Wu, SF., Lee, CJ., Liao, CL., Dwek, RA., Zitzmann, N., Lin, YL. (2002). Antiviral Effects of an Iminosugar Derivative on Flavivirus Infections. Journal of Virology, 76(8): 35963604. Wyde, P.R., Gilbert, B.E., Ambrose, M.W. (1989). Comparison of the anti-respiratory syncytial virus activity and toxicity of papaverine hydrochloride and pyrazofurin in vitro and in vivo. Antiviral Research, 11: 15-26. Zimmerman, T.P., Deeprose, R.D. (1978). Metabolism of 5-amino-1-beta-Dribofuranosylimidazole-4-carboxamide and related five-membered heterocycles to 5’triphosphatases in human blood and L5178Y cells. Biochemical Pharmacology, 27(5): 709-716. Zhang, N., Chen, HM., Koch, V., Schmitz, H., Liao, CL., Bretner, M., Bhadti, V.S., Fattom, A.I., Naso, R.B., Hosmane, R.S., Borowski, P. (2003). Ring-Expanded (“Fat”) Nucleoside and Nucleotide Analogues Exhibit Potent in Vitro Activity against Flaviviridae NTPases/Helicases, Including Those of the West Nile Virus, Hepatitis C Virus, and Japanese Encephalitis Virus. Journal of Medical Chemistry, 46: 4149-4164.
Literatuurlijst
77
ADDENDUM I
I
