Szakdolgozat
Szekunder metabolitok tisztítása folyadék-folyadék kromatográfiával Lorántfy László Vegyész MSc hallgató Témavezető: Dr. Szekeres András Belső konzulens Dr. Torkos Kornél Eötvös Loránd Tudományegyetem 2012. Budapest
Fumoprep Kft 2012. Mórahalom
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS ..............................................................................................4 BEVEZETÉS ........................................................................................................................5 1.
IRODALMI RÉSZ........................................................................................................6 1.1.
Szekunder metabolitok ............................................................................................6
1.1.1.
Fumonizinek ...................................................................................................6
1.1.2.
Bacillus antibiotikumok ...................................................................................9
Bacillus lipopeptidek előállítása és tisztítása ................................................................. 10 1.2.
Centrifugális megoszlási kromatográfia (CPC) ...................................................... 10
1.2.1.
A CPC oldószer rendszerei ............................................................................ 11
1.2.2.
A CPC gyakorlata.......................................................................................... 13
1.2.3.
pH-gradiens alkalmazása, azaz a pH-zóna ..................................................... 15
1.2.4.
Affinitás kromatográfia CPC-vel ...................................................................17
1.3.
Különleges detektálási módszerek ......................................................................... 17
2)
CÉLKITŰZÉS ............................................................................................................ 19
3)
KÍSÉRLETI RÉSZ .....................................................................................................20 3.1.
Felhasznált vegyszerek .......................................................................................... 20
3.2.
Sejtkultúrák, mikrobiológiai törzsek és a fermentációk .......................................... 20
3.2.1.
Fusarium törzsek és fumonizin fermentáció .................................................. 20
3.2.2.
Bacillus törzsek és fengycin fermentáció ....................................................... 21
3.3.
Minták előkészítése ............................................................................................... 21
3.3.1.
Fumonizin minta előkészítése ........................................................................ 21
3.3.2.
Fengycin minta előkészítése .......................................................................... 21
3.4.
Megoszlási hányadosok megállapítása...................................................................21
3.5.
Centrifugális megoszlási kromatográfiás futások kivitelezése ................................ 22
3.5.1.
pH-zóna elválasztások ................................................................................... 23
3.5.2.
További tisztítások hagyományos CPC-vel .................................................... 24
3.6.
Analitikai vizsgálatok............................................................................................ 25
HPLC-CAD rendszer .................................................................................................... 25 HPLC-MS rendszer....................................................................................................... 25 Fengycin vékonyréteg-kromatográfiás (TLC) vizsgálata ............................................... 27
2
4.
MÉRÉSI EREDMÉNYEK ......................................................................................... 29 4.1.
Fumonizin tisztítása .............................................................................................. 29
4.1.1.
Fumonizin minta analitikai mérése és előkészítése......................................... 29
4.1.2.
Vizsgált oldószerrendszerek a fumonizinek elválasztására ............................. 30
4.1.3.
Fumonizin tisztítása pH-zóna módszerrel ...................................................... 32
4.1.4.
Fumozin további tisztítása a pH-zóna után ..................................................... 34
4.2.
Fengyicin tisztítása ................................................................................................ 36
4.2.1.
Vizsgált oldószerrendszerek a fengycin elválasztására ...................................36
4.2.2.
Fengycin tisztítása pH-zóna módszerrel ......................................................... 37
4.2.3.
Fengycin tisztítása kloroform-metanol-víz rendszerben ................................. 38
ÖSSZEFOGLALÁS ........................................................................................................... 41 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ............................................................................................ 42 IRODALOMJEGYZÉK .................................................................................................... 43
3
Köszönetnyilvánítás Köszönöm témavezetőmnek Dr. Szekeres Andrásnak segítségét, aki megismertette a velem a CPC technikát, és kutató munkám során rengeteg gyakorlati tanáccsal segített az elválasztások kivitelezésénél. Köszönettel tartozom az Edison House Holding Zrt vezérigazgatójának, Németh Lászlónak, aki lehetővé tette, hogy a szaklaboratóriumi munkámat a Fumoprep Kft laboratóriumában végezzem. Köszönöm az itt dolgozó Dr. Vékes Erikának, hogy szakdolgozatom írásakor ötletekkel és megfelelő dokumentációkkal látott el. Köszönöm az itt dolgozó munkatársaknak, hogy munkámat segítették. Köszönöm a B & B Alapítványnak, hogy az elnyert ösztöndíjjal támogatták tanulmányaimat. Köszönöm belső konzulensemnek, Dr. Torkos Kornélnak, hogy a szakdolgozat írása során tanácsokkal látott el.
4
Bevezetés Az analitikai kémiában meghatározó szerepet töltenek be a kromatográfiás módszerek, ahol azok elválasztó képességét minták analízisére hasznosítják. Azonban ha az analitikai méretskáláról a nagyobb preparatív mennyiségek felé haladunk, akkor azt tapasztaljuk, hogy a kromatográfiás technikák egyre háttérbe szorulnak, a méretnövelési problémák és a költségek gyors emelkedése miatt. Szaklaboratóriumi munkám során egy olyan teljesen egyedülálló és hazánkban még kevésbé ismert kromatográfiás technikával, a Centrifugális Megoszlási Kromatográfiával (CPC) dolgoztam, amely egy preparatív célú elválasztási technika, ami úgy teszi lehetővé a könnyű méretnövelést, hogy az elválasztási költségek jelentősen nem növekednek. A mikroorganizmusok által termelt szekunder metabolitokhoz számos mérgező vagy gyógyító hatású tulajdonság rendelhető. Szakdolgozatom során két különböző forrású szekunder metabolittal dolgoztam. Az egyik csoport, a Fusarium gombák által termelt fumonizinek, amelyek erős mérgező hatásuk miatt az élelmiszerbiztonság területén fokozott figyelmet igényelnek. A másik a Bacillus családba tartozó baktériumok által termelt több antimikrobális hatású, felületaktív lipopeptid, melyek potenciális farmakonok. A közvetlen fermentációs termékek azonban mindkét csoport esetében a mikroorganizmusok által az igen kis mennyiségben termelt célvegyületeket számos szennyező anyag mellett tartalmazzák, ezért szükséges ezek tisztítása elválasztási technikák alkalmazásával. Az említett preparatív kromatográfiás technika felhasználásával új elválasztási és tisztítási eljárást dolgoztam ki két eltérő forrású és szerkezetű vegyületre, a Fusarium verticilloides F16 törzs által termelt Fumonizin B1-re és a Bacillus mojavensis IP4 törzse által termelt fengycinre. Tekintettel arra, hogy a munkám egy része az Innocsek pályázat keretében valósult meg, melyben a Fumoprep Kft, mint megbízó és az Szegedi Tudományegyetem TTIK Mikrobiológiai Tanszéke, mint vállalkozó működött együtt, ezért üzleti titok részét képezi.
5
1. Irodalmi rész 1.1. Szekunder metabolitok Minden olyan anyagcsereterméket, amely nincs közvetlen összefüggésben a szervezet növekedésével, fejlődésével vagy szaporodásával szekunder metabolitnak, azaz másodlagos anyagcsereterméknek nevezünk. A szekunder metabolitok hiánya a primer metabolitok, azaz az elsődleges anyagcseretermékekkel szemben, nem okozza a szervezet gyors pusztulását, azonban hosszú távon hatással lehetnek a szervezet túlélési képességeire. A baktériumok által termelt toxikus szekunder metabolitokat toxinoknak, míg a gombák által termelteket mikotoxinoknak nevezzük [1]. 1.1.1. Fumonizinek A fumonizinek olyan mikotoxinok, amelyek a Fusarium fonalas gomba nemzettségről kapták nevüket. Ebbe a nemzettségbe tartozik a Fusarium verticilloides, amely mint a legtöbb nemzettségbe tartozó faj, képes a fumonizinek szintézisére [2]. A fuminizineket többnyire az említett fajok termelik, de kimutatták, hogy az Aspergillus niger bizonyos törzsei is képesek a fumonizin B2 termelésére [3] [4]. A vegyületcsoportot 1988-ban fedezték fel, melyek azóta ’90-es évektől kezdődően intenzív kutatás célpontjaivá váltak [2]. A vizsgálatok megállapították, hogy többnyire az élelmezési és takarmány célra szánt gabonanövényekben fordulnak elő, elsősorban nedves és meleg éghajlatú területeken, mivel ez a klíma kedvez a termelő gombák szaporodásának. A megtermelt gabonafélékben, főleg a kukoricában a mennyiségük μg/kg és mg/kg koncentrációszintek között mozog [5]. A vegyületcsoport szerkezetileg öt különböző osztályba sorolható, amelyeket különböző betűkkel jelölnek (A, B, C, F és P). A fumonizinek közé tartozó vegyületek közös jellegzetessége a hosszú, elágazó szénlánc, amelyen az adott vegyülettől függően több hidroxil- vagy karboxil-csoport található [6]. A vegyületek közül a fumonizin B1 fordul elő leggyakrabban, amely kiteheti a teljes fumonizin mennyiség 70-80%-át is [7], ennek szerkezetét az 1. ábra mutatja.
6
1) ábra: A fumonizin B1 szerkezete A fumonizinek az állatkísérletek során hepatotoxikus és nephrotoxikus hatást mutattak [8]. Patkányoknál a 25 mg/kg (testtömeg) adagokra vonatkoztatott érték a NOEL (No Obserbed Effect Limit). Ez az a határ, ahol a szennyező anyagot a kísérleti állat szervezetébe juttatva, annak testtömeg kilogrammára számolva, még nem tapasztaltak hatást. Ezzel szemben 50 mg/kg adagok esetén a patkányok 66%-nál tapasztaltak daganatokat [8]. Humán vizsgálatok nem történtek, a bizonyított mérgezések hiánya ellenére, azonban korrelációt találtak a magas fumonizin tartalmú élelmiszerek és lakosság különböző rákos megbetegedései között. Az állatokon bizonyított hatásokat figyelembe véve komoly veszélyt jelentenek az ember számára is, így a patkányokon végzett kísérletek alapján egy numerikus biztonsági tényezőt (1000) figyelembe véve léteznek ajánlások a maximális napi bevitel mennyiségére (TDI). Egy korábbi tanulmányban a maximális napi bevitelt 0,8 μg/kg-ban [8], majd a 2003-ban a WHO IPCS bizottsága 2μg/kg-ban állapította meg ezt az értéket [9]. A jelentős veszély miatt több állam szorgalmazza mérésüket az élelmiszerekben és takarmányokban [10], sőt FB1 és FB2 együttes határértékeket is megállapítottak, amelyet az 1. és 2. táblázat foglal össze.
