Növényi szekunder metabolitok, alkaloidok

Pécs Miklós: Biotermék technológia 2.

Növényi szekunder metabolitok elıállítása

Növényi szekunder metabolitok, alkaloidok

Szekunder metabolitok Definíció: az elsıdleges anyagcsere termékeibıl képzıdı olyan anyagok, amelyeknek nem a szintetizáló sejt, hanem legfeljebb az egész szervezet szempontjából van jelentısége. A primer és szekunder metabolizmus között dinamikus egyensúly van, mely összetett szabályzás alatt áll. Kulcs enzimek: „átjárók” a két anyagcsere között, mennyiségük és aktivitásuk szabályozza a szekunder metabolitok termelését. → génmanipulációt ezeken érdemes végezni. Pl.: fenilammónia liáz: összekötı a primer anyagcsere és a fenil-propanoidok szintézise között triptofán-dekarboxiláz: az indol-alkaloidok szintéziséhez 2

ALKALOIDOK = növényi eredető, nitrogénatomot tartalmazó, szekunder metabolitok. = régi, empírikus név, arra utal, hogy a N-atom miatt legtöbbször bázikus természető molekulák = soknak erıs fiziológiai hatása van, lehetnek: élvezeti szerek: nikotin, koffein, teobromin gyógyszerek: opiátok, digitalisz kábítószerek: meszkalin, kokain toxinok (csak mérgezık): koniin, szolanin 3

BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék

1



A szekunder metabolitok funkciói Pigmentek (pl: berberin, sáfrány) - Aromák (pl: kakaó, kávé, főszerek) - mérgek (ehetetlenné teszik a növényt) - patogének elleni toxinok (pl: fitoncidok (pl az allicin a fokhagymában)), - tropán alkaloidok: gyökérben, más növények növekedését gátolják

4

Szekunder metabolitok felhasználása Gyógyszerekben: szívglikozid, morfin, kodein, szkopolamin, atropin, kinin Élelmiszeriparban: ízesítık, főszerek, színezékek (sáfrány,vanília) Kozmetikumokban: sikonin (rúzsokban), jázmin olaj (parfümökben)

5

Szekunder metabolitok elıállítása

A másodlagos anyagcseretermékeket elıállíthatjuk: 1. A növénybıl, vagy annak egy részébıl (drog) extrakcióval 2. Növényi szövettenyészettel

6


2



A szövettenyésztési út elınyei - bárhol megvalósítható (nem befolyásol ja a föld minısége, mérete, idıjárás, stb) → nem függ ettıl a termelés) - gazdaságosabb lehet (vizsgálni kell) - gyorsabb, több lehetıség kísérletezésre, az eredmények ellenırzésére - in vitro screening segítségével gyorsan, nagy egyedszámból kikereshetjük a nekünk megfelelıket, kis helyen - nagyobb hatóanyag koncentráció érhetı el (tenyésztési paraméterek változtathatók, optimálhatók)

7

A szövettenyésztés lehetıségei Kallusztenyészetben, szilárd táptalajon csak kis koncentrációban, a legtöbb szekunder metabolit esetén nem gazdaságos Szuszpenzióként fermentorban – gazdaságosabb A szubmerz fermentáció elınye: gyorsabban nı, mint a kallusz és homogén a tenyészet! Léptéknövelhetı! A szekunder metabolit képzıdés akkor gyorsabb, amikor nincs intenzív sejtosztódás (késı exponenciális fázisban) Hajszálgyökér tenyészetben (immobilizált) – Ri plazmiddal transzformált növényi szövet inert, üreges hordozón (pl. mőanyaghab) 8

