Nové mechanismy patogeneze chronické lymfocytární leukémie

MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie

Nové mechanismy patogeneze chronické lymfocytární leukémie Diplomová práce

Pavlína Janovská

VEDOUCÍ PRÁCE: MGR.VÍTĚZSLAV BRYJA, PH.D.

BRNO 2013

Bibliografický záznam Autor:

Bc. Pavlína Janovská Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita, Ústav experimentální biologie

Název práce:

Nové mechanismy patogeneze chronické lymfocytární leukémie

Studijní program:

Experimentální biologie

Studijní obor:

Molekulární biologie a genetika

Vedoucí práce:

Mgr. Vítězslav Bryja, Ph.D.

Odborný konzultant: Mgr. Markéta Kaucká, PhD. Akademický rok:

2012/2013

Počet stran:

82

Klíčová slova:

Chronická lymfocytární leukémie, APP, APLP1, APLP2, WNT/PCP signální dráha

Bibliographic entry Author:

Bc. Pavlína Janovská Masaryk University, Faculty of Science, Department of Experimental Biology

Title of thesis:

New Mechanisms of Chronic lymphocytic Leukemia Pathogenesis

Degree programme:

Experimental Biology

Field of study:

Molecular Biology and Genetics

Supervisor:

Mgr. Vítězslav Bryja, Ph.D.

Co-supervisor:

Mgr. Markéta Kaucká, Ph.D.

Academic year:

2012/2013

Number of pages:

82

Keywords:

Chronic lymphocytic leukemia, Amyloid precursor protein, WNT/PCP pathway, APP, APLP1, APLP2

Abstrakt Chronická lymfocytární leukémie (CLL) byla dlouho povaţována za nemoc, která vzniká v důsledku narušené apoptózy a proliferačních procesů B-lymfocytů. Předpokládalo se, ţe v těle dochází k hromadění nefunkčních imunologicky nekompetentních buněk, které nejsou odstraňovány přirozenou cestou, a tak postupnou akumulací narušují fyziologické procesy v těle. Poslední dobou je ale zřejmé, ţe k patogenezi CLL přispívá mnohem více změn a narušená apoptóza není hlavní příčinou rozšíření klonu CLL buněk. Proliferace CLL buněk je stimulována interakcí s dalšími buněčnými typy v tkáních a orgánech jako jsou kostní dřeň a lymfatické uzliny, kde buňky získávají signály i pro delší přeţívání. Tyto buňky kostní dřeň a lymfatické uzliny často infiltrují, postupně vytlačují normální krvetvorbu a narušují imunitní systém. Často migrují i do dalších orgánů jako jsou játra nebo slezina, kde také narušují jejich fyziologickou funkci. Tato migrace je řízena specifickými chemoatraktanty, běţně nazývanými chemokiny. Právě schopnost CLL buněk aktivně migrovat v chemokinovém gradientu je mechanismus, který v naší laboratoři studujeme. Polarizovaná migrace buněk v gradientu chemokinů je proces řízený dosud málo popsanou WNT/PCP signalizací, která je známá spíše pro svou roli v embryogenezi. Zdá se však, ţe ovlivňuje některé procesy v těle dospělých jedinců, zejména v kontextu polarizace buněk a pohybu v určitém směru. Dráha byla také popsána jako kritická pro rozvoj CLL. Tato práce se soustřeďuje na odhalení funkce amyloidních proteinů, známých hlavně pro svou roli v patogenezi Alzheimerovy choroby, v regulaci WNT/PCP dráhy u CLL. Navazuje na studie, které popisují amyloidní proteiny jako regulátory WNT/PCP v nervové soustavě. V této práci se snaţíme potvrdit hypotézu, ţe amyloidní proteiny mohou fungovat jako modulátory WNT/PCP dráhy i mimo nervovou tkáň, konkrétně v CLL lymfocytech.

Abstract Chronic lymphocytic leukemia (CLL) was for many years considered as a disease caused by disrupted apoptosis and proliferation of B-lymphocytes. These were expected to be immunologically incompetent B-cells, which could not be removed from the body in a natural way, thus accumulated in peripheral blood and lymphoid organs and disrupted physiological processes in the body. Lately, it´s become more and more obvious that the CLL pathogenesis is affected by various other factors and that disrupted apoptosis is not the sole and main reason for expansion of the CLL clone. Proliferation of CLL cells is stimulated by interaction with other cell types in tissues and organs like bone marrow or lymph nodes, where they also obtain prosurvival signals. These cells infiltrate bone marrow and lymph nodes quite often and gradually disrupt normal hematopoesis and immune system. They often migrate to other organs like liver or spleen as well, where they negatively affect their physiological function. This migration is directed by specific chemoatractants, called chemokines. In our lab, we focus on the process of active migration of CLL cells in chemokine gradient. Polarized cell migration in the chemokine gradient is directed by the WNT/PCP pathway, which still has not been completely described and is known mainly for its role during embryogenesis. It seems to be affecting some processes in adult body as well, mainly in connection with directional movement. It has been described as critical for development of CLL. This work concentrates on the role of amyloid proteins, previously described as neurospecific regulators of WNT/PCP, in the pathogenesis of CLL. We try to confirm the hypothesis that these proteins could affect WNT/PCP activity also in other tissues – specifically in CLL B-cells – and play an important role in the CLL pathogenesis.

Poděkování Na tomto místě bych ráda poděkovala svému školiteli Vítězslavu Bryjovi za poskytnutí nesčetného mnoţství příleţitostí a nekončící optimismus ve chvílích, kdy mně dochází (a ţe to není zrovna výjimečná situace v posledním roce). Neméně chci poděkovat Markétě Kaucké, která mi věnovala svůj čas, pomáhala mi spolu s dalšími studenty naučit se všechny základní laboratorní metody a přes veškeré mé nestíhání a zmatky dokončit tuto práci. To by se nepovedlo ani bez podpory Jana Weyra, který před mým útokem alespoň trochu uchránil český jazyk. Děkuji výzkumné skupině prof. Šárky Pospíšilové za poskytnutí materiálu, pracovního prostoru i rad a konkrétně za výbornou intenzivní spolupráci s Šárkou Pavlovou, Kájou Plevovou, Luckou Poppovou a Hanou Mádrovou. Za příleţitost podílet se vůbec na tomto výzkumu a poskytnutý materiál (a příliš často pokoušenou trpělivost) děkuji dr. Bassemu Hassanovi a jeho výzkumné skupině.

Obsah Bibliografický záznam ........................................................................................................... 2 Bibliographic entry ................................................................................................................ 5 Abstrakt ................................................................................................................................. 6 Abstract ................................................................................................................................. 7 Poděkování ............................................................................................................................ 8 Prohlášení ..........................................................................Chyba! Záložka není definována. Seznam zkratek .................................................................................................................... 13 1.

Úvod ............................................................................................................................. 13

2.

Chronická lymfocytární leukémie (CLL)....................................................................... 15 2.1 Biologie CLL.............................................................................................................. 15 2.2 Klinické rozdělnení CLL a terapie .............................................................................. 21 2.3 Molekulární signální dráhy ......................................................................................... 23

3. Rodina amyloidních proteinů APP, APLP1 a APLP2 ....................................................... 30 3.1 APP – Amyloid beta A4 protein.................................................................................. 31 3.2 APLP1, APLP2 .......................................................................................................... 34 4.

Cíle diplomové práce .................................................................................................... 36

5.

Materiály a metody: ...................................................................................................... 37 5.1

Buněčné linie, práce s tkáňovými kulturami ........................................................... 37

5.1.1 HEK293 ............................................................................................................... 37 5.1.2 MEC1 .................................................................................................................. 38 5.1.3 MEF..................................................................................................................... 38 5.2 Transfekce pomocí PEI (polyethylenimin) .................................................................. 39 5.3 Ko-imunoprecipitace .................................................................................................. 40 5.4

Imunocytochemie .................................................................................................. 41

5.5

Polymerázová řetězová reakce v reálném čase (qRT-PCR)..................................... 43

5.5.1

Zpracování cDNA pro klinickou analýzu pacientů s CLL................................ 43

5.5.2

Izolace RNA z buněčné linie MEC1................................................................ 45

5.5.3

Přepis RNA do cDNA ..................................................................................... 45

5.6

Agarózová elektroforéza ........................................................................................ 45

5.7

„Western blotting – SDS page“ .............................................................................. 46

5.7.1

Příprava polyakrylamidového gelu .................................................................. 46

5.7.2

Příprava vzorků .............................................................................................. 47

5.7.3

SDS-page........................................................................................................ 47

Výsledky ...................................................................................................................... 49

6.

6.1 Exprese amyloidních proteinů v B-lymfocytech pacientů s CLL ................................. 50 6.1.1 Charakteristika souboru pacientů .......................................................................... 50 6.1.2 Míra exprese amyloidních proteinů u CLL pacientů ............................................. 53 6.2 Interakce amyloidních proteinů s komponentami WNT/PCP dráhy ............................. 60 6.2.1 APP/APPL, neurospecifický regµlátor WNT/PCP signalizace .............................. 60 6.2.2 APLP2 – potvrzování interakce s komponentami WNT/PCP dráhy – předběţná data ..................................................................................................................................... 66 7.

Diskuze ......................................................................................................................... 69

8.

Souhrn .......................................................................................................................... 72

9.

Summary ...................................................................................................................... 73

10.

Literatura................................................................................................................... 74

Internetové zdroje: ............................................................................................................... 81 11. Přílohy ........................................................................................................................... 82

Seznam zkratek Abeta ABL AD AICD AML APLP1 APLP2 APP

Amyloid beta Abelson kinase Alzheimer´s disease APP intracellular domain Acute myeloid leukemia Amyloid-like protein 1 Amyloid-like protein 2 Amyloid precursor protein

IP JNK LRP5/6 MEF MMTV MSC NK NLC

APPL

Beta-amyloid-like protein

NOD/SCID

APS ATM B2M BCR BTK cDNA CK1 CLL

Amonium persulphate Ataxia telangiectasia mutated Beta-2-mikroglobulin B-cell receptor Bruton tyrosine kinase Complementary DNA Casein kinase 1 Chronic lymphocytic leukemia

PCP PEI PI3K PK PLC PVDF qRT-PCR RNA

DAB

Disabled

ROR1/2

DGO

Diego

RPMI

dKO

Double knock-out Dulbecco's Modified Eagle DMEM Medium DNA Deoxyribonucleic acid Dsh/DVL Dishevelled Fludarabin, Cyclophosphamide, FCR Rituximab FMI Flamingo FZD Frizzled GFP Green fluorescent protein HEK Human embryonic kidney Immunoglobulin heavy chain IGHV variable region Igα/β Immunoglobulin α/β

SDS

Immunoprecipitation Jun N-terminal kinase Low-density lipoprotein receptor 5/6 Mouse embryonic fibroblasts Mouse mammary tumor virus Mesenchymal stromal cell Natural killer Nurselike cell Nonobese diabetic/Severe combined deficiency Planar cell plarity Polyethylenimine Phosphoinositol-3-kinase Prickle Phospholipase C Polyvinylidendifluorid Quantitative real-time PCR Ribonucleic acid Receptor tyrosine kinase-like orphan receptor Roswell Park Memorial Institute medium Sodium dodecyl sulphate

STBM/VANG Strabismus/Van Gogh SYK TCL1

Spleen tyrosine kinase T-cell leukemia/lymphoma 1

TCR

T-cell receptor

TEMED TFS Tm TMRE

Tetramethylethylendiamin Treatment free survival Melting temperature Ethylester tetramethylrhodamine

WNT

Wingless-Integrated

ZAP-70

Zeta-associated protein

1. Úvod Chronická lymfocytární leukémie (CLL) je nejčastější hematologické nádorové onemocnění v Evropě a Spojených státech. Konkrétní příčina a molekulární mechanismy patogeneze však zůstávají i přes intenzivní výzkum neznámé. V současné době není dostupná ţádná stoprocentně účinná léčba. Existuje několik moţných přístupů a aplikovaná terapie se postupně stává méně toxickou a efektivnější, Stále však vzhledem k vedlejším účinkům a vyššímu věku pacientů (medián věku v době diagnózy je 65 let) převládá tradiční přístup „diagnostikovat, sledovat a čekat“ a teprve při výskytu váţných příznaků zvolit nejvhodnější terapii. CLL je velmi heterogenní onemocnění – pacienti mohou přeţívat bez váţnějších příznaků i dvacet a více let a bylo by zbytečné je zatěţovat léčbou, která můţe být náročnější neţ nemoc samotná. Někteří pacienti však mohou během několika měsíců od stanovení diagnózy přejít do agresivního stadia CLL, kdy je léčba nevyhnutelná. Ţádná ze současných terapeutických metod není stoprocentně úspěšná, protoţe neřeší (neznámou) příčinu onemocnění a po období remise se u většiny pacientů nemoc znovu vrací. Moţnost transplantace hematopoetických kmenových buněk je omezená pro náročnost terapie a značnou zátěţ organismu starších pacientů. I přes četné nevýhody zůstává tato forma terapie jediným způsobem léčby CLL, který dokáţe u některých pacientů nemoc kompletně vyléčit. Problematika rozlišení skupiny pacientů s indolentním onemocněním od skupiny pacientů s tendencí k rychlé progresi se proto stává hlavní motivací výzkumu. Identifikování časných prognostických markerů by umoţnilo stanovit prognózu v čase diagnózy a vyčlenit pacienty s tendencí k progresi. Včasné zařazení do léčebného programu by pak mohlo významně ovlivnit průběh nemoci a prodlouţit ţivot pacienta. Popsání molekulárních mechanismů během patogeneze onemocnění by mohlo vést k vývoji lépe cílené a efektivnější terapie s menšími toxickými účinky a zlepšení ţivotního komfortu pacientů. S tím také souvisí potřeba studia fyziologie zdravých B-lymfocytů, která dosud nebyla podrobně popsána. Porozumění mechanismům, které řídí tvorbu a vývoj B-lymfocytů ve zdravém jedinci, by mohlo pomoci odhalit, ze kterého vývojového stádia B-lymfocytu vznikají leukemické buňky, co je prvotním signálem k maligní transformaci, jaké jsou rozdíly mezi indolentní a agresivní nemocí a co způsobuje progresi u některých pacientů, zatímco jiní zůstávají stabilní. 13