7
1. táblázat: A fumonizinek határértékei az élelmiszerekben [11] Termék Feldolgozatlan kukorica, a nedves őrlésre szánt feldolgozatlan kukorica kivételével Közvetlen emberi fogyasztásra szánt kukorica, kukoricaalapú élelmiszerek, kivétel a későbbiek Kukoricalapú reggeli pelyhek és kukoricaalapú szeletek Csecsemők és kisgyermekek számára készült kukoricaalapú élelmiszerek és bébiételek A kukorica 1103 13 vagy 1103 20 40 KN-kód alá tartozó, 500 mikronnál nagyobb méretű őrlési frakciói és kukoricából származó egyéb, nem közvetlen emberi fogyasztásra szánt, az 1904 10 10 KN-kód alá tartozó, 500 mikronnál nagyobb méretű őrlési termékek A kukorica 1102 20 KN-kód alá tartozó, legfeljebb 500 mikron méretű őrlési frakciói és kukoricából származó egyéb, nem közvetlen emberi fogyasztásra szánt, az 1904 10 10 KN-kód alá tartozó, legfeljebb 500 mikron méretű őrlési termékek
FB1+FB2 (μg/kg termék) 4000 1000 800 200 1400
2000
2. táblázat: A fumonizinek határértékei a takarmányokban [11] Takarmány alapanyag Különböző állatoknak szánt kiegészítő és teljes értékű takarmányok
Termék Kukoricafélék és kukoricakészítmények Sertések, lovak (lófélék), nyulak, kedvtelésből tartott állatok Halak Baromfi, borjak (<4 hónap), bárányok és gidák Felnőtt kérődzők (>4 hónap) és vidra
FB1+FB2 (μg/kg termék) 60000 5000 10000 20000 50000
A fumonizinek mérésére számos eljárás létezik, többek között vékonyréteg-, gáz- és folyadékkromatográfiás eljárások, amelyekkel a fumonizinek mérhetők, akár 10 ppb kimutatási határral [12]. A legelterjedtebb a nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás eljárás [13], melyből léteznek származékképzéses [14], és származékképzés nélküli eljárások is, ahol fényszóródás-detektort [15] [16], vagy újabban tömegspektrometriát [17] alkalmaznak.
Minden
analitikai
módszer
közös
jellemzője,
hogy
a
kvantitatív
meghatározáshoz nagy tisztaságú standardra van szükség, így ezek előállítása kiemelkedő fontosságú a mérések kivitelezéséhez. Fumonizinek előállítása és tisztítása A fumonizinek komplex szerkezeti tulajdonságai miatt mesterséges szintézisük nehéz feladat [18]. Az irodalom beszámol a kémiai szintézisről [19], de ezen eljárásoknak gyakorlati jelentősége csekély, ezért a standardhoz használt vegyületek kiindulási forrása mindig a 8
Fusarium törzsek fermentációs termékei. A termelés általában szilárd fázisú fermentációval történik, kontrollált atmoszférikus körülmények között. A fermentációs termékek tisztítását többnyire egy könnyű anion cserélő töltetet (SAX) alkalmazó dúsító lépéssel kezdik, melynek célja az anyagot kísérő, a szilikagél oszlop tönkremenetelét okozó szennyezők eltávolítása. A tisztítási lépés során a preparatív nagyteljesítőképességű folyadékkromatográfiát alkalmazzák (prep-HPLC) [20] [21], amelynek a kivitelezési költsége jelentősen növeli a standardok előállítási költségeit, mivel nagy az oldószerigény, valamint a preparatív töltet költsége is jelentős. Az irodalomban nem található olyan alacsony költségű és jól méretnövelhető eljárás, amely nagy tisztaságú fumonizin standardok előállítására adna lehetőséget. 1.1.2. Bacillus antibiotikumok A Bacillus családba tartozó
baktériumfajok
többféle
lipopeptid szerkezetű
antibakteriális és antifungális hatású, azaz a baktériumok illetve a gombák szaporodását gátló, vegyületet képesek előállítani, ilyenek például a surfactin, iturin, bacillomycin, mycosubtilin és a fengycin. A vegyületek szerkezetének közös jellemzője, hogy tartalmaznak egy ciklikus polipeptid részt, amely a surfactin és az iturin esetében 7, a fengycin esetében 10 aminosavból áll. Az egyik aminosavhoz egy hosszú szénlánc kapcsolódik, amely a surfactin esetén 13-16, az iturin esetén 14-17, míg a fengycin esetében 14-18 szénatomból áll (2. ábra) [22]. A lipopeptidek szerkezetüknek köszönhetően képesek beépülni a sejtmembránba, és megnövelik annak permeábilitását. E jelenségnek köszönhető erős biológiai hatásuk. A folyamat mechanizmusa azonban még nem teljesen tisztázott. Az iturin és a fengycin ismert széles spektrumú antifungális hatásáról, amely a szénlánc hosszával növekedik, ennek feltételezett oka az, hogy a molekulák könnyebben épülnek be a sejtmembránba. A surfactin széles spektrumú antibiotikum és az egyik legerősebb ismert felületaktív anyag. Alkalmazásukat jelenleg korlátozza előállítási és tisztítási költségük, valamint az erős hemolitikus aktvitásuk, amely a surfactin esetében a legnagyobb. A fengycin hemolitikus aktivitása már csak negyvened része a surfactinénak [23].
9
2) ábra: fengycin szerkezete Bacillus lipopeptidek előállítása és tisztítása A legkorábban alkalmazott módszer a lipopeptidek elválasztására a többi szekretált terméktől a lipopeptidek felületaktív tulajdonságát használja ki. Ha a fermentációs reaktort valamilyen gázzal buborékoltatják, akkor a képződő hab eltávolításával kinyerhető a termelt surfactin. A hab centrifugálása után annak savanyításával a lipopeptidek kicsaphatók [24]. Nagy mennyiségű termelés esetén átkristályosítással (például surfactin vízben) kevésbé tiszta termék nyerhető [24]. A fengycinre eddig oszlopkromatográfiás tisztítást alkalmaztak, amely képes volt azt elválasztani az egyéb lipopeptidektől [25]. Nagy tisztaságú termék állítható elő például surfactinból a fermentációs termék több lépcsős ultraszűrésével [26]. A fengycin esetében még nem jelent meg közlemény olyan folyadék-folyadék kromatográfiás eljárásról, amely alkalmas lenne a fengycin homológok egymástól és a többi termelt lipopeptidtől való elválasztására.
1.2. Centrifugális megoszlási kromatográfia (CPC) A folyadék-folyadék kromatográfiás módszerek esetében mind az állófázis, mind a mozgófázis folyadék halmazállapotú. Az elválasztás egy egymással nem elegyedő, kétfázisú oldószerkeverékben történik, ahol az elválasztás alapja a különböző komponensek eltérő megoszlása a két folyadék fázis között. Az első folyadék-folyadék kromatográfiás eljárások során a folyadék állófázist a gravitációs erő immobilizálta, amely a kezdetekben még nem tette lehetővé a mobil fázis gyors áramlását. Ezzel szemben a centrifugális megoszlási 10
kromatográfiát alkalmazó készülékekben a folyadék állófázist egy erős centrifugális erőtér tartja fenn, mely lehetővé teszi a mozgófázis gyors áramoltatását, és ezáltal a gyors és hatékony elválasztást [27]. A megfelelő CPC-s elválasztásnak két feltétele van. Az egyik, hogy a minta komponenseinek megoszlási hányadosa (K) 0,5 és 2,0 között legyen, ez biztosítja, hogy egyik komponens se eluálódjon túl hamar a holttérfogattal, vagy esetleg túl nagy térfogattal. A másik feltétel, hogy az elválasztandó komponensek megoszlási hányadosának aránya (α) legalább 1,25 legyen. Ez biztosítja a megfelelő felbontást. Mindkét feltétel elérhető megfelelő oldószerrendszer kiválasztásával [28]. 1.2.1. A CPC oldószer rendszerei Az elválasztáshoz használhatunk kettő, három, négy vagy több komponensű oldószer elegyeket, amelyek két fázist alkotnak. A háromkomponensű elegyek esetén az irodalomban számos rendszerre találhatok terner diagramok, amelyekkel megállapítható az egyes fázisok pontos összetétele [29]. Amennyiben a minta megoszlása erősen az apolárisabb fázis fele tolódik el (amely általában a felső fázis), akkor apolárisabb oldószerrendszert kell választani. Hasonlóan, ha a megoszlás a polárisabb fázis fele tolódik el, akkor polárisabb oldószerrendszert kell választani. A háromkomponensű elegy kiválasztására a „legjobb oldószer módszer” nyújtja a leggyorsabb megoldást. Ekkor kiválasztjuk a célvegyület legjobb oldószerét, majd a további két oldószernek választunk ennél valamivel polárisabb illetve apolárisabb oldószert. A kiválasztásnál és az oldószerek keverési arányánál figyelembe kell venni, hogy alkalmazásra csak kétfázisú elegyek felelnek meg, így a terner diagramok alapján a megfelelő mezőt kell kiválasztani. A leggyakoribb ilyen rendszer a kloroform, metanol és víz elegye, mivel a metanol gyakori oldószer. Ennek az elegynek a terner diagrammát a 3. ábra mutatja.
11
3) ábra : A kloroform-metanol-víz rendszer terner diagrammja. Az alsó középső mező jelzi a kétfázisú elegyeket, ahol a ferde vonalak megmutatja a két fázis összetételét. Négykomponensű elegyek alkalmazása esetén jobban beállítható a polaritás, jobb oldhatóság, valamint jobb fázis térfogatarány érhető el (a két fázis nagyjából azonos arányban használjuk fel). A négykomponensű elegyek hátránya, hogy az irodalomban található, négyfázisú elegyek összetételét jellemző a kvaterner diagramok száma korlátozott. Azonban az előbb felsorolt előnyök miatt a CPC során használt empirikus oldószerrendszerek többnyire mind ide sorolhatók, ilyenek például a HEMWat, az Oka, az Arizona rendszer. Ezek az oldószerrendszerek polaritás szerint rendezve tartalmaznak táblázatosan keverési arányokat az oldószerekre, segítségükkel gyorsan meghatározható az elválasztásra szánt oldószer rendszer. Az előbbi HEMWat rendszer előnye, hogy a megoszlási hányados megjósolható vékonyréteg kromatográfia segítségével. Amennyiben a HEMWat táblázatban szereplő hexánt és etil-acetátot a felsorolt arány szerint összekeverjük, és ezzel az eluenssel futtatunk hagyományos szilikagél vékonyréteglapot, akkor a tapasztalt R f érték közel egyenlő lesz a sorszámozott oldószerben tapasztalt megoszlási hányadossal. Ezt az empirikus módszert 22 anyagon tesztelték, és általánosan alkalmazható a megfelelő oldószerrendszerek keresésénél [28].
