Obecná Zoologie Pro kombinované i denní studium biologie
Doplněk skript Opora OZ, kap. 8 Zařízení a metody pro studium buněk a tkání Pouze pro osobní potřebu účastníka konzultace Šíření v rozporu se zákonem o autorských právech
Mareš V., KBI, PřF UJEP Ústí n.L. Aktualizováno 14.2.2010 Pokud není uveden jiný zdroj materiál je z archivu autora
Metody a zařízení pro studium buněk a tkání Mikroskopy – Světelné - Transmisní klasické fázový a DIF kontrast Inverzní pro buněčné kultury fázový a DIF kontrast Fluorescenční: klasické i inverzní konfokální luminiscentní -Elektronové - Transmisní Skanovací - Atomové (AMF) Doplňková zařízení viz další snímek
Obr označené * jsou z této publikace. Autoři jednotlivých kapitol jsou uvedeny u příslušných snímků
Opora OZ kap.9
Doplňková zařízení ke SM a EM: 1. Kreslící zařízení pro SM (Abbeho zrcátko, ramenový tubus, grafické tablety aj. ) 2. Fotografická zařízení pro SM a EM ( fotografické aparáty a digitalizační kamery) 3. Počítačová analýza mikroskopických obrazů 4. X-ray mikrodensitometrie pro stanovení chemických prvků
Další speciální zařízení 1. Průtokové (flow-) cytofluorometry 2. „Třídiče“ buněk (Cell sorters) 3. Separační centrifugy (pro isolaci buněk ) 4. Robotická zařízení pro tzv. microarrays („mikrořady“) 5. Atomové mikroskopy (Atom Force Microscopy, AMS)
*
RS objektivu (RS) = Nejmenší vzdálenost mezi 2 body kdy ještě „nesplývají v jeden“ RS = 0. 61 x λ/n.sin alfa n= refrakterní index skla, montovacího a imersního media sin alpha = ½ sinus vstupního úhlu světla = numerická apertura ! (NA) λ=vlnová délka světla 0.61= konstanta pro tzv. inkoherentní světlo. Cave: modré světlo 400- 470 nm; zelené: 565 nm; červené : >600nm; Max. RS oka: 500-1000 um , SV: 0.2 um (200nm) ,
*
*
*
Typy světelných mikroskopů Klasické transmisní pro denní světlo Inverzní pro práci s buněčnými kulturami Fluorescenční Polarizační Pomocná zařízení Fázový kontrast Fotodokumentace a analýza obrazu
Rozlišovací schopnost objektivu (RS) = Nejmenší vzdálenost mezi 2 body kdy ještě „nesplývají v jeden“ RS = 0. 61 x λ/n.sin alfa n= refrakterní index skla, montovacího a imersního media sin alfa = ½ sinus vstupního úhlu světla = numerická apertura ! (NA) λ=vlnová délka světla 0.61= konstanta pro tzv. inkoherentní světlo
1. 3 Typy a vlastnosti objektivů pro SM: 1. Suché 2. Imersní: (olejové, nebo vodní) Vady objektivů a jejich korekce (kombinací vícero typů čoček z různých druhů skla- flintové, korundové,křemičité ): 1. Vada chromatická: Části spektra s odlišnou λ mají různý fokus→ neostrý obraz. Objektivy s korekcí pro 2 barvy: achromáty; pro 3 barvy: apochromáty 2. Vada sférická: Střed čočky láme světlo více než okraje → neostrý obraz 3. Nerovnoměrné zakřivení zorného pole. Objektivy s korekcí: planapochromáty (dokonale ploché pole)
Nervová tkáň v trasnsmisním světelném mikroskopu Parafin, H&E, 400x
a mozečku v trasnsmisním světelném mikroskopu afin, H&E, 200x
Kůra mozečku v trasnsmisním světelném mikroskopu Parafin, Luxol stain, 600x
Buňky ve fázovém kontrastu v kultuře (jádra a cytoplazma s organelami vč. cytoskeletu)
* text z Jaečková a ost
Inverzní světelný mikroskop
*
*
* text z Jaečková a ost
*
Mikrofilamenta zobrazena protilátkou proti aktinu fluorescenční technikou