Kallusztenyészet Differenciálatlan növényi szövet

sikonin termelı

9


3



Szuszpenziós tenyésztés fermentorban Nagy sejtek, nagy szövet halmazok → nehéz a homogén mintavétel és az élı sejtszám megadása A generációs idı nagy → fermentációs idı hosszú → termék drága kicsi a levegıigény: 1-10 mmol O2/l.h (1-10 % a baktériumokhoz viszonyítva) gáz és szubsztrát fogyasztási sebesség kicsi érzékeny a nyíró hatásra (keverıs fermentor általában nem megfelelı) általában szakaszos, ritkán rátáplálásos (fed batch) nagy inokulum nagyság szükséges (több lépés): 10 → 100 x (baktériumoknál: 1 → 100 x) 10

Mikrobákkal és növényi sejtekkel végzett fermentáció összehasonlítása

Jellemzı sejtméret növekedési sebesség inokulum mennyiség nyírásérzékenység oxigénigény

mikroorganizmus kicsi gyors kevés (max. 10%) érzéketlenek nagy

növény nagy lassú sok (10-20%) általában érzékenyek: lassú kavarás! kicsi

11

Hajszálgyökér (hairy root) kultúra Agrobacterium rhisogenes által okozott növényi betegség. Az Ri (root-inducing) plazmid beépül a növény genomjába, és differenciálódást okoz: hajszálgyökerek képzıdnek - ez a ”Hairy Root Disease”. Több mint 450 (elsısorban kétszikő) növényfaj érzékeny rá. Hasonlít az A. tumefaciens Ti plazmidja által okozott betegséghez, ennél is opinokat termel a növény. Az Ri plazmiddal is géneket lehet bevinni a növénybe → a génmanipulációhoz remek vektor. Teljes növény is regenerálható a hairy root-ból. A gyökérkultúra in vitro körülmények közt is jól szaporodik, nincs szükség fitohormonokra sem. Nagy mennyiségben is lehet termelni. 12


4



Hajszálgyökér kultúra Elınyei: – Gyorsabban nı – Nincs szükség fitohormonok adagolására – Olyan metabolitok is termelhetık, amik kallusztenyészetben nem, csak differenciált szövetben termelıdnek – Egyszerő tápoldat szervetlen komponensekkel 13

Fermentáció lépései, módszerei A megfelelı törzs kiválasztása (screenelés jó termelıre: szín, kémiai tulajdonságok, termelıképesség alapján) Szelekció, folyamatos törzsmunka: spontán ill. indukált mutációval jobb termelık keresése Tápanyagoptimalizálás tápoldat összetétele → akár tízszer több hatóanyag pH: általában 5-6.5 Hımérséklet: 15-32 oC Tápoldat sterilezése 14

Tápanyagigény Alap: MS táptalaj Szénhidrátok: szacharóz, glükóz, galaktóz, glicerin… Makroelemek: N, P, K, Ca, Mg, S Mikroelemek: Fe, Mn, Co, Cu, Zn, Mo, B Aminosavak: Glu, Asp, Ala, Pro, Gly Vitaminok Aktív szén: megköti a terméket v. inhibitor anyagokat Anyagcsere befolyásolása : - Prekurzorok adagolásával digoxin termelésnél: szteránvázas vegyületet (általában progeszteront) a tápoldatba adagolva elindul a termelés Rozmarinsavnál: tirozin a prekurzor 15


5



Elicitorok Anyagcsere befolyásolása : - Elicitorok alkalmazása: hatásuk hasonlít az indukcióra, egyes anyagcsereutakat aktiválnak, metabolittermelést segítı anyagok (pl. fitoalexinek) → hatás: a kulcsenzimek mennyiségét növelik 1. Biotikus elicitorok: Aspergillus, Alternaria, gomba homogenizátumok 2. Abiotikus elicitorok: nyomelemek (Cd, Cu, Va, mechanizmus nem mindig ismert) 3. Élesztıbıl kivont glükánok (oligoszacharidok) berberin termelésénél a Thalictrum rugosumból, sanguinarin termelésnél Eschscholtzia californiaból (8-10-szer több termék) 16

