Cellulaire afweer tegen HIV: De CD8+ cel Antivirale Factor (CAF)

Cellulaire afweer tegen HIV: De CD8+ cel Antivirale Factor (CAF)

Rinske Drost Juni 2004

1

Cellulaire afweer tegen HIV: De CD8+ cel Antivirale Factor (CAF)

Rinske Drost 0152951 Begeleider: Adri Thomas Ontwikkelingsbiologie Faculteit Biologie Universiteit Utrecht Juni 2004

Plaatje van: www.nlm.nih.gov

2

Inhoudsopgave Samenvatting

4

1. Inleiding 1.1. Het immuunsysteem 1.2. HIV infectie 1.2.1. Historische achtergrond HIV 1.2.2. Verloop HIV infectie 1.2.3. Moleculaire biologie HIV 1.3. Verantwoording onderzoek

5 5 8 8 10 12 14

2. De CD8+ cel Antivirale Factor (CAF) 2.1. Identificatie CNAR en CAF 2.2. Kenmerken CAF 2.3. Kandidaten CAF 2.3.1. Cytokines en chemokines 2.3.2. Defensines 2.3.3. Overige kandidaten

16 16 18 21 21 25 29

3. Discussie

32

4. Referenties

37

3

Samenvatting De cellulaire immuunrespons vormt een belangrijk deel van de afweer van de gastheer tegen virale infectie. CD8+ T-cellen spelen een belangrijke rol bij deze cellulaire immuniteit. De CD8+ cel afweer tegen HIV heeft twee kanten: een cytotoxische en een noncytotoxische. Over de cytotoxische afweer tegen HIV is het meest bekend: geïnfecteerde cellen worden opgeruimd door CD8+ T-cellen. Er bleek geen relatie te zijn tussen de cytotoxische kant van de anti-HIV activiteit en de klinisch gezonde staat van ‘Long Term Non Progressors’ (LTNP) en ‘Exposed-Uninfected’ (EU) personen. De hoogste CD8+ cel Noncytotoxische Antivirale Respons (CNAR) werd gevonden in LTNP en was afwezig in personen met AIDS. Dit geeft een indicatie voor een correlatie tussen een sterke non-cytotoxische CD8+ cel anti-HIV activiteit en de gezonde klinische staat van LTNP en EU personen. CNAR blijkt gemedieerd te worden door een of meer oplosbare factoren, genaamd CD8+ cel Antivirale Factor (CAF). Aangezien CAF slechts in zeer kleine hoeveelheden geproduceerd wordt, is het zeer moeilijk om de identiteit van CAF te bepalen. Toch heeft men een aantal eigenschappen van CAF weten te bepalen, die zeer nuttig kunnen zijn bij het achterhalen van de identiteit van CAF. Een groot aantal interleukines, interferonen, chemokines, groeifactoren en andere cytokines met anti-HIV activiteit zijn bekeken als kandidaten voor CAF. Al deze kandidaten bleken niet alle kenmerken van CAF te vertonen, hetgeen suggereert dat CAF uit meerdere componenten bestaat. Wel heeft de zoektocht naar CAF een groot aantal nieuwe anti-HIV factoren aangetoond.

4

1. Inleiding Wanneer het immuunsysteem gedeeltelijk of helemaal niet meer functioneert, spreken we van immunodeficiëntie (Janeway et al., 2001). Zo’n 25 jaar geleden werd een nieuwe vorm van immunodeficiëntie geconstateerd, het ‘Acquired Immunodeficiency Syndrome’ of AIDS (Gallo & Montagnier, 1988). In deze inleiding zal eerst de algemene werking van het immuunsysteem behandeld worden. Hierin wordt toegespitst op de afweer van het immuunsysteem tegen infecties door virussen, aangezien AIDS veroorzaakt wordt door het ‘Human Immunodeficiency Virus’ of HIV (Gallo & Montagnier, 1988). Inmiddels is HIV het meest intensief bestudeerde virus in de geschiedenis. Na de ontdekking van AIDS en HIV heeft men heel veel onderzoek gedaan naar de werking van het virus, de moleculaire biologie van het virus en de manier waarop het virus het immuunsysteem weet uit te schakelen. Om duidelijk het kader van het uiteindelijke onderwerp van deze scriptie te schetsen, is het noodzakelijk om ook eerst deze onderwerpen te behandelen. 1.1. Het immuunsysteem Het immuunsysteem verdedigt de gastheer tegen infectie. De herkomst van alle cellen van het immuunsysteem ligt in het beenmerg. Hier vindt ook de maturatie van veel van deze cellen plaats. Vervolgens migreren deze cellen naar de perifere weefsels via het bloed en het lymfatisch systeem. Alle bloedcellen stammen af van eenzelfde precursor, de hematopoietische stamcel. Deze pluripotente stamcel differentieërt tot een lymfoïde progenitor of een myeloïde progenitor. Uit de lymfoïde progenitor ontstaan later de B- en Tcellen, uit de myeloïde progenitor ontstaan onder andere rode bloedcellen en bloedplaatjes, maar ook mestcellen, macrofagen, granulocyten en dendritische cellen (Janeway et al., 2001) (figuur 1). In het immuunsysteem maakt men onderscheid tussen de zogenaamde ‘innate immunity’ en de ‘acquired/adaptive immunity’. De erfelijke innate immunity is altijd aanwezig en neemt niet toe na blootstelling aan een pathogeen. De innate immunity is de eerste fase van de gastheerrespons op een infectie. Het is, na de huid, de tweede verdedigingslinie tegen pathogenen en is voornamelijk van belang bij de afweer tegen bacteriën en virussen. De belangrijkste componenten van de innate immunity zijn macrofagen en neutrofielen. Deze cellen reageren snel op een infectie door middel van fagocytose van pathogenen en via het uitscheiden van cytokines en chemokines. Cytokines zijn de boodschappermolekulen van de cellen van het immuunsysteem. Cytokines maken het mogelijk voor cellen om op afstand te communiceren. Cytokines zijn eiwitten afgegeven

5

door cellen, bijvoorbeeld lymfocyten, die het gedrag van andere cellen met specifieke cytokine-receptoren beïnvloeden. Chemokines zijn in staat cellen met chemokinereceptoren, zoals bijvoorbeeld neutrofielen en monocyten, aan te trekken naar de plaats van infectie. Dit proces wordt ook wel chemotaxis genoemd (Janeway et al., 2001).

Figuur 1. Oorsprong van de cellen van het immuunsysteem (van: www.biology.arizona.edu).

Uit de innate immunity heeft zich de acquired immunity ontwikkeld (Levy, 2001). De adaptieve immuunrespons wordt voornamelijk verzorgd door lymfocyten. Er zijn twee hoofdtypen lymfocyten: B-lymfocyten, die matureren in het beenmerg en T-lymfocyten, die matureren in de thymus. Antilichamen zijn het specifieke product van de adaptieve immuunrespons, ze worden gesecreteerd door B-cellen. Immuniteit gemedieerd door antilichamen wordt ook wel de humorale immuniteit genoemd. Antilichamen reageren op pathogenen in het bloed en de extracellulaire ruimten. Virussen repliceren echter in de cel waar ze onopgemerkt blijven voor antilichamen. Het doden van deze indringers is de functie van de T-cel (cell-mediated immune response). De adaptieve immuunrespons ontstaat niet op de eerste plek waar een pathogeen infectie veroorzaakt, maar vindt plaats in de perifere lymfoïde weefsels waar naïeve T-cellen continu migreren. Pathogenen of hun produkten worden via de lymfe of soms via het bloed naar het lymfoïde weefsel getransporteerd. Pathogenen die mucosale oppervlakken

6

geïnfecteerd hebben komen terecht in de tonsillen of in de ‘Peyer’s patches’, lymfeklieren van de darm. De pathogenen in het bloed komen terecht in de milt. De pathogenen die infectie veroorzaken op perifere plekken komen terecht in de dichtstbijzijnde lymfeknopen. Al deze lymfoïde organen bevatten cellen die in staat zijn antigenen op te nemen en aan Tcellen te presenteren, zoals bijvoorbeeld dendritische cellen. Dit gebeurt met behulp van de innate immuunrespons. Dendritische cellen, macrofagen en B-cellen brengen de gespecialiseerde costimulatoire molekulen tot expressie die nodig zijn om naïeve T-cellen te activeren. Dendritische cellen zijn in staat een grote variëteit aan pathogenen op te nemen en te presenteren en zijn de belangrijkste activatoren van naïeve T-cellen. Macrofagen en Bcellen zijn gespecialiseerd in het presenteren van geëndocyteerde pathogenen en oplosbare antigenen en zijn daarnaast de targetcellen van CD4+ T-cellen. Naïeve T-cellen circuleren continu tussen lymfoïde organen en bloed en komen daarbij in contact met vele Antigeen Presenterende Cellen (APCs). T-cellen die in contact komen met APCs en dus met specifieke antigenen prolifereren en differentiëren tot effector T-cellen. Het genereren van effector cellen uit naïeve T-cellen neemt enkele dagen in beslag. Daarna verlaten de effector T-cellen het lymfoïde orgaan en migreren via het bloed naar de plek van infectie. Een adaptieve immuunrespons wordt opgewekt wanneer een circulerende T-cel een specifiek antigen herkent op het oppervlak van een lichaamseigen cel. Deze antigenen zijn afkomstig van virussen die repliceren binnenin de cel of zijn binnengekomen via endocytose. T-cellen herkennen stukjes kleine peptiden gebonden aan een ‘Major Histocompatibility Complex’ of MHC-molekuul aan het oppervlak van de cel (Janeway et al., 2001).

Figuur 2. De twee klassen MHC met targetcellen en coreceptoren (van: www.shmu.edu.cn).

7

De humane versie van dit molekuul wordt soms ook wel ‘Human Leukocyte Antigen’ ofwel HLA genoemd, maar de term MHC wordt algemeen geaccepteerd (Engelhard, 1994). Er zijn twee typen MHC-molekulen: MHC klasse I en MHC klasse II, die onder andere verschillen in de peptiden die ze presenteren. MHC klasse I molekulen verzamelen peptiden uit het cytosol en zijn dus in staat fragmenten van virale eiwitten op hun oppervlakte te presenteren. MHC klasse II molekulen binden peptiden afkomstig uit intracellulaire vesicles en zijn dus in staat antigenen van fagocytische en B-cellen te presenteren. MHC klasse I molekulen bevinden zich op alle kernhoudende cellen, MHC klasse II molekulen alleen op antigeen presenterende cellen (APCs). Er zijn drie typen antigeen presenterende cellen: dendritische cellen, macrofagen en B-cellen. Er zijn twee hoofdtypen T-cellen die verschillen in het type MHC wat ze herkennen: cytotoxische T-cellen (CTLs) en T-helper cellen. De antigenspecifieke activatie van deze verschillende typen T-cellen is afhankelijk van co-receptoren. Cytotoxische T-cellen brengen de CD8 coreceptor tot expressie, die aan MHC klasse I molekulen bindt. T-helper cellen brengen de CD4 coreceptor met specificiteit voor MHC klasse II molekulen tot expressie (Janeway et al., 2001) (figuur 2). 1.2. HIV infectie 1.2.1. Historische achtergrond HIV

Zo’n 20 jaar geleden was men ervan overtuigd dat infectieziekten geen probleem meer zouden vormen in de westerse wereld. Men ging zich met name richten op non-infectieuze ziekten als kanker en hart- en vaatziekten. Begin jaren ’80 verscheen plotseling het ‘Acquired Immunodeficiency Syndrome’ ofwel AIDS. Een paar jaar later werd het ‘Human Immunodeficiency Virus’ ofwel HIV geïdentificeerd als de hoofdoorzaak van AIDS (Gallo & Montagnier, 1988). Er bleken twee verschillende typen HIV te bestaan, HIV1 en HIV2, die beiden lijken te zijn overgesprongen van aap op mens. HIV1 komt het meest voor en blijkt virulenter te zijn dan HIV2, dat met name in West-Afrika voorkomt (Gallo & Montagnier, 1988, Greene, 1993). Daarom richt men zich in het onderzoek naar HIV met name op HIV1 en dat zal in deze scriptie ook het geval zijn. Uit studies naar de divergentie tussen verschillende HIV stammen en mutatiesnelheid heeft men bepaald dat HIV in mensen tussen de 20 en 100 jaar aanwezig is. De vraag die hieruit voorkomt is waarom er dan nu pas sprake is van een epidemie. Men vermoedt dat het virus aanwezig was in kleine, geïsoleerde groepen mensen in Centraal-Afrika. Doordat

8

de manier van leven veranderde (migratie naar steden), wist HIV zich te verspreiden (Gallo & Montagnier, 1988). HIV kan zich onder andere verspreiden via sexuele gemeenschap, intraveneus drugsgebruik en bloedtransfusies (Gallo & Montagnier, 1988). HIV transmissie via bloedtransfusies is in de westerse wereld door uitgebreide controle van bloed inmiddels uitgesloten. In het westen zijn er remmers voor HIV progressie en HIV overdracht aanwezig, zoals bijvoorbeeld azidothymidine (AZT). AZT is onder andere in staat de kans dat HIV tijdens de zwangerschap wordt overgedragen van moeder op kind te verlagen. Bovendien zijn westerse mensen goed voorgelicht over de manieren waarop zij hun persoonlijk risico op infectie kunnen verlagen. Dit ontbreekt in de minder ontwikkelde landen. Daarom wordt AIDS meer en meer een ziekte van de Derde Wereld (Gallo & Montagnier, 1988) (figuur 3).

