NITROGÉN-MONOXID METABOLITOK A KILÉGZETT LEVEGŐ KONDENZÁTUMÁBAN OXIDATÍV STRESSZEL JÁRÓ KÓRÁLLAPOTOKBAN
Dr. Bálint Beatrix
Témavezető: Dr. Horváth Ildikó Egyetemi doktori (PhD) értekezés Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Klinikai Orvostudományok
Budapest 2001
TARTALOMJEGYZÉK TARTALOMJEGYZÉK................................................................................................... 2 RÖVIDÍTÉSEK ............................................................................................................... 3 1. BEVEZETÉS ÉS CÉLKITŰZÉS ............................................................................... 4 2. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK ................................................................................... 7 2.1. Vizsgált csoportok ................................................................................................. 7 2.1.1.Cystás fibrosisban szenvedő betegcsoport...................................................... 7 2.1.2.Egészséges, habituális dohányzók és nem-dohányzók .................................. 7 2.3. Kilégzett NO és CO mérés.................................................................................... 8 2.4. Kilégzett levegő kondenzátum gyűjtése ................................................................. 8 2.5. Kilégzett levegő kondenzátumának kémia analízise.............................................. 8 2.6. Statisztikai analízis ................................................................................................ 9 3. EREDMÉNYEK .......................................................................................................... 9 3.1. FENO és NO metabolitok CF-s betegcsoportban ................................................. 9 3.2. FENO, kilégzett CO és NO metabolitok egészséges habituális dohányosokban. 10 3.2.2. FENO, kilégzett CO és NO metabolitok cigaretta expozíciót követően ..... 10 4. MEGBESZÉLÉS ....................................................................................................... 10 4.1. NO metabolitok CF-ben ...................................................................................... 10 4.2 NO metabolitok dohányzás esetén........................................................................ 12 5. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS..................................................................................... 13 6. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK NEMZETKÖZI ÉS HAZAI FOLYÓIRATOKBAN:.... 14
2
RÖVIDÍTÉSEK BAL
Tüdőmosófolyadék
CF
Cystás fibrosis, mucoviscidosis
CFTR
Cysticus fibrosis transmembran conductans regulátor
cNOS
Konstitutív nitrogén-monoxid szintáz enzim
CO
Szén-monoxid
COPD
Krónikus obstructiv bronchitis
DAN DLC O
Diaminonaftalén
eNOS
Endotheliális nitrogén-monoxid szintáz enzim
FENO
Kilégzett levegő nitrogén-monoxid koncentráció
FEV1
Forszírozott kilégzési másodperctérfogat
FVC
Vitálkapacitás
iNOS
Indukálható nitrogén-monoxid szintáz enzim
LPS
Lipopoliszacharidok
MPO
Mieloperoxidáz
nNOS
Neuronális nitrogén-monoxid szintáz enzim
NO
Nitrogén-monoxid
NOS
Nitrogén-monoxid szintáz enzim
PMN
Polymorphonuclealis granulocyta
ppb
Részecske per billió
ppm
Részecske per millió
RV
Reziduális volumen
SOD
Szuperoxid-dizmutáz
TLC
Totálkapacitás
Diffuziós kapacitás
3
