NITROGÉN-MONOXID METABOLITOK A KILÉGZETT LEVEGŐ KONDENZÁTUMÁBAN OXIDATÍV STRESSZEL JÁRÓ KÓRÁLLAPOTOKBAN Dr. Bálint Beatrix Témavezető: Dr. Horváth Ildikó
Egyetemi doktori (PhD) értekezés Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Klinikai Orvostudományok Budapest 2001
Tartalomjegyzék RÖVIDÍTÉSEK ______________________________________________________ 3 1. BEVEZETÉS ______________________________________________________ 5 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS __________________________________________ 8 2.1. Nitrogén-monoxid (NO)____________________________________________ 8 2.2. Kilégzett levegő kondenzálása______________________________________ 17 2.3. NO metabolitok a légutak gyulladásos betegségeiben ___________________ 20 2.4. FENO és NO metabolitok cystás fibrosisban (CF) ______________________ 22 2.5. FENO és NO metabolitok habituális dohányosokban____________________ 25 3. CÉLKITŰZÉSEK _________________________________________________ 28 4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK ______________________________________ 29 4.1. Vizsgált csoportok _______________________________________________ 29 4.1.1.Cystás fibrosisban szenvedő betegcsoport _________________________ 29 4.1.2.Egészséges, habituális dohányzók és nemdohányzók ________________ 30 4.3. Kilégzett NO mérés ______________________________________________ 32 4.4. Kilégzett CO mérés ______________________________________________ 32 4.5. Kilégzett levegő kondenzátum gyűjtése _______________________________ 32 4.6. Kilégzett levegő kondenzátumának kémia analízise _____________________ 33 4.6.1. Nitrit, nitrit + nitrát mérése ____________________________________ 33 4.6.2. Nitrotirozin mérés ___________________________________________ 33 4.7. Statisztikai analízis ______________________________________________ 34 5. EREDMÉNYEK ___________________________________________________ 35 5.1. FENO és NO metabolitok CF-s betegcsoportban _______________________ 35 5.1.1. FENO _____________________________________________________ 35 5.1.2. Nitrotirozin a kilégzett levegő kondenzátumban ___________________ 36 5.1.3. Nitrit és nitrit + nitrát a kilégzett levegő kondenzátumban ___________ 39 5.2. FENO, kilégzett CO és NO metabolitok egészséges habituális dohányosokban 39 5.2.1. Alap FENO, kilégzett CO és NO metabolitok______________________ 39 5.2.2. FENO, kilégzett CO és NO metabolitok cigaretta expozíciót követően __ 41 6. MEGBESZÉLÉS __________________________________________________ 43 6.1. NO metabolitok CF-ben __________________________________________ 43 6.2 NO metabolitok dohányzás esetén ___________________________________ 48 7. KÖVETKEZTETÉSEK_____________________________________________ 52 8. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS ________________________________________ 53 9. IRODALOMJEGYZÉK ____________________________________________ 54 10. SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE________________________________ 63 10.1. Közlemények __________________________________________________ 63 10.2. Könyvfejzetek __________________________________________________ 63 10.3. Előadáskivonatok ______________________________________________ 63 10.4. A disszertációban fel nem használt közlemények ______________________ 64 10.5. A disszertációban fel nem használt előadáskivonatok___________________ 64 11.A. ÖSSZEFOGLALÓ ______________________________________________ 66 11.B. SUMMARY ____________________________________________________ 67
2
RÖVIDÍTÉSEK BAL
Bronchoalveolaris lavage
Ca
Kálcium
cAMP
Ciklikus adenozin-monofoszfát
CF
Cystás fibrosis, mucoviscidosis
CFTR
Cysticus fibrosis transmembran conductans regulátor
Cl
Klór
cNOS
Konstitutív nitrogén-monoxid szintáz enzim
CO
Szén-monoxid
COPD
Krónikus obstructív bronchitis
DAN
Diaminonaftalén
DLCO
Diffúziós kapacitás
DNS
Dezoxiribonukleinsav
eNOS
Endotheliális nitrogén-mnoxid szintáz enzim
EPO
Eosinophil peroxidáz
EIA
Enzim-immun assay
FENO
Kilégzett levegő nitrogén-monoxid koncentráció
FEV1
Forszírozott kilégzési másodperctérfogat
FVC
Vitálkapacitás
IL
Interleukin
iNOS
Indukálható nitrogén-monoxid szintáz enzim
LPS
Lipopolysacharidok
LTB
Leukotrién
MPO
Mieloperoxidáz
Na
Nátrium
nNOS
Neuronális nitrogén-monoxid szintáz enzim
NO
Nitrogén-monoxid
NOS
Nitrogén-monoxid szintáz enzim
PG
Prosztaglandin
PMN
Polymorphonuclealis granulocyta 3
ppb
Részecske per billió
ppm
Részecske per millió
RV
Reziduális volumen
SOD
Szuperoxid-dizmutáz
TLC
Totálkapacitás
TNF
Tumornecrosis faktor
4
1. BEVEZETÉS A tüdőgyógyászat egyik fontos betegségcsoportja a légutak különböző eredetű krónikus gyulladással járó elváltozásai. Ide tartozik az asztma, krónikus obstruktív bronchitis (COPD), cystás fibrosis, azaz mucoviscidosis (CF) és bronchiectasia. Ezek a betegségek mind pathomechanizmusukban mind tüneteikben nagyon különböznek. Maga a gyulladás jellege is eltérő, melyet elsősorban invazív úton nyert biológiai
mintákból
tudunk
megállapítani
(biopszia,
indukált
köpet,
hörgőmosófolyadék). Példának okául COPD esetén a gyulladás kezdetben a kis bronchusok és bronchiolusok szintjén alakul ki, majd fokozatosan terjed a tüdőparenchymára. Itt elsősorban makrofágok, T limfociták és polymorphonuclealis granulociták (PMN) felszaporodása jellemző. Ezzel ellentétben asztma esetén a gyulladásos sejtes infiltrációban az eosinofil leukociták és hízósejtek dominenciája észlelhető. Ugyanakkor CF-s betegek légútjaiban a gyakori bakteriális exacerbáció, csaknem állandó bakteriális kolonizáció a PMN-k túlsúlyát okozza. E patológiai különbségeknek
természetesen
kórélettani
és
ebből
következően
terápiás
következményei is vannak. A gyulladás folyamata a szervezetben különböző funkciójú immunológiai védekező rendszerek indukciójával jár együtt. Ezek egyike a nitrogén-monoxid (NO) képződésében résztvevő enzim, a nitrogén-monoxid szintáz (NOS) aktivációja. A NOSnak 3 izomere ismert, melyek közül gyulladásos folyamatok esetén az indukálható NOS-nak (iNOS) van a legnagyobb jelentősége. Az iNOS képződés különböző légúti sejtekben gyulladást okozó baktériumok, lipopolysacharidok (LPS), és citokinek expozíciójának hatására jön létre (1, 2). NOS indukcióját követően a sejtekben Largininból L-citrullin keletkezik, miközben NO szabadul fel (3). A hörgőrendszerben így képződött NO a kilégzett levegőben detektálható (4). Különböző kóros és nem kóros állapotokban eltérő koncentrációjú NO mutatható ki a kilégzett levegőben (5). Általában véve jellemző, hogy a gyulladásos eredetű kórállapotokban a kilégzett NO (FENO) szintje emelkedik. Így asztma esetén (6, 7), COPD akut exacerbációjában (8), bronchiectasiában (9), légúti infekció kapcsán egyaránt magasabb FENO értékeket mérhetünk (10). Munkánkban két csoportot tanulmányoztunk, melyek közös tulajdonsága, hogy oxidatív stressz fennállása ellenére az FENO koncentráció csökken. CF-ben az oxidatív
stressz az állandó gyulladás miatt a légutakon belül képződő oxidatív hatású anyagok miatt jön létre, míg rendszeres dohányzás esetén oxidatív hatású molekulák exogén úton a dohányfüst belégzése által jutnak a szervezetbe. CF a külső elválasztású mirigyek veleszületett működési zavara, melynek következtében az emésztőszervi és légúti váladék besűrűsödik. Az exokrin mirigyek besűrűsödött váladéka eltömeszeli a légutakat, ami kedvez az infekciók kialakulásának. Ebben a betegségben a légutak intenzív gyulladása ellenére, meglepő módon az FENO szintje nem nő, hanem csökken (11-15). A jelenség magyarázatát keresve két lehetőség merül fel. Egyrészt ismert tény, hogy a CF-s légúti epitheliás sejtek iNOS expressziója csökken, melynek megfelelően arányosan kevesebb NO tud
képződni (16, 17).
Másrészt, az okok között - feltételezhetően - az NO légutakban zajló fokozott metabolizmusa (oxidációja) is szerepel. Gyulladás jöhet létre a légutakban külső károsító tényezők provokáló hatására is. Ilyen exogén noxának tekinthető a dohányzás is. Az FENO-t illetően hasonló, paradox helyzetet tapasztalhatunk habituális dohányosokban, mint CF-ben, ahol a várttól eltérően az FENO szignifikáns csökkenését észlelték egészséges nem dohányzó egyének adataival összehasonlítva (17, 18). Ennek oka egyelőre még nem teljesen tisztázott. Cigaretta elszívását követően oxidáns hatású vegyületek sora (NO, superoxid, peroxinitrit) kerül a légutakba (19), ugyanakkor a habituális dohányzás légúti gyulladásos sejtek (PMN-k, makrofágok) felszaporodását is kiváltja. Az ezekből felszabaduló oxidáns hatású szabadgyökök az NO oxidációját okozhatják (21, 22). Továbbá a cigaretta füstből a szervezetbe kerülő NO feed-back mechanizmus útján gátolhatja az endogén NO képződését (23). Az NO igen reaktív molekula, gyorsan kötődik szabadgyökökhöz, például superoxidhoz, melynek következtében különböző oxidációs számú NO metabolitok jöhetnek létre (24, 25). Az NO oxidációs végtermékei a nitrit és a nitrát. Légúti váladékok nitrit és nitrát tartalmának mennyiségi meghatározásával adatokat nyerhetünk az NO tüdőn belüli anyagcseréjére vonatkozólag. NO metabolitokat mérhetünk köpetben (26), hörgőmosófolyadékban (BAL) (27) és a kilégzett levegő kondenzátumában (12). Míg a köpet indukció és a BAL egyaránt az invazív vizsgálatok körébe tartoznak, melyek ismétlési száma egy-egy személyben 6
bizonyos
időtartamon
belül
korlátozott,
továbbá
e
mintavételi
eljárások
-
invazivitásuknál fogva - önmagukban is befolyásolhatják a minta kémiai összetételét, addig a kilégzett levegő kondenzátum gyűjtése teljességgel non-invazív, tetszőleges gyakorisággal megismételhető, és a benne kimutatható különböző kémiai anyagok jól reflektálnak a légúti epithelialis folyadék összetételével (28, 29). A kilégzett levegő kondenzálása napjainkban kifejlesztett új, egyszerű módszer, melynek technikai alapja, hogy a kilégzés alatt a légutakból kijutó levegő bekerül a kondenzáló eszközbe, mely jéggel, vagy fagyasztó rendszer segítségével biztosítja annak azonnali hűtését. Az így nyert kondenzátum alkalmas kémiai analízisre. Számtalan anyag kimutatható a kondenzátumban: NO metabolitok, lipidperoxidációs termékek, citokinek, leukotrienek, prostaglandinok stb. Tanulmányunk célkitűzése az volt, hogy a kilégzett levegő kondenzátumában levő NO anyagcseretermékek analizálásával választ kapjunk arra a kérdésre, hogy a fent említett kórállapotokban a várttól eltérően miért csökken az FENO. Magyarázható-e a CF-ben illetve habitualis dohányosokban tapasztalható csökkent FENO az NO oxidatív stressz hatására létrejövő fokozott oxidációjával, azaz NO metabolitokká való átalakulásával?
7
2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 2.1. Nitrogén-monoxid (NO) Az utóbbi 10 esztendő egyik legkedveltebb kutatási témája a "Janus arcú" NO molekula. Az orvostudomány csaknem valamennyi ága foglalkozik ezzel a biomolekulával, mely az élettani folyamatok regulációjában, a szervezet védekező mechanizmusában és patológiai folyamataiban egyaránt szerepet játszik. Jelentőségét és a rendkívüli érdeklődést mutatja, hogy az irodalomban 43121 NO-val foglalkozó publikáció található (Medline 1990-2001). Természetesen a pulmonológia is komoly részt vállalt az NO körüli kutatásokban, számtalan tanulmánnyal hozzájárulva az NO tüdőben
betöltött
szerepének
tisztázásához,
különböző
kórállapotokban
való
jelentőségének megvilágításához. Az NO tüdőgyógyászati vonatkozásait taglaló első cikkek 1990-es évek elején jelentek meg, és a korai felfedezések közül az egyik legjelentősebb az volt, hogy az NO detektálható egészséges és beteg emberek kilégzett levegőjében (7, 4). A tudósok ezzel utat nyitottak a további NO-val kapcsolatos széles körű klinikai kutatások számára azáltal, hogy kidolgozták a kilégzett NO mérésének egyszerű, non-invazív módszerét. Ezt követően tanulmányok sora foglalkozott azzal, hogy megállapítsa a különböző kóros és nem kóros állapotokban az FENO koncentrációját, annak viszonyát egészséges egyének hasonló adataihoz, így feltérképezve az NO biológiai, kémiai és patológiai összefüggéseit a tüdőben. Az NO gázhalmazállapotú mediátor, mely számos fiziológiai és patofiziológiai folyamat szabályozásában játszik szerepet (1). Ezek közé tartoznak az értónus regulációja, neurotranszmisszió, védekező- és sejtpusztító mechanizmusok (2). Az NO az emberi szervezet különböző sejtjeiben endogén enzimatikus úton képződik, a NOS enzim közreműködésével. Az enzim az
L-arginint L-citrullinná
alakítja, miközben NO szabadul fel (3). A felszabaduló NO az L-arginin terminális guanidino csoportjából származik (3). A reakcióban molekuláris oxigén és NADPH coszubsztrátként szerepelnek, mialatt a tetrahydrobiopterin (30), flavin nucleotidok és thiolok co-faktorként szolgálnak (31). NG-hydroxy-L-arginin, mint rövid életű köztitermék jön létre, míg az L-citrullin a melléktermék (3). A képződött L-citrullin ammónia beépülésével L-argininná alakul vissza, ami az L-arginin raktárak folyamatos
biztosításának egyik fontos lépése lehet (32). (1. ábra: NO és O2- képződése a légutakban)
Nitrogén-monoxid (NO) és superoxid anion (O2-) képződése a légutakban Epithelium
NO
iNOS
NO
NO
iNOS
iNOS
1. ábra.