12
Az adott oldószerrendszer tesztelésére a legelterjedtebb módszer a Shake-flask [30]. Ennek során összeállítjuk a tervezett oldószerrendszert néhány ml térfogatban, majd azonos térfogatokat pipettázunk ki az alsó és felső fázisból. Ezekhez hozzáadjunk a vizsgálni kívánt komponenst, majd vortexen rázatjuk. A keverés után hagyjuk, hogy a két fázis egymástól elváljon, majd mintát veszünk mindkettőből külön-külön, és egy megfelelő analitikai módszerrel megvizsgáljuk összetételüket. 1.2.2. A CPC gyakorlata Asc/Dsc UV-detektor
váltó szelep
frakciószedő
pumpa
CPC oszlop
mintahurok
4) ábra : CPC készülék frakciószedővel Egy, az Armen (Franciaország) cég által gyártott CPC készülék látható a 4. ábrán. A mobil fázis haladásának iránya szerint a készülék a következő részegységekből áll: pumpa, mintahurok, Ascendens/Descendens váltó szelep, CPC oszlop (rotor), detektor, frakciószedő. Az oszloptól eltekintve a készülék felépítése megegyezik egy preparatív HPLC felépítésével, azonban itt az oszlop különös figyelmet kap. A rotor tömítőgyűrűkkel (szimering) ellátott, vízszintes tengelyen forgó, üregesre mart rozsdamentes acél lemezekből áll, amelyeket teflon szigetelések választanak el egymástól [31].
13
5) ábra : Rotor lemezei a cellákkal, és egy cella kinagyítva A centrifugális erő a nagyobb sűrűségű fázist a rotor külseje felé szorítja, míg a felhajtóerő a kisebb sűrűségű fázist a rotor tengelye felé. A fellépő erő, amely a rotor geometriai felépítésének függvénye, a gravitációs erő sokszorosa, ezzel a két fázis elválása egymástól gyorsan meg tud valósulni. Ha az 5. ábrán látható cellákat összekötő csatornákban a sűrűbb fázist úgy pumpáljuk, hogy az a rotor tengelye felől a kerülete felé haladjon, akkor descendens módról beszélünk. Hasonlóan, ha a kisebb sűrűségű fázist úgy pumpáljuk, hogy az a rotor kerülete felől a tengely fele haladjon, akkor ascendens módról beszélünk [27]. Minden, a rotor lemezein található üreg felfogható egy-egy extrakciós cellának. Mivel egy rotorban több ezer is található belőlük, így hasonlóan sok extrakciós lépés történik egymás után, ezzel az elméleti tányérszám jelentős mértékben növekszik. Itt érdemes kiemelni, hogy a folyadék-folyadék kromatográfia, és ezen belül a CPC, azon kromatográfiás módszerek közé tartozik, ahol a tányérszámhoz tárgyi jelentés is köthető. A CPC elválasztás első lépése az oszlop feltöltése állófázissal, amely alacsony fordulatszámon és magas áramlási sebesség mellett történik annak érdekében, hogy az oszlopban jelen lévő folyadék teljes mennyisége kiszoruljon. Ezután a rotor fordulatának emelése következik, amelyet olyan magas fordulatszámra kell növelni, hogy a centrifugális erő elegendő legyen az állófázis megtartásához. Az elválasztás következő lépésében a mozgófázist pumpálják át a tervezett áramlási sebességgel. Ez a lépés a kiszorítás, amely során az oszlopban beáll a hidrodinamikai egyensúly a két fázis között. Ekkor bizonyos mennyiségű állófázis kiszorul, melynek térfogata egyenlő lesz a holttérfogattal (ha többi csatlakozás és vezeték holttérfogata elhanyagolható) [27]. A minta hurokkal, vagy pumpával történő adagolása után a (leggyakrabban használt) elúciós módban történik a mozgófázis pumpálása. Az esetek többségében a vizes fázisunk az alsó fázis, így a descendens mód a reverzfázisú kromatográfiának, míg az ascendens mód a normál-fázisú kromatográfiának 14
feleltethető meg, ha a hagyományos HPLC-s technikával akarunk párhuzamot vonni. Kivételes eset a kloroform-metanol-víz rendszer, ahol pont fordítva igazak a korábbi állítások, mivel a kloroformos szerves fázis lesz az alsó. A legtöbb (beleértve az itt használt) készülék képes a descendens – ascendens mód váltására futás közben is, amely megfeleltethető a folyadékkromatográfiánál a normál- illetve reverz-fázis váltásának egy elválasztáson belül. Olyan esetekben, ahol a minta komponenseinek két fázis közötti megoszlási hányadosa nagymértékben különböző, lesznek olyan komponensek, amelyek nagyon nagy retenciós térfogattal eluálódnak, illetve extrém esetekben végtelen nagy térfogattal, azaz beleragadnának az oszlopba. Az elúciós mód, vagyis ascendens-descendens mód egy futáson belüli váltásával ezek a komponensek is gyorsan elválaszthatóak [27]. Ez a hagyományos kromatográfiás technikák esetén nehezen kivitelezhető technika. Amennyiben VH a holttérfogat, VR az oszlopban lévő állófázis térfogata (melyek összege az oszlop teljes térfogata), valamint a minta i-edik komponensének megoszlási hányadosa K i , akkor az adott komponens elúciós térfogata: Vi VH VR Ki . Az előbbi képlettel kiszámítható összefüggés alapján elmondható, hogy a komponensek megoszlási hányadosainak ismeretében az elválasztás paraméterei megjósolhatóak [27]. A folyadék állófázis alkalmazásával nincs szükség drága, a szennyezőkre vagy pH-ra érzékeny szilárd (szilika) állófázisra. Az oszlop szennyeződése esetén azt csak újra kell tölteni. Az oldószerek mennyiségi és tisztasági igénye szintén kisebb a nagy hatékonyságú folyadék-kromatográfiához (HPLC) képest, ezzel jelentős költségmegtakarítás érhető el. A módszer erős mátrix-toleranciája lehetővé tette alkalmazását erősen szennyezett természetes eredetű minták elválasztására és tisztítására [32] [33] [34]. A módszer alkalmazása nagy mértékben terjed olyan szekunder metabolitok elválasztásánál, mint az antibiotikumok [35], valamint a mikotoxinok [36], mivel bizonyos esetekben jobb tisztaságot és magasabb kitermelést eredményez a prep-HPLC-s technika alkalmazásánál [37]. A centrifugális megoszlási kromatográfia módszere kiegészíthető egyéb technikákkal. Amennyiben az elúció folyamán erős pH-gradienst alkalmazunk, úgy lehetővé válik a savi jelleg alapján történő elválasztás. Ionpár képző reagens alkalmazása esetén pedig affinitás kromatográfia is megvalósítható. 1.2.3. pH-gradiens alkalmazása, azaz a pH-zóna A CPC alkalmazása során egy speciális technika lehetővé teszi a savi vagy bázikus tulajdonságok alapján történő elválasztást. Gyakran előfordul, hogy az elválasztandó szerves 15
komponensek rendelkeznek karboxil-csoportokkal. Ezek deprotonálódásával hidrofil, míg protonálódásával organofil species keletkezik. Amennyiben a kétfázisú oldószerrendszert helyesen választjuk meg, egy erős pH-gradiens alkalmazásával, az eltérő savi erősségű komponensek különböző pH-n fognak különböző molekulaszerkezetet felvenni, így fázist váltani, ezzel megvalósítható azok elválasztása. A módszer hasonlóan működik más proton leadására vagy felvételére képes csoportok esetében is [38]. A gyakorlatban a fent említett karboxil-csoportot tartalmazó vegyületek esetén ez azt jelenti, hogy az oszlopot az elválasztás kezdetén a kétkomponensű elegy savas felső, szerves fázisával töltjük fel, a mintát ebben az oldószerben oldva injektáljuk. Ezután az oszlop fordulatszámát megnövelve a bázist tartalmazó alsó fázist pumpáljuk keresztül. Ekkor a hidrodinamikai egyensúly az elválasztás folyamán áll be. Az elválasztás során először a legerősebb savak eluálódnak, és az oszlopban különböző pH-zónák alakulnak ki (lásd 6. ábra), ebből ered az elnevezés.
6) ábra : Megoszlási egyensúlyok az oszlopban, illetve az elúciós profil pH-zóna CPC esetében [38] A módszer előnye, hogy az injektált minta mennyisége általában a tízszeresére növelhető [30], ezáltal könnyebben alkalmazható biológiai [39] vagy mikrobiológiai minták [40] elválasztására, tisztítására. A módszer alkalmazási feltétele az alábbi egyenlőtlenség teljesülése:
16
Ahol Ka a komponens megoszlási hányadosa savas közegben, Kr annak a savnak a megoszlási hányadosa, amely a komponenst annak protonálásával a szerves fázisban tartja (retainer acid), Kb pedig a komponens megoszlási hányadosa lúgos közegben. További feltétel, hogy a komponens megoszlási hányadosának pH függésének meredeksége a lépcső környékén nagyon nagy legyen (legalább egy nagyságrend változás a koncentrációban 0,2-es pH egység változásra) [38]. 1.2.4. Affinitás kromatográfia CPC-vel Bizonyos töltött komponenseket nem lehet egyedül az előbbi pH-gradiens alkalmazásával elválasztani, mivel megoszlási hányadosuk pH-függése közel megegyezik. Ilyen komponensek például az azonos aminosav összetételű nem származékképzett polipeptidek. Az affinitás-elválasztást régóta alkalmazzák a folyadékkromatográfiában, általában úgy, hogy a szilikagél oszlopra megfelelő ligandumot kötnek, ezzel lehetővé teszik például nukleinsavak és fehérjék elválasztását [41]. Az ilyen speciális oszlopok költsége általában sokszorosa a hagyományos HPLC oszlopoknak. A CPC lehetővé teszi, hogy az affinitás-elválasztást végrehajtsuk azzal, hogy a szükséges ligandumot feloldjuk az állófázisként használt folyadékban. Amennyiben a ligandum homokirális, úgy lehetővé válik enantiomerek elválasztása is [42]. Polipeptidek elválasztására a di(2-etil-hexil)-foszforsav (DEHPA) ligandum terjedt el, amellyel már több dipeptid és polipeptid keverék elválasztását írták le [43].
1.3. Különleges detektálási módszerek Tekintettel arra, hogy a korábban ismertetett vegyületek (mind a fumonizinek, mind a fengycin) nem eléggé UV-aktívak, ezért szükség van a koronakisüléssel töltött aeroszol detektor (Corona CAD) alkalmazására, amelynek vázlatos felépítését a 7. ábra mutatja.
17
7) ábra : Corona CAD vázlatos működése A HPLC-oszlopról érkező folyadékáram a porlasztóba jut, ahol nitrogén gáz segítségével finom aeroszollá porlasztódik, ahol a cseppek mérete arányos az oldott anyaggal. Ezután egy kamrában az aeroszol összekeveredik egy olyan nitrogénárammal, amelyet nagyfeszültség segítségével ionizáltak, így az átadja pozitív töltését a cseppeknek. A szerzett pozitív töltés arányos a csepp méretével, így az oldott anyaggal. Egy ioncsapda segítségével lehetőség van a töltött részecskék szűrésére. Ezek után a Collector-ban a cseppek töltéseivel arányos elektromos jel keletkezik, amely az előbbiek alapján arányban van az oldott anyag mennyiségével. Ebből következik, hogy a Corona CAD egy univerzális detektor, minden molekulára egyaránt érzékeny, nem szelektív, ezáltal széleskörűen alkalmazható például proteinek, szénhidrátok mérésére. A törésmutató detektorral ellentétben nem érzékeny a gradiens programokra.