1. BEVEZETÉS ÉS CÉLKITŰZÉS A gyulladás folyamata a szervezetben különböző funkciójú immunológiai védekező rendszerek indukciójával jár együtt. Ezek egyike a nitrogén monoxid (NO) képződésében résztvevő enzim, a nitrogén-monoxid szintáz (NOS) aktivációja. A NOSnak 3 izomérje ismert, melyek közül gyulladásos folyamatok esetén az indukálható NOS-nak (iNOS) van jelentősége. Az iNOS képződés különböző légúti sejtekben gyulladást okozó baktériumok, lipopoliszacharidok (LPS) és citokinek expozíciójának hatására jön létre. NOS indukcióját követően a sejtekben L-argininból L-citrullin keletkezik, miközben NO szabadul fel. A hörgőrendszerben így képződött NO a kilégzett levegőben detektálható. Különböző kóros és nem kóros állapotokban eltérő a kilégzett levegő NO koncentrációja (FENO). Általában véve jellemző, hogy a gyulladásos eredetű kórállapotokban az FENO szintje emelkedik, pl. asztmában, krónikus obstruktív bronchitis (COPD) akut exacerbációjában, bronchiectasiában, légúti infekcióban. Munkánkban két olyan csoportot tanulmányoztunk, melyek közös tulajdonsága, hogy oxidatív stressz fennállása ellenére az FENO csökken. Cystás fibrosis (CF) autoszomális, recesszív módon öröklődő betegség, melyet a cysticus fibrosis transmembran conductans regulátor (CFTR) gén mutációja okoz. A kórképre jellemző a krónikus endobronchiális infekció, visszatérő akut exacerbációkkal, bakteriális superinfekciókkal. A csaknem állandó bakteriális kolonizáció és ennek következményeként létrejövő masszív polymorphonuclealis granulocyta (PMN) akkumuláció fokozott oxidatív stresszt okoznak a légutakban. Ismert tény, hogy CF esetén az FENO szintje csökken egészséges egyének adataihoz viszonyítva Az FENO koncentráció csökkenését nem befolyásolja a betegek életkora, genotípusa, nem különbözik szteroiddal kezelt és nem kezelt betegcsoportban, továbbá nem mutat változást akut exacerbáció esetén sem. Joggal merül fel a kérdés, hogy a perzisztáló gyulladás ellenére miért csökkent az FENO ebben a betegcsoportban. Egyrészt kimutatható a CF-s epitheliális sejtek csökkent iNOS expressziója, melynek következtében gyulladásos mediátorok felszabadulását követően elmarad az NO képződés várható emelkedése. Másrészt, valószínű az NO fokozott metabolizmusa, 4
melynek következtében az NO átalakulva NO metabolittá, úgymond "felhasználódik" a kémiai reakciók során. Az, hogy milyen szerepe van az NO fokozott anyagcseréjének, nevezetesen oxidációs átalakulásának a légutakon belül még teljességgel nem tisztázott. Továbbá nyitott kérdés, hogy az alacsony légúti NO koncentráció hogyan hat a légutak kórokozókkal szembeni ellenállóképességére. Gyulladás jöhet létre a légutakban külső károsító tényezők provokáló hatására is. Ilyen exogén noxának tekinthető a dohányzás. A dohányzás számos káros hatása ismert, melyek leginkább a kardiovaszkuláris- és a légzőrendszert érintik. Az FENO-t illetően hasonló, paradox helyzetet tapasztalhatunk habituális dohányosokban, mint CF-ben, vagyis az FENO csökkent egészséges, nem dohányzó egyének adataihoz képest. Ennek oka egyelőre még nem ismert. Cigaretta elszívását követően oxidáns hatású vegyületek sora (NO, superoxid, peroxinitrit) kerül a légutakba, ugyanakkor a habituális dohányzás légúti gyulladásos sejtek (PMN-k, makrofágok) felszaporodását is kiváltja. Az ezekből felszabaduló oxidáns hatású szabadgyökök az NO oxidációját okozhatják. Továbbá a cigaretta füstből a szervezetbe kerülő NO feed-back mechanizmus útján gátolhatja az endogén NO képződését. Az alacsony NO koncentráció a légutakban - legalábbis részben – magyarázhatja a dohányosok hajlamát légúti infekciókra, hipertóniára, perifériás érbetegségekre. A tüdőben endogén úton képződött NO-nak csak egy része távozik a kilégzett levegővel, másik része (nem tudni milyen hányada) különböző kémiai átalakuláson mehet keresztül és a belőle kialakult molekula tulajdonságának megfelelő lokális hatást fejthet ki. Az NO gyorsan kötődik szabadgyökökhöz, pl superoxidhoz (O2-), melynek következtében peroxinitrit (ONOO-) jön létre. A ONOO- tiol tartalmú biomolekulában, mint a cistein és a glutation S-nitrozotiol formájában képes raktározódni, de tovább is oxidálódhat nitritté vagy nitráttá. Gyulladásos sejtek aktivációja által jelentős mennyiségű O2- termelődik, ugyanakkor az NO szintézis is fokozódik (iNOS indukció). Az ekkor képződő mikromoláris nagyságrendű NO már hatásosan versenghet a szuperoxiddizmutázzal (SOD) a O2- -ért, hogy ONOO--t képezzen. A peroxinitritnek potens oxidáló és nitráló hatása van, képes elindítani a biológiai membránok lipid peroxidációját, hidroxilációját, az aromás aminosavak nitrálását és a proteinek sulfhidril 5