Figuur 3. HIV-prevalentie in de wereld (van: www.developmentgoals.org).

Hoewel er meer mensen sterven aan andere ziekten, zoals bijvoorbeeld malaria, dan aan AIDS, is AIDS toch de meest bestudeerde ziekte in de geschiedenis. Met name de snelle verspreiding van HIV en het ontbreken van een behandeling of vaccin maken deze ziekte zo alarmerend (Greene, 1993).

9

1.2.2. Verloop HIV infectie Kenmerkend voor het verloop van de HIV infectie is de lange latente periode voordat AIDS geconstateerd wordt. Deze lengte van deze periode verschilt van persoon tot persoon. Meestal is de tijd tussen het begin van de asymptomatische fase en het verschijnen van AIDS 3 tot 10 jaar (Haseltine & Wong-Staal, 1988). In de acute beginfase van de infectie repliceert het virus vrijuit en bevinden zich veel vrije virusdeeltjes in het bloed en andere lichaamsvloeistoffen (figuur 4).

Figuur 4. Het verloop van de HIV infectie (van: www.slic2.wsu.edu:82). Voor details, zie tekst.

Het virus is in staat T-helper cellen en macrofagen te infecteren. Het lichaam reageert hierop met een sterke immuunreactie. B-cellen produceren neutraliserende antilichamen tegen het virus. Tegen de tijd dat er antilichamen geproduceerd worden is de infectie al permanent. Dat wil zeggen dat integratie van het virale DNA in het gastheergenoom heeft plaatsgevonden. Nu zal elke keer dat de cel deelt ook het virale DNA gedupliceerd worden, waardoor de infectie permanent is. Geactiveerde CTLs zijn in staat veel virusgeïnfecteerde cellen te doden. Dit is een van de voornaamste oorzaken voor de initiële daling van het aantal T-helper cellen (figuur 4). Het vermogen van het lichaam om T-helper cellen te produceren wordt niet door het virus aangetast. De eerste symptomen van het virus zijn vaak griepachtig: koorts, spierpijn, gezwollen lymfeknopen, vaak gepaard met neurologische klachten (Haseltine & Wong-Staal, 1988). Deze neurologische klachten lijken voort te komen uit het feit dat het virus ook in staat is macrofagen te infecteren. Macrofagen zijn namelijk in

10

staat de ‘Blood-Brain barrier’ te passeren en zo kan het virus in de hersenen terechtkomen (Gallo & Montagnier, 1988). De symptomen verdwijnen wanneer de virusconcentratie in het bloed ofwel de ‘viral load’ daalt en het lichaam tijdelijk in staat is de hoeveelheid T-helper cellen weer op peil te krijgen (Haseltine & Wong-Staal, 1988). Maar toch blijft het virus latent aanwezig op plaatsen waar de infectie onzichtbaar is voor het immuunsysteem, waarschijnlijk onder andere in de lymfeknopen. Het grootste HIV-reservoir is niet het bloed, maar het lymfoïde weefsel, waar zich geïnfecteerde CD4+ T-cellen, monocyten, macrofagen en dendritische cellen bevinden. Deze cellen zijn zelf niet geïnfecteerd, maar dienen als het ware als een opslagplaats voor HIV-virusdeeltjes. Macrofagen en dendritische cellen kunnen replicerend virus bevatten zonder dat ze noodzakelijkerwijs gedood moeten worden en dienen zo als HIV-reservoir (Janeway et al., 2001). In de lymfeknopen komen T-cellen en andere immuuncellen samen om te reageren op infectie. HIV is in staat de lymfeknopen geleidelijk te beschadigen. Deze beschadiging van de lymfeknopen zou kunnen resulteren in het afnemende aantal CD4+ T-cellen in het bloed. De uiteindelijke stijging van de virusconcentratie in het bloed zou het gevolg kunnen zijn van de totaal niet meer functionerende lymfeknopen. De lymfeknopen zijn nu niet meer in staat virus efficiënt op te ruimen en het virus kan ontsnappen in de bloedsomloop (Greene, 1993). Tijdens de chronische fase van de infectie blijft het immuunsysteem goed functioneren en is de hoeveelheid aantoonbaar virus relatief laag (figuur 4). Tijdens deze fase van de infectie heeft de patiënt vaak vrijwel geen klachten. Toch neemt de viral load geleidelijk aan toe, terwijl de het aantal T-helper cellen geleidelijk afneemt. Zo’n 2 tot 10 jaar na het begin van de asymptomatische fase neemt de replicatie weer sneller toe en gaat de infectie zijn laatste fase in. Wanneer het aantal T-helper cellen onder de 200 komt, wordt de diagnose AIDS gesteld. Tijdens de laatste fase van de infectie neemt de viral load weer sterk toe en verdwijnt de immuunactiviteit vrijwel helemaal (figuur 4). Dit zorgt ervoor dat opportunistische ziekten zich kunnen manifesteren (Nowak & McMichael, 1995). De twee meest voorkomende opportunistische ziekten zijn Pneumocystis Carinii Pneunomia (PCP) en Kaposi Sarcoma (KS). PCP is een door een schimmel veroorzaakte longontsteking waarbij de interstitiële ruimtes van de longen zich vullen met vloeistof. KS is een vorm van vaatkanker die zich het eerst manifesteert in de huid en mucosale membranen. Bij AIDS-patiënten kan het zich verspreiden over het hele lichaam en zelfs interne organen beschadigen. In gezonde individuen is het immuunsysteem in staat deze ziekten af te weren, maar vaak zijn deze opportunistische ziekten de doodsoorzaak voor AIDS-patiënten (Greene, 1993).

11

1.2.3. Moleculaire biologie van HIV De levenscyclus van HIV is die van een retrovirus. Er zijn drie families van retrovirussen: oncovirussen, lentivirussen en spumavirussen. Oncovirussen veroorzaken, zoals de naam al zegt, kanker. Kenmerkend voor lentivirussen is een zeer langzame progressie. HIV is een lentivirus. Over spumavirussen is vooralsnog zeer weinig bekend. Er bestaan ook dierlijke varianten van retrovirale infecties. Zo infecteert het Simian Immunodeficiency Virus’ (SIV) niet-humane primaten, beïnvloedt het ‘Feline Immunodeficiency Virus’ (FIV) katten en infecteert het Visna virus schapen. Net als alle andere virussen kunnen retrovirussen niet repliceren zonder het systeem van de gastheercel over te nemen. Het genetisch materiaal van een retrovirus is RNA. Dit moet eerst omgezet worden in DNA (Gallo & Montagnier, 1988). Wanneer een HIV partikel in het lichaam van de gastheer terecht is gekomen, bindt het partikel aan een targetcel en injecteert zijn genetisch materiaal. Het viruspartikel bevat twee identieke RNA-strengen en de benodigde structurele eiwitten en enzymen. Het enzym reverse transcriptase, bestaande uit een DNA polymerase en een ribonuclease, is verantwoordelijk voor het omzetten van RNA in DNA. Dit enzym maakt eerst een enkelstrengs DNA-kopie van het virale DNA. Vervolgens wordt het oorspronkelijke RNA afgebroken door de ribonuclease en een tweede DNA-kopie gemaakt met de eerste als template (Haseltine & Wong-Staal, 1988) (figuur 6). Dan migreert het dubbelstrengs DNA naar de celkern. Daar zorgt het enzym integrase voor integratie van het virale DNA in het gastheergenoom (figuur 6). Nu zal elke keer dat de cel deelt ook het virale DNA gedupliceerd worden, waardoor de infectie permanent is.

Figuur 5. Een HIV-viruspartikel (van: medfak.narod.ru).

12

De produktie van nieuwe virusdeeltjes begint wanneer de ‘Long Terminal Repeats’ of LTRs, stukken DNA aan de uiteinden van het virale genoom, enzymen van de gastheer ertoe aanzetten het virale DNA om te zetten in RNA. Een deel van het RNA zal dienen als genetisch materiaal voor nieuwe virusdeeltjes, een ander deel zal bijdragen aan de produktie van de structurele eiwitten en enzymen voor het nieuwe virusdeeltje (Haseltine & Wong-Staal, 1988). Twee eiwitmolekulen migreren afzonderlijk naar de periferie van de cel, binden aan elkaar en stulpen uit het celmembraan. Het ene eiwitmolekuul zal de matrix van het virusdeeltje vormen, de ander de virale enzymen. Het zich vormende virusdeeltje trekt twee strengen RNA aan, die vervolgens geïncorporeerd worden. Het virusdeeltje snoert zich, ingesloten in een stukje membraan van de gastheer, af van de cel (figuur 6). Deze zogenoemde envelop van het virusdeeltje bevat envelopeiwitten in de vorm van spikes, die afzonderlijk van de andere eiwitten naar het celoppervlak getransporteerd worden. Elke spike bestaat uit drie subeenheden die op hun beurt weer bestaan uit twee componenten: gp120, een glycoprotein met een moleculaire massa van 120 kDa, en gp41. Gp120 bevindt zich buiten de cel, gp41 ligt ingebed in het virusmembraan (figuur 5).

Figuur 6. De replicatiecyclus van HIV (van: research.bidmc.harvard.edu). Voor details, zie tekst.