O2-
NO
O2-
H2O2
iNOS
Erek Gyulladás kapcsán aktivizálódó sejtek
1. ábra
9
Az NO képződésében szerepet játszó enzimnek, a NOS-nak 3 fő izomere azonosítható. Az nNOS (NOS1: neuronból felszabaduló NOS) és az eNOS (NOS3: endothelből felszabaduló NOS) konstitutívan expremálódnak, míg az iNOS (NOS2: indukálható NOS) indukálható úton termelődik különböző sejtekben (PMN-k, makrofágok, epitheliális sejtek) gyulladást okozó baktérium, LPS és citokin expozíciót követően (3). Az eNOS és nNOS (konstitutivan felszabaduló NOS izoformok) aktivizálódása a sejtek citoplazmájának Ca2+/kalmodulin tartalmától függ és rövid időtartamra, kis mennyiségű NO képződését okozza. Ezzel ellentétben az iNOS melynek aktivitása a Ca2+/kalmodulin rendszertől független - hosszú időtartamú, nagy mennyiségű NO felszabadulását generálja (3). Az NO felezési ideje in vivo körülmények között mindössze néhány másodperc (1, 2, 33). Ez azonban nem tekinthető állandó értéknek, mivel a felezési idő fordítottan arányos az NO koncentrációjával, így sokkal hosszabbá válik, ha az NO koncentrációja csökken (34). Az NO molekulában hét elektron a nitrogénből, nyolc pedig az oxigénből származik. Az NO párosítatlan elektronja miatt könnyen interakcióba lép olyan molekulákkal amelyek szintén tartalmaznak párosítatlan elektront. Ilyenek a szabad gyökök (pl. superoxid) és a metál ionok, mint a hem vas ionja. (24, 34). Figyelembe véve a reakciók sebességét az NO in vivo biokémiája három fő útra egyszerűsíthető le: 1
guanilátcikláz enzimhez kötődve, azt aktiválja
2
bekerülve a vörösvértestbe kötődik az oxihemoglobinhoz, majd átalakulhat methemoglobinná és nitráttá
3
superoxiddal reakcióba lépve peroxinitritté transzformálódhat (34).
Az NO oxidációja vagy más biomolekulákkal való reakciója a mikrokörnyezet kémiai tulajdonságaitól
függenek.
Oxidatív
metabolizmusa
kapcsán
reaktív
nitrogén
köztestermékek keletkeznek, melyekben a nitrogén oxidációs száma 1-5-ig terjedhet. Oxidatív anyagcseréjének végtermékei a nitrit és a nitrát (34). (2. ábra: NO oxidatív metabolitjai)
10
NO oxidatív metabolitjai
Kémiai képlet
Név
Nitrogén atom oxidációs száma
NO-
Nitroxil anion
+1
N2O
Nitros-oxid
+1
NO•
Nitrogén-monoxid (nitrogén-oxid) + 2
NO+
Nitrozil kation
+3
NO2-
Nitrit
+3
N2O3
Dinitrogén-trioxid
+3
NO2•
Nitrogén-dioxid
+4
N2O4
Dinitrogén-tetraoxid
+4
ONOO-
Peroxinitrit
+5
NO2+
Nitril (nitronium) kation
+5
NO3-
Nitrát
+5
2. ábra 11
Az NO reakciója superoxiddal (O2-) - csaknem diffuzió-limitált sebességgel peroxinitritet (ONOO-) eredményez (24, 25). A ONOO- tiol-tartalmú biomolekulában, mint a cisztein és a glutation S-nitrozotiol formájában képes raktározódni, de tovább is oxidálódhat nitritté vagy nitráttá. Normál körülmények között az intracelluláris O2koncentráció nagyon alacsony (< 10 pM) és a ONOO- kialakulását az eukariota sejtek nagy superoxiddizmutáz (SOD) (4-10 µM) tartalma gátolja. Gyulladásos sejtek (PMN és eosinophil granulocyták, macrophagok) aktivációja által jelentős mennyiségű O2termelődik, ugyanakkor az NO szintézis is fokozódik (iNOS indukció). Az ekkor képződő mikromoláris nagyságrendű NO már hatásosan versenghet a szuperoxiddizmutázzal (SOD) a O2- -ért, hogy ONOO--t képezzen. Továbbá a ONOO- nagy reaktivitása miatt anitoxidáns rendszerek jelenlétében is képes elérni biológia célpontját (35). ONOO- képződés mutatható ki humán PMN sejtekben (36), patkány alveoláris macrophagjaiban (37) és szarvasmarha aorta endothel sejtjeiben is (38). A peroxinitritnek potens oxidáló és nitráló hatása van, képes elindítani a biológiai membránok lipid peroxidációját, hidroxilációját, az aromás aminosavak nitrálását és a proteinek sulfhidril oxidációját (2, 24, 25, 39-41). Ugyanakkor képes konvertálódni peroxinitrit savvá (ONOOH) miközben hidroxil gyök (•OH)-szerű aktivitással rendelkező molekulák szabadulnak fel (42). Toxicitását anionjának direkt reakciója, valamint savszerű reaktivitása (ONOOH) okozza. Állatkísérletekkel bizonyítottan légúti hiperreaktivitást indukál (43), gátolja a tüdő surfactantját (44), károsítja a tüdő epithelialis sejtjeit (39), és oxidálja a glutationt (41). Peroxinitrit fokozott termelődését tapasztalták számos olyan tüdőbetegségben, melyek krónikus gyulladással és/vagy oxidatív stresszel járnak (45, 46). Mind a peroxinitrit és a nitrogén-dioxid (NO2•) képesek nitrálni a fenol vegyületeket, így a tirozin és triptofán gyököt tartalmazó fehérjéket. Ennek a reakciónak kapcsán egy stabil vegyület, a 3-nitrotirozin képződik a tüdőszövetben (25, 42), mely reaktív nitrogén gyökök indikátorának tekinthető (25, 47). A fehérjék nitrálása biológiai folyamat, mely az NO és az NO-ból származó szekunder bomlástermékek reaktív oxigéngyökökkel való interakciója következtében jön létre (25, 47). Különböző körülmények között többféle kémiai úton jöhet létre a tirozin gyök nitrálódása, feltételezhetően nem mindegyik kémiai átalakulás releváns in vivo körülmények között (48). Nitrotirozin képződésének lehetőségei tehát egyrészt a 12
peroxinitrit út, másrészt - főként krónikus gyulladás esetén - a mieloperoxidáz (MPO) dependens út, mely szintén hozzájárulhat a 3-nitrotirozin képződéséhez. A PMN leukocitákból felszabaduló MPO a nitritet gyulladásos oxidánsokká képes konvertálni. Valószínű, hogy hidrogén-peroxid (H2O2) jelenlétében a nitritből (az NO fő végtermékéből) nitráló hatású köztestermék jön létre, mely szintén képes a tirozin gyök nitrálására (48). (3/A, 3/B ábra: Nitrotirozin képződés)
Nitrotirozin képződés
Tirozin
NO2• Nitrogén-dioxid
3-nitrotirozin H2O2 / EPO, MPO HOCl / MPO
NO2Nitrit
ONOOPeroxinitrit 3/A ábra MPO: myeloperoxidáz, EPO: eozinofil peroxidáz.
13
Nitrotirozin képződés mechanizmusa a légutakban
Epithelium
Gyulladásos sejtek
3/B ábra
14
Az NO különböző oxidációs termékei különböző biológiai folyamatokban vesznek részt. A reaktív nitrogén gyökök többsége reakcióba léphet különböző biomolekulákkal, úgymint metál ionok a metalloproteinekben, aminosavak (tiol, amin, tirozin), nem szaturált lipidek, dezoxiribonukleinsav (DNS). Ezek az interakciók tehetők felelőssé a fokozott NO termelődéssel járó pathofiziológiai következményekért. A reaktív NO köztestermékek fő citotoxikus hatásai azon alapulnak, hogy többféle módon képesek az eukariota gének expresszióját gátolni (49). Az NO anyagcsere biológiai végtermékei a nitrit (NO2-) és a nitrát (NO3-), melyek gyorsan szétterjednek a szervezetben és kiválasztódnak a vizelettel (50). Az NO-val kapcsolatos biokémiai változások ismerete a későbbiekben lehetőséget teremthet megfelelő terápiás intervenciókhoz is. A tüdőben képződött NO a felső légutakat elérve a kilégzett levegőben kimutatható.
Mérése ma már rutinszerűen történik megfelelő technikai eszközök
birtokában. NO mérőműszerek általában kemilumineszcens módszeren alapulva detektálják az FENO koncentrációját, mely egészséges egyéneknél 3-9 részecske per billió (ppb) között változik (5, 51). Számos kórképben az FENO eltér egészséges egyének adataihoz viszonyítva, mely megkönnyítheti a diagnózis felállítását, segíthet a betegség súlyossági fokának megítélésében, a terápia beállításában és annak nyomon követésében. A betegségeken kívül, különböző élettani változások, exogén noxák, táplálkozási szokások, hormonális hatások is befolyásolják az FENO mennyiségét (5). (4 ábra: FENO különböző állapotok, betegségek esetén).
15
Kilégzett NO különböző állapotok, betegségek esetén Kilégzett NO ⇑ Betegségek
Állapotok
• • • •
• • • • • • • • • •
Allergén-, pollen expozíció Levegő szennyeződés Foglalkozási expozíció (ózon) Arginin, nirit, nitrát gazdag étrend
Asztma Instabil, súlyos COPD Rhinitis allergica Felső légúti infekció Influenza vakcináció Bronchiectasia Colitis ulcerosa Tbc Aktív sarcoidosis Tüdő carcinoma
Kilégzett NO ⇓ Betegségek
Állapotok
• • • •
Menstruáció Dohányzás Akut alkohol abuzus Szájöb lítés 4. ábra
• • • • •
Krónikus köhögés (nem asztmás) Pulmonalis hypertonia Kartagener syndroma Primer ciliaris dyskinesis CF
(Kharitonov S A, et al. Eur Respir J 200; 16: 781-792) 16
A tüdő akut és krónikus gyulladásos betegségei kapcsán általában fokozott NO képződés tapasztalható, így asztma, rhinitis allergica, instabil COPD, felső légúti infekció, bronchiectasia, tbc egyaránt emelkedett FENO-val járnak (5). Ennek feltételezhetően az az oka, hogy a gyulladás kapcsán felszabaduló mediátorok hatására fokozott iNOS expresszió jön létre, melynek következtében több NO képződik. A magasabb NO koncentrációnak kettős hatása van a légutakra. Egyrészt lehet protektív az oxidánsok által provokált cytotoxikus reakciók kivédésében és antimikróbás hatásában, másrészt lehet káros a sejtfunkciókra, reaktív NO metabolitok kialakulásán keresztül (34, 53, 24). Az NO fokozott képződése az FENO szignifikáns emelkedésével mérhető (6, 9). Asztma betegségben antiflogisztikus gyógyszerek (pl. glucocorticosteroid)
a
fokozott
NO
képződést
csökkentik,
mely
az
FENO
mérséklődésében nyilvánul meg (6). Az FENO koncentráció változásának detektálása különböző kórállapotokban arra is lehetőséget ad, hogy a tüdőben zajló pathologiai, fiziológiai folyamatokat felderítsük és azok következményeit megítéljük. Ehhez szorosan kapcsolódva indultak meg a kutatások az NO tüdőben zajló metabolizmusát megvilágítandó, az NO metabolitok in vivo szerepének megismerésére. NO anyagcseretermékek egyaránt kimutathatók a tüdő epitheliális folyadékában, BAL folyadékban és indukált köpetben. 2.2. Kilégzett levegő kondenzálása Az utóbbi évek új metodikája a légutakban képződő kémiai anyagok (markerek, mediátorok) feltérképezésére a kilégzett levegő kondenzátumának gyűjtése, a felfogott anyag kémiai analízise. A módszer azon a hipotézisen alapul, hogy a kilégzett levegőben levő részecskék szoros korrelációval jelzik a légúti extracellularis folyadék összetételét. Az epitheliális folyadékban antioxidánsok, szolubilis markerek, különböző molekulák találhatók, melyek mint első védelmi vonal jelzik a külső oxidáns hatások, (dohányzás, ózonexpozíció, nitrogén-oxidok), allergének, mikróbák és baktériumok káros hatásait. Ezek az anyagok képet adhatnak a tüdőt érintő oxidatív noxák, gyulladások által létrejött változásokról, ugyanakkor alkalmasak lehetnek a terápia hatásosságának megítélésére, sőt a betegség monitorozására is. 17
Az első publikációk a 80-as években jelentek meg a kilégzett levegő kondenzátumában kimutatható surfactantról és lipidperoxidációs termékekről (53). Újabban többféle citokint, interleukint (IL-1b, IL-2b, IL-6) tumor necrosis faktort (TNF), izoprosztánt (8-izoprosztán) és prosztaglandint (PG) mértek egészséges egyénekben valamint asztmás, COPD-s, CF-s és interstitialis tüdőbetegségben szenvedő egyénekben. (54-58). (5. ábra: Kilégzett levegő kondenzátumában kimutatott anyagok)
Kilégzett levegő kondenzátumában kimutatott anyagok 1. Nitrogén-oxid metabolitok a.
Nitrit (12, 62)
b.
Nitrát (63)
c.
S-nitrozotiol (75)
d.
Nitrotirozin (55)
2. Hidrogén-peroxid (54) 3. Lipidperoxidációs termékek: tiobarbiturátsav (84, 85) 4. Vazoaktív aminok: szerotonin, hisztamin (56) 5. Eicosanoidok a.
Izoprosztán: 8-izoprosztán (57, 94)
b.
Leukotriének: LTB4, LTC4, LTE4, LTD4 (55)
c.
Prosztaglandinok: PGE2, PGF (58)
6. Citokinek: IL-8, Il-1β, IL-6 (63) 7.
Hidrogén ion: pH (85) 5. ábra
(A zárójelben levő számok az irodalomjegyzékben felsorolt referenciákra vonatkoznak.)
18
Potenciálisan, a kondenzátumban levő anyagok különböző markerekre és molekulákra utalhatnak, melyek eredhetnek a szájból (szájüreg, oropharynx), a tracheobronchialis rendszerből és az alveolusokból egyaránt. Hogy honnan, milyen arányból származnak ezek, még nincs teljesen tisztázva. Valószínű, hogy a nem gáz halmazállapotú komponensek, a véráram által a tüdőbe került anyagok - légúti sejtek által - metabolizált termékei (28). A kilégzett levegő kondenzátum gyűjtésének többféle technikai útja lehetséges. A legegyszerűbb módszer az, amikor a vizsgálati alany egy szájrészbe lélegzik, mely egy egyirányú (visszaáramlást gátló) szeleppel van ellátva. A szelep lehetővé teszi, hogy a ki- és belégzett levegő szeparálódjon. Kilégzés alatt a kilégzett levegő bekerül a kondenzáló eszközbe, mely jéggel, vagy fagyasztó rendszer segítségével biztosítja a kilégzett levegő azonnali hűtését. Az alacsony hőmérséklet igen fontos tényező, mivel vizsgálandó anyagok nagy része hő hatására kémia átalakuláson mehet keresztül, mely meghamisíthatja a vizsgálati eredményt. Általában 10 - 15 perc alatt 1 - 3 ml kondenzátum gyűjthető össze. Potenciálisan a nyál kontamináció befolyásolhatja a kondenzátum kémia összetételét. Ezt elkerülendő, meghatározhatjuk a kodenzátum amiláz tartalmát és ennek ismeretében kizárhatjuk a mérésekből a további vizsgálatra alkalmatlan (szignifikáns mennyiségű amilázt tartalmazó) mintákat. Ismert, például az eicosanoidok nagy mennyisége a nyálban asztmás roham esetén, a nitrit és nitrát mennyiségének emelkedése nitrit gazdag diétát követően (29). Mindezen tényezők természetesen megváltoztathatják a kilégzett levegő kondenzátum kémiai összetételét (28, 29). A kilégzett levegő kondenzátumának mennyisége független a percventillációtól, a kilégzett levegő hőmérsékletétől és páratartamától (59). (6. ábra: Kilégzett levegő kondenzálása: a készülék működési elve)
19
Normál Mintagyűjtő tartály (-20 C0) Szobalevegő 2 – 4 ml kondenzátum / 510 perc
6. ábra Kilégzett levegő kondenzálása: a készülék működési elve
2.3. NO metabolitok a légutak gyulladásos betegségeiben Az NO metabolitok némelyike, pl. nitrit, nitrát kimutathatók az egészséges tüdő légúti epitheliális folyadékában (60), BAL folyadékban (27, 61), indukált köpetben (26, 62) és a kilégzett levegő kondenzátumában (12, 63, 64). Mennyiségükből, egymáshoz és az FENO-hoz viszonyított arányukból következtethetünk az NO tüdőn belüli anyagcseréjére, oxidatív hatású anyagok jelenlétére, koncentrációjára, ezek biokémiai hatásaira. A nitrit, nitrát, S-nitrozotiol és nitrotirozin közötti egyensúly az epitheliális folyadékban a kilégzett levegő kondenzátumának kémiai összetételét is befolyásolja. Ily módon a kondenzátum analízisének segítségével képet kaphatunk az NO termelődés gyorsan bekövetkező, illetve hosszabb távú változásairól. Többféle módszer ismert a nitrit,
nitrát,
nitrozotiol
mennyiségi
meghatározására,
úgymint
fluorometriás, kolorimetriás és elektrokémiai módszerek (65- 68).