Fermentációs kinetika Rendszerint növekedéshez nem kötött termékképzıdés → külön kell optimálni a növekedési és a termékképzıdési szakaszra Termékképzıdéshez tápanyag limit szükséges (pl. foszfát) Hormonok szerepe: a 2,4-D segíti a növekedést, de drasztikusan csökkenti a termék képzıdést. Ezért a termékképzési szakaszban megvonják. (Eredetileg a növekedés csökkentéséért adagoltak kevesebb foszfátot és 2,4-D-t, majd rájöttek, hogy ennek szabályozó hatása van.) 17

kvasszin Akkor kezdenek felhalmozódni, amikor a tenyészet már nem nı tovább atropin

18


6



Fermentáció lépései, módszerei Immobilizálás: néha elınyös tenyésztésnél (ajmalicin) de különösen: biotranszformációknál (pl: Ca-alginát gélben digitoxin → digoxin) hajszálgyökértenyészetnél habszivacs alkalmazása, benövik a belsı üregeket Termékkinyerés: a) extracelluláris: sejtfeltárásra nincs szükség (alkaloid extracelluláris lesz → toluol hatására) b) intracelluláris (vakuólumokban, vezikulumokban halmozódik föl): a teljes feltárás nehézkes, általában csak a plazmamembránt roncsolják apoláris oldószerrel (pl n-hexadekánnal) 19

Bioreaktorok A növényi szuszpenziós tenyészet specifikus bioreaktort igényel, mert a tenyészet is különleges. Térfogat általában: 200-5000 liter Speciális jellemzık, kicsi produktivitás → relatíve drága berendezések Jellemzı reaktortípusok: - keverıs - air-lift - buborékkolonnás - töltött oszlop 20

Bioreaktorok immobilizált növényi sejtekhez • Tápoldat: kevés foszfát, nitrát, növekedési regulátorok • Sok szacharóz • A tápoldat cirkulál a sejtek körül →termékeket magával viszi →nincs feedback inhibíció • Lassú növekedés →akár 30 hét is! 21


7



Reaktorok „hairy root” kultúrákhoz

Hőtés/főtés lehetséges Airlift reaktor

22

Buborékkolonnás reaktor

Hasznos szekunder metabolitokat termelı növények Kémiai osztály cardenolide terpenoid alkaloid coumarin flavonoid anthraquinone glucosinolate

Szekunder metabolit digitoxin cycloartenol atropine caffeine scopoletin 1-maakiasin 7-methylpurpurin sinigrin

Termelı növény (más fajok is termelhetik) Digitalis purpurea Nicotiana tabacum Datura stramonium Coffea arabica Nicotiana tabacum Sophora augustifolia Digitalis lanata Wasaba japonica

Hétköznapi neve győszővirág dohány maszlag kávécserje dohány akácfajta győszővirág Japán zöldmustár

23

Iparban is használatos szekunder metabolitok hatóanyag codeine

növény Papaver somniferum (mák)

quinine

Cinchona ledgeriana

Felhasználás fájdalomcsillapító altatószer Maláriaellenes gyógyszer, keserő ízesítı (tonik ital)

Digitalis lanata szívgyógyszer (győszővirág) Atropa belladona A paraszimpatikus idegrendszrre hat, csillapítólag (nadragulya) vincristine Catharantus roseus Leukémia gyógyszer (rózsameténg) Crocus sativus crocin (saffron) Ételszinezék és ízesítı (sáfrány) vanillin Vanilla fragrans ételízesítı (vanília) Jasminium sp. jasmine oil Illatanyag parfümökben (jázmin) digoxin

atropine

24


8



Hajszálgyökér kultúra Elıállítanak vele: - Nikotin és piridin-alkaloidokat dohányból - Tropán alkaloidok nadragulyából - Berberin Coptis japonica-ból - Poliacetilének, indol-alkaloidok, polifenolok, flavonoidok