Cílem této práce je identifikovat doposud neznámé proteiny, které přispívají k patogenezi chronické lymfocytární leukémie a zjistit, zda nějakým způsobem ovlivňují mechanismus tzv. nekanonické Wnt dráhy planární buněčné polarity (WNT/PCP, PCP - Planar cell polarity), jejímţ studiem se v naší laboratoři intenzivně zabýváme. Hypotéza, ţe WNT/PCP hraje roli při rozvoji a metastázování nádorů, byla uţ několikrát potvrzena. Je tomu tak například u buněk maligního melanomu, nádoru ţaludku nebo nádoru prsu (Dissanayake et al., 2007; Kurayoshi et al., 2006; Luga et al., 2012; Weeraratna et al., 2002). Stejně tak pro rozvoj chronické lymfocytární leukémie je aktivita WNT/PCP dráhy kritická (Kaucka et al., 2013). CLL je v současné době definována jako nemoc, při které dochází k akumulaci CD5+ B-lymfocytů, které pod vlivem chemokinových gradientů migrují do orgánů a narušují jejich přirozenou funkci. Narušena je následně i normální krvetvorba a funkce imunitního systému, coţ je také nejčastější příčinou smrti. Právě chemokinem řízená migrace buněk je proces regulovaný WNT/PCP dráhou, a proto se její jednotlivé komponenty zdají být nadějnými potenciálními cíli pro terapii – některé inhibitory či blokující protilátky jsou jiţ ve fázi testování pro moţné pouţití v klinické léčbě. Z tohoto důvodu se snaţíme najít další regulátory WNT/PCP dráhy, které by pomohly blíţe vysvětlit mechanismus, který řídí vznik a progresi CLL, a zároveň by mohly slouţit jako časné markery pro lepší rozlišení indolentních a progradujících pacientů, nebo přímo jako terapeutický cíl.

14

2. Chronická lymfocytární leukémie (CLL)

2.1 Biologie CLL CLL je téměř nevyléčitelné hematologické onemocnění, které se vyznačuje klonální expanzí maligních B-lymfocytů

CD19+CD5+

v periferní krvi,

kostní dřeni

a sekundárních

lymfatických orgánech. Jedná se o nejčastější hematologické nádorové onemocnění v Evropě a Spojených státech s incidencí 2-6/100 000 nových případů za rok, muţi bývají postiţeni 1,5-2x častěji neţ ţeny (Rozman and Montserrat, 1995). Pacienti jsou často diagnostikováni na základě rutinních krevních testů, i kdyţ nevykazují ţádné další výrazné symptomy jako únava, slabost, ztráta hmotnosti, dlouhodobé horečky bez zánětlivé

příčiny,

noční

pocení,

zvětšení

lymfatických

uzlin,

sleziny

a

jater.

U progresivnějších stadií se vyskytují váţnější příznaky jako následek narušené normální krvetvorby a imunitního systému. Příčinou je infiltrace kostní dřeně a sekundárních lymfatických tkání CLL buňkami. Pacienti pak trpí anémií, poruchami imunity a opakujícími se infekcemi, které jsou nejčastější příčinou úmrtí mezi CLL pacienty. Sporadická forma tohoto onemocnění se projevuje většinou v pozdějším věku (věkový medián v době diagnózy je 65 let). Byla popsána i familiární forma CLL, u které bývá postiţeno dva a více členů rodiny a nemoc bývá detekována v časnějším věku. Častěji bývají také detekovány chromozomové aberace. V celogenomové studii na pacientech z evropské a americké populace byla nalezena asociace s oblastmi chromozomu 2q22.1, 6p22.1 a 18q21.1 (Sellick et al., 2007). Nebyly však zatím popsány konkrétní geny a jejich vliv na vznik CLL nebo způsob dědičnosti. Nejedná se o oblasti, ve kterých se nacházejí aberace často detekované u CLL pacientů (del17p-, del13q-, trizomie chromozomu 12, del11q-), coţ poukazuje na jiný mechanismus vzniku onemocnění, který je navíc geneticky podmíněný. Existenci genetické predispozice pro CLL podporuje i fakt, ţe výskyt onemocnění je výrazně niţší v čínské, japonské nebo korejské populaci oproti Evropě a Spojeným státům, stejně jako v populaci přistěhovalců ţijících mimo svou rodnou zemi (Weiss, 1979). Další studie, která podporuje existenci dědičnosti u CLL, ukázala, ţe u 8-14% zdravých příbuzných pacientů s familiální CLL se v krvi vyskytují cirkulující B-lymfocyty podobné CLL buňkám (Rawstron et al., 2002).

15

Dříve se mělo za to, ţe CLL je onemocnění způsobené narušenou apoptózou B-lymfocytů a jejich následnou akumulací v periferní krvi, sekundárních lymfatických orgánech a kostní dřeni. Předpokládalo se, ţe tyto nefunkční B-lymfocyty se dále nedělí a svou přítomností vytlačují normální krvetvorbu a imunitu. Bylo však zjištěno, ţe tomu tak zcela není. Buňky cirkulující v krevním oběhu se sice nedělí, existují však tzv. proliferační centra v lymfatických uzlinách a kostní dřeni, kde B-lymfocyty získávají signály pro přeţití a proliferaci od stromálních buněk (Messmer et al., 2005). Ve výsledku dochází k dělení buněk s rychlostí 0,1-1% celé populace kaţdý den. Tato data jsou zaloţena na pokusech s těţkou vodou podávanou CLL pacientům a na zjištění, ţe CLL buňky mají zkrácené telomery a akumulují mutace v průběhu času (intenzivněji u pacientů s nemutovaným IGHV, viz kapitola 2.2) (Hultdin et al., 2003). Počet CLL buněk se dlouhodobě neměnil a to i u pacientů s dlouhodobě vysokými hladinami B-lymfocytů v krvi, coţ ukazuje, ţe buňky jsou normálně odstraňovány apoptózou. Tuto hypotézu podporují výsledky kultivace CLL buněk v kultuře – brzy dochází ke spontánní apoptóze, pokud buňky nejsou kultivovány společně s dalšími buněčnými typy, jako jsou např. stromální buňky, které CLL lymfocytům poskytují signály nutné pro přeţití (Burger and Gandhi, 2009). Právě interakce s mikroprostředím a jeho vliv na přeţívání a proliferaci CLL lymfocytů jsou v poslední době intenzivně studovány. CLL buňky přímo i nepřímo interagují a komunikují např. s mesenchymálními stromálními buňkami (MSC), CD4+ T-lymfocyty nebo s CD68+ „nurselike“ buňkami (NLC), které na svém povrchu exprimují specifické molekuly a produkují do okolí různé chemoatraktanty, které mají za úkol B-lymfocyty do určité tkáně navádět (viz kapitola 2.2). Původ CLL buněk CLL lymfocyty exprimují na svém povrchu markery maturovaných B-lymfocytů CD19+ a CD23+, které společně s CD5+ umoţňují jejich odlišení od dalších hematologických onemocnění. CLL buňky exprimují menší mnoţství imnoglobulinu neţ zdravé lymfocyty (Matutes et al., 1994; Moreau et al., 1997). Nevyřešenou otázkou zůstává, jaká buňka je vlastně fyziologickým prekurzorem CLL buněk. Proto se výzkum v poslední době zaměřuje hlavně na fyziologii zdravých B-lymfocytů, u kterých jsou během maturace aktivovány různé signální dráhy a na povrchu vystavovány různé molekuly slouţící jako jejich markery. Tyto buňky mění během svého vývoje morfologii podle své funkce a umístění – naivní B-lymfocyty jsou schopné efektivně migrovat v gradientu CXCL12 do germinálního centra, kde dochází k selekci jednotlivých 16

klonů na základě afinity k antigenům a jejich následnému dělení. Takto maturované lymfocyty opět vycestovávají do krevního oběhu, kde plní svou roli v imunologické odpovědi. Po setkání s antigenem mají schopnost transformovat se v plazmatickou buňku produkující protilátky nebo paměťové buňky. Po stimulaci antigenem dochází také k somatickým hypermutacím, které vytvářejí mnoho variant imunoglobulinu specifického vůči konkrétnímu antigenu, proliferaci buněk a posílení imunitní reakce. Jednotlivá stádia od naivních buněk aţ po maturované lymfocyty je moţné rozdělit pomocí průtokového cytometru právě podle exprese různých povrchových molekul (např. IgD +CD27CD38low u naivních lymfocytů, CD38highCD77+/- buňky germinálního centra, CD27+CD38low paměťové buňky) (Klein et al., 2003). Předmětem studia je momentálně tyto populace popsat také z funkčního hlediska – aktivitu různých signálních drah, schopnost migrace, imunologické odpovědi aj. Ţádné vývojové stádium B-lymfocytu není všeobecně přijímáno jako prekurzor CLL buněk. Srovnávání genové exprese různých populací zdravých B-lymfocytů z periferní krve a sleziny s buňkami CLL pacientů s mutovaným a nemutovaným IGHV však přineslo přesvědčivé výsledky (Seifert et al., 2012). Analýza transkriptomu odhalila dvě populace buněk, které by mohly být prekurzory CLL. Obě nesou molekulární marker CD5+, liší se však tím, zda prošly germinálním centrem a nesou stereotypní přestavby V genu, nebo ne. Mutační status IGHV řetězce u CLL buněk je významným prognostickým faktorem – pacienti s nemutovaným řetězcem vykazují výrazně horší prognózu a přeţívání. Stejné klinické příznaky pacientů, ale různá agresivita onemocnění a různý mutační status IGHV ukazuje, ţe nemoc u těchto pacientů pravděpodobně vzniká z jiné prekurzorové buňky. Hypotéza byla podpořena právě touto studií, kde byla popsána populace CD5+CD27- naivních buněk jako moţný původ CLL s nemutovaným IGHV a populace CD5+CD27+, která jiţ prošla germinálním centrem a nese přestavby V genů, jako moţný původ CLL s mutovaným IGHV. Genetické abnormality Cytogenetické studie ukazují, ţe buňky 80% pacientů s CLL nesou genetické abnormality jako del13q14, trizomii chromozomu 12, del11q22-23 nebo del17p13. Tyto aberace nejsou příčinou vzniku onemocnění, jejich výskyt však má zásadní prognostický význam. Některé genetické abnormality se u CLL hromadí v čase, coţ je důkaz probíhajícího dělení buněk a klonální evoluce – dochází k selektování určitých klonů (např. s mutovaným p53), kterým mutace přináší výhodu v přeţívání, proliferaci nebo rezistenci k určité terapii (Burger and Montserrat, 2013). 17

IGHV mutace a genetické aberace jsou dva samostatné parametry s různou prognostickou hodnotou, zdá se však, ţe spolu korelují. Mutace spojené se špatnou prognózou a vysokým rizikem (11q- a 17p-) se častěji vyskytují u pacientů s nemutovaným IGHV (umutIGHV), zatímco pozitivní mutace (13q-) se častěji vyskytuje ve skupině s mutovaným IGHV (mutIGHV) (Krober et al., 2002). Tento fakt ukazuje na rozdílné genetické pozadí těchto pacientů. Delece 17p13 a 11q22-23 jsou spojovány s rychlou progresí onemocnění a krátkým přeţíváním pacientů (Stilgenbauer et al., 1998). Delece 17p- zahrnuje tumor supresorový gen p53 a vyskytuje se zhruba u 10% všech pacientů. Tato genetická abnormalita je asociována s rezistencí vůči některým typům terapie (Byrd et al., 2005). V oblasti 11q- se nachází další tumor supresorový gen - Ataxia telangiactasia mutated (ATM). Mutace se vyskytuje aţ u 20% pacientů. Stejně tak s horší prognózou je spojena i trizomie chromozomu 12, vyskytující se u stejného mnoţství pacientů. Jedinou aberací, která má pozitivní vliv na přeţívání pacientů, je del13q14.3 (Orlandi et al., 2012). Bývá detekována u více neţ 50% pacientů. Deletovaná oblast obsahuje úseky s microRNA mir-15a a mir16-1. Ty se podílejí na regulaci antiapoptických genů (např. BCL2). Celkově mají nejkratší medián přeţití bez terapie pacienti s del17q- (9 měsíců), zatímco pacienti s del13q- mají prognózu nejlepší (92 měsíců) (Dohner et al., 2000). Znalost přítomných aberací je ţádoucí také při výběru terapie, protoţe se můţe výrazně lišit odpověď na určitý typ léčby. Například del17p- a/nebo abnormality genu p53 jsou spojeny se selháním léčby alkylačními agens, purinovými analogy nebo rituximabem (Byrd et al., 2005). Epigenetický profil CLL Aberantní metylace CpG ostrovů v oblasti promotoru zapříčiňuje potlačení genové exprese a tím pádem funkční inaktivaci tumor supresorových genů u mnoha nádorů (Jones and Baylin, 2007). Data několika skupin ukazují, ţe metylace CpG ostrovů asociovaných s promotory je u lymfoidních leukémií, včetně CLL, běţná (Kanduri et al., 2010; Martin-Subero et al., 2009). Tato modifikace DNA je reverzibilní a otevírá moţnosti terapie pomocí inhibitorů metyltransferáz (např. 5-aza-2'-deoxycytidin). Klinický účinek těchto látek u pacientů s CLL byl jiţ prokázán (Silverman et al., 2002). Byl také popsán odlišný metylační profil skupin pacientů s mutovaným a nemutovaným řetězcem IGHV (Kanduri et al., 2010). Konkrétně bylo u skupiny s nemutovaným IGHV identifikováno 7 známých nebo kandidátních tumor-supresorových genů s hypermetylovaným 18