mouse mab anti-actin, anti mouse IgG-FITC
9.1 4. Konfokální mikroskop pracuje s laserovým (i) paprskem(y), kterými excituje fluorochrom navázaný na molekuly buňky. Mikroskop provádí automaticky skanování objektu v různých hloubkách. Získané obrazy automaticky zaznamenává a umožňuje tak prostorové („3D“) zobrazení molekul a organel v buňce. *
*Pala a Krist 2008
*
*
*
*
Výroba monoklonálních protilátek
Ferenčík
9. 2 Elektronový mikroskop 1. Trasmisní (TEM) 2. Skanovací (SEM)
RS EM = 0. 61 x λ/n.sin alfa = 0.0002 um (0.2 nm, 2A ) RS (λ elektronů 0.005 nm (50 000 V na katodě)
*
*
EM gliových buněk v kultuře
Gliové buňky v kultuře extra situm (Skenovací elektronový mikroskop zobrazující povrch buněk) Optimální růstové podmínky
Změny po chemicky vyvolané inhibici růstu
9.5 Příprava mikroskopických preparátů a jejich barvení 9. 5. 1 Typy mikroskopických preparátů: a. Nátěry b. Otisky c. Roztlače d. řezy 9. 5. 2. Fixace biologického materiálu: Denaturace a inaktivace bílkovin, především enzymů. Tím se zabrání samovolnému rozkladu tkáně lyszomálními enzymy (konservace tkáne). Denaturace bílkovin vyvolá změny prostorové konfigurace bílkovin a tím často zlepší dostupnost („obnaží“) reaktivní funkční skupiny molekul buňky. Chemická fixativa (viz níže) mohou některé molekuly z buňky vyluhovat. Typy fixace: Fyzikální (zmražení, mrazové vysoušení, krátkodobé zvýšení teploty, mikrovlné záření) Chemická (formaldehyd, ethanol, methanol, aceton, kyselina octová, pikrová, osmičelá a j.) Nejčastěji použivané fixační směsi: Carnoyova tekutina (ethanol + octová kys.+ ev. chloroform, 6:3:1, Bakerova tekutina: 10% formol-chlorid vápenatý, Buinova tekutina: formalin 37% 25 ml, pikrová kyselina nasycená 75ml, octová kyselina ledová 5 ml).
9. 5. 3 Zalévání vzorku do zpevňujících medií Prosycení biologického vzorku pevnou látkou (viz níže) umožní krájení tenkých řezů. Předchází „vyprání“ fixativa, dehydratace tkáně a její prosycení rozpustidlem zalévací hmoty. Nejčastější zalévací hmoty: Celoidin (nitrocelulóza v ethanolu), parafin, Paraplast-Plus (+ DMSO), sacharóza, polymerizující pryskřice pro EM. 9. 5. 4 Krájení Pro studium tkání pod mikroskopem je nezybtné, aby tloušťka prohlíženého objektu nebyla větší než průměrná velikost buněk (7-20 um). V opačném případě se totiž obrazy buněk překrývají. Řezy tkání se pro SM připravují na speciálních zařízeních, tzv. mikrotomech, s kovovým nožem. Dle konstrukce se mikrotomy dělí na sáňkové (objekt je pevně zachycen a pohybuje se nůž) a rotační (nůž je pevně uchycen a objekt se pobybuje). Krájení zmražených tkání se provádí na tzv. zmrazovacím mikrotomu nebo kryostatu, pracujícím při minus 2030oC. Mikrotomy pro EM používá velmi tvrdý a ostrý skleněný nůž, který umožní krájet trvzenou pryskyřici o tlouštce řezu ve zlomích mikrometru.
9. 6 Barvení Cílem barvení je zobrazit bunňky pro pozorování ve SM nebo EM. Před vlastním barvením je nutno ze vzorku odstranit zalévací medium (např. parafin xylenem , pryskyřice methanolem a peroxidem vodíku. Preparáty pro EM se „barví“ ionty těžkých kovù (Os, U aj.) ještě před zalitím do pryskyřice. Barvení orthochromatické: barva buněk a barviva je stejná. Barvení metachromatické: Barvivo barví některou komponentu biologického vzorku odlišně.