Gp120 en gp41 zijn essentieel voor het infecteren van nieuwe cellen (Haseltine & WongStaal, 1988). Het gp120 envelop eiwit kan binden aan CD4, een eiwit dat zich bevindt op het membraan van verschillende type cellen van het immuunsysteem. Wanneer gp120 bindt aan

13

een cel met CD4 en een chemokinereceptor fuseren de membranen van het virus en de cel onder invloed van het gp41 envelopeiwit. De chemokinereceptoren CCR5 en CXCR4 dienen als coreceptoren voor de HIV binding aan de cel. Vervolgens komt de inhoud van het virusdeeltje vrij in de cel. Cellen van het immuunsysteem met CD4 en chemokine receptoren op hun membraan zijn dendritische cellen, macrofagen, monocyten en met name T-helper lymfocyten. De laatste zijn dan ook de voornaamste targetcel van HIV. CCR5 bevindt zich op dendritische cellen, macrofagen en CD4 T-cellen, CXCR4 bevindt zich vrijwel alleen op Tcellen. Het vermogen van HIV om verschillende celtypen te infecteren, het zogenaamde tropisme van het virus, wordt bepaald door de aanwezigheid van deze specifieke receptoren op het celoppervlak. Er bestaan verschillende HIV varianten en het celtype dat ze infecteren wordt met name bepaald door het gebruik van de chemokinereceptor. De HIV varianten die geassocieerd worden met de primaire infectie gebruiken CCR5 als coreceptor en vereisen slechts een laag niveau van CD4 op het celoppervlak. Omdat vooral macrofagen CCR5 op hun oppervlak hebben en dus in het begin van de infectie geïnfecteerd raken, wordt ook wel gesproken van de ‘Macrophage-tropic’ of M-tropic variant. Deze HIV variant is niet in staat om syncytia te induceren en wordt dan ook Non Syncytia Inducing genoemd (NSI). Syncytia zijn grote cellen die zich vormen doordat meerdere cellen fuseren (Gallo & Montagnier, 1988). In tegenstelling tot de M-tropic variant van HIV infecteert de ‘Lymphocyte-tropic’ of T-tropic variant alleen T-cellen met hoge concentratie CD4 en gebruikt hiervoor de CXCR4 coreceptor. Deze HIV variant is wel in staat syncytia-vorming te induceren en wordt dan ook wel Syncytia Inducing (SI) genoemd. Het blijkt dat het M-tropic (NSI) fenotype van HIV vooral gevonden wordt in recent geïnfecteerde individuen en dus betrokken is bij de transmissie van HIV. Later in de infectie vindt de switch van CCR5 naar CXCR4 als coreceptor plaats (en van NSI naar SI) en dit blijkt gepaard te gaan met afname van de hoeveelheid CD4 T-cellen en progressie naar AIDS (Connor et al., 1997). Bewijs voor het belang van chemokinereceptoren bij HIV infectie komt voort uit studies naar exposeduninfected (EU) individuen. Dit zijn personen die ondanks herhaaldelijke blootstelling aan HIV niet geïnfecteerd raken. Eén reden van deze resistentie blijkt een mutatie in de CCR5 coreceptor te zijn. 1.3. Verantwoording onderzoek Normaliter leidt 75% van de HIV infecties binnen 10 jaar tot AIDS. Zoals reeds gezegd zijn een lage hoeveelheid CD4+ T-cellen en een hoge viral load kenmerkend voor deze aandoening. Er bestaat echter een kleine groep individuen die na HIV infectie voor meer dan 10 jaar asymptomatisch blijven en een stabiel aantal CD4+ T-cellen hebben zonder

14

antivirale medicijnen te nemen. Het profiel van deze zogenaamde Long Term Non Progressors (LTNP) of Long Term Survivors (LTS) lijkt sterk op dat van ongeïnfecteerde individuen. Deze groep individuen is dan ook zeer interessant om te bestuderen, aangezien zij wellicht unieke virologische en immunologische kenmerken hebben. Daarom is het nuttig om een uitgebreide vergelijking te maken tussen LTNP en progressors. Normaliter hangt het risico op infectie samen met het aantal blootstellingen aan het virus maar er bestaat ook een groep mensen die herhaaldelijk blootgesteld is aan HIV, maar niet geïnfecteerd geraakt is (Exposed-Uninfected; EU). Wellicht kan ook deze groep perspectief bieden voor nieuwe antiHIV therapieën. De huidige therapieën volstaan namelijk niet meer vanwege hun enorme pillenlast, bijwerkingen en resistentie. Om een goede vergelijking te kunnen maken tussen LTNP/EU en progressors is natuurlijk geprobeerd invloeden van leeftijd, sexe, etniciteit en lengte van de HIV infectie uit te schakelen door vergelijkbare klinische cohorten samen te stellen. Er zijn al een paar parameters bekend die bij kunnen dragen aan de gezonde klinische staat van LTNP en EU: •

Lage viral load of replicatie-defect virus

•

Resistentie van targetcellen (vb CCR5 mutatie)

•

HIV-specifieke antilichamen of cellen die in staat zijn infectie of verspreiding te voorkomen

Op deze parameters is uitvoerig getest en ze bleken in deze studies niet significant meer voor te komen in de LTNP- en de EU-groep dan in de controlegroep (Barker et al., 1998b). Aangezien de cellulaire immuunrespons een essentiële rol speelt in de afweer van de gastheer tegen virale infectie veronderstelde men dat deze cel-gemedieerde kant van het immuunsysteem wel eens verantwoordelijk zou kunnen zijn voor de klinisch gezonde staat van LTNP en EU personen.

15

2. De CD8+ cel Antivirale Factor (CAF) 2.1. Identificatie CNAR en CAF De cellulaire immuunrespons vormt een belangrijk deel van de afweer van de gastheer tegen virale infectie. Halverwege jaren '80 werd voor het eerst een effectieve anti-HIV cellulaire immuunrespons bij een HIV-geïnfecteerd individu waargenomen (Walker et al., 1991). CD8+ T-cellen spelen een belangrijke rol bij deze cellulaire immuniteit. CD8+ Tcellen blijken in staat HIV replicatie in geïnfecteerde CD4+ T-cellen te onderdrukken (Tsubota et al., 1989). Er is onderzoek gedaan naar het mechanisme waarop CD8+ cellen de HIV replicatie in CD4+ cellen weten te onderdrukken. Aangezien contact tussen CD8+ cellen en geïnfecteerde CD4+ cellen in eerste instantie noodzakelijk leek voor de inhibitie van virusgroei, ging men aanvankelijk uit van een cytotoxisch mechansime (Tsubota et al., 1989). De cytotoxische CD8+ T-cel afweer tegen HIV is al geruime tijd bekend en het mechanisme van werking wordt dan ook goed begrepen. Cytotoxische T-cellen (CTLs) zijn in staat virale antigenen gepresenteerd op het MHC van geïnfecteerde cellen te herkennen en vervolgens de geïnfecteerde cel te doden via lysis of apoptose. Apoptose is geprogrammeerde celdood. HIV kan CD4+ cellen ertoe aanzetten zelfmoord te plegen. Het molekuul wat hierbij een belangrijke rol speelt is gp120. Apoptose wordt geïnduceerd wanneer twee gp120-CD4 complexen ‘gecrosslinked’ worden door een antilichaam. Deze ‘crosslinking’ zet de CD4+ cel aan tot apoptose (Cohen, 1993). De antigenen van HIV die CTLs herkennen zijn voornamelijk epitopen van virale eiwitten als pol, nef, gag en env. Deze cytotoxische respons ontstaat vlak na de infectie, nog voordat er antilichamen aanwezig zijn, en zorgt waarschijnlijk voor de initiële daling van het aantal CD4+ T-cellen. Uit onderzoek is gebleken dat de cytotoxische T-cel reactie gedurende alle fasen van de HIV infectie aanwezig blijft en niet afneemt naarmate de ziekte vordert. Hoge CTL concentraties blijken niet in staat infectie te verhinderen (reviewed in Levy et al., 1996). Hieruit blijkt dat de cytotoxische T-cel respons niet geheel verantwoordelijk kan zijn voor de gezonde klinische staat van LTNP en EU. Andere studies hebben aangetoond dat CD4+ cellen niet geëlimineerd worden in een co-cultuur met CD8+ cellen (Walker et al., 1991). In deze studies is de cytotoxiciteit onderzocht door te kijken naar het aantal HIV-geïnfecteerde CD4+ cellen voor en na cocultuur met antivirale CD8+ cellen. Hieruit bleek dat een co-cultuur van CD8+ cellen met geïnfecteerde CD4+ cellen aanvankelijk zorgde voor een reductie van het aantal geïnfecteerde CD4+ cellen, maar 7 dagen later voor een toename van geïnfecteerde CD4+ cellen. Deze resultaten bevestigen dat suppressie van de virale replicatie in geïnfecteerde CD4+ cellen door CD8+ cellen niet veroorzaakt wordt door een cytotoxisch mechanisme.

16

CD8+ cellen blijken zelfs in staat een toename van HIV-geïnfecteerde cellen wel te kunnen vertragen, naar niet te kunnen voorkomen (Walker et al., 1991). Het bleek moeilijk om virus te isoleren uit T-celculturen van LTNP. Wanneer uit deze LTNP culturen echter de CD8+ cellen verwijderd werden, was er binnen een aantal dagen virusreplicatie te detecteren in de overgebleven cellen (Walker et al., 1991). Er blijkt dus wel virus aanwezig te zijn in deze cellen, maar de virusreplicatie wordt in toom gehouden door de CD8+ T-cellen. Deze in vitro bevindingen laten zien dat CD8+ cellen een rol spelen bij de controle van HIV replicatie zonder de virusgeïnfecteerde cellen te doden. Inmiddels hebben verscheidene groepen deze nieuwe activiteit van CD8+ cellen, de CD8+ cel Non-cytotoxische Antivirale Respons of CNAR, laten zien (Levy et al., 1996). Er zijn twee methoden gebruikt om deze CD8+ cel-specifieke activiteit aan te tonen: de endogene assay en de acute infectie assay. Bij de endogene assay worden de op natuurlijke wijze geïnfecteerde CD4+ cellen gekweekt in aanwezigheid van CD8+ cellen. Dit gebeurt met verschillende CD8+:CD4+ ratio’s. In de acute infectie assay worden ongeïnfecteerde CD4+ cellen geïnfecteerd met HIV, en opgekweekt met CD8+ cellen van LTNP, wederom met verschillende CD8+:CD4+ ratio’s. Het antivirale effect wordt bepaald door de virale replicatie bij verschillende CD8+:CD4+ ratio’s te vergelijken met de virale replicatie zonder CD8+ cellen. CNAR is in vitro aangetoond door CD8+ cellen van een LTNP te mixen met normale CD4+ cellen, die acuut geïnfecteerd waren met HIV. De virale replicatie bleek met meer dan 90% gereduceerd te worden. CD8+ cellen van progressors lukt dit vrijwel niet. Bovendien bleek dit ook veel efficiënter te gaan met CD8+ cellen van LTNP dan met CD8+ cellen van progressors: er waren ruim 3 keer zoveel CD8+ cellen van progressors dan van LTNP nodig om tot een 90% suppressie van de virale replicatie te komen (Levy et al., 1996). De resultaten van deze assays geven een indicatie voor een correlatie tussen een sterke antivirale respons en een gezonde klinische staat. De grootste CNAR activiteit wordt teruggevonden in LTNP en ontbreekt vrijwel geheel in mensen met AIDS. Deze antivirale activiteit van CD8+ T-cellen wordt teruggevonden in bloed en lymfeknopen van HIVgeïnfecteerde individuen (Levy et al., 1996). Terwijl de CTL respons afhankelijk is van MHC1 blijkt de non-cytotoxische anti-HIV activiteit niet door het MHC bepaald te worden (Mackewicz et al., 1998). Gelijksoortige waarnemingen zijn gedaan bij HIV2 en ‘Simian Immunodeficiency Virus’ of SIV. SIV replicatie in makaken bleek drastisch toe te nemen wanneer gebruikt gemaakt werd van een antilichaam tegen CD8+ T-cellen (Zhang et al., 2002). CNAR blijkt dus niet specifiek te zijn voor een bepaald type retrovirus: deze antivirale respons is in staat replicatie van zowel HIV1, HIV2 als ‘Simian Immunodeficiency Virus’ of SIV te inhiberen

17

(Levy et al., 1996). Bovendien is CNAR activiteit inmiddels ook gevonden bij malaria en hepatitis B infecties. Deze antivirale respons blijkt dus niet alleen voorbehouden aan HIV. CNAR verschijnt vlak na de HIV infectie, nog voordat er antilichamen aanwezig zijn (Mackewicz & Yang, 1994). CNAR lijkt samen met CTLs vlak na infectie het virus te controleren. Het is aangetoond dat CNAR de HIV transcriptie onderdrukt en niet ingrijpt op andere stappen in de virale replicatie (Mackewicz et al, 1995). Ook de CNAR die de EU individuen bezat bleek voldoende om in vitro infectie van andere cellen te voorkomen (Stranford et al., 1999). Dit zou kunnen betekenen dat CNAR ook bijdraagt aan het beschermen tegen HIV infectie. Het feit dat CD8+ cellen HIV replicatie niet via een cytotoxische reactie controleren, zou kunnen betekenen dat direct contact tussen CD8+ en CD4+ cellen niet noodzakelijk is. Om deze mogelijkheid te onderzoeken zijn HIV-geïnfecteerde CD4+ cellen ofwel direct in contact met CD8+ cellen of gescheiden van CD8+ cellen door een semi-permeabel membraan opgekweekt. Direct contact leidde zoals verwacht tot complete eliminatie van detecteerbare virale replicatie. Bij gebruik van een semi-permeabel membraan tussen de CD8+ en de CD4+ cellen bleek ook substantiële remming van de virale replicatie op te treden. Deze resultaten laten zien dat CD8+ cellen een of andere oplosbare antivirale factor produceren om HIV replicatie te onderdrukken. Deze factor staat nu bekend als de CD8+ cel antivirale factor of CAF. Voor complete suppressie van de HIV replicatie is wel direct contact tussen de twee celtypen nodig (Walker et al., 1991). CAF is ook aangetoond door geïnfecteerde CD4+ cellen bloot te stellen aan gefilterde supernatanten van gekweekte CD8+ cellen (reviewed in Levy et al., 1996). 2.2.