promotorem (např. VHL, ABI3 a IGSF4) a 8 nemetylovaných genů podílejících se na regulaci buněčné proliferace a progrese nádorů (např. ADORA3 a PRF1, které zvyšují aktivitu NF-κB a mitogenních signálních drah). Tyto geny byly naopak umlčeny u pacientů s mutovaným IGHV. Umlčení genu DAPK1 je zase asociováno s výskytem familiární CLL (Raval et al., 2007). V nedávné studii byla popsána i metylace promotoru genu APP (Tong et al., 2010) (viz oddíl 3.1). Cílem současných studií je popsat specifické změny v metylaci genů a jejich funkční dopady na pacienty s CLL. Detekce takovýchto metylačních změn můţe přispět k lepší klasifikaci nemoci do podskupin s rozdílným prognostickým a terapeutickým potenciálem. Komunikace s mikroprostředím, chemoatraktanty Lymfocyty ve zdravém těle neustále aktivně cirkulují mezi kostní dření, krevním oběhem a sekundárními lymfoidními tkáněmi. Tento oběh je organizován tkáňově specifickou expresí chemokinů a odpovídajících receptorů na povrchu lymfocytů i dalších typů buněk, stejně jako interakcí s extracelulární matrix a s adhezivními molekulami na povrchu jiných buněk. Lymfocyty v krevním řečišti během tohoto aktivního pohybu komunikují s endoteliálními buňkami pomocí selektinů a integrinů. Vyskytne-li se v jejich okolí signál (např. specifický chemokin), na který jsou schopné reagovat, promigrují přes endotel do tkáně ve směru chemokinového gradientu (viz Obrázek č. 1). Tento mechanismus funguje jak v normálních fyziologických

procesech

germinálního

centra

B-lymfocytů,

imunitní

(migrace uzlin,

do

maturace

reakce),

tak

u nádorových onemocnění. Zásadní je právě schopnost B-lymfocytů cíleně migrovat ve směru

chemokinového

gradientu.

Různé

chemokiny jsou produkovány specifickými buňkami v tkáních. produkují

určité

Stejně tak B-lymfocyty chemokiny,

které

O BRÁZEK Č. 1: MIGRACE V CHEMOKINOVÉM GRADIENTU (BURGER AND MONTSERRAT, 2013)

zprostředkovávají komunikaci s dalšími buňkami (např. T-lymfocyty, monocyty). Aby došlo k vytvoření zralých funkčních B-lymfocytů, musí tyto buňky dokázat vycestovat z kostní dřeně do periferie a následně vcestovat do germinálního centra lymfatických uzlin, kde dochází k setkávání s antigeny, ke klonální selekci a k somatickým hypermutacím. 19

B-lymfocyty se zde dostávají do kontaktu se dalšími buňkami, které jim poskytují nezbytné proliferační a anti-apoptické signály. Nejdříve buňky, tzv. centroblasty, vstupují do temné zóny germinálního centra, kde díky kontaktu s dalšími buňkami proliferují. Poté migrují do světlé zóny, kde jsou selektovány podle afinity k antigenům (zde uţ mluvíme o centrocytech). Pro migraci naivních lymfocytů do lymfatických uzlin jsou nezbytné chemokiny CXCL12, CXCL13 a CCL19/21, které se váţou na odpovídající receptory CXCR4, CXCR5 a CCR7 na jejich povrchu (Burger and Montserrat, 2013). Centroblasty exprimují vysokou hladinu CXCR4 a migrují směrem k CXCL12, který je nejvíce koncentrovaný v oblasti temné zóny. Naopak CXCL13 směřuje centrocyty (CXCR4 -/CXCR5+) do světlé zóny. Centroblasty se od centrocytů liší právě v expresi CXCR4 na povrchu – centrocyty mají receptor po setkání s chemokinem internalizovaný a dále na signál nereagují (Calissano et al., 2009; Caron et al., 2009). Lymfocyty také samy produkují chemokiny CCL3, CCL4 nebo CCL22, které zajišťují interakci s T-lymfocyty a monocyty (Burger et al., 2009; Ghia et al., 2002). To ukazuje, ţe samotné B-lymfocyty dokáţí aktivně ovlivnit své mikroprostředí. Tyto fyziologické mechanismy cílené migrace buněk do určitých tkání fungují jak u normálních, tak u neoplastických buněk, včetně CLL B-lymfocytů, které na svém povrchu nesou velké mnoţství receptorů CXCR4 a ochotně migrují v gradientu CXCL12 (Burger et al., 1999). V posledních letech jsou proto testovány antagonisté CXCR4 nebo CXCL12 jako moţná terapie. Tyto látky mobilizují CLL buňky z tkání, kde jsou chráněny stromálními buňkami, do periferní krve. Mobilizace způsobuje navýšení populace CLL buněk v periferní krvi 1,2-15x (Basak et al., 2011). Tím se stávají senzitivnějšími k další terapii. Nedostává se jim uţ protektivních anti-apoptických a proliferačních signálů. Právě buňky, které zůstávají při léčbě v kostní dřeni nebo v lymfatických orgánech, chráněné kontaktem se stromálními buňkami, jsou pravděpodobně zdrojem reziduální nemoci a moţného relapsu. Jejich odstranění je tedy moţnou cestou ke kompletní remisi. Problémem by mohla být mobilizace nejen CLL buněk, ale také normálních hematopoetických kmenových buněk z protektivního mikroprostředí kostní dřeně, coţ by následně mohlo vést k vysoké toxicitě léčby. Tato obava se však v klinickém testování dosud nepotvrdila a antagonisté CXCR4 a CXCL12 jsou nadále testovány pro pouţití v klinické léčbě jako doplnění klasické terapie.

20

2.2 Klinické rozdělnení CLL a terapie Prognóza Vzhledem k heterogenitě onemocnění je velice obtíţné říct, kteří pacienti budou rychle progradovat do agresivnějších stadií a kteří zůstanou stabilní bez potřeby terapie. Bylo prokázáno, ţe nasazení terapie indolentním pacientům přináší více komplikací neţ výhod, proto je tradiční terapie určena většinou pokročilejším stadiím onemocnění (Byrd et al., 2005). Tradiční rozdělení pacientů podle klinických příznaků bylo zavedeno na počátku 80. let – vznikly systémy podle Raie a Bineta (Binet et al., 1977; Rai et al., 1975). Tyto systémy popisují aktuální klinický stav pacienta zaloţený na fyzické prohlídce a klasických laboratorních testech, rozdělují tak pacienty podle míry rizika. Neříká však přímo, jak rychle a jakým způsobem se bude onemocnění vyvíjet. Proto byly kromě klinických prognostických faktorů zavedeny také faktory biologické (tradiční a molekulární). Klinické prognostické markery Podle klinických znaků se tedy pacienti dělí do: raného stadia téměř bez vnějších příznaků s nejlepší prognózou (Rai 0, Binet A – pouze lymfocytóza v periferní krvi), intermediálního stádia (Rai I/II, Binet B – lymfocytóza a lymfadenopatie, splenomegalie nebo hepatomegalie) a pokročilého stádia (Rai III/IV – lymfocytózy, anémie, trombocytopenie). Jednotlivá stádia vykazují výrazně odlišné přeţívání (>7-10 let u počátečních stádií oproti 1-3 letům u pokročilejších stádií). Toto rozdělení však neurčuje, jestli a kdy budou jednotliví pacienti progradovat do dalšího stádia. Více neţ 80% pacientů je diagnostikováno v raném stádiu nemoci, další prognostické markery jsou tedy nezbytné. Tradiční biologické prognostické markery Mezi tradiční biologické markery se řadí ty, které popisují dynamiku expanze klonu CLL – např. doba, za kterou dojde ke zdvojnásobení počtu CLL buněk v periferii, infiltrace kostní dřeně, zvýšený počet prolymfocytů v krvi, vysoká hladina β2-mikroglobulinu (všechny tyto faktory jsou negativní pro prognózu). Molekulární biologické markery Zatím nejvýznamnějším faktorem pro predikci průběhu onemocnění je mutační status genů kódujících variabilní oblast těţkého řetězce imunoglobulinu (IGHV) (Hamblin et al., 1999).

21

Pacienti jsou rozdělováni na ty s mutovaným nebo nemutovaným IGHV. Jako mutovaný se uvaţuje ten gen, který se liší v sekvenci ve srovnání s germinální linií o více neţ 2%. Normálně tyto somatické mutace nesou maturované B-lymfocyty, které po stimulaci antigenem prošly germinálním centrem, a poskytují vyšší variabilitu imunoglobulinů produkovaných B-lymfocyty proti konkrétnímu antigenu. Tyto mutace se vyskytují u více neţ 50% pacientů a výrazně korelují s dobrou prognózou. Ve spojení s přítomností nemutovaného IGHV byly popsány dva silné prognostické markery – membránový protein CD38 (Damle et al., 1999) a cytoplazmatický marker ZAP-70 (Crespo et al., 2003; Hamblin et al., 2000). Korelace těchto markerů není úplná. 10-30% pacientů vykazuje odlišný expresní profil. ZAP-70 (Zeta-associated protein) je cytoplazmatická tyrosin kináza, která je normálně exprimována jen „natural killer“ buňkami (NK buňky) a T-lymfocyty. U CLL buněk je exprimována ve vyšší míře u populace s nemutovaným IGHV (Chen et al., 2002). Exprese ZAP-70 souvisí s větší schopností CLL buněk odpovídat na přítomnost antigenu aktivací BCR signální dráhy (normálně ZAP-70 hraje roli hlavně v TCR signalizaci T-lymfocytů). Slouţí jako prognostický marker, který je asociovaný s dřívějším nasazením terapie, horší reakcí na léčbu a horším přeţíváním všeobecně. CD38 nebývá obvykle exprimován u zdravých B-lymfocytů cirkulujících v periferní krvi, vyskytuje se však ve větším mnoţství u prekurzorů B-lymfocytů,

buněk

germinálního

centra

nebo

u plazmatických buněk. Leukemické buňky s větším mnoţstvím

CD38

jsou responzivnější

ke stimulům

aktivujícím BCR signalizaci a vykazují vyšší proliferační a migrační kapacitu. Signální dráha, kterou CD38 aktivuje, zahrnuje ZAP-70 a ERK1/2. Samotný CD38 se často vyskytuje jako dimer v blízkosti BCR receptoru a molekul ovlivňujících migraci buněk do tkání (např. CXCR4, viz Obrázek č. 2). Exprese CD38 se mění v čase spolu s progresí onemocnění, popisuje tedy postup onemocnění.

22

O BRÁZEK Č. 2: U MÍSTĚNÍ BCR, CD38 A ZAP70 (MALAVASI ET AL., 2011)

Terapie Nejstarší a nejznámější látkou pouţívanou v terapii CLL je Chlorambucil (Gellhorn et al., 1956). Indukuje částečnou remisi u 60-70% pacientů bez předchozí léčby, ale kompletní remise nastávají velmi zřídka. Často se pouţíval v kombinaci s dalšími alkylačními agens – např. cyclophosphamid, vincristin, prednison (Kalil and Cheson, 2000). Dále se pouţívají v různých kombinacích purinové analogy (např. Fludarabin). Ty inhibují DNA polymerázu a ribonukleotid-reduktázu a tím indukují apoptózu buněk. Fludarabin vykazuje vyšší procento kompletních remisí a je lépe tolerován. Úspěšně se pouţívají monoklonální protilátky – např. Rituximab, monoklonální protilátka specifická pro CD20. K částečné remisi dochází zhruba u 50% pacientů, problémem jsou však buňky ukryté v kostí dřeni a orgánech. Další protilátkou je Alemtuzumab specifický proti CD52. Ten je schopný velice úspěšně zlikvidovat buňky z periferní krve u 90% pacientů a dosáhnout kompletní remise u 60%, způsobuje však váţnou lymfopenii a časté infekce (infekce cytomegaloviry u 10% pacientů). Monoklonální protilátky jsou všeobecně pouţívány jako doplňky chemoterapie a k zacílení minimální reziduální nemoci nebo při snaze dosáhnout kompletní remise. Nejčastěji se pouţívá kombinace chemo-imunoterapie – Fludarabin, Cyclophosphamid, Rituximab (tzv. FCR), dosahující více neţ 70% kompletní remise.

2.3 Molekulární signální dráhy BCR signalizace Hlavní signalizace, která řídí osud B-lymfocytů a jejich fyziologickou funkci, je signální dráha Bbuněčného receptoru (BCR dráha). BCR je zkratka pro B-buněčný receptor (B-cell receptor), který se nachází na povrchu B-lymfocytů. Skládá se z membránově vázaného imunoglobulinu, který nese unikátní místa pro

navázání

antigenu,

a heterodimeru

dvou

asociovaných řetězců Igα a Igβ (CD79a, b). Setkání

receptoru

s komplementárním

antigenem

způsobuje aktivaci dráhy. B-lymfocyt diferencuje v plasmatickou buňku, která proliferuje a produkuje populaci buněk schopných sekretovat protilátky. 23

O BRÁZEK Č. 3: BCR SIGNALIZACE (HENDRIKS , 2011)

Následně z některých vznikají paměťové buňky. BCR tedy zajišťuje předání signálu v návaznosti na navázání antigenu, jeho internalizaci a procesování v buňce, které vede k vystavení

antigenu

na

povrchu

B-lymfocytu.

