Obecné zákonitosti účinku toxických látek a vznik rezistence vůči nim Cílem zde uvedených referátů je popsat problémy, které nejsou běžně uváděny, ale jimž by měl pracovník v ochraně rostlin rozumět. Snažíme se vyhnout informacím, které jsou dostupné v metodických návodech. Již lékař Paracelsus kolem roku 1500 uvádí, že toxickou není látka, ale její dávka. Jestliže kuchyňská sůl má toxicitu pro teplokrevné asi 850 mg/kg, je tedy toxičtější než řada pesticidů, které mají ED50 2000 – 5000 mg/kg. Praktické využití pesticidů je založeno na jediném principu – pesticidní látka je pro škodlivý organismus toxická v nižších dávkách než pro rostlinu. Účinek všech toxických látek je založen na jejich nepříznivém zásahu do metabolismu organismu. Proto organismy v klidovém stadiu jsou vůči nim zcela necitlivé (semena plevelů v půdě, dormantní stadia škůdců). Látka může působit jen tehdy, bude-li přítomna až organismus bude metabolicky aktivní. Citlivost organismu se mění s fází jeho vývoje, je různá u jednotlivých instarů, u vývojových fází plevelů atd. Vztah mezi toxickou látkou a reakcí živého organismu má obecnou platnost. Jeho zákonitosti jsou stejné ať už se jedná o velké živočichy, houby či bakterie. Je důležité si uvědomit, že sice mluvíme o působení insekticidu na mandelinku bramborovou, jako by šlo o jedince, nebo více stejných jedinců, ale ve skutečnosti pesticid působí na populaci jedinců daného druhu, kteří jsou vůči dané látce různě citliví. Mezi dávkou a účinností
je složitý vztah. Ten je příčinou, proč v toxikologii i
v laboratorních testech pesticidů nejčastěji stanovujeme dávku, která usmrtí 50 % jedinců, nikoliv l00 %, jak by se zdálo logické. V grafu č. 1 je znázorněn vztah mezi dávkou a účinností. Tou může být procento usmrcených jedinců pokusného hmyzu. U velmi nízkých dávek, vidíme, že nedochází k žádné úmrtnosti. Při postupném zvyšování dávek narůstá počet usmrcených jedinců. Důležité je, že vztah mezi dávkou a jejím účinkem není přímočarý. Jestliže u velmi nízkých dávek zvýšíme aplikovanou dávku na dvojnásobek, zvýší se účinnost jen málo. Naopak v oblasti kolem 50% účinnosti je nárůst výrazný. Postupně se zvyšováním dávky se zvyšuje i její účinek. Pokud se dostaneme na úroveň kolem 50 % je zde průběh křivky téměř přímočarý. Dále se opět zplošťuje a v úrovni kolem 99 % je již téměř vodorovný.
Graf č. 1 Vztah mezi dávkou a účinností při různém sklonu křivek účinnosti Toto je obecně platná zákonitost vztahu mezi dávkou toxikantu a jeho účinkem. Platí pro všechny látky ve vztahu ke všem živým organismům a jejich reakcím na toxikant. Čím vyšší hodnotu účinnosti si zvolíme, z tím plošší části křivky ji stanovujeme. Uváděné hodnoty jsou pak zatíženy velkou statistickou chybou, neboť na koncích křivky jsou dány jen malým počtem jedinců. Proto čím vyšší hodnotu účinnosti než ED50 chceme stanovit, s tím menší statistickou přesností ji lze vypočíst.
Pro hodnoty blížící se stovce nelze již dosáhnout
potřebnou statistickou přesnost a ED99 je proto hodnotou v běžných pokusech nereálnou. Sklon křivky účinnosti Křivka účinnosti je různě strmá u jednotlivých látek i při různém způsobu aplikace. Sklon křivky je dán rozdílnou reakcí testovaných jedinců. Jestliže rozdíly v citlivosti jedinců jsou malé, sklon křivky je strmý, jestliže rozdíly jsou velké, sklon křivky je plochý. Sklon křivky je tedy odrazem genetické variability organismu v daném znaku – v citlivosti na zkoumanou látku. Což má zásadní vliv z hlediska vzniku rezistence – viz dále. Toto platí pro srovnání více látek za konstantních podmínek pokusu. Tatáž látka vykazuje různé sklony křivky účinnosti v pokusech prováděných za různých podmínek. Čím větší je variabilita podmínek pokusu, tím plošší je křivka účinnosti – se změnou dávky se méně mění účinnost. V polních pokusech jsou křivky účinnosti plošší, neboť je v nich větší variabilita.
