lncRNA a epigenom
Molekulární mechanismy formování epigenomu Epigenetika = věda o stabilních genetických modifikacích, které vedou ke změně exprese a funkce genů beze změny sekvence DNA Epigenetické procesy – klíčové pro: - diferenciaci a vývoj - funkci mozku - dlouhodobé odpovědi na proměnlivost prostředí Základní nástroje epigenetických procesů: Metylace DNA Modifikace histonů RNAi + nekódující RNA
Metylace DNA Metylace DNA = přidání metylové skupiny na cytosin
5-metylcytosin
- u prokaryot i eukaryot (rostliny, houby, živočichové) - u savců metylace hlavně na CpG - u savců 3 metyltransferázy: DNMT1 – udržuje metylaci DNMT3A a DNMT3B – metylace de novo - 2 vlny demetylací u savců: v zárodečných buňkách a před implantací embrya Význam:
- ochrana před TEs - embryonální vývoj - diferenciace kmenových buněk - genomový imprinting - inaktivace X
Modifikace histonů = Kovalentní připojení skupiny, většinou na N-konec (tail) - Známo 8 typů, nejstudovanější acetylace, metylace, fosforylace, ubiquitinace - > 60 aa pozic pro modifikace
Epigenetické změny a RNA Modifikace histonů, metylace DNA a modulace chromatinu prováděny komplexy – jejich směřování často řízeno RNA
- 20% lncRNA asociována s chromatin modulujícími komplexy - RNA asociována s chromatinem funkce a směřování komplexů modulujících chromatin jsou řízeny RNA
Dlouhá nekódující RNA (lncRNA) - > 200 bp (až stovky kbp) - cca 80% RNA v buňce - v savčích genomech desítky tisíc typů lncRNA - polyadenylovány, sestřihovány, regulovány TFs - většinou neznáme funkci, ale jsou indicie, že nějakou mají: - 1) exprese a alternativní splicing během diferenciace - 2) tkáňově a buněčně specifický pattern exprese - 3) regulace exprese morfogeny, TFs a hormony - 4) asociace s chromatinem v oblasti aktivních genů - 5) změna exprese v rakovinných buňkách
Funkce lncRNA Přibývají informace o funkcích konkrétních lncRNA - reprogramování kmenových buněk - regulace homeotických genů - metastáze rakoviny - genomový imprinting - inaktivace chromosomu X
Obecně regulace epigenetických procesů (diferenciace, reakce genomu na vnější prostředí, funkce mozku). Morris and Volt 2010
Dobře charakterizované lncRNAs u živočichů
Xist a inaktivace savčího X Kompenzace genové dávky = potřeba vyrovnat genovou dávku mezi samicí (XX) a samcem (XY)
Různé skupiny živočichů dělají různě.
Kompenzace genové dávky u savců - u vačnatců inaktivace paternálního X (asi primitivní stav) - paternální X označeno v samčí meióze - nevýhoda: škodlivé recesivní mutace na X odhaleny u samce i samice - u placentálů náhodná inaktivace – v různých buňkách různá Xa - výhoda – samice chráněny před škodlivými recesivními mutacemi na X - potřeba mechanismu, který spočítá poměr X:A a vybere Xi - u myši kombinace: embryo – náhodná inaktivace placenta - paternální Xi Inaktivace X v období implantace embrya (Hore et al. 2007)
Výběr Xi Komunikace mezi Xic obou X – synapse v období inaktivace X Regulační složky Xic - Xist (X inactive specific transcript) delece Xist inaktivuje druhé X chybí u ptakořitných - Tsix – exprese na obou X, ale na Xa déle delece = inaktivace nositele
Exprese Xist - Dlouhá nekódující RNA – šíření po celém X (cis) - Exprese Xist jen na počátku inaktivace, udržení inaktivace jinými faktory - Translokace Xist na autosom = inaktivace autosomu x méně efektivní - Na X mimořádně vysoká koncentrace LINEs, zřejmě místa interakce s Xist RNA
Xist inaktivuje X u placentálů i vačnatců
Inaktivace Xi Rozprostření Xist - vyloučení RNApol II z blízkosti Xi - ztráta epigenetických značek - povolání komplexů PRC2 a PRC1 (polycomb repressive complex) represivní modifikace histonů.