20
immunassay,
Asztma akut exacerbációja kapcsán mind a köpetben (69), mind a kilégzett levegő kondenzátumában (64) magas nitrit koncentrációt találtak, melyből arra lehet következtetni, hogy az exacerbáció kapcsán a gyulladásos sejtekből felszabaduló oxidáns hatású molekulák lehetőséget teremtenek az NO fokozott oxidációjára. E megfigyelés akár az asztma exacerbáció házi monitorozására is felhasználható (64). Asztmás betegek légúti epitheliuma és gyulladásos sejtjei erős nitrotirozin immunreaktivitást mutatnak, jelezve a reaktív nitrogén gyökök részvételét a kóros folyamatban (48). Enyhe fokú, szteroiddal nem kezelt asztma esetén a kilégzett levegő kondenzátumában is kimutatható a nitrotirozin koncentráció emelkedése (55), míg súlyos, szteroiddal kezelt asztmásokban pedig az egészségeseknél magasabb, de az előző asztmás csoport adataihoz képest relatíve csökkent mennyiségű nitrotirozin detektálható a kondenzátumban (55). Mivel a kondenzátum magas nitrotirozin tartalma középsúlyos asztmában - szteroid terápia visszavonását követően - az asztmás tünetek súlyosbodásával és a légzésfunkciós adatok rosszabbodásával korrelál, valószínű, hogy a nitrotirozin koncentráció emelkedése (melyet a szteroid kezelés csökkent) nemcsak az asztma exacerbáció előrejelző faktora, hanem kulcsszerepet játszik az asztma pathomechanizmusában is (29). S-nitrozotiol mennyiségi csökkenése mutatható ki légzési elégtelenségben szenvedő asztmás gyerekek tracheájának epitheliális folyadékában (70). Ez arra utal, hogy az S-nitrozotiol, mint endogén hörgtágító mérsékelheti az asztmában tapasztalható bronchospazmust. Enyhe asztmában a kilégzett levegő kondenzátumának S-nitrozotiol tartalma nagy dózisú inhalatív szteroid hatására csökken (71). Ugyanakkor a kilégzett levegő kondenzátumának nitrit + nitrát mennyisége gyorsan és dózistól függően mérséklődik - szteroid kezelés hatására - ugyanezen betegcsoportban. Ezen adatok arra utalnak, hogy a nitrit + nitrát koncentrációjának változása érzékenyebben jelzi a gyulladásellenes terápia hatását, mint a nitrozotiol mennyisége. COPD. Nitrotirozin képződés fokozódik COPD esetén. Mennyisége negatívan korrelál a FEV1-el, jelezve, hogy súlyosabb állapotban a légutakban képződött NO felhasználódik - a gyulladásos sejtekból felszabadult - superoxid anionnal való reakció és/vagy peroxidáz-dependens mechanizmus által (72).
21
Sarcoidosis. BAL folyadék nitrit + nitrát koncentrációja emelkedett aktív tüdő sarcoidosis esetén, utalva az NO fokozott oxidatív metabolizmusára a kórkép aktivitása idején (61). 2.4. FENO és NO metabolitok cystás fibrosisban (CF) Mucoviscidosis, azaz cystás fibrosis (CF) az europid népesség leggyakoribb letális, örökletes anyagcserebetegsége. A kórképet magyar és német nyelvterületen mucoviscidosisnak, az angolszászok cystás fibrosisnak nevezik. Ma már felnőttkorban is találkozunk ezzel a kórformával, mivel a korán elkezdett terápia mellett a betegek megélhetik a felnőttkort. A kórkép előfordulási gyakorisága Európában 1:2000, hazai felmérések szerint Magyaroroszágon 1:4000 (73). A genetikai vizsgálatok szerint a betegség autoszomális, recesszív módon öröklődik, kialakulásáért a cysticus fibrosis transmembran conductans regulátor (CFTR) gén mutációja felelős. Ez a kóros gén a betegek 70 %-ban a deltaF508 gén, amely kódolja a CFTR fehérjét és azonos a ciklikus adenozin-monofoszfát (cAMP) által regulált kloridcsatornával (73). A külső elválasztású mirigyek működési zavarának következményeként a termelt váladék jelentősen besűrűsödik. A betegség biokémiai alapja az epitheliális sejtek apikális membránján keresztül történő kloridtranszport zavara. Az exokrin mirigyek működészavara következtében csökken a mirigyváladék víztartalma, kórosan megemelkedik a nátrium (Na) és klór (Cl) tartalma, így az exkrétumok sűrűvé és tapadóssá válnak. A besűrűsödött váladék eltömeszeli a kivezetőcsöveket amiből a különböző szervi megbetegedések adódnak. Felnőttkorban leggyakrabban légzőszervi manifesztációk figyelhetők meg. Károsodik a mukociliáris transzportfunkció, az elzáródott légutak mögött atelektáziás tüdőrészek alakulnak ki. A beteg dyspnoéssé válik, majd cyanotikussá. A légutakban pangó váladék elősegíti a lokális fertőzések kialakulását. A légúti hám károsodása, a peribronchialis fibrosis és a bronchusfal elvékonyodása következtében pedig bronchiectasia
jöhet
létre.
A
légutakban
kezdeti
stádiumban
leggyakrabban
Staphylococcus aureus és Haemophilus influenzae, később pedig Pseudomonas aeruginosa megtelepedése figyelhető meg. A Pseudomonásnak létezik egy CF-re 22
specifikus nyáktermelő kolonizációja, a Pseudomonas cepacia mely kizárólag ebben a kórformában szokott előfordulni, elsősorban a végstádiumban és a tüdő gyors károsodását okozza. A kórképre jellemző krónikus endobronchialis infekció, visszatérő akut exacerbációkkal, bakteriális superinfekciókkal, tovább rontja a beteg pulmonológiai státuszát. A tüdőbetegség súlyosságának megítélése, megfelelő kezelése azért is fontos, mert a beteg életminőségét és életkilátását leginkább a tüdőmanifesztáció befolyásolja. A csaknem állandó bakteriális kolonizáció és ennek következményeként létrejövő masszív PMS akkumuláció, fokozott oxidatív stresszt jelentenek a légutakban. Ismert tény, hogy CF esetén az FENO szintje csökken hasonló korú egészséges egyének adataihoz viszonyítva (11-15). Ez egyaránt megfigyelhető újszülött, gyermek és felnőttkorú CF-s betegekben (11-14). Az FENO koncentráció csökkenését nem befolyásolja a genotípus - vagyis hogy a beteg deltaF508 homozygota, vagy heterozygota -, és nem különbözik szteroiddal kezelt és nem kezelt betegcsoportban (15). Továbbá akut exacerbáció esetén, amikor a gyulladás fokozódása következtében nagy mennyiségben gyulladásos mediátorok szabadulnak fel - melyek iNOS expressziót indukálnak - sem emelkedik az FENO (13). Ezen adatok alapján levonhatjuk azt a következtetést, hogy az asztmában a gyulladás nyomon követésére, a terápia hatásosságának megítélésére oly jól hasznosítható FENO mérés CF-ben nem ad lehetőséget a gyulladás markerezésére. Joggal merül fel a kérdés, hogy a perzisztáló gyulladás, csaknem állandó bakteriális kolonizáció ellenére miért csökken az FENO ebben a betegcsoportban. Egyrészt kimutatható a CF-s epitheliális sejtek csökkent iNOS expressziója, melynek következtében gyulladásos mediátorok felszabadulását követően elmarad az NO képződés várt emelkedése (16, 17). Másrészt, valószínű az NO fokozott metabolizmusának
lehetősége is, melynek következtében az NO átalakulva NO
metabolittá, úgymond "felhasználódik" a kémiai reakciók során. Az, hogy a légúti epitheliális sejtek csökkent NO képződésén kívül, milyen szerepe van az NO fokozott anyagcseréjének, nevezetesen az NO oxidációs átalakulásának még nem teljességgel tisztázott. Továbbá nyitott kérdés, hogy az alacsony légúti NO koncentrációnak milyen
23
hatásaa van a légutak kórokozókkal szembeni csökkent ellenállóképességét és a tüdő funkcionális és organikus károsodását illetően. A kérdést megválaszolandó, különböző légúti váladékok NO metabolitjait széles körben vizsgálják. Az NO metabolitok koncentrációját CF-ben számtalan faktor befolyásolhatja. Ezek: a gyulladás súlyosságának foka, a gyógyszeres kezelés, a légúti váladék gyűjtésének módja és az NO metabolitok detektálási technikája. Valószínűleg ez az oka az irodalomban ismertetett némiképp ellentmondásos adatoknak. Köpet nitrát koncentrációja emelkedett stabil CF-s betegekben egészséges egyének trachea váladékához viszonyítva. A betegek nyálában levő nitrát mennyisége szintén magasabb, mint a kontrollcsoport adatai (62). Sem a nyál, sem a köpet nitrit + nitrát mennyisége nem különbözik stabil állapotú és exacerbációban szenvedő betegekben (62). Más megfigyelések szerint a CF-s köpet nitrit + nitrát mennyisége szignifikánsan emelkedett CF akut exacerbációjában, stabil állapotú CF-s betegek és egészséges egyének adataihoz képest, és ez 2 hetes antibiotikus kezelést követően is emelkedett maradt (26). E szerint a köpet nitrit + nitrát koncentráció változásának mérése lehetőséget teremthet az akut infekció monitorozására is (26). Jones és munkatársai ugyanakkor azt állapították meg, hogy CF-s köpet nitrát, nitrotirozin és MPO koncentrációja emelkedett, ellenben a nitrit mennyiséggel. E megfigyelés alapján nagyobb mennyiségű endogén NO képződésre következtetnek, mint amennyi a kilégzett levegőben detektálható (74). Más tanulmány nem találta magasabbnak a CF-s köpet nitrit és nitrát mennyiségét, de itt is magasabbnak bizonyult az MPO tartalom (75). Kilégzett levegő kondenzátum nitrit szintje szignifikánsan emelkedett CF-s betegcsoportban egészséges egyének adataival összehasonlítva (12, 56). A kondenzátum nitrit koncentrációja pozitívan korrelált a szérum fehérvérsejt számmal, de nem korrelált az FENO-al és a légzésfunkciós paraméterekkel. Ez azt a hipotézist támasztja alá, hogy a gyulladásos légutakban az NO szignifikáns mennyisége oxidációs átalakuláson megy keresztül és nitritté és/vagy nitráttá alakul. NO és glutation interakciója kapcsán S-nitrozotiol jön létre, mely képes az NO káros
hatásait
csökkenteni.
Nitrozotiol
detektálható
CF-s
betegek
kilégzett
kondenzátumában (76). Kimutatták, hogy a nitrozotiol koncentráció emelkedik felnőtt,
24
súlyos állapotú CF-s betegcsoportban mind stabil periódusban mind az akut exacerbáció ideje alatt (76). 2.5. FENO és NO metabolitok habituális dohányosokban A dohányzás számos káros hatása ismert, melyek leginkább a kardiovaszkulárisés a légzőrendszert érintik. Sok információval rendelkezünk az ártó tényezők mibenlétét illetően, de a pontos mechanizmus még nem teljesen ismert. A hátrányos hatások kialakulásában a füst alkotóelemeinek az epitheliális sejtek funkciójára gyakorolt toxikus effektusa, a tüdő öntisztulási folyamatának károsodása, az alveoláris macrophagok tevékenységének csökkenése és fokozott PMN akkumuláció egyaránt szerepet játszanak. A kardiovaszkuláris betegségek magasabb rizikója a populáció e csoportjában jól ismert tény, feltételezhetően a cigaretta füst részecskéinek endothel sejtekre gyakorolt hatása miatt. Valószínűleg az NO és anyagcseréje kapcsán képződött oxidációs metabolitok is részt vesznek a fennt említett pathológiai folyamatok létrejöttében. Az irodalomban széles körben publikált azon tény, hogy dohányosokban az FENO szignifikáns csökkenése tapasztalható, egészséges, hasonló korú, nem dohányzó egyének adataihoz viszonyítva. Továbbá szignifikáns korelációt állapítottak meg a napi cigaretta fogyasztás mennyisége és az NO csökkenés mértéke között (18, 19). Cigaretta expozíciót közvetlenül követően további tranziens, kisfokú FENO koncentrációesést mutattak ki (18). A dohányzásról való leszokás után az FENO szint visszatér a normál értékhez (77). Az alacsony NO koncentráció a légutakban - legalábbis részben – magyarázhatja a dohányosok hajlamát bizonyos betegségekre. Az NO antimikróbás hatása miatt az endogénen képződött NO-nak szerepe van a légúti infekciók elleni védelemben. Az NO a légúti epitheliális sejtek ciliáris működésének szabályozásában is részt vesz, mely fontos mechanizmus a felső és alsó légutak váladéktól, szennyeződéstől való megtisztításában. Ismert az NO PMN sejtek adhézióját gátló és kemotaxisát befolyásoló effektusa (78). Az NO mennyiségének endogén csökkenése PMN dominanciájú infiltrációra hajlamosíthat, mely gyakran megfigyelhető rendszeres dohányzóknál (79). 25
Az NO képződés csökkenése tehát - többféle módon - prediszponálhat légúti infekciókra. A kardiovaszkuláris betegségek közül a dohányosoknak magasabb a rizikója hipertóniára és perifériás érbetegségekre (pl. érelmeszesedés, iszkémia). A bazális NO termelődés eNOS aktivitás útján, a szisztémás keringésben a vaszkuláris tónus egyik fontos szabályozója lehet. Ezt támasztja alá az a megfigyelés, hogy NOS inhibitor infúziója egészséges egyénekben vérnyomás emelkedést okoz (80). Az endotheliumból származó NO szerepet játszik a trombocita addhézió megakadályozásában és véd az ateroszklerózis kialakulásától (2). Amennyiben a dohányzás csökkenti a bazális endogén NO termelődését – cNOS gátlás mechanizmusán keresztül - ez magyarázatot adhat arra, hogy miért fordulnak elő gyakrabban kardiovaszkuláris betegségek habituáis dohányzók körében. Az
NO
csökkent
képződése
mellett
természetesen
az
NO
fokozott
metabolizmusa is befolyásolhatja az FENO koncentrációját. Tekintettel arra, hogy a dohányzók légútjai állandó oxidatív stressznek vannak kitéve, és a cigaretta füst önmagában is nagymennyiségű oxidáns és magas koncentrációjú NO forrása, valószínűnek tűnik az NO légutakon belüli átalakulása káros hatású oxidációs termékekké (20). Dohányzókban a tüdő epitheliális folyadékában szokatlanul magas antioxidáns koncentráció mérhető, mely mutatja a szervezet alkalmazkodó képességét és védekezőreakcióját az oxidatív hatásokkal szemben. Az NO S-nitrozotiol formájában raktározódhat a légutak epitheliális folyadékában, vagy ebből való átalakulás után felszabadulhat peroxinitrit formájában, mely az FENO átmeneti növekedését okozhatja cigaretta elszívását követően (81). Krónikus oxidatív stressz, melyet a cigaretta okoz, csökkenti a tiol vegyületek hozzáférhetőségét, és fokozza a nitrozotiol lebomlását. Az NO metabolizmusát taglaló tanulmányok azt mutatják, hogy az NO oxidációra való hajlama miatt, anyagcseréjét egyik legjobban befolyásoló tényező a légutakat érő, vagy a külvilágból származó - exogén noxa - vagy belső, a léguti sejtek pathofiziológiai változása, például gyulladása kapcsán létrejövő - endogén noxa oxidatív stressz.