18
2) Célkitűzés Az ismertetett CPC technika újdonsága miatt nem terjedt még el a hazai preparatív laboratóriumi gyakorlatban, annak ellenére, hogy rengeteg kiaknázatlan lehetőséggel bír. Ezért célul tűztem ki, hogy elválasztó képességét bemutassam azáltal, hogy elválasztási és tisztítási eljárást dolgozok ki mikrobiológiai fermentációkból származó szekunder anyagcseretermékekre. Ezen értékes szekunder metabolitokat tartalmazó minták feldolgozása az elterjedt prep-HPLC technikákkal körülményes, valamint jelentős költséggel bír. Fontos szempont volt, hogy a feldolgozás során a méretnövelés szempontjából problémás és költséges mintaelőkészítő lépések kiküszöbölésre kerüljenek, mint például a szilárdfázisú extrakció vagy az ioncserélő gyantát tartalmazó töltetek használata, vagy az ultraszűrés. A két választott vegyület a fumonizin B1 és a fengycin volt. A fumonizin B1-nél a kapott termék tisztasága és az előállítás alacsony költsége jelentette az elválasztás legfőbb erényét, mert a tervezett felhasználás mint analitikai standard történne. A fengycinek esetében cél volt az elválasztás a fermentáció során termelődött egyéb lipopeptidektől, valamint más szennyezőktől. Tekintve, hogy a szénlánc hosszának függvényében, és egy aminosav cseréje miatt több fengycin homológ létezik, célul tűztem ki ezek elválasztását is egymástól.
19
3) Kísérleti rész 3.1. Felhasznált vegyszerek 3. táblázat: Felhasznált anyagok a forrás szerint Forrás Molar Chemicals Magyarország
Sigma-Aldrich Ltd. Co. Budapest, Magyarország VWR Magyarország Bakers, Hollandia BioSolve Inc Hollandia Macherey-Nagel Németország Merck Németország
Anyag terc-butil-metil-éter A.R. acetonitril A.R. butan-1-ol A.R. etil-acetát A.R. hexán A.R. metanol A.R. trifluor-ecetsav A.R. fumonizin standard acetonitril, LC-MS minőség acetonitril, HPLC minőség metanol, HPLC minőség 0,1% hangyasav tartalmú acetonitril, LC-MS minőség metanol LC-MS minőség TRI-BOX pH-papír Üveg hordozón F254 fluoreszcens adalékot tartalmazó szilikagél bevonatú vékonyréteg lap (1.05805.001 Cat. no.)
Az ionmentes vizet az auqaMAX Basic (Young-Lin, Korea) készülékkel nyertem, a HPLC futásokhoz használt ultratiszta vizet pedig az előbbi vízből egy aquaMAX Ultra (Young-Lin, Korea) készülék állította elő.
3.2. Sejtkultúrák, mikrobiológiai törzsek és a fermentációk 3.2.1. Fusarium törzsek és fumonizin fermentáció A Fusarium verticilloides F16 törzset korábban izolálálták, Bartók és munkatársainak munkája [44] alapján, amelyet burgonya dextróz agaron (Sigma, Magyarország) tartottak fent. A fumonizin szilárd fázisú fermentációját a Szegedi Tudományegyetem TTIK Mikrobiológiai Tanszékén végezték el a következők szerint : 400 ml-es befőttesüvegekbe 5050 g hosszúszemű rizst (Uncle Ben’s) és 50-50 ml HPLC-tisztaságú vizet tettek, amelyet szobahőmérsékleten tartottak. A befőttesüvegeket autoklávban sterilizálták, egymás után kétszer 121°C-on 15 percig, két egymást követő nap, majd 5 db burgonya dextróz agaron előtenyésztett F. verticilloides FV16 izolátum agar dugóival beoltották, majd sötétben 28°Con inkubálták. A kultúrákat az első három nap naponta felrázták, hogy biztosítsák az aerációt 20
és egyenletesen eloszlassák a telepeket, és megakadályozzák a szemek összeragadását. Négy hét után a kultúrákat eltávolították az inkubátorból, és azonnal lefagyasztották. A kultúrákat liofilizálták, majd finom porrá őrölték, és -80°C-on tárolták a felhasználásig. 3.2.2. Bacillus törzsek és fengycin fermentáció A Bacillus mojavensis IP4 törzs izolációját és a fermentációt a Szegedi Tudományegyetem TTIK Mikrobiológiai Tanszékén végeztél el az INNO_08_DADEPFER08 azonosítójú pályázat keretében. A fermentáció végén a fermentlevet 8000 g-vel 10 percig centrifugálták, hogy a baktériumsejtek kiülepedjenek. A felülúszót főzőpoharakba vitték át, majd a fermentlevek pH-értékét 2-esre állították be sósavval. A csapadékos fermentleveket 5 °C-on egy éjszakát inkubálták, hogy a csapadék teljesen leváljon.
A
csapadékot centrifugálással kiülepítették és elválasztották. Ezt a csapadékot juttatták el hozzám.
3.3. Minták előkészítése 3.3.1. Fumonizin minta előkészítése A minta előkészítésére egy irodalomban leírt módszert használtam [45], méretnövelve. A módszer az alábbiakban foglalható össze: 50 g liofilizált mintát először 2x50 ml etilacetáttal extraháltam, ezt az extraktumot félretettem. A szilárd részt ezután háromszor 100 ml metanol-víz 3:1 térfogatarányú elegyével extraháltam. A metanolos extraktumot ezután bepároltam centrifugális vákuumbepárlón kb. 25 ml-re. 3.3.2. Fengycin minta előkészítése A kapott fengycin szilárd mintákat az elválasztásokra előkészítés nélkül használtam fel. Az oldószerpróbákhoz pedig 10mg/ml-es koncentrációjú metanolos oldatot készítettem.
3.4. Megoszlási hányadosok megállapítása A megoszlási hányadosokat a Shake-flask módszerrel állapítottam meg. A vizsgálni kívánt oldószerrendszert először összekevertem kb. 5 ml össztérfogatnyi mennyiségben, amelyből kivettem 2-2 ml alsó és felső fázist egy 10 ml-es kémcsőbe. A kivett részletbe helyeztem a vizsgálni kívánt anyag oldatából 100 μl-t. Az elegyet három percig kevertem Vortexen (Heidolf, Germany), majd a fázisok szétválása után 0,7-0,7 ml mintát vettem mind az alsó mind a felső fázisból, amiket a fumonizinek esetében HPLC-CAD-del vizsgáltam. A fengycin esetében először a két fázist TLC-vel vizsgáltam, majd azokat a rendszereket, ahol
21
mind az alsó és mind a felső fázis tartalmazott fengycint, HPLC-CAD-del is megmértem. A megoszlási hányadost a következők szerint számítottam ki: Ki
cfelső fázis . calsó fázis
A pH-zóna és affinitás mérések esetén a fumonizinek vizsgálatához, a fumonizin minta hozzáadása után az elegyet először meglúgosítottam ammóniával 10-es pH fölé. Ekkor 0,7-0,7 ml mintát vettem mind az alsó, mind a felső fázisból. A maradék oldatot megsavanyítottam a trifluorecetsavval pH=2-re, majd ebből is hasonlóan mintát vettem. Mind a négy mintát HPLC-vel vizsgáltam. Két megoszlási hányadost számoltam, külön savas és lúgos körülményekre. A pH-zóna mérések esetén a fengycinek vizsgálatához a fengycin minta hozzáadása után, hozzáadtam a megfelelő mennyiségű DEHPA-t, majd az elegyet megsavanyítottam sósavval 1-es pH-ra. Ekkor 0,7-0,7 ml mintát vettem mind az alsó, mind a felső fázisból. A maradék oldatot trietilaminnal lúgosítottam pH 6-ra, majd ebből is hasonlóan mintát vettem. Mind a négy mintát először TLC-vel, majd HPLC-vel vizsgáltam. Két megoszlási hányadost számoltam, külön savas és bázikus körülményekre.
3.5. Centrifugális megoszlási kromatográfiás futások kivitelezése Az elválasztásokat egy ASCPC-250L készüléken (Armen, Franciaország) végeztem, amelynek oszloptérfogata 250 ml volt, és egy Spot-prep készülékhez (Armen, Franciaország) volt csatlakoztatva, amely tartalmazott egy négybemenetű gradiens HPLC pumát, egy 10 mles mintahurkot a kézi injektáláshoz, egy K-2501 UV detektort (Knauer, Németország) és egy automata frakciószedőt. Nem volt lehetőség a CPC oszlop termosztálására. A fumonizinek esetén egy Corona CAD detektort is csatlakoztattam, úgy hogy az oszlop után, de a frakciószedő előtt az áramlást 1:10 arányban elosztottam (splitteltem), a kisebb rész ment a Corona CAD-be, a nagyobb rész ment az UV-detektoron át a frakciószedőbe. A CoronaCAD ekkor a HPLC-s körülményekkel megegyező paraméterekkel működtettem, kivéve a méréshatárt, ami jelen esetben 500pA volt.
22
4. táblázat: A CPC futás során használt körülmények összefoglalva Fumonizin
Fengycin elválasztása
Fumonizin további
Fengycin elválasztása
elválasztására pH-
pH-zóna módszerrel
tisztítása
klorofrom-metanol-
zóna módszerrel
víz rendszerben
Oldószer-
MTBE, BuOH,
MTBE, MeCN, Víz
MTBE, MeCN, 0,1%
Kloroform, metanol,
rendszer
MeCN, Víz (2:2:1:5)
(4:1:5)
TFA vízben (2:2:3)
víz (5:4:3)
Állófázis
Felső, pH 2-re állítva
Felső, pH 2-re állítva
FB1: felső
Felső
TFA-val
TFA-val
FB2, FB3: alsó
Alsó, pH 10-re állítva
Alsó, pH 10-ra állítva
FB1: alsó
ammóniával
ammóniával
FB2, FB3: felső
500 fordulat/perc, 50
500 fordulat/perc, 50
500 fordulat/perc, 50
500 fordulat/perc, 50
ml/perc, 6 perc
ml/perc, 6 perc
ml/perc, 6 perc
ml/perc, 6 perc
Nincs
Nincs
2200 fordulat/perc,
1250 fordulat/perc,
10 ml/perc, 20 perc
10 ml/perc, 20 perc
Mozgófázis Feltöltés Leszorítás Injektálás
Alsó
50 ml, állófázis
10 ml, állófázis,
5-5 ml mozgó- és
5-5 ml mozgó- és
pumpáról
mintahurok
állófázis, mintahurok
állófázis, mintahurok
Elválasztás
50 perc
50 perc
60 perc
40 perc
Frakciószedés
10 percig nincs, 14
20 ml, majd pH 3
10 percig nincs, majd
20 ml frakciók
perc 20 ml frakciók,
körül 10 ml
20 ml frakciók,
frakciók pH mérése
Corona-CAD
majd 10 ml frakciók Detektálás
Corona-CAD, frakciók pH mérése
3.5.1. pH-zóna elválasztások A forgási és az áramlási sebesség optimalizálásának érdekében (a hidrodinamikai egyensúly eléréséhez) egy elválasztást végeztem minta injektálása nélkül. Az oszlopot feltöltöttem állófázissal alacsony forgási sebesség (500 rpm) és nagy áramlási sebesség (50 ml/perc) mellett. Ezután a forgási sebességet 2500 rpm-re állítottam, majd elkezdtem a mobil fázis lassú pumpálását 10 ml/perc áramlási sebességgel. Ha a nyomás elérte a 80 bart, akkor a forgási sebességet csökkentettem. Fumonizinek elválasztása A bepárolt töményített kiindulási anyagot először közvetlenül injektáltam.