Poruchy

této

signalizace

vedou

k imunodeficienci, autoimunitním a jiným B-buněčným onemocněním. Aktivace BCR spouští kaskádu událostí, které převádějí vnější signál aţ na úroveň transkripce (viz Obrázek č. 3). Nejdříve jsou fosforylovány cytoplazmatické domény receptoru Ig-α a Igβ (Burger and Montserrat, 2013). Následně je rekrutována kináza SYK (Spleen tyrosine kinase) a jsou aktivovány kinázy BTK (Bruton tyrosine kinase) a PI3K. Tyto kinázy pak spouštějí další signalizaci, včetně aktivace AKT, MYC, NFκB a jiných proliferačních signálů. B-lymfocyty pacientů s profilem ZAP70+ a nemutovaným IGHV jsou výrazně responzivnější ke stimulaci BCR a všeobecně k signálům z mikroprostředí (Richardson et al., 2006). Jedná se tedy o skupinu pacientů, pro kterou je výhodná léčba pomocí inhibitorů kináz asociovaných s BCR. Běţné inhibitory kináz SYK, BTK a PI3Kδ během několika týdnů vedou ke zmenšení jater a sleziny a k přechodnému zvýšení počtu lymfocytů v krvi, coţ ukazuje na účinnou redistribuci buněk z orgánů do periferie (Advani et al., 2013; Friedberg et al., 2010; Furman, 2010). Inhibitor BTK je obzvláště zajímavý, protoţe tato kináza hraje roli nejen v BCR signalizaci, ale také v migraci a buněčné adhezi (např. dráhy receptorů CXCR4 a CXCR5, integriny). Dalo by se říct, ţe BTK integruje signály několika signalizací. Inhibitor BTK efektivně blokuje signály pro přeţití a proliferaci CLL buněk po stimulaci faktory jako CD40L, BAFF, IL-6, TNF-α, fibronectinem nebo kontaktem se stromálními buňkami. Sniţuje také mnoţství chemokinu CCL3 a CCL4 produkovaného CLL buňkami a schopnost migrovat v gradientu chemokinů CXCL12, CXCL13 a CCL19 (de Rooij et al., 2012). Dále zabraňuje adhezi k fibronectinu a VCAM-1 pomocí integrinů. PI3K je také aktivní v různých signalizacích ovlivňujících buněčný růst, přeţití a migraci. Existuje několik forem, PI3Kδ je výlučně exprimována v hematopoetických buňkách a hraje kritickou roli ve funkci a homeostáze B-lymfocytů. U CLL B-lymfocytů je PI3Kδ konstitutivně aktivní, pravděpodobně díky růstovým signálům z mikroprostředí a aktivaci CXCR4. Inhibitor PI3K u nich indukuje apoptózu, inhibuje také chemotaxi v gradientu CXCL12 a CXCL13.

24

Inhibitory BCR signalizace účinně způsobují redistribuci CLL B-lymfocytů z orgánů do periferie, kde mohou být snadněji zacíleny, inhibují migraci v chemokinovém gradientu a indukují apoptózu. Jedná se tedy o jednu z moţných cest účinnější terapie CLL. Několik laboratoří studovalo IGHV geny exprimované CLL buňkami s nadějí, ţe najdou souvislost vývoje CLL se strukturou BCR receptoru a s určitým antigenem. Pokud by onemocnění opravdu souviselo s aktivací buněk antigenem, CLL buňky by vykazovaly častější výskyt určitých typů těţkých řetězců neţ náhodná populace zdravých B-lymfocytů. Klonální expanze buněk by byla omezena na buňky s BCR komplementárním k antigenu. Primární struktura místa pro navázání antigenu je determinována sekvencí variabilních (V) domén BCR receptoru. Ten se skládá z rekombinovaných VH, D a JH segmentů u těţkých řetězců a ze segmentů VL a JL u lehkých řetězců. Další variabilitu poskytují delece a inzerce nukleotidů v místech spojení při rekombinaci. Pokud je proces rekombinace zcela náhodný, byla by pravděpodobnost výskytu dvou B-lymfocytů se stejným BCR receptorem 1/3 200 000 (Keating et al., 2005), frekvence jsou však vyšší (Fais et al., 1998). VH geny nejčastěji pouţívané CLL buňkami jsou 1-69, 3-07 a 4-34. Selekce určitých B-lymfocytů s vysokou afinitou k určitému antigenu, které se jsou schopné zaktivovat se a proliferovat, je znakem imunokompetentních lymfocytů. Dá se tedy předpokládat, ţe prekurzory CLL buněk jsou imunokompetentní buňky, protoţe B-lymfocyt se nemůţe dělit, pokud nezískal signál přes BCR receptor. Po navázání antigenu a klonální expanzi u některých B-lymfocytů dochází k hromadění somatických mutací, dalšího znaku kompetentních B-lymfocytů. Pro vznik somatických hypermutací je nutné kroslinkování BCR receptoru antigenem, jeho aktivace a kooperace s T-lymfocyty a dalšími stromálními buňkami, které se účastní reakce v germinálním centru. WNT/PCP dráha Pojem Wnt signalizace pod sebe shrnuje několik vzájemně propojených signálních drah, které jsou nezbytné jak v embryonálním vývoji, tak při udrţování homeostázy dospělého organismu. Poprvé byla Wnt dráha popsána v osmdesátých letech na vývojovém modelu Drosophila melanogaster (Nusslein-Volhard and Wieschaus, 1980). Byl objeven gen wingless (wg) a jeho význam v embryonálním vývoji. Později byl u myší infikovaných retrovirem MMTV (mouse mammary tumor virus) identifikován první savčí wnt gen Integrated1 (Int1), aktivovaný v přítomných nádorech (Nusse and Varmus, 1982). Spojení mezi savčím protoonkogenem Int1 a drozofilím genem regulujícím segmentaci těla wg bylo 25

objeveno aţ v roce 1987, kdy byla popsána jejich sekvenční a funkční homologie (Rijsewijk et al., 1987). Samotný název Wnt pak vznikl spojením wingless a Integrated1. Tento objev otevřel prostor pro studium velice konzervované skupiny signálních drah, které se brzy ukázaly být nezbytnými ve všech základních procesech regulace mnohobuněčného organismu. Jsou kritické pro normální vývoj, regeneraci a udrţení homeostázy organismu, jednotlivé dráhy regulují buněčné dělení, diferenciaci, polarizaci buněk, cílenou migraci, apoptózu nebo udrţování kmenových buněk. Narušení funkce Wnt drah je příčinou mnoha vývojových defektů, dědičných chorob a nádorových onemocnění. Wnt dráhy jsou evolučně velmi konzervované – jednotlivé komponenty jsou zachovány od ţahavců aţ po člověka. U savců bylo popsáno celkem 19 genů Wnt, které kódují hydrofobní sekretované proteiny o velikosti 350-400 aminokyselin (Coudreuse and Korswagen, 2007). Tyto proteiny fungují jako extracelulární signály, ligandy, pro určité receptory vázané v buněčné membráně. Zatím byly popsány receptory z evolučně konzervované rodiny Fzd1-10 (Frizzled), Lrp5/6 (Low-density lipoprotein receptor 5 a 6) nebo Ror1/2 (Receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1 a 2) (Logan and Nusse, 2004; MacDonald and He, 2012). Jak bylo zmíněno, pojem Wnt signalizace sdruţuje několik signálních drah ovlivňujících různé procesy, v některých případech navzájem antagonistické. Nejjednodušeji mohou být rozděleny na β-catenin závislou, tzv. kanonickou, Wnt dráhu a dráhy nazávislé na β-cateninu, mezi které patří i zmiňovaná WNT/PCP signalizace (viz Obrázek č. 4). β-catenin závislá dráha je aktivována navázáním typického Wnt1,

ligandu

Wnt3a)

O BRÁZEK Č. 4: WNT SIGNÁLNÍ DRÁHY (HERMLE ET AL., 2010)

(např.

na komplex

receptorů Frizzled a LRP5/6 (Logan and Nusse, 2004). Následuje

aktivace

cytoplazmatických

efektorů

(např. Dishevelled), která vede k rozpadnutí

destrukčního

komplexu Axin/GSK3-β/APC, stabilizování β-cateninu a jeho přesunutí do jádra, kde váţe 26

transkripční faktory TCF-LEF1 a reguluje transkripci cílových genů. Dráhy nezávislé na β-cateninu jsou typicky aktivovány ligandy Wnt4, Wnt5a nebo Wnt11. Jejich mechanismy a vzájemné propojení však nejsou vţdy podrobně popsány. Mezi hlavní patří Wnt/Ca2+ signalizace, která reguluje hladinu vápníkových iontů v buňkách přes klíčovou komponentu fosfolipázu C (PLC) a řídí dynamickou přestavbu cytoskeletu a buněčnou adhezi. Další významnou dráhou je právě signalizace řídící planární polaritu buněk, tzv. WNT/PCP dráha. Tato dráha signáluje přes malé GTPázy Rho a Rac a reguluje přestavby cytoskeletu (Seifert and Mlodzik, 2007). Poprvé

byla

tato

signalizace

popsána

O BRÁZEK Č. 5: NORMÁLNÍ CHLOUPKY NA HRUDNÍM ČLÁNKU D.MELANOGASTER ( VLEVO ), MUTANTNÍ WNT/ PCP FENOTYP ( VPRAVO ) (FRANCO ET AL., 2009)

u Drosophila melanogaster, kde reguluje planární polaritu buněk v epiteliích oka, křídla

a

hrudníku

(Mlodzik,

1999).

Organizuje přesnou orientaci jednotlivých omatid ve sloţeném oku drozofily a orientaci buněk na křídle a hrudníku. Tento fenotyp se vyuţívá pro analýzu WNT/PCP dráhy – narušení funkce způsobuje ztrátu polarizace buněk a pravidelného uspořádání epitelu (viz Obrázek č. 5). U savců byla PCP dráha popsána na uspořádání stereocilií ve vnitřním uchu (Wallingford, 2012). WNT/PCP dráha byla sice nejdříve studována na modelu polarizovaného epitelu, později však bylo zjištěno, ţe hraje roli také při polarizované migraci buněk. Účastní se procesů konvergentní extenze během gastrulace, kontroluje uzavírání nervové trubice, vývoj končetin a orgánů nebo navádění axonů neuronů. Nedávné studie ukazují, ţe WNT/PCP dráha hraje roli také v progresi nádorových onemocnění, invazi buněk a metastázování. Je tomu tak například u buněk maligního melanomu, nádoru ţaludku nebo nádoru prsu (Dissanayake et al., 2007; Kurayoshi et al., 2006; Luga et al., 2012; Weeraratna et al., 2002). Naší skupinou byla popsána zvýšená aktivita také u chronické lymfocytární leukémie (Kaucka et al., 2013). Hlavními komponentami u Drosophila melanogaster jsou Diego (Dgo, ANKRD6 u savců), membránový protein Strabismus/Van Gogh (Stbm nebo Vang, VANGL1/2 u savců), Flamingo (Fmi, CELSR1-3 u savců), Prickle (Pk, PRICKLE1-4 u savců), membránový receptor Frizzled (Fz, Fzd1-10 u savců) a cytoplazmatický efektor Dishevelled (Dsh, DVL1-3 u savců), který je fosforylován a aktivován kinázou CK1 (případně také kinázou Abl). Polarita buněk je ustavena asymetrickým rozdělením právě těchto proteinů – Pk a Stbm jsou umístěny 27

v proximální části, zatímco Fzd, Dsh nebo Dgo v distální části. Fmi je výjimečný lokalizací v obou částech buňky. Přesný mechanismus, který ustavuje tuto polarizaci, není znám a je předmětem intenzivního výzkumu. Významnou roli hrají pravděpodobně iontové kanály ovlivňující lokálně prostředí cytoplazmy. U lidí byly popsány další komponenty patřící do WNT/PCP signalizace – např. receptory ROR1/2, RYK nebo PTK7. Signální kaskáda je spouštěna navázáním specifického Wnt ligandu na receptor Fzd (viz Obrázek č. 6). Dále je signál přenášen přes cytoplazmatický efektor Dishevelled na malé GTPázy Rho/Rac a dále na kinázy ROCK/JNK, coţ ve výsledku vede k přestavbě cytoskeletu buňky (Fanto et al., 2000; Winter et al., 2001). V naší laboratoři bylo prokázáno, ţe exprese komponent WNT/PCP dráhy (Vangl2, Celsr1, Prickle1, FZD3, FZD7, Dvl2, Dvl3 a CK1) je u pacientů s chronickou lymfocytární leukémií výrazně zvýšena (Kaucka et al., 2013). Dochází také

k akumulaci

nemoci. signalizace

Bylo je

a transendoteliální

PCP

proteinů

prokázáno,

ţe

s progresí WNT/PCP

nezbytná

pro

migraci

invazi

CLL

buněk

v chemokinovém gradientu in vitro stejně jako

O BRÁZEK Č. 6: SCHÉMA WNT/ PCP SIGNALIZACE ( PŘEVZATO ZE STRÁNEK HTTP :// RGD.MCW. EDU )

in vivo. Inhibitory WNT/PCP signalizace (např. CK1/Rho/ROCK inhibitory, Porcupine inhibitor tvorby Wnt) účinně blokují migraci buněk v chemokinovém gradientu. Analýza 93 pacientů ukázala, ţe vysoká exprese FZD3, FZD7 a PRICKLE1 koreluje s horší prognózou. WNT/PCP dráha je tedy dalším mechanismem, který reguluje interakci CLL buněk s mikroprostředím, migraci v gradientu chemokinů a přispívá tak k patogenezi CLL. Pro klinické testování se momentálně připravují nejen inhibitory Wnt signalizace, ale také blokující protilátky proti ROR1 receptoru - ten byl poprvé spojen s patogenezí CLL uţ v roce 2008 (Baskar et al., 2008; Daneshmanesh et al., 2008; Fukuda et al., 2008). Vzhledem k tomu, ţe se WNT/PCP dráha je uplatňuje hlavně v embryogenezi, byla vysoká exprese receptoru ROR1 (a PCP genů vůbec) u adultních B-lymfocytů překvapením. Ukázalo se, ţe exprese ROR1 je specifická pro CLL buňky. Nedávno bylo prokázáno, ţe i ROR1/2 receptory váţí Wnt5a ligand a podílejí se na Wnt signalizaci (Fukuda et al., 2008; Ho et al., 2012). Mechanismus však zatím není přesně popsán. Je známo, ţe signalizace zahrnuje PI3 kinázu a JNK, bylo také prokázáno, ţe CK1 fosforyluje ROR2 a indukuje jeho autofosforylaci. 28

