NG) Test

® Chlamydia trachomatis/Neisseria gonorrhoeae (CT/NG) Test

PRO ÚČELY DIAGNOSTIKY IN VITRO. AMPLICOR® CT/NG Specimen Preparation Kit

CT/NG PREP

100 Tests

P/N: 20759414 122 ART: 07 5941 4 US: 83315

AMPLICOR® CT/NG Amplification Kit

CT/NG AMP

96 Tests

P/N: 20759902 122 ART: 07 5990 2 US: 83319

AMPLICOR® Chlamydia trachomatis Detection Kit

CT MWP DK

96 Tests

P/N: 20753491 122 ART: 07 5349 1 US: 83252

AMPLICOR® Neisseria gonorrhoeae Detection Kit

NG MWP DK

96 Tests

P/N: 20744026 122 ART: 07 4402 6 US: 83020

Následující kit AMPLICOR® CT/NG Amplification Kit lze použít k detekci amplifikované vnitřní kontroly CT/NG. Při testování vzorků moči nebo výtěrů přenesených do kultivačního transportního media pro Chlamydia záleží na uživateli, rozhodne-li se vnitřní kontrolu stanovit. Detekce vnitřní kontroly je nezbytná u výtěrů přenesených do AMPLICOR® STD Swab Specimen Collection and Transport Kit. AMPLICOR® Internal Control Detection Kit

IC MWP DK

96 Tests

P/N: 20763306 122 ART: 07 6330 6 US: 83324

Následující kit lze použít pro sběr a transport výtěrů z děložního hrdla a močové trubice. AMPLICOR® STD Swab Specimen Collection and Transport Kit

STD SWAB

50 Tests

P/N: 20753920 122 ART: 07 5392 0 US: 83075

POUŽITÍ AMPLICOR® Chlamydia trachomatis/Neisseria gonorrhoeae (CT/NG) Test je kvalitativní test pro detekci Chlamydia trachomatis a/nebo Neisseria gonorrhoeae v moči mužů i žen, ve výtěrech z děložního krčku a ve výtěrech z močové trubice u mužů in vitro. Test využívá amplifikace nukleových kyselin pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) a hybridizace nukleových kyselin k detekci C. trachomatis a/nebo N. gonorrhoeae ve vzorcích z urogenitálního traktu. SOUHRN A PRINCIP TESTU Chlamydia trachomatis Chlamydia jsou gram-negativní, nepohyblivé bakterie, které se vyskytují jako obligátní vnitrobuněční parazité eukaryotických buněk, neboť nemají schopnost syntetizovat ATP. Rozlišujeme čtyři druhy chlamydií; C. trachomatis a C. pneumoniae (TWAR) jsou primárně lidskými patogeny a C. pecorum a C. psittaci jsou primárně patogeny zvířecí1-3. C. trachomatis infekce jsou dnes považovány za hlavní příčinu přenosných pohlavních chorob (STD) ve Spojených státech, kde je ročně hlášeno více než 3 milliony případů ročně4. Ve světě je chlamydiová infekce druhou nejrozšířenější pohlavně přenosnou chorobou (STD) s přibližně 89,1 milliony případů ročně5. C. trachomatis je známo, že vyvolává onemocnění děložního čípku, zánětlivá onemocnění ledvinové pánvičky (PID), zánět očních spojivek u dětí, dětskou pneumonii, zánět močové trubice, epididymitidu a proktitidu1,6. C. trachomatis je rovněž nejčastější příčinou (přibližně v 25–55% případech) non-gonokokového zánětu močové trubice u mužů. U neléčených žen jsou následky chlamydiální infekce závažné. Vzhledem k tomu, že zhruba tři čtvrtiny těchto infekcí jsou asymptomatické, zůstává mnoho případů onemocnění nezjištěno a tedy neléčeno, což vede k dalším komplikacím zvláště u těhotných žen. U dětí narozených matkám infikovaným chlamydiemi je vysoké riziko onemocnění zánětem očních spojivek a zánětem plic.

1

K detekci C. trachomatis v klinických vzorcích je k dispozici několik metod. Tyto metody zahrnují přímé barvení infikované tkáně Giemsou, zjišťování přítomnosti shluků chlamydií v infikovaných buněčných kulturách měřením fluorescence obarvených protilátek, přímou detekcí antigenů měřením fluorescence obarvených protilátek a sond nukleových kyselin1,7-9. Metoda měření fluorescence obarvených monoklonálních protilátek v kulturách je všeobecně považována za zlatý standard6. Protože citlivost chlamydiálních kultur není 100%, doporučuje se rozšířit zlatý standard o širokospektrý test, kterým lze identifikovat i ty infikované vzorky, které neodhalil test provedený na kulturách10. Neisseria gonorrhoeae N. gonorrhoeae (gonokok) vyvolávají kapavku. N. gonorrhoeae jsou gram negativní diplokoky, pozitivní na cytochromoxidázu, jsou nepohyblivé a nevytvářejí spory11-13. N. gonorrhoeae je blízkou příbuznou N. meningitidis (meningokok), která vyvolává onemocnění jedním z typů bakteriální meningitidy a poněkud vzdálenější příbuznou N. lactamica, občasným lidským patogenem. Obě N. gonorrhoeae i N. meningitidis napadají výhradně lidi. Existují další druhy Neisseria které jsou považovány u lidí za běžnou flóru včetně N. cinerea, N. elongata, N. flavescens, N. mucosa, N. sicca, a N. subflava11,12. Infekce gonokokem Neisseria gonorrhoeae jsou třetí nejčastější příčinou STD s celosvětově 62,2 miliony případů ročně5. U mužů toto onemocnění zpravidla končí ventrální uretritidou doprovázenou hnisavým výtokem. U žen je onemocněním nejčastěji zasaženo děložní hrdlo ale infikovány mohou být též vagina a děloha12,14. Stanovení diagnózy onemocnění kapavkou je založeno na zjištění přítomnosti N. gonorrhoeae v kultuře a následným morfologickým vyšetřením založeným na přítomnosti cytochromoxidázy12,14,15. Jiné testy potvrzující správnost diagnózy N. gonorrhoeae jsou založeny na spotřebě uhlohydrátů (fermentace cukrů), aglutinaci, fluorescencí obarvených protilátek a sond DNA11-13,15. Za mezinárodní zlatý standard bezpečné identifikace N. gonorrhoeae je všeobecně považována izolace kolonií N. gonorrhoeae na modifikovaném Thayer Martin mediu po 72 hodinové inkubaci při 34–36°C; pozitivní oxidázový test, vizualizace gram negativních diplokoků a test na odbourávání uhlovodanů16. PRACOVNÍ POSTUP AMPLICOR® CT/NG Test obsahuje čtyři fáze: příprava vzorků; PCR amplifikace17,18 terčová DNA s použitím biotinylovaných primerů; hybridizace amplifikovaných productů s oligonukleotidovými sondami specifickými pro terčovou sekvenci (terčové sekvence); a kolorimetrickou detekci produktů amplifikace vázaných k sondě. AMPLICOR® CT/NG Test umožňuje současně amplifikaci C. trachomatis cílové DNA, N. gonorrhoeae cílové DNA a vnitřní kontroly (IC) DNA. Činidlo Master Mix obsahuje biotinylované páry primerů specifických jak pro C. trachomatis, N. gonorrhoeae tak pro vnitřní kontrolu. Detekce amplifikované DNA C. trachomatis a/nebo amplifikované DNA N. gonorrhoeae je na rozhodnutí uživatele. Při vyšetřování výtěrů získaných a transportovaných pomocí AMPLICOR® STD Swab Specimen Collection a Transport Kit je detekce vnitřních kontrol CT/NG IC nutná. Při vyšetřování vzorků moče nebo výtěrů přenášených v transportním mediu pro kultury chlamydií je detekce vnitřních kontrol CT/NG IC na rozhodnutí uživatele. Příprava vzorku Z epiteliálních buněk, leukocytů a přidružených buněk C. trachomatis a N. gonorrhoeae, přítomných ve výtěrech nebo peletách z moči se působením detergentu uvolní chlamydiální DNA obsažená ve vláknech chlamýdií a DNA z neiserií. Přidáním dalšího detergentu se získá lýzovaný vzorek pro amplifikaci. PCR amplifikace Amplifikace terče Vedle chromozomální DNA obsahuje C. trachomatis kryptický plazmid (se zhruba 7500 páry bází), který je společný všem serovarům C. trachomatis19,20. AMPLICOR® CT/NG Test využívá k určení sekvence přibližně 208 nukleotidů DNA přítomné ve skrytých plazmidech C. trachomatis primerů CP24 a CP27. Výběr cílové sekvence N. gonorrhoeae závisí na identifikaci úseků genomu N. gonorrhoeae vykazujících maximální konzervaci sekvencí mezi různými kmeny. AMPLICOR® CT/NG Test využívá k určení sekvence 201 nukleotidů uvažované cytosin DNA metyltransferázy genu N. gonorrhoeae primerů SS01 a SS0221. Zpracované vzorky se přidají k amplifikační směsi do reagenčních zkumavek, ve kterých probíhá PCR. Termální cykler zahřeje reakční směs ve zkumavkách. Zahřátím se denaturuje dvojvláknová DNA a odkryje se sekvence terčového primeru. Při chladnutí směsi se biotynylované primery CP24 a CP27 naváží na C. trachomatis a vnitřní kontrolu cílové DNA a biotinylované primery SS01 a SS02 se naváží na N. gonorrhoeae cílové DNA. Působením termostabilní DNA polymerázy, Taq polymerase, se v přítomnosti nadbytku deoxynucleosidtrifosfatáz (dNTPs) deoxyadenosintrifosfatázy, deoxyguanosintrifosfatázy, deoxycytidintrifosfatázy a deoxyuridintrifosfatázy (na místo deoxythymidintrifosfatázy), prodlouží navázané primery podél terčových templátů za vzniku sekvence DNA nazývané amplikon. Tento proces se mnohokrát opakuje a v každém cyklu se množství amplikonu zdvojnásobuje.

2

Amplifikace vnitřní kontroly Rozsah amplifikace pomocí enzymu jakým je PCR může být snížena v přítomností inhibitoru, který může být obsažen v klinickém vzorku. Proto se k setu AMPLICOR® CT/NG Test přidává vnitřní kontrola CT/NG, což umožňuje zjistit, zda vyšetřované vzorky neobsahují látky, které by mohly bránit amplifikaci PCR. Vnitřní kontrola CT/NG je DNA plazmid s oblastmi vázajícími primery, které jsou identické s terčovou sekvencí CT, randomizovaná interní sekvence podobné délky a podobného složení bází jakou má terčová sekvence CT a oblast pro vazbu unikátní sondy, která odlišuje interní kontrolu CT/NG od cílového amplikonu. Tento postup byl zvolen proto, aby byla zajištěna stejná amplifikace vnitřní kontroly a obou CT i NG terčových DNA. Vnitřní kontrola CT/NG se přidává ke každé amplifikační reakci a je amplifikována společně s terčovou DNA přítomnou v klinickém vzorku. Selektivní amplifikace K selectivní amplifikaci terčové DNA v klinických vzorcích se v testu AMPLICOR® CT/NG používá enzym AmpErase (uracil-N-glycosyláza)22 a deoxyuridintrifosfatáza (dUTP). Enzym AmpErase rozezná vlákna DNA obsahující deoxyuridin a katalyzuje jejich destrukci, ale nepozná DNA pokud obsahuje deoxythymidin. Deoxyuridin se v přírodní DNA nevyskytuje, ale v amplikonu je vždy přítomen vzhledem k tomu, že v Master Mixu se používá deoxyuridintrifosfát namísto deoxythymidintrifosfátu. Proto pouze amplikon obsahuje deoxyuridin. V důsledku přítomnosti deoxyuridinu je kontaminující amplikon citlivý vůči destrukci enzymem AmpErase před amplifikací terčové DNA. Enzym AmpErase, který je obsažený v Master Mixu, katalýzuje rozštěpení DNA obsahující deoxyuridin v místě deoxyuridinového zbytku rozevřením deoxyribozového řetězce v pozici C1. Když je řetězec amplikonové DNA v prvním tepelně cyklizačním kroku při alkalickém pH činidla Master Mix zahříván, štěpí se v poloze deoxyuridinu, čímž se DNA stává neamplifikovatelnou. Enzym AmpErase je při teplotách nad 55°C, to je během celé termální fáze cyklu, neaktivní a nerozbíjí cílový amplicon. Po amplifikaci jsou všechny zbývající enzymy denaturovány přídavkem denaturačního roztoku aby se zabránilo rozpadu kteréhokoliv cílového ampliconu. Bylo prokázáno, že enzym EmpErase, který se používá v AMPLICOR® CT/NG Test inaktivuje nejméně 103 kopií CT či NG amplikonů obsahujících deoxyuridin na PCR. Hybridizační reakce Po amplifikaci PCR jsou amplikony denaturovány a vzniká jednovláknová DNA. Alikvóty této směsi se přenesou do jednotlivých jamek mikrodestiček (MWP) ve kterých jsou oligonukleotidové sondy specifické na terčové CT (CP 35), NG (SS06T5) nebo vnitřní kontrolu IC (SK535). Je na volbě uživatele, zda použije jednu, dvě nebo všechny tři MWP. Biotinylované amplikony jsou zachyceny sondou, kterou jsou potaženy jamky MWP. Touto hybridizací amplikonu na terčově specifickou sondu se zvyšuje celková specifičnost testu. Detekční reakce Po skončení hybridizační reakce se MWO vypláchnou aby se odstranil nenavázaný materiál a do každé mističky se přidá konjugát avidin-křenové peroxidázy (AV-HRP). Konjugát avidin-křenové peroxidázy se váže na biotinovaný amplikon hybridizovaný oligonikleotidovou sondou vázanou k destičce. MWP se znovu vypláchnou aby se odstranil nenavázaný konjugát a do mističek se přidá substrátový roztok obsahující peroxid vodíku a 3,3',5,5'-tetrametylbenzidin (TMB). Navázaná křenová peroxidáza katalyzuje v přítomnosti peroxidu vodíku oxidaci TMB a vytváří barevný komplex. Reakce se zastaví přidáním slabé kyseliny a automatickou čtečkou mikrodestiček se měří absorbance při 450 nm. ČINIDLA AMPLICOR® CT/NG Specimen Preparation Kit AMPLICOR® CT/NG Souprava pro přípravu vzorků (P/N: 20759414 122; ART: 07 5941 4; US: 83315) CT/NG URINE WASH (CT/NG Vymývací pufr pro vzorky moči) Pufr Tris-HCl 300 mM chlorid sodný < 0,1% detergent 0,09% azid sodný

