NIPT: praktische aspecten, eerste resultaten en een blik vooruit. Kornelia Neveling (PhD) en Lean Beulen (MD) 4 th November 2014

NIPT: praktische aspecten, eerste resultaten en een blik vooruit Kornelia Neveling (PhD) en Lean Beulen (MD) 4th November 2014

Inhoud • Wat is NIPT? • Hoe werkt NIPT? (van bloedafname tot testresultaat) • Betrouwbaarheid NIPT

• Technische ontwikkelingen • Klinische (proef)implementatie • Counseling

• Eerste resultaten • Een blik vooruit

Human Genetics Nijmegen

Wat is NIPT?


NIPT Non-invasive prenatal testing • niet-invasieve prenatale test • bij vrouwen met verhoogd risico op T21/T18/T13

> prenataal onderzoek zonder invasieve ingreep (vlokkentest of vruchtwaterpunctie) mogelijk • vermijden van kans op miskraam (3-5 op 1000 testen)

http://www.meerovernipt.nl


Wat is een trisomie? • een gezond individu heeft 46 chromosomen in een cel (23 van moeder en 23 van vader) • twee zijn geslachtschromosomen (XX of XY) • 44 autosomen: chr 1 tot en met chr 22 (2x) > diploïd • trisomie: 3 in plaats van 2 kopieën van een chromosoom • foutje in celdeling van eicel of zaadcel • vaak oorzaak van ernstige aandoening van het kind

Trisomie 21 (downsyndroom) Trisomie 18 (edwardssyndroom) Trisomie 13 (patausyndroom)


Testen op een trisomie combinatietest: > bloedtest, nekplooimeeting, maternale leeftijd > bij verhoogd risico: vlokkentest of vruchtwaterpunctie

nieuw: mogelijkheid om niet-invasief onderzoek te doen

1997


Wat betekent dat? • chromosomen bestaan uit DNA • in het bloed van de moeder: DNA-fragmenten van foetus

> circulating cell-free fetal DNA (ccffDNA) • afkomstig van placenta • sterk gefragmenteerd • detecteerbaar vanaf week 5 van zwangerschap • in totaal: ~2-10 ng ccf DNA per ml maternaal plasma • slechts 5-15% hiervan is foetaal DNA • dit foetaal DNA onderzoeken op T13/18/21 Hui and Bianchi, Trends in Genetics, 2013


Verschillen zijn heel subtiel

Lo LYM, Chiu RWK. Nat Rev Genet, 2007;8:71-77.

trisomie 21

monster

% foetaal DNA

 chr 21 (%)

 chr 21 (-fold)

chorionic villus

100%

50%

1.5

maternaal plasma

~10%

5%

1.05

• de techniek moet heel subtiele verschillen kunnen detecteren • minstens 10 million reads/monster Human Genetics Nijmegen

Hoe werkt het?


Bloed afnemen > DNA isoleren > sequencing placenta Maternal blood

Fetal DNA

• DNA isolatie • sequencing (NGS) Maternal DNA

> bepalen van sequentie (lezen van DNA)

> informatie interpreteren Human Genetics Nijmegen

DNA voorbereiden…

genomisch DNA

DNA fragmenteren

adaptoren binden

sequentie amplificeren

vertalen naar miljoenen losse reads

AAGTGTTGAGGCTTTGTGATGCTTATATTATATTAGCAAACTTAGA Human Genetics Nijmegen

Lezen van de DNA we vergelijken de reads met een bekende referentie sequentie (mapping) chromosoom 3

Reference Genome

chromosoom 15

> nu weten we waar de fragmenten DNA vandaan komen > voor elk chromosoom hebben we vele fragmenten DNA gelezen > en dan tellen we: hoeveel fragmenten DNA (reads) zien we per chromosoom?


Hoeveel reads per chromosoom? Bepalen of er van een chromosoom meer (of minder) materiaal aanwezig is, ten opzichte van een referentie set van normale individuen/plasma’s

subtiel verschil!!!


Goede analyse tools nodig: Z-score • tellen van alle reads op een chromosoom • corrigeren voor het gemiddelde aantal reads (referentie monsters) • berekenen van een score Z-score =

% reads (monster) – gemiddelde % reads (ref) standaarddeviatie (ref)

• Z-score < -3 = loss/monosomie

• Z-score > 3 = gain/trisomie


Betere analyse tools beschikbaar vele verschillende opties:  Z-score (Chiu et al., 2008)  Normalized Chromosome Value (Sehnert et al., 2011)  student’s t -test-based (Jiang et al., 2012)  WISECONDOR (Straver et al., 2013)  .....