26
Az NO metabolitok légúti váladékokban történő vizsgálata párhuzamosan az FENO detektálásával közelebb vihet bennünket a kérdés megválaszolásához, hogy miért tapasztalható egyes pulmonális betegségekben, állapotokban - a gyulladásos patológia és/vagy rekurráló oxidatív stressz fennállása ellenére - csökkent FENO érték. Légúti váladék non-invazív gyűjtésének egyik legegyszerűbb, újonnan kidolgozott metodikája a kilégzett levegő kondenzátumának analízise, mely lehetővé teszi a légutakban zajló biokémiai folyamatok pontosabb megismerését.
27
3. CÉLKITŰZÉSEK Jelen munkám közvetlen célkitűzései a következők voltak: Különböző NO metabolitok (nitrit, nitrát, nitrotirozin) koncentrációjának meghatározása
a
kilégzett
levegő
kondenzátumában,
FENO
detektálásával
párhuzamosan, olyan kórállapotokban melyek exogén vagy endogén oxidatív stresszel járnak és közös jellemzőjük az FENO csökkenése. I. NO metabolitok koncentrációjának meghatározása CF-s betegek kilégzett kondenzátumában, ahol a krónikus légúti gyulladás és fokozott oxidatív stressz ellenére az FENO csökkenése detektálható. Van-e különbség a kilégzett kondenzátum NO metabolit koncentrációjában CF-s betegek és egészséges egyének között? Van-e különbség a kilégzett kondenzátum NO metabolit koncentrációjában az antiflogisztikus kezelésben (szteroid) részesült és nem részesült csoport között? Van-e valamilyen összefüggés az FENO, légzésfunkciós adatok és NO metabolitok között? II. NO metabolitok koncentrációjának meghatározása habituális dohányosokban, ahol a cigaretta füst által kiváltott exogén oxidatív stressz ellenére szintén az FENO csökkenése figyelhető meg. Van-e különbség a kilégzett levegő kondenzátum NO metabolitjának (nitrit, nitrát, nitrotirozin) koncentrációjában egészséges dohányos és nem dohányzó személyek között? Cigaretta expozíció után rövid idővel (30 perc) van-e változás az NO metabolitok koncentrációjában? Cigaretta elszívása után hosszabb idő elteltével (3 óra) tapasztalható-e változás a fenti NO metabolitok szintjében?
4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 4.1. Vizsgált csoportok 4.1.1.Cystás fibrosisban szenvedő betegcsoport A vizsgált személyeket a Royal Brompton Hospital (London, UK) Cystic Fibrosis Klinikájáról vontuk be tanulmányunkba. Burkholderia cepacia, meticillin rezisztens Staphylococcus aureus kolonizáció vagy akut légúti infekció kizáró tényezők voltak. A klinikai stabilitás kritériuma az akut exacerbáció kizárhatósága volt, melyet a következőképpen definiáltunk: fokozódó köhögés, fokozódó mennyiségű köpetürítés, változás a köpet minőségében (purulens, véres, putrid) fokozódó fulladás, szignifikáns FEV1 csökkenés a beteg legutóbbi adataihoz viszonyítva, csökkent terhelési tolerancia. Amennyiben ezen tünetek közül bármelyik észlelhető volt a betegnél a tanulmányba nem vontuk be. 36 stabil állapotú, felnőtt, CF-ben szenvedő beteget vizsgáltunk meg (23 férfi, 29 ± 1 éves, FEV1 59,7 ± 26,4 a várható érték %-ként kifejezve), közülük 16 tartós inhalatív és/vagy per os kortikoszteroid terápiát kapott (a dózistartomány napi 400 µg inhalatív szteroid és napi 8 mg per os szteroid között volt). Minden betegnél történt köpet bakteriológiai tenyésztése valamint vér laboratóriumi vizsgálata. Közülük 22 (61 %) köpetben volt kimutatható Pseudomonas aeruginosa (> 105 cfu/ml) kolonizáció, 12 (33 %) esetben egyéb kórokozót detektáltak (Staphylococcus aureus, Heamophilus influenzae), 2 köpetben volt normál flóra. 5 (14 %) köpetben tenyészett ki mind a Pseudomonas aeruginosa és a Staphylococcus aureus is. Fehérvérsejtszám 10,5 ± 0,5 g/L, a Westergreen érték pedig 18,3 ± 3,5 mm/óra volt. A kontrol csoport 14 egészséges, felnőtt, önkéntes egyénből állt (6 férfi, 34 ± 2 éves, FEV1 101,8 ± 2,6 %), akik nem szedtek rendszeresen semmiféle gyógyszert, valamint anamnézisükben nem szerepelt légúti infekció a vizsgálatot megelőző két hétben. Minden vizsgálati személy (CF-s betegek, egészségesek önkéntesek) nem dohányzó voltak. A klinikai adatok a 1. táblázaton láthatók.
29
A tanulmány protokollját a Royal Brompton Hospital Etikai Bizottsága jóváhagyta, minden vizsgált beteg a beleegyező nyilatkozatot aláírta.
1. Táblázat CF-S BETEGCSOPORT ÉS EGÉSZSÉGES KONTROLL CSOPORT KLINIKAI ADATAI
Kor (év)
Szteroid nélkül kezelt CF-s betegek (n=20) 27 ± 2
Szteroiddal kezelt CF-s betegek (n=16) 30 ± 2
Egészséges normál egyének (n=14) 34 ± 2
Sex (F/N)
14/6
9/7
6/8
FVC (%)
86,3 ± 4,9
74,7 ± 5,5
100,5 ± 3,1
FEV1 (%)
67,5 ± 6,5
51,9 ± 4,9
101,8 ± 2,6
PA köpet bakteriológiai tenyésztésben Terápia Inhalatív szteroid Per os szteroid Per os + inhalatív szteroid
9
13
0
0 0 0
9 5 2
0 0 0
Rövidítések definíciói: FEV1 = forszírozott kilégzési másodperctérfogat, FVC = forszírozott vitálkapacitás, PA = Pseudomonas aeruginosa. Az értékek átlag ± SEM-ben vannak kifejezve.
4.1.2.Egészséges, habituális dohányzók és nemdohányzók 30 egészséges önkéntes (13 férfi) adatait vizsgáltuk. Az alanyokat két csoportba osztottunk dohányzási szokásuktól függően: nem dohányzókra (n = 14, 34,8 ± 2,3 év) és 30
dohányzókra (n = 16, 31,7 ± 2,2 év). A habituális dohányzók cigaretta fogyasztása 7,3 ± 2,0 dobozév. A vizsgált személyek anamnézisében nem szerepelt légúti vagy kardiális betegség (hipertónia, asztma, légúti infekció a vizsgálatot megelőző két hétben). A vizsgált egyének a tanulmány idején illetve az azt megelőző két hétben semmiféle gyógyszert nem szedtek. A tanulmány során FENO-t, kilégzett szén-monoxidot (eCO)-t, légzésfunkciós adatokat mértünk, valamint a kilégzett levegő kondenzátumát gyűjtöttük minden személynél. A légzésfunkciós paraméterek FEV1, FVC normál tartományban voltak. A vizsgált személyek klinikai adatait a 2. táblázat tartalmazza. A vizsgálat megkezdése előtt a dohányosok legalább 4 órán keresztül tartózkodtak a dohányzástól. A kiindulási adatok lemérése, illetve a kondenzátum gyűjtése után a dohányzók 2 cigarettát szívtak el, majd ezt követően 30 és 90 perccel fenti adatok ismételt mérése, illetve kondenzátum gyűjtése történt. A tanulmány protokollját a Royal Brompton Hospital Etikai Bizottsága jóváhagyta, minden önkéntes vizsgálati alany a beleegyező nyilatkozatot aláírta.
2. Táblázat EGÉSZSÉGES DOHÁNYZÓK ÉS NEM DOHÁNYZÓK KLINIKAI ADATAI
Kor (év)
Egészséges dohányzók (n=15) 32 ± 2
Egészséges nem dohányzók (n=14) 35 ± 2
Sex (F/N)
7/8
6/8
FVC (%)
97,1 ± 3,1
100,5 ± 3,1
FEV1 (%)
90,1 ± 1,4
101,1± 2,6
Kilégzett NO (ppb)
4,3 ± 0,3*
5,5 ± 0,5
Kilégzett CO (ppm)
12,5 ± 2,2**
3,5 ± 0,3
Röviditések definiciói: FEV1 = forszirozott kilégzési másodperctérfogat FVC = forszirozott vitál kapacitás, NO = nitrogén monoxid, CO = szénmonoxid. Az értékek átlag ± SEM-ben vannak kifejezve. *p < 0,05; **p < 0,001. 31
4.2. Légzésfunkció FVC-t és FEV1-t spirométerrel mértünk (Vitalograph, Buckingham, UK) három manőver közül a legjobbat a várható érték százalékában fejeztük ki. A totálkapacitást (TLC) és a reziduális volument (RV) pletizmográffal detektáltuk. (Transfer Factor Model B; PK Morgan; Rainham, UK). 4.3. Kilégzett NO mérés FENO mérése kemilumineszcens módszerrel történt (Model LR2000, Logan Research Ltd, Rochester, UK). A módszer szenzitivitása 1 - 500 ppb volumenenként, 0,3 ppb mellett. A műszer lehetővé teszi az FENO koncentráció ”online„ detektálást. A készüléket ismert NO keverékkel (nitrogénben) (55 ppb) kalibráltuk (BOC Special gases, Guilford, UK). Az FENO mérése lassú kilégzés alatt (5 to 6 L/min) a TLC 20 - 25. másodpercében történt 3 ± 0,4 Hgmm ellenállás mellett, azért hogy a nazális kontaminációt kiküszöböljük. A fenti ellenállás esetén záródik a lágyszájpad. Az NO értékét a kilégzett CO2 koncentrációját jelző görbe platójának végpontján határoztuk meg, így az alsó légutakból származó mintát tudtuk detektálni. 4.4. Kilégzett CO mérés Kilégzett CO mérése módosított elektrokémiai szenzorral történt, melynek szenzitivitása 1 részecske per millió (ppm) - 500 ppm, (Logan Research Ltd, Rochester, Kent, UK). Két mérés átlagát jegyeztük fel. A levegő CO tartalmát minden esetben levontuk a mért értékekből. 4.5. Kilégzett levegő kondenzátum gyűjtése A kilégzett levegő kondenzátumának gyűjtése speciális kondenzáló eszközzel történt, mely lehetővé teszi a kilégzett levegő nem gáz jellegű komponenseinek non32
invazív összegyűjtését (EcoScreen, Jaeger, Würzburg, Germany). Szájöblítést követően, a vizsgált személyek egy szájrészen át lélegeztek, mely két szelepes billentyűvel volt ellátva (ez egyúttal nyálcsapdaként is szolgált). A vizsgált egyének 10 percen keresztül normál légzési volumennel és frekvenciával lélegeztek, miközben orrcsipeszt viseltek. A kondenzátumot, melynek mennyisége 10 perc alatt legkevesebb 1 ml volt, -20°C-on gyűjtöttük és -70°C-n tároltuk. 4.6. Kilégzett levegő kondenzátumának kémia analízise 4.6.1. Nitrit, nitrit + nitrát mérése NO2- mérése fluorometriás assay-vel történt, mely a nitrit és a 2,3diaminonaphthalene (DAN) azon reakcióján alapult, hogy a képződött termék (1-(H)naphthotriazol) fluorescens tulajdonsággal rendelkezik (68). Az assay detekciós limitje 0,1 µM. 100 µl mintát (a kilégzett levegő kondenzátumából) összekevertünk 10 µl 0,05 mg/ml-s
koncentrációjú
DAN
reagenssel
0,625
M
HCl-ban.
A
reakció
szobahőmérsékleten, sötétben történt, melyet 10 µl 1,4 M NaOH-al állítottunk le. A fluoreszcens jel intenzitását fluorométerrel azonnal leolvastuk (Ex: 360 nm, Em: 460 nm: Biolite F1, Labtech, International Ltd, Uckfield, UK). A minták inkubálása nitrát reduktázzal lehetővé tette, hogy a mintában levő nitrát ugyanezen módszerrel mérhető legyen miután a mintában levő nitrát nitritté konvertálódott. 4.6.2. Nitrotirozin mérés A nitrotirozint specifikus enzim immunoassay-vel mértük (EIA) (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI). Az assay-t ismert koncentrációjú nitrotirozinnal hitelesítettük (0,95). A kilégzett levegő kondenzátum nitrotirozin koncentrációját EIAval detektáltuk. Az assay detekciós limitje 3,9 ng/ml volt. Minden esetben a kilégzett levegő kondenzátumából származó mintákat száraz fagyasztó
segítségével
(Modulyo,
Edwards,
koncentráltuk és ezt követően analizáltuk. 33
Crawley,
UK)
háromszorosára
6 mintában vizsgáltuk amiláz jelenlétét. Mivel amiláz nem volt kimutatható egy mintában sem, valószínűnek tartottuk, hogy a kondenzátum nem kontaminálódott nyállal. 4.7. Statisztikai analízis Az adatok mind átlag ± SEM vannak kifejezve. A vizsgálatban részt vevő személyek adatai normális eloszlást mutattak. A CF-s betegcsoport és az egészséges önkéntesek közötti statisztikai összehasonlítások Student-t teszttel történtek. Az FENO és nitrotirozin koncentráció, valamint a nitrotirozin szint és légzés funkciós adatok (FVC, FEV1, RV, TLC) közötti korrelációt Pearson korrelációs koefficienssel, illetve multiplex regressziós analízissel határoztuk meg. Az egészséges dohányzó és nem dohányzó csoportok közötti statisztikai összehasonlítások Student-t teszttel történtek. Dohányzás hatásának vizsgálata az NO metabolitokra ANOVA-val történt. A szignifikanciát p < 0,05 értéknél fogadtuk el. A statisztikai analízis Statistica 5.1-s statisztikai programmal történt (StatSoft Inc, Tulsa, Oklahoma, USA).
34
5. EREDMÉNYEK 5.1. FENO és NO metabolitok CF-s betegcsoportban 5.1.1. FENO FENO koncentráció szignifikánsan csökkent CF-s betegekben egészséges kontrollcsoport adataihoz viszonyítva (4,4 ± 0,3 vs 5,6 ± 0,4 ppb, p < 0,05). Nem volt szignifikáns különbség a szteroid-mentes és szteroid-kezelt csoportok között (4,7 ± 0,4 vs 4,1 ± 0,6 ppb) (7. ábra). Az FENO érték nem korrelált sem a légzés funkciós adatokkal (FVC, FEV1, RV/TLC) sem a fehérvérsejtszámmal és a Westergreen értékkel.