Kenmerken CAF

Deze non-cytotoxische antivirale CAF activiteit wordt slechts in zeer lage concentraties gevonden in de vloeistoffen van CD8+ celculturen en gekloneerde CD8+ cellen (Levy, 2003). Door deze zeer lage concentratie is het zuiveren van CAF vooralsnog niet gelukt, waardoor de identiteit van CAF voorlopig nog onbekend blijft (Geiben-Lynn, 2002). Toch heeft men enkele eigenschappen van deze factor weten te achterhalen, die wellicht kunnen bijdragen aan het achterhalen van de identiteit van CAF. CAF activiteit is waargenomen in de CD8+ T-cellen van SIV-geïnfecteerde makaken en HIV-geïnfecteerde chimpansees (Zhang et al., 2002). Bovendien blijkt ook CAF geproduceerd door CD8+ T-cellen van HIV2-geïnfecteerde bavianen de replicatie van HIV1 te onderdrukken (Locher et al., 1999) CAF blijkt in staat de replicatie van verschillende HIV stammen, zowel M-tropic als T-tropic, te onderdrukken en wordt het meest geproduceerd in

18

asymptomatische personen. Proliferatie en activatie van CD4+ cellen worden niet beïnvloed door de antivirale factor en wanneer geïnfecteerde CD4+ cellen verwijderd worden uit een omgeving met CAF neemt de HIV replicatie toe (Levy et al., 1996). De door CD8+ cellen gereduceerde HIV replicatie kan gemeten worden met behulp van drie parameters: Reverse Transcriptase (RT) activiteit, HIV eiwitsynthese en HIV RNA expressie. CAF activiteit lijkt virale transcriptie te inhiberen. Dit blijkt uit het feit dat de concentraties viraal RNA in geïnfecteerde cellen opgekweekt met CD8+ cellen gereduceerd is. Op dag 0 van het experiment bevatte 13% van de CD4+ cellen HIV RNA, maar na toevoeging van CD8+ cellen werd deze hoeveelheid met maar liefst 94% gereduceerd (op dag 2). Dus binnen twee dagen blijken CD8+ cellen in staat de produktie van viraal RNA en daarmee virale eiwitten in CD4+ cellen te remmen. Bovendien is aangetoond dat CAF-bevattend medium in staat is expressie van genen van de HIV ‘Long Terminal Repeat’ of LTR te blokkeren (Mackewicz et al., 1995). Het mechanisme van inhibitie van LTR activatie door CAF is nog niet bekend. Het is aangetoond dat CAF inhibitie van de LTR-gereguleerde genexpressie gemedieerd kan worden door cytokine-gestimuleerde activatie van ‘Nuclear Factor-κB’ ofwel NF-κB (reviewed in Chang et al., 2002). In 2002 is door Chang et al. verder onderzoek gedaan naar de moleculaire mechanismen van CAF-gemedieerde inhibitie van HIV. Zij hebben aangetoond dat dit inhiberende effect van CAF op de LTR activatie van HIV wordt gemedieerd via ‘Signal Transducers and Activators of Transcription’ ofwel STAT1 activatie. STATs zijn een familie cytoplasmatische eiwitten die bijdragen aan controle van de genexpressie als cellen in contact komen met hormonen, zoals cytokines (Darnell, 1997). STAT eiwitten zijn het eerst geïdentificeerd als transcriptiefactoren in interferon signaaltransductie systemen (Chang et al., 2002). Tot nu toe zijn er zeven STAT-genen in zoogdieren gevonden (Darnell, 1997). STAT eiwitten kunnen geactiveerd worden door een groot aantal extracellulaire stimuli, zoals cytokines, hormonen en groeifactoren. STAT eiwitten spelen een centrale rol in een groot aantal biologische activiteiten, zoals celdifferentiatie en de controle van celgroei. STATs hebben onder andere één enkele tyrosine fosforylatieplaats, een SH2-domein en een DNAbindingsplaats. STAT eiwitten worden geactiveerd door tyrosine fosforylatie, dimeriseren vervolgens via een SH2-domein en gaan de kern binnen om daar genexpressie te reguleren (Darnell, 1997). Er is geen bewijs dat zich een STAT bindingsplaats bevindt in de LTRs van HIV. Wel is er een bindingsplaats aanwezig voor de eiwitten van ‘Interferon Regulatory Factors 1 en 2’ ofwel IRF-1 en IRF-2. Het is bekend dat eiwitten van de IRF-familie gereguleerd worden door STAT eiwitten en geïnduceerd worden door een groot aantal stimuli. CAF is in staat STAT1 activatie en IRF-1 genexpressie te induceren. De activiteit van

19

CAF blijkt correlatie te vertonen met STAT1 activatie. Het inhiberende effect van CAF op HIV replicatie en LTR activatie was verdwenen in STAT1-deficiënte cellen en cellen die een STAT1 dominant negatieve mutant tot expressie brachten. Wanneer er STAT1-eiwitten aan deze STAT1-deficiënte cellen toegevoegd worden, bleek de inhiberende functie van CAF zich te herstellen. Daarnaast werd aangetoond dat CAF in staat was de expressie van ‘Interferon Regulatory Factor 1’ ofwel IRF-1 te induceren en dat de IRF-1 gen inductie STAT1afhankelijk was. Al deze resultaten laten zien dat CAF STAT1 activeert, wat vervolgens leidt tot inductie van IRF-1 en inhibitie van LTR-gereguleerde genexpressie (Chang et al., 2002). Deze studie helpt een van de moleculaire mechanismen van de gastheerafweer tegen HIV te verduidelijken. Aangezien andere antivirale effectormolekulen, zoals perforine en granzymes, in exocytische granules van CD8+ T-cellen liggen, is de mogelijkheid onderzocht dat CAF zich in granules bevindt. Naast deze effectormolekulen liggen ook ander immuunfactoren, zoals granulysine en β-chemokines in granules. In naïeve T-cellen zijn geen granules detecteerbaar, maar na activatie stijgt de granule-inhoud en bereikt zijn piek zo’n 5 tot 10 dagen later. Uit de resultaten van dit onderzoek is gebleken dat CAF niet in granules van CD8+ T-cellen van HIV-geïnfecteerde individuen ligt. Daarentegen werd er wel anti-HIV activiteit gedetecteerd in de cytoplasmatische fragmenten van deze CAF-producerende CD8+ T-cellen. Deze bevindingen tonen aan dat CAF niet opgeslagen ligt in granules en opnieuw gesynthetiseerd moet worden indien nodig (Mackewicz et al., 2003b). In pogingen om de identiteit van CAF te achterhalen, die in de volgende paragraaf uitgebreid behandeld zullen worden, werd ontdekt dat een aantal protease inhibitors in staat is de anti-HIV activiteit van CD8+ T-cellen te inhiberen. Voornamelijk leupeptine bleek in staat zowel de anti-HIV activiteit in CD8+ T-celculturen als CNAR dosisafhankelijk met meer dan 95% te inhiberen. Vanwege de chemische kenmerken van leupeptine, zoals de positieve lading, zal leupeptine CD8+ cellen niet binnengaan. Waarschijnlijk heeft leupeptine dus invloed op een membraangeassocieërd eiwit. Ook leidde voorbehandeling van CD8+ cellen met leupeptine tot een gereduceerde CNAR. Het inhiberende effect van protease inhibitors heeft geen invloed op celgroei, expressie of activatie van antigenen of viabiliteit van CD8+ of geïnfecteerde CD4+ cellen. Deze resultaten tonen aan dat CNAR wellicht een protease of een eiwit wat interacteert met een protease bevat. Het is mogelijk dat er proteolyse van CD8+ celprodukten plaatsvindt. Waarschijnlijk produceren CD8+ cellen een protease die in staat is een ander eiwit antiviraal te maken. In een derde van de gevallen heeft leupeptine geen effect op CNAR/CAF. Dit zou te verklaren zijn doordat de antivirale factor in dat geval al geactiveerd is en dus niet afhankelijk is van protease activiteit. Het is mogelijk dat CNAR

20

gemedieerd wordt door twee onafhankelijke CD8+ cel anti-HIV mechanismen: een waar een protease en zijn substraat bij betrokken zijn en een ander ongevoelig voor protease inhibitors. Aangezien de concentratie CAF aanwezig in CD8+ T-cellen erg laag is, is CAF dus moeilijk te isoleren en identificeren. Wellicht zou leupeptine gebruikt kunnen worden als een soort ‘probe’ of affiniteitsligand voor CAF. Het eiwit zou gelabeled en geïsoleerd kunnen worden met leupeptine of een andere protease inhibitor (Mackewicz et al., 2003a). Aangezien CAF gevoelig bleek te zijn voor proteases is vast komen te staan dat CAF een eiwit is (Mackewicz et al., 2003a). CAF is een eiwit dat uitsluitend geproduceerd lijkt te worden door geactiveerde CD8+ cellen, voornamelijk CD8+CD25+ cellen (Levy et al., 1996). CAF heeft duidelijke biochemische en fysische eigenschappen die goed te gebruiken zijn bij de identificatie. Uit onderzoeken blijkt de lengte van het eiwit vooralsnog te variëren tussen de 10-50 kDa. Het eiwit blijkt resistent tegen hitte en blijft intact na 10 minuten bij 86°C (Mackewicz et al., niet-gepubliceerd, reviewed in Levy et al., 1996). Ook blijkt het eiwit een lage pH te kunnen verdragen. De anti-HIV activiteit blijft gehandhaafd bij een pH van 2.0 (Cocchi et al., 1995). Aangezien CAF stabiel blijft bij extractie met ether bevat CAF geen belangrijke lipid-component (Mackewicz et al., 2003a). Pre-incubatie van CD4+ cellen met CAF heeft geen invloed op de vatbaarheid voor infectie. CD4+ cellen blijken CAF niet op te nemen en dus bindt CAF waarschijnlijk niet irreversibel aan targetcellen (Mackewicz et al., niet-gepubliceerd, reviewed in Levy et al., 1996). CAF productie bereikt 5-9 dagen na de activatie van CD8+ cellen een maximum (Levy et al., 1996). 2.3. Kandidaten CAF Een groot aantal interleukines, interferonen, chemokines, groeifactoren en andere cytokines met anti-HIV activiteit zijn bekeken als kandidaten voor CAF. De belangrijkste zullen besproken worden. Al deze kandidaten bleken niet alle kenmerken van CAF te vertonen, hetgeen suggereert dat CAF uit meerdere componenten bestaat. Wel heeft de zoektocht naar CAF een groot aantal nieuwe anti-HIV factoren aangetoond. 2.3.1. Cytokines en chemokines Aangezien cytokines belangrijke boodschappers binnen het immuunsysteem zijn, is als eerste onderzocht of CAF misschien een cytokine was. Men heeft gekeken naar de concentraties van bekende cytokines aanwezig in CAF-bevattende en niet CAF-bevattende celculturen. Daarnaast is gekeken naar het effect van recombinante cytokines op HIV