9.6.1 Přehledné (nespecifické) barvící metody: Barvení diachromy (chromogeny): Pigmenty pohlcující viditelnou část spektra. Vytvoření kovalentní vazby mezi ionizovanými skupinami organických molekul buněk a iontem barviva (=reaktivní látky s aromatickým řetězcem a vysoce pohyblivými elektrony). Kationická (basická) barviva (pararosanilin, basický fuchsin, kresylvioleť, toluidinová modř, hematoxylin) obsahují volné kationtové skupiny a váží se proto na aniontové skupiny organických molekul buněk (karboxylové, hydroxylové, fosfátové, sulfátové a další). Barví proto hlavně nukleové kyseliny a tzv. ”kyselé” proteiny, obsahující četnější dikarboxylové aminokyseliny. Anionická (kyselá) barviva (žlutá kyselina pikrová, červený eosin a j.) obsahují volné aniontové skupiny se váží na kationtové skupiny organických molekul buněk (aminoskupiny, iminoskupiny sulfhydrylové, β-indolylové a imidazolylové, aj.). Barví např. “basické” tj. diamino aminokyseliny obsahující proteiny (histony).
9. 6 Speciální histochemické a cytochemické metody
-74)
9. 6.1 Přímé barvení organických molekul (např. DNA Feulgenovou reakcí, polysacharidů alciánovou modří, RNA galocyanimem apod.) 9.6.2 Katalytická histochemie enzymů (příloha str. 74) Enzym + jeho substrát---> štěp substrátu, který se převede na barevný produkt. Barevný produkt vzniká: (i) Srážením produktu enzymatické reakce s kationty těžkých kovù (Gomoriho reakce: kationtem těžkého kovu se sráží štěpný produkt, vzniklý činností enzymu. Průkaz fosfatáz, cholinesterázy, sulfatázy, glukuronidázy). Příklad: glycerofosforečnan sodný jako substrát fosfatáz + enzym + Ca++ ----> fosforečnan vápenatý. Přidání AgNO3 ---> fosforečnan stříbrný, který se redukuje na stříbro
(ii) tzv. azokopulací. Bezbarvá diazoniová sùl je zbytkem syntetického štěpného substrátu přemění na azobarvivo. Vhodné pro fosfatázy, esterázy karboxylových kyselin, aminopetidázy aj. Příklad: fosforečný fosfát alfa naftolu + fosfatáza --> štěpný produkt na který se váže bezbarvá diazoniová sůl (Fast Blue B, Fast Red TR Salt a j.), která se přemění na barevný pigment
(iii) Tzv. Indigogenní reakcí: Indoxyl, uvolněný enzymem z indoxyl-substrátu se oxiduje kyslíkem na indigo. Vhodné pro nespecifické esterázy, glukozidázy, galaktosidázy, fosfatázy. (iv) Tzv.tetrazoliovou reakcí: Tetrazoliová sůl je redukovaná vodíkem, který se uvolňuje ze syntetických substrátů flavinovými enzymy (jejichž přítomnost chceme prokázat), a která se mění na barevný a nerozpustný formazan. Vhodné pro dehydrogenázy, monoaminoxidázy, disacharidázy
9. 6. 4 Imunocytochemie (obr. 66 a příloha str. 71) Proti studované molekule se na zvířecím modelu nebo pomocí tzv. hybridomu v buněčné kultuře (viz níže) nejprve vyrobí (dnes již skoro vždy koupí) specifická protilátka, se kterou se buňky inkubují. Protilátka se tak specificky naváže na molekuly, které chceme studovat. Tato tzv. primární protilátka je bezbarvá a proto se musí vizualizovat přímým, nebo nepřímým navázáním-konjugací (“vmezeřením” tzv. sekundární protilátky při tzv.nepřímé metodě barvení) vhodného fluorochromu (nejčastěji tzv. FITC, TRITC, Texas Red-Cy3, Cy5 a další s emisními spektry různé vlnové délky, barva zelená, modrá červena aj.). Příklad: Průkaz vimentinu, bílkoviny středních filamet cytoskeletu. Buňky se inkubují s primární protilátkou proti vimentinu, isolovanou ze séra např. králíka imunizovaného vimentinem. Následuje inkubace s protilátkou proti králičímu imunoglobulinu (vyrobenou např. na praseti nebo ovci a pod.), konjugovanou s některým fluorochromem (viz shora). Struktury obsahující vimentin zeleně fluoreskují po excitaci svìtlem specifické vlnové délky). Viz praktikum
Atom Force Microscopy (AFM)
Poznámka: (a) Protilátky izolované z krve imunizovaného zvířete obsahují imunoglobuliny proti mnoha epitopům (= usekům polypeptidického rětězce) dané látky-antigenu, např. vimentinu, který byl použit k imunizaci zvířete. Proto protilátky polyklonální, neboť jsou tvořeny vícero klony lymfocytů. Protilátky monoklonální se připravují v prvním kroku imunizací myši. Z imunizované myši se isolují lymfocyty, které se jednotlivě “spojí” (hybridizují) s nádorovými buňkami myší sleziny (myelomové buňky). Vznikají tzv. hybridomy, z nichž každý tvoří protilátky proti pouze jednomu epitopu (= úseku polypeptidického řetězce) daného antigenu (např. vimentinu). (b) Sekundární protilátka může být též konjugovaná s enzymem, např. křenovou peroxidázou (KPx),alkalickou fosfatázou a pod. Komplex je pak vizualizován inkubací se substrátem specifickým pro konjugovaný enzym, který je enzymem štěpen a který oxiduje další bezbarvou látku, která se mění na barevný produkt (např. KP rozkládá H2O2, který oxiduje bezbarvý diaminobenzidin na hnědý pigment).