CT/NG PREP

100 testů

1 x 50 ml

CT/NG LYS (CT/NG Lyzační pufr) Pufr Tris-HCl < 1% rozpouštědlo 0,09% azid sodný

1 x 25 ml

CT/NG DIL (CT/NG roztok k ředění vzorků) Pufr Tris-HCl 6 mM chlorid hořečnatý < 25% detergent 0,05% azid sodný

2 x 50 ml

3

AMPLICOR® CT/NG Amplification Kit AMPLICOR® CT/NG Amplifikační souprava (P/N: 20759902 122; ART: 07 5990 2; US: 83319)

CT/NG AMP

96 testů

CT/NG MMX (CT/NG Master Mix) Pufr Tris-HCl EDTA 100 mM chlorid draselný Glycerol < 0,01% AmpliTaq® (Taq DNA polymeráza, mikrobiální) < 0,016% dUTP < 0,005% dATP, dCTP, dGTP < 0,01% AmpErase (uracil-N-glykosyláza) enzym (mikrobiální) < 0,0004% SS01, SS02, CP24 a CP27 primery, biotinylované 0,05% azid sodný

3 x 1,8 ml

CT/NG IC (CT/NG vnitřní kontrola) Pufr Tris-HCl < 0,001% neinfekční plazmid DNA (mikrobiální) obsahující sekvence C. trachomatis vázající primer a vazebnou oblast pro unikátní sondu < 0,005% Poly rA RNA (syntetická) EDTA Amarantové barvivo 0,05% azid sodný

3 x 0,1 ml

CT (+) C (C. trachomatis (+) kontrola) Pufr Tris-HCl < 0,001% neinfekční plazmid DNA (mikrobiální) obsahující sekvence C. trachomatis < 0,005% nespecifický nosič DNA (savčí) < 0,5% detergent EDTA 0,05% azid sodný NG (+) C (N. gonorrhoeae (+) kontrola) Pufr Tris-HCl < 0,001% neinfekční plasmid DNA (mikrobiální) obsahující sekvence N. gonorrhoeae < 0,005% nespecifický nosič DNA (savčí) < 0,5% detergent EDTA 0,05% azid sodný AMPLICOR® Chlamydia trachomatis Detection Kit AMPLICOR® Chlamydia trachomatis Detekční souprava (P/N: 20753491 122; ART: 07 5349 1; US: 83252)

CT MWP DK

1 x 0,8 ml

1 x 0,8 ml

96 testů

+

CT MWP (Chlamydia trachomatis Mikrodestičky) 1 x 96 testů Mikrodestičky potažené CT-specifickou DNA sondou Dvanáct, 8-jamkových stripů v jednom opakovaně a těsně uzavíratelném sáčku s vysoušecím prostředkem [1] DN 1 x 12 ml (Denaturační roztok) 1,6% hydroxid sodný EDTA Thymolová modř Xi 1,6% hm. hydroxid sodný

Dráždivý

4

1 x 20 ml

+

[2] CT/NG HYB (CT/NG hybridizační pufr) Roztok fosforečnanu sodného < 0,2% rozpouštědlo 32,4% thiokyanát sodný Xn 32,4% hm. thiokyanát sodný

Zdraví škodlivý [3] AV-HRP (Konjugát avidin-křenové peroxidázy) Pufr Tris-HCl < 0,001% konjugát avidin-křenové peroxidázy Konjugát hovězího gamma globulinu (savčí) Emulsit 25 (Dai-ichi-Kogyo Seiyaku Co., Ltd.) 0,1% fenol 1% konzervační činidlo ProClin® 150

1 x 12 ml

[4A] SUB A (Substrát A) Citrátový roztok 0,01% peroxid vodíku 0,1% konzervační činidlo ProClin 150

1 x 12 ml

[4B] SUB B (Substrát B) 0,1% 3,3',5,5'-tetrametylbenzidin (TMB) 40% dimehylformamid (DMF) T 40% hm. dimehylformamid (DMF)

1 x 3 ml

Toxický R: 61-20/21-36

Může poškodit plod v těle matky. Zdraví škodlivý při vdechování a při styku s kůží. Dráždí oči.

S: 53-45

Zamezte expozici - před použitím si obstarejte speciální instrukce. V případě nehody, nebo necítíteli se dobře, okamžitě vyhledejte lékařskou pomoc (je-li možno, ukažte toto označení).

[5] STOP (Stop činidlo) 4,9% kyselina sírová

1 x 12 ml

10X WB (10X vymývací koncentrát) < 2% fosfátový pufr < 9% chlorid sodný EDTA < 2% detergent 0,5% konzervační činidlo ProClin® 300

2 x 90 ml

AMPLICOR® Neisseria gonorrhoeae Detection Kit AMPLICOR® Neisseria gonorrhoeae Detekční souprava (P/N: 20744026 122; ART: 07 4402 6; US: 83020)

NG MWP DK

96 testů

NG MWP (Neisseria gonorrhoeae Mikrodestičky) 1 x 96 testů MWP potažené DNA sondou specifickou na NG Dvanáct, 8-jamkových stripů v jednom opakovaně a těsně uzavíratelném sáčku s vysoušecím prostředkem

5

1 x 12 ml

+

[1] DN (Denaturační roztok) 1,6% hydroxid sodný EDTA Thymolová modř Xi 1,6% hm. hydroxid sodný

Dráždivý 1 x 20 ml

+

[2] CT/NG HYB (CT/NG hybridizační pufr) Roztok fosforečnanu sodného < 0,2% rozpouštědlo 32,4% thiokyanát sodný Xn 32,4% hm. thiokyanát sodný

Zdraví škodlivý [3] AV-HRP (Konjugát avidin-křenové peroxidázy) Pufr Tris-HCl < 0,001% konjugát avidin-křenové peroxidázy Konjugát hovězího gamma globulinu (savčí) Emulsit 25 (Dai-ichi-Kogyo Seiyaku Co., Ltd.) 0,1% fenol 1% konzervační činidlo ProClin 150 [4A] SUB A (Substrát A) Citrátový roztok 0,01% peroxid vodíku 0,1% konzervační činidlo ProClin 150

1 x 12 ml

[4B] SUB B (Substrát B) 0,1% 3,3',5,5'-tetrametylbenzidin (TMB) 40% dimehylformamid (DMF) T

1 x 12 ml

1 x 3 ml

40% hm. dimehylformamid (DMF)

Toxický R: 61-20/21-36

Může poškodit plod v těle matky. Zdraví škodlivý při vdechování a při styku s kůží. Dráždí oči.

S: 53-45

Zamezte expozici - před použitím si obstarejte speciální instrukce. V případě nehody, nebo necítíte-li se dobře, okamžitě vyhledejte lékařskou pomoc (je-li možno, ukažte toto označení).

[5] STOP (Stop činidlo) 4,9% kyselina sírová

1 x 12 ml

10X WB (10X vymývací koncentrát) < 2% fosfátový pufr < 9% chlorid sodný EDTA < 2% detergent 0,5% konzervační činidlo ProClin 300

2 x 90 ml

6

UPOZORNĚNÍ A BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ A. PRO ÚČELY DIAGNOSTIKY IN VITRO. B. Tento test je určen pouze pro vyšetřování vzorků odebraných z děložního hrdla a močové trubice nebo vzorků moči. Tento test nebyl prověřen pro vyšetřování vzorků z krku, rekta a dalších. C. Nepipetujte ústy. D. V pracovních laboratorních prostorách nejezte, nepijte a nekuřte. Při práci se vzorky a činidly kitu používejte rukavice na jedno použití, pracovní oděv a ochrané brýle. Po práci se vzorky a zkušebními činidly si důkladně umyjte ruce. E.

Při odebírání alikvotů ze zásobních roztoků v lahvích zabraňte mikrobiální kontaminaci činidel. Doporučuje se používat jednorázových pipet špiček k pipetám.

F. G. H. I. J.

Nesměšujte dohromady činidlo z různých šarží, ani z různých lahviček téže šarže. Nespotřebovaná činidla a odpad likvidujte v souladu s celostátními a místními předpisy. Po vypršení lhůty použitelnosti již soupravu nepoužívejte. Pravidla bezpečnosti při práci (MSDS) zašle na vyžádání vaše místní pobočka firmy Roche. Pracoviště v laboratoři musí být uspořádáno tak, aby bylo možno postupovat při jednotlivých pracovních operacích stále stejným směrem počínaje pracovní plochou pro přípravu činidel a dále plochou pro přípravu vzorků vzorků až k amplifikačnímu a detekčnímu pracovišti. Předamplifikační činnosti začínají přípravou činidel a postupují k přípravě vzorků. Pracoviště pro přípravu činidel a pro přípravu vzorků musí být od sebe oddělena a používána výhradně pro tuto činnost. Přístroje a potřebné pomůcky musí být určeny pro každý z těchto kroků samostatně a nesmějí být použity pro jinou činnost. Nesmějí se ani přenášet. Ve všech prostorech je třeba nosit rukavice, které se před opuštěním prostoru vymění. Vybavení a materiály pro přípravu činidla se nesmějí používat k přípravě vzorků, ani pro pipetování nebo zpracování amplifikované DNA či jiných zdrojů terčové DNA. Materiály a vybavení určené pro amplifikaci a detekci musí být po celou dobu ponechány v prostoru, který je pro tuto činnost vyhrazen. Se vzorky je třeba zacházet jako s infekčními a používat odpovídající laboratorní postupy, například jak jsou uvedeny v publikaci Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories23 nebo v dokumentu CLSI M29-A24. Důkladně omyjte a dezinfikujte veškeré pracovní plochy 0,5% roztokem chlornanu sodného v deionizované nebo destilované vodě.

K.

POZNÁMKA: Běžné bělicí prostředky pro domácnost obvykle obsahují chlornan sodný v koncentraci 5,25%. Roztok o koncentraci 0,5% tak dostanete zředěním bělidla pro domácnost v poměru 1 : 10. L.

AMPLICOR® CT/NG Test bude detekovat též některé izoláty nepatogenních N. subflava a N. cinerea. Tyto druhy jsou v krku některých i zdravých jedinců součástí flóry. Při vyšetřování výtěrů z krku tak můžeme dospět k falešným pozitivním výsledkům na N. gonorrhoeae. Při práci v laboratoři je třeba přijmout taková opatření, aby nedošlo ke kontaminaci amplifikačních činidel, činidel používaných při zpracování vzorků a vzorků samotných respiračními aerosoly.

M.

Vzorky výtěrů, které přijdou do laboratoře v AMPLICOR® STM jsou pro testování nepřijatelné. Tyto vzorky je nutno vyhodit a odebrat nové.

N.

Vzorky odebrané a transportované s použitím AMPLICOR® STD Swab Specimen Collection a Transport Kit mohou inhibovat PCR. Při testování těchto vzorků je nutné současně testovat vzorky vnitřní kontroly CT/NG IC.

O.

Vzorky výtěrů přenášené v transportním mediu určeném pro kultury Chlamydia musí být ponechány v transportních zkumavkách, aby bylo možno provézt vizuální důkaz inokulace. AMPLICOR® CT/NG Test byl prověřen pro vzorky výtěrů přenášených ve zkumavkách v transportním mediu určeném pro kultury Chlamydia. Použitelnost vzorků přenášených v transportním mediu určeném pro kultury Chlamydia bez tampónu musí být laboratoří ověřena.

P.