21

replicatie en het effect van cytokine neutraliserende antilichamen op CAF activiteit. Men heeft zich voornamelijk gericht op een groep van chemoattractieve cytokines, de chemokines, die in staat blijken te interfereren met de binnenkomst van HIV in de cel (Barker et al., 1998a). In 1995 werden de β-chemokines RANTES, ‘Macrophage Inflammatory Protein 1α’ of MIP-1α en MIP-1β geïdentificeerd als de belangrijkste anti-HIV factoren uitgescheiden door CD8+ T-cellen (Cocchi et al., 1995). Twee eiwitten gezuiverd uit het supernatant van CD8+ T-celculturen bleken de sequentie te vertonen van RANTES, een polypeptide van 8 kDa dat behoort tot de β-chemokine familie, en MIP-1α, wederom een 8 kDa polypeptide dat nauw verwant is aan RANTES. Alle drie de chemokines werden in verschillende concentraties uitgescheiden door CD8+ T-cellen. Vervolgens werd de invloed van neutraliserende antilichamen tegen RANTES, MIP-1α en MIP-1β bekeken op de anti-HIV activiteit. Alleen het antilichaam tegen RANTES bleek de anti-HIV activiteit gedeeltelijk te blokkeren. RANTES bleek dus de meest effectieve inhibitor van de drie. De anti-HIV activiteit bleek echter geheel te worden uitgeschakeld door een combinatie van neutraliserende antilichamen tegen RANTES, MIP-1α en MIP-1β. Dit betekent dat de anti-HIV activiteit niet kan worden toegeschreven aan de werking van een enkele chemokine, maar een gevolg is van gecombineerde werking van verschillende chemokines. Deze drie chemokines bleken in staat verschillende HIV1, HIV2 en SIV stammen dosis-afhankelijk te inhiberen. Het fenomeen bleek dus niet afhankelijk van de HIV stam die gebruikt werd. Uitgesloten werd dat de antivirale activiteit van RANTES, MIP-1α en MIP-1β het gevolg was van een negatief effect op de celproliferatie (Cocchi et al., 1995). Er werd dus verondersteld dat de β-chemokines RANTES, MIP-1α en MIP-1β verantwoordelijk zouden kunnen zijn voor de antivirale activiteit van CD8+ cellen (Cocchi et al., 1995). Maar hoewel deze chemokines in hoge concentraties (0.5-1.0 µg/ml) een zekere anti-HIV activiteit vertonen in de endogene assay, doen ze dit niet in de acute infectie assay. Bovendien is er geen correlatie tussen de aanwezigheid van deze cellulaire factoren en de CAF activiteit en zorgen antilichamen tegen chemokines niet voor het verdwijnen van de CAF activiteit (Levy et al., 1996). Naast CD4+ T-cellen zijn monocyten en macrofagen belangrijke targetcellen van HIV. Macrofagen zijn waarschijnlijk een van de eerste celtypen die door HIV geïnfecteerd worden (Barker et al., 1998a). Deze cellen kunnen de infectie verspreiden naar CD4+ T-cellen. Infectie van macrofagen leidt niet noodzakelijkerwijs direct tot cytolyse, maar resulteert in latentie of persistente chronische infectie (Moriuchi et al., 1996). Infectie met HIV kan leiden tot een verlaagde antigeen presentatie van macrofagen doordat hun vermogen om cytokines te produceren veranderd wordt. Wellicht kan HIV infectie ook de effector functie van

22

macrofagen veranderen, zoals de antilichaam-afhankelijke cytotoxiteit en het doden van intracellulaire organismen (Barker et al., 1998a). Antilichaam-afhankelijke cytotoxiciteit (Antibody Dependent Cell-mediated Cytotoxity = ADCC) houdt in dat targetcellen bedekt met antilichamen gedood worden door CTLs of ‘Natural Killer’ (NK) cellen. ADCC wordt geïnduceerd wanneer een antilichaam op het oppervlak van een targetcel interacteert met receptoren op de cytotoxische T-cel (Janeway et al., 2001). Verschillende HIV1 stammen verschillen in hun vermogen om macrofagen te infecteren. HIV1 stammen lijken tijdens progressie van de ziekte hun tropisme voor macrofagen te verliezen (Moriuchi et al., 1996). Hieruit blijkt dat macrofagen een belangrijke rol spelen in de pathogenese van de HIV infectie en dan voornamelijk tijdens de primaire infectie en de latente periode. Preventie van de HIV infectie van macrofagen is dus belangrijk om het verspreiden van de infectie te voorkomen en de cellulaire immuunrespons van het geïnfecteerde individu in stand te houden (Barker et al., 1998a). Helaas worden de mechanismen betrokken bij deze virale latentie en persistente infectie van macrofagen nog niet goed begrepen. Een aantal cytokines, waaronder tumor necrosis factor α, IL-1 en IL-6, blijkt in staat HIV replicatie in macrofagen te verhogen. Daarentegen blijken interferon α, β en γ, IL-10 en IL-13 HIV replicatie in macrofagen juist te onderdrukken. Deze cytokines blijken echter weinig effect te hebben op de HIV replicatie in T-lymfocyten. Hieruit valt op te maken dat regulatie van de HIV replicatie door cytokines afhangt van het celtype (Moriuchi et al., 1996). Het is nog onduidelijk of CAF activiteit in staat is de HIV replicatie in macrofagen te inhiberen. Om te kijken naar de regulatie van de HIV replicatie in macrofagen zijn de supernatanten van CD8+ T cellen getest op aanwezigheid van RANTES, MIP-1α, MIP-1β en nog een aantal andere cytokines (Moriuchi et al., 1996). Aangetoond is dat de supernatanten van CD8+ Tcellen inderdaad in staat bleken HIV replicatie in macrofagen te onderdrukken. Er werd een inhibitie van de virale replicatie van meer dan 90% waargenomen en deze suppressie was dosis-afhankelijk. Nog een andere groep heeft suppressie van HIV replicatie in macrofagen door CD8+ T-cellen laten zien (Barker et al., 1998a). Voor deze studie zijn co-culturen van CD8+ T-cellen en acuut geïnfecteerde macrofagen in een 1:1 ratio gebruikt. Dit bleek te resulteren in een 87% reductie van de reverse transcriptase activiteit (figuur 7). Om te bepalen of het vermogen van de CD8+ cellen om HIV replicatie te onderdrukken het gevolg was van een oplosbare factor werden de macrofagen van de CD8+ cellen gescheiden door een permeabel membraan. Het bleek dat de CD8+ cellen in aanwezigheid van dit permeable membraan nog steeds in staat waren virale replicatie te inhiberen en er dus inderdaad sprake is van een oplosbare factor (figuur 7).

23

Figuur 7. Het vermogen van CD8+ T-cellen om HIV replicatie te onderdrukken na scheiding van geïnfecteerde macrofagen door een semi-permeabel membraan aangeduid met ‘transwell insert’ (uit: Barker et al., 1998a).

Na verwijderen van de CD8+ T-cellen bleek de reverse transcriptase activiteit weer toe te nemen (figuur 8). Met celoverlevingsstudies werd aangetoond dat het zeer onwaarschijnlijk was dat deze HIV suppressie veroorzaakt was door een cytotoxisch effect (Barker et al., 1998a).

Figuur 8. Het effect van CD8+ T-cellen van HIV-geinfecteerde individuen op de HIV replicatie in macrofagen (uit: Barker et al., 1998a). Na verwijdering van de CD8+ T-cellen neemt de activiteit van het virale enzym reverse transcriptase drastisch toe.

24

β-chemokines bleken HIV replicatie in macrofagen niet te kunnen onderdrukken (Moriuchi et al., 1996). Antilichamen tegen RANTES, MIP-1α en MIP-1β waren niet in staat de antivirale activiteit van CD8+ T-cellen in macrofagen te reduceren (Moriuchi et al., 1996). Uit deze resultaten valt op te maken dat de β-chemokines, die wel in staat zijn HIV replicatie te onderdrukken in CD4+ T-cellen, niet verantwoordelijk zijn voor de anti-HIV activiteit van CD8+ T-cel supernatanten in macrofagen. Zoals gezegd zijn er enkele cytokines bekend, onder andere IL-4, IL-10, IL-13, IFN-α, IFN-β en IFN-γ, die HIV infectie in macrofagen kunnen inhiberen. Ook is bekend dat CD8+ T-cellen in staat zijn enige van deze cytokines, IL-10, IL-13, IFN-α en IFN-γ, te produceren. Om te onderzoeken of het vermogen van CD8+ T-cellen om HIV replicatie te onderdrukken gerelateerd is aan de anti-HIV activiteit van deze cytokines is wederom gebruik gemaakt van neutraliserende antilichamen tegen de cytokines. Neutralisatie van elk van deze cytokines apart had vrijwel geen effect op de HIV replicatie in macrofagen. Als alle neutraliserende antilichamen tegen de cytokines in combinatie gebruikt werden, nam de HIV replicatie toe. De HIV replicatie bereikte echter niet zijn maximum. Deze resultaten laten zien dat de anti-HIV activiteit van CD8+ T-cellen het gevolg is van meerdere factoren en dat RANTES, MIP-1α en MIP-1β niet de enige antiHIV factoren zijn die geproduceerd worden door CD8+ T-cellen (Moriuchi et al., 1996). Naast de β-chemokines is een andere chemokine, Interleukine 16 (IL-16), voorgesteld als kandidaat voor CAF. IL-16 bleek echter niet detecteerbaar in CAF-bevattende celculturen en is alleen in staat HIV replicatie te reduceren in hele hoge concentraties (> 1.0 µg/ml) Ook IL-16 heeft dus niet de identiteit van CAF (Levy et al., 1996). 2.3.2. Defensines Defensines zijn kleine, cysteïne-rijke, kationische, antimicrobiële peptiden die door de gastheer gecodeerd worden en deel uitmaken van de innate immunity. Defensines worden geproduceerd als antwoord op microbiële produkten of proinflammatoire cytokines (Lehrer & Ganz, 2002). Door gebruik te maken van de chemokine receptoren op dendritische en Tcellen zouden defensines ook bij kunnen dragen aan de acquired of adaptive immunity van de gastheer (Yang et al., 2002). Defensines zijn in staat de membranen van een groot spectrum van organismen, waaronder grampositieve en gramnegatieve bacteriën, schimmels en virussen, permeabel te maken (Lehrer & Ganz, 2002). In hoge concentraties zijn defensines toxisch voor zoogdiercellen. Defensines zijn slechts 2-6 kDa groot (figuur 9).

25

Figuur 9. Classificatie, grootte, structuur en activiteit van defensines in zoogdieren (uit: Yang et al., 2002).

Ze lijken vanwege hun zwavelbruggen en clusters positief geladen aminozuren sterk op de iets grotere (8-10 kDa) chemokines (Lehrer & Ganz, 2002). Op basis van hun grootte en patroon van zwavelbruggen zijn defensines verdeeld in een α-, β- en θ-categorie (figuur 9). Alle defensines zijn ontstaan uit een voorouderlijk gen wat bestond voordat de reptielen en de vogels divergeerden. Alle typen defensines bevatten 6 cysteïnes en hebben grote βsheets, die gestabiliseerd worden door drie zwavelbruggen (figuur 9). Hoewel α- en βdefensines verschillen wat betreft de cysteïnes hebben ze dezelfde topologie. α-defensines, die geïdentificeerd zijn in mensen, apen en enkele knaagdiersoorten, worden met name geproduceerd door neutrofielen en macrofagen (Lehrer & Ganz, 2002). In elke onderzochte zoogdiersoort zijn tot nu toe β-defensines aangetroffen. Hoewel in neutrofielen van koeien meer dan 13 β-defensines zijn gevonden, worden in de meeste andere zoogdiersoorten βdefensines voornamelijk geproduceerd door epitheelcellen rondom verscheidene organen. Vrij recentelijk is een nieuw type defensine, de θ-defensine, aangetroffen in het beenmerg van de rhesusmakaak. Deze defensine bleek circulair te zijn door de fusie van twee getrunceerde α-defensine precursors. Vervolgens zijn nog twee andere circulaire θdefensines gevonden in de rhesusmakaak (Cole et al., 2002). Naast hun directe antimicrobiële effecten vertonen defensines ook immunostimulatoire activiteiten zoals inductie van cytokine produktie en een chemotactisch effect op T-lymfocyten, monocyten en dendritische cellen (Lehrer & Ganz, 2002, Yang et al., 2002) (figuur 9).