oxidációját. Légúti hiperreaktivitást indukál, gátolja a tüdő surfactantját, károsítja a tüdő epitheliális sejtjeit, és oxidálja a glutationt. Peroxinitrit fokozott termelődését tapasztalták számos olyan tüdőbetegségben, melyek krónikus gyulladással és/vagy oxidatív stresszel járnak. Mind a peroxinitrit és a nitrogén dioxid képesek nitrálni a fenol vegyületeket, így a tirozin és triptofán gyököt tartalmazó fehérjéket. Ennek a reakciónak kapcsán egy stabil vegyület, a 3-nitrotirozin képződik a tüdőszövetben, mely reaktív nitrogén gyökök indikátorának tekinthető. Különböző körülmények között többféle kémiai úton jöhet létre a tirozin gyök nitrálódása, ámbár feltételezhetően- nem mindegyik kémiai átalakulás releváns in vivo. Nitrotirozin képződésének lehetőségei tehát egyrészt a peroxinitrit út, másrészt -főként krónikus gyulladás estén- a mieloperoxidáz (MPO)-dependens út, amikor a PMN leukocitákból felszabaduló
MPO
hidrogén
(H2O2)
peroxid
jelenlétében
nitráló
hatású
köztestermékeket hoz létre nitritból, az NO legfőbb végtermékéből. Légúti váladékok NO metabolitjainak (nitrit, nitrát, nitrozotiol, nitrotirozin) és az FENO-nak párhuzamos meghatározásával adatokat nyerhetünk az NO tüdőn belüli anyagcseréjére
vonatkozólag.
NO
metabolitokat
mérhetünk
köpetben,
hörgőmosófolyadékban (BAL) és a kilégzett levegő kondenzátumában. Légúti váladék non-invazív
gyűjtésének
egyik
egyszerű,
új
metodikája
a
kilégzett
levegő
kondenzátumának analízise, mely lehetővé teszi a légutakban zajló biokémiai folyamatok pontosabb megismerését és a benne kimutatható különböző kémiai anyagok jól reflektálnak a légúti epitheliális folyadék összetételével. Tanulmányunk célkitűzése az volt, hogy a kilégzett levegő kondenzátumában levő NO anyagcseretermékek analizálásával választ kapjunk arra a kérdésre, hogy a fent említett kórállapotokban a várttól eltérően miért csökken az FENO. Magyarázható-e a CF-ben illetve habitualis dohányosokban tapasztalható alacsony FENO koncentráció az NO oxidatív stressz hatására létrejövő fokozott oxidációjával, azaz NO metabolitokká való átalakulásával?
6
2. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 2.1. Vizsgált csoportok 2.1.1.Cystás fibrosisban szenvedő betegcsoport 36 stabil állapotú, felnőtt, CF-ben szenvedő beteget (23 F, 29 ± 1 év, FEV1 59 ± 26 %) valamint 14 egészséges, felnőtt, önkéntes egyént vizsgáltunk meg (6 F, 34 ± 2 év, FEV1 101 ± 2 %). A vizsgálati egyéneknél FENO-t, légzésfunkciós adatokat mértünk, valamint kilégzett levegő kondenzátumát gyűjtöttük. A CF-s betegeknél vér laboratóriumi vizsgálata (quantitatív, qualitatív vérkép, szerum analízis) és köpet bakteriológiai tenyésztése is történt. 2.1.2.Egészséges, habituális dohányzók és nem-dohányzók 30 egészséges önkéntes (13 F) adatait vizsgáltuk, akiket dohányzási szokásuktól függően nem dohányzókra (n = 14, 34 ± 2 év) és dohányzókra (n = 16, 31 ± 2 év) osztottunk. Minden személynél FENO-t, kilégzett szén-monoxidot (CO), légzés funkciós adatokat mértünk, és a kilégzett levegő kondenzátumát gyűjtöttük. A légzésfunkciós paraméterek normál tartományban voltak. A vizsgálat megkezdése előtt a dohányosok legalább 4 órán keresztül tartózkodtak a dohányzástól. A kiindulási adatok lemérése, illetve a kondenzátum gyűjtése után a dohányzók 2 cigarettát szívtak el, majd ezt követően 30 és 90 perccel fenti adatok ismételt mérése, illetve kondenzátum gyűjtése történet. A tanulmányok protokollját a Royal Brompton Hospital Etikai Bizottsága jóváhagyta, minden vizsgálati alany a beleegyező nyilatkozatot aláírta. 2.2. Légzésfunkció FVC-t és FEV1-t spirométerrel mértük (Vitalograph, Buckingham, UK), a totálkapacitást (TLC) és a reziduális volument (RV) pletizmográffal detektáltuk. (Transfer Factor Model B; PK Morgan; UK).