Například někteří jedinci jsou zasaženi malými dávkami, nebo žijí skrytě v nižších patrech porostu a nejsou zasaženi vůbec. Při ploché křivce účinnosti nemá změna dávky o 20 i o 30 % žádný význam. U látek, které mají strmou křivku účinnosti se může výrazně projevit. Z toho co bylo výše řečeno vyplývá, že kromě různé citlivosti jedinců dané geneticky, ovlivňují sklon křivky vnější faktory, především rozdílné množství nánosu na jednotlivých listech. Účinnost fungicidu proti plísni bramborové se proto méně mění s dávkou než např. účinnost kontaktního herbicidu proti vzcházejícím plevelům. Účinnost je v polních podmínkách ovlivněna mnoha faktory. Proto registrovaná dávka má v sobě zahrnutou určitou reservu. Měli-li bychom prokázat, že ji lze snížit, museli bychom mít mnoho pokusů za různých podmínek. Navíc pokusy by musely být velmi rozsáhlé, aby zjištěné rozdíly byly statisticky významné. Uvedené skutečnosti vysvětlují proč pokud v jednom pokusu snížíme dávku řekněme i o 30 %, velmi často „prokážeme“, že nedošlo ke snížení účinku.
Rezistence škodlivých organismů vůči pesticidům O rezistenci mluvíme tehdy, jestliže určitý škodlivý organismus byl vůči dané látce zpočátku citlivý a teprve v důsledku jejího používání svou citlivost ztratil – stal se rezistentním. Původně se říkalo „získaná rezistence“
– pro jednoduchost říkáme jen
„rezistence“. Jako rezistenci nemůžeme označit případ, kdy nějaká látka nepůsobí na určité organismy od samého počátku. Například růstové herbicidy hubí většinu dvouděložných plevelů, ale nepůsobí na trávy. Toto nelze označit za rezistenci. Každý druh živého organismu se vyskytuje jako populace jedinců do určité míry se lišících některými svými znaky – mimo jiné i citlivostí vůči použitému pesticidu. Zpočátku studia rezistence jsme mluvili o rezistenci druhu. Dnes si uvědomujeme, že se vždy setkáváme s populací jedninců o různých vlastnostech, tedy i o různé citlivosti/rezistenci vůči dané látce. Důležité je procentické zastoupení citlivých i různě rezistentních jedinců. Jestliže budeme opakovaně používat danou pesticidní látku, bude podíl citlivé subpopulace klesat a narůstat podíl subpopulace rezistentní. Pesticid ztratí účinnost a v praxi takovou situaci označíme jako rezistenci daného škodlivého organismu vůči používanému pesticidu. Jestliže tuto látku přestaneme používat, bude se populace navracet do původního stavu, bude se opět zvyšovat podíl citlivých jedinců a klesat podíl jedinců rezistentních.
Jestliže účinná látka pesticidu zasahuje mnoho různých biochemických reakcí v buňce škodlivého organismu, znamená to, že zasahuje do procesů řízených mnoha zcela různými geny – výsledná citlivost je jakýmsi průměrem těchto procesů. Určité odlišnosti řízené jedním genem se v tomto průměru neprojeví. Aby došlo k takové změně, kterou bychom z praktického hlediska mohli označit jako rezistenci, muselo by se naráz změnit mnoho genů. To není reálné, to už by byl jiný organismus. Proto také u starších „klasických“ kontaktních fungicidů rezistence na tomto principu nevzniká (např. mancozeb, thiram). Všechny výše uvedené mechanismy vzniku rezistence jsou do jisté míry selektivní. Reagují na určité vlastnosti látky. To znamená, že organismus je rezistentní ne vůči jedné látce, ale vůči všem příbuzným látkám, které mají stejným biochemický mechanismus účinnosti. Toto se označuje jako křížová rezistence. Od rezistentního jedince k rezistentní populaci Na základě matematických zákonitostí lze dokázat, že v každé populaci je jedinec rezistentní vůči dané látce. Nelze odlišit, zda už byl přítomen, nebo právě vznikl na základ genetických změn. Vznik rezistence je prakticky významným problémem u pesticidů zasahujících zpravidla do jediného biochemického procesu řízeného jedním nebo několika málo geny. Zde mohou nastat z praktického hlediska dvě významně odlišné situace: 1 – V populaci škodlivého organismu jsou už přítomni rezistentní jedinci. Jejich zastoupení je velmi nízké, ale jestliže pesticid vyhubí citlivé jedince, získávají tito rezistentní jedinci životní prostor a rychle se namnoží. Dochází k velmi rychlé ztrátě účinnosti pesticidu. 2 – Rezistentní jedinci vznikají pomocí mutací či jiných genetických změn. Jejich podíl v době působení fungicidu pozvolna narůstá, v době kdy populace není vystavena účinku fungicidu opět klesá. Toto je situace zřejmě nejčastější. Účinnost pesticidů vůči škodlivým organismům je ovlivňována mnoha faktory. Rezistence jako prakticky významný problém nastává tehdy, jestliže je snížení citlivosti některých jedinců v populaci škodlivého organismu dědičné. Za zdroj nového znaku – rezistence, jsou většinou považovány mutace. Pohlavní rozmnožování usnadňuje vznik nových kombinací znaků a tedy i usnadňuje, aby vznikl rezistentní jedinec. Ovšem v dalších generacích dochází ke štěpení znaků a udržuje se určité zastoupení citlivých a rezistentních jedinců. Nárůst zastoupení rezistentních jedinců v populaci je pomalý. Naopak při