Během skladování vzorků moči za pokojové teploty po dobu delší než 24 hodin může dojít k jejich degradaci. Vzorky moči uchovávané při pokojové teplotě déle než 24 hodin se testovat nemají.

Q.

CT/NG URINE WASH, CT/NG LYS, CT/NG DIL, CT/NG MMX, CT/NG IC, CT (+) C a NG (+) C obsahují azid sodný. Azid sodný může reagovat s olověnými nebo měděnými uzávěry a vytvářet vysoce explozivní kovové azidy. Budete-li tedy vylévat roztoky obsahující azid do laboratorní výlevky, spláchněte je velkým objemem vody, aby se azid nemohl nikde usadit.

R.

Při práci s [1] DN, [3] AV-HRP, [4A] SUB A, [4B] SUB B a pracovním substrátem (směs [4A] SUB A a [4B] SUB B) používejte ochranné brýle, pracovní oděv a jednorázové rukavice. Dbejte, aby se tyto materiály nedostaly do styku s pokožkou, očima nebo sliznicemi. Pokud ke styku dojde, okamžitě postiženou oblast omyjte velkým množstvím vody. Pokud byste tuto péči zanedbali, mohly by se vyvinout popáleniny. Jestliže se některé činidlo rozlije nebo rozsype, před vytřením dosucha je zřeďte vodou.

7

S.

Zabraňte kontaktu kůže a sliznic s [4B] SUB B nebo s pracovními substráty. Pokud ke kontaktu dojde, omyjte okamžitě postiženou oblast velkým množstvím vody.

T.

[4B] SUB B a pracovní substrát obsahují dimetylformamid, který je při požití většího množství toxický a může poškodit lidský plod. Potřísnění kůže, vdechnutí par a požití je třeba se vyvarovat. Pokud ke styku s pokožkou dojde, omyjte ji důkladně vodou a mýdlem a vyhledejte okamžitě lékařskou pomoc.

U.

Zkumavky se zkoumanými kontrolními vzorky musejí být uzavřeny šroubovacími víčky aby se zabránilo vystříknutí vzorků a jejich případné zkřížené kontaminaci. Zkumavky s nasazovacím uzávěrem nepoužívejte.

ZACHÁZENÍ SE VZORKY A JEJICH SKLADOVÁNÍ A.

Činidla nezmrazujte.

B.

Uchovávejte CT/NG MMX a CT/NG IC při 2–8°C. Před otevřením jsou tato činidla stálá až do vypršení vyznačené doby použitelnosti. Pracovní Master Mix (CT/NG MMX ke kterému byla přidána CT/NG IC) se musí uchovávat při 2-8°C. Při této teplotě je stabilní po dobu 4 týdnů.

C.

Uchovávejte CT (+) C a NG (+) C při 2–8°C. Tato činidla jsou stálá až do vypršení vyznačené doby použitelnosti.

D.

Uchovávejte CT/NG LYS př 2–25°C. Uchovávejte CT/NG URINE WASH a CT/NG DIL při 2–8°C. Vytvoří-li se v těchto činidlech během skladování sraženina, ohřejte roztok na pokojovou teplotu a před upotřebením důkladně protřepejte. Činidla jsou stálá do vypršení vyznačené doby použitelnosti.

E.

Uchovávejte CT MWP a NG MWP při 2–8°C v přiložených plastikových sáčcích. Destičky jsou před otevřením plastikových sáčků stabilní až do vypršení vyznačené doby. Po otevření jsou MWP stabilní po dobu 3 měsíců (nebo dokud nevyprší vyznačená doba použitelnosti, podle toho, co nastane dříve) v uzavíratelném sáčku s vysoušecím prostředkem.

F.

Uchovávejte [1] DN, [2] CT/NG HYB a [5] STOP při 2–25°C. Tato činidla jsou stálá až do vypršení vyznačené doby použitelnosti.

G.

Uchovávejte [3] AV-HRP, [4A] SUB A a [4B] SUB B při 2–8°C. Před otevřením jsou tato činidla stálá až do vypršení vyznačené doby použitelnosti. Po otevření jsou stálá 3 měsíce (nebo dokud nevyprší vyznačená doba použitelnosti, podle toho, co nastane dříve).

H.

Pracovní substráty musí být připravovány denně čerstvé. Připraví se smícháním [4A] SUB A s [4B] SUB B a jsou stabilní po dobu 3 hodin při pokojové teplotě a jsou-li chráněny před světlem. Nevystavujte [4A] SUB A, [4B] SUB B nebo Working Substrate styku s kovy, oxidujícími látkami a přímému světlu.

I.

Skladujte 10X WB při teplotách 2–25°C. 10X WB je stálý až do vypršení vyznačené doby expirace. Prohlédněte před ředěním 10X WB a v případě potřeby jej zahřejte na 30–37°C aby se rozpustily všechny sraženiny. Pracovní Wash Solution (1X), připravený naředěním 10X WB destilovanou nebo deionizovanou vodou musí být uchováván při 2–25°C v čisté uzavřené plastové lahvi. Je stabilní 2 týdny od data přípravy.

MATERIAL, KTERÝ JE SOUČÁSTÍ AMPLICOR® Chlamydia trachomatis/Neisseria gonorrhoeae Test A.

AMPLICOR® CT/NG Specimen Preparation Kit AMPLICOR® CT/NG Souprava pro přípravu vzorků (P/N: 20759414 122; ART: 07 5941 4; US: 83315)

CT/NG PREP

CT/NG URINE WASH (CT/NG Pufr na vymývání vzorků moči) CT/NG LYS (CT/NG Lyzační pufr) CT/NG DIL (CT/NG Roztok pro ředění vzorků) B.

AMPLICOR® CT/NG Amplification Kit AMPLICOR® CT/NG Amplifikační souprava (P/N: 20759902 122; ART: 07 5990 2; US: 83319) CT/NG MMX (CT/NG Master Mix) CT/NG IC (CT/NG Vnitřní kontrola) CT (+) C (CT (+) Kontrola) NG (+) C (NG (+) Kontrola) 8

CT/NG AMP

C.

AMPLICOR® Chlamydia trachomatis Detection Kit AMPLICOR® Chlamydia trachomatis Detekční souprava (P/N: 20753491 122; ART: 07 5349 1; US: 83252)

CT MWP DK

CT MWP (CT Mikrodestičky) [1] DN (Denaturační roztok) [2] CT/NG HYB (CT/NG Hybridizační pufr) [3] AV-HRP (Konjugát avidin-křenové peroxidázy) [4A] SUB A (Substrat A) [4B] SUB B (Substrat B) [5] STOP (Stop činidlo) 10X WB (10X vymývací koncentrát) D.

AMPLICOR® Neisseria gonorrhoeae Detection Kit AMPLICOR® Neisseria gonorrhoeae Detekční souprava (P/N: 20744026 122; ART: 07 4402 6; US: 83020)

NG MWP DK

NG MWP (NG Mikrodestičky) [1] DN (Denaturační roztok) [2] CT/NG HYB (CT/NG Hybridizační pufr) [3] AV-HRP (Konjugát avidin-křenové peroxidázy) [4A] SUB A (Substrat A) [4B] SUB B (Substrat B) [5] STOP (Stop činidlo) 10X WB (10X vymývací koncentrát) MATERIÁL, KTERÝ NENÍ SOUČÁSTÍ KITŮ Preamplifikace – pracoviště pro přípravu činidel •

Pro Applied Biosystems GeneAmp® PCR System 9600 a 9700 termální cykler, používejte MicroAmp® zkumavky (AB #N801-0533), víčka (AB #N801-0535), stojánky (AB #403081) a podložky (AB #N801-0531)

•

Pro Applied Biosystems GeneAmp PCR System 2400 termální cykler, používejte MicroAmp zkumavky (AB #N801-0533), víčka (AB #N801-0535), stojánky (AB #N801-5530) a podložky (AB #N801-5531)

•

Pipetu Eppendorf Multipette® se dvanácti zásobníky Eppendorf Combitip® se špičkou pro objem 1,25 ml (sterilní, jednotlivě balené)

•

Mikropipety s aerosolovou bariérou (pro objemy 50 µl and 100 µl) nebo špičkami s pozitivním posuvem (100 µl)*

•

Vortex mixer

•

Rukavice na jedno použití nepoprášené pudrem

9

Preamplifikace – pracoviště pro přípravu vzorků •

Mikrocentrifuga (max. RCF 16 000 x g, min. RCF 12 500 x g); Eppendorf 5415C, HERMLE Z230M, nebo její ekvivalent

•

2 ml polypropylenové zkumavky se šroubovacími víčky, sterilní, nesilikónizované, kónické (např. Sarstedt 72.693.105 nebo jejich ekvivalent)**

•

Stojánek na zkumavky (Sarstedt 93.1428)

•

Sterilní, kalibrované přenášecí mikropipety

•

Mikropipety (pro objemy 50 µl, 100 µl, 200 µl, 250 µl, 500 µl and 1000 µl)* s ochranou proti tvorbě aerosolu nebo špičkami s přímým vypuzováním

•

Rozšířené špičky s ochranou proti tvorbě aerosolu pro práci s AMPLICOR® STD Swab Specimen Collection a Transport Kits (např. Matrix 7235 nebo její ekvivalent)

•

Rozšířené špičky s ochranou proti tvorbě aerosolu pro práci se vzorky přenášenými v transportních mediích M4 Culture Transport Medium nebo Bartels ChlamTrans™ Chlamydial Transport Medium (např. Matrix 7055 nebo její ekvivalent)

•

37°C ± 2°C inkubátor nebo zahřívající blok

•

Vortex mixer

•

Rukavice na jedno použití nepoprášené pudrem

Post-amplifikace – pracoviště pro amplifikace a detekci •

Pipeta s více zásobníky (pro objemy 25 µl a 100 µl) nebo elektronická pipeta (Impact® nebo AMPLICOR®)

•

Špičky s ochranou proti tvorbě aerosolu (pro objemy 25 µl, a 100 µl) a špičky bez této ochrany (100 µl)*

•

Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9600, 9700 nebo 2400 termální cykler

•

MicroAmp podložka a pomůcka k víčkování pro práci s Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9600, 9700 nebo 2400

•

Myčka mikrodestiček***

•

Čtečka mikrodestiček****

•

Jednorázový reagenční reservoirs

•

Víčko k mikrodestičkám

•

96-mikrojamkový strip ejektor, Costar® #2578

•

Inkubátor 37°C ± 2°C

•

Destilovaná nebo deionizovaná voda

•

Sterilní, jednorázové, polystyrénové sérologické pipety (5 ml)

•

Kalibrované zkumavky

•

Vortex mixer

• Rukavice na jedno použití nepoprášené pudrem * Pipetory musejí být přesné na 3% jmenovitého objemu. Špičky s ochranou proti tvorbě aerosolů nebo s přímým vypuzováním musí být používány všude, kde je to předepsáno, aby se zabránilo kontaminaci. ** K uzavírání zkumavek se vzorky používejte šroubovací víčka, aby se zabránilo vystříknutí a případné zkřížené kontaminaci vzorků a kontrol. Zkumavky s nasazovacím uzávěrem nepoužívejte. *** S kapacitou pro mytí mikrodestiček 12 x 8 mikrojamek v objemu 250–300 µl mycího roztoku na jednu jamku v intervalech 30 sekund. ****Specifikace čtečky mikrodestiček: Šířka pásma = 10 nm ± 3 nm; Rozmezí absorbance = 0 až ≥ 3,00 A450; Opakovaná měření ≤ 1%; Přesnost ≤ 3% od 0 do 3,00 A450; Posun ≤ 0,01 A450 za hodinu.

10

ODBĚR VZORKŮ, JEJICH TRANSPORT A UCHOVÁVÁNÍ POZNÁMKA: Zacházejte se vzorky jako s možnými přenašeči infekce. Testovat lze pouze: (a) vzorky moči (mužů a žen) transportované v čistých polypropylénových lahvičkách bez použití konzervačních činidel; (b) výtěry z děložního hrdla a močové trubice odebrané do transportních medií pro kultury 2-SP Culture Transport Medium, Bartels ChlamTrans Chlamydial Transport Medium (Bartels, Inc.), nebo M4 Culture Transport Medium (MicroTest, Inc.) a v nich transportované; nebo POZNÁMKA: Při transportu výtěrů v AMPLICOR® STD Swab Specimen Collection a Transport Kit se musí testovat též vnitřní kontrola CT/NG IC. (c) výtěry z děložního hrdla a močové trubice odebrané a přenášené v AMPLICOR® STD Swab Specimen Collection and Transport Kit. Pro získání spolehlivých výsledků testu se při odběru vzorků řiďte následujícími instrukcemi. Tento test nebyl prověřen pro vyšetřování vzorků z krku, rekta a dalších. A.

Vzorky moči (muži a ženy)

POZNÁMKA: Pacient nesmí během předcházejících dvou hodin močit. 1.

Do polypropylenové nádobky neobsahující žádnou konzervační přísadu se odebere 10–50 ml první zachycené moči (první části toku).

2.

Uzavřete lahvičku a řádně ji označte. Vzorky mohou být transportovány k místu testování při pokojové teplotě.