26

In 1993 werd voor het eerst inhibitie van HIV replicatie door α-defensines waargenomen (Nakashima et al., 1993). In 2002 werd met behulp van een protein-chip technology een cluster eiwitten, die uitgescheiden wordt door geactiveerde CD8+ T-cellen van LTNP, geïdentificeerd (Zhang et al., 2002). Deze kleine eiwitten bleken allemaal drie intramoleculaire zwavelbruggen te bevatten, suggererend dat de eiwitten zeer nauw aan elkaar gerelateerd zijn. Met behulp van specifieke antilichaamherkenning en bepaling van de aminozuurvolgorde is vastgesteld dat deze eiwitten inderdaad α-defensines 1, 2 en 3 zijn. De voornaamste bron van α-defensines is de neutrofiel (Lehrer & Ganz, 2002). Daarnaast zijn er nog additionele producerende cellen bekend zoals B-cellen, NK cellen, macrofagen en epitheelcellen. Aangezien α-defensines met name door cellen van het immuunsysteem geproduceerd worden, is het niet zo verrassend dat α-defensines ook geproduceerd zouden kunnen worden door CD8+ T-cellen. Daarmee zouden defensines interessante kandidaten voor CAF zijn. Om de relatieve bijdrage van α-defensines 1, 2 en 3 aan de activiteit van CAF te onderzoeken heeft men met behulp van antilichamen de α-defensines 1, 2 en 3 verwijderd uit de supernatanten van gekweekte CD8+ T-cellen van LTNP. Zowel de replicatie van X4-virussen als van R5-virussen bleek hierdoor aanzienlijk gestimuleerd te worden. Dit effect bleek dosis-afhankelijk te zijn: de anti-HIV activiteit van de CD8+ T-cel supernatanten van LTNP nam af als de concentratie antilichaam tegen α-defensines 1, 2 en 3 toenam. Bij een antilichaamconcentratie van 25 µg/ml was de anti-HIV activiteit tegen X4-virussen vrijwel helemaal verdwenen. Ook de remmende activiteit tegen R5-virussen bleek gereduceerd te worden, maar niet helemaal te verdwijnen. Dit zou verklaard kunnen worden door een mogelijke activiteit van β-chemokines tegen R5-virussen (Cocchi et al., 1995). Synthetische en gezuiverde α-defensines bleken ook, zonder cytotoxiciteit, in staat de replicatie van HIV in vitro te inhiberen. Echter wanneer een α-defensine individueel getest werd, bleek de remmende activiteit veel lager dan in combinatie met de andere αdefensines. Deze resultaten laten zien dat α-defensines 1, 2 en 3 wellicht gezamenlijk bijdragen aan de anti-HIV activiteit van CAF. Het is mogelijk dat de anti-HIV activiteit veroorzaakt wordt doordat verschillende defensines met elkaar interacteren, wellicht door de vorming van heterodimeren. Helaas is het precieze mechanisme van werking nog niet bekend (Zhang et al., 2002). In 2004 werd de identiteit van defensines als actieve component van CAF echter betwijfeld, en nog wel door dezelfde groep (Zhang et al., 2004). Aan de antivirale activiteit van α-defensines werd niet getwijfeld, maar wel aan de cellulaire oorsprong van deze αdefensines. In een poging te bepalen welke specifieke CD8+ cel subpopulaties deze αdefensines produceren, kwam men tot de ontdekking dat de CD8+ T-cel supernatanten in

27

afwezigheid van ‘Peripheral Blood Mononuclear Cells’ (PBMCs) geen α-defensines bevatten. Dit zou kunnen betekenen dat de α-defensines geproduceerd worden door een populatie cellen binnen deze PBMCs. Om dit te bevestigen zijn de PBMCs behandeld met antilichamen om neutrofielen te elimineren. Nu waren er geen α-defensines te detecteren in de supernatanten van de gestimuleerde CD8+ T-cellen. Bovendien bleek met behulp van een PCR-assay dat geen α-defensine mRNA kon worden aangetoond in CD8+ T-cellen (Zhang et al., 2004). Waarschijnlijk lekken er tijdens het fixatieproces α-defensines vanuit neutrofielen in andere cellen, zoals CD8+ T-cellen. Deze nieuwe bevindingen tonen aan dat α-defensines niet geproduceerd worden door CD8+ T-cellen. Dit zou betekenen dat ze niet verantwoordelijk zijn voor de CD8+ cel antivirale activiteit en dus geen kandidaat meer zijn voor CAF. Het is ook mogelijk dat de naam CAF incorrect is en veranderd moet worden, aangezien de CD8+ T-cel wellicht niet de enige producent is van de non-cytotoxische antiHIV activiteit. Na eliminatie van α-defensines en β-chemokines blijft er slechts zeer geringe anti-HIV activiteit over. Er bestaat dus geen twijfel over de anti-HIV activiteit van αdefensines; het mechanisme van hun antivirale werking verdient verdere bestudering. In 2003 is onderzoek gedaan naar de effecten van α-defensines, en dan met name αdefensine 1, op de verschillende fasen van de HIV infectie en de bijdrage aan de CAF activiteit tegen HIV (Chang et al., 2003). α-defensine 1 bleek de HIV infectie na de binnenkomst van het virus te beïnvloeden en HIV genexpressie te onderdrukken. Antilichamen tegen de α-defensines bleken echter niet in staat het inhiberende effect van CAF op de HIV genexpressie te onderdrukken. De bijdrage van α-defensine 1 aan CAF activiteit werd verder uitgezocht door te kijken naar activatie van STAT1 tyrosine fosforylatie. α-defensine 1 bleek uit deze resultaten niet verantwoordelijk voor de anti-HIV activiteit van CAF. CAF en α-defensine 1 hebben verschillende eigenschappen. Hoewel ze beiden in staat zijn de HIV infectie en de genexpressie te inhiberen, werkt alleen CAF door STAT1 te activeren. α-defensine 1 is in staat HIV infectie te remmen via een STAT1onafhankelijke signaaltransductie (Chang et al., 2003). Men heeft in het humane beenmerg mRNA gevonden dat homoloog is aan de precursors van de circulaire defensines in de rhesusmakaak. Vanwege een stopcodon in de signaalsequentie is er hier waarschijnlijk sprake van een pseudogen. De sterke conservering van het rhesus en humane mRNA suggereert dat deze mutatie in mensen vrij recentelijk in de evolutie is ontstaan. Toch is de sequentie gebruikt om retrocycline, de voorouderlijke vorm van humane circulaire defensines, te synthetiseren. Retrocycline is voor 88,9% identiek aan de precursor van de rhesus circulaire defensines. Retrocycline bleek humane CD4+ T-cellen in vitro te kunnen beschermen tegen HIV infectie met zowel T- als M-tropic

28

stammen. Retrocycline is veelbelovend voor de ontwikkeling van een middel dat HIV infectie kan voorkomen (Cole et al., 2002). 2.3.3. Overige kandidaten CD8+ T-cellen scheiden oplosbare factor(en) uit die in staat zijn zowel R5- als X4-tropic stammen van HIV te remmen. Het is reeds bekend dat CCR5 chemokine liganden, uitgescheiden door geactiveerde CD8+ T-cellen, bijdragen aan de antivirale activiteit van deze cellen. Deze chemokines zijn echter niet de enige CD8+ T-cel antivirale factoren. Dit blijkt met name uit het feit dat de chemokines niet in staat zijn de replicatie van X4-tropic stammen, die CXCR4 als alternatieve coreceptor gebruiken, te remmen, terwijl CAF in staat is zowel R5- als X4-tropic stammen te remmen. Recentelijk zijn bij verdere pogingen om de identiteit van CAF te bepalen twee produkten van CD8+ T-cellen geïdentificeerd die in staat zijn X4-Tropic stammen van HIV te remmen (Geiben-Lynn, 2002b). Deze twee componenten verschillen in massa en in het vermogen om aan heparine te binden. Het grotere heparinebindende eiwit blijkt een gemodificeerde vorm van anti-thrombine III (ATIII) te zijn. Normaal gesproken is ATIII 53 kDa groot, maar in gemodificeerde vorm 43 kDa. Het is nog niet bekend of deze reductie in grootte het gevolg is van een proteolytisch proces of van deglycosylering. Onder fysiologische omstandigheden bestaat ATIII in verschillende vormen. ATIII circuleert in een inactieve L-vorm, waarbij de reactieve COOH-terminale loop wordt afgeschermd en niet aan targeteiwitten kan binden. Wanneer ATIII echter heparine bindt, ontstaat een andere conformatie, de zogenaamde S-vorm. De COOH-terminale loop komt bloot te liggen en de bindingsaffiniteit voor thrombine neem enorm toe. Vervolgens dissocieert het thrombine-ATIII complex langzaam en wordt de reactieve loop van ATIII gekliefd door het vrijgekomen thrombine. Deze nieuwe ‘Relaxed’ (R) vorm van ATIII is niet in staat targeteiwitten te binden. De R-vorm van ATIII blijkt anti-angiogene activiteit te hebben en in staat te zijn tumorgroei te remmen. Om te bepalen welke vorm van ATIII in staat is HIV te remmen, zijn de R- en de L-vorm gemaakt uit de commercieel verkrijgbare S-vorm. Zowel de R- als de S-vorm waren in staat de replicatie van X4-tropic stammen van HIV te remmen. De L-vorm vertoonde geen anti-HIV activiteit. De S-vorm bleek het X4-virus het efficiëntst te remmen. Bovendien bleek de S-vorm ook SIV replicatie aanzienlijk te remmen. Zowel de R- als de S-vorm bleken stabiel te zijn bij hoge temperatuur en gevoelig voor proteases. V8 protease was in staat de heparine bindingsplaats te klieven en zo de activiteit van de S-vorm te verlagen. Dit suggereert dat deze heparine bindingsplaats van belang is voor de inhibitie van HIV. Alle ATIII vormen bleken niet toxisch voor CD4+ T-cellen en hadden geen invloed op de celoverleving of celgroei. Vervolgens is men de CD8+ T-cellen

29

van HIV-seropositieve individuen gaan vergelijken met de CD8+ T-cellen van HIVseronegatieve individuen. In tegenstelling tot de CD8+ T-cellen van HIV-seropositieve individuen bleken ongestimuleerde CD8+ T-cellen HIV replicatie niet substantieel te remmen, ook niet in aanwezigheid van heparine. De 43 kDa vorm van ATIII was hier niet te detecteren. Hieruit blijkt dat alleen geactiveerde CD8+ T-cellen van HIV-geïnfecteerde personen in staat zijn ATIII te modificeren tot een vorm met anti-HIV activiteit. Seronegatieve CD8+ T-cellen produceren deze antivirale activiteit niet of in mindere mate omdat de CD8+ T-cellen minder geactiveerd worden, wat resulteert in minder factor om ATIII te modificeren. Tot nu toe heeft de zoektocht naar CAF zich gericht op factoren die uitgescheiden worden door CD8+ T-cellen. Voor het eerst is nu aangetoond dat CD8+ Tcellen een serumeiwit kunnen activeren om HIV te remmen. Dit maakt het aannemelijk dat een deel van CAF een protease is. Waarschijnlijk remt ATIII HIV niet als competitieve agonist van CXCR4. Er is namelijk niet waargenomen dat het eiwit CXCR4 downreguleert (Geiben-Lynn, 2002b). Een andere groep heeft aangetoond dat ATIII inderdaad antivirale activiteit heeft bij concentraties van 25-50 µg/ml, maar dit effect is niet consistent teruggevonden bij HIV-geïnfecteerde CD4+ cellen. Bovendien kunnen CAF en CNAR gewoon worden aangetoond in afwezigheid van serumeiwitten, waaronder ATIII (Mackewicz et al., niet gepubliceerd, reviewed in Levy et al., 2003). Toch zijn de bevindingen op het gebied van ATIII relevant voor het onderzoek dat liet zien dat CAF een protease-gevoelig eiwit is (Levy et al., 1996). Bepaalde protease inhibitors, zoals leupeptine, waren in staat CAF en CNAR activiteit in 70% van de gevallen te blokkeren (Mackewicz et al., 2003a) (zie kenmerken CAF). Het mechanisme van deze reactie is nog niet bekend, maar zou de activiteit van een protease op een of ander produkt van CD8+ cellen kunnen inhouden. In 30% van de gevallen heeft leupeptine geen invloed op de antivirale activiteit van CAF. De oorzaak hiervan zou kunnen zijn dat het precursor eiwit al gekliefd is of dat er nog onbekende anti-HIV eiwitten actief zijn (Levy et al., 2003). De identiteit van de eiwitten die beïnvloed worden door de protease inhibitor is nog niet bekend, maar zou wel eens hetzelfde kunnen zijn als het hypothetische eiwit dat ATIII modificeert. CD8+ T-cellen zijn de belangrijkste bron voor de produktie van non-cytotoxische factoren die in staat HIV replicatie te remmen. In een poging om deze factoren verder te karakteriseren heeft men de genexpressie profielen van geactiveerde CD8+ T-cellen bekeken. Hieruit bleek dat de ‘Natural Killer Enhancing Factor A’ ofwel NKEF-A en NKEF-B, meer geproduceerd werden door CD8+ T-cellen van HIV-seropositieve dan door CD8+ Tcellen van HIV-seronegatieve personen. In het genexpressie profiel van geactiveerde CD8+ T-cellen bleken deze componenten meer geproduceerd te worden. Normaliter worden NKEF-