Samotné navázání Wnt5a také indukuje dimerizaci a autofosforylaci (Yamamoto et al., 2007). Vzhledem k podobnosti receptorů se podobný proces předpokládá i u ROR1. Blokující α-ROR1 protilátky způsobují internalizaci receptoru do buňky a jejich apoptózu (Daneshmanesh et al., 2012; Hojjat-Farsangi et al., 2013; Kaucka et al., 2011). To vede k podobnému efektu jako inhibice CK1 kinázy - zablokování signalizace, viditelné sníţení úrovně fosforylace DVL a sníţení migrační kapacity buněk v odpovědi na chemokin.

29

3. Rodina amyloidních proteinů APP, APLP1 a APLP2

Savčí proteiny APP, APLP1 i APLP2 náleţí do vysoce konzervované rodiny amyloidních proteinů, které jsou známy hlavně svou rolí v centrální nervové soustavě při růstu axonů a vzniku synapsí. Jedná se o transmembránové proteiny (1x procházející přes membránu), které jsou mohutně upravovány glykosylací i štěpením. Vzniká tak mnoho různých funkčních forem, jejich fyziologická funkce však není úplně známa (názvy a základní velikosti neštěpených proteinů viz Tabulka č. 1). Homology nalezneme jak u Caenorhabditis elegans (APL-1), tak u Drosophila melanogaster (APPL, Beta-amyloid-like protein) (Daigle and Li, 1993; Luo et al., 1990). APPL vykazuje nejen strukturní, ale také funkční konzervovanost lidský APP dokáţe zastoupit fyziologickou funkci drozofilího APPL a navrátit původní fenotyp mutantním Drosophila m. (Luo et al., 1992). Nejvíce studií bylo věnováno výzkumu APP v souvislosti s patogenezí Alzheimerovy choroby (Alzheimer‘s disease, AD) – z proteinu APP jsou proteolytickým štěpením β- a γ-sekretázou uvolňovány Abeta částice, které se hromadí v mozku a vytvářejí amyloidní plaky. Má se za to, ţe právě tyto plaky jsou příčinou neurodegenerace u pacientů s AD (Bayer and Wirths, 2008; Ling et al., 2009). Neurotoxicita těchto částic však úplně nevysvětluje, čím je onemocnění způsobeno. Proto se nyní výzkum více obrací k fyziologické funkci APP a jeho podjednotek. Dosavadní studie ukazovaly na spojení funkce APP s růstem a degenerací axonů (Leyssen et al., 2005; Nikolaev et al., 2009). Ve spolupráci s naší skupinou byla fyziologická role dále osvětlena – bylo popsáno spojení s WNT/PCP signální dráhou (podrobněji v následující kapitole). T ABULKA Č. 1: AMYLOIDNÍ PROTEINY – ZÁKLADNÍ CHARAKTERISTIKA

Zkratka

Plný název

Organismus

Délka řetězce

Základní velikost

Membránová forma

APP APLP1 APLP2 APPL

Amyloid precursor protein/ Amyloid beta A4 protein Amyloid-like protein 1 Amyloid-like protein 2 Beta-amyloid-like protein

savčí savčí savčí Drosophila m.

770 AA 650 AA 763 AA 887 AA

87kDa 72kDa 87kDa 98kDa

110-135kDa 90kDa 120-170kDa 145kDa

30

3.1 APP – Amyloid beta A4 protein Jen málo proteinů bylo studováno více neţ APP. Neustále však zůstává více otázek neţ odpovědí. K dispozici jsou studie popisující detailně strukturu jednotlivých domén, fenotypy „knock-out“ myší, drozofil i háďátka, analýza post-translačních modifikací a hlavně dlouhý seznam potenciálních funkcí jednotlivých forem. Mezi moţné fyziologické funkce patří regulace růstu axonů, arborizace (větvení) dendritů, synaptogeneze, interakce buňka-buňka nebo buňka-substrát, receptoru pro vnější signály aj. Vzhledem k mnoţství variant se většina výzkumu soustředí na studium funkce pouze konkrétní formy APP. Analýza tohoto proteinu je sloţitá i proto, ţe během 30-90 min je APP v buňce procesován a nezůstává tedy stabilně v původní formě v membráně (Herreman et al., 2003). To ukazuje spíše na regulační neţ na strukturní funkci. APP je exprimován ve všech embryonálních tkáních, nejvyšší hladina je v mozku, ledvinách, srdci a slinivce. V nervové tkáni je predominantní isoforma APP695. Modelové organismy – hledání fyziologické funkce Biologické modely ţivočichů deficientních pro APP nebo jeho homology ukázaly na jeho moţné fyziologické funkce v kontextu celého organismu. APPL-/- drozofily jsou viabilní, fertilní a vykazují menší změny v chování a neurální defekty – menší počet nervových synapsí, poruchy tvoření synaptických knoflíků a neuromuskulárních spojení (Luo et al., 1992). Podobný fenotyp nalezneme například u drozofil mutantních pro fasciclin II, adhezivní molekulu regulující vývoj synapsí, coţ ukazuje na podobnou roli APP (Ashley et al., 2005). Zvýšení exprese APP nebo APPL u Drosophila m. indukuje několik různých fenotypů – defekty křídel typické pro poruchy adhezivních molekul, fenotyp podobný mutantímu fenotypu Notch signalizace, deficity axonálního transportu, nebo indukci růstu a větvení axonů (přes Abelsonovu kinázu a profilin) (Fossgreen et al., 1998; Leyssen et al., 2005; Loewer et al., 2004). Výrazné fenotypy byly nalezeny u myší deficientních pro všechny tři geny – APP/APLP1/APLP2. Tyto myši umírají perinatálně nebo brzy po narození a vykazují vývojové vady typické pro vzácné lidské onemocnění nervové soustavy – lissencefalii typu II (tzv. agyrie, „hladký mozek“ – stav způsobený narušenou migrací neuroblastů v průběhu embryonálního vývoje, kortikální dysplázie) (Herms et al., 2004). Mechanismus tohoto onemocnění není plně vysvětlen, ukazuje však na roli APP v buněčné adhezi a migraci neuronů. Deficience samotného APP nemá tak výrazný fenotyp. Původní hypotézou byla kompenzace funkce APP dalšími amyloidními proteiny (Heber et al., 2000; Zheng et al., 1995), pozdější studie však ukázaly, ţe mnoţství APLP1 nebo APLP2 se u mutantních myší 31

nemění a mechanismus kompenzace tedy není znám (Herms et al., 2004). Je tedy zřejmé, ţe APP není pro embryogenezi úplně nezbytný, hraje ale významnou roli v dospělosti. Struktura a funkce různých forem APP Dalším způsobem, jak popsat funkci APP v buňce, je podrobné studium struktury jednotlivých domén a štěpených forem. APP je transmembránový protein typu I – je uchycen v plazmatické membráně krátkým hydrofobním úsekem, který odděluje velkou

N-terminální

extracelulární

doménu

od

krátké

cytoplazmatické. Samotná extracelulární oblast (tvoří ji 70% aminokyselin řetězce) se však dá dále rozdělit na několik funkčních domén spojených linkery. Tato neštěpená forma proteinu vázaného v membráně se nazývá holo-protein,

v průběhu

maturace

je

bohatě

upravován

v Endoplazmatickém retikulu a Golgiho aparátu N- a Oglykosylací (viz. Obrázek č. 7). Tato forma hraje roli v regulaci

O BRÁZEK Č. 7: STRUKTURA HOLO APP V CYTOPLAZMATICKÉ MEMBRÁNĚ

( HTTP:// WWW.RCSB.ORG/ PDB / HOME / HOME . DO )

Cu2+ iontů, iontových kanálů a reguluje růst neuronů interakcí s komponentami extracelulární matrix – např. heparinem nebo kolagenem I a IV (Reinhard et al., 2005). Můţe fungovat jako monomer nebo tvořit homodimery a fungovat jako receptor růstových faktorů či regulovat interakci buňka-buňka nebo buňka-matrix. Stejně tak můţe tvořit funkční heterodimery s proteiny APLP1 a APLP2. Štěpením α-sektretázou jsou uvolňovány solubilní APPα a β, které fungují jako růstové faktory (viz Obrázek č. 8). C-terminální fragmenty C80 a C83 jsou zadrţovány v buňce a dále štěpeny γ-sektretázou za vzniku P3 peptidů. Fragment C99 je štěpen γ-sektretázou ve spolupráci

s presenilinem

na

Abeta

peptidy

a cytotoxické

fragmenty

γ-CTF50,

γ-CTF57 a γ-CTF59. Protein APP je štěpen na mnoho dalších menších forem, nejsou však významné

pro

tuto

práci

a nebudou dále zmiňovány.

O BRÁZEK Č. 8: SCHÉMA ŠTĚPENÍ LIDSKÉHO APP695 (REINHARD ET AL ., 2005)

Nejvíce pozornosti bylo vţdy věnováno právě charakterizaci Abeta peptidů – jejich solubilní formy,

tvorbě

intermediátů 32

a fibril. Zajímavý je rozdíl v konformaci - zatímco solubilní Abeta se vyskytuje ve formě α-helixů, fibrily jsou tvořeny hlavně β-skládanými listy. Podnět, který vede k takové změně konformace, není znám. Bylo však popsáno, ţe některé mutace spojené s onemocněním (tzv. holandská nebo arktická) způsobují přednostní skládání do β-skládaných listů a vytváření většího mnoţství fibril (Levy et al., 1990). Důvodem je umístění mutace v oblasti prvního helixu. Fyziologická funkce Abeta částic je zatím nejasná. Byla popisována jejich role jako regulátoru iontových kanálů (Ramsden et al., 2001), mají také schopnost vázat a redukovat ionty kovů – např. ţelezo, zinek a měď. Nezdá se však, ţe by funkce byla pro mozek úplně kritická. Například myši mají oproti člověku třikrát menší mnoţství Abeta částic na 1 mol APP, kteý není v takové míře štěpen β-sekretázou a liší se značně i v sekvenci. Abeta sekvence chybí proteinům APLP1 a APLP2. Jak bylo výše popsáno, intracelulární doména AICD (APP intracellular domain) můţe být odštěpována proteázovým komplexem presenilin/γ-sekretáza a dále procesována za vzniku Abeta40-42. Důleţitá je však hlavně pro interakci s vazebnými partnery. Většina z nich se váţe právě přes tuto doménu. Zvláštní pozornost si zaslouţí motiv YENPTY (aminokyseliny 682-687) nacházející se v AICD. Tento motiv je kompletně zachovaný od Caenorhabditis elegans aţ po savce. Je nezbytný pro endocytózu proteinu klatrinovými váčky i pro vazbu hlavních partnerů jako Fe65, JIP, Dab nebo X11/Mint (Reinhard et al., 2005). AICD je zvláštní tím, ţe v roztoku nemá stabilní konformaci a výrazně mění rozloţení helixů, skládaných listů a hydrofobních klastrů podle konkrétního pH a vazebného partnera. Uvaţuje se, ţe právě vazba s konkrétním proteinem umoţňuje stabilizaci konformace (Zhang et al., 1997). Pro některé interakce je nezbytná také fosforylace AICD na threoninu 668 (Ando et al., 2001). Předpokládá se, ţe AICD hraje roli v několika signálních drahách od vápníkové signalizace, přes apoptózu aţ k regulaci genové exprese (Reinhard et al., 2005). Funkce této domény v jaderné signalizaci byla navrţena v 90. letech kvůli podobnosti s Notch signalizací. Byly popsány například tyto cílové geny: APP, Tip60, neprilysin, GSK3β, KAI1. Neprilysin degraduje částice Abeta a vytváří tak zpětnovazebnou smyčku regulace APP. APP a různá onemocnění Defekty ve funkci a zpracování proteinu APP mohou být příčinou Alzheimerovy choroby (Alzheimer disease, AD). Jedná se o neurodegenerativní onemocnění charakterizované progresivní demencí, ztrátou kognitivních schopností, depozicí fibrilárních amyloidních proteinů

ve

formě

neurofibrilárních vřetének,

extracelulárních amyloidních plaků

a vaskulárních depozitů. Hlavní sloţkou těchto plaků jsou právě Abeta40-42 peptidy 33