3.

Vzorky moče jsou stabilní po dobu 24 hodin při pokojové teplotě. Vzorky moči, které nebudou zpracovávány do 24 hodin od odběru mohou být přechovávány při teplotě 2–8°C, ale musí být zpracovány do 7 dnů po odběru. Vzorky moči, které nemohou být zpracovány do 7 dnů po odběru mohou být při teplotě –20°C uchovány až 2 měsíce.

4.

Vzorky moči, které je třeba dopravit do vzdálenějšího testovacího centra musí být dopravovány přes noc se zárukou, že budou dopraveny do 24 hodin. Za této podmínky je lze transportovat při pokojové teplotě. Budou-li vzorky moči přepravovány při pokojové teplotě, musí být až do okamžiku transportu uchovávány při teplotě 2–8°C, aby byla jistota že doba po kterou budou vystaveny pokojové teplotě nepřesáhne 24 hodin. Vzorky musí být přepravovány v souladu se všemi místními a zákonnými předpisy platnými pro přepravu látek neznámého obsahu25.

B.

Výtěry

B1.

Výtěry odebrané do AMPLICOR® Specimen Transport Medium (STM) 1.

Jedním z dodaných velkých tamponů odstraňte z ektocervixu hlen a tampon zlikvidujte.

2.

Další velký tampon vložte do endocervikálního kanálu, až není špička vidět.

3.

Otáčejte 3–5 sekund a vytáhněte tak, abyste se nedotkli stěny vaginy.

4.

Vložte tampon do zkumavky s obsahem AMPLICOR® STM a důkladně s ním zakružte nebo protřepejte tampon v roztoku po dobu 15 sekund.

POZNÁMKA: Ponecháte-li tampon v kontaktu se STM déle než 15 sekund, může to vést k inhibici PCR.

B2.

5.

Tampon natlačte na stěnu zkumavky, abyste z něj vymáčkli kapalinu. Všechen hlen ve vzorku odstraňte zachycením na tampon. Vytlačte veškerou zbylou tekutinu z hlenu tlakem tamponu proti stěně zkumavky. Vyjměte tampon s hlenem a vyhoďte jej. Zazátkujte zkumavku.

6.

Označte řádně zkumavku. Přeneste zkumavku na testovací pracoviště při pokojové teplotě. Vzorky výtěrů jsou při pokojové teplotě stále po dobu 10 dní. Podle návodu na testu musí být vzorky výtěrů přechovávány při pokojové teplotě a zpracovány do 10 dnů po odběru.

7.

Výtěry, které je nutno odeslat do vzdáleného testovacího střediska, se až do expedice skladují při pokojové teplotě. Měly by být při pokojové teplotě přepravovány a na testovací pracoviště by měly v době, aby je bylo možno zpracovat do 10 dnů od odběru. Vzorky musí být přepravovány v souladu se všemi místními a zákonnými předpisy platnými pro přepravu látek neznámého obsahu25.

Výtěry odebrané do transportního media pro kultury 1.

Vzorky výtěrů z děložního hrdla a močové trubice mohou být odebrané do transportních medií 2-SP Culture Transport Medium, Bartels ChlamTrans Chlamydial Transport Medium (Bartels, Inc.), nebo M4 Culture Transport Medium (MicroTest, Inc.) a v nich i transportovány.

2.

Při odběru vzorků postupujte podle pokynů výrobce. U těchto vzorků mohou být tampony ponechány v transportním mediu.

3.

Při transportu postupujte podle pokynů výrobce Vzorky mohou být uchovávány při 2–8°C až 7 dní po odběru nebo při –70°C nejvýše 2 měsíce. 11

NÁVOD K POUŽITÍ POZNÁMKA: Postup prací by měl probíhat ve dvou různých laboratorních prostorách (Preamplifikace a Postamplifikace) tak, jak je to předepsáno v následujících instrukcích. POZNÁMKA: Budou-li vzorky zpracovány, amplifikovány a detekovány v průběhu jednoho pracovního dne, postupujte podle níže uvedeného návodu. Bude-li příprava vzorku ukončena jiný den než amplifikace a detekce připravte reakční činidla (část A) tentýž den, kdy budete provádět amplifikaci a detekci (část D). POZNÁMKA: Inhibice PCR může být snížena ponecháním vzorků přes noc při teplotě 2–8°C dříve než je přidáme k Working Master Mix27. POZNÁMKA: Před zahájením práce zapněte termální cykler aby se zahřál. Veškerá činidla musí být před použitím temperovány na teplotu místnosti. Používejte pipety se špičkami s ochranou proti tvorbě aerosolu nebo přímým vypuzováním všude, kde je to předepsáno. VĚNUJTE MIMOŘÁDNOU PÉČI ZAJIŠTĚNÍ SELEKTIVNÍ AMPLIFIKACE. A.

Příprava činidel Provádějte v: Předamplifikce – pracoviště pro přípravu činidel 1.

Zvolte odpovídající počet reagenčních zkumavek, potřebných pro testování vzorku pacienta a kontrol. Doporučuje se testovat současně se vzorky dva (2) duplikáty CT (+) Control a dva (2) duplikáty NG (+) Kontroly budou přidány ke každé serii vzorků, které se budou amplifikovat. Vložte zkumavky do stojánku a zajistěte je.

POZNÁMKA: I v případě, že vnitřní kontroly CT/NG IC nebudou detekovány, CT/NG IC musí být přidány do CT/NG MMX. Protřepejte zkumavky s CT/NG IC na vortexu.

B.

2.

Připravte pracovní Master Mix přidáním 100 µl CT/NG IC do zkumavky s CT/NG MMX (směs postačí na 32 amplifikací). Uzavřete zkumavku s CT/NG MMX a dobře promíchejte 10–15 násobným převrácením zkumavek nebo krátce protřepte na vortexu. Napište na zkumavku datum přípravy. Working Master Mix (CT/NG MMX ke kterému byl přidán CT/NG IC) je při 2–8°C stabilní po dobu 4 týdnů nebo do doby než vyprší vyznačená doba podle toho, co nastane dříve. Prázdné zkumavky od CT/NG IC vyhoďte.

3.

Do každé A-zkumavky odměřte 50 µl pracovního Master Mix za použití opakovacího pipetoru nebo pipetoru s aerosolovou bariérou nebo se špičkou s pozitivním posuvem. V této fázi neuzavírejte zkumavky víčkem.

4.

Vložte stojánek s Working Master Mix do opakovatelně uzavíratelného plastikového sáčku. Vložte přiměřený počet víček ke zkumavkám do opakovaně uzavíratelného plastikového sáčku. Pečlivě plastikové sáčky uzavřete a přemístěte je na pracoviště pro preamplifikační přípravu vzorků. Stojánek s Working Master Mixem udržujte při teplotách 2–8°C v prostoru preamplifikační přípravy vzorků dokud není příprava vzorků dokončena. Working Master Mix ve zkumavkách uzavřených v plastikových sáčcích je stálý při 2–8°C po dobu 48 hodin.

Příprava vzorků Provádějte v: Preamplifikace – Pracoviště pro přípravu vzorků a kontrol

B1.

Vzorky moči (muži a ženy) 1.

Pipetou se sterilní špičkou napipetujte 500 µl CT/NG URINE WASH do přiměřeného počtu 2 ml polypropylenových zkumavek. Zkumavky s nasazovacím uzávěrem nepoužívejte. Dbejte pokynů uvedených v části Upozornění a bezpečnostní opatření. Každou zkumavku označte.

2.

Moč vířením po dobu 3–10 sekund důkladně promíchejte. Zmrazený vzorek oči nechte před protřepáváním roztát při pokojové teplotě (objemy větší než 2 ml musí být rozmrazovány přes noc). Vzorek zpracovávejte i v případě, že obsahuje precipitát Sundejte opatrně víčka z lahviček s močí. Dbejte na to, abyste močí ve víčku nepotřísnili rukavice. Znečistěné rukavice vyměňte před další prací za čisté.

3.

Pipetou se špičkou s ochranou proti tvorbě aerosolu přidejte do zkumavek obsahujících CT/NG URINE WASH 500 µl dobře promíchaného vzorku moči. Pro každý vzorek moči použijte novou špičku. Uzavřete zkumavky víčky a dobře protřepejte na vortexu.

4.

Inkubujte při 37°C po dobu 15 minut.

5.

Centrifugujte přit ≥ 12 500 x g po dobu 5 minut.

6.

Slijte supernatant a odsajte každou zkumavku novým kouskem savého papíru.

7.

Mikropipetou se špičkou s ochranou proti tvorbě aerosolu přidejte do každé zkumavky 250 µl CT/NG LYS Pro každý vzorek použijte novou špičku. Uzavřete zkumavky a dobře je protřepejte na vortexu.

8.

Inkubujte zkumavky 15 minut při pokojové teplotě. 12

9.

Mikropipetou se špičkou sochranou proti tvorbě aerosolů přidejte do každé zkumavky 250 µl CT/NG DIL Pro každý vzorek použijte novou špičku. Uzavřete zkumavky a dobře je protřepejte na vortexu.

10. Centrifugujte zkumavky 10 minut při ≥ 12 500 x g. POZNÁMKA: Vzorky mohou před pipetováním alikvótních podílů do Working Master Mix stát při pokojové teplotě nejvýše 2 hodiny. Na dobu delší než 2 hodiny musí být vzorky přechovávány při teplotách 2–8°C. Vzorky skladované při teplotách 2–8°C musí být testovány do 7 dnů. POZNÁMKA: Vzorky uchovávané při teplotách 2–8°C musí být před amplifikací zahřáty na pokojovou teplotu a dobře protřepány na vertexu. Po protřepání centrifugujte vzorky 10 minut při ≥ 12 500 x g. 11. Mikropipetou se špičkou s ochranou proti tvorbě aerosolu napipetujte 50 µl supernatantu do zkumavek obsahujících Working Master Mix. Pro každý vzorek použijte novou špičku. Dbejte na to, abyste neporušili peletu (peleta nemusí být dobře viditelná). Označte pořadí vzorků pacientů ve stojánku. Uzavřete zkumavky víčky. 12. Zbytky vzorků uchovávejte při teplotách 2–8°C pro případné opakování testu. Opakování musí být provedeno do 7 dnů od zpracování vzorku. B2.

Výtěry

B2.1. Vzorky transportované v transportním mediu AMPLICOR® Specimen Transport Medium (STM) POZNÁMKA: Prohlédněte transportní zkumavku AMPLICOR® STM. V případě, že vzorek byt transportován ve zkumavce s tamponem, je nutno takový vzorek vyhodit a odebrat nový. POZNÁMKA: S těmito vzorky je nutno testovat současně i vnitřní kontrolu CT/NG IC. 1.

Do každé transportní zkumavky odpipetujte 1 ml CT/NG DIL; na každou zkumavku přitom použijte vždy novou sterilní pipetu.

2.

Zkumavky uzavřete. Vortexujte 5-10 sekund.

3.

Inkubujte při pokojové teplotě 10 minut.

POZNÁMKA: Vzorky mohou před pipetováním alikvótních podílů do Working Master Mix stát při pokojové teplotě nejvýše 2 hodiny. Na dobu delší než 2 hodiny musí být vzorky přechovávány při teplotách 2–8°C. Vzorky skladované při teplotách 2–8°C musí být testovány do 7 dnů. POZNÁMKA: Vzorky, které byly uchovávány při 2–8°C musí být před amplifikací zahřáty na pokojovou teplotu. 4.

Mikropipetou se špičkou s ochranou proti tvorbě aerosolu napipetujte 50 µl vzorku do zkumavek obsahujících Working Master Mix. Pro každý vzorek použijte novou špičku. Označte pořadí vzorků pacientů ve stojánku. Uzavřete zkumavky víčky.

5.

Zbytky vzorků uchovávejte při teplotách 2–8°C pro případné opakování testu. Opakování musí být provedeno do 7 dnů od zpracování vzorku.

B2.2. Vzorky transportované v transportním mediu pro kultury POZNÁMKA: AMPLICOR® CT/NG Test byl prověřen pouze testování, při kterém se pro transport vzorků používají media 2-SP Culture Transport Medium, Bartels ChlamTrans Chlamydial Transport Medium (Bartels, Inc.) a M4 Culture Transport Medium (MicroTest, Inc.). Použití jiných medií musí být laboratoří prověřeno. POZNÁMKA: Přesvědčte se, že transportní zkumavky obsahují tampon. Platnost testů u vzorků, které byly transportovány v transportním mediu pro kultury Chlamydia bez tamponů musí být v laboratoři ověřena. 1.

Pipetou se sterilními špičkami napipetujte do každé 2 ml polypropylenové zkumavky 100 µl CT/NG LYS. Zkumavky s nasazovacím uzávěrem nepoužívejte. Dbejte pokynů uvedených v části Upozornění a bezpečnostní opatření. Každou zkumavku označte.

2.

Promíchejte vzorky opatrným vortexováním. Vzorky, které byly přechovávány ve zmrazenémstavu nechte před vortexováním rozmrazit při pokojové teplotě. Opatrně sundejte víčka ze zkumavek. Dbejte na to, abyste si nepotřísnili rukavice. Znečištěné rukavice vyměňte před další prací za čisté.