Průtoková (flow-) cytofotometrie Třídiče buněk (cell sorters)
Blotting Podobně lze imunochemicky specifikovat bílkoviny isolované elektroforézou. Z elektroforetogramu se bílkoviny přenesou tzv. blottovaním (blott angl. sací papír) nebo elektrickým nábojem na speciální membránu, která se inkubuje s příslušnými protilátkami a dalšími reagenciemi. Metoda se označuje mezinárodně jako Western blotting v případě, že jsou takto studovány bílkoviny. Northern nebo Southern blotting se používá pro detekci sekvencí nukleových kyselin. V posledních 2 aplikacích se místo imunochemického postupu může použít i postup autoradiografický po předchozím označení tzv. nukletidové sondy radioizopem. Poznámka k terminologii. Blottovací metoda byla poprvé navržena E. Southernem pro izotopové studium DNA. Názvy modifikací podle světových stran jsou slovní hříčky. N (DNA-radio RNA, tzv.RNA sonda) E Glycan-lectin
W (Protein-protilátka) S (DNA-radio- DNA, tzv. DNA sonda) E. Southern
Macromolecule blotting and probing The terms northern, western and eastern blotting are derived from what initially was a molecular biology joke that played on the term Southern blotting, after the technique described by Edwin Southern for the hybridisation of blotted DNA. Patricia Thomas, developer of the RNA blot which then became known as the northern blot actually didn't use the term[2]. Further combinations of these techniques produced such terms as southwesterns (protein-DNA hybridizations), northwesterns (to detect protein-RNA interactions) and farwesterns (protein-protein interactions), all of which are presently found in the literature. Wikipedie……. Northern (DNA-RNA)
Western (protein-protein) Eastern (glycan-lectin)
Southern (DNA-DNA) E. Southern
9. 10 Hybridizace nukleových kyselin Dvouvláknová DNA (double stranded DNA, dsDNA) se denaturací teplem rozvlákní a na každé vlákno (single stranded DNA, ssDNA) se naváže komplementárním párováním předem připravená jednovláknová molekula RNA, nebo fragment DNA (tzv. DNA sonda), které jsou „označena“ isotopem nebo fluorochromem. Tento proces spojení nukleových kyselin se označuje jako hybridizace. Komplex se zviditelní autoradiograficky nebo ve fluorescenčně. V případě, že objektem stdua jsou celé buňky, lze takto lokalizovat např. geny v jádře i na jednotlivých chromozomech, studovat jejich expresi, vyhledávat mutované geny atp. Jde o tzv. hybridizaci in situ. Zkratka často používané FISH metody pak znamená „Fluorescence In Situ Hybridization“.