produkované sekvenčním štěpením proteinu APP sekretázami α-γ. Za degeneraci neuronů jsou zodpovědné také cytotoxické C-terminální fragmenty (CTF). Některé familiární formy AD jsou podmíněny mutacemi v APP nebo presenilinu – způsobují zvýšenou tvorbu Abeta částic a celkově změny v procesování proteinu APP. Některé zase zvyšují tendenci Abeta částic k agregaci. Jednou z příčin sporadické AD je deregulace procesování APP, přesné mechanismy nejsou známy a jsou předmětem intenzivního výzkumu. Dalším onemocněním je např. cerebrální amyloidní angiopatie, dědičná choroba způsobená ukládáním amyloidních peptidů v cévách mozku. Hlavními projevy jsou opakující se mozková krvácení, mrtvice, ischemie a zhoršování mentálních schopností. Role APP v hematologických onemocněních byla studována jen okrajově. Například u pacientů s akutní myeloidní leukémií (AML) koreluje vysoká exprese genu s výskytem translokace t(8;21), jinak však nebyl popsán signifikantní vliv míry exprese na klinický stav pacienta, ani vliv na diferenciaci, proliferaci a apoptózu zkoumaných buněčných linií (Baldus et al., 2004; Wang et al., 2010). Moţný vztah APP k chronické lymfocytární leukémii popsala celogenomová epigenetická studie hledající nové molekulární signální dráhy pozměněné u tohoto onemocnění (Tong et al., 2010). Bylo nalezeno celkem 280 potenciálních cílů aberantní metylace DNA. Metylační status byl u 78 pacientů s CLL potvrzen pro 22 genů pomocí pyrosekvenování. Dva z těchto genů – APP a PRIMA1 byly dále analyzovány v primární kultuře leukemických buněk. Byla potvrzena inverzní asociace exprese genu s metylací, byl testován efekt inhibitoru metyltransferáz 5-aza-2′-deoxycytidinu. Podle studie metylovaný stav promotoru APP koreluje s kratším přeţíváním pacientů. Mutační status IGHV nebo exprese ZAP-70 však nekoreluje s konkrétním metylačním profilem. Analýza celkově ukázala, ţe aberantní metylace je jedním z potenciálních mechanismů patogeneze CLL a moţným terapeutickým cílem.

3.2 APLP1, APLP2 Ve srovnání s proteinem APP jsou jeho homology APLP1 a APLP2 velice málo prostudované, chybí jasný fenotyp mutantních myší a není přesně známa fyziologická funkce. Oba APLP proteiny vykazují silnou sekvenční homologii s APP a jsou také podobně procesovány proteolytickými enzymy (neobsahují však Abeta sekvenci). Stejně jako u APP jsou štěpením uvolňovány solubilní extracelulární domény. Specifická exprese v různých tkáních byla popsána in situ hybridizací a analýzou RT-PCR – APP a APLP2 vykazují 34

společný výskyt ve většině tkání během embryonálního vývoje i u dospělých organismů, APLP1 je primárně exprimován v nervové tkáni (Slunt et al., 1994; von Koch et al., 1995). Vzhledem k podobnosti ve výskytu a sekvenční homologii se tedy původně uvaţovalo také o podobné funkci proteinů v regulaci růstu neuronů nebo tvorbě synapsí. Studie myší deficientních pro různé kombinace těchto proteinů však ukazují opak. Jedinci deficientní pro jeden z genů vykazují vţdy jen mírný fenotyp (Heber et al., 2000). Myši APP -/- jsou viabilní a fertilní, mají lehké poruchy motoriky, omezenou uchopovací schopnost předních končetin a menší váhu oproti kontrolním jedincům. APLP1-/- myši jsou také viabilní a fertilní, vykazují pouze lehký růstový deficit. APLP2-/- sám o sobě nepřináší ţádný fenotyp. Jinak je tomu u myší deficientních pro více genů zároveň - linie APP-/APLP2-/- i APLP1-/-APLP2-/- jsou většinou perinatálně letální bez ţádné zjevné příčiny, ţivě narození jedinci většinou umírají brzy po narození. Naopak mutanti APP-/-APLP1-/- se podobají jedincům APLP-/- a nevykazují ţádné abnormality kromě menší váhy oproti kontrolám. Zvláštní je tedy fakt, ţe proteiny APP a APLP2, většinou povaţovány za funkční homology, musí mít naprosto odlišnou fyziologickou funkci. Zatímco APP není nezbytný pro embryonální vývoj, bez APLP2 jeho úspěšné dokončení není moţné. Přitom ţádná analýza těchto mutantů neodhalila zjevnou příčinu smrti. Nebyla nalezena ţádná vada vývoje orgánů, porucha tvorby synapsí, migrace a adheze neuronů, viability, diferenciace nebo růstu axonů. Mutace APP-/-APLP1-/-APLP+/- jsou také letální. Pouze minimum jedinců přeţívá aţ do narození, pokud ano, umírají brzy kvůli poruchám příjmu potravy bez zjevné příčiny. U těchto mutantů se vyskytuje fenotyp podobný lissencefalii, způsobený poruchou migrace a adheze neuronů při embryonálním vývoji. Byla zkoumána také moţnost vzájemné funkční kompenzace u myší s jedinou mutací, které by vysvětlovalo absenci silnějšího fenotypu. Na úrovni proteinu však tato hypotéza nebyla prokázána. Perinatální letalita zabraňuje dále zkoumat mechanismy, které jsou narušeny u mutantních jedinců. Tento problém řeší embryonální kmenové buňky odvozené z embryí APP-/-APLP1-/APLP2+/-. Z nich je moţné diferencovat neurony in vitro a hledat specifický fenotyp (Bergmans et al., 2010). Bohuţel ani tato metoda nepřinesla ţádné jednoznačné výsledky. APP-/-APLP1-/-APLP+/- neurony nevykazují signifikantní rozdíl v apoptóze, migraci, diferenciaci, tvorbě neuritů, synapsí ani zachovávání polarity neuronů. Fyziologická role těchto proteinů tedy zůstává zatím neobjasněna. Celkově byly tyto proteiny studovány hlavně v kontextu embryonálního vývoje a nervové soustavy. V naší studii hledáme moţnou souvislost s patogenezí CLL, tedy krevních buněk. 35

4. Cíle diplomové práce Cílem této práce je ověřit význam kandidátních proteinů APP, APLP1 a APLP2 v patogenezi CLL a v regulaci WNT/PCP dráhy. 

V rámci klinické části studie bude provedena analýza exprese na úrovni mRNA. Vybrané geny APP, APLP1 a APLP2 (kódující amyloidní proteiny) budou analyzovány nejdříve na skupině 76 pacientů pomocí qRT-PCR na platformě LC480 a Syber Green firmy Roche. Exprese těchto genů bude posouzena v souvislosti s klinickým stavem, přítomnými genetickými aberacemi, přeţíváním bez nutnosti nasazení terapie a celkovou prognózou. Bude také provedena analýza změny exprese genů v čase u pacientů s agresivní chorobou, kterým byla nasazena terapie, a u pacientů s indolentní formou CLL bez terapie.



Vztah amyloidních proteinů APP/APPL a APLP2 k WNT/PCP dráze bude ověřen pomocí biochemických metod – ko-imunoprecipitace, imunocytochemie a analýzou fosforylačního statusu DVL2 (fosforylovaný DVL2 je znakem aktivní WNT/PCP signalizace). Interakce bude ověřována s vyuţitím drozofilích (APPL, dFZD, VANG) i savčích konstruktů (APLP2, FZD6, ROR1/2). K analýze fosforylačního statusu DVL2 budou vyuţity linie MEF odvozené z embryí myší mutantních pro jednotlivé geny (podrobněji popsáno v oddíle Materiály a metody).



Bude zkoumán vliv Abeta částic, štěpené formy APP, na aktivitu WNT/PCP dráhy. Důvodem je známá role částic Abeta v patogenezi Alzheimerovy choroby (tvorba amyloidních plaků). K experimentům budou vyuţity rekombinantní Abeta40 a 42.



Budou započaty experimenty popisující vliv proteinu APLP2 na migraci a apoptózu B-lymfocytů.

36

5. Materiály a metody:

5.1 Buněčné linie, práce s tkáňovými kulturami Všechny buněčné linie byly kultivovány v inkubátoru při teplotě 37°C a 5% koncentraci CO2. Adherentní linie byly pasáţovány kaţdé dva aţ tři dny před dosaţením stavu konfluence pomocí trypsinu (PAA), suspenzní kultura byla před dosaţením konfluence (u MEC1 buněk 1-2x106 b/ml) ředěna předehřátým mediem. Buňky byly po delších časových obdobích kultivace ošetřovány Sparfloxacinem (Sigma) jako prevence před nákazou mykoplazmaty. Pro všechny linie byl pouţíván plastik pro tkáňové kultury (TPP, Biotech), objem ţivného média i trypsinu podle následující tabulky: Kultivační misky Růstový povrch/jamku Růstový povrch Objem trypsinu Objem média/jamku 15 cm

148,7 cm2

148,7 cm2

60,1 cm

2

9,03 cm

2

24 jamek Kultivační lahve

1,91 cm

2

25 cm2

25 cm2

25 cm2

75 cm2

75 cm2

75 cm2

10 cm 6 jamek

60,1 cm

2

3 ml

30 ml

1 ml

10 ml

54,18 cm

2

0,3 ml

3 ml

45,84 cm

2

0,1 ml

0,5 ml

Buňky byly před trypsinizací a při přípravě vzorků omývány sterilním fyziologickým roztokem PBS, pH 7,6 (NaCl 7,75 g; K2HPO4 1,50 g; KH2PO4 0,20 g v 1 l dest. vody). 5.1.1 HEK293 Adherentní buněčná linie HEK293 (HEK293 - Human embryonic kidney, ATCC) byla kultivována v ţivném mediu DMEM (Gibco, Invitrogen), doplněného: 10% fetální bovinním sérem (FBS, PAA), 1% L-glutaminem (PAA), 1% penicilin-streptomycinem (PAA). Tato buněčná linie byla pouţita pro snadnou transfekovatelnost a produkci velkého mnoţství proteinů potřebného pro jejich analýzu. Byly vyuţity pro potvrzení interakce amyloidních proteinů s proteiny PCP dráhy – konkrétně pro imunoprecipitaci a imunocytochemii. Samotná linie byla odvozena v 70. letech Alexem van Ebem transformací kultury normálních embryonických buněk ledvin adenoviry. V genomu HEK293 bylo identifikováno několik chromozomových aberací – tři kopie chromozomu X, čtyři kopie chromozomu 17 a 22. Nejsou tedy vhodné jako modelová linie pro studium mechanismů a normálního chování 37

buněk, jsou však výjimečně dobře transfekovatelné a ideální pro produkci proteinů, jak bylo zmíněno výše. 5.1.2 MEC1 Suspenzní buněčná linie MEC1 (DSMZ) byla kultivována v ţivném mediu RPMI 1640 (Biotech) doplněném o 10% fetální bovinní sérum (FBS, PAA), 1% L-glutamin (PAA) a 1% penicilin-streptomycin (PAA). Pro účely funkčních experimentů bylo pouţito médium s obsahem 1% FBS. Pro vnesení DNA/siRNA do buněk byla pouţita metoda nukleofekce s vyuţitím přístroje Neon (Invitrogen). Linie MEC1 byla popsána jako modelová buněčná linie pro studium CLL (Stacchini et al., 1999) a v naší laboratoři byl tento model optimalizován pro studium migračního potenciálu CLL buněk. Linie byla v devadesátých letech odvozena z periferních B-lymfocytů pacienta s touto nemocí. MEC1 buňky vykazují expresi markerů maturovaných B-lymfocytů CD19, CD20, CD21 a CD22. Jsou CD11a+, CD18+, CD44+, CD49d+, CD54+ a exprimují vysoká mnoţství jak CD80, tak CD86. Naopak mají menší expresi CD5. V buňkách linie MEC1 nabyly detekovány somatické mutace těţkého řetězce imunoglobulinu. 5.1.3 MEF Adherentní buněčná linie MEF (MEF - mouse embryonic

fibroblasts) byla odvozena

z myších embryonálních fibroblastů. Tato linie byla také kultivována v ţivném mediu DMEM (Gibco, Invitrogen), doplněného o 10% fetální bovinní sérum (FBS, PAA), 1% L-glutamin (PAA), 1% penicilin-streptomycin (PAA). Tato linie byla pouţita pro funkční studie z důvodu snadné analýzy fosforylačního statusu proteinu DVL, který je znakem aktivace PCP dráhy. K buňkám byl do média pro tento účel přidáván rekombinantní protein Wnt5a (Recombinant Human/Mouse Wnt-5a, 645-WN-010, RnD) ve finální koncentraci 100 ng/ml a rekombinantní Abeta40/42 (Amyloid beta 40 a 42, RnD) ve finální koncentraci 100 nM a 1 µM. Funkce amyloidních proteinů v regulaci WNT/PCP dráhy byla dále studována na buněčné linii MEF derivované z APP-/-/APLP2-/myších embryí, dále na linii s navrácenou expresí app. Obě tyto linie byly vyprodukovány a pro práci zapůjčeny z laboratoře VIB Center for the Biology of Disease v rámci spolupráce na společném projektu (Alessia Soldano: The Amyloid Precursor Proteins are conserved modulators of the Wnt PCP pathway required for robustness of axonal outgrowth, PLOS Biology, 2013).