3.

Mikropipetou se špičkou s ochranou proti tvorbě aerosolu napipetujte 100 µl dobře promíchaného vzorku do zkumavky s obsahem CT/NG LYS. Pro každý vzorek použijte novou špičku. Uzavřete zkumavky víčky a dobře protřepte na vortexu.

4.

Inkubujte při pokojové teplotě 10 minut.

13

5.

Mikropipetou se špičkou s ochranou proti tvorbě aerosolu napipetujte do každé zkumavky 200 µl CT/NG DIL. Uzavřete zkumavky víčky a dobře protřepejte na vortexu.

6.

Inkubujte při pokojové teplotě 10 minut.

POZNÁMKA: Vzorky mohou před pipetováním alikvótních podílů do zkumavek obsahujících Working Master Mix stát při pokojové teplotě nejvýše 2 hodiny. Na dobu delší než 2 hodiny musí být vzorky přechovávány při teplotách 2–8°C. Vzorky skladované při teplotách 2–8°C musí být testovány do 7 dnů. POZNÁMKA: Vzorky, které byly uchovávány při 2–8°C musí být před amplifikací zahřáty na pokojovou teplotu. 7.

Mikropipetou se špičkou s ochranou proti tvorbě aerosolu napipetujte 50 µl vzorku do zkumavek obsahujících Working Master Mix. Pro každý vzorek použijte novou špičku. Označte pořadí vzorků pacientů ve stojánku. Uzavřete zkumavky víčky.

8.

Zbytky vzorků uchovávejte při teplotách 2–8°C pro případné opakování testu. Opakování musí být provedeno do 7 dnů od zpracování vzorku. C. Příprava kontrol Provádějte v: Preamplifikace – prostor pro přípravu vzorku a kontroly POZNÁMKA: Pracovní kontroly musí být připravované každý den čerstvé. Pracovní kontroly lze připravit najednou pro více testů, ale nepoužité musejí být na konci každého vyhozeny. POZNÁMKA: CT (+) C slouží jako pozitivní kontrola pro CT MWP a negativní kontrola pro NG MWP. Zkumavky označené NG (+) C složí jako pozitivní kontrol pro NG MWP a negativní kontrol CT MWP. Takže i v případě, že vzorky budou testovány pouze na CT nebo pouze na NG musejí být připraveny obě kontroly na CT i na NG. POZNÁMKA: Testujete-li pouze moč a/nebo transportní medium STM pro výtěry, připravte přiměřený počet kontrol a testujte je v duplikátu. Testujete-li pouze transportní medium pro kultury výtěrů CTM připravte přiměřený počet kontrol a testujte je v duplikáttue. Při testování obojího, moče i výtěrů v CTM je nutné připravit jednu sadu kontrol pro každý typ vzorků; každá sada kontrol bude testována jednou. 1. Připravte následující pracovní kontroly (Working Controls) pro CT a NG. a) Připravte Working CT (+) Control přidáním 100 µl CT (+) C do 2 ml polypropylenových zkumavek obsahujících 1,0 ml CT/NG DIL. Protřepejte dobře na vortexu. Uchovávejte při pokojové teplotě a na konci pracovního dne zbytek vyhoďte. b) Připravte Working NG (+) Control přidáním 100 µl NG (+) C do 2 ml polypropylenových zkumavek tube obsahujících 1,0 ml CT/NG DIL. Protřepejte dobře na vortexu. Uchovávejte při pokojové teplotě a na konci pracovního dne vyhoďte. 2. Pro testování vzorků moči nebo výtěrů transportovaných v mediu pro výtěry AMPLICOR® STM si připravte kontroly správnosti pracovního postupu CT (+) a NG (+) pro moč a/nebo výtěr v STM. a) Připravte kontroly správnosti pracovního postupu CT (+) pro vzorky moče nebo výtěrů v AMPLICOR® STM přidáním 250 µl CT/NG LYS ke 250 µl Working CT (+) Control a dobře protřepejte na vortexu. Inkubujte při pokojové teplotě 10 minut. Uchovávejte při pokojové teplotě a na konci pracovního dne vyhoďte. b) Připravte kontroly správnosti pracovního postupu NG (+) pro vzorky moče nebo výtěrů v AMPLICOR® STM přidáním 250 µl CT/NG LYS ke 250 µl Working NG (+) Control a dobře protřepejte na vortexu. Inkubujte při pokojové teplotě 10 minut. Uchovávejte při pokojové teplotě a na konci pracovního dne vyhoďte. 3. Pro testování výtěrů přenášených v transportním mediu pro kultury CTM připravte kontroly správnosti pracovního postupu CT (+) a NG (+) CTM pro výtěry. a) Připravte kontroly správnosti pracovního postupu CT (+) CTM pro výtěry přidáním 100 µl transportního media ke 100 µl CT/NG LYS. Přidejte 200 µl Working CT (+) Control a dobře promíchejte vířením. Inkubujte při pokojové teplotě 10 minut. Uchovávejte při pokojové teplotě a na konci pracovního dne zbytek vyhoďte. b) Připravte kontroly správnosti pracovního postupu NG (+) CTM pro výtěry přidáním 100 µl transportního media ke 100 µl CT/NG LYS. Přidejte 200 µl Working NG (+) Control a dobře promíchejte vířením. Inkubujte při pokojové teplotě 10 minut. Uchovávejte při pokojové teplotě a na konci pracovního dne vyhoďte. 4. Pipetou se špičkou s aerosolovou bariérou napipetujte 50 µl od každé kontroly správnosti pracovního postupu do přiměřeně velkých zkumavek s obsahem Working Master Mix. Označte pořadí kontrol ve stojánku. Uzavřete zkumavky víčky. 5. Připravené vzorky (vzorky pacientů a kontroly) ve stojanech přemístěte do amplifikační/detekční oblasti. Tyto vzorky připravené na PCR mohou být uchovány při teplotách 2–8°C až 16 hodin.

14

D.

Amplifikace a detekce Provádějte v: Prostor pro Postamplifikaci – Amplifikaci/Detekci

D1.

Amplifikace

POZNÁMKA: Zapněte Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9600 nebo GeneAmp PCR System 2400 termální cykler nejméně 30 minut před zahájením amplifikace. 1.

Vložte soupravu stojánek/držák do bloku termálního cykleru.

2.

Naprogramujte termální cykler Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9600 nebo GeneAmp PCR System 2400 na amplifikaci AMPLICOR® CT/NG Test následujícím způsobem: HOLD Program: 2 min 50°C HOLD Program: 5 min 95°C CYCLE Program (35 cyklů): 10 sec 91°C; 50 sec 62°C; 35 sec 72°C HOLD Program: 5 min 72°C HOLD Program: 72°C VŽDY (NESMÍ PŘEKROČIT 24 HODIN) V cyklačních programech ponechte náběhové časy nastavené na (0:00), což je maximální rychlost a přípustnou chybu nastavení (2°C). Spojte těchto 5 programů dohromady do METHOD programu. Pro další informace o programování a práci s termálními cyklery nastudujte uživatelský manuál k Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9600 nebo k GeneAmp PCR System 2400.

3.

Naprogramujte termální cykler Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9700 na AMPLICOR® CT/NG Test následujícím způsobem: HOLD Program: HOLD Program: CYCLE Program (36 cyklů): HOLD Program: HOLD Program:

2 min 50°C 5 min 94°C 20 sec 93°C; 60 sec 61°C; 40 sec 71°C 5 min 72°C 72°C VŽDY (NESMÍ PŘEKROČIT 24 HODIN)

V programu CYCLE musí být všechny rychlosti zvyšování resp. Snižování teploty nastaveny na 50% ze 100%, kdy cyklování neprobíhá. Z možností, které nabízí monitor pod Create zvolte kurzorem program CYCLE a klikněte na funkci More abyste se dostali k nabídce Modify. Klikněte na obrazovce na Modify a na obrazovce se otevře nabídka Select Modification. Stiskněte Ramp a dostanete sena obrazovce k nabídce Ramp Rate Modification. Použijte kruhovou klávesu a zvolte náběh, který chcete změnit a zvolte 50% Slower. Opakujte toto nastavení pokaždé,když budete měnit rychlost zvyšování nebo snižování teploty v programu CYCLE. V dalším nastavte Reaction Volume na 100 µl tak, že změníte nejprve Ramp Speed z 9600 Mode na Max Mode. Abyste toho dosáhli, sjeďte kurzorem dolů nac Ramp Speed a zvolte Max. Pak se kurzorem vraťte k Reaction Volume a zvolte 100 µl. Nastudujte v uživatelském manuálu pro termální cykler Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9700 další informace o programování a použití.

D2.

4.

Nastartujte program METHOD. Programběží přibližně 2 hodiny. Vzorky mohou být vyjmuty kdykoliv během programu HOLD, ale nejpozději do 24 hodin.

5.

Vyjměte stojánek se vzorky s dokončenou PCR z termálního cykleru a vložte MicroAmp Base. NEPŘENÁŠEJTE VZORKY DO PREAMPLIFIKAČNÍHO PROSTORU. AMPLIFIKOVANÉ KONTROLY A VZORKY JE NUTNO POVAŽOVAT ZA HLAVNÍ ZDROJ KONTAMINACE.

6.

Odstaňte opatrně víčka ze zkumavek tak, abyste zamezili vytvoření aerosolu z produktu. Ihned napipetujte multikanálovou pipetou se špičkami s ochranou proti tvorbě aerosolů do prvního sloupce nebo řady zkumavek 100 µl [1] DN a vzorky promíchejte jejich opětovným nasáváním do pipety a vypuzováním. Tento postup opakujte u všech vzorků. Používejte vždy nové sady špiček. Pro dosažení úplné denaturaci inkubujte vzorky 10 minut při pokojové teplotě.

7.

Denaturovaný amplikon může stát při pokojové teplotě nejvýše 2 hodiny. Není-li možné zahájit detekční reakci dříve než po 2 hodinách, uzavřete opět zkumavky a uchovávejte denaturovaný amplikon při 2–8°C nejvýše jeden týden.

Detekce

POZNÁMKA: Postupujte při detekci amplikonů CT, NG a IC podle tohoto návodu. Používejte MWP potažených sondami CT, NG a/nebo IC DNA, které jsou pro detekci vhodné. Pro vnitřní kontrolu IC MWP používejte [2] CT/NG HYB dodávaný v kitu AMPLICOR® CT/NG Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae Detection Kits.

15

POZNÁMKA: Všechny reagencie zahřejte na pokojovou teplotu. POZNÁMKA: Při testování vzorků výtěrů odebraných do a transportovaných v AMPLICOR® STD Swab Specimen Collection and Transport Kit je nutné provádět i detekci vnitřních kontrol CT/NG IC. 1.

Připravte pracovní promývací pufr (1X) následujícím způsobem. Prohlédněte WB, a v případě nutnosti jej zahřejte na 30–37°C, aby se rozpustily všechny sraženiny. Přidejte 1 objem 10X WB k 9 objemům destilované nebo deionizované vody. Dobře promíchejte. Pro ruční promývání připravte 40 ml Working Wash Solution na každou řádku 8-jamkové mikrodestičky (MWP). Pro automatickou myčku připravte množství odpovídající používanému modelu myčky. Working Wash Solution lze skladovat při teplotách 2–25°C v čistých uzavřených plastikových lahvičkách. Zůstává stálý po dobu 2 týdnů od přípravy.

2.

Temperujte MWP před vyjmutím z plastikových sáčků při pokojové teplotě. Vyjměte přiměřený počet 8-jamkových MWP stripů z plastikového balíčku (plastikových balíčků) a vložte do MWP rámečku MWP. Nepoužité mikrodestičky vraťte do sáčku, přesvědčte se, že je v něm desikační přípravek a sáček uzavřete. (POZNÁMKA: S MWP stripy je nutno zacházet opatrně aby se nepolámaly. Při vyjímání z rámečku umístěte střed MWP na vrchol Costar® 96-well strip ejectoru a stlačte rovnoměrně rohy rámečku. Při vkládání stripů umístěte Costar 96-well strip ejector na vrchol stripu a stlačte rovnoměrně proti stripům.)

3.

Přidejte 100 µl [2] CT/NG HYB do každé testovací jamky MWP.

4.

Pokud byly denaturované amplikonyf přechvávány při 2–8°C, inkubujte je při 37°C 2–4 minuty, aby se snížila viskozita.

5.

Používejte mikropipetu se špičkou s ochranou proti tvorbě aerosolu a napipetujte 25 µl denaturovaného amplikonu do jamek MWP. Poklepejte jemně na destičku asi 10–15 krát dokud se nezmění barva z modré na světle žlutou (změna barvy indikuje, že promíchání bylo dostatečné).

6.

Zakryjte MWP víčkem na MWP; inkubujte 1 hodinu přit 37°C ± 2°C.

7.

Vypláchněte 5 krát destičky ručně nebo v automatické myčce destiček roztokem Working Wash Solution. Ruční mytí: a.