25

Ipari eredmények

Csak azon az anyagoknál gazdaságos, amelynél a növény növekedése nagyon lassú → a fermentáció elınyösebb lehet Kis mennyiségben → magas áron értékesítik Pl: sikonin, digoxin, taxol, dioszgenin, podophyllotoxin, vinkrisztin, vinblasztin 26

Mikor éri meg? Gazdaságos lehet a termelés ha: a termékre az igény min 50 M USD/év a termék ára 400-500 USD/kg felett van vagy: a biomassza: 40-60 g/l, a hatóanyag min. 2%

Termék Ajmalicin Jázmin olaj Borsmenta olaj

Ára 1500 USD/kg 5000 USD/kg 30 USD/kg

Igény 5 M USD/év 0,5 M USD/év 100 M USD/év

27


9



Szövettenyészetben gazdaságosan elıállítható hatóanyagok hatóanyag

alkalmazás

ár$/kg

ajmalicine serpentine codeine

Keingési problémák

1500

Köhögéscsillapító, leszoktató, altató szívgyógyszer

3000

digoxin diosgenin quinine

Éves igény (kg) (1990-es adatok) 3000

650

shikonin

Szteroid szintézis alapanyaga Malária ellen, Keserő ízesítı (tonik) antibakteriális, festékenyag

4500

vincristine vinblastine Jasmin

Leukémia ellen

5 000 000

kozmetikumokban

5 000

7700 USA 6000 USA 200 000 300 000 500 000 150 Japan 5

674 100

28

Ipari léptékben is alkalmazható szövettenyésztési technológiák Termék Shikonin Berberine Biomass Peroxidase Geraniol Rosmarinic acid Digoxin

Növényfaj Lithospermum erythrorhizon Coptis japonica Panax ginseng Raphanus Geranium Coleus blumei Digitalis lanata

Cég

Ország Japan Japan Japan Japan Japan Japan Németo.

Mitsui Mitsui Nitto Denki Toyobo Kanebo Natterman Boehringer

29

Shikonin gyártása tradicionális gyógyszer Japánban: Lithospermum erythrorhizon növény gyökerébıl Piros színő naftokinon pigment Gyulladáscsökkentı, égési sérülésekre is hat. HIV vírust gátolhatja? (kísérletek) Ipari méretben: 1983. Mitsui Petrochemical Co OH A tenyésztés két szakaszra osztható: - elsı szakasz: a sejtek elszaporítása - második szakasz: sikonin termelése Hairy root tenyészetben is termeltethetı OH ár: 4500 USD/kg.

O

O

OH

H3C

CH3

Sikonin

30


10



Shikonin gyártása Reaktor: keverıs v. airlift hatóanyag: 20 x, mint a növényben nagy hátrány: a termék intracelluláris, termék a vakuólumban és az organellumokban marad További koncentráció növelés: - Extrakció hidrofób oldószerrel: n- hexadekanollal és etanollal 8x-os shikoninszint - Extrakció és elicitor: 65x-ra nıtt a termék konc. Reaktortérfogat:750 l (viszonylag kicsi) 31

Shikonin gyártása

32

Berberin Izokinolin vázas alkaloid Erıs sárga szín → festékanyag

Emellett: Antibakteriális hatású, az emésztırendszeri betegségekre is hat, pl. gátolja a Helicobacter pylori kolonizációját a gyomor-, illetve a nyombél nyálkahártyáján) Immunserkentı hatás: aktiválja a makrofágokat Vérnyomáscsökkentı is. 33


11



Berberin Coptis japonica, Coptis chinensis, Berberis vulgaris, Thalictrum rugosum sóskaborbolya, stb termeli. Növénybıl vonják ki, de szövettenyészetben is termelik. Gyártásánál elicitor: élesztı glukán a növekedés egy bizonyos pontján kell adagolni a kívánt hatáshoz (Mitsui Co, J)