38

5.2 Transfekce pomocí PEI (polyethylenimin) Pro účely ko-imunoprecipitace (IP) byly buňky HEK293 nasazeny na 6-jamkové misky nebo misky s průměrem 10 cm a ponechány v inkubátoru 24 h při 37°C/5% CO2 pro dosaţení 60% konfluence. Následně byly transfekovány pomocí transfekčního činidla PEI, pH 7,0 (Sigma). Transfekční směs byla připravena v celkovém objemu 400 µl, poměr DNA a PEI byl vţdy 1 µg DNA : 2 µl PEI, zbytek objemu byl doplněn bezsérovým médiem DMEM. Vţdy byla transfekována kombinace dvou plazmidů, celkově 8 µg DNA/misku. V negativních kontrolách bylo mnoţství transfekované DNA nahrazeno prázdným vektorem pcDNA3.1. Směs byla promíchána vortexem a inkubována 20 minut při pokojové teplotě, aby došlo k vytvoření komplexů PEI s DNA. Poté byla rovnoměrně rozkapána na buňky a po třech aţ pěti hodinách bylo médium vyměněno za nové. Transfekované buňky byly kultivovány další dva dny, poté sklizeny pro účely IP. Buňky pro imunocytochemii byly na začátku nasazeny na kulatá krycí sklíčka (průměr 13 mm, Vitrum-VWR) na 24-jamkové misky v hustotě 60 000 buněk na jamku. Transfekce probíhala analogicky, celkový objem však byl 50 µl a mnoţství DNA 0,4 µg. Povrch sklíček byl pokryt 0,1% ţelatinou (Sigma), která zajišťuje pevné přichycení buněk na povrch a větší stálost během následné fixace a barvení. 24 hodin po nasazení byly buňky transfekovány, po třech hodinách bylo vyměněno medium a buňky byly před fixací kultivovány dalších 24 hodin. Sloţení transfekční směsi: 1. Plazmidová DNA -

10cm misky – 4 µg + 4 µg DNA/jamku (dva DNA konstrukty, kaţdý po 4 µg)

-

6-jamkové misky – 2µg + 2 µg DNA/jamku

-

24-jamkové misky – 0,2 µg + 0,2 µg DNA/jamku

2. Sterilní PEI, pH 7.0 -

2 µl PEI/1µg DNA

3. Bezsérovým mediem DMEM doplnit do celkového objemu 400 µl/50 µl DNA pouţitá pro transfekci byla připravena kitem JETSTAR Plasmid Maxi 20 Kit (Genomed) pro izolaci plazmidové DNA z E.coli a rozpuštěna v 1xTE pufru (10 mM Tris, 1 mM EDTA). Níţe je uveden seznam všech plazmidů uţitých pro experimenty se základní specifikací.

39

Plazmid

Gen

Značka

Zdroj

pCMV6-XL6-Ror1

Ror1

-

Homo S.

-

-

-

pcDNA3.1-HA-mDvl2 wt

Dvl2

HA

Mus M.

pcDNA3-Appl-Flag

Appl

Flag

Drosophila m.

pcDNA3.1 neo (+) APLP 2 myc

Aplp2

Myc

Homo S.

pcDNA3-VANG-myc

Vang

myc

Drosophila m.

pcDNA3-dFz-eGFP

dFz

eGFP

Drosophila m.

phsFzd6-GFP-WT

Fzd6

GFP

Homo S.

pcDNA3

5.3 Ko-imunoprecipitace Ko-imunoprecipitace je jednou ze základních metod pro studium interakcí mezi proteiny. Byla vyuţita při studiu vztahu amyloidních proteinů s komponentami PCP dráhy a pro doménové mapování. Buňky HEK293 byly nasazeny na 10cm nebo 6-jamkové misky a transfekovány při konfluenci 60%. Po dvou dnech od transfekce, tedy po dosaţení konfluence, byly sklizeny pro účely imunoprecipitace. Nejdříve bylo odsáto médium a buňky byly opláchnuty roztokem PBS. V této fázi byly misky přeneseny na led a veškerá další manipµlace s buňkami nebo lyzátem probíhala na +4°C, důvodem je zachování vazby mezi proteiny. Pro lyzi buněk byl pouţit vychlazený lyzační pufr NP40: 50 mM Tris buffer pH 7.4 150 mM NaCl 1 mM EDTA 0.5% NP40 Do alikvotu lyzačního pufru NP40 byl přidán roztok 1x koncentrovaných proteázových inhibitorů (Roche) a 0,1 mM DTT (Sigma). Na kaţdou jamku/misku byl pouţit 1 ml lyzačního pufru, lyze probíhala 30 minut na ledu. Lyzát byl přenesen do předchlazených zkumavek a centrifugován při maximální rychlosti (13 000 rpm) 60 minut při 4°C. Supernatant byl poté rozdělen do tří zkumavek – 60 µl jako kontrolní vzorek, 450 µl určených pro inkubaci s protilátkou specifickou pro jeden z proteinů, 450 µl pro inkubaci s protilátkou specifickou pro druhý z proteinů. Ve všech případech 1µg protilátky na kaţdý ze vzorků. Ve většině případů bylo vyuţíváno protilátek proti značením na proteinech (tzv. tagy), v případě ROR1 byla pouţita protilátka přímo proti lidskému ROR1 proteinu. 40

Název

Specifita

Anti-c-myc Flag M2 Anti-GFP Anti-hROR1 Anti-HA tag HA-probe antibody (Y-11)

Myc Flag GFP ROR1 HA HA

Katalogové číslo C3956 F1804 20R-GR011 AF2000 ab9110 sc-805

Výrobce

Zdroj

Sigma Sigma Fitzgerald RnD Systems Abcam Santa Cruz

králík myš králík koza králík myš

Ke kontrolním vzorkům bylo přidáno po 15 µl roztoku 5x Laemmli (sloţení viz oddíl 5.7.2), následně byly povařeny 2 minuty při 100°C a zamraţeny na -20°C. Lyzáty s protilátkami byly inkubovány 40 minut na ledu, v mezičase byly připraveny sefarózové kµličky. Jedná se o sefarózové kuličky konjugované s G-proteinem (GE Healthcare), schopné vázat na sebe protilátky se specificky navázanými proteiny. Kuličky jsou uchovávány v roztoku ethanolu, nejdříve proto byly promyty NP40 lyzačním pufrem. Promývání se provádí třemi opakováními centrifugace (1000 rpm, 4°C, 1min) příslušného objemu kuliček a následným opláchnutím pufrem NP40. Po 40 minutách inkubace supernatantu s protilátkami bylo ke kaţdému vzorku přidáno 15 µl kuliček. Vzorky byly umístěny na karusel na +4°C. Tam byly ponechány buď 4 hodiny, nebo přes noc. Další den byly vzorky dále zpracovávány. Vzorky byly 5x promyty vychlazeným lyzačním pufrem (opět centrifugace 1000 rpm 4°C, 1 min a následné promytí pufrem). Po posledním kroku promývání byl veškerý supernatant odstraněn a ke kaţdému vzorku bylo přidáno 40 µl roztoku 2x Laemmli. Vzorky byly povařeny 2 min při 100°C a zamrazeny na -20°C. Takto připravené vzorky byly dále analyzovány metodou western blotting.

5.4 Imunocytochemie Imunocytochemie je další metodou pro studium interakce proteinů, umoţňující přímo vizualizovat lokalizaci a funkci proteinů v buňce. Pro tuto metodu byla pouţita buněčná linie HEK293. Jak uţ bylo zmíněno v kapitole o transfekci, buňky pro imunocytochemii bylo nutné připravit na kulatá krycí sklíčka potaţená 0,1% ţelatinou v hustotě 60 000 buněk/jamku na 24-jamkové desky. Sklíčka byla nejprve opláchnuta v ethanolu, oţehnuta nad kahanem a vloţena do jamek. Sklíčka byla na 20 min převrstvena 300 µl 0,1% ţelatiny (Sigma), ta byla poté odstraněna a sklíčka byla ponechána důkladně oschnout. Na sklíčka byla následně 41

rozdávkována buněčná suspenze. Po 24 hodinách, kdy uţ byly buňky pevně přisedlé na sklíčku, byla provedena transfekce konstruktů kódujících studované proteiny. Po dalších 24 hodinách mohou byly buňky dále zpracovány. Čas, po který buňka produkuje protein, i mnoţství transfekované DNA bylo optimalizováno tak, aby bylo dosaţeno dostatečného mnoţství proteinu, které je moţné vizualizovat, ale zároveň byla zachována co nejpřirozenější lokalizace a konformace. Takto připravené buňky byly

omyty roztokem PBS a fixovány 4% roztokem

paraformaldehydu (300 µl/jamku, 15 min). Poté byly buňky 3x roztokem PBS, při promývání vţdy ponecháme stát 5-10 min. Pro prevenci nespecifických vazeb protilátek byly vzorky blokovány 1 hodinu 500 µl PBTA (1x PBS; 3% BSA; 0,25% Triton X-100; 0,01% NaN3). Následně byly k PBTA přídány primární protilátky v koncentraci 1:500. Vzorky byly inkubovány přes noc při teplotě 4°C. Název Anti-c-myc Flag M2 Anti-GFP Anti-hROR1 Anti-HA tag Anti-Amyloid β Antibody Anti-APLP2, full length

Specifita Myc Flag M2 GFP ROR1 HA Abeta APLP2

Katalogové číslo C3956 F1804 20R-GR011 AF2000 Ab9110 MABN10 171617

Dodavatel Sigma Sigma Fitzgerald Biomedica Abcam Millipore Calbiochem

Zdroj králík myš králík koza králík myš králík

Další den byly vzorky 6x promyty roztokem PBS, pokaţdé 5-10 min. Promyté vzorky byly opět blokovány, tentokrát 30 min, v roztoku PBTA. Poté byly přidány sekundární protilátky v koncentraci 1:1000. Vzhledem k tomu, ţe sekundární protilátky jsou jiţ konjugované s fluorescenční barvou, bylo nutné od této chvíle vzorky chránit před světlem aluminiovou fólií. Následně byly vzorky znovu 6x promyty. Po třetím promytí byly buňky na 10 min inkubovány s 300 nM roztokem DAPI (Invitrogen), který umoţní vizualizaci buněčných jader.

42

Specifita

Katalogové číslo

M R G M R G

A-11001 A-11008

A-21121 A-11004

A-11011 A-11058

Dodavatel

Emise (λ)

Life Technologies Life Technologies Life Technologies Life Technologies Life Technologies Life Technologies

488 488 488 568 568 594

Obarvené a promyté vzorky byly pomocí glycerol-ţelatiny (Sigma) rozehřáté na 50°C upevněny na podloţní skla. Takto připravené vzorky byly uchovány ve speciálních kazetách při 4°C. Snímky pro tuto práci byly pořízeny na laserovém konfokálním mikroskopu Olympus FV1000 na pracovišti Ústavu histologie a embryologie Lékařské fakµlty Masarykovy univerzity a v případě experimentů s Abeta na fluorescenčním mikroskopu Olympus IX51.

5.5 Polymerázová řetězová reakce v reálném čase (qRT-PCR) 5.5.1 Zpracování cDNA pro klinickou analýzu pacientů s CLL cDNA 94 pacientů (celkem 129 vzorků, u části pacientů byl odebrán druhý vzorek po určitém čase pro moţné srovnání změny exprese genu v čase a vlivu terapie) s chronickou lymfocytární leukémií pro analýzu exprese amyloidních proteinů byly připraveny na spolupracujícím pracovišti Centra molekulární biologie a genové terapie, Klinice interní hematologie a onkologie. Naředěná cDNA nám byla dodána pro zpracování v naší laboratoři, kde byl opět pouţit k měření Light cycler 480 (Roche). Reakční směs byla namíchána do finálního objemu 20 µl podle následujícího rozpisu: 1 jamka (20 µl celkový objem): 1,7 µl 25 mmol MgCl2 (Fermentas) 6 µl primery - směs primerů FW + RW, finální koncentrace 0,5 µM (syntéza Generi Biotech) 3 µl SyberGreen Master I 2x koncentrovaný (Roche) 5,3 µl H2O 4 µl templát cDNA Připravená 96-jamková deska se vzorky byla vţdy zakryta průhlednou fólií a stočena při 1000 rpm po dobu 2 min. 43

Samotná reakce proběhla podle základního rozpisu cyklů templátu pro Syber Green I Master mix. Analyzovány byly geny APLP2, APLP1, APP a kontrolní geny ACTIN a B2M. U genů APLP1 a APP byla pouţita teplota pro nasedání primerů 55°C, u genu APLP2 teplota 57°C. Kontrolní geny byly vţdy analyzovány zároveň s geny zájmu, při stejné teplotě a na stejné desce. Jako kontrolní vzorek pro srovnání relativní exprese byla pouţita cDNA buněk MEC1. Vzorky byly měřeny v triplikátu, jako výsledná hodnota CT byl brán průměr těchto tří hodnot. Hodnoty triplikátu se směrodatnou odchylkou větší neţ 0,5 nebyly pro výpočet brány v úvahu a odlehlá hodnota byla vyřazena. Specifita reakce byla zkontrolována analýzou Tm (Tm melting temperature, analýza křivky tání). Teplota nasedání primerů na templát byla předem optimalizována tak, aby reakcí vznikal pouze jeden specifický produkt. Přítomnost specifického produktu byla ověřena na 1% agarózovém gelu podle níţe uvedeného postupu (oddíl 5.6). Rozpis cyků pro Light cycler 480: Krok pre-inkubace amplifikace křivka tání ochlazení