7
2.3. Kilégzett NO és CO mérés FENO mérése kemilumineszcens módszerrel (Model LR2000, Logan Research Ltd, Rochester, UK), kilégzett CO mérése módosított elektrokémiai szenzorral történt (Logan Research Ltd, Rochester, Kent, UK). Két mérés átlagából a levegő CO tartalmát levontuk. 2.4. Kilégzett levegő kondenzátum gyűjtése A kilégzett levegő kondenzátumának gyűjtése speciális kondenzáló eszközzel történt, mely lehetővé teszi a kilégzett levegő nem gáz jellegű komponenseinek noninvazív gyűjtését (EcoScreen, Jaeger, Würzburg, Germany). Szájöblítést követően, a vizsgált személyek egy szájrészen át 10 percen keresztül normál légzési volumennel és frekvenciával lélegeztek, orrcsipeszt viselve. A kondenzátumot, melynek mennyisége 10 perc alatt legkevesebb 1 ml volt -20°C-on gyűjtöttük. 2.5. Kilégzett levegő kondenzátumának kémia analízise Nitrit, nitrit + nitrát mérése: NO2- mérése fluorometriás assay-vel történt, mely a nitrit és a 2,3-diaminonaphthalene (DAN) azon reakcióján alapult, hogy a képződött termék fluorescens tulajdonsággal rendelkezik. Az assay detekciós limitje 0,1 µM. A minták inkubálása nitrát reduktázzal lehetővé tette, hogy a mintában levő nitrát ugyanezen módszerrel mérhető legyen miután a mintában levő nitrát nitritté konvertálódott. Nitrotirozin mérés: A kilégzett levegő kondenzátum nitrotirozin koncentrációját specifikus enzim immun-assay-vel (EIA) detektáltuk (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI). Az assay detekciós limitje 3,9 ng/ml volt. A kilégzett levegő kondenzátumából származó mintákat száraz fagyasztó segítségével (Modulyo, Edwards, Crawley, UK) háromszorosára koncentráltuk és ezt követően analizáltuk.
8
2.6. Statisztikai analízis Az adatok átlag ± SEM vannak kifejezve. A vizsgálatban részt vevő személyek adatai normális eloszlást mutattak. A CF-s betegcsoport és az egészséges önkéntesek közötti statisztikai összehasonlítások Student-t teszttel történtek. Az adatok közötti korrelációt Pearson korrelációs koefficienssel, illetve multiplex regressziós analízissel határoztuk meg. Az egészséges dohányzó és nem dohányzó csoportok közötti statisztikai összehasonlítások Student-t teszttel történtek. Dohányzás hatásának vizsgálata az NO metabolitokra ANOVA-val történt. A szignifikanciát p < 0,05 értéknél fogadtuk el. 3. EREDMÉNYEK 3.1. FENO és NO metabolitok CF-s betegcsoportban FENO koncentráció szignifikánsan csökkent CF-s betegekben egészséges kontrollcsoport adataihoz viszonyítva (4,4 ± 0,3 vs 5,6 ± 0,4 ppb, p < 0,05). Nem volt szignifikáns különbség a szteroid-mentes és szteroid-kezelt csoportok között. Az FENO érték nem korrelált sem a légzés funkciós adatokkal sem a fehérvérsejtszámmal és a Westergreen értékkel. Nitrotirozin értéke szignifikánsan magasabb volt a CF-s csoportban (6,3 ± 0,8 vs 25,3 ± 1,5 ng/ml, p < 0,001). Nem volt szignifikáns különbség a szteroid-mentes és a szteroiddal kezelt csoportok között. Nem volt korreláció az FENO és nitrotirozin szintek között, ugyanakkor a nitrotirozin mind az FVC % (r = 0,71, p < 0,001), mind a FEV1 % (r = 0,70, p < 0,001) értékekkel pozitív lineáris összefüggést mutatott. Az RV/TLC % negatívan korrelált a nitrotirozin koncentrációval (r = -0,70, p < 0,001), jelezve, hogy jobb légzésfunkció magasabb nitrotirozin szinttel járt. Nitrit és nitrit + nitrát koncentrációjában nem volt különbség a CF-s betegek és az egészséges egyének között (3,9 ± 0,7 vs 3,2 ± 0,5 µM; 25,4 ± 6,1 vs 21,5 ± 3,2 µM).