Többi
elválasztásnál a savat tartalmazó állófázis 50 ml-ével extraháltam, a pH-t 3-ra állítva trifluorecetsavval. Az oszlopot feltöltöttem állófázissal lassú forgási sebesség és nagy áramlási sebesség mellett. Ezután a mintát is tartalmazó állófázist pumpáltam 20 ml/perc áramlási sebességgel. A forgási sebességet egy magasabb, korábban meghatározott értékre
23
állítottam, majd elkezdtem a mobil fázis áramoltatását 10 ml/perc áramlási sebességgel, descendens módban. A frakciószedést 10 perc után kezdtem, 20 ml-es frakciók szedésével, de 24 perc után 10 ml-es frakciókat szedtem. Minden frakcióból 0,7 ml mintát vettem. Ahol az oszlopvérzés miatt két fázis volt a frakcióban, ott mindkét frakcióból vettem külön mintát. A mintákat HPLC-CAD-del vizsgáltam. Minden frakció pH-ját megmértem és lejegyeztem. Fengycin tisztítása pH-zóna CPC módszerrel A csapadékokat extraháltam 10 ml savat tartalmazó állófázissal. Az oszlopot feltöltöttem állófázissal lassú forgási sebesség és nagy áramlási sebesség mellett. A forgási sebességet feljebb vettem, a korábban meghatározott értékre, majd a minta hurkon át történő adagolásával, elkezdtem a mobil fázis áramoltatását 10 ml/perc áramlási sebességgel. A frakciószedést a legelején kezdtem 20 ml-es frakciókkal, majd ahol a pH gyengén savas volt, ott 10 ml-es frakciókat szedtem. Minden frakció pH-ját megmértem és lejegyeztem. A frakciókat rotációs vákuumbepárlón teljesen bepároltam, majd 5 ml metanolban felvettem. Ezután vettem 0,7-0,7 ml mintákat, amelyeket TLC-vel és HPLCCAD-del vizsgáltam. 3.5.2. További tisztítások hagyományos CPC-vel Az oszlopot feltöltöttem állófázissal lassú forgási sebesség és nagy áramlási sebesség mellett. Ezek után a rotort felpörgettem 2800 rpm-re, majd elkezdtem a mozgófázis lassú pumplását 10 ml/perc áramlási sebességgel. Amennyiben a nyomás túllépte a 80 bart, úgy csökkentettem a forgási sebességet. Ezt addig folytattam, míg be nem állt a hidrodinamikai egyensúly, azaz nem távozott több állófázis. Fumonizin további tiszítása A különböző fumonizinek további tisztítását a terc-butil-éter, acetonitril és víz 2:2:3 térfogatarányú elegyével végeztem úgy, hogy az FB1 esetén az alsó vizes fázist, míg az FB2 és az FB3 esetén a felső szerves fázist használtam mozgó fázisnak. Az FB1 tartalmú frakciókat, amiket a pH-zóna elválasztással nyertem, bepároltam, majd felvettem 5 ml alsó és 5 ml felső fázisban. A mintát a hurkon keresztül injektáltam a CPC oszlopra. A frakciók szedését 10 perc után kezdtem és 20 ml frakciókat gyűjtöttem. Azokból a frakciókból, amelyek a CAD detektor alapján fumonizint tartalmazhattak, 0,7-0,7 ml mintát vettem, és HPLC-CAD-del vizsgáltam.
24
Az FB2 és FB3 tartalmú frakciókat bepároltam, majd felvettem 5 ml alsó és 5 ml felső fázisban. A mintát a hurkon keresztül injektáltam. A frakciók szedését 10 perc után kezdtem és 20 ml frakciókat gyűjtöttem. Azokból a frakciókból, amelyek a CAD detektor alapján fumonizint tartalmazhattak, 0,7-0,7 ml mintát vettem, és HPLC-vel vizsgáltam. Fengycin tisztítása a kloroform-metanol-víz rendszerben A fengycinek tisztítására a kloroform, metanol és víz 5:4:3 térfogatarányú elegyét használtam, ahol az alsó szerves fázis volt a mozgó fázis. A fengycin tartalmú mintát felvettem 5 ml alsó és 5 ml felső fázisban. A mintát a hurkon keresztül injektáltam. Végig 20 ml frakciókat szedtem, az elválasztás kezdetétől. A kapott frakciókat centrifugális vákuumbepárlón teljesen bepároltam, majd 1-1 ml metanolban felvettem, és TLC-vel valamint HPLC-vel vizsgáltam.
3.6. Analitikai vizsgálatok A frakciók összetételének és tisztaságának vizsgálatára egy HPLC-CAD rendszert alkalmaztam, de a komponensek azonosítását egy HPLC-MS rendszer segítségével végeztem, ahol azonos oszloppal és körülményekkel dolgoztam. Ez lehetővé tette, hogy miután az adott komponenseket a molekulaion alapján azonosítottam, megállapítsam a retenciós időt, így a HPLC-CAD rendszeren is azonosítsam az anyagokat. A két rendszer felépítése, valamint a fumonizinek és fengycin elválasztására használt kromatográfiás körülményei alább olvashatók. HPLC-CAD rendszer A méréseket egy YL9100 moduláris HPLC rendszeren végeztem (Young-Lin, Korea), amely állt egy YL9101 vákuum gázmentesítőből, QL9110 négybemenetű gradiens pumpából, egy YL9150 automatikus mintaadagolóból, egy YL9130 oszloptermosztátból és egy YL9160 diódasoros detektorból. Az utóbbi után egy Corona Charged Aerosole Detectort (ESA BioScience, Nagy-britannia) is illesztettem, amelynek méréshatára 100 pA volt, a készülékbe a nitrogénáram 35 psi-vel, és nem használtam elektronszűrést. A készüléket a YLClarity szoftverrel vezéreltem (ver 2.6.5.459). HPLC-MS rendszer A HPLC-MS méréseket egy Agilent (Palo Alto, USA) 1100 szériás HPLC rendszerrel végeztem, amely egy Agilent 6410 QQQ tömegspektrométerhez volt kapcsolva, amely electrospray (ESI) ionizációt alkalmazott. A készülék állt egy G1312A kétbemenetű gradiens
25
pumpából, egy G1379A vákuumgázmentesítőből és egy G1367A automata mintaadagolóból. A készülékegyüttest a MassHunter Acquisition szoftverrel (ver B.01.03) vezéreltem, és az adatok kiértékelését a Masshunter Qualification szoftverel (ver B0.1.04) végeztem. Fumonizinek elválasztásának kromatográfiás körülményei Az elválasztáshoz egy YMC-Pack ODS-A 250x4,6 mm-es oszlopot (YMC, Németország) használtam, amely 5 μm részecskemérettel és 12 nm pórusmérettel rendelkezett, és egy YMC ProC18 20x4,0 mm (YMC, Németország) guard oszloppal volt ellátva, aminek azonos részecske és pórusmérete volt az analitikai oszloppal. Az A eluens víz, a B eluens acetonitril volt, mindkettő 0,1 térfogatszázalék hangyasav tartalommal. Az áramlási sebesség 1 ml/perc volt, és az oszlopot a HPLC-CAD mérések esetén 35°C-on termosztáltam. A mérés során alkalmazott gradiens programot 5. táblázat tartalmazza. Az injektált térfogat 5 μl volt. A minőségi azonosítást és a mennyiségi meghatározást standard 5 illetve 20 μl-es részleteinek injektálásával végeztem, amelynek FB1 és FB2 tartalma egyaránt 50 μg/ml volt. A többi fumonizin azonosítását a HPLC-MS futások alapján végeztem. 5. táblázat: A fumonizinek elválasztására használt gradiens program Idő (perc) 0 1 11,5 15 18 20 22 25
A eluens (%) 70 65 60 40 0 0 70 70
B eluens (%) 30 35 40 60 100 100 30 30
A minőségi azonosításhoz a HPLC-MS spektrométer scan módban üzemelt, pozitív ionokat vizsgálva 100 és 1000 m/z között. A szárító gáz hőmérséklete 300°C volt, és áramlási sebessége 6 l/perc. A porlasztó nyomása 15 psi volt, míg a kapilláris feszültsége 4000V. A 722 m/z karakterisztikus tömegű ion felelt meg a FB1 protonált formájának (
) [44].
Fengycin elválasztásának kromatográfiás körülményei Az elválasztáshoz a fumonizin elválasztásával megegyező HPLC oszlopot használtam. Az A eluens víz, a B eluens acetonitril volt, mindkettő 0,05 térfogatszázalék trifluorecetsav tartalmú volt. Az áramlási sebesség 1 ml/perc volt, oszloptermosztálás nem történt. A gradiens programot az 6. táblázat tartalmazza. Az injektált térfogat 20 μl volt.