Chromosomy myši s chromosomem X pokrytým Xist RNA
lncRNAs a genomový imprinting Air, Kcnq1ot1 - Relativně dobře prostudované - Součásti klastrů imprintovaných genů - Aktivní u paternální alely - podílejí se na umlčení genů v cis - Mechanismus umlčování není znám (RNAi, chromosome coating, ...)
V klastrech IGs další ncRNAs i jiné typy nekódujících RNA (snoRNA)
Genomový imprinting - Většina genů exprimována bez ohledu na původ (M/P) X některé podle původu (maternální vs. paternální) = genomový imprinting -
Objev v 80. letech 20. století u myší – 2 typy pokusů: 1) Výměna prvojader – vznik zygoty s pouze paternálním / maternálním genomem Vzniklé potomstvo nebylo životaschopné
M i P genom je potřeba
2) Výměna jednotlivých chromosomů (křížení linií s translokacemi) – uniparentální disomie
- 90. léta 20. století – objev prvních imprintovaných genů (Igf2 a Igf2r) – růst embrya
První objevené imprintované geny Igf2 – růstový faktor - PEG u vačnatců a placentálů - aktivní v celém embryu a placentě - delece paternální kopie
embryo 40% normální velikosti
- 2 paternální kopie u člověka Beckwith-Wiedermannův syndrom = přerostlý plod a vysoký výskyt nádorů
První objevené imprintované geny Igf2r – receptor Igf2 - MEG u vačnatců a placentálů (kromě primátů - opačná funkce než Igf2 - u obratlovců vazebné místo pro proteiny označené manoso-6- fosfátem + fosfatázy degradace proteinů v lysozomech - u živorodých savců navíc vazba Igf2 degradace - delece maternální kopie 130% normální velikosti
embryo 125-
Imprinting Igf2 a Igf2r u savců Vejcorodí Igf2 Igf2r
není imprintovaný nemá vazebné místo pro Igf2
Vačnatci Igf2 Igf2r
PEG MEG, má místo pro Igf2
Placentálové Igf2 Igf2r
PEG MEG, má místo pro Igf2 (u sudokopytníků, hlodavců, ale ne u primátů)
Imprinting Igf2 a Igf2r zřejmě souvisí s těsným spojením matky a embrya během embryonálního vývoje prostor pro manipulaci.
Genomový imprinting se děje v zárodečných buňkách
Kota and Feil 2010
Kinship theory IGs jsou nástrojem v boji matky a otce o zdroje, které matka poskytne potomkovi - Otec chce pro svého potomka maximum zdrojů na úkor matky (další potomci nemusí být jeho) X - Matka chce racionalizovat distribuci zdrojů mezi všechny své děti - Imprintované geny jsou exprimovány hlavně v embryu/extraembryonálních tkáních a mozku (manipulace chování)
Kinship theory
Hore et al. 2007
Další taxony s predikovaným imprintingem Živorodí obratlovci – hadi, ještěři, žáby, ryby aktivní extrakci živin z matky
prostor pro
Haplodiploidní sociální hmyz – různé příbuzenské vztahy mezi pohlavími - otec příbuzný s dcerami 100% - chce jen dcery, matka 50% - chce 1:1
Vysoká otcovská investice u mořských koníků predikované opačné role MEGs a PEGs
Lidské choroby způsobené chybou imprintingu Příčiny: 1) Chromosomální aberace 2) Uniparentální disomie
Manipalviratn et al. 2009
Syndrom Prader-Willi Projev: - malý vzrůst - snížená inteligence (IQ ~ 70) - problémy s učením - chronický pocit hladu přejídání obezita
chorobné
-… Příčina: - delece části paternálního chromosomu 15 – ztráta genu, který je maternálně imprintován jedinci s PWS nemají aktivní alelu. Sesterský syndrom - Angelmanův
La monstrua desnuda (1680) od de Juan Carreño de Miranda - pravděpodobně dívka s PWS Zdroj: Wikipedia
Angelmanův syndrom Projev: - problémy s koordinací pohybu, nemotorná chůze - neschopnost mluvit (max. několik slov) - opožděný psychosomatický vývoj - zvláštní chování, stále se usmívá -…
Příčina: Delece části maternálního chromosomu 15 Důvodem je zřejmě chybějící maternální aktivní alela genu UBE3A (ubiquitin ligáza)
Chlapec s loutkou Giovani Francesco Caroto
Imprintované geny - U myši známo 145 imprintovaných genů (IG) x predikováno cca 1300 - Cca 1/2 z nich imprintována i u člověka - Některé IGs konzervované (i u vačnatců) - 80% v IGs v klastrech - V klastru bialelické, maternálně (MEGs) i paternálně (PEGs) inprintované geny - Celkový poměr MEGs a PEGs v genomu vyrovnaný - IGs nejsou sekvenčně homologické - Promotory bohaté na CpG Reik a Walter 2001