7. ábra. Kilégzett NO egészséges egyénekben és CF-s betegekben. Kilégzett NO szignifikánsan csökkent CF-s betegekben. Nem volt szignifikáns különbség a szteroiddal kezelt és nem kezelt CF-s betegcsoportban ns = nem szignifikáns
35
5.1.2. Nitrotirozin a kilégzett levegő kondenzátumban Nitrotirozin detektálható volt egészséges egyének és CF-s betegek kilégzett levegő kondenzátumában és értéke szignifikánsan magasabb volt a CF-s betegekben (6,3 ± 0,8 vs 25,3 ± 1,5 ng/ml, p < 0,001). (8. ábra)
8. ábra. Kilégzett levegő kondenzátumának nitrotirozin koncentrációja egészséges egyénekben és CF-s betegekben. Nitrotirozin koncentráció szignifikánsan emelkedett CF-s betegekben. Nem volt szignifikáns különbség a szteroiddal kezelt és nem kezelt CF-s betegcsoportban ns = nem szignifikáns
36
Nem volt szignifikáns különbség a nitrotirozin koncentrációban a szteroidmentes és a szteroiddal kezelt csoportok között (25,5 ± 1,9 vs 24,2 ± 2,5 ng/ml). Nem volt korreláció az FENO és nitrotirozin szintek között. Abból a célból, hogy megállapítsuk, vajon a tüdőbetegség súlyossága befolyásolja-e a nitrotirozin szintet, meghatároztuk az összefüggést a nitrotirozin szint és a légzésfunkciós adatok között. A nitrotirozin mind az FVC % (r = 0,71, p < 0,001), mind a FEV1 % (r = 0,70, p < 0,001) értékekkel pozitív lineáris összefüggést mutatott. Az RV/TLC % negatívan korrelált a nitrotirozin koncentrációval (r = -0,70, p < 0,001), jelezve, hogy jobb légzésfunkció magasabb nitrotirozin szinttel járt. (9. ábra) A Pseudomonas aeruginosa-val infektálódott valamint egyéb kórokozóval fertőzött
csoportok
között
nem
volt
szignifikáns
különbség
a
nitrotirozin
koncentrációban (25,4 ± 1,8 vs 23,8 ± 2,7 ng/ml). Nem találtunk összefüggést a leukocita szám, Westergreen értékek és a nitrotirozin szintek, valamint a fehérvérsejtszám, Westergreen érték és a légzés funkciós paraméterek között (FEV1 %, FVC %).
37
9. ábra Összefüggés a kilégzett levegő kondenzátum nitrotirozin tartalma és a légzésfunkciós paraméterek között CF-s betegekben. A nitrotirozin koncentráció pozitívan korrelál az FVC %-al és a FEV1%-al és negatívan az RV/TLC %-al. 38
5.1.3. Nitrit és nitrit + nitrát a kilégzett levegő kondenzátumban Nem tapasztaltunk szignifikáns különbséget a kilégzett levegő kondenzátum NO2- és NO2- + NO3- szintjeiben CF-s betegek és egészséges egyének között (3,9 ± 0,7 vs 3,2 ± 0,5 µM; 25,4 ± 6,1 vs 21,5 ± 3,2 µM). Nem volt korreláció a NO2- és NO2- + NO3- és a nitrotirozin szintek között. (10. ábra)
ns
ns 50
-
NO2 +NO3 (µM)
5
-
-
NO2 (µM)
10
40 30 20 10 0
0
Egészséges egyének
Egészséges egyének CF-s betegek
CF-s betegek
10. ábra Nitrit, nitrit + nitrát a kilégzett levegő kondenzátumban egészséges egyénekben és CF-s betegekben. Nem volt szignifikáns különbség a nitrit, nitrit + nitrát szintekben egészséges egyének és CF-s betegek között ns = nem szignifikáns
5.2. FENO, kilégzett CO és NO metabolitok egészséges habituális dohányosokban 5.2.1. Alap FENO, kilégzett CO és NO metabolitok FENO szignifikánsan csökkent a dohányos csoportban egészséges nem dohányzók adataival összehasonlítva (4,3 ± 0,3 vs 5,5 ± 0,6 ppb, p < 0,05). Kilégzett CO szignifikánsan emelkedett volt a dohányzóknál (12,5 ± 2,0 vs 3,4 ± 0,3 ppm, p < 39
0,001). Nem találtunk szignifikáns különbséget a kilégzett levegő kondenzátum NO2(2,5 ± 0,3 vs 3,2 ± 0,5 µM), NO2- + NO3- (19,9 ± 2,6 vs 18,6 ± 2,5 µM), és nitrotirozin (7,2 ± 1,3 vs 6,3 ± 0,8) koncentráció értékeiben dohányzók és nem-dohányzók között. (11. ábra)
11. ábra Kilégzett NO és kilégzett kondenzátum nitrotirozin, nitrit + nitrát és nitrit koncentrációja egészséges, nem dohányzó és habituális dohányzó személyekben. A kilégzett NO szignifikánsan csökkent dohányosokban. Nem volt szignifikáns különbség a kilégzett levegő kondenzátum NO metabolitjainak szintjében a két csoport között. ns = nem szignifikáns
40
5.2.2. FENO, kilégzett CO és NO metabolitok cigaretta expozíciót követően Abból a célból, hogy meghatározzuk a dohányzás rövid távú hatását az FENO-ra, kilégzett CO-ra és NO metabolitokra (NO2-, NO2- + NO3-, nitrotirozin) habituális dohányosoknál 30
és 90 perccel 2 cigaretta elszívását követően mértünk a fenti
paramétereket. Az NO2- + NO3- koncentráció szignifikánsan emelkedett 30 perccel a dohányzást követően (19,9 ± 2,6 µM vs 28,9 ± 3,3 p < 0,05) majd visszatért az alapértékre 90 percnél (23,4 ± 3,5 µM). Sem az FENO-ban (4,2 ± 0,3 vs. 4,3 ± 0,4 ppm) sem a NO2-, sem a nitrotirozin koncentrációban nem volt szignifikáns változás 30 és 90 perccel cigaretta expozíciót követően. Kilégzett CO szignifikánsan emelkedett 30 perccel a dohányzás után (12,5 ± 2.0 vs 19,8 ± 2.8 ppm, p < 0,05), azonban a 90 perces mérésnél már nem különbözött szignifikánsan az alapértéktől (14,1 ± 2,3 ppm). Nem tapasztaltunk korrelációt az FENO és a kilégzett levegő kondenzátumában levő NO metabolitok koncentráció értékei között 2 cigaretta elszívását követően. (12. ábra)
41
12. ábra Kilégzett levegő kondenzátum nitrit + nitrát, nitrit és nitrotirozin koncentrációja habituális dohányzó személyekben cigaretta expozíciót követően 30 és 90 perccel. ns = nem szignifikáns
42
6. MEGBESZÉLÉS Az NO-ról való egyre több ismeret birtokában logikusnak tűnt a kutatások folytatása a célból, hogy az NO szervezeten belüli kémiai folyamatait is megismerhessük. Annak a ténynek az ismeretében, hogy az NO in vitro és in vivo egyaránt igen gyors reakcióra képes egyéb szabad gyök jellegű molekulákkal (24, 33), valamint könnyen oxidálódik (2, 24, 25, 50, 40), az NO oxidációs metabolitok légúti váladékokban való megmérése további felvilágosítással szolgálhat a szervezetben zajló biokémiai folyamatokról. Egyúttal magyarázatot adhat arra is, hogy mi okozza a különböző tüdőbetegségekben tapasztalható emelkedett vagy csökkent FENO szinteket. Tanulmányunkban az NO tüdőben való metabolizmusa kapcsán vizsgáltuk a különböző eredetű, exogén és endogén oxidatív stressz hatását a kilégzett levegő kondenzátum
NO
anyagcseretermékeire
az
FENO
koncentráció
párhuzamos
detektálásával. Ehhez olyan állapotot (károsító szokást) és betegcsoportot kerestünk, ahol ismert a légutakat érő - csaknem állandó - oxidatív stressz jelenléte. 6.1. NO metabolitok CF-ben A CF-s betegek tüdőbetegségére jellemző a krónikus endobronchialis infekció, visszatérő akut exacerbációkkal, bakteriális superinfekciókkal. A bakteriális kolonizáció és ennek következményeként létrejövő masszív PMS akkumuláció a légutakban fokozott oxidatív stresszt jelent. Tanulmányunkban azt vizsgáltuk, hogy a különböző NO metabolitok, valamint a protein nitráció markerének tekinthető nitrotirozin a kilégzett levegő kondenzátumában kimutathatók-e CF-ben. Továbbá, van-e szignifikáns különbség egészséges egyének adataihoz viszonyítva és valamely paraméter szolgálhat-e a légúti gyulladás markerezésére ebben a betegcsoportban. Eredményeink
azt
mutatják,
hogy
a
nitrotirozin
a
kilégzett
levegő
kondenzátumában szignifikánsan magasabb stabil - akut exacerbáció nélküli - CF-s betegekben egészséges kontroll csoport adataihoz viszonyítva. Ugyanakkor nem találtunk különbséget egyéb NO anyagcseretermékek tekintetében.
A nitrotirozin a protein nitráció markere, megfelelő specifikus nitrotirozin antitesttel kimutatható. A fehérjék nitrálása biológiai folyamat, mely az NO vagy az NO-ból származó másodlagos termékek biokémiai interakciójával jön létre (34, 25). A tirozin nitrálása többféle úton történhet, a környező közeg kémiai tulajdonságaitól függően. Általában többféle nitráló tulajdonsággal rendelkező vegyület képes a biológiai
nitrálásra,
ámbár
jelenleg
csak
viszonylag
kevés
információ
áll
rendelkezésünkre a nitráló tulajdonsággal rendelkező molekulák hatásairól in vivo (25). A fehérjék tirozin gyöke határozottan hajlamos a nitrálódásra. Például a peroxynitrit képes nitrálni a fehérjék tirozin gyökét, így nitrotirozin jön létre. A tirozin nitrációja módosítja a fehérje funkcióját és károsan hat a sejt életképességére (34, 25, 47). NO metabolitok és nitrotirozin a tüdőben többféle gyulladásos betegség esetén kimutathatók, például asztmában, idiopathiás tüdőfibrozisban, tüdő transplantáció utáni obliterativ bronchitisben, ARDS-ben (34). Krónikus gyulladás és egyéb sejt-mediálta gyulladásos körülmények között a nitrotirozin képződés mieloperoxidáz (MPO)-dependens útjának lehetőségével is számolnunk kell. Nagy mennyiségű PMN akkumulálódik a CF-s betegek légútjaiban, mely fokozott MPO aktivitáshoz vezet (82, 23). Az aktivált humán PMN sejtek képesek a NO2--t oxidánssá konvertálni a MPO-dependens kémiai úton keresztül (47). Valószínű, hogy MPO-katalizált nitráció hidrogén peroxid (H2O2) jelenlétében nitráló hatású köztestermékeket hoz létre NO2--ból, az NO legfőbb végtermékéből. Ez a folyamat a protein nitráció egyik alternatív mechanizmusa, mely független a peroxynitrittől (47). Egyéb lehetőségek a nitrotirozin képződésére - melyek in vitro detektálhatók -, a nitrit direkt oxidációja hidrogén peroxid vagy hipoklórossav által, továbbá az NO vagy nitrogén-dioxid reakciója tirozil gyökkel. E folyamatok in vivo jelentősége még nem teljesen tisztázott (25). MPO és iNOS együttesen találhatók a PMN-ben, valamint NO és NO2- együttesen termelődnek a hipoklórossavval (HOCl) a gyulladásos gócokban, arra utalva, hogy NO2- és HOCl reakciójához a feltételek adottak in vivo is. Eiserich és munkatársai kimutatták, hogy NO2- reakcióba lépve HOCl-l reaktív vegyületet hoz létre, valószínűleg nitril-kloridot (Cl-NO2), mely képes nitrálni, klorinálni és oxidálni a fehérjék tirozin gyökét (83). Továbbá van der Vliet és munkatársai bebizonyították, 44
hogy fenolt tartalmazó vegyületek nitrálása, lehetséges NO2- + H2O2 által, mely reakciót a hem peroxidázok - mint az MPO - képesek katalizálni (84). Az ilyen nitrálási folyamatok fiziológiai relevanciáját támogatják azon tanulmányok, melyek PMN-t tanulmányoznak, mint az MPO és a H2O2 forrását (47). A nitrotirozin tehát a biológiai mintákban a reaktiv nitrogén speciesek kollektív indikátorának tekinthető (34). Újabb adatok bizonyítják, hogy bizonyos klinikai körülmények között a légutakban uralkodó kémhatás megváltozhat, és savas irányba tolódhat el. A pH ilyen irányú módosulása is befolyásolhatja az NO biokémiáját (85). A környező közeg kémhatása szerepet játszhat a nitrotirozin képződésben, ámbár további tanulmányok szükségesek ahhoz, hogy ennek jelentőségét in vivo megállapítsák, és a kémhatás szerepét a nitrotirozin kialakulásában tisztázzák. Nem tapasztaltunk szignifikáns különbséget a kilégzett levegő kondenzátum -
NO2 + NO3- szintjében CF-s betegek és egészséges egyének adatai között. Ez azt jelzi, hogy a nitrotirozin képződése jobbára a MPO-dependens úton keresztül (PMN infiltráción alapulva) történik. Tanulmányunk eredményei arra engednek következtetni, hogy a gyulladás kapcsán indukálódó oxidatív stressz nitrotirozin képződéséhez vezet, mely granulocita peroxidázok hatására létrejövő fokozott direkt nitrációra utal. Eredményeink az FENO szignifikánsan csökkenését mutatták CF-s betegeknél egészséges egyének hasonló adataihoz viszonyítva, mely egybevág az irodalomban eddig közölt adatokkal (11-15, 62). E jelenség - részben - azzal magyarázható, hogy az alsó légutakban képződött NO mennyiségének jelentős része oxidáció útján, biológiailag aktív nitrogén-oxiddá metabolizálódik, mielőtt elérné a légutak belső felszínét (11, 12). A
jelentősen
emelkedett
nitrotirozin
koncentráció
CF-s
betegek
kondenzátumában arra utal, hogy az NO metabolitok a CF-s légutakban egyrészt peroxinitritté metabolizálódhatnak és ezen a kémiai úton keresztül hozzájárulnak a nitrotirozin kialakulásához. Másrészt lehetséges, hogy a nitrotirozin kialakulásában más kémiai út - nevezetesen az MPO-dependens út – is jelentős szerepet játszik, melyhez a feltételek adottak a PMN túlsúlyú krónikusan gyulladt CF-s légutakban.
45
Nem volt szignifikáns különbség az FENO szintekben összehasonlítva a csak Pseudomonas aeruginosa-val kolonizált és a más baktériumokkal is infektálódott betegek között, mely adatunk megfelel Thomas és munkatársai által közölt megfigyeléseknek (15). Tanulmányunkban nem találtunk szignifikáns különbséget az FENO és a kilégzett levegő kondenzátum nitrotirozin szintjében a szteroiddal kezelt és a szteroid nélkül kezelt betegcsoportok között. A szteroid terápia az asztma kezelésének egyik legfőbb fenntartó gyulladásellenes gyógyszere (6), de indikációja nem teljesen egyértelmű CF-ben (86). A fokozott nitrotirozin képződés a légutakban, melyet nem befolyásol a szteroid terápia, azt jelezheti, hogy a CF-s betegek légútjaiban zajló gyulladás különbözik az asztmás jellegű gyulladástól. A CF-s légúti gyulladás, úgy tűnik nem szteroid szenzitív, hasonlóan a szintén nem szteroid szenzitív légúti gyulladáshoz, ami COPD-ben figyelhető meg (87). Szoros inverz korrelációt tapasztaltuk a kilégzett levegő kondenzátumának nitrotirozin szintje és a tüdőbetegség funkcionális súlyossági fokozata között. Egymásnak ellentmondó adatok találhatók az irodalomban az NO oxidációs metabolitok és a légzésfunkciós adatok közötti összefüggést illetően CF-ben. Grasemann és munkatársai azt találták, hogy pozitív korreláció van az FENO koncentráció és az FVC, de nem a FENO és FEV1 között, e megfigyelésből arra következtetve, hogy az FENO fordítottan aránylik a betegség súlyossági fokához (11). Továbbá arról számolnak be, hogy a köpetben található NO metabolitok pozitívan korrelálnak a FEV1-el és az FVCvel (62). Ezzel ellentétben Ho és munkatársai nem találtak összefüggést a kilégzett levegő kondenzátum nitrit szintje és a légzés funkciós paraméterek között (12). A tanulmányunkban észlelt pozitív korreláció a kondenzátum nitrotirozin értékei és a légzésfunkciós paraméterek között arra engednek következtetni, hogy magasabb nitrotirozin szintek relatíve fokozott NO produkciót jelezhetnek a betegség enyhébb tünetekkel járó manifesztációja esetén. Ez az adat egybevág azzal a megfigyeléssel, hogy azoknál a betegeknél, akiknek a tüdőparenchyma előrehaladottabb károsodása detektálható tovább csökkenhet az FENO érték is (11), ennek következményeként (NO hiányában) - relatíve - csökkenhet a nitrotirozin képződés is.