WISECONDOR: within sample copy number aberration detector


Resultaten WISECONDOR – Voorbeeld 1 chromosoom 13

chromosoom 18

chromosoom 21

> Wisecondor kijkt naar alle autosomen, niet naar geslachtschromosomen Human Genetics Nijmegen

Voorbeeld 2

duplicatie 18p


Voorbeeld 3

15 Mb deletie op 11p


Hoe betrouwbaar zijn de resultaten?


Sensitiviteit en specificiteit

Sensitiviteit: T21: 99% T18: 97% T13: 92%

N

N T21

Sensitivity

Specificity

Chiu 2011

232

86

100%

97,9%

Ehrich 2011

449

39

100%

99,8%

Palomaki 2011

1683

212

98,6%

99,8%

Sehnert 2011

47

13

100%

100%

Ashoor 2012

397

50

100%

100%

Bianchi 2012

493

89

100%

100%

Lau 2012

108

11

100%

100%

Norton 2012

3080

81

100%

99,97%

Sparks 2012

167

36

100%

100%

Jiang 2012

903

16

100%

100%

Liang 2013

412

40

100%

100%

Nicolaides 2013

242

25

100%

100%


Discrepanties Mogelijke oorzaken voor discrepanties: • Technisch (waaronder lage foetale fractie) • Vanishing twin • Confined placental mosaicism (CPM, mozaïek beperkt tot placenta) • Maternaal of foetaal mozaïek • Maternale deletie of duplicatie • Maternale geslachtschromosomale afwijking • Maternale maligniteit

Osborne et al., Prenat Diagn 2013, 33(6),609–611 NIPT (duplo metingen)  trisomie 13  monosomie 18?  vruchtwater  46,XY en normaal array profiel  Postnatale analyse van placenta biopten  normaal > Maternale tumor met cytogenetisch numerieke afwijkingen (#13 als #18)


Wat kunnen we (niet) met NIPT? • test is gevalideerd voor - Trisomie 21 (downsyndroom) - Trisomie 18 (edwardssyndroom) - Trisomie 13 (patausyndroom) • WISECONDOR detecteert ook andere trisomieën • grotere partiële afwijkingen (>15 Mb) op dit moment niet mogelijk (in Nederland): • detecteren van (veranderingen op) geslachtschromosomen • kleine partiële afwijkingen (<15 Mb) niet mogelijk met deze test: • triploïdie • gebalanceerde translokaties • puntmutaties in genen Human Genetics Nijmegen

 ()

Technische ontwikkelingen


April-September: sequencen op SOLiD 5500XL

• SOLiD 5500XL

• 32 sample op 1 flowchip • run tijd 6-7 dagen


April-September: sequencen op SOLiD 5500XL Week 1

ma/di:

Binnenkomst materiaal Afdraaien  plasma scheiden van buffy coat

Week 2

di/woe:

DNA isolatie

do/vrij

Library prep

ma/di

ePCR en starten NGS machine (5500xl) Runnen NGS machine

Week 3

do/vrij

Week 4

ma


Data analyse en interpretatie Uitslag

3 wkn

Sinds September: 2 NextSeq 500 (Illumina)

• NextSeq500 (Illumina) • max 24 samples op een run • run tijd: 11 uur (!!!)


Sinds September: 2 NextSeq 500 (Illumina) Week 1

ma/di:

Binnenkomst materiaal

Afdraaien  plasma scheiden van buffy coat di/woe:

Week 2

DNA isolatie / Library prep

do

Library prep

vrij

Runnen NGS machine (NextSeq)

ma

Data analyse en interpretatie

di

Uitslag


(>) 1 week

Verdere technische ontwikkelingen • kleinere afwijkingen • geslachtschromosomen • meten (en verrijken) van foetale fractie • ontwikkeling van sample tracking methode

• gebruiken van Streck®-buizen (of andere buizen) hoeveelheid ccffDNA kritisch: • zichtbaar vanaf week 5 in zwangerschap • percentage foetaal DNA voldoende vanaf ~ week 10

Wat kunt u doen? • stuur (4x) 10ml EDTA bloed • let op positie van de sticker!


XXXX

NIPT: praktische aspecten, eerste resultaten en een blik vooruit. Kornelia Neveling (PhD) en Lean Beulen (MD) 4 th November 2014

Recommend Documents