9
3.2. FENO, kilégzett CO és NO metabolitok egészséges habituális dohányosokban FENO szignifikánsan csökkent a dohányos csoportban nem dohányzók adataival összehasonlítva (4,3 ± 0,3 vs 5,5 ± 0,6 ppb, p < 0,05). Kilégzett CO szignifikánsan magasabb volt a dohányzóknál (12,5 ± 2,0 vs 3,4 ± 0,3 ppm, p < 0,001). Nem találtunk különbséget a kilégzett levegő kondenzátum NO2- (2,5 ± 0,3 vs 3,2 ± 0,5 µM), NO2- + NO3- (19,9 ± 2,6 vs 18,6 ± 2,5 µM), és nitrotirozin (7,2 ± 1,3 vs 6,3 ± 0,8) koncentráció értékeiben dohányzók és nem-dohányzók között a kiindulási adatokban. 3.2.2. FENO, kilégzett CO és NO metabolitok cigaretta expozíciót követően Azért, hogy meghatározzuk a dohányzás közvetlen hatását, FENO-t, kilégzett CO-t és a kondenzátum NO metabolit koncentrációját (NO2-, NO2- + NO3-, nitrotirozin) mértünk dohányosoknál 30 és 90 perccel 2 cigaretta elszívását követően. Az NO2- + NO3- koncentráció szignifikánsan emelkedett 30 perccel a dohányzást követően (19,9 ± 2,6 µM vs 28,9 ± 3,3 p < 0,05) majd visszatért az alapértékre 90 percnél (23,4 ± 3,5 µM). Sem az FENO-ban, sem az NO2-, sem a nitrotirozin koncentrációban nem volt szignifikáns változás cigaretta expozíció után. Kilégzett CO szignifikánsan emelkedett dohányzást követően 30 perccel (12,5 ± 2.0 vs 19,8 ± 2.8 ppm, p < 0,05), azonban a 90 perces mérésnél már nem különbözött az alapértéktől. Nem volt korreláció az FENO és a kondenzátumban levő NO metabolitok koncentrációi között cigarettázás után. 4. MEGBESZÉLÉS Tanulmányunkban az oxidatív stressz hatását vizsgáltuk az NO tüdőben való metabolizmusára. Ehhez olyan állapotot (károsító szokást) és betegcsoportot kerestünk, ahol ismert a légutakat érő - csaknem állandó - oxidatív stressz jelenléte és ennek ellenére csökkent FENO detektálható. . 4.1. NO metabolitok CF-ben Eredményeink
azt
mutatják,
hogy
a
nitrotirozin
a
kilégzett
levegő
kondenzátumában szignifikánsan magasabb stabil - akut exacerbáció nélküli - CF-s 10
betegekben egészséges kontroll csoport adataihoz viszonyítva. Ugyanakkor nem találtunk különbséget egyéb NO anyagcseretermékek tekintetében. Nitrotirozin a protein nitráció markere, megfelelő specifikus nitrotirozin antitesttel kimutatható. A tirozin nitrációja módosítja a fehérje funkcióját és károsan hat a sejt életképességére. A folyamat többféle kémiai úton mehet végbe, a környező közeg kémiai tulajdonságaitól függően: -Egyik lehetőség a peroxinitrit út, amikor az NO és superoxid reakciója kapcsán peroxynitrit képződik, mely képes a fehérjék tirozin gyökének nitrálására. -Másik lehetőség, amivel krónikus gyulladásos körülmények között számolnunk kell az MPO-dependens út. A CF-s betegek légútjaiban akkumulálódó nagy mennyiségű PMN fokozott MPO aktivitáshoz vezet. Az aktivált humán PMN-k képesek a NO2- -t oxidánssá konvertálni. Valószínű, hogy MPO-katalizált nitráció
hidrogén peroxid
(H2O2) jelenlétében nitráló hatású köztestermékeket hoz létre NO2--ből, az NO legfőbb végtermékéből. -Egyéb lehetőségek a nitrotirozin képződésére - melyek in vitro detektálhatók - a NO2- direkt oxidációja H2O2 vagy hipoklórossav által, továbbá az NO vagy nitrogén-dioxid reakciója tirosil gyökkel. A
jelentősen
emelkedett
nitrotirozin
koncentráció
CF-s
betegek
kondenzátumában arra utal, hogy az NO metabolitok a CF-s légutakban egyrészt peroxinitritté metabolizálódhatnak és ezen a kémiai úton keresztül hozzájárulnak a nitrotirozin kialakulásához. Másrészt lehetséges, hogy a nitrotirozin kialakulásában más kémiai út - nevezetesen az MPO-dependens út – is jelentős szerepet játszik, melyhez a feltételek adottak a PMN túlsúlyú krónikusan gyulladt CF-s légutakban.