46
Ennek a spekulációnak némileg elentmond az a tény, hogy nem találtunk korrelációt a kilégzett levegő kondenzátum nitrotirozin koncentrációja és az FENO között. De figyelembe véve, hogy az eleve csökkent FENO igen kis mértékű változásairól van szó, és az NO metabolizmusában más tényezők is szerepet játszanak, ezt a feltevést nem vethetjük el. A kémiai reakciók lehetőségeit ismerve azonban valószínűbbnek tartjuk, hogy a nitrotirozin képződés sokkal inkább a MPO által katalizált kémiai úton keresztül történik. Más lehetséges magyarázat az, hogy a kislégutak csökkent ventillációja, a nagy mennyiségű, sűrű, tapadós bronchiális szekréció miatt a légutak destruálódott falán keresztül, melyhez megnövekedett anatómiai holttér is járul a betegség előrehaladottabb stádiumában (88), gátolhatja az endogénen képződött szabad nitrotirozin kijutását az alsó légutakból a kilégzett levegőbe, így a relatíve csökkent nitrotirozin a súlyosabb állapotú betegekben nem ad teljesen valós képet a légutak alsó részein képződött mennyiségről. Nem zárható ki a környező közeg kémhatásának szerepe sem a nitrotirozin képződés modulálásában. Feltételezve, hogy súlyosabb betegség esetén a pH savasabb a légutakban (az asztma betegség analógiájára), lehetséges, hogy az NO-ból képződött peroxynitrit sokkal inkább hidroxillá és nitrogén-dioxiddá disszociál, minthogy reagáljon a tirozin gyökkel és létrehozza a stabil 3-nitrotirozin vegyületet, aminek nagyobb valószínűsége van enyhébb betegség - azaz fiziológiásabb pH - mellett. Másrészről, több tanulmány kimutatta, hogy az NO képes úgy viselkedni, mint antioxidáns hatású molekula, ellensúlyozva a reaktív gyökök citotoxikus hatásait (89). Feltételezve, hogy az emelkedett nitrotirozin szintek - melyek enyhébb betegséggel kapcsolódnak - magasabb NO képződést jelentenek, érthető, hogy e betegcsoportban a magasabb koncentrációban képződő NO pozitív hatásai képesek valamennyire védeni a tüdőt a reaktív oxidáns gyökök káros hatásaitól. Összegzésként elmondhatjuk, hogy az emelkedett nitrotirozin koncentráció CFben, reaktív nitrogén gyökök fokozott képződésére utalhat, mely történhet a peroxynitrit dependens úton vagy a granulocita peroxidázok által facilitált direkt nitráció útján. A nitrotirozin, amely a légutakban jön létre, és összegyűjthető a kilégzett levegő kondenzátumában, az oxidatív stressz markereként szolgálhat e betegcsoportban. 47
További tanulmányok szükségesek ahhoz, hogy tisztázzák az NO és oxidatív produktumainak (mint a peroxynitrit), komplex biokémiai folyamatait krónikus szuppuratív tüdőbetegségekben. 6.2 NO metabolitok dohányzás esetén Dohányzás esetén a légutakat gyakori, ismétlődő oxidatív stressz éri a cigaretta füst inhalációja által, így érdemesnek tartottuk megvizsgálni hogyan hat ez a kilégzett levegő kondenzátumában levő NO anyagcseretermékekre. Meghatároztuk bizonyos NO metabolitok
(nitrit,
nitrát,
nitrotirozin)
mennyiségét
egészséges,
habituális
dohányosokban, néhány órás dohányzási absztinenciát követően és dohányzás után közvetlenül. A habituális dohányzók absztinenciát követő mérési eredményei reprezentálhatják a cigarettafüst krónikus inhalációja által kiváltott hosszútávú hatást, a cigaretta elszívását közvetlenül követő értékek pedig a dohányzás akut effektusát az NO anyagcseretermékekre. A kérdést azért is tartottuk figyelemre méltónak, mert ismert tény, hogy az FENO koncentrációja csökken a rendszeres dohányzóknál, mely jelenség magyarázata még nem kellően tisztázott (18, 19). Vizsgálati eredményeink azt bizonyították, hogy habituális dohányzóknál az FENO szignifikánsan csökkent, nem-dohányzó, egészséges egyének hasonló adataival összehasonlítva, mely egybeesik előző tanulmányok megfigyeléseivel (18, 19). Ugyanakkor nem tapasztaltunk szignifikáns különbséget az NO2-, NO2- + NO3-, és nitrotirozin koncentrációjában a két csoport között a dohányzási absztinenciát követő alapadatoknak tekintett - paramétereket illetően. Két szál cigaretta elszívását követően 30 perccel az FENO értéke nem változott, ugyanakkor az NO oxidációs metabolitjának (NO2- + NO3-) szintjében szignifikáns emelkedést tapasztaltunk. Ez a koncentrációnövekedés átmenetinek bizonyult, mivel a 90 perces mérésnél az NO2- + NO3- szintje visszatért a kiindulási értékre. Számos kutatás foglalkozik a dohányzás légutakra gyakorolt káros hatásának megfejtésével. A cigarettafüst által provokált oxidatív stressz többféle módon jön létre. Egyrészt a füst önmaga is oxidánsok gazdag forrása: egyetlen szippantás cigaretta körülbelül 1017 oxidáns molekulát és magas koncentrációban NO-t és CO-t tartalmaz 48
(20). E monoxidok direkt úton is képesek az NO termelődés csökkentésére a NOS gátlásán keresztül (23, 90). Ezen kívül azonban más - még nem ismert - mechanizmusok is szerepet játszhatnak az FENO csökkentésében. Habituális dohányzás kapcsán a légúti nyálkahártyában gyulladás alakulhat ki, mely tovább generálhatja a PMN sejtekből és macrophagokból eredő oxidáló hatással rendelkező kémiai anyagok, például superoxid felszaporodását (21, 22, 91). A dohányzóknál tapasztalható FENO koncentráció csökkenésére többféle magyarázat lehetséges. Egyrészt feltételezhető az NO képződés csökkenése cNOS downreguláció következtében (18), de ugyanakkor nem zárható ki az NO fokozott metabolizmusa, vagy az NO fokozott koncentrálódása a légutak epitheliális felszínén, bioequivalens nitrogén-oxidok például peroxinitrit és/vagy S-nitrozotiol formájában (81). Kiindulva abból a megfigyelésből, hogy az FENO szint alacsonyabb a dohányosoknál, ugyanakkor a superoxid koncentráció emelkedett, feltételezhető, hogy fokozott NO metabolizmussal (is) állunk szemben. Tanulmányunkban a rendszeres dohányzóknál csökkent FENO értékeket mértünk, ugyanakkor nem tapasztaltunk különbséget az NO metabolitokat illetően a dohányosok - absztinenciát követő alapadatai - és egészséges, nem-dohányzó kontroll csoportok értékei között. Vizsgálati eredményeink azt jelzik, hogy a cigaretta által indukált exogén oxidatív stressznek in vivo nem detektálható hosszútávú hatása az NO oxidációjára. Ez arra utal, hogy a dohányosoknál tapasztalt krónikusan csökkent FENO inkább a csökkent NO képződésnek (csökkent NOS termelődés következtében) köszönhető, mint fokozott metabolizmusnak. A dohányzás akut hatását vizsgálva az irodalom némiképp különböző adatokat közöl. Míg Kharitonov és munkatársai (18) a dohányzást követően 5 perccel szignifikánsan csökkent FENO-t mértek - ebből cNOS csökkent expressziójára következtetve -, addig Chambers és munkatársa enyhe, de állandó FENO emelkedésről számolnak be közvetlenül a cigaretta expozíció után (81). E tanulmány arra következtet, hogy az NO a légutak epitheliális felszínén un. "csapdában" biológiailag ekvivalens nitrogén-oxidok formájában tárolódik. Feltételezhető, hogy az NO különböző oxidatív metabolit formájában való megkötése a légutak felszínén redox-szenzitív.
49
Saját tanulmányunk a - dohányzás azonnali hatását illetően - részben ez utóbbi hipotézist támogatja, mivel szignifikáns, tranziens emelkedését tapasztaltunk az NO2- + + NO3- szintjében cigaretta expozíciót követően, ugyanakkor nem volt különbség az NO2- és nitrotrirozin szintekben. Az NO3 emelkedése a NO2-vel szemben azzal a megfigyeléssel magyarázható, hogy az aktivált PMN-ekből felszabaduló superoxid anion képes felhasználni, így csökkenteni az NO szintet azáltal, hogy nitráttá konvertálja. Valószínű, hogy savas kémhatású körülmények között - mely jellemző a sejtek lízise és pusztulása esetén - a nitrit nitráttá alakul (67). Mindez arra utal, hogy a dohányzás befolyásolja az NO biokémiáját és reaktív nitrogén metabolitok tranziens emelkedését okozza. Nem tapasztaltunk szignifikáns különbséget a dohányzók és a nem-dohányzók között a kilégzett levegő kondenzátum nitrotirozin szintjében sem a kiindulási adatokat illetően, sem 2 cigaretta elszívását követően. Magyarázatként feltételezhető, hogy a cigarettafüst önmaga is csökkentheti a nitrotirozin képződést, vagy fokozhatja annak lebomlását. Adataink azt jelzik, hogy a cigaretta hatására indukálódó akut oxidatív stressz a légutakban lokálisan fokozott oxidatív anyagcserét idézhet elő, mely az NO fokozott oxidációját okozva, átmenetileg emelkedett koncentrációjú oxidatív metabolithoz vezet. Mivel
az
NO
metabolitok
emelkedése
átmeneti
volt,
valószínű,
hogy
a
keringésirendszeren és a tüdő antioxidáns rendszerén keresztül ezek hamar közömbösítődnek és elszállítódnak a légutakból. Összegzésként levonhatjuk azt a következtetést, hogy a cigaretta módosíthatja az NO anyagcseréjét, elősegíti az NO fokozott oxidációját, átmenetileg emelve az oxidatív hatású köztestermékek koncentrációját, hozzájárulhat a cigarettafüst inhalációjának a légutakra gyakorolt káros hatásaihoz. Azon tény, hogy a cigarettafüst által okozott krónikus exogén oxidatív stressz ellenére rendszeres dohányzóknál ugyanannyi NO metabolitot mértünk a kilégzett levegő kondenzátumában, mint egészséges egyéneknél (néhány órás absztinenciás periódus után), azt mutatja, hogy az NO anyagcseretermékek mennyisége hosszútávon nem változik a dohányosoknál, és valószínűleg a szervezet védekező
mechanizmusai
segítenek
a
reaktív
metabolitok
viszonylag
gyors
eliminálásában. Ezt támasztja alá az is, hogy az NO és tiol vegyületek interakciója 50
kapcsán
képződő
nitrozotiol
mennyisége
emelkedett
dohányosok
kilégzett
kondenzátumában, egészséges egyének hasonló adataihoz képest, jelezve, hogy az NO oxidatív metabolitjait a szervezet ezen az úton is közömbösítheti (81). A
dohányzás
légutakra
gyakorolt
káros
effektusainak
kialakulásában
természetesen az NO anyagcseretermékein kívül egyéb kémiai anyagok is részt vesznek, mint például hydrocarbonátok (pentán, etán) (92, 93), és eicozanoidok (8izoprosztán) (94). Eredményeink arra engednek következtetni, hogy a tüdőben képződött NO egy része oxidatív átlakuláson megy keresztül, mely szerepet játszhat a csökkent FENO kialakulásában. Az oxidatív stressz következtében létrejött oxidáns gyökök káros hatása hozzájárulhat a légúti epitheliális sejtek károsodásához akár CF-ben, akár dohányosoknál.
51
7. KÖVETKEZTETÉSEK A légutakban fennálló tartós oxidatív stressz módosítja az NO metabolizmusát. Attól függően, hogy az oxidatív hatású anyagok endogén vagy exogén úton kerülnek a tüdőbe, különböző NO metabolitok mennyiségi emelkedését tapasztaltuk. Ez arra utal, hogy az FENO csökkenését az NO fokozott „felhasználódása” okozza - reaktív oxigén gyökökkel való kapcsolódás következtében -, azonban ennek mechanizmusa és a végtermékei különböznek endogén és exogén oxidatív stressz esetén. 1. Nitrotirozin kimutatható egészséges egyének és CF-s betegek kilégzett levegő kondenzátumában. 2. A CF-s betegek kilégzett kondenzátumában levő emelkedett nitrotirozin szint fokozott nitrotirozin képződésre utal. Ez reaktív nitrogén gyökök fokozott képződését jelzi. 3. A reaktív nitrogén gyökök CF-ben - nagyobb részt - feltehetőleg granulocita peroxidázok által facilitált direkt nitráció útján jönnek létre. 4. A nitrotirozin, amely a légutakban képződik és mérhető a kilégzett levegő kondenzátumában, az oxidatív stressz markereként szolgálhat CF-s betegeknél. 5. Cigaretta expozíció módosítja az NO anyagcseréjét, elősegíti az NO fokozott oxidációját, átmenetileg emelve az oxidatív hatású metabolitok koncentrációját. 6. Az NO oxidációs metabolitok szintjének tranziens növekedése hozzájárulhat a cigarettafüst inhalációjának a légutakra gyakorolt káros hatásához. 7. A cigarettafüst okozta exogén oxidatív stressznek nem volt hosszútávú hatása az NO metabolitokra. Ez arra utal, hogy dohányzás után a szervezet anitoxidáns rendszerei gyorsan közbelépnek és eliminálják az NO oxidatív köztestermékeket.
8. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Köszönetet szeretnék mondani mindazoknak, akikkel eddigi pályám során volt szerencsém megismerkedni, együtt dolgozni. Köszönettel tartozom témavezetőmnek, Dr. Horváth Ildikónak, aki a kezdet kezdetétől egyengette az utamat, megszervezte számomra, hogy ösztöndíjam ideje alatt Londonba, Barnes Professzor által vezetett Asthma Laboratoriumba kerüljek. Mind tanulmányutam előtt, mind az alatt és hazatérésem után felbecsülhetetlen szakmai és baráti segítséget nyújtott. Személyében kiváló tudóst és embert ismerhettem meg. Végül szeretném megköszönni a tézisek alapjául szolgáló kéziratok elkészítésében nyújtott segítségét. Köszönetet
szeretnék
mondani
Peter
J.