30

A en –B geproduceerd bij oxidatieve stress. Wanneer T-cellen getransfecteerd werden met NKEF-A en –B cDNA bleek HIV replicatie in vitro te worden geremd. De NKEFs bleken ook in staat replicatie van SIV te remmen. Het bloedplasma van LTNP bleek significant meer NKEFB te bevatten dan het plasma van symptomatische individuen. Dit significante verschil tussen LTNP en symptomatische patiënten is echter waarschijnlijk het gevolg van een grotere cytotoxische activiteit van CD8+ T-cellen van LTNP. In vitro bleek HIV replicatie afgenomen wanneer NKEF eiwitten in CD4+ T-cellen tot overexpressie waren gebracht. Deze resultaten laten zien dat NKEF-A en –B, leden van de peroxiredoxine familie (uitleg), meer geproduceerd worden door geactiveerde CD8+ T-cellen bij HIV infectie. Wellicht dragen deze antioxidante eiwitten bij aan de antivirale activiteit van CD8+ T-cellen. Hoewel deze eiwitfamilie enkele chemokine-achtige eigenschappen heeft, zoals heparine-binding en chemotaxis, is het antivirale mechanisme van de NKEFs waarschijnlijk heel anders. Dit maakt onderzoek naar de antivirale werking van NKEFs natuurlijk erg interessant. De NKEFs hebben wellicht het vermogen om te dienen als een soort synergistische therapie als het antivirale mechanisme inderdaad verschilt van dat van chemokines (Geiben-Lynn et al., 2003b). Daarnaast is recentelijk een mogelijke rol voor ribonuclease ofwel RNase in de antiHIV activiteit voorgesteld. Al een aantal jaren geleden is aangetoond dat onconase en bovine seminal RNase, twee leden van de RNase A superfamilie, in staat zijn HIV replicatie te remmen. Twee leden van dezelfde familie blijken dit niet te kunnen. Dit laat zien dat er tussen homologe RNases een selectieve antivirale activiteit is (Youle et al., 1994). Onderzocht is of RNase betrokken zou kunnen zijn bij CNAR. Antilichamen tegen RNase bleken niet in staat CNAR en CAF activiteit te kunnen blokkeren. Bovendien werd er geen mRNA voor RNase gedetecteerd in CD8+ cellen en is de cellulaire herkomst van RNase nog niet bekend (Mackewicz et al., niet-gepubliceerd, reviewed in Levy et al., 2003).

31

3. Discussie Er bestaat een kleine groep individuen die na HIV infectie voor meer dan 10 jaar asymptomatisch blijven en een stabiel aantal CD4+ T-cellen hebben. Het profiel van deze zogenaamde Long Term Non Progressors (LTNP) lijkt sterk op dat van ongeïnfecteerde individuen. Deze groep individuen is zeer interessant om te bestuderen, aangezien zij wellicht unieke virologische en immunologische kenmerken hebben. Normaliter hangt de kans op infectie samen met het aantal blootstellingen aan het virus maar er bestaat een groep mensen die herhaaldelijk blootgesteld werd aan HIV, zonder geïnfecteerd te raken (Exposed-Uninfected; EU). Wellicht kan ook deze groep perspectief bieden voor nieuwe antiHIV therapieën. CD8+ T-cellen spelen een belangrijke rol bij de cellulaire immuunrespons tegen virale infectie. De CD8+ cel afweer tegen HIV heeft twee kanten: een cytotoxische en een noncytotoxische. Er bleek geen relatie te zijn tussen de cytotoxische kant van de anti-HIV activiteit en de klinisch gezonde staat van LTNP en EU personen. De hoogste CD8+ cel Noncytotoxische Antivirale Respons (CNAR) werd gevonden in LTNP en was afwezig in personen met AIDS. Dit geeft een indicatie voor een correlatie tussen een sterke non-cytotoxische CD8+ cel anti-HIV activiteit en de gezonde klinische staat van LTNP en EU personen (Levy et al., 1996, Stranford et al., 1999). De non-cytotoxische CD8+ afweer tegen HIV blijkt niet bepaald te worden door het type MHC (Mackewicz et al., 1998) en niet alleen voorbehouden te zijn aan HIV (Levy et al., 1996). CNAR verschijnt vlak na de HIV infectie, nog voordat er antilichamen aanwezig zijn (Mackewicz et al., 1994) en lijkt dan samen met CTLs het virus te controleren. CNAR blijkt gemedieerd te worden door een of meer oplosbare factoren, die gezamenlijk de CD8+ cel Antivirale Factor (CAF) genoemd worden. Aangezien CAF gevoelig bleek voor proteases is vastgesteld dat CAF een eiwit of groep van eiwitten is (Mackewicz et al., 2003a). CAF is een eiwit dat uitsluitend geproduceerd lijkt te worden door geactiveerde CD8+ cellen (Levy et al., 1996). Aangezien CAF slechts in zeer kleine hoeveelheden geproduceerd wordt, is het zeer moeilijk om de identiteit van CAF te bepalen. Zuiveren en bepalen van de aminozuurvolgorde van CAF is tot op heden nog niet gelukt. Aangezien protease inhibitors in staat zijn de werking van CAF te blokkeren is het mogelijk dat CAF zelf een protease is of een eiwit dat een interactie met een protease aangaat (Mackewicz et al., 2003a). Het is mogelijk dat antivirale CD8+ cellen een protease en een precursor van CAF produceren. Deze precursor wordt pas actief na klieving. Dit antivirale eiwit reageert vervolgens met het celmembraan van een HIV-geïnfecteerde CD4+ cel en zorgt voor een soort van anti-HIV staat (figuur 10). In de gevallen dat CAF niet

32

geblokkeerd wordt door een protease inhibitor is het mogelijk dat de CAF precursor al gekliefd is of dat er nog onbekende anti-HIV factoren een rol spelen (Levy, 2003).

Figuur 10. Hypothetisch model voor de produktie van de CD8+ cel Antivirale Factor (CAF) (uit: Levy, 2003). CAF productie bereikt 5-9 dagen na de activatie van CD8+ cellen een maximum. CAF heeft duidelijke biochemische en fysische eigenschappen die goed te gebruiken zijn bij de identificatie van CAF. Zo blijkt de lengte van het eiwit te variëren tussen de 10-50 kDa. Het eiwit blijkt resistent tegen hitte en een lage pH (Cocchi et al., 1995). Aangezien CAF stabiel blijft tijdens extractie met ether blijkt het eiwit geen essentiële lipid-component te bevatten (tabel 1). Tabel 1. Kenmerken van CAF (aangepast uit Levy, 2003) •

Geproduceerd door CD8+ T-cellen

•

Niet gevonden in granules

•

Gevoelig voor protease

•

Grootte van 10-50 kDa

•

Stabiel bij hoge temperatuur en lage pH

•

Stabiel tijdens extractie met ether: geen essentiële lipid-component

•

Actief tegen HIV-1, HIV-2, SIV

•

Blokkeert HIV replicatie door LTR-gedreven transcriptie te remmen

•

Heeft geen invloed op CD4+ cel activatie of proliferatie

33

CAF blijkt in staat de replicatie van verschillende HIV stammen te onderdrukken en wordt het meest geproduceerd in asymptomatische personen (Levy et al., 1996, Stranford et al., 1999) (tabel 1). CAF is in staat expressie van genen van de HIV ‘Long Terminal Repeats’ of LTRs te blokkeren (Mackewicz et al., 1995). Aangetoond is dat dit inhiberende effect van CAF op de LTR activatie van HIV wordt gemedieerd via STAT1 activatie. Het is bekend dat eiwitten van de IRF-familie gereguleerd worden door STAT eiwitten. CAF is in staat STAT1 te activeren, wat vervolgens leidt tot inductie van IRF-1 en inhibitie van LTR-gereguleerde genexpressie (Chang et al., 2002). Een groot aantal interleukines, interferonen, chemokines, groeifactoren en andere cytokines met anti-HIV activiteit bleken sommige maar niet alle kenmerken van CAF te vertonen, hetgeen suggereert dat CAF uit meerdere componenten bestaat. Is CAF een cytokine? Er is met name gekeken naar een groep van chemoattractieve cytokines, de chemokines, die in staat blijken te interfereren met de binnenkomst van HIV in de cel (Barker et al., 1998a). Cocchi et al. hebben in 1995 de βchemokines RANTES, MIP-1α en MIP-1β geïdentificeerd als de belangrijkste anti-HIV factoren uitgescheiden door CD8+ T-cellen. De antivirale activiteit van de β-chemokines, liganden van de CCR5 receptor, werd wel waargenomen tegen M-tropic stammen, maar niet tegen T-tropic stammen (Cocchi et al., 1995). Dit werd later verklaard door de ontdekking van de CCR5 receptor als coreceptor voor de binnenkomst van HIV in CD4+ T-cellen. βchemokines zijn in staat de zogenaamde R5-virussen die CCR5 als coreceptor gebruiken competitief te blokkeren, maar niet de zogenaamde X4-virussen die CXCR4 als alternatieve coreceptor gebruiken. β-chemokines bleken in staat HIV replicatie in CD4+ T-cellen en PBMCs in vitro te onderdrukken (Cocchi et al., 1995). In macrofagen bleek de HIV replicatie door β-chemokines niet geremd te worden (Barker et al., 1998a). Ofschoon de β-chemokines wel degelijk anti-HIV activiteit hebben, voldoen ze niet aan alle kenmerken van CAF. CAF is in staat de replicatie van beide typen HIV, zowel X4- als R5-virussen, te remmen. De βchemokines dragen dus wel bij aan de CD8+ cel anti-HIV activiteit, maar er moeten nog andere componenten bij betrokken zijn (figuur 11). Zijn defensines een mogelijke kandidaat voor CAF? Hoewel er meerdere klassen defensines zijn, heeft men tot nu toe de aandacht vooral gericht op de α-defensines. De verschillende α-defensines bleken gezamenlijk in staat zowel de replicatie van R5- als X4virussen te remmen. Wanneer gebruik gemaakt werd van antilichamen tegen de αdefensines werd de replicatie van X4-virussen geheel niet meer geremd. De inhibitie van de replicatie van R5-virussen verdween gedeeltelijk, maar nooit helemaal. Dit zou verklaard kunnen worden door een mogelijke activiteit van β-chemokines tegen R5-virussen (Cocchi et

34

al., 1995). De cellulaire oorsprong van de α-defensines bleek echter niet de CD8+ T-cel te zijn, maar de neutrofiel. Een van de kenmerken van CAF is dat het eiwit uitsluitend geproduceerd wordt door geactiveerde CD8+ cellen (Levy et al., 1996), vandaar de naam CD8+ cel Antivirale Factor ofwel CAF. Aangezien α-defensines niet geproduceerd worden door CD8+ T-cellen zou dit betekenen dat α-defensines niet de identiteit van CAF kunnen hebben. Het is echter mogelijk dat er naast de CD8+ T-cel nog andere producenten van CAF bestaan en dat dus de term CAF incorrect is (figuur 11).

Figuur 11. Hypothetisch model samenstelling en werking CAF.