Microarrays DNA microarrays (arrays= řady, šiky, nepřekládá se do češtiny) jsou založeny rovněž na principu hybridizace nukleových kyselin. Na malou pevnou podložku (cca 2x2 cm) se roboticky nanese formou mikroteček několik set i více známých nukleotidových sond do „řádků“- arrays (průměr tečky cca 100 um, 100-1000 a více. Na takovýto „čip“ se pak nanese nukleová kyselina jednoho nebo vícero studovaných vzorků( mRNA po předchozím přepisu do DNA). Molekuly z obou vyšetřovaných vzorků jsou označeny 2 odlišnými fluorochromy (např. zeleně-FITC nebo červeně-TRITC). V místě komplementární vazby nukleotidových sekvencí sond a vyšetřovaného vzorku (hybridizace) vznikne pevná vazba a objeví se odpovídající fluorescence. V případě vazby molekul 2 vzorků na týž gen vzniká sumaci obou fluorochromů barva žlutá až bílá. Vazba se vyhodnocuje se roboticky Protein microarays. Pracují na podobném principu. Reagovat se však nechává protein s protilátkou. Podrobněji v molekulární biologii Poznámka. Elektroforéza je způsob separace látek v elektrickém poli, ve kterém se látky pohybují ve směru opačného náboje. Klasickým nosičem je agarózový nebo polyakrylamidový gel, který funguje rovněž jako síto přes které se molekuly pohybují rychlostí nepřímo úměrnou jejich molekulové hmotnosti. Metoda má mnoho variant. Provádí se pomocí řady komerčních zařízení. V předkládaných skriptech je zmíněna ELFO separace bílkovin např. pro Western blotty, nukleových kyselin pro DNA finger printing, hybridizaci nukleových kyselin (Southern a Northern blotty, viz shora). Více v Základech chemie a fyziky a Molekulové biologii.
Microarrays
Na destičku (chip) zhruba 2x2 cm je nanesen velký p pikomolárních množství tzv. DNA prób,charakteristic pro různé geny. Po inkubaci ve směsi fluorescenčně označených molekul i mRNA zkoumaných buněk, doj navázání partnerských molekul principem párování nukleotidových bazí (hybridizace). mRNA jedné sku je označena červeně, druhá skupina zeleně. Geny ex v obou skupinách buněk svítí žlutě až bíle. Nanášení i odečítání je robotické. Slouží k mapovaní genomu a jeho exprese. http://en.wikipedia.org/wiki/DNA_micro
Hybridization of the target to the probe http://en.wikipedia.org/wiki/DNA_microarray
http://en.wikipedia.org/wiki/File:Microarray-schema.jpg
9.6.3
Izotopové „značení“ molekul, organel a buněk- autoradiografie
Radioaktivně značená prekurzorová molekula se po podání zvířeti nebo buňkám v kultuře inkorporuje do molekuly, organely a buňky, které chceme studovat. Místo inkorporace se zobrazí fotografickým principem pomocí speciální fotoemulse, která se navrství na histologický řez nebo jiný preparát buněk (autoradiografie). Studovat lze takto i rozložení např. iontů a anorganických molekul. Příklad: 3H-thymidin se podá zvířeti nebo živým buňkám v tkáňové kultuře. Inkorporuje se do DNA buněk v S-fázi buněčného cyklu. Nad buňkami se objeví mikroskopická černá zrníčka stříbra (viz preparáty na praktiku).
Podobně je možno zobrazit radioaktivně značené fragmenty nukleových kyselin nebo bílkoviny rozdělené elektroforézou. Využití autoradiografie pro tento účel (tzv. Southern blott, viz též 9.6.4 ) je dnes nejčastější. Neposkytuje však informaci o lokalizaci inkorporovaného izotopu v buňce. Příklad. Místo 3H-thymidinu se podá zvířeti nebo živým buňkám v tkáňové kultuře atypický nukleotid (nejčastěji bromdeoxyuridin), který buňka nerozpozná jako pozměněný a inkorporuje jej do DNA místo thymidinu. Způsob detekce pomocí protilátky proti bromodeoxyuridinu je uveden v následující kapitoly.
Izotopové i imunocytochemické značení jaderné DNA se využívá k nepřímému studiu buněčného cyklu. Podíl „značených“ buněk v celkové populaci určuje relativní délku S-fáze. V případě, že buňky již později nedělí (např. neurony), inkorporovaná „značka“ ukazuje kde a kdy buňka procházela časnou proliferační fází (tzv. tracing buněk). Tato místa jsou v některých orgánech značně vzdálená místům konečné lokalizace diferencovaných buněk. Příklady na praktiku.
Isolace chromozomů hypotonickým šokem