Az FENO csökkenéséhez tehát valószínűleg az is hozzájárul, hogy az alsó légutakban képződött NO egy része oxidáció útján, biológiailag aktív nitrogén-oxiddá metabolizálódik, mielőtt elérné a nagylégutakat.
Összegzésként elmondhatjuk, hogy
az emelkedett nitrotirozin koncentráció CF-ben, reaktív nitrogén gyökök fokozott képződésére utal, mely történhet a peroxynitrit dependens úton vagy granulocita peroxidázok által facilitált direkt nitráció útján. Nitrotirozin, amely a légutakban
11
képződik és mérhető a kilégzett levegő kondenzátumában, az oxidatív stressz markereként szolgálhat CF-s betegeknél. 4.2 NO metabolitok dohányzás esetén Vizsgálati eredményeink azt mutatták, hogy az FENO szignifikánsan csökkent habituális dohányzóknál, nem-dohányzó egyének adataival összehasonlítva. Nem volt szignifikáns különbség az NO2, NO2- + NO3-, és nitrotirozin koncentrációjában a dohányosok (absztinenciát követő) alapadatai és a nem-dohányzók értékei között. Két szál cigaretta elszívását követően 30 perccel az FENO nem változott, míg az NO oxidációs metabolitjának (NO2- + NO3-) szintjében átmeneti, szignifikáns emelkedést tapasztaltunk. Rendszeres dohányzás következtében légúti nyálkahártyagyulladás jön létre, mely a PMN-ekből és makrofágokból oxidatív tulajdonsággal rendelkező kémiai anyagok (pl. superoxid) felszaporodását generálhatja, ugyanakkor a cigarettafüst is oxidánsok gazdag forrása. A dohányzóknál tapasztalható FENO koncentráció csökkenésére többféle magyarázat lehetséges. Egyrészt feltételezhető az NO csökkent képződése, de nem zárható ki az NO fokozott metabolizmusa vagy koncentrálódása a légutak epitheliális felszínén,
bioequivalens
nitrogén-oxidok
formájában.
Kiindulva
abból
a
megfigyelésből, hogy dohányosoknál az FENO alacsonyabb és a superoxid koncentráció magasabb, feltételezhető, hogy fokozott NO metabolizmusával (is) állunk szemben. Vizsgálati eredmények azt jelzik, hogy a cigaretta által indukált oxidatív stressznek az NO oxidációs anyagcseréjére nincs hosszútávú hatása. Ez arra utal, hogy a dohányosoknál tapasztalt krónikusan csökkent FENO inkább a csökkent NO képződésnek (csökkent NOS termelődés következtében) köszönhető, mint fokozott metabolizmusnak. A dohányzás akut hatását vizsgálva tanulmányunkban szignifikáns, tranziens emelkedését tapasztaltunk az NO2- + NO3- szintjében cigaretta expozíciót követően, ugyanakkor nem volt különbség az NO2- és nitrotrirozin szintekben. Feltételezhető, hogy az aktivált PMN-ekből felszabaduló superoxid anion képes felhasználni, azaz 12
csökkenteni az NO szintet azáltal, hogy nitráttá konvertálja. Valószínű, hogy savas kémhatású körülmények között - mely jellemző a sejtek lízise és pusztulása kapcsán - a nitrit nitráttá alakul. Nem tapasztaltunk szignifikáns különbséget a dohányzók és nemdohányzók
között
a
kilégzett
levegő
kondenzátum
nitrotirozin
szintjében.