Vznik a regulace PWS-AS lokusu Oblast 15q-11-13 - delece způsobuje Prader-Willi / Angelmanův syndrom - dvě oblasti: PWS – 5 PEGs + snoRNA AS – 2 MEGs (exprese v mozku) IC řídí expresi genů v obou oblastech
Vznik a regulace PWS-AS lokusu U vačnatců a vejcorodých - většina genů chybí - chybí snoRNA - nalezené geny na různých místech genomu - chybí ICR bialelická exprese
PWS-AS lokus vznikl po odštěpení vačnatců před radiací placentálů
Čtení epigenetických značek - Komplexní – IGs jsou v klastrech sekvence
mohou sdílet regulační
- Metylace regulační sekvence ≠ nutně umlčení genu - Regulace většinou na úrovni transkripce - Regulace běžnými nástroji (metylace promotorů, silencery, antisense RNA, hraniční sekvence)
Čtení epigenetických značek Metylace promotoru - promotory IGs bohaté na CpG - vazba komplexu MBDs + Dnmt1 + deamináz histonů modulace chromatinu
Antisence RNA - část IGs asociována s antisense RNA (př. Air, Kcnq1ot1) - antisense transkriptů sama imprintována
Čtení epigenetických značek Hraniční oblasti - oblast mezi enhancerem a promotorem IG - hraniční oblast nemetylována vazba represoru inhibice IG čili metylace = aktivita IG Umlčovací faktor (silencer) - některé DMRs metylované na aktivní alele – obsahují silencer
Myší chiméry - Studium vlivu imprintovaných genů na myších chimérách - Chiméra = směs wt buněk s androgenickými (2 P genomy)/ partenogenetickými (2 M genomy) Výsledek: 1) Množství P a M buněk koreluje s velikostí embrya (P zvětšuje, M zmenšuje) a mozku (P zmenšuje, M zvětšuje) 2) Frekvence P a M buněk je v různých tkáních různá: Vyšší koncentrace P buněk: extraembryonální tkáň, hypothalamus, chondrocyty, tuk a zubní sklovina Vyšší koncentrace M buněk : embryo, mozková kůra, dentin, nosní sliznice
V souladu s kinship theory
IGs a regulace chování U savců pokračuje rodičovská investice i po narození pro manipulaci chování - IGs hojně exprimované v mozku (i u dospělců) ovlivňují chování - Knock-outy IGs kinship hypotézu
změny v chování podporující
-Peg3 a Gnaxl – podorují sání mléka - Mest, Peg3 a Magel2 – kritické pro normální mateřské chování - PEGs podporují vydávání UZ volání matky X MEGs ho potlačují
prostor
IGs a regulace chování u myši Grb10 a sociální chování - MEG v embryu – inaktivace alely v regulaci insulinu a glukózy
nadměrný růst embrya, poruchy
- PEG v dospělém mozku – inaktivace alely sociální nekompetence
Curley 2011
zvýšená dominance a
Paternální Grb10 potlačuje agresivitu
Mateřská péče a imprinting Špatné zkušenosti během raného vývoje mají dlouhodobý efekt (nemoci a poruchy chování v dospělosti). U lidí týrání/přehlížení v dětství zvýšená pravděpodobnost fyzických a psychiatrických onemocnění, užívání drog. U myší, potkanů a makaků – oddělení mláďat od matky silnější reakce na stres, poruchy sociálního a reprodukčního chování (infanticida, týrání)
Mateřská péče a imprinting Peg3 - reguluje přežívání buněk v placentě, embryu a mozku - knock-out vede k poruchám mateřské péče - dodávání živin embryu, kojení, olizování a opečovávání, či stavba hnízda. - výměna potomstva mezi wt a Peg3liniemi chování převzato od náhradní matky, přeneslo se na vnoučata 1) Peg3 manipuluje matku směrem k péči o potomstvo 2) Zkušenosti z raného vývoje se přenášejí až do následující generace
Jak to funguje na molekulární úrovni GR (hippocampal glucocorticoid receptor) - Řídí odpověď na stres regulací osy hypothalamus – šišinka – nadledvinky ( kortizol, adrenalin, …) - Vysoká hladina GR
slabá odpověď na stres
- Samičky lépe pečující o mladé méně metylovaný promotor GR může nasednout TF (NGFI-A -indukovaný nervovým růstovým faktorem) vyšší exprese GR - Metylační pattern se ustaví v prvním týdnu života – zůstává po celý život.