26
6. táblázat: A fengycin elválasztására használt gradiens program Idő (perc) 0 20 25 26 27 30
A eluens (%) 60 20 0 0 60 60
B eluens (%) 40 80 100 100 40 40
Tekintettel a nagy áramlási sebességre és az eluens összetételére, az ESI ionforrás előtt egy 1:2 arányú splittelést alkalmaztam, ahol a kisebb rész ment a tömegspektrométerbe. A spektrométer scan módban üzemelt, pozitív ionokat vizsgálva 500 és 1500 m/z között. A szárító gáz hőmérséklete 350°C volt, és áramlási sebessége 12 l/perc. A porlasztó nyomása 40 psi volt, míg a kapilláris feszültsége 4000V. 7. táblázat: A fengycin analógok karakterisztikus tömegei és retenciós idő értékei Név Retenciós idők m/z [M+2H]2+ 1 Fengycin A C15 14,4 14,9 15,2 725,4 2 Fengycin A C16 15,3 15,8 16,1 732,5 3 Fengycin A C17 15,7 16,2 16,5 739,4 4 Fengycin B 16,4 16,9 17,3 739,4 5 Fengycin B C15 17,1 17,3 17,7 739,4 6 Fengycin B C16 17,3 17,9 18,3 746,4 7 Fengycin B C17 18,1 18,8 19,2 753,4 Megjegyzés: A legutolsó szám a szénlánc hosszúságát jelzi, az A jelűek alanint, míg a B jelűek valint tartalmaznak a megfelelő helyen. A 4-es számú fengycin szerkezetét nem sikerült teljesen beazonosítani. Fengycin vékonyréteg-kromatográfiás (TLC) vizsgálata A vékonyréteg lapra Hamilton-fecskendővel 10-10 μl mintát vittem fel. A lapokat 130 ml kloroform, 50 ml metanol és 8 ml tisztított víz keverésével képzett futtató elegyben fejlesztettem. A futtatás után a lapokat megszárítottam majd előhívó reagenst porlasztottam rá, amelyet 47,5 ml etanol, 2,5 ml tömény kénsav és 10 μl ánizsaldehid elegyítésével készítettem. A lapokat megszárítottam majd főzőlapon melegítettem, míg színes foltok nem jelentek meg. A fengycin homológokra R f 0, 2 -t kaptam, a vékonyréteg-lap vázlata a 8. ábrán látható
27
8) ábra: Az előhívott vékonyréteg-lap vázlata
28
4. Mérési eredmények 4.1. Fumonizin tisztítása 4.1.1. Fumonizin minta analitikai mérése és előkészítése Rizs Fusarium verticilloides F16 törzs által végzett, szilárd fázisú fermentációjával kapott fumonizin tartalmú termékből indultam ki, amelyet etil-acetátos majd metanol-vizes extrakciónak vetettem alá. A
fumonizineket
tartalmazó
minta
előkészítése
során
HPLC
mérésekkel
megállapítottam, hogy az etil-acetátos extraktum nem tartalmazott fumonizineket, ellenben az apoláris szennyezők nagy részét képes volt eltávolítani. A metanol-víz eleggyel egymás után képzett extraktumok fumonizin B1 tartalma csökkent, egy kísérleti 4. extraktum már nem tartalmazott FB1-et, így az extrakció hatékonynak mondható. Ezen extraktumok kromatogramja az 9. és 10. ábrán látható, amely alapján jól látható, hogy a fumonizinek mellett rengeteg szennyezőt is tartalmaz a kiindulási anyag. [V] E:\ YLClarity\ Fumonizin_Lac k o_20110711\ Data\ Fumsor_8_13_2011 9_49_57 AM - Detec tor 1
46
18.5 48 18.7 49 18.9 FA2 50 19.1 51 52 53 19.3 19.4 19.6 54
17.6 FB4 45
47
18.4
18.0
43
17.2
16.7
15.9 40 16.1 41 16.2 42
37 14.5
15.0 38 15.3 39
12.3 31 32 12.7 33 12.8 34
11.7 29 11.9 30
28 11.2
8.0 17 8.3 18 8.6 19 8.8 20 9.2 21 9.3 22 9.6 23 9.8 24 10.1 25 10.2 26
5.0 5 5.3 6 5.6 7 5.9 8 6.0 9 6.1 10 6.3 11 6.4 12 6.6 13 6.8 14 6.9 15
3.8
0.2
4.1 3 4.4 4
2
0.4
36
10.6 FB3 27
Voltage
0.6
44
13.3 FB2 35
0.8
14.1
3.4
1
7.1 FB1 16
1.0
0.0
0
5
10
15 Time
9) ábra: A nyers extraktum HPLC-CAD kromatogramja
10) ábra: A nyers extraktum LC-MS TIC kromatogramja
29
20
25 [min.]
4.1.2. Vizsgált oldószerrendszerek a fumonizinek elválasztására A CPC elválasztása megtervezése érdekében oldószerrendszer-teszteket végeztem a fumonizinekre. Az oldószerrendszerek összeállítása után mintát adagoltam, majd megmértem a komponensek megoszlási hányadosát. A fumonizinek elválasztására több hagyományos oldószerrendszert teszteltem, amelyeket a 8. táblázat mutat. Azoknál a rendszereknél, amelyek nem tartalmaztak valamilyen pH-t beállító puffert vagy savat, a megoszlási hányados nehezen reprodukálható és koncentrációfüggő volt, amely magyarázható a fumonizinek savi jellegével. A 9. táblázat tartalmazza az alkalmasabb oldószerrendszereket szelektivitási tényezőit. A legalkalmasabb rendszernek a terc-butil-metil-éter : acetonitril : 0,1% trifluorecetsavas víz 2:2:3 térfogatarányú elegye bizonyult, ezért az FB1, FB2 és FB3 tisztítására ezt az oldószerelegyet választottam a hagyományos CPC futások számára. 8. táblázat: Vizsgált oldószerrendszerek a fumonizinek elválasztására Sorszám 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23.
Oldószerek EtOAc; BuOH; víz EtOAc; víz BuOH; víz BuOH; AcAc; víz BuOH; 0,1% TFA vízben BuOH; 0,2M NaCl vízben BuOH; 0,1% HCOOH in vízben Hex; EtOAc; MeOH; 0,1% TFA vízben EtOAc; BuOH; víz EtOAc; BuOH; víz CHCl3; MeOH; víz CHCl3; MeOH; víz EtOAc; BuOH; víz MTBE; MeCN; víz MTBE; BuOH; MeCN; víz MTBE; BuOH; MeCN; víz MTBE; BuOH; MeCN; víz MTBE; BuOH; MeCN; víz EtOAc; BuOH; 0,1% HCOOH in víz MTBE; BuOH; MeCN; 0,1% HCOOH vízben MTBE; BuOH; MeCN; 0,1% TFA vízben MTBE; MeCN; 0,1% TFA vízben MTBE; MeCN; 0,1% TFA vízben
30
Térfogatarány
K FB1
Megjegyzés
3:2:5 1:1 1:1 4:1:4 1:1 1:1 1:1 3:5:3:5 3,5:1,5:5 3:2:5 4:3:2 4:4:1 2:3:5 2:2:3 4:1:4:6 4:1.5:4:6 4:2:4:6 4:3:4:6 2:3:5 4:1:4:6
1,48
Lassú szétválás Lassú szétválás Opálos
4:1:4:6 2:2:3 6:3:8
3,7 0,018 32,2 55,6 4,6 <0,1 0,15 0,23 >10
Opálos
Egy fázis 0,69 0,04 0,09 1,17 1,63 5,38 5,93
Lassú szétválás
Opálos 2,89 1,17 0,3
9. táblázat: Szelektivitási tényezők a vizsgált oldószereknél K Rt 6.8
FB1, FB3
FB1, FB 2
FB1, R 6.8
2,5 0,4 2,21
1,30
1,69 2,67 1,89
1,11
4,77
0,64
1,69 2,40 1,61 1,34 2,21
1,85
1,75
Sorszám
K FB1
K FB 3
K FB 2
1. 9. 16 17 22.
1,48 0,15 1,17 1,63 1,17
2,5 0,36 1,88 2,19 2,58
t
Megjegyzés: Rt=6,8 az a szennyező, ami pont az FB1 előtt eluál a HPLC kromatogramokon. A fumonizin elválasztásához pH-zóna alkalmazásával négy oldószerrendszert vizsgáltam, amelyeket a 10. táblázat mutat. Ezek közül terc-butil-metil-éter, butanol, acetonitril és víz 2:2:1:5 térfogatarányú elegyének megoszlási hányadosa volt megfelelő mind a savas, mind a bázikus körülmények között. A 11-es ábrán jól látható, hogy a fumonizinek bázikus körülmények között az alsó fázisban (kék) találhatóak, míg a 12-es ábrán látható kromatogramon már a felső fázisban (zöld). 10. táblázat: Megoszlási hányadosok FB1-ra a vizsgált oldószereknél Hexán MTBE MTBE MTBE
1. 2. 3. 4.
Oldószerek EtOAc MeOH Víz MeCN Víz BuOH MeCN
Térfogatarány 1:1:1:1 1:1 2:2:3 2:2:1:5
Víz
Víz
Kbázikus 0,01 0,01 0,05 0,01
Ksavas 0,01 0,01 1,5 12,2
[mV] 250
G:\ YL Clarity\ Fumonizin_Lac k o_20110711\ Data\ F4ba_8_2_2011 2_29_20 PM - Detec tor 1 G:\ YL Clarity\ Fumonizin_Lacko_20110711\ Data\ F4bf_8_2_2011 2_54_36 PM - Detector 1
8,95 FB1
200
17,01
18,97 FB4
16,15 FB2 15,23
14,87
14,41
12,32
12,69 12,89 FB3
11,76
10,58
11,12 11,25
9,99
9,57
7,63 7,78
6,73
6,00 6,26 6,37
4,67
5,04
50
8,29 8,57
3,35
100
3,65
Voltage
150
0
5
10
15 Time
[min.]
11) ábra: A 4. számú ph-zóna rendszer kromatogramja bázikus körülmények között – a kék mutatja az alsó fázist, a sárga a felső fázist
31
[mV] G:\ YL Clarity\ Fumonizin_Lacko_20110711\ Data\ F4sa_8_2_2011 3_19_51 PM - Detector 1 G:\ YL Clarity\ Fumonizin_Lac k o_20110711\ Data\ F4sf_8_2_2011 3_45_08 PM - Detec tor 1 8,62 FB1
300
250
16,67
17,13
15,90 16,08 FB2
15,19
14,77
13,82 14,05
12,85 FB3
11,71 11,99
10,03 10,31
9,61
7,65 7,81
6,57
5,91
4,60 4,92
3,80 4,05
50
8,21 8,33 8,43
100
18,95 FB4 19,10 19,23 19,34 19,46 FA2
150 3,18
Voltage
200
0
5
10
15 Time
20 [min.]
12) ábra: A 4. számú ph-zóna rendszer kromatogramja savas körülmények között – a rózsaszín mutatja az alsó fázist, a zöld a felső fázist 4.1.3. Fumonizin tisztítása pH-zóna módszerrel A CPC forgási sebességnek optimalizálása érdekében mintaadagolás nélküli futást végeztem, amelynek során optimalizált forgási sebesség 2200 fordulat/perc volt, 10 ml/perces áramlási sebesség mellett. Ekkor a nyomár 80±2 bar és az oszlopban maradt állófázis 170 ml volt. A korábbi metanolos-vizes kivonatot bepárlásával kapott, betöményített vizes elegy közvetlen injektálása esetében az állófázis elvesztette teljes retencióját, és nem tapasztaltam jelentős elválasztást. A frakciók ekkor zavarosak voltak, jelezve, hogy a minta bizonyos komponensei segítették a két fázisból emulzió képződését. Amennyiben a betöményített elegyet savas állófázissal extraháltam, úgy nem következett be az elválasztást tönkretevő retencióvesztés. Az extrakció nem volt teljes hatékonyságú, mivel az összes fumonizin B1 mennyiségének csak 55%-a került át az injektált térfogatba, azonban a szennyezők nagy része a vizes fázisban maradt. Az oszlopban maradt állófázis mennyisége legalább 100 ml volt minden esetben. Az injektálással így 98 mg FB1-et tartalmazó keverék elválasztását kezdtem meg. A frakciók HPLC analízise után kiderült, hogy a választott oldószerrendszerrel megvalósított elválasztás többre képes, mint az ioncserélő töltetet alkalmazó dúsító lépés kiváltása, ugyanis bizonyos frakciókban a FB1 tisztasága 90%-ot is elért (lásd 11. táblázat, valamint 13. ábra). Az FB1 tartalmú nagytisztaságú frakciók tartalma 41,5 mg volt, későbbiekben ezekkel dolgoztam tovább, így ezen lépés kitermelése 42%-os volt. A 11.