Vyprázdněte destičky a osušte je papírovým ručníkem.

b.

Napipetujte do každé jamky Working Wash Solution tak, aby byla plná (250–300 µl). Ponechte 30 sekund namočené. Vyprázdněte a osušte.

c.

Opakujte krok (b) 4 několikrát.

Automatické mytí v myčce: a.

Vysajte obsah jamek.

b.

Naplňte každou jamku po okraj s Working Wash Solution (přibližně 250–300 µl v závislosti na myčce), ponechte 30 sekund namočené a obsah zcela odsajte.

c.

Opakujte krok (b) 4 několikrát.

d.

Po skončení automatického mytí destičky osušte.

8.

Přidejte 100 µl [3] AV-HRP do každé jamky. Destičku přikryjte a inkubujte 15 minut při 37°C ± 2°C.

9.

Připravte Working Substrate smícháním 2,0 ml [4A] SUB A a 0,5 ml [4B] SUB B pro každý dvojnásobek 8-well microwell plate strips (16 testů). Nepřipravujte toto činidlo dříve než 3 hodiny před použitím. Uchovávejte při pokojové teplotě a chraňte před přímým světlem.

10. Destičky vymejte tak, jak je popsáno v kroku 7. 11. Přidejte 100 µl Working Substrate do každé testované jamky (AMPLICOR® Electronic Pipettor, Program 2). 12. Zabarvení se objeví během 10 minut při pokojové teplotě (20–25°C) ve tmě. 13. Přidejte 100 µl [5] STOP do každé jamky (AMPLICOR® Electronic Pipettor, Program 2). 14. Měřte absorbanci při 450 nm do 1 hodiny po přidání [5] STOP. Zaznamenejte hodnoty měření u každého vzorku a kontrol. KONTROLA KVALITY V každé serii testů musejí být nejméně jeden duplikát CT (+) Control a jeden duplikát NG (+) Control. Pro testování vzorků moče a/nebo výtěrů přenášených v STM připravte odpovídající sadu kontrol a testujte je v duplikátu. Při testování samotných výtěrů přenášených v CTM připravte odpovídající sadu kontrol a testujte je v duplikátu. Při testování obojího, moče i výtěrů v CTM je nutné připravit jednu sadu kontrol pro každý typ vzorků; každá sada kontrol bude testována jednou. Pro přípravu odpovídajících kontrol ke každému typu vzorku viz Část C sekce „Návod k použití“. Při zavádění každého nového laboratorního postupu musí operátor uvážit zařazování dalších negativních i pozitivních kontrol do každého testovaného souboru a to až do doby kdy si je dostatečně jist, že provádí testování správně. Není rozhodující, na které pozici ve stojánku MicroAmp jsou kontroly zařazeny. 16

Negativní Kontroly CT (+) Control na NG MWP Výsledky eseje pro každou CT (+) C na NG MWP by měly být nižší než 0,20 A450 jednotek. Jestliže jsou hodnoty CT (+) C vyšší anebo rovné 0,20 A450 jednotek, je celá procedura neplatná a test (příprava vzorku, amplifikace a detekce) se musí opakovat. Jestliže je hodnota absorbance CT (+) C trvale vyšší než 0,20 A450, kontaktujte místní pobočku fi Roche a požádejte o technickou pomoc. NG (+) Control na CT MWP Výsledky eseje pro každou NG (+) C na CT MWP by měly být nižší než 0,20 A450 jednotek. Jestliže je hodnota NG (+) C větší nebo rovná 0,20 A450 jednotek, je celá procedura neplatná a test (příprava vzorku, amplifikace a detekce) se musí opakovat. Jestliže je hodnota absorbance NG (+) C trvale vyšší než 0,20 A450, kontaktujte místní pobočku fi Roche a požádejte o technickou pomoc. Pozitivní kontroly CT (+) Control na CT MWP Výsledky eseje pro každou CT (+) C na CT MWP by měly být vyšší nebo rovné 2,0 A450 jednotek. Jestliže je hodnota CT (+) C nižší než 2,0 A450 jednotek, je celá procedura neplatná a test (příprava vzorku, amplifikace a detekce) se musí opakovat. Jestliže je hodnota absorbance CT (+) C trvale nižší než 2,0 A450, kontaktujte místní pobočku fi Roche a požádejte o technickou pomoc. NG (+) Control na NG MWP Výsledky eseje NG (+) C na NG MWP by měly být vyšší nebo rovné 1,5 A450 jednotek. Jestliže jsou hodnoty NG (+) C nižší než 1,5 A450 jednotek, je celá procedura neplatná a test (příprava vzorku, amplifikace a detekce) se musí opakovat. Jestliže je hodnota absorbance NG (+) C trvale nižší než 1,5 A450, kontaktujte místní pobočku fi Roche a požádejte o technickou pomoc. Kontrola správného postupu testování vzorků K ověření efektivity pracovního postupu při zpacování vzorků (doporučuje se provádět jednou měsíčně), se do zkumavky s transportním mediem pro kultury nebo AMPLICOR® STM přidá 103–104 McCoys buněk infikovaných C. trachomatis a/nebo přibližně 104 N. gonorrhoeae buněk (obojí dostupné z American Type Culture Collection) a inkubuje se 1 hodinu při pokojové teplotě. Naočkované vzorky by měly být zpracovány a testovány stejným způsobem jako odpovídající vzorky výtěrů. V případě správného postupu by hodnota absorbance na MWP měla být > 0,8 A450. VÝSLEDKY A.

VÝSLEDKY CT

Interpretace výsledků – Bez detekce vnitřní kontroly 1.

Podívejte se na hodnoty kontrol, abyste měli jistotu, že výsledky měření jsou platné (viz sekce „Kontrola kvality“). Jestliže jsou výsledky měření neplatné, opakujte celé měření od začátku (příprava vzorku, amplifikace a detekce).

2.

Jestliže je měření platné, interpretují se výsledky takto: A450 < 0,2

C. trachomatis DNA nezjištěna. Vzorek je považován za negativní na C. trachomatis. Negativní výsledek nevylučuje infekci C. trachomatis, protože výsledky závisí na správném odběru vzorku, nepřítomnosti inhibitorů a dostatečném množství zjišťované DNA.

≥ 0,8

C. trachomatis DNA zjištěna. Vzorek je pozitivní na C. trachomatis.

≥ 0,2; < 0,8

3.

INTERPRETACE

Nejednoznačné. Výsledky vyšetření vzorku na přítomnost C. trachomatis jsou dvojznačné. Opakujte test u vyšetřovaného vzorku v duplikátu. Výsledky vyhodnoťte na základě všech 3 hodnot.

U nejednoznačných vzorků, se konečná interpretace testu stanoví pomocí mezní hodnoty A450 = 0,20. Vzorky s dvojznačnými výsledky (A450 ≥ 0,2; < 0,8) musí být před konečným rozhodnutím testovány ještě jednou v duplikátu. Vzorky, u kterých bude nejméně u 2 ze 3 výsledků (originální a nejméně jeden opakovaný duplikát) A450 větší nebo rovné 0,2 je třeba považovat za pozitivní na C. trachomatis. Jestliže u obou duplikátů bude A450 menší než 0,2, lze považovat vzorek za negativní na C. trachomatis. 17

Interpretace výsledků – S detekcí vnitřní kontroly 1.

Podívejte se na hodnoty kontrol, abyste měli jistotu, že výsledky měření jsou platné (viz sekce „Kontrola kvality“). Jestliže jsou výsledky měření neplatné, opakujte celé měření od začátku (příprava vzorku, amplifikace a detekce).

2.

U platných měření jsou vzorky s hodnotami A450 < 0,2 hodnoceny následovně: Výsledek na CT A450

Výsledek na IC A450

INTERPRETACE

< 0,2

≥ 0,2

C. trachomatis DNA nezjištěna. Vzorek je považován za negativní na C. trachomatis. Negativní výsledek nevylučuje infekci C. trachomatis protože výsledky závisí na správném odběru vzorku, nepřítomnosti inhibitorů a dostatečném množství zjišťované DNA.

< 0,2

< 0,2

Inhibitorní vzorek. C. trachomatis DNA, nemusí být zjistitelná i když bude přítomna. Zpracujte další alikvotní podíl původního vzorku a test opakujte. Inhibitory jsou často nestálé a vzorky, které byly zpočátku inhibiční nemusí už být při opakování inhibovány. Není-li původní vzorek k dispozici, je nutné odebrat nový vzorek.

3.

Jsou-li měření platná, je vzorek s hodnotou A450 ≥ 0,8 považován za pozitivní na C. trachomatis, bez ohledu na naměřenou hodnotu u vnitřní kontroly.

4.

Při platném měření jsou, se musejí měření vzorků vykazujících počáteční hodnoty CT v šedé zóně (A450 ≥ 0,2, < 0,8), bez ohledu na naměřené hodnoty vnitřních kontrol, před konečným rozhodnutím opakovat. Pro konečné hodnocení těchto vzorků je hraniční hodnota absorbace 0,2 A450. Interpretace opakovaného testu: Opakovat výsledek CT vzorku Nejméně jeden výsledek ≥ 0,2

B.

Opakovat výsledek IC vzorku Jakákoliv hodnota

Oba výsledky < 0,2

Oba výsledky ≥ 0,20

Oba výsledky < 0,2

Minimálně jeden výsledek < 0,20

Interpretace Vzorek je pozitivní na C. trachomatis. Vzorek je považován za negativní na C. trachomatis. Neplatný negativní výsledek. Přítomnost C. trachomatis ve vzorku je nejistá.

NG VÝSLEDKY

Interpretace výsledků – Bez detekce vnitřní kontroly 1.

Podívejte se na hodnoty kontrol, abyste měli jistotu, že výsledky měření jsou platné (viz sekce „Kontrola kvality“). Jestliže jsou výsledky měření neplatné, opakujte celé měření od začátku (příprava vzorku, amplifikace a detekce).

2.

Jestliže je měření platné, interpretují se výsledky takto: A450

INTERPRETACE

< 0,2

N. gonorrhoeae DNA nezjištěna. Vzorek je považován za negativní na N. gonorrhoeae. Negativní výsledekt nevylučuje N. gonorrhoeae infekci, protože výsledky závisí na správném odběru vzorku, nepřítomnosti inhibitoru a dostatečném množství detekované DNA.

≥ 0,2

N. gonorrhoeae DNA zjištěna. Vzorek je považován za pozitivní na N. gonorrhoeae. Výsledky by měly být potvrzeny opakováním testu.

18

3.

Výsledky měření u vzorků považovaných za pozitivní na N. gonorrhoeae by měly být ověřeny opakováním testu. U vzorků moče a výtěrů v CTM, použijte jiný alikvót z původního vzorku anebo požádejte o nový vzorek a proveďte samostatný test. U výtěrů transportovaných v AMPLICOR® Specimen Transport Media, proveďte samostatný test u původního vzorku. Výsledek opakovaného testu je rozhodující pro konečné hodnocení. Vzorky s hodnotami A450 ≥ 0,2 v opakovaném testu jsou pozitivní na N. gonorrhoeae. Vzorky s hodnotami A450 < 0,2 v opakovaném testu jsou považovány za negativní na N. gonorrhoeae.

POZNÁMKA: Vzorky z urogenitálního traktu obsahují nepatogenní druhy Neisseria, které vykazují zkříženou reakci a mohou být příčinou pozitivních výsledků i opakovaných měření26. Takže některé vzorky, které jsou hodnoceny jako pozitivní nemusí N. gonorrhoeae obsahovat. Dopad takovýchto falešných výsledků na prokazatelnost testu závisí na stupni promoření populace gonokokální infekcí (viz Limity testu). Interpretace výsledků – S detekcí vnitřní kontroly 1.

Podívejte se na hodnoty kontrol, abyste měli jistotu, že výsledky měření jsou platné (viz sekce „Kontrola kvality“). Jestliže jsou výsledky měření neplatné, opakujte celé měření od začátku (příprava vzorku, amplifikace a detekce).

2.

Jestliže je měření platné, interpretují se výsledky takto:

3.

Výsledek na NG A450

Výsledek na IC A450

INTERPRETACE

< 0,2

≥ 0,2

N. gonorrhoeae DNA nezjištěna. Vzorek je považován za negativní na N. gonorrhoeae. Negativní výsledek nevylučuje N. gonorrhoeae infekci, protože výsledky závisí na správném odběru vzorku, nepřítomnosti inhibitorů a dostatečném množství detekované DNA.

< 0,2

< 0,2

Inhibitorní vzorek. N. gonorrhoeae DNA nebude možné zjistit i když bude přítomna. Zpracujte další alikvótní část původního vzorku a test opakujte. Inhibitory jsou často nestálé a vzorky, které byly zpočátku inhibiční nemusí už být při opakování inhibovány. Není-li původní vzorek k dispozici, je nutné jej znovu odebrat.

≥ 0,2

JAKÉKOLIV

N. gonorrhoeae DNA zjištěna. Vzorek je považován za pozitivní na N. gonorrhoeae. Tyto výsledky by měly být potvrzeny opakováním testu.