34

DIGITÁLISZ GLIKOZIDOK A győszővirág fajok (Digitalis purpurea, D. lanata) hatóanyagai. A szívizom ionháztartását befolyásolják, a Na-K-ATP-áz pumpa gátlásával meghoszszabbítják az akciós potenciál idejét, ezzel növelik a perctérfogatot. Szívelégtelenség esetén használják. Fı elıállítás: extrakció növénybıl, de mellette biokonverzió is 35

DIGITOXIN, DIGOXIN Kémiai szerkezet: Szteránvázas aglikon, + 3 cukor (digitoxóz, di-dezoxi cukor) Az aktív hatóanyag a digoxin, egyetlen OH csoportban tér el a kis aktivitású digitoxintól.

36


12



A digoxin elıállítása biokonverzióval

A növény jelentıs mennyiségő inaktív digitoxint is termel. Ez egy lépésben hidroxilezéssel átalakítható az aktív digoxinná. A konverziót nem mikroorganizmussal, hanem D. lanata szövettenyészetével végzik. Csak a differenciálódott sejtek képesek az átalakításra, a kallusz nem. 37

A digoxin elıállítása biokonverzióval Sejtszaporítás 5 napig, ezután 2 naponként digitoxin adagolás, összesen 15 nap. Melléktermékek: purpurea glikozid A és deacetil-lanatozid C Reaktor: 200 literes air-lift típusú, vagy immobilizált sejtes. Körülmények: 24 oC, levegıztetés Konverzió: ~67 %-os Hatóanyag extrakció: acetonitrillel

38

Dioszgenin elıállítás

Mexikói yam gyökér termeli. A gyökérgumóból extrahálták, de kísérleteztek szövettenyésztéssel is. Régebben jelentıs volt a termelése, ma már nem gazdaságos. Felhasználása: szteroid alapanyagként (ma inkább szitoszterolt használnak) Ösztrogén aktivitása is van (= fitoösztrogén) 39


13



ÓPIUM ALKALOIDOK A Papaver somniferum tucatnyi hasonló szerkezető vegyületet termel: morfin, kodein, narkotin, kotarnin, tebain, papaverin, stb. A kábítószerekhez a zöld mákgubó tejnedvét használják. Magyarországon: Kabay eljárás 40

KABAY ELJÁRÁSOK Két eljárást dolgozott ki: - teljes zöld máknövénybıl - száraz mákszalmából (ennél még a mák magját is fel lehet használni) Büdszentmihály

= Tiszavasvári 41

KABAY ELJÁRÁSOK Két eljárást dolgozott ki: - teljes zöld máknövénybıl - száraz mákszalmából (ennél még a mák magját is fel lehet használni) Büdszentmihály

= Tiszavasvári 42


14



KABAY ELJÁRÁSOK 2. Fı lépései: Extrakció híg savval (sóképzés) Tisztítás, koncentrálás, a bázis kicsapása lúggal Benzolos oldás – csak a morfin oldhatatlan Bepárlás, lúgos oldás – csak a narkotin oldhatatlan

43

MORFIN •Igen erıs kábító hatású fáj-dalomcsillapító. Fiziológiai és pszichológiai függıséget okoz, kábítószer. •Származékai: Etil-morfin (Dolor), Azidomorfin-bitartarát •Nagy dózisban légzésbénu-lást okoz. •Diacetil-morfin = heroin 44

KODEIN A morfintól egy metilcsoportban különbözik. Fájdalomcsillapító és euforikus hatása jóval gyengébb, viszont jó köhögés-csillapító. Ugyanazok a receptorok, mint a morfinnál, ezért annak pótlására, a kábítószer-elvonás tüneteinek enyhítésére alkalmas.