32
táblázatban szereplő 12 és 13-as frakciót választottam ki további elválasztásra, az FB1 további tisztítása érdekében. A fumonizin B1 mellett a B2 és B3 komponens elválasztása is megfelelőnek bizonyult, ugyanis bizonyos frakciókban lehetővé tette azok jelentős dúsulását a csúcsterület arányában (lásd 12. táblázat és 14. ábra). A 12. táblázatban szereplő mindhárom frakciót kiválasztottam FB2 és FB3 további tisztítására. 11. táblázat: pH-zóna frakciók FB1 tisztasága és tartalma Frakció FB1 tisztasága (%) FB1 tartalma (mg)
11 15 0,8
12 >87 17,4
13 >90 24,0
14 28 6,6
12. táblázat: pH-zóna frakciók FB2 és FB3 tisztasága Frakció FB2 tisztasága (%) FB3 tisztasága ( %)
15 12,6 17,9
16 28,6 28,7
17 26,8 15,8
Megjegyzés: a tisztaságot az adott csúcs alatti terület és az összes terület hányadosaként állapítottam meg (százalékos értékre számolva) [mV] E:\ YLClarity\ Fumonizin_Lac k o_20110711\ Data\ pH6-13f-5x_8_15_2011 12_54_30 PM - Detec tor 1
7.1 FB1 15
400
18.1 25 18.3 26
23 14.6
24
22 12.0
16.4
21 10.9
18 19 9.5 9.7
10.1 FB3 20
16
17
8.3
8.9
12
11 6.0
6.5
9 10 5.5 5.6
4.5 7 4.8 8
1 2 3 4 5 6
100
6.8 13 7.0 14
200
3.3 3.5 3.6 3.8 4.0 4.2
Voltage
300
0
0
5
10
15
Time
13) ábra: A 13-as frakció HPLC-CAD kromatogramja
14) ábra: A 17-es frakció HPLC-CAD kromatogramja 33
20 [min.]
4.1.4. Fumozin további tisztítása a pH-zóna után A hagyományos CPC futások során lehetővé válik a forgási sebesség optimálása a leszorítási művelet alatt. A descendens futás során (melyet az FB1 további tisztítására használtam) az optimalizált forgási sebesség 2200 fordulat/perc volt, az alsó fázis 10 ml/perces áramlási sebessége mellett. Az ascendens futás során (melyet az FB2 és az FB3 további tisztítására használtam) az optimalizált forgási sebesség 2100 fordulat/perc volt, a felső fázis 10 ml/perces áramlási sebessége mellett. Mindkét esetben a nyomás 80±2 bar, az oszlopban maradt állófázis 170 ml volt. Az FB1 további tisztítása során nyert frakciók HPLC-CAD vizsgálatával megállapítottam, hogy ezen lépés képes volt a termék tisztaságának további növelésére. A 12. ábra egy olyan frakció kromatogramját mutatja, ahol a fumonizin B1 tisztasága 97,8% volt. A 15. ábrán is szereplő
frakciónak az FB1 tartalma 16,14 mg, így ennek a lépésnek a
kitermelése 39%-os volt. Az FB2 és FB3 további tisztítása azonban nem volt teljes. Az FB2 esetében a tisztaságot 70,2%-ra, míg az FB3 esetében a tisztaságot 76,1%-ra sikerült növelni (lásd 16. és 17. ábra). Tekintettel arra, hogy ez az oldószerrendszer az FB1 elválasztására volt optimalizálva, az FB2 és az FB3 megoszlása is erőteljesen a felső fázis felé van eltolva, amely alacsony retenciós térfogatot eredményezett. Ezekre a vegyületekre célzott oldószerrendszer megválasztásával hatékonyabb elválasztási módszer fejleszthető.
15) ábra: Egy fumonizin B1-re nézve 97,8% tisztaságú frakció HPLC-CAD kromatogramja
34
16) ábra: Egy fumonizin B2-re nézve 70,2%-os tisztaságú frakció HPLC-CAD kromatogramja
17) ábra: Egy fumonizin B3-re nézve 76,1%-os tisztaságú frakció HPLC-CAD kromatogramja A korábbi pH-zóna és ezen poláris oldószerrendszert alkalmazó hagyományos CPC módszer kombinálásával egy olyan teljes tisztítási eljárást kaptam, amellyel lehetővé válik analitikai standard tisztaságú termékek előállítása a fumonizin B1 vegyületből. A módszer kivitelezési költsége lényegesen kisebb az irodalomban találhatókénál, tekintve hogy az elválasztás során nem használtunk fel drága ioncserélő tölteteket, sziligagél állófázist, valamint a felhasznált oldószerek mennyisége és minőségi követelménye is kisebb volt. Az eljárás teljes kitermelése 8,9%-os, azonban ez jelentősen javítható a további elválasztások során azzal, hogy az alacsonyabb tisztaságú frakciókat visszatápláljuk a következő elválasztás kezdetére. További optimalizálásával könnyedén elérhető, hogy a többi fumonizin, köztük az FB2 és az FB3 is hasonló tisztasággal legyen előállítható hasonló feltételekkel.
35
4.2. Fengyicin tisztítása 4.2.1. Vizsgált oldószerrendszerek a fengycin elválasztására A fengycinek elválasztásához pH-zóna illetve ionpárképző reagens alkalmazásával több poláris
oldószerrendszert
vizsgáltam,
oldószerrendszerek közül egyedül a
amelyeket
a
terc-butil-metil-éter,
13.
táblázat
mutat.
Az
acetonitril és víz 4:1:5
térfogatarányú elegye bizonyult megfelelőnek. Ehhez a rendszerhez tartozó kromatogramokat a 18. és 19. ábra mutatja. Általánosságban elmondható, hogy az ionpárképző reagens alkalmazása nélkül a célkomponensek megoszlásai erősen az alsó fázis fele irányultak, míg annak alkalmazásával a megoszlás teljesen a felső fázis fele tolódott el. Ionpárképző reagens esetén így az oldószerrendszert az apolárisabb irányba kellett volna eltolni, azonban ekkor az elválasztás egyik alkalmazási feltétele sérült volna, miszerint a reagensnek csak elhanyagolható mennyisége lehet a mobil fázisban. 13. táblázat: Megoszlási hányadosok a fengycinre a vizsgált oldószereknél 1. 2. 3. 4. 5. 6.
Oldószerrendszer MTBE:MeCN:Víz MTBE:MeCN:Víz MTBE:MeCN:Víz MTBE:MeCN:Víz MTBE:Víz MTBE:Víz
Térfogatarány 4:1:5 6:3:8 2:2:3 4:1:5 1:1 1:1
Kbázikus <0,1 <0,1 <0,1 >10 >10 >10
Ksavas ~2 <0,1 <0,1 >10 >10 >10
DEHPA
10% felsőben 10% felsőben 2,5% felsőben
18) ábra: Az 1. számú pH-zóna rendszer kromatogramja bázikus körülmények között – a fekete mutatja az alsó fázist, a lila a felső fázist
36
19) ábra: Az 1. számú pH-zóna rendszer kromatogramja savas körülmények között – a piros mutatja az alsó fázist, a zöld a felső fázist 4.2.2. Fengycin tisztítása pH-zóna módszerrel A pH-zóna módszer alkalmazása esetén a fengycinek pH=4 körül eluálódtak, de a fengycin homológok nem váltak el egymástól, valamint nem sikerült több szennyezőtől való elválasztás sem (lásd 20. és 21. ábra). Ez azzal magyarázható, hogy a megoszlási hányodosok pH függése közel azonos. Tekintve, hogy az ionpárképző reagens alkalmazása nem bizonyult használhatónak az oldószerpróbák során, így pH-zónán vagy affinitás kromatográfián alapuló elválasztási módszer kidolgozásához még további kísérletekre van szükség.
20) ábra: A kiindulási anyag HPLC-CAD kromatogramja
37
21) ábra: A pH-zóna tisztítás fengycin tartalmú frakciójának HPLC-CAD kromatogramja 4.2.3. Fengycin tisztítása kloroform-metanol-víz rendszerben Tekintettel arra, hogy a pH-zóna módszer nem adott megfelelő tisztaságot a fengycinre, egy peptidek elválasztására általánosan alkalmas rendszerrel próbálkoztam, amely kloforom metanol és víz 5:4:3 térfogatarányú elegye volt. Az oszlopban a hidrodinamikai egyensúly a leszorítás során 1250 fordulat/perc forgási sebesség mellett állt be. Az elválasztás kezdetén, a minta injektálása után erőteljes oszlopvérzést tapasztaltam. Elválasztás előtt 68% retenciót számoltam, amely elválasztás alatti oszlopvérzés miatt közel 50%-ra csökkent, de a hidrodinamikai egyensúly újra helyreállt. A HPLC vizsgálatok alapján ez a módszer alkalmas volt a fengycin homológok részleges elválasztására, 14. táblázat bemutatja az egyes frakciók tisztaságait. Az egyes frakciók kromatogramjait a 22-25. ábrák mutatják.
38
14. táblázat: Fengycin homológok tisztasága az egyes frakciókban Fengycin- FengycinA-C15 A-C16 0 0 0 0 0 1,3 0 5,5 0 14,1 2,4 22,2 3,7 21,6
Tisztaság (%) Fengycin- Fengycin- Fengycin- Fengycin- FengycinA-C17 B B-C-C15 B-C16 B-C17 0 0 0 0 11,8 0 0 3,2 7,5 14,4 6,7 26,8 16,4 8 0 26,9 21,6 6,8 2 0 29,6 9,7 3,3 0 0 18,1 0 0 0 0 13,1 0 0 0 0
Frakció F12. F13. F14. F15. F16. F17. F18. Egyesített pH-zóna frakciók 5,8 7,3 7,2 4,5 2,9 2,6 Megjegyzés: a tisztaság az adott csúcs alatti terület osztva az összes csúcs alatti területtel.
2
Tekintettel arra, hogy a retenció az elválasztás elején csökkent, lecsökkent az egyes kromatográfiás csúcsok közötti felbontás. A mintaelőkészítés megfelelő módosításával el kell távolítani az oszlopvérzést okozó szennyezőket, ezáltal a módszer további fejlesztése során elérhető a jobb elválasztás.