Aangezien na eliminatie van α-defensines en β-chemokines slechts zeer geringe antiHIV activiteit overblijft, is het mogelijk dat ze in combinatie bijdragen aan de werking van CAF. Het is dus nuttig om verder onderzoek te verrichten aan het precieze mechanisme van hun antivirale werking. CAF is in staat STAT1 te activeren, wat vervolgens leidt tot inductie van IRF-1 en inhibitie van LTR-gereguleerde genexpressie (Chang et al., 2002). α-defensine 1 blijkt daarentegen STAT1-onafhankelijk te werken (Chang et al., 2003). β-chemokines vertonen anti-HIV activiteit door te interfereren met de binnenkomst van HIV. Vooralsnog is niet bekend of β-chemokines daarnaast een STAT1-afhankelijke werking hebben om HIV replicatie te remmen. Bij verdere pogingen om de identiteit van CAF te bepalen is een produkt van CD8+ Tcellen geïdentificeerd dat in staat is X4-Tropic stammen van HIV te remmen (Geiben-Lynn et al., 2002b). Dit heparine-bindende eiwit blijkt een gemodificeerde vorm van ATIII te zijn. Uit

35

vergelijking van de CD8+ T-cellen van HIV-seropositieve individuen met de CD8+ T-cellen van HIV-seronegatieve individuen bleek dat ongestimuleerde CD8+ T-cellen niet in staat waren HIV replicatie te remmen, ook niet in aanwezigheid van heparine. Alleen geactiveerde CD8+ T-cellen van HIV-geïnfecteerde personen zijn dus in staat ATIII te modificeren tot een vorm met anti-HIV activiteit. Seronegatieve CD8+ T-cellen produceren deze antivirale activiteit niet of in mindere mate omdat de CD8+ T-cellen minder geactiveerd worden en er dus minder factor geproduceerd wordt om ATIII te kunnen modificeren. Tot dan toe was de zoektocht naar CAF vooral gericht op factoren die uitgescheiden werden door CD8+ T-cellen. Maar nu blijkt dat CD8+ T-cellen ook een serumeiwit kunnen activeren om HIV te gaan remmen. Dit maakt het aannemelijk dat een deel van CAF een protease is (figuur 11). Waarschijnlijk remt ATIII HIV niet als competitieve agonist van CXCR4. Er is namelijk niet waargenomen dat het eiwit CXCR4 downreguleert (Geiben-Lynn et al., 2002b). NKEF-A en –B bleken meer geproduceerd te worden door CD8+ T-cellen van HIVseropositieve dan door CD8+ T-cellen van HIV-seronegatieve personen. Wanneer T-cellen getransfecteerd werden met NKEF-A en –B cDNA bleek HIV replicatie in vitro te worden geremd. De NKEFs bleken ook in staat replicatie van SIV te remmen. In vitro bleek HIV replicatie afgenomen wanneer NKEF eiwitten in CD4+ T-cellen tot overexpressie waren gebracht. Wellicht dragen deze antioxidante eiwitten bij aan de antivirale activiteit van CD8+ T-cellen (figuur 11). Hoewel deze eiwitfamilie enkele chemokine-achtige eigenschappen heeft, zoals heparine-binding en chemotaxis, is het antivirale mechanisme van de NKEFs waarschijnlijk heel anders. Dit maakt onderzoek naar de antivirale werking van NKEFs natuurlijk erg interessant. De NKEFs hebben wellicht het vermogen om te dienen als een soort synergistische therapie (Geiben-Lynn et al., 2003). De precieze identiteit van CAF is vooralsnog niet bekend. Dit kan betekenen dat één nog onbekende factor voor de totale CAF activiteit zorgt of dat meerdere componenten door met elkaar te interacteren deze activiteit veroorzaken. In een hypothetisch model is de mogelijke interactie tussen verschillende componenten weergegeven. Er zijn nog vele andere kandidaten bekeken die bij zouden kunnen dragen aan de activiteit van CAF, maar vooralsnog is de precieze samenstelling van CAF niet bekend. In het model is weergegeven wat er tot nu toe bekend is over de werking en samenstelling van CAF (figuur 11). Wanneer de precieze werking van CAF bekend is, zal dit begrip bij kunnen dragen aan de ontwikkeling van nieuwe therapieën tegen HIV.

36

4. Referenties Balter, M. (1997) HIV survives drug onslaught by hiding out in T-cells. Science 278, 1227 Barker, E., Bossart, K.N., Levy, J.A. (1998a) Primary CD8+ cells from HIV-infected individuals can suppress productive infection of macrophages independent of β-chemokines. Immunology 95, 1725-1729 Barker, E., Mackewicz, C.E., Reyes-Terán, G., Sato, A., Stranford, S.A., Fujimora, S.H., Christopherson, C., Chang, S., Levy, J.A. (1998b) Virological and immunological features of Long-Term Human Immunodeficiency Virus-infected individuals who have remained asymptomatic compared with those who have progressed to Acquired Immunodeficiency Syndrome. Blood 92, 3105-3114 Chang, T.L., Francois, F., Mosoian, A., Klotman, M.E. (2003) CAF-mediated Human Immunodeficiency Virus (HIV) type 1 transcriptional inhibition in distinct from α-defensin-1 HIV inhibition. Journal of Virology 77, 6777-6784 Chang, T.L., Mosoian, A., Pine, R., Klotman, M.E., Moore, J.P. (2002) A soluble factor(s) secreted from CD8+ T lymphocytes inhibits HIV-1 replication through STAT activation. Journal of Virology 76, 569-581 Cocchi, F., Devico, A.L., Garzino-Demo, A., Arya, S.K., Gallo, R.C., Lusso, P. (1995) Identification of RANTES, MIP-1α d MIP-1β as the major HIV-suppressive factors produced by CD8+ T-cells. Science 270, 1811-1815 Cohen, J. (1993) AIDS research: the mood is uncertain. Science 260, 1254-1265 Cole, A.M., Hong, T., Boo, L.M., Nguyen, T., Zhao, C., Bristol, G., Zack, J.A., Waring, A.J., Yang, O.O., Leher, R.I. (2002) Retrocyclin : a primate peptide that protects cells from infection by T-and M-tropic strains of HIV-1. PNAS 99, 1813-1818 Connor, R.I., Sheridan, K.E., Ceradini, D., Choe, S., Landau, N.R. (1997) Change in coreceptor use correlates with disease progression in HIV-1-infected individuals. Journal of Experimental Medicine 185, 621-628

37

Darnell, J.E. (1997) STATs and gene regulation. Science 277, 1630-1635 Engelhard, V.H. (1994) How cells process antigens. Scientific American august, 42-51 Gallo, R.C. and Montagnier, L. (1988) AIDS in 1988. Scientific American october, 25-32 Geiben-Lynn, R. (2002a) Anti-human immunodeficiency virus noncytolytic CD8+ T-cell response: a review. AIDS Patient Care and STDS 16, 471-475 Geiben-Lynn, R., Brown, N., Walker, B.D., Luster, A.D. (2002b) Purification of a modified form of bovine Antithrombin III as an HIV-1 CD8+ T-cell Antiviral Factor. Journal of Biological Chemistry 277, 42352-42357 Geiben-Lynn, R., Kursar, M., Brown, N.V., Addo, M.M., Shau, H., Lieberman, J., Luster, A.D., Walker, B.D. (2003) HIV-1 antiviral activity of recombinant Natural Killer Cell Enhancing Factors, NKEF-A and NKEF-B, members of the peroxiredoxin family. Journal of Biological Chemistry 278, 1569-1574 Greene, W.C. (1993) AIDS and the immune system. Scientific American september, 67-73 Haseltine W.A. and Wong-Staal, F. (1988) The molecular biology of the AIDS virus. Scientific American october, 34-42 Janeway, C.A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. (2001) Immunobiology (5th ed.): the immune system in health and disease. Garland Publishing, New York Lehrer, R.I. and Ganz, T. (2002) Defensins of vertebrate animals. Current opinion in Immunology 14, 96-102 Levy, J.A. (2001) The importance of the innate immune system in controlling HIV infection and disease. Trends in Immunology 22, 312-315 Levy, J.A. (2003) The search for the CD8+ cell anti-HIV factor (CAF). Trends in Immunology 24, 628-632

38

Levy, J.A., Mackewicz, C.E., Barker, E. (1996) Controlling HIV pathogenesis: the role of the noncytotoxic anti-HIV response of CD8+ T-cells. Immunology Today 17, 217-224 Locher, C.P., Blackbourne, D.J., Levy, J.A. (1999) Suppression of HIV-1 replication by a soluble factor produced by CD8+ lymphocytes from HIV-2-infected baboons. Immunology 66, 151-157 Mackewicz, C.E., Blackbourne, D.J., Levy, J.A. (1995) CD8+ T-cells suppress HIV replication by inhibiting viral transcription. Immunology 92, 2308-2312 Mackewicz, C.E., Craik, C.S., Levy, J.A. (2003a) The CD8+ cell noncytotoxic anti-HIV response can be blocked by protease inhibitors. PNAS 100, 3433-3438 Mackewicz, C.E., Garovoy, M.R., Levy, J.A. (1998) HLA compatibility requirements for CD8+ T-cell-mediated suppression of HIV replication. Journal of Virology 72, 10165-10170 Mackewicz, C.E., Wang, B., Metkar, S., Richey, M., Froelich, C.J., Levy, J.A. (2003b) Lack of the CD8+ cell anti-HIV factor in CD8+ cell granules. Blood 102, 180-183 Mackewicz, C.E. and Yang, L.C. (1994) Non-cytolytic CD8 T-cell anti-HIV responses in primary HIV-1 infection. Lancet 344, 1671-1673 Moriuchi, H., Moriuchi, M., Combadiere, C., Murphy, P.M., Fauci, A.S. (1996) CD8+ T-cellderived soluble factor(s), but not β-chemokines RANTES, MIP-1α d MIP-1β suppress HIV-1 replication. Medical Sciences 93, 15341-15345 Nakashima, H., Yamamoto, N., Masuda, M., Fujii, N. (1993) Defensins inhibit HIV replication in vitro. AIDS 7, 1129 Nowak, M.A. and McMichael, A.J. (1995) How HIV defeats the immune system. Scientific American august, 42-49

39

Stranford, S.A., Skurnick, J., Louria, D., Osmond, D., Chang, S., Sninsky, J., Ferrari, G., Weinhold, K., Lindquist, C., Levy, J.A. (1999) Lack of infection in HIV-exposed individuals is associated with a strong CD8+ cell noncytotoxic anti-HIV respons. Immunology 96, 10301035 Tomaras, G.D., Lacey, S.F., McDanal, C.B., Ferrari, G., Weinhold, K.J., Greenberg, M.L. (2000) CD8+ T-cell-mediated suppressive activity inhibits HIV-1 after virus entry with kinetics indicating effects on virus gene expression. PNAS 97, 3503-3508 Tsubota, H., Lord, C.I., Watkins, D.I., Morimoto, C., Letvin, N.L. (1989) A cytotoxic T lymphocyte inhibits acquired immunodeficiency syndrome virus replication in peripheral blood lymphocytes. Journal of Experimental Medicine 169, 1421-1434 Walker, C.M, Erickson, A.L., Hsueh, F.C., Levy, J.A. (1991) Inhibition of Human Immunodeficiency Virus replication in acutely infected CD4+ cells by CD8+ cells involves a noncytotoxic mechanism. Journal of Virology 65, 5921-5929 Yang, D., Biragyn, A., Kwak, L.W., Oppenheim, J.J. (2002) Mammalian defensins in immunity: more than just microbicidal. Trends in Immunology 23, 291-295 Youle, R.J., Wu, Y., Mikulski, S.M., Shogen, K., Hamilton, R.S., Newton, D., Alessio, G.D., Gravell, M. (1994) RNase inhibition of Human Immunodeficiency Virus infection of H9 cells. Medical Sciences 91, 6012-6016 Zhang, L., Yu, W., He, T., Yu, J., Caffrey, R.E., Dalmasso, E.A., Fu, S., Pham, T., Mei, J., Ho, J.J., Zhang, W., Lopez, P., Ho, D.D. (2002) Contribution of human α-defensin 1, 2 and 3 to the anti-HIV activity of the CD8 Antiviral Factor. Science 298, 995-999 Zhang, L., Lopez, P., He, T., Yu, W., Ho, D.D. (2004) Retraction of an interpretation. Science 303, 467

40