Výsledky měření u vzorků považovaných za pozitivní na N. gonorrhoeae by měly být ověřeny opakováním testu. U vzorků moče a výtěrů v CTM, použijte jiný alikvót z původního vzorku anebo požádejte o nový vzorek a proveďte samostatný test. U výtěrů transportovaných v AMPLICOR® Specimen Transport Media, proveďte samostatný test u původního vzorku. Konečné vyhodnocení testu závisí na výsledcích opakovaného měření s: Výsledek vyšetření na NG Výsledek vyšetření na IC

Interpretace

≥ 0,2

Jakákoliv hodnota

< 0,2

≥ 0,20

Vzorek je považován za negativní na N. gonorrhoeae.

< 0,2

< 0,20

Neplatný negativní výsledek. Přítomnost N. gonorrhoeae je nejistá. Opakujte test ještě jednou a použijte další alikvotni podíl původního vzorku.

Vzorek je pozitivní na N. gonorrhoeae.

POZNÁMKA: Vzorky z urogenitálního traktu obsahují nepatogenní druhy Neisseria, které vykazují zkříženou reakci a mohou být příčinou pozitivních výsledků i opakovaných měření26. Takže některé vzorky, které jsou hodnoceny jako pozitivní nemusí N. gonorrhoeae obsahovat. Dopad takovýchto falešných výsledků na prokazatelnost testu závisí na stupni promoření populace gonokokální infekcí (viz Limity testu).

19

BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ PŘI PRÁCI 1.

Pracovní tok musí v laboratoři probíhat jednosměrně, od předamplifikačního prostoru směrem k prostoru poamplifikačnímu (amplifikace/detekce). Předamplifikační činnosti začínají přípravou činidel a postupují k přípravě vzorků. Látky a vybavení se musí přiřadit jednotlivým předamplifikačním činnostem a nesmějí se používat k jiným činnostem, ani přenášet mezi jednotlivými vyhrazenými prostory. Ve všech prostorech je třeba nosit rukavice, které se před opuštěním prostoru vymění. Vybavení a materiály používané při přípravě činidel se nesmějí používat při přípravě vzorků nebo pro pipetování nebo manipulaci s amplifikovanou DNA nebo jinými zdroji terčové DNA. Postamplifikační materiály a vybavení musí vždy zůstat v postamplifikačním prostoru.

2.

Jak je tomu při každém testovacím postupu, je pro správné fungování tohoto testu věcí zásadním požadavkem dodržovat principy správné laboratorní praxe. Vzhledem k vysoké analytické citlivosti testu je třeba věnovat mimořádnou péči tomu, aby se zachovala čistota reagencií soupravy a amplifikačních směsí. U všech činidel je třeba čistotu bedlivě sledovat. Jakmile je podezření na znečištění, je třeba činidlo zlikvidovat.

LIMITY TESTU 1.

Na funkčnost testu může mít vliv prevalence gonokokové infekce v dané populaci. Pozitivní prediktivní hodnoty klesají při testování populace s nízkou prevalencí nebo u jedinců s nulovým rizikem nákazy. Protože výskyt onemocnění N. gonorrhoeae může být u některých skupin obyvatel nebo skupiny pacientů nízký, může jejich falešně-pozitivní podíl 4% až 5% překrýt skutečně-pozitivní skupinu a prediktivní hodnota pozitivního testu je velmi nízká. Jelikož někteří skutečně infikovaní pacienti nebudou při testování jednoho vzorku na kulturu zjištěni, nemůže být z klinických dat zjištěn podíl falešně-pozitivních případů. Podíl falešně-pozitivních výsledků testů může záviset na zkušenosti, zručnosti pracovníka, zacházení se vzorky i s činidly a podobných faktorech každé laboratoře. Doporučuje se pro vyloučení možnosti falešně-pozitivní diagnózy na N. gonorrhoeae a možných nepříjemných důsledků provést jiný test amplifikace nukleových kyselin nebo kultivaci vzorku4. Kultivace je nutná pro zjištění antimikrobiální citlivosti a k uložení pro případné lékařsko-právní projednávání. Viz Charakteristické projevy, Predictivní hodnoty.

2.

Tento test je prověřen pro výtěry z děložního hrdla u žen, výtěry z močové trubice mužů a vzorky moči žen i mužů. Pokud by byly testovány jiné typů vzorků, mohly by být výsledky falešně negativní nebo falešně pozitivní. Výtěry z krku budou s vysokou pravděpodobností falešně-pozitivní na N. gonorrhoeae.

3.

I když vzácně, mutace ve vysoce konzervovaných oblastech DNA krypického plazmidu C. trachomatis pokryté primery testu a/nebo sondou mohou vést k selhání detekce bakterie v této situaci.

4.

AMPLICOR® CT/NG Test nezjistí bezplazmidové varianty Chlamydia trachomatis.

5.

Důvěryhodnost výsledků závisí na správném odběru vzorků a správném způsoby přepravy vzorků.

6.

Detekce C. trachomatis závisí na počtu organizmů přítomných ve vzorku a může být ovlivněna metodou odběru vzorku, zvláštnostmi pacienta (věk, anamnéza STD, přítomnost symptomů), průběhem infekce a/nebo infikujícím C. trachomatis serovaru.

7.

Detekce N. gonorrhoeae závisí na počtu organizmů přítomných ve vzorku a může být ovlivněna metodou odběru vzorku, zvláštnostmi pacienta (věk, anamnéza STD, přítomnost symptomů), průběhem infekce a/nebo kmenem infikující N. gonorrhoeae.

8.

V důsledku inhibice polymerázy se mohou objevit falešně negativní výsledky. CT/NG Internal Control je součástí AMPLICOR® CT/NG Test proto, aby identifikovala ve vzorcích látky, které mohou interferovat s PCR amplifikací.

9.

Při testování výtěrů odebraných a přepravených pomocí soupravy AMPLICOR® STD Swab Specimen Collection and Transport Kit je třeba provádět detekci vnitřní kontroly CT/NG.

10.

Laboratoře zavádějící COBAS® AMPLICOR® CT/NG Test na Chlamydia trachomatis a zaměstnávají začátečníky, nebo přecházejí na jiné testování nebo jiný zůsob odběru vzorku mohou využít CT/NG IC k zjišťování výše inhibice v místní populaci. To je důležité při testování vzorků moči a výtěrů transportovaných v kultivačním transportním mediu pro Chlamydie. Podle výsledků vyhodnocení tohoto testu se může laboratoř rozhodnout používat i nadále CT/NG IC při vyšetřování těchto tří typů vzorků.

11.

Přidání enzymu AmpErase k CT/NG MMX snižuje riziko kontaminace amplikonu. Ale zabránit kontaminaci od CT/NG pozitivních kontrol a CT/NG pozitivních klinických vzorků lze jenom dodržováním správných laboratorních praktik a pečlivým dodržováním doporučení popsaných v této příručce.

12.

Interference exogenními nebo endogenními látkami nebyla zjištěna.

13.

Dostatečnost vzorku může být zjištěna mikroskopickým vyšetřením cylindrických epiteliálních buněk ve vzorku.

14.

Tak jako u všech diagnostických testů by měly být výsledky s AMPLICOR® CT/NG Test interpretovány v souvislosti se všemi klinickými a laboratorními nálezy.

15.

S produktem by měli pracovat pouze pracovníci znalí technik PCR. 20

16.

Pro tento test lze požívat pouze termálních cyklerů Applied Biosystems GeneAmp PCR Systems 9600, 9700 nebo GeneAmp PCR Systems 2400.

CHARACTERISTIKA TESTU A.

Specifičnost

Analytická specifičnost AMPLICOR® CT/NG Test byla ověřována přidáním vykultivovaných buněk nebo virů k vzorkům CTM i běžné lidské moči. CTM a moč byly zpracovány a testovány standardní procedurou za použití AMPLICOR® CT/NG testu. Testované organismy se hojně vyskytují v urogenitálním traktu. Žádný z následujících organismů nebo virů nebyl v AMPLICOR® CT/NG Testu reaktivní: Achromobacter xerosis Acinetobacter calcoaceticus Acinetobacter lwoffi Acinetobacter sp. genospecies 3 Actinomyces isrealii Aerococcus viridans Aeromonas hydrophila Agrobacterium radiobacter Alcaligenes faecalis Bacillus subtilis Bacillus thuringiensis Bacteriodes fragilis Bacteroides caccae Bacteroides gracilis Bifidobacillus longum Bifidobacterium adolescentis Branhamella catarrhalis Brevibacterium linens Candida albicans Candida glabrata Candida guilliermondi Candida krusei Candida parapsilosis Candida tropicalis Chlamydia pneumoniae Chlamydia psittaci Chromobacter violaceum Citrobacter freundii Clostridium innocuum Clostridium perfringens Corynebacterium genitalium Corynebacterium xerosis Cryptococcus neoformans Cytomegalovirus Deinococcus radiopugnans Derxia gummosa Echerichia coli Edwardsiella tarda Eikenella corrodens Enterobacter cloacae Enterococcus avium Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Epstein Barr Virus Erysipelothrix rhusiopathiae Ewingella americana Flavobacterium meningosepticum Gamella haemolysans Gamella morbillorum Gardnerella vaginalis Haemophilus ducreyi Haemophilus influenzae Herpes simplex virus 1 Herpes simplex virus 2 Lidský papilloma virus typ 16

Lidský papilloma virus typ 18 Kingella kingae Klebsiella pneumoniae ss ozaenae Lactobacillus acidophillus Lactobacillus brevis Lactobacillus crisptus Lactobacillus jensenii Lactobacillus lactis lactis Lactobacillus oris Lactobacillus parabuchnerri Lactobacillus vaginalis Lactococcus lactis cremoris Legionella bozemnii Legionella pneumophila Leuconostoc paramesenteroides Micrococcus luteus Mobiluncus curtsil subsp. curtsii Mobiluncus curtsil subsp. homesi Moraxella osloensis Morganella morganii Mycobacterium smegmatis Mycoplasma genitalium Mycoplasma hominis Mycoplasma pneumoniae Neisseria elongata Neisseria flavescens Neisseria kochi Neisseria lactamica Neisseria meningitidis 135 Neisseria mucosa Neisseria perflava Neisseria polysaccharea Neisseria sicca Paracoccus denitrificans Pasteurella maltocida Pediococcus acidilactica Peptostreptococcus anaerobius Peptostreptococcus magnus Peptostreptococcus productus Previttla bivia Previttla corporis Prevotella intermedia Propionibacterium acnes Proteus mirabilis Providencia stuartii Pseudomonas putida Pseudomonas aeruginosa Rahnella aquatilis Rhodospirillum rubrum Salmonella minnesota Salmonella typhimurium Serratia marscence Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Streptococcus agalactiae 21

Streptococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes Streptococcus salivarius Treponema pallidum* Trichomonas vaginalis Ureaplasma urealyticum Vibrio parahaemolyticus Yersinia enterocolitica

Streptococcus anginosus Streptococcus bovis Streptococcus dysgalatia Streptococcus sanguis Streptomyces griseinus Streptococcus equinis Streptococcus mitis Streptococcus mutans

* Ke vzorkům CTM a moči byla přidána purifikovaná DNA. Kmeny N. subflava a N. cinerea získané z American Type Culture Collection také nereagovaly s AMPLICOR® CT/NG Test. Avšak dva izoláty N. subflava a jeden izolat N. cinerea získaných při výtěru krku zdravého člověka vykazovaly zkříženou reaktivitu, když byly po amplifikaci detekovány na NG MWP. Tyto izoláty nevykazují zkříženou reaktivitu při detekci na CT MWP. B.

Analytická citlivost

C. trachomatis AMPLICOR® CT/NG Test je schopen detekovat i jednu IFU v C. trachomatis na PCR reakci. Tato analytická citlivost byla stanovena postupným zřeďováním titru kultur každého z 15 sérovarů C. trachomatis v CTM. Vzorky z každého ředění byly zpracovány a testovány standardním postupem pro AMPLICOR® CT/NG Test. Každý ze sérovarů ředěný CTM s obsahem 80 IFU/ml, což odpovídá 1 IFU na amplifikační reakci, dával silnou pozitivní odpověď na C. trachomatis MWP. N. gonorrhoeae AMPLICOR® CT/NG Test může detekovat pouhých pět CFU N. gonorrhoeae na PCR reakci. Tato analytická citlivost byla stanovena postupným zřeďováním titru kultur každého z 15 izolátů N. gonorrhoeae v CTM. Vzorky z každého ředění byly zpracovány a testovány standardním postupem pro AMPLICOR® CT/NG Test. Každý kmen ředěný CTM s obsahem 400 CFU/ml, což odpovídá 5 CFU na jednu amplifikační reakci, dával silnou pozitivní odpověď na N. gonorrhoeae MWP. C.