22) ábra: A fengycin F13 frakció HPLC-CAD kromatogramja
39
23) ábra: A fengycin F14 frakció HPLC-CAD kromatogramja
24) ábra: A fengycin F16 frakció HPLC-CAD kromatogramja
25) ábra: A fengycin F18 frakció HPLC-CAD kromatogramja
40
Összefoglalás Szakdolgozati munkám során egy hazánkban új és egyedülálló módszerrel, a centrifugális megoszlási kromatográfiával foglalkoztam. Segítségével elválasztásokat dolgoztam ki mikrobiológiai fermentációból származó szekunder metabolitok tisztítására. A Fusarium verticilloides F16 törzse képes több fumonizin mikotoxin termelésére. A fumonizin B1 vegyületre sikeresen dolgoztam ki olyan alacsony költségű és könnyen méretnövelhető eljárást, amely alkalmas analitikai standard előállítására. Az elválasztás termékét így fel lehet használni a takarmányok és az élelmiszerek ellenőrzése során. Az oldószerrendszer hangolásával a többi fumonizinre, lehetővé válhat analitikai standard előállítása azokból is. Tekintve, hogy az eljárás kitermelése alacsonyabb prioritást élvezett a termék tisztaságán, de a fel nem használt frakciók visszatáplálásával az elválasztás elejére javítható a kitermelés a méretnövelés során. A Bacillus mojavensis IP4 törzse képes a fengycin nevű erős felületaktív és antibiotikus hatású vegyület termelésére. Munkám során több elválasztási módszer alkalmazását kíséreltem meg, amelyek közül a kloroform-metanol-víz rendszer lehetővé tette a részleges elválasztást. A módszer további fejlesztésével, beleértve az oszlopvérzés megakadályozását, elérhető a teljes elválasztás erre a potenciális farmakonra.
41
Rövidítések jegyzéke Rövidítés CPC FB1 FB2 FB3 HPLC prep-HPLC NOEL TDI SAX WHO IPCS TLC A.R. HPLC-MS
MeOH BuOH MTBE MeCN EtOAc TFA HEMWat rpm
Angol Centrifugal Partition Chromatography Fumonisin B1 Fumonisin B2 FUmonisin B3 High Performance Liquid Chromatography Preparative HPLC No Observed Effect Level Tolerable Daily Intake Soft Anion Exchange World Health Organization International Program on Chemical Safety Thin Layer Chromatography Analitical Reagent Grade High Performance Liquid Chromatography hyphenated with Mass Spectrometry Methanol 1-buthanol Methyl-tert-buthyl-ether Acetonitrile Ethyl-acetate Trifluoroacetic-acid Solvent system using hexane, ethylacetate, methanol and water Rounds per minute
42
Magyar Centrifugális megoszlási kromatográfia Fumonizin B1 Fumonizin B2 Fumonizin B3 Nagy teljesítőképességű folyadék kromatográfia Preparatív HPLC Tapasztalt hatás alatti szint Maximális napi beviteli mennyiség Lágy anioncserélő töltet Egészségügyi Világszervezet Nemzetközi Kémiai Biztonsági Program Vékonyréteg kromatográfia Analitikai reagens minőség Nagy teljesítőképességű kromatográfia csatolva tömegspektrometriával Metanol Butan-1-ol terc-butil-metil-éter Acetonitril Etil-acetát Trifluorecetsav Hexánt, etil-acetátot, metanolt és vizet alkalmazó oldószerrendszer fordulat percenként
Irodalomjegyzék [1] Dudley H. Williams, Martin J. Stone, Peter R. Hauck, and Shirley K. Rahman, "Why are secondary metabolites (natural products) biosynthesized," Journal of Natural Products, vol. 52, no. 6, pp. 1189-1208, 1989. [2] Walter F.O. Maracas, Enviromental Health Perspectives, vol. 109, pp. 239-243, 2001. [3] J. C. Frisvad, J. Smedsgaard, R. A. Samson, T. O. Larsen, and U. Thrane, J.of Agric. and Food Chem., vol. 55, pp. 9727-9732, 2007. [4] J. Varga et al., Int. J. of Food Microbio., vol. 143, pp. 143-149, 2010. [5] A. Logrieco, A Bottalico, G. Mulé, A. Moretti, and G. Perrone, Eur. J. of Plant Pathology, vol. 109, pp. 545-557, 2003. [6] S. M. Musser and R. D. Plattner, J. of Agric. and Food Chem., vol. 45, pp. 1169-1173, 1997. [7] M.E. Stack, J. AOAC Int., vol. 81, p. 737, 1998. [8] W.C.A. Gelderblom et al., Toxicology, vol. 161, pp. 1152-60, 2001. [9] Scientific Committee on Food, "Updated opinion of the Scientific Comittee on Food on Fuminisin B1, B2 and B3," in European Comission, Brussel, Belgium, 2003. [10] Hans P. van Egmond, Anal Bioanal Chem, vol. 378, 2004. [11] Szeitzné Szabó Mária, "Gabonaalapú élelmiszerek fuzáriumtoxin szennyezettségének csökkentési lehetőségei," MÉBIH, Budapest, 2009. [12] G S Shephard, "Chromatographic determination of the fumonisin mycotoxins," Journal of Chromatography, vol. 815, pp. 31-39, 1998. [13] I. Arranz, W.R.G. Baeyens, G. Van Der Weken, S. De Saeger, and C. Van Peteghem, Critical Review in Food Science and Nutrition, vol. 44, pp. 195-203, 2004. [14] C. M. Lino, L. J. G. Silve, A. L. S. Pena, and M. I. Silveria, Anal. Bioanal. Chem., vol. 384, pp. 1214-1220, 2006. [15] J. G. Wilkes, J. B. Sutherland, M. I. Churchwell, and A. J. Williams, J. of Chrom. A, vol. 695, pp. 319-323, 1995. [16] J. Wank, Y. Zhou, and Q. Wang, Food Chemistry, 2007. [17] M. Sulyok, R. Krska, and R. Schuhmacher, Anal. Bioanal. Chem., vol. 389, pp. 15051523, 2007.
43
[18] W.T. Allaben, J.R. Bucher, and P.C. Howard, "Toxicology of Fumonisin," Environmental Health Perspectives, vol. 109, p. Supplement 2., 2001. [19] M.K. Gurjar, V. Rajendrad, and B.V. Rao, Terahedron Lett., vol. 39, pp. 3803-3806, 1998. [20] F.I. Meredith, C.W. Bacon, W.P. Norred, and R.D. Plattner, Adv Exp Med Biol, vol. 392, pp. 113-22, 1996. [21] J.D. Miller., M.E. Savard, and S. Raplor, Natural toxins, vol. 2, pp. 354-359, 1994. [22] Eric Akpa et al., "Influence of Culture Conditions on Lipopeptide Production by Bacillus subtilis," Applied Biochemistry and Biotechnology, vol. 91-93, pp. 551-561, 2001. [23] Magali Deleu, Michel Paquot, and Tommy Nylander, "Effect of Fengycin, a Lipopeptide Produced by Bacillus subtilis, on Model Biomembranes," Biophysical Journal, vol. 94, no. 7, pp. 2667-2679, 2008. [24] D.G. Cooper, C.R. Macdonald, S.J.B. Duff, and N. Kosaric, "Enhanced Production of Surfactin from Bacillus subtillis by Continouos Product Removal and Metal Cation Additions," Applied and Environmental Microbiology, vol. 42, no. 3, pp. 408-412, 1981. [25] Andreia Fonseca de Faria et al., "Purification and structural characterization of fengycin homologues produced by Bacillus subtilis LSFM-05 grown on raw glycerol," J Ind Microbiol Biotechnol, vol. 38, pp. 863-871, 2011. [26] Mohd Hafez Isa, Richard A. Frazier, and Paula Jauregi, "A further sutdy of the recovery and purification of surfactin from fermentation borth by membrane filtration," Separation and Purification Technology, vol. 64, pp. 176-182, 2008. [27] A. P. Foucault, Centrifugal Partition Chromatography. New York, Basel, Hong Kong: Marcel Dekker, Inc., 1994, vol. 68: Centrifugal Partition Chromatography. [28] J. B. Friesen and G. F. Pauli, J. of Liq. Chrom. Rel. Tech., vol. 28, pp. 2777-2806, 2005. [29] J. M. Sørensen and R. Arlt, Liquid-Liqguid Equilibrium Data Collection, eds. Behrens and R. Eckermann, Ed. New York, USA: Scholium International, 1980. [30] I. Yoichiro, J. of Chromatography A, vol. 1065, pp. 145-168, 2005. [31] Armen instrument. (megnyitás: 2012.V.13.) Introduction to centrifugal partition chromatography CPC/CCC. [Online]. http://edisonhouse.hu/pdf/Armen%20SCPC%20presentation.pdf [32] G. F. Pauli, S. M. Pro, and J. B. Friesen, J. of Natural Products, pp. 1489-1508, 2008.
44
[33] J-C Delaunay, C. Castagnino, C. Chéze, and J. Vercauteren, J. of Chrom. A., vol. 964, pp. 123-128, 2002. [34] A. Marston and K. Hostettmann, J. of Chrom. A, vol. 1112, pp. 181-194, 2006. [35] H. Oka, K. Harada, Y. Ito, and Y. Ito, J. of Chrom. A., vol. 812, pp. 35-52, 1998. [36] Jianwei He et al., J. of Chrom. A, vol. 1151, pp. 187-192, 2007. [37] J. He, R. Tsao, R. Yang, and T. Zhou, Food Additives & Contaminants: Part A, vol. 26, pp. 101-107, 2009. [38] Yoichiro Ito and Ying Ma, "pH-Zone-refining countercurrent chromatography," Journal of Chromatography A, vol. 753, pp. 1-36, 1996. [39] J-H. Renault et al., J. of Chrom. A, pp. 421-431, 1999. [40] A. Maurya, S. Gupta, S. Negi, and S. K. Srivastava, J. Sep. Sci., vol. 32, pp. 3126-32, 2009. [41] H. Schott, Affinity Chromatography. New York: Marcel Dekker, 1984. [42] Eva Pérez, Maria J. Santos, and Cristina Minguillón, "Application of cellulose and amylose arylcarbamates as chiral selectors in counter-current chromatography," Journal of Chromatography A, vol. 1107, pp. 165-174, 2006. [43] Ying Ma and Yoichoro Ito, "Affinity Countercurrent Chromatography Using a Ligand in the Stationary Phase," Analitical Chemistry, vol. 68, pp. 1207-1211, 1996. [44] T. Bartók, Á. Szécsi, A. Szekeres, Á. Mesterházy, and M. Bartók, Rapic Commun Mass Spectrom, vol. 20, pp. 2447-2462, 2006. [45] K. Duncan, S. Kruger, N. Zabe, B. Kohn, and R. Prioli, J. Chromatogr. A., vol. 815, pp. 41-47, 1998. [46] C.L. Pereira, Yi-Hung Chen, and F.E. McDonald, J. of Am. Chem. Soc., vol. 131, pp. 6066-6067, 2009.
45