45


15



Tumorellenes növényi hatóanyagok Az antitumor hatású növényi szekunder metabolitokat már korábban tárgyaltuk. Mindegyiknél folynak kísérletek a gyártás szövettenyészetben való megvalósítására, mert a termelı növények: - Igen kis koncentrációban tartalmazzák a hatóanyagot - Korlátozottan hozzáférhetık - Nem vonhatók mezıgazdasági termesztésbe Az egyes anyagok tulajdonságait nem ismételjük meg, csak a szövettenyésztéssel kapcsolatos eredményeket foglaljuk össze. 46

Tumorellenes növényi hatóanyagok Taxol: a szövettenyésztésben nincs léptéknövelhetı eredmény. Kerülı út → a taxán alapváz termeltetésére törekednek, erre azután szintetikus lépésekkel teszik rá a funkciós csoportokat. Vinkrisztin, vinblasztin: a de novo bioszintézis nagyon keveset termel. Kerülı út → a növény nagyságrenddel több intermediert termel, mint végterméket. Ezeket (katarantin, vindolin) extrahálják, és prekurzorként adják a szövettenyészetbe. Lignánok: podophyllotoxin, arctigenin, trachelogenin Kallusztenyészetben nagyobb koncentráció, mint a növényben. 47

Fejlesztési irányok Megnövelt szekunder metabolit termelés → több hatóanyag → elérhetıbb gyógyszerek súlyos betegségekre - a kulcsenzimek konstitutívvá tétele: állandó szintézis, és nem csak a növekedési szakasz után. - a kulcsenzim bevitele több kópiában További kulcsenzimek, szők keresztmetszetek keresése, és ezek „tágítása” génmanipulációval. Mőködı példa: szkopalamin (tropán alkaloid) termelése, az enzim: hyoscyamin 6 β-hidroxiláz, Eredmény: ötszörös termelés 48


16



ANYAROZS (ERGOT) ALKALOIDOK A tucatnyi alkaloidot a természetben a gabonaparazita Claviceps purpurea fonalas gomba termeli. A fertızött gabonaszemek jellegzetes szkleróciumot (varjúköröm) alkotnak. Alkaloid mérgezés: ergotizmus, Szent Antal tüze, ignis sacer, bizserkór Gyártás: - fermentáció - mesterségesen fertızött gabonából extrakció 49

ANYAROZS ALKALOIDOK ERGOMETRIN: az amin-csoport miatt sóképzésre hajlamos, tartarát (ERGAM), vagy maleát formájában hozzák forgalomba. A szabad bázis vízben rosszul oldódik, etilacetáttal extrahálható, CCl4-dal együtt kristályosodik. Gyártása: a Claviceps gombát fermentálják, szekunder metabolit, lassú folyamat, 12-14 nap. Hatása: oxitocin jellegő, a méhizomzat összehúzódását okozza. A szülés megindítására, gyorsítására és a kapcsolatos vérzések csökkentésére használják. 50

ANYAROZS ALKALOIDOK Érösszehúzó hatása miatt migrénes rohamok kezelésére is jó. Adagja: 0,3 mg (picike) Ellenjavallat: terhesség. Az Ergometrin önmagában is gyógyszer, de a lizergsav és más származékok kiindulási anyaga is lehet.

51


17



ANYAROZS ALKALOIDOK ERGOTAMIN: másik típus, itt az alapvázon több-győrős tripeptid lóg. A különbözı aminosavak beépülése révén több hasonló molekula. Apoláros aminosav oldalláncok rosszabb vízoldhatóság. Erıs érösszehúzó hatású, ezzel a vérnyomást emeli. Szelektált Claviceps törzsekkel fermentálják.

52

ANYAROZS ALKALOIDOK Elimoklavin, lizergol, lizergsav → LSD

53

ANYAROZS ALKALOIDOK Az elimoklavint fermentálják, kinyerik → nyerstermék Átizomerizálják lizergollá – szintetikus lépés, toluolban, Al2O3-mal, a termék rá is kötıdik. Lizergolból több termék is lehet: - dihidro-lizergol, - nicergolin - lizergsav A lizergsavból → dietil-amid = LSD 54


18

Növényi szekunder metabolitok, alkaloidok

Recommend Documents