nepohlavním rozmnožování je potomstvo geneticky identické – všichni potomci rezistentního jedince jsou rezistentní. Poněvadž citliví jedinci jsou pesticidem vyhubeni je možné, aby se rezistentní jedinec rychle namnožil a populace jako celek se stala rezistentní. Toto je jednou z příčin problémů, které máme s rezistencí u škodlivých organismů, které se nepohlavně rozmnožují během vegetace např. padlí, mšice, svilušky a další. Klíčovým pojmem je fitness. Není podstatné zda rezistence vznikne, ale zda rezistentní kmen bude mít i dostatečnou fitness, aby se mohl namnožit a způsobit škody. Jako fitness označujeme celý komplex vlastností, které umožňují aby potomstvo rezistentního jedince přežívalo a množilo se v konkurenci původních citlivých kmenů. Nové mutace jsou zpravidla recesivní a méně životaschopné. Dík tomu v případě, že přestaneme používat danou látku, pomine selekční výhoda rezistentních jedinců a v populaci postupně začnou převládat citliví jedinci. Toto jsou důvody, proč u látek ohrožených vznikem rezistence se omezuje počet aplikací . Vliv dávky na riziko vzniku rezistence Z praktického hlediska je důležité zodpovědět otázku, jak aplikovaná dávka přípravku ovlivňuje riziko vzniku rezistence.V praxi zpravidla převládá starší představa o tom, že nižší dávka přispívá ke vzniku rezistence, neboť umožňuje, aby rezistentní kmeny přežily a namnožily se. Toto by mohla být do určité míry pravda v situaci, kdy je rezistence řízena větším počtem genů. Jestliže je vysoký stupeň rezistence řízen jediným genem, pak nízká aplikovaná dávka nemůže vznik rezistence ovlivnit, neboť rezistentní kmeny neinhibuje třeba ani dávka 1000krát vyšší. Opačný názor říká, že rezistentní populace, tedy ta kterou v praxi zaznamenáme v důsledku ztráty účinnosti fungicidu vzniká v důsledku selekčního tlaku – čím častěji a v čím větší dávce fungicid aplikujeme, tím rychleji z populace odstraníme citlivé kmeny a populace se stane rezistentní. Nižší dávka znamená nižší selekční tlak a proto i nižší riziko vzniku rezistence. Je tu však ještě jeden prakticky významný faktor, který tyto časté úvahy převrací naruby. Platily by, pokud by všechny části rostliny byly ošetřeny přesně stejnou dávkou fungicidu. Víme však, že tomu tak zdaleka není. Například při ošetření obilnin proti klasovým chorobám je největší množství fungicidu zachyceno klasem a praporcovým listem, na druhém a třetím listu shora je již fungicidu mnohem méně a do nižších pater již fungicid téměř neproniká. To znamená, že v horní části rostliny může být dávka fungicidu dostatečně vysoká,
aby působila i na kmeny s určitou sníženou citlivostí, ale v nižších patrech se patogen rozvíjí stejně jako na neošetřené rostlině. Jestliže zvýšíme, nebo snížíme dávku fungicidu dvakrát, nebo i čtyřikrát, je to nepatrná změna proti tomuto rozdílu v dávce dopadající na horní a spodní listy v rozsahu statisícínásobků (pokud nějak vyjádříme dávky na spodních listech blížící se nule). Z toho vyplývá, že za těchto běžných provozních podmínek změna dávky nemůže mít podstatný vliv na to, zda se populace stane rezistentní dříve či později. Rozhodující je jak často použijeme pesticid se stejným mechanismem účinku. V případě, že po aplikaci jakéhokoliv pesticidu jsme nedosáhli očekávanou účinnost, je třeba nejprve hledat všechny možné jiné příčiny neúspěchu než rezistenci. Může jí být ošetření v nevhodném termínu, u houbových chorob nejčastěji příliš pozdní aplikace, špatná dávka, nevhodná účinná látka, nepříznivé povětrnostní podmínky a podobně. Rezistence jako příčina špatné účinnosti je u nás zatím nejméně častou. Je to především dáno velmi nízkou intenzitou chemické ochrany u nás a to zvláště v případě fungicidů. Jak předcházet vzniku rezistence je problém nejsložitější. Vyžaduje, aby všichni pěstitelé dodržovali doporučené pokyny pro používání jednotlivých látek. Rezistentní kmeny se mohou od neukázněného pěstitele šířit do okolí a znehodnocovat tak úsilí ostatních. Anti-rezistentní strategie se objevuje už jako součást doporučení při registraci nových látek. Základními opatřeními jsou: - omezení počtu aplikací dané skupiny látek během vegetace (viz křížová rezistence) - kombinace více účinných látek s různým mechanismem účinku, nejčastěji např. jednopolohové fungicidy (systémové) s vícepolohovými (kontaktními). - střídání pesticidů s různým mechanismem účinku - použití všech jiných dostupných metod ochrany s cílem omezit potřebu chemických zásahů. Témuž slouží i cílená aplikace na základě prognózy a signalizace.