Barnes
professzornak,
hogy
laboratóriumában dolgozhattam Angliában, Londonban a National Heart and Lung Institute Thoracic Department-jében. Köszönettel tartozom a Magyar Tüdőgyógyász Társaságnak, hogy ösztöndíjat biztosítottak számomra, mely lehetővé tette külföldi tanulmányutamat. Külön köszönettel tartozom Kraszkó Pál professzornak, aki támogatást, biztatást adott eddigi egész pályámon, biztosította számomra a lehetőséget a tudományos munkára, és ráirányította figyelmemet a mindennapi klinikai munka szépségeire. Ugyanakkor köszönetet szeretnék mondani a Deszki Tüdőkórház Tanszékén dolgozó orvosoknak, akik távollétem ideje alatt helytálltak és a kórházi munka rámeső részét felvállaltak. Külön köszönetet érdemel családom, gyermekeim és barátaim: Dr. Szalontai Klára, Dr. Lányi Cecília azért, hogy a nehéz pillanatokban mindvégig támogattak.
9. IRODALOMJEGYZÉK 1. Barnes P J. Nitric oxide and airway diseases. Ann. Med. 1995; 27:389-93. 2. Moncada S, Palmer R M J, Higgs E A. Nitric oxide: physiology, pathophysiology and pharmacology. Pharmacol. Rev. 1991; 43:109-141. 3. Moncada S, Palmer R M J, Higgs E A. Biosynthesis of nitric oxide from L-arginine. A pathway for the regulation of cell function and communication. Biochem. Pharmacol. 1989; 38: 1709-1715. 4. Barnes P J, Kharitonov S A. Nitric oxide: a new lung function test. Thorax 1996; 51: 233-7 5. Kharitonov S A, Barnes P J. Clinical aspects of exhaled niric oxide. Eur Respir J 2000; 16: 781-792. 6. Kharitonov S A, Yates D, Robbins R A, Logan-Sinclair, Shinebourne E, Barnes P J. Increased nitric oxide in exhaled air of asthmatic patients. Lancet 1994; 343: 133135 7. Alving K, Weitzberg E, Lundberg J M. Increased amount of nitric oxide in exhaled air of asthmatics. Eur Respir J. 1993; 6: 1368-1370. 8. Mazaik W, Loukides S, Culpitt S V, Sullivan P, Kharitonov S A, Barnes P J. Exhaled nitric oxide in chronic obstructive pulmonary disease, Am J Respir Crit Care Med. 1998; 157: 998-1002. 9. Kharitonov S A, Wells A U, O’Connor B J, Hansell D M, Cole P J, Barnes P J. Elevated levels of exhaled nitric oxide in bronchiectasis. Am J Respir Crit Care Med.1995; 151: 1889-93. 10. Kharitonov S A, Yates D H, Barnes P J. Increased nitric oxide in exhaled air of normal human subjects with upper respiratory infections. Eur Respir J. 1995; 12: 295-297. 11. Grasemann H, Michler E, Wallot M, Ratjen F. Decreased concentrations of exhaled nitric oxide (NO) in patients with cystic fibrosis. Pediatr Pulmonol. 1997; 24: 173177. 12. Ho L P, Innes J A, Greening A P. Nitrite levels in breath condensate of patients with cystic fibrosis is elevated in contrast to exhaled nitric oxide. Thorax 1998; 53: 680684.
13. Grasemann H, Ratjen F. Cystic fibrosis lung disease: The role of nitric oxide. Pediatr Pulmonol. 1999; 28: 442-448. 14. Elpick H E, Demoncheaux E A, Ritson S, Higenbottam T W, Everard M L. Exhaled nitric oxide is reduced in infants with cystic fibrosis, Thorax 2001; 56: 151-152. 15. Thomas S R, Kharitonov S A, Scott S F, Hodson M E, Barnes P J. Nasal and exhaled nitric oxide is reduced in adult patients with cystic fibrosis and does not correlate with cystic fibrosis genotype. Chest 2000; 117: 1085-1089. 16. Kelley T J, Drumm M L. Inducible nitric oxide synthase expression is reduced in cystic fibrosis murine and human airway epithelial cells. J Clin Invest. 1998; 102: 1200-1207. 17. Meng Q H, Springall D R, Bishop A E. Lack of inducible nitric oxide synthase in bronchial epithelium: a possible mechanism of susceptibility to infection in cystic fibrosis. J Pathol 1998; 184: 323-331. 18. Kharitonov S A, Robbins R A, Yates D, et al. Acute and chronic effects of cigarette smoking on exhaled nitric oxide. Am J Respir Crit Care Med 1995; 152: 609-12. 19. Schilling J, Holzer P, Guggenbach M, et al. Reduced endogenous nitric oxide in the exhaled air of smokers and hypertensives. Eur Respir J 1994; 7: 467-471. 20. Pryor W A, Stone K. Oxidants in cigarette smoke: radicals, hydrogen peroxide, peroxynitrate, and peroxynitrite. Ann N Y Acad Sci 1993; 686: 12-28. 21. Ludwig P W, Hoidal J R. Alterations in leukocyte oxidative metabolism in cigarette smokers. Am Rev Respir Dis 1982; 126: 977-980. 22. Hubbard R C, Ogushi F, Fels G A, et al. Oxidants spontaneously released by alveolar macrophages of cigarette smokers can inactivate the active site of α1antitrypsin, rendering it ineffective as an inhibitor of neutrophil elastase. J Clin Invest 1987; 80: 1289-1295. 23. Assreuy J, Cunha F Q, Liew F Y, et al. Feedback inhibition of nitric oxide synthase by nitric oxide. Br J Pharmacol 1993; 108: 833-837. 24. Beckman J S, Koppenol W H. Nitric oxide, superoxide, and peroxynitrite: the good, the bad, and the ugly. Am J Physiol 1996. 271 (Cell Physiol. 40): C1424-37.
55
25. Ischiroppoulos H. Biological Tyrosine Nitration: A Pathophysiological Function of Nitric Oxide and Reactive Oxygen Species. Arch of Biochem and Biophys. 1998; 356(1): 1-11. 26. Linnane J S, Keatings V M, Costello C M, Moynihan J B, O'connor B, Fitzgerald M X, McLoughlin P. Total sputum nitrate plus nitrite is raised during acute pulmonary infection in cystic fibrosis. Am J Respir Crit Care Med 1998; 158: 207-212. 27. Vyas J R, Currie A E, Shuker D E, Field D J, Kotecha S. Concentration of nitric oxide products in bronchoalveolar fluid obtained from infants who develop chronic lung disease of prematurity. Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed. 1999; 81(3): F21720. 28. Barnes P J, Kharitonov S A. Non-invasive monitoring of airway inflammation: exhaled breath condensate. Info Special Edition 2001; 1: 3-7. 29. Kharitonov S A, Barnes P J. Exhaled markers of pulmonary disease. Am J Respir Crit Care Med 2001; 163: 1693-1722. 30. Tayeh M A, Marletta M A. Oxidation of L-arginine to nitric oxide, nitrite, and nitrate: Tetrahydrobiopterin is required as a cofactor. J Biol Chem 1989; 264: 19654-19658. 31. Kwon N S, Nathan C F, Gilker C, Griffith O W, Matthews D, Stuehr D J. Lcitrulline production from L-arginine by macrophage nitric oxide synthase: The ureido oxygen derives from dioxygen. J.Biol.Chem 1990; 265: 13442-13445. 32. Hecker M, Sessa W C, Harris H J, Anggard E E, Vane J R. The metabolism of Larginine and its significance for the biosynthesis of endothelium-derived relaxing factor. Cultured endothelial cells recycle L-citrulline to L-arginine. Proc Natl Acad Sci USA 1990; 87: 8612-8616. 33. Palmer R M J, Ferrige A G, Moncada S. Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor. Nature 1987; 327: 524-6. 34. van der Vliet A, Eiserich J P, Shigenaga M K, et al. Reactive nitrogen species and tyrosine nitration in the respiratory tract. Am J Respir Crit Care Med 1999; 160: 1-9. 35. van der Vliet A, Smith D, O'Neill C A, Kaur H, Darley-Usmar V, Cross C E, Halliwell B. Interactions of peroxynitrite with human plasma and its constituents: oxidative damage and antioxidant depletion. Biochem.J. 1994; 303: 295-301. 56
36. Carreras M C, Pargament G A, Catz S D, Poderoso J J, Boveris A. Kinetics of nitric oxide and hydrogen peroxide production and formation of peroxynitrite during the respiratory burst of human neutrophils. FEBS Lett. 1994; 341: 65-68. 37. Ischiropoulos H, Zhu L, Beckman J S. Peroxynitrite formation from macrophagederived nitric oxide. Arch Biochem Biophys. 1992; 298: 446-451. 38. Kobzik L, Bredt D S, Lowenstein C J, Drazen J, Gaston B, Sugarbaker D, Stamler J S. Nitric oxide synthase in human and rat lung: immunocytochemical and histochemical localization. Am J Respir Cell Mol Biol. 1993; 9: 371-377. 39. Matalon S, Hu P, Ischiropoulos H, Beckman J S. Peroxynitrite inhibition of oxygen consumption and ion transport in alveolar type II pneumocytes. Chest 1994; 105: 74S. 40. Gaston B, Drazen J M, Loscalzo J, et al. The biology of nitrogen oxides in the airways. Am J Respir Crit Care Med 1994; 149: 538-51. 41. Radi R J, Beckman J S, Bush K M, et al. Peroxynitrite oxidation of sulfhydryls. J Biol Chem 1991; 266: 4244-4250. 42. Beckman J S. Oxidative damage and tyrosine nitration from peroxynitrite. Chem Res Toxicol. 1996; 9: 836-844. 43. Sadeghi-Hashjin G, Folkerts G, Henricks P A J, Verheyen K P, Linde H J, Ark I, Coene A, Nijkamp F P. Peroxynitrite induces airway hyperresponsiveness in guinea pigs in vitro and in vivo. Am J Respir Crit Care Med. 1996; 153: 1697-1701. 44. Haddad I Y, Ischiropoulos H, Holm B A, Beckman J S, Baker J R, Matalon S. Mechanism of peroxynitrite induced injury to pulmonary surfactants. Am J Physiol. 1993; 265: L555-L564. 45. Wizeman T, Gardner C, Laskin J, Quinones S, Durham S, Goller N, Ohnishi T, Laskin D. Production of nitric oxide and peroxynitrite in the lung during acute endoxemia. J Leukoc Biol. 1994; 56: 759-768. 46. Ischiropoulus H, al-Mehdi A B, Fisher A B. Reactive species in ischemic rat lung injury: contribution of peroxynitrite. Am Physiol 1995; 269: L158-L164. 47. Eiserich J P, Hristova M, Cross C E, Jones A D, Freeman B A, Halliwell B, van der Vliet
A.
Formation
of
nitric
oxide-derived
inflammatory
myeloperoxidase in neutrophils. Nature 1998; 391: 393-397. 57
oxidants
by
48. Kaminsky D A, Mitchell J, Carroll N, James A, Soultanakis R, Janssen Y. Nitrotyrosine formation in the airways and lung parenchyma of patients with asthma. J Allergy Clin Immunol. 1999; 104: 747-754. 49. Wink D A, Kasprzak K S, Maragos C M, Elespuru R K, Misra M, Dunams T M, Cebula T A, Koch W H, Andrews A W, Allen J S. DNA deaminating ability and genotoxicity of nitric oxide and its progenitors. Science. 1991; 254: 1001-1003. 50. Parks N J, Krohn K A, Mathis C A, et al. Nitrogen-13-labelled nitrite and nitrate: distribution and metabolism after intratracheal administration. Science. 1981; 212: 58-61. 51. Anonymus. Recommendations for standardized procedures of the online and offline measurement of exhaled lower repiratory nitric oxide and nasal nitric oxide in adults and children. Am J Respir Crit Care Med. 1999; 160: 2104-2117. 52. Kroncke K, Fehsel D K, Kolb-Bachofen V. Niric oxide: cytotoxicity versus cytoprotection-how, why, when and where? Nitric oxide:Biol. Chem 1997; 1: 107120. 53. Sidorenko G I, Zborovskii E I, Levina D I. Surface-active properties of the exhaled air condensate (a new method of studying lung function). Ter Arkh. 1980; 52: 65-68. 54. Horvath I, Donnelly L E, Kiss A, Kharitonov S A, et al. Combined use of exhaled hydrogen peroxide and nitric oxide in monitoring asthma Am J Respir Crit Care Med. 1998; 158: 1042-1046. 55. Hanazawa T, Kharitonov S A, Oldfield W, Barnes P J. Nitrotyrosine and cystenyl leukotrienes in breath condensate are increased after withdrawal of steroid treatment in patients with asthma. Am J Respir Crit Care Med. 2000; 161: A919. 56. Goncharova V A, Brisenko L V, Dotsenko E K, Pokhaznikova M A. Kallikreinkinin indices and biological composition of exhaled condensate in acute bronchitis patients with varying disease course. Klin Med. 1996; 74: 46-48. 57. Montuschi P, Ciabattoni G, Paredi P, Kharitonov S A, Barnes P J. 8-Isoprostane as a biomarker of oxidative stress in interstitial lung diseases. Am J Respir Crit Care Med. 1998; 158: 1524-1527.
58
58. Montuschi P, Kharitonov S A, Carpagnano E, Culpitt S V, Russell R, Collins J V, Barnes P J. Exhaled prostaglandin E2:a new biomarker of airway inflammation in COPD (abstract). Am J Respir Crit Care Med. 2000; 161: A821. 59. Reinhold P, Langennberg A, Becher G, et al. Breath condensate - a medium obtained by a noninvasive method for the detection of inflammation mediators of the lung. Berl Munc Tierarzt Wochennschr. 1999; 112: 254-259. 60. Dweik R A, Laskowski D, Abu-Soud H M, et al. Nitric oxide synthesis in the lung. Regulation by oxygen through a kinetic mechanism. J Clin Invest 1998; 101: 660666. 61. O’Donnell D M, Noyniham J, Finlay G A, et al. Exhaled nitric oxide and bronchoalveolar lavage nitrite/nitrate in active pulmonary sarcoidosis. Am J Respir Crit Care Med. 1997; 156: 1892-1897. 62. Grasemann H, Ioannidis I, Tomkiewicz R P, de Groot H, Rubin B K, Ratjen F. Nitric oxide metabolites in cystic fibrosis lung disease. Arch Dis Child. 1998; 78: 49-53. 63. Cunningham S, McColm J R, Ho L P, Greening A P, Marshall T G. Measurement of inflammatory markers in the breath condensate of children with cystic fibrosis. Eur Resp J. 2000; 15: 955-957. 64. Hunt J, Byrns R E, Ignarro L J, Gaston B. Condensed expirate nitrite as a home marker for acute asthma. Lancet. 1995; 346: 1235-1236. 65. Vukomanovic D V, Hussain A, Zoutman D E, Marks G S. Brien J F, Nakatsu K. Analysis of nanomolar S-nitrosothiol concentration in physiological media. J Pharmacol Toxicol Method. 1988; 39: 235-240 66. Hou Y, Wang J, Arias F, Echegoyen L, Wang P G. Electrochemical studies of Snitrosothiols. Bioorg Med Chem Lett. 1988; 8: 3065-3070. 67. Wink D A, Kim S, Coffin D, Cook J C, Vodovotz Y, Chistodoulou D, Jourdheuil D, Grisham M B. Detection of S-nitrosothiols by fluorimetric and colorimetric methods. Methods Enzymol. 1999; 301: 201-211. 68. Marzinzig M, Nussler A K, Stadler J, Marzinzig E, Barthlen W, Nussler N C, Beger H G, Morris S M, Brückner U B. Improved methods to measure end products of
59
nitric oxide in biological fluids: nitrite, nitrate, and S-nitrosothiols. Biology and Chemistry. 1997; 2: 177-189. 69. Gabazza B, Taguchi O, Tamaki S, Murashima S, Kobayashi H, Yasui H, Kobayashi T, Hataji O, Adachi Y. Role of nitric oxide in airway remodelling. Clin Sci. (Colch) 2000; 98: 291-294. 70. Gaston B, Sears S, Wods J, Hunt J, Ponaman M, McMahon T, Stamler J S. Bronchodilator S-nitrosothiol deficiency in asthmatic respiratory failure. Lancet. 1998; 351: 1317-1319. 71. Kharitonov S A, Donnelly L E, Corradi M, Montuschi P, Barnes P J. Dosedependent onset and duration of action of 100/400 mcg budesonide on exhaled nitric oxide and related changes in other potential markers of airway inflammation in mild asthma Am J Respir Crit Care Med. 2000; 161: A186. 72. Ichinose M, Sugiura H, Yamagata S, Koarai A, Shirato K. Increase in reactive nitrogen species production in chronic obstructive pulmonary disease airways. Am J Respir Crit Care Med. 2000; 162: 701-706. 73. Magyar P, Hutás I, Vastag P. Pulmonológia 1998; Ed. Med. Könyvkiadó 270-275. 74. Jones K L, Hegab A H, Hiffman B C, Simpson K L, Jinkins P A, Grisham M B, Owens M W, Sato E, Robbins R A. Elevation of nitrotyrosine and nitrate concentration in cystic fibrosis sputum. Pediatr Pulmonol. 2000; 30: 79-85. 75. van der Vliet A, Nguyen M N, Shigenaga M K, Eiserich J P, Marelich G P, Cross C E. Myeloperoxidase and protein oxidation in cystic fibrosis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2000; 279(3): L537-46. 76. Corradi M, Montuschi P, Donnelly L E, Pesci A, Kharitonov S A, Barnes P J. Increased nitrosothiols in exhaled breath condensate in inflammatory airway diseases. Am J Respir Crit Care Med. 2001; 163: 854-858. 77. Robbins R A, Millatmal T, Lassi K, et al. Smoking cessation is associated with an increase in exhaled nitric oxide. Chest. 1971; 12: 313-8. 78. Belensky S N, Robbins R A, Rennard S I, Gossman R, Nelson K J, Rubinstein I. Inhibitors of nitric oxide synthase attenuate neutrophil chemotaxis in vitro. J Lab Clin Med. 1993; 122: 388-394.