Feltételezhető, hogy a cigarettafüst csökkentheti a nitrotirozin képződést, vagy fokozhatja lebomlását. Összegzésként levonhatjuk azt a következtetést, hogy a cigaretta módosítja az NO anyagcseréjét, elősegíti fokozott oxidációját, átmenetileg emelve az oxidatív hatású metabolitok koncentrációját. Ez hozzájárulhat a cigarettafüst légutakra gyakorolt káros hatásaihoz. Az, hogy a cigarettafüst által okozott krónikus exogén oxidatív stressz ellenére habituális dohányzóknál (absztinenciás periódus után) ugyanannyi NO metabolitot detektáltunk a kondenzátumban, mint egészséges egyéneknél, azt jelezheti, hogy az NO metabolitokat a szervezet antioxidáns védekező mechanizmusai viszonylag gyorsan eliminálják. Eredményeink arra engednek következtetni, hogy a tüdőben képződött NO egy része oxidatív átalakuláson megy keresztül, mely szerepet játszhat a csökkent FENO kialakulásában. Az oxidatív stressz következtében létrejött oxidáns gyökök káros hatása hozzájárulhat a légúti epitheliális sejtek károsodásához akár CF-ben, akár dohányosoknál. Attól függően, hogy az oxidatív hatású anyagok endogén vagy exogén úton kerülnek a tüdőbe különböző NO metabolitok növekedését tapasztaltuk. Ez arra utal, hogy az FENO csökkenését az NO fokozott „felhasználódása” - reaktív oxigén gyökökkel való kapcsolódás következtében - okozza, azonban ennek mechanizmusa és a végtermékek eltérhetnek endogén és exogén oxidatív stressz esetén. 5. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Köszönetet szeretnék mondani mindazoknak, akikkel eddigi pályám során volt szerencsém megismerkedni, együtt dolgozni. Köszönettel tartozom témavezetőmnek, Dr. Horváth Ildikónak, aki a kezdet kezdetétől egyengette az utamat, megszervezte számomra, hogy ösztöndíjam ideje alatt Londonba, Barnes Professzor által vezetett Asthma Laboratóriumba kerüljek. Mind tanulmányutam előtt, mind az alatt és hazatérésem után felbecsülhetetlen szakmai és 13
baráti segítséget nyújtott. Személyében kiváló tudóst és embert ismerhettem meg. Végül szeretném megköszönni a tézisek alapjául szolgáló kéziratok elkészítésében nyújtott segítségét. Köszönetet
szeretnék
mondani
Peter
J.
Barnes
professzornak,
hogy
laboratóriumában dolgozhattam Angliában, Londonban a National Heart and Lung Institute Thoracic Department-jében. Köszönettel tartozom a Magyar Tüdőgyógyász Társaságnak, hogy ösztöndíja lehetővé tette külföldi tanulmányi utamat. Külön köszönettel tartozom Kraszkó Pál professzornak, aki támogatást, biztatást adott eddigi egész pályámon, biztosította számomra a lehetőséget a tudományos munkára, ugyanakkor ráirányította figyelmemet a mindennapi klinikai munka szépségeire. Köszönetet érdemel családom, gyermekeim és barátaim Dr. Szalontai Klára, Dr. Lányi Cecília azért, hogy a nehéz pillanatokban mindvégig támogattak. 6. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK NEMZETKÖZI ÉS HAZAI FOLYÓIRATOKBAN: A témával kapcsolatos közlemények 1. Balint B, Kharitonov SA, Donnelly LE, Hanazawa T, Barnes PJ. Increased nitrotyrosine in exhaled breath condensate in cystic fibrosis. Eur Resp J. 2001;17:1201-1207. 2. Balint B, Donnelly LE, Hanazawa T, Kharitonov SA, Barnes PJ. Increased nitric oxide metabolites in exhaled breath condensate after exposure to tobacco smoke. Thorax. 2001;56:456-461. 3. Bálint B, Csoma Zs, Herjavecz I, Horváth I. Kilégzett nitrogén-monoxid és szén-monoxid atópiás és nem-atópiás asztmás betegekben. Allergológiai és Klinikai Immunológia. 2001;4:43-46. A témával kapcsolatos könyvfejezet 1. Balint B, Horváth I, Kharitonov SA, Barnes PJ. Exhaled markers in cystic fibrosis. NATO ASI Book. 2001. London, UK (In press). 14