Čas 5 min 10 s/10 s/10 s 5 s/1 min/30 s

Teplota 95°C 95°C/55°C/72°C 95°C/65°C/97°C 40°C

Cykly 1 45 1 1

Sekvence pouţitých primerů: ACTIN fw ACTIN rv B2M fw B2M rv APP fw APP rv APLP1 fw APLP1 rv APLP2 fw APLP2 rv

5´ GAT TCC TAT GTG GGC GAC GAG 3´ 5´ATG GCT GGG GTG TTG AAG GTC TC 3´ 5´ TGT CTG GGT TTC ATC CAT CCG 3´ 5´ TTG TTC ACA CGG CAG GCA TAC TC 3´ 5´ TGC AGA ATT CCG AACA TGA CT 3´ 5´ TCC AAT GAT TGC ACC TTT GT 3´ 5´ TCA CAC CCT TTT GTG AGA CG 3´ 5´ TGG GAA TTC TTA GGG ATG GA 3´ 5´ CAA ATG TGA TGG AGG CAA AC 3´ 5´ ACA AAT TCA CCC ACG AGA CA 3´

Relativní exprese genů byla vypočítána jako 2-ΔΔCT, kde

ΔΔCT

= ΔCT (genu zájmu) – ΔCT

(průměrné hodnoty). Exprese byla normalizována ke dvěma kontrolám – actinu a β-2-mikroglobulinu. Hodnota ΔCT byla vypočítána podle vzorce ΔCT =CT (genu zájmu) – CT (kontroly). 44

Pro analýzu výsledných hodnot, vytváření grafického zobrazení a výpočet statistických údajů byl pouţit program GraphPad Prism 5. 5.5.2 Izolace RNA z buněčné linie MEC1 Celková RNA z buněk MEC1 byla izolována kitem UltraClean Tissue and Cells RNA Isolation Kit (MoBio) podle protokolu výrobce. Pro izolaci bylo pouţito vţdy 2x106 buněk z kaţdé kondice. Izolovaná RNA byla rovnou přepsána reverzní transkripcí do cDNA, zbytek byl uchován na -80°C. Koncentrace a čistota RNA byla změřena na přístroji Nanodrop 2000 (Thermo Scientific). 5.5.3 Přepis RNA do cDNA Nejdříve byla namíchána směs RNA, Oligo d(T) primeru a vody v celkovém objemu 23 µl. Směs byla zahřáta po dobu 5 min na 65°C (směs A). Zvlášť byl pro všechny vzorky připraven přídavek pufru, směsi nukleotidů, vody a reverzní transkriptázy do objemu 17 µl (směs B). Směs obsahující reverzní transkriptázu byla přidána k předpřipravené směsi. Vše bylo inkubováno při 37°C po dobu 1 hod, následně 10 min při 70°C. Z takto připravené cDNA byly odebrány vzorky a naředěny 10x vodou pro analýzu qRT-PCR. Zbytek koncentrované cDNA byl uchován na -80°C. Směs A: 1 µg RNA 2 µl Oligo d(T) primer (20 µM, Fermentas) Doplnit H2O (bez RNáz) do 23 µl, zcentrifµgovat, zahřát na 5 min na 65°C. Směs B: 8 µl 5x pufr pro reverzní transkriptázu (Fermentas) 4 µl 10 mM dNTP (Fermentas) 3 µl H2O (bez RNáz) 2 µl reverzní transkriptáza (Fermentas) Přidat k směsi A, inkubovat hodinu při 37°C, poté 10 min při 70°C.

5.6 Agarózová elektroforéza Specifita produktu qRT-PCR byla testována na 1% agarózovém gelu. Gel byl připraven z 1x TAE pufru (50x TAE: 242 g Tris, 57,1 ml ledová kyselina octová, 100 ml 0,5 M EDTA – pH 45

8.0), rozpuštěním 1g agarózy (Serva) ve 100 ml roztoku TAE (nutno rozvařit). Ethidium bromid (6 µl/100 ml, Sigma) byl přidán po zchladnutí směsi na 60°C – jedná se o barvu interkalující mezi báze DNA a umoţňuje zviditelnění DNA na gelu po osvícení UV světlem. Na gel bylo nanášeno 10 µl produktu qRT-PCR smíchaného s nanášecí barvou 6x Orange (Fermentas) v poměru 6:1. Jako velikostní marker poslouţily DNA Ladder 1 a DNA Ladder 2 (Fermentas). Elektroforéza probíhala při konstantní voltáţi 100 V po dobu 60 min.

5.7 „Western blotting – SDS page“ „Western blotting“ (WB, alternativně také imunoblot) je základní metodou pro detekci specifických proteinů v daném vzorku (buněčný lyzát nebo jinak upravené vzorky). Je zaloţena na principu gelové elektroforézy v nativním nebo denaturačním prostředí. Pro tuto práci byla prováděna analýza proteinů v denaturujících podmínkách, které umoţňují rozdělit proteiny podle délky polypeptidového řetězce. Proteiny jsou z polyakrylamidového gelu přenášeny na PVDF membránu, která umoţňuje detekci proteinů pomocí specifických primárních a sekundárních protilátek. Pro analýzu byl vyuţit systém Mini Protean system firmy Biorad. 5.7.1 Příprava polyakrylamidového gelu Pro separaci proteinů je pouţíván polyakrylamidový gel různé hustoty podle toho, jaké proteiny chceme zachytit – 8% gel je vhodný pro proteiny velikosti 50-200 kDa, 10% gely pro proteiny velikosti 37-200 kDa, 15% například zachytí i malé proteiny kolem 10 kDa. Vzorky byly analyzovány na 10% gelu o tomto sloţení:

10% dest. H2O 1 M Tris pH 6,8 1 M Tris pH 8,8 Acrylamide-bis 40% SDS 20% TEMED APS 10%

4,6 ml x 4,2 ml 2,45 ml 66 μl 7,5 μl 30 μl

1 gel Zaostřovací gel 1,18 ml 0,75 ml x 0,36 ml 19 μl 3,75 μl 37,5 µl

46

5.7.2 Příprava vzorků Metodou western blot byly analyzovány vzorky jak z imunoprecipitace, tak přímo buněčné lyzáty např. transfekovaných buněk. Příprava vzorků z imunoprecipitace byla popsána v oddíle 5.3. Ostatní buňky byly lyzovány přímo v 1x Laemmli pufru, DNA byla rozrušena sonikací a vzorek povařen po dobu 5 min na 100°C. Na gel byl nanesen velikostní marker PageRuler Plus Prestained Protein Ladder (Fermentas) a samotné vzorky (20 µg proteinu/jamku). Sloţení lyzačního roztoku Laemmli:

1x Laemmli 2x Laemmli 5x Laemmli

Tris HCL (pH 6,8) 63 mM 0,125 M 3M

Glycerol 10% 20% 50%

2-mercaptoethanol 0,1% 10% 20%

Bromfenolová modř 0,0005% 0,004% 0,01%

SDS 2% 4% 10%

Laemmli je pufr svými vlastnostmi speciálně formµlovaný pro SDS-PAGE. Obsahuje 2-mercaptoethanol (Sigma Aldrich), který redukuje intra a intermolekµlární disulfidické vazby. SDS detergent zase denaturuje proteiny a udává jim po celém povrchu negativní náboj, takţe mohou být rozdělovány podle velikosti (1,3 g SDS váţe 1g proteinu). Bromfenolová modř slouţí k obarvení vzorku a glycerol zvyšuje hustotu, a tak umoţňuje nanesení vzorku na gel. 5.7.3 SDS-page Pro samotné rozdělování proteinů byl pouţít systém Mini-PROTEAN Tetra Cell (Biorad). Gely se do něj uchytí a celé se ponoří do tzv. „running“ pufru (1 l H2O, 14,4 g Glycin, 3 g Tris, 5 ml 20% SDS) . Zaostření probíhá 20 min při napětí 120 V, rozdělení proteinů při 150 V podle potřeby (1,5-2 hod.) Z gelu jsou proteiny přeneseny na methanolem aktivovanou PVDF membránu (Immobilon-P, Biotech), transfer probíhá opět ve speciální aparatuře. Jako elektrolyt slouţí tentokrát tzv transfer pufr (700 ml H2O, 1,44 g Glycin, 0,3 g Tris, 200 ml methanol). Proces probíhá při 100 V po dobu 1 hod, je nutné chlazení ledem po celou dobu. Dále se membrány s navázanými proteiny blokují 30 min v 5% mléce (5 g sušeného odtučněného mléka/100 ml promývacího pufru), to slouţí k vyvázání nespecifických vazeb na membráně. Poté jsou membrány nařezány a přeneseny do mléka s primární protilátkou. Koncentrace protilátek se pohybuje většinou 1:500 – 1:3000, podle doporučení výrobce 47

(viz tabulka níţe). V primární protilátce jsou membrány inkubovány přes noc při 4°C, nebo 1,5 hod při pokojové teplotě. Povrch membrány musí být roztokem neustále omýván. Následuje promývání, které zajistí odmytí nespecificky navázaných primárních protilátek. Probíhá 4x10 min v roztoku tohoto sloţení: 1x Promývací pufr 5l 2M Tris pH 7,6 NaCl 10% TWEEN 20 dest. H2O

25 ml 35 g 4 ml 5l

V další fázi jsou membrány inkubovány 1,5 hod se sekundárními protilátkami v mléku, ředění je 1:5000 pro všechny sekundární protilátky. Po dalším promývání 4x10 min jsou membrány vyvolány

za

pouţití

chemiluminiscenčního

Western Chemiluminescent HRP Substrate

(Merck)

a

substrátu rentgenových

Immobilon filmů

AGFA

(PROGOM). Seznam primárních protilátek pouţitých pro WB: Dodavatel

Zdroj

Myc

Katalogové číslo sc-40

Santa Cruz

myš

Ředění pro WB 1 : 500

Flag M2

Flag

F1804

Sigma

myš

1 : 1000

Anti-GFP (3H9)

GFP

-

Chromotek

krysa

1:2000

Anti-hROR1

ROR1

AF2000

RnD Systems

koza

1:1000

HA 11

HA

MMS-101P

Covance

myš

1 : 1000

Anti-APLP2, full length

APLP2

171617

Calbiochem

králík

1 : 3000

Anti-Amyloid β Antibody Anti-Amyloid Precursor Protein Anti-actin (C-11) Anti-Dvl2 (30D2)

Abeta

MABN10

Millipore

myš

1 : 1000

APP

171-610

Millipore

králík

1 : 4000

actin DVL2

sc-1615 cs-3224

Santa Cruz Cell Signaling

králík králík

1 : 2000 1 : 1000

Název

Specifita

Anti-c-myc (9E10)

Seznam sekundárních protilátek pouţitých pro WB: Název

Specifita

Katalogové číslo

Dodavatel

Ředění

Anti-mouse IgG, peroxidase conjugate

M

A4416

Sigma

1 : 5000

Anti-rabbit IgG, peroxidase conjugate

R

A6667

Sigma

1 : 5000

Anti-goat IgG, peroxidase conjugate

G

A5420

Sigma

1 : 5000

Anti-rat IgG, peroxidase conjugate

Rat

A9037

Sigma

1 : 5000

48

6. Výsledky

Cílem této práce bylo identifikovat doposud neznámé proteiny, které přispívají k patogenezi chronické lymfocytární leukémie (CLL). Této práci tedy předcházely dvě nezávislé analýzy, zaměřené na CLL a WNT/PCP dráhu. Kandidátní proteiny pak byly navrţeny na základě překryvu těchto dat. Na pracovišti Centra molekulární biologie a genové terapie, Klinice interní hematologie a onkologie, ve spolupráci s výzkumnou skupinou prof. Pospíšilové, proběhla analýza transkriptomu pacientů s mutovaným a nemutovaným IGHV. V naší laboratoři byla provedena analýza vazebných partnerů DVL a ROR hmotnostní spektrometrií. Překryvem těchto dat bylo vybráno několik méně známých proteinů, které se zdály být zajímavé z pohledu jak CLL, tak WNT/PCP signalizace. Mezi nimi i protein APLP2. Celá rodina amyloidních proteinů APP, APLP1 a APLP2 byla podrobena další analýze a následné validaci. Nejdříve proběhla klinická část studie, která měla za cíl potvrzení významu všech tří proteinů/genů pro prognózu a diagnózu CLL. Na základě těchto výsledků se práce dále omezila pouze na dva z nich – APP a APLP2, které byly proto analyzovány dalšími metodami. Výzkum vlivu APP a APLP2 na nekanonickou WNT/PCP dráhu byl výrazně podpořen spoluprací s laboratoří doktora Bassema Hassana (VIB Center for the Biology of Disease, Leuven, Belgie) na projektu, jehoţ výstupem byla publikace v časopise PLOS Biology, 2013 The Amyloid Precursor Proteins are conserved modulators of the Wnt PCP pathway required for robustness of axonal outgrowth (viz Příloha č. 2). Vzhledem k tomu, ţe se laboratoř B. Hassana zaměřuje na vývojový model Drosophila melanogaster, velká část práce v naší laboratoři souvisela právě s drozofilími homology proteinu APP a jednotlivých komponent WNT/PCP dráhy. Validace proteinu APLP2 neustále probíhá, byly provedeny základní experimenty pro potvrzení interakce s komponentami WNT/PCP dráhy pomocí metod ko-imunoprecipitace a imunocytochemie, k dispozici jsou předběţná data, na která je potřeba navázat dalšími experimenty. Byla také započata práce ověřující vliv proteinu APLP2 na migraci CLL buněk. Data však nejsou zatím prezentována. Po optimalizaci metody transfekce MEC1 buněk a migrační eseje zatím nebyl přesně definován způsob, jakým budou data prezentována.

49