60
79. Bosken C M, Hards J, Gatter X, Hogg J C. Characterization of the inflammatory reaction
on
the
peripherial
airways
of
cigarette
smokers
using
immunocytochemistry. Am Rev Respir Dis. 1992; 145: 911-917. 80. Haynes W G, Noon J P, Walker B R, Webb D J. L-NMMA increases blodd pressure in man. Lancet. 1993; 342: 931-932. 81. Chambers D C, Tunnicliffe W S, Ayres J G. Acute inhalation of cigarette smoke increases lower respiratory tract nitric oxide concentrations. Thorax. 1998; 53: 677679. 82. Witko-Sarsat V, Allen R C, Paulais M, Nguyen A T, Bessou G, Lenoir G, Descamps-Latscha B. Disturbed myeloperoxidase-dependent activity of neutrophils in cystic fibrosis homozygotes and heterozygotes, and its correction by amiloride. J Immunol. 1996; 15; 157(6): 2728-35. 83. Eisherich J P, Cross C E, Jones A D, Halliwell B, van der Vliet A. Formation of nitrating and chlorinating species by reaction of nitrite with hypochlorous acid: a novel mechanisms for nitric oxide-mediated protein modification. J Biol Chem 1996: 271: 19199-19208 84. van der Vliet A, Eisherich J P, Halliwell B, Cross C E. Formation of reactive nitrogen species during peroxidase-catalysed oxidation of nitrite: a potential additional mechanism of nitric oxide-dependent toxicity. J Biol. Chem. 1997: 272: 7617-7625. 85. Hunt J F, Fang K, Malik R, Snyder A, Malhotra N, Platts-Mills T A, Gaston B. Endogenous airway acidification. Am J Respir Crit Care Med. 2000; 161: 694-699. 86. Conway S P, Watson A. Nebulised bronchodilators, corticosteroids, and rhDNase in adult patients with cystic fibrosis. Thorax 1997, 52 (Suppl 2): S64-S68. 87. Keatings V M, Jatakanon A, Worsdell Y M, Barnes P J. Effects of inhaled and oral glucocorticoids on inflammatory indices in asthma and COPD. Am J Respir Crit Care Med. 1997; 155(2): 542-8. 88. Hirsch J A, Zhang S P, Rudnick M P. Resting oxygen consumption and ventilation in cystic fibrosis Pediatr Pulmonol. 1989; 6: 19-26.
61
89. Wink D A, Hanbauer I, Krishna M C, et al. Nitric oxide protects against cellular damage and cytotoxicity from reactive oxygen species. Procl Natl Acad Sci USA 1993; 90: 9813-9817. 90. White K A, Marletta M A. Nitric oxide synthase is a cytochrome P-450 type hemoprotein. Biochemistry 1992; 31: 6627-6631. 91. Hoidal J R, Fox R B, LeMarbe P A, et al. Altered oxidative metabolic responses in vitro of alveolar macrophages from asymptomatic cigarette smokers. Am Rev Respir Dis 1981; 123: 85-89. 92. Paredi P, Kharitonov S A, Leak D, Ward S, Cramer D, Barnes P J. Exhaled ethane, a marker of lipid peroxidation, is elevated in chronic obstructive pulmonary disease. Am J Respir Crit Care Med 2000; 162: 369-373. 93. Do B K, Garewal H S, Clements-N C J, Penf Y M, Habib M P. Exhaled ethane and vitamin supplements in active smokers. Chest 1996; 110: 159-164. 94. Montuschi P, Collins J V, Ciabattoni G, Lazzeri N, Corradi M, Kharitonov S A, Barnes P J. Exhaled 8-isoprostane as an in vivo biomarker of lung oxidative stress in patients with COPD and healthy smokers. Am J Respir Crit Care Med 2000; 162: 1175-1177.
62
10. SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE KÖZLEMÉNYEK NEMZETKÖZI ÉS HAZAI FOLYÓIRATOKBAN: TÉMÁVAL KAPCSOLATOS SAJÁT PUBLIKÁCIÓK
10.1. Közlemények 1. Balint B, Kharitonov S A, Donnelly L E, Hanazawa T, Barnes P J. Increased nitrotyrosine in exhaled breath condensate in cystic fibrosis. Eur Resp J. 2001; 17: 1201-1207 2. Balint B, Donnelly L E, Hanazawa T, Kharitonov S A, Barnes P J. Increased nitric oxide metabolites in exhaled breath condensate after exposure to tobacco smoke. Thorax. 2001; 56: 456-461. 3. Bálint B, Csoma Zs, Herjavecz I, Horváth I. Kilégzett nitrogén-monoxid és szénmonoxid atópiás és nem-atópiás asztmás betegekben. Allergológiai és Klinikai Immunológia. 2001; 4: 43-46.
10.2. Könyvfejzetek 1. Balint B, Horváth I, Kharitonov S A, Barnes P J. Exhaled markers in cystic fibrosis. NATO ASI Book. 2001. London, UK (In press).
10.3. Előadáskivonatok 1. Balint B, Donnelly L E, Hanazawa T, Kharitonov S A, Barnes P J. Increased nitric oxide metabolites in exhaled breath condensate after smoking exposure. Eur Resp J. 2000;16: Suppl. 31.186S.1399. 2. Balint B, Donnelly L E, Hanazawa T Kharitonov S A, Barnes P J. Increased nitrotyrosine in exhaled breath condensate in cystic fibrosis. Eur Resp J. 2000; 16: Suppl. 31.512S.3574. 3. Balint B, Donnelly L E, Kharitonov S A, Barnes P J. The effect of smoking on nitrogen oxides of exhaled breath condensate. Am J Respir Crit Care Med. 2000; Suppl. 503/166.
4. Balint B, Donnelly L E, Hanazawa T et al. Nitric oxide metabolites in exhaled breath condensate and exhaled monoxides in cystic fibrosis patients. Am J Respir Crit Care Med. 2000; Suppl. 607/260.
10.4. A disszertációban fel nem használt közlemények 1. Bálint B. Pneumocystis carinii pneumonia HIV pozitiv betegben. Orv Hetil 1992; 29: 133(13): 785-6. 2. Bálint B, Makk L, Csanádi J, Kraszkó P. Hyperamylasemia primer tüdőcarcinoma esetén. Medicina Thoracalis. 1998.51.25-27. 3. Balint B, Somfay A, Kraszkó P. Diagnostic role of bronchial lavage in smear negative pulmonary tuberculosis. Tuberculosis past and present. 1999. Ed by Golden Book Publ., Hungary. 203-205. 4. Somfay A, Bálint B, Kurunczi F, Kraszkó Pál.Üreges infiltració pulmonális hipertoniával. Medicina Thoracalis. 1998; 51: 25-27. 5. Horváth I, Donnelly L E, Shoemark A, Balint B, Wilson R, Kharitonov S A, Barnes P J. Elevated level of nitrite, but not nitrate in exhaled breath condensate in bronchiectasis. Thorax-hoz közlésre beküldve.
10.5. A disszertációban fel nem használt előadáskivonatok 1. Balint B, Csoma Z, Mikos M, Herjavecz I, Horváth I. Exhaled monoxides in patients with extrinsic and intrinsic asthma Am J Respir Crit Care Med. 2000; Suppl. 519/483. 2. Balint B, Kharitonov S A, Kazuhiro I, Hart L, Hodson M E, Barnes P J. Increased interleukin-8 in exhaled breath condensate in unstable cystic fibrosis. Am J Respir Crit Care Med 2001; Suppl. 2. 3. Balint B, Kharitonov S A, Kemp M, Geddes D, Hodson M E, Barnes P J. Ionic composition of exhaled breath condensate in cystic fibrosis. Eur. Respir. J. 2001; Suppl. 33: 8: 158.
64
4. Csoma Zs, Kharitonov S A, Shahid S K, Balint B, Wilson N, Bush A, Barnes P J. Leukotrienes in exhaled breath condensate of children with asthma. Eur Respir J. 2001; Suppl. 33:38:P358. 5. Csoma Zs, Kharitonov S A, Shahid S K, Donnelly L E, Balint B, Wilson N, Bush A, Barnes P J. Nitric oxide metabolites in exhaled breath condensate of children with primary ciliary dyskinesia. Eur Respir J. 2001; Suppl. 33: 180: 1276. 6. Csoma Zs, Kharitonov S A Shahid S K, Balint B, Wilson N, Bush A, Barnes P J. Eicosanoids in exhaled breath condensate of children with primary ciliary dyskinesia. Eur Respir J. 2001; Suppl. 33:180: 1277. 7. Balint B, Kharitonov S A, Kazuhiro I, Hart L, Hodson M E, Barnes P J. Increased interleukin-8 in exhaled breath condensate in cystic fibrosis during acute exacerbation. Eur. Respir J. 2001; 33; 537: P3596. 8. Paredi P, Balint B, Peter J. Barnes, S A. Kharitonov. Slower rise in exhaled breath temperature in cystic fibrosis: a novel marker of airway disease. Eur Respir J. 2000; 31;512: P3576.
65
11.A. ÖSSZEFOGLALÓ Tanulmányunkban azt vizsgáltuk, hogy olyan állapotokban, ahol a légutakat érő fokozott oxidatív stressz ellenére csökkent FENO értéket detektálhatunk, hogyan változnak a tüdőben levő NO metabolitok egészséges egyének adataihoz viszonyítva. Erre két csoportot tartottunk alkalmasnak, egyrészt a cystás fibrosist (CF), mely betegségre a légutak krónikus gyulladása jellemző, másrészt a habituális dohányosokat, akik a cigarettafüst inhalációja által szintén fokozott oxidatív stressznek vannak kitéve. Mindkét állapotban a légúti gyulladások markereként szolgáló kilégzett nitrogénmonoxid (FENO) meglepő módon csökkent. Az NO metabolitokat a kilégzett levegő kondenzátumában mértük, mely a légúti váladék vételének új, non-invazív módszere. Mivel ismert, hogy az NO könnyen oxidálódik, feltételeztük, hogy az NO fokozott oxidatív metabolizmusa is szerepet játszhat a fenti állapotok esetén detektálható csökkent FENO kialakulásában. A reaktív NO gyökök kollektív indikátorának tekinthető stabil vegyület a 3-nitrotirozin. CF-s betegek kilégzett levegő kondenzátumának nitrotirozin koncentrációja szignifikánsan emelkedett egészséges egyének adataihoz viszonyítva. A kondenzátum nitrotirozin szintje és a tüdőbetegség súlyossága között inverz korrelációt tapasztaltunk. Nem találtunk különbséget a nitrit+nitrát szintekben CF-s betegek és egészségesek között. Eredményeink arra utalnak, hogy CF-ben a nitrotirozin emelkedése reaktív nitrogén gyökök kialakulát jelzi, mely peroxinitrit és/vagy granulocita peroxidáz úton jön létre. A kondenzátum nitrit, nitrit+nitrát, és nitrotirozin koncentrációjában nem volt különbség egészséges nem-dohányzók és dohányzók alapértékei között. Cigaretta expozíciót követően a nitrit+nitrát szintek átmeneti emelkedést mutattak, azonban nem volt változás az FENO és NO metabolitok (nitrit, S-nitrozotiol vagy nitrotirozin) koncentrációjában. Eredményeink arra engednek következtetni, hogy a tüdőben képződött NO egy része oxidálódik, mely szerepet játszhat az FENO csökkenésében. Az oxidatív stressz következtében létrejött oxidáns gyökök ártalmas hatásai hozzájárulhatnak a légúti epitheliális sejtek károsodásához akár CF-s betegeknél, akár dohányosoknál.
11.B. SUMMARY This study investigated the effect of oxidative stress on NO metabolites in exhaled breath condensate in two different conditions, where oxidative stress exists. We hypothised, that increased oxidative metabolism of NO may - partly - explain the decreased FENO in these conditions. Cystic fibrosis (CF) is characterized by recurrent pulmonary infections and increased oxidative stress leading to damage of airways. Cigarette smoking is associated also with increased oxidative stress in the lung. Suprisingly, exhaled nitric oxide (FENO), a marker of inflammation in airway diseases is decreased in either in CF patients or in habitual cigarette smokers. NO is a reactive molecule, which can be oxidised rapidly. The oxidation endproducts of NO metabolism are nitrite and nitrate. 3-nitrotyrosine is a stable product, which may indicate local formation of reactive nitrogen species. Analysis of exhaled breath condensate is a new non-invasive method for detection of changes in lung metabolism and the inflammatory status of the lung. Nitrotyrosine levels in breath condensate from stable CF patients were increased significantly compared to normal subjects. There was an inverse correlation between the levels of nitrotyrosine and the severity of lung disease. There was no difference in the levels of nitrite+nitrate between CF patients and normal subjects. The elevation in nitrotyrosine in CF may reflect increased formation of reactive nitrogen species such as peroxynitrite or direct nitration by granulocyte peroxidases, indicating increased oxidative stress in CF airways. There was no difference in the levels of condensate nitrite, nitrite+nitrate, and nitrotyrosine at the baseline visit between smokers and nonsmokers. After smoking, nitrite+nitrate levels significantly but transiently increased. There was no significant change in the levels of FENO, and other NO metabolites 30 and 90 minutes following smoking. These findings suggest that cigarette smoke can increase the levels of nitrate, but not nitrite, S-nitrosothiols or nitrotyrosine in breath condensate. Our results suggest that a considerable part of NO may be consumed by oxidation in the airways and it may take account for the decreased FENO. The deleterious effect of oxidant radicals induced by oxidative stress may contribute to the epithelial damage of airways seen in either CF or in smokers. 67