A témával kapcsolatos előadáskivonatok 1. Balint B, Donnelly LE, Hanazawa T, Kharitonov SA, Barnes PJ. Increased nitric oxide metabolites in exhaled breath condensate after smoking exposure. Eur Resp J.2000;16. Suppl. 31.186S.1399. 2. Balint B, Donnelly LE, Hanazawa T, Kharitonov SA, Barnes PJ. Increased nitrotyrosine in exhaled breath condensate in cystic fibrosis. Eur Resp J. 2000;16. Suppl. 31.512S.3574. 3. Balint B, Donnelly LE, Kharitonov SA, Barnes PJ. The effect of smoking on nitric oxides of exhaled breath condensate. Am J Respir Crit Care Med. 2000; Suppl. 503/166. 4. Balint B, Donnelly LE, Hanazawa T et al.. Nitric oxide metabolites in exhaled breath condensate and exhaled monoxides in cystic fibrosis patients Am J Respir Crit Care Med. 2000;Suppl. 607/260. A disszertációban fel nem használt közlemények 1. Bálint B. Pneumocystis carinii pneumonia HIV pozitív betegben. Orv Hetil. 1992; 29:133(13):785-6. 2. Bálint B, Makk L, Csanádi J, Kraszkó P.Hyperamylasemia primer tüdőcarcinoma esetén. Medicina Thoracalis. 1998;51:25-27. 3. Balint B, Somfay A, Kraszkó P. Diagnostic role of bronchial lavage in smear negative pulmonary tuberculosis. Tuberculosis past and present.1999;Ed by Golden Book Publ, Hungary203-205. 4. Somfay A, Bálint B, Kurunczi F, Kraszkó Pál. Üreges infiltráció pulmonális hipertoniával. Medicina Thoracalis. 1998;51:25-27. 5. Horváth I, Donnelly L E, Shoemark A, Balint B, Wilson R, Kharitonov S A, Barnes P J. Elevated level of nitrite, but not nitrate in exhaled breath condensate in bronchiectasis. Thorax-hoz közlésre beküldve.
15
A disszertációban fel nem használt előadáskivonatok 1. Balint B, Csoma Z, Mikos M, Herjavecz I, Horváth I. Exhaled monoxides in patients with extrinsic and intrinsic asthma Am J Respir Crit Care Med. 2000; Suppl. 519/483. 2. Balint B, Sergei A. Kharitonov, I. Kazuhiro, Loran Hart, Margaret E. Hodson, Peter J. Barnes. Increased interleukin-8 in exhaled breath condensate in unstable cystic fibrosis. Am J Respir Crit Care Med. 2001; Suppl. 2. 3. Balint B, Sergei A. Kharitonov, M. Kemp, D. Geddes, M. E. Hodson, Peter J. Barnes. Ionic composition of exhaled breath condensate in cystic fibrosis. Eur Respir J. 2001; Suppl. 33:8:158. 4. Csoma Zs, S. A. Kharitonov, S. K. Shahid, B. Balint, N. Wilson, A. Bush, P. J. Barnes. Leukotrienes in exhaled breath condensate of children with asthma. Eur Respir J. 2001; Suppl. 33:38:P358. 5. Csoma Zs, S. A. Kharitonov, S. K. Shahid, L. E. Donnelly, B. Balint, N. Wilson, A. Bush, P. J. Barnes. Nitric oxide metabolites in exhaled breath condensate of children with primary ciliary dyskinesia. Eur Respir J.2001; Suppl. 33:180:1276. 6. Csoma Zs, S. A. Kharitonov, S. K. Shahid, B. Balint, N. Wilson, A. Bush, P. J. Barnes. Eicosanoids in exhaled breath condensate of children with primary ciliary dyskinesia. Eur Respir J.2001; Suppl. 33:180:1277. 7. B. Balint, S. A. Kharitonov, I. Kazuhiro, Loran Hart, Margaret E. Hodson, Peter J. Barnes. Increased interleukin-8 in exhaled breath condensate in cystic fibrosis during acute exacerbation. Eur Respir J. 2001; 33;537:P3596. 8. Paredi P, B. Balint, Peter J. Barnes, S. A. Kharitonov. Slower rise in exhaled breath temperature in cystic fibrosis: a novel marker of airway disease. Eur Respir J. 2000; 31;512:P3576.
16