Sociální mozek Lidský mozek selektovaný na řešení sociálních interakcích - IGs nadprůměrně exprimované v mozku ovlivňují chování - analogie placenty = řídí distribuci zdrojů mezi příbuzné - nerovnováha imprintingu psychická porucha - dva extrémy: autismus (porucha PEGs) a psychóza (porucha MEGs)
Crespi and Badcock 2008
Vliv prostředí na epigenom Embryonální vývoj vs. dospělost – jiné vlivy a intenzita dopadu
Aguilera et al. 2010
Vliv výživy na epigenom Myší linie s mutací Avy (agouti viable yellow) – model pro vliv epigenomu na fenotyp - vložení TE do genu agouti
nesprávná exprese
žlutá myš
- krmení matek stravou s donory metylových skupin (methionin, cholin) a kofaktory (kyselina listová, B12) represe promotoru TE hnědé potomstvo
Žluté myši - sklon k obezitě a rakovině Feil a Fraga 2012
Vliv výživy na epigenom Přísun živin během embryonálního vývoje a na počátku života může ovlivnit zdraví v dospělosti (krevní tlak, kardiovaskulární choroby, cukrovka, rakovina).
Příjem potravy v rané fázi života ovlivňuje metylaci DNA - obzvláště citlivé jsou TEs a IGs - málo metylace mobilita TEs + aktivita jejich promotorů exprese „downstream“ genů - málo metylace
bialelická exprese IGs
- příliš mnoho metylace
umlčení aktivních alel IGs
změna
Vliv výživy na epigenom Hladomor v Holandsku 1944 -srovnání lidí počatých v tomto období s nepostiženými sourozenci rozdíly v metylacích Igf2 po 60 letech vnější vlivy na počátku těhotenství přetrvávají po celý život
Prostředí a epigenom Strava - Dostatek složek metabolismu S-adenosylmethioninu (kyselina listová, vitamíny B6, B12, methionin, …) - Butyrát (sýry), sulforaphan (brokolice) – inhibice HDAC promotorů tumorsupresorů
acetylace
Léky Diethylstilbestrol - zvýšené riziko rakoviny prsu, vaginy a děložního krčku a vývojovými anomáliemi změny exprese metyltransferáz a metylace DNA Valproát sodný – inhibice HDAC
Prostředí a epigenom Životní/pracovní prostor - Ionty kovů (kadmium, nikl a chrom) - redukce metylace a inhibice metyltransferáz, nikl mění modifikace histonů - Bisfenol A - využíván v plastovém průmyslu + vinclozolin - fungicid používaný na vinicích - mění metylaci DNA na některých promotorech, účastní se vývojových poruch a rakoviny. Nezdravé návyky - Kouření - hypermetylace promotorů tumor-supresorů v plicích - Alkohol - u alkoholiků nalezeny změny v metylacích CpG - u potkanů – alkoholiků - rozsáhlé epigenetické změny - Kokain – konzumace matkou změna metylací a genové exprese v hippokampu novorozenců a prepubertálních potomků.
O čem to bylo - Epigenetické měny umožňují genomu pružně reagovat na vnější podmínky - Hlavními nástroji modulace epigenomu jsou modifikace histonů a metylace DNA - Směřování modulujících komplexů je často řízeno RNA - Genomový imprinting savců – ovlivňuje růst embrya a mozek, zřejmě reakce na vznik placenty, boj otce a matky o matčiny zdroje - Epigenetické změny mohou být ovlivněny prostředím a mají dlouhodobý efekt - Správná výživa v těhotenství a mateřská péče vytvářejí odolnost vůči stresu a chorobám - Strava, životní prostředí, léky a návykové látky ovlivňují epigenom
Konec