Přesnost

Přesnost testu AMPLICOR® CT/NG byla ověřována u terčů CT, NG a vnitřních kontrol porovnáním výsledků získaných při jednom měření, mezi různými měřeními a mezi měřeními z různých dnů. Výpočty jsou založeny na NCCLS (EP5-A) směrnici pro přesnost měření v jedné sadě a celkové přesnosti. Variace byla vypočítána jako druhá mocnina průměrné hodnoty odchylek hodnot jednotlivých měření od průměrné hodnoty souboru. Všechny záporné hodnoty odchylek byly kalkulovány jako nula. Byly vybrány čtyři typy vzorků: zpracovaná CTM CT (+) Control, zpracovaná CTM NG (+) Control, zpracovaná CT (+) Control v moči a zpracovaná NG (+) Control v moči. Tyto vzorky s obsahem 20 DNA replik/amplifikační reakci byly 2-krát naředěny vzorkovým pufrem tak, aby obsahovaly 10 DNA replik/amplifikační reakci. V každém z těchto čtyř typů vzorků bylo denně testováno 2 pracovníky osm replikátů pro obě koncentrace DNA. Testování probíhalo pět dní. Takže bylo denně testováno 16 replikátů obou koncentrací DNA, celkem 80 testů. K testování přesnosti na CT při 0 kopiích CT DNA byly použity vzorky obsahující NG (+) Control (při 20 DNA replik/amplifikaci) (Tabulka 1). Podobně byly k testování NG s 0 kopiemi NG DNA použity vzorky s obsahem CT (+) Control (s 20 DNA replik/amplifikaci) (Tabulka 2). Test přesnosti pro vnitřní kontrolu byl měřen pouze pro 20 kopií CT/NG Internal Control DNA/PCR; to je množství CT/NG Internal Control, které se používá v AMPLICOR® CT/NG Test. Test přesnosti pro Internal Control byl měřen v přítomnosti zpracovaných CTM CT (+) Control, CTM NG (+) Control, CT (+) Control v moči a NG (+) Control v moči (Tabulka 3).

22

Tabulka 1 Přesnost AMPLICOR® CT/NG Test: CT Přesnost KONTROLA: POČET KOPIÍ/PCR: Celkový počet replicátů

CT moč 0 k./PCR

CT výtěr 0 k./PCR

CT moč 10 k./PCR

CT výtěr 10 k./PCR

CT moč 20 k./PCR

CT výtěr 20 k./PCR

80

80

80

80

80

80

Průměrná absorbance

0,050

0,044

3,945

3,956

3,887

3,966

Minimální hodnota

0,039

0,033

3,676

3,564

3,522

3,704

Maximální hodnota

0,126

0,093

4,000

4,000

4,000

4,000

Směrodatná odchylka

0,000

0,002

0,019

0,016

0,0043

0,000

Variační koeficient

0,00%

4,80%

0,50%

0,40%

0,10%

0,00%

MEZI RŮZNÝMI MĚŘENÍMI Směrodatná odchylka Variační koeficient

0,010 19,60%

0,005 10,50%

0,021 0,50%

0,011 0,30%

0,012 0,30%

0,023 0,60%

V RÁMCI JEDNOHO MĚŘENÍ Směrodatná odchylka Variační koeficient

0,011 21,60%

0,007 16,60%

0,093 2,40%

0,091 2,30%

0,136 3,50%

0,066 1,70%

CELKEM Směrodatná odchylka Variační koeficient

0,015 29,10%

0,009 20,20%

0,097 2,50%

0,093 2,40%

0,136 3,50%

0,070 1,80%

V RÁMCI JEDNOHO DNE

Tabulka 2 Přesnost AMPLICOR® CT/NG Test: NG Přesnost KONTROLA: POČET KOPIÍ/PCR:

CT moč 0 k./PCR

CT výtěr 0 k./PCR

CT moč 10 k./PCR

CT výtěr 10 k./PCR

CT moč 20 k./PCR

CT výtěr 20 k./PCR

Celkový počet replicátů Průměrná absorbance Minimální hodnota Maximální hodnota

80 0,048 0,037 0,137

80 0,049 0,035 0,103

80 3,806 2,795 4,000

80 3,886 3,075 4,000

80 3,799 3,405 4,000

80 3,925 2,975 4,000

V RÁMCI JEDNOHO DNE Směrodatná odchylka Variační koeficient

0,000 0,00%

0,000 0,00%

0,000 0,00%

0,000 0,00%

0,000 0,00%

0,044 1,10%

MEZI RŮZNÝMI MĚŘENÍMI Směrodatná odchylka Variační koeficient

0,004 8,80%

0,005 10,80%

0,182 4,80%

0,096 2,50%

0,125 3,30%

0,019 0,50%

V RÁMCI JEDNOHO MĚŘENÍ Směrodatná odchylka Variační koeficient

0,018 37,60%

0,010 19,30%

0,187 4,90%

0,157 4,00%

0,143 3,80%

0,140 3,60%

CELKEM Směrodatná odchylka Variační koeficient

0,018 38,60%

0,011 22,10%

0,261 6,90%

0,184 4,70%

0,190 5,00%

0,148 3,80%

23

Tabulka 3 Test přesnosti na CT/NG Internal Control* KONTROLA: POČET KOPIÍ/PCR:

CT moč 20 k./PCR

CT výtěr 20 k./PCR

NG moč 20 k./PCR

NG výtěr 20 k./PCR

Celkový počet replicátů Průměrná absorbance Minimální hodnota Maximální hodnota

80 3,886 3,056 4,000

80 3,82 2,427 4,000

80 3,943 2,851 4,000

80 3,829 2,655 4,000

V RÁMCI JEDNOHO DNE Směrodatná odchylka Variační koeficient

0,000 0,00%

0,000 0,00%

0,000 0,00%

0,000 0,00%

MEZI RŮZNÝMI MĚŘENÍMI Směrodatná odchylka Variační koeficient

0,000 0,00%

0,186 4,90%

0,054 1,40%

0,218 5,70%

V RÁMCI JEDNOHO MĚŘENÍ Směrodatná odchylka Variační koeficient

0,170 4,40%

0,262 6,90%

0,149 3,80%

0,248 6,50%

CELKEM Směrodatná odchylka Variační koeficient

0,169 4,40%

0,321 8,40%

0,158 4,00%

0,331 8,60%

* Každá amplifikace obsahuje 20 kopií CT/NG Internal Control. CT/NG Internal Control byla amplifikována v přítomnosti označené kontroly DNA a signály byly měřeny na IC MWP.

D.

Prediktivní hodnoty

Průkaznost testu může ovlivnit rozšířená gonokokové infekce uvnitř populace. Pozitivní prediktivní hodnoty klesají při testování populace s nízkou prevalencí nebo u jedinců s nulovým rizikem nákazy. Protože výskyt onemocnění N. gonorrhoeae může být u některých skupin obyvatel nebo skupiny pacientů nízký, může jejich falešně-pozitivní podíl 4% až 5% překrýt skutečně-pozitivní skupinu a prediktivní hodnota pozitivního testu je velmi nízká. Jelikož někteří skutečně infikovaní pacienti nebudou při testování jednoho vzorku na kulturu zjištěni, nemůže být z klinických dat zjištěn podíl falešně-pozitivních případů. Podíl falešně-pozitivních výsledků testů může záviset na zkušenosti, zručnosti pracovníka, zacházení se vzorky i s činidly a podobných faktorech každé laboratoře. Doporučuje se pro vyloučení možnosti falešně-pozitivní diagnózy na N. gonorrhoeae a možných nepříjemných důsledků provést jiný test amplifikace nukleových kyselin nebo kultivaci vzorku.4 Kultivace je nutná pro zjištění antimikrobiální citlivosti a k uložení pro případné lékařsko-právní projednávání. Hypoteticky pozitivní a negativní prediktivní hodnoty (PPV a NPV) pro různý podíl výskytu onemocnění jsou pomocí hodnot citlivosti 97,1% a specifičnosti 98,1% uspořádány v Tabulce 4. Tabulka 4 AMPLICOR® CT/NG Test na Neisseria gonorrhoeae Hypotetické prediktivní hodnoty při různém podílu výskytu Rozšíření (%)

Citlivost (%)

Specifičnost (%)

Pozitivní prediktivní hodnota (%)

Negativní prediktivní hodnota (%)

1

97,1

98,1

34,5

99,9

5

97,1

98,1

73,3

99,8

10

97,1

98,1

85,3

99,7

20

97,1

98,1

92,9

99,3

24

E.

Klinická průkaznost

AMPLICOR® CT/NG Test byl vyhodnocován na čtyřech různých místech na základě klinických studií. Na třech pracovištích byla stanovována i vnitřní kontrola. Celkem bylo testováno 651 vzorků moče mužů, 634 výtěrů z močové trubice u mužů, 752 vzorků moče u žen a 737 vzorků z výtěrů děložního hrdla žen. V této studii nebyly PCR-pozitivní vzorky na NG potvrzovány opakovaným testováním. Od většiny pacientů byly získány vhodné vzorky z výtěrů i moče. Jako referenční test sloužily kultury z výtěrů děložního hrdla a močové trubice mužů. Pouze v některých případech byly k dispozici i kultury C. trachomatis. Tyto vzorky byly zahrnuty do analýzy úspěšnosti zjišťování C. trachomatis ale byly vyloučeny z analýzy odhalování N. gonorrhoeae. Vzorky C. trachomatis u kterých byla diskrepance mezi mezi výsledkem kultivace na kultuře a výsledkem testu AMPLICOR® byly opakovaně analyzovány testem AMPLICOR® CT/NG (amplifikované produkty byly detekovány pouze na CT a IC MWP) a vystavením PCR alternativní C. trachomatis-specifické sekvence terčové DNA (část genu MOMP). Vzorky s rozpornými výsledky na N. gonorrhoeae získanými vyhodnocením kultivace na kultuře a testováním AMPLICOR® byly opakovaně analýzovány testem AMPLICOR® CT/NG (amplifikované produkty byly detekovány pouze na NG a IC MWP) a vystavením PCR alternativní N. gonorrhoeae-specifické sekvenci terčové DNA (část genu 16S rRNA). Výsledky byly zpracovány dvěma způsoby. Při první metodě (analýza na jeden vzorek) byly identifikovány referenční test-negativní infekce pomocí výsledků PCR pouze pro jeden typ vzorků, tedy buď pro výtěry nebo pro moč. Pacient byl klasifikován jako pozitivní na infekci, jestliže byl pozitivní referenční test nebo jestliže byl hodnocený typ vzorku PCR-pozitivní pro primární i alternativní terč. Při druhé metodě (analýza na jednoho pacienta) byly identifikovány referenční test-negativní infekce pomocí výsledků PCR pro výtěr i moč od jednoho pacienta. Pacient byl klasifikován jako pozitivní na infekci, jestliže byl pozitivní referenční test nebo jestliže byl jeden z obou typů vzorků PCR-pozitivní pro primární i alternativní terč. Výsledky byly počítány dvěma způsoby. Při výpočtu průkaznosti u testů bez vnitřní kontroly (Internal Control) byly inhibiční vzorky vyhodnoceny jako negativní na C. trachomatis a/nebo N. gonorrhoeae (Tabulky 5 a 7). Při výpočtu průkaznosti u testů s Internal Control byly inhibiční vzorky vyhodnoceny jako pozitivní nebo negativní podle výsledku opakování testu; vzorky, které byly i při opakovaném testu inhibiční byly považovány za nevyhovující a z výpočtů citlivosti a specifičnosti byly vyloučeny (Tabulky 6 a 8). Parametry testu byly vypočítávány pro každý typ vzorku zvlášť. AMPLICOR® NG-pozitivní vzorky nebyly ověřovány opakováním testu. Průkaznost NG ukazuje na citlivost a specifičnost AMPLICOR® při podezření na infekci NG. Citlivost a specifičnost byla vypočtena v porovnání s referenčními výsledky, výsledky členěnými na jednotlivé vzorky a výsledky členěnými na jednotlivé pacienty. Skutečná míra klinické citlivosti a specifičnosti testu AMPLICOR® CT/NG by měla být odvozena od srovnání počtu pacientů, u kterých byla správně zjištěna diagnóza. Pro zjištění průkaznosti nálezů NG byla provedena samostatná studie, ve které byly znovu testovány AMPLICOR® NG-pozitivní vzorky. Výtěry z močové trubice a současně vzorky moči padesáti mužů a výtěry z děložního hrdla a zároveň vzorky moči od 226 žen byly testovány testem AMPLICOR® CT/NG. Byly detekovány pouze NG a IC MWP. U všech vzorků, které byly AMPLICOR® NG-pozitivní byly pomocí AMPLICOR® CT/NG Test znovu testovány další alikvótní podíly původních vzorků. Jako referenční test sloužily kultury z výtěrů děložního hrdla a močové trubice mužů. Pro AMPLICOR® NG-pozitivní vzorky od pacientů s negativním výsledkem kultivace byla provedena diskrepační analýza. Tato analýza zahrnuje ty vzorky, které byly původně otestovány jako AMPLICOR® NG-pozitivní, ale při opakování testu byly negativní. Pro potřeby diskrepační analýzy byly alikvóty z původních vzorků zpracovány a testovány paralelně testem AMPLICOR® CT/NG (amplifikované produkty byly detekovány pouze na NG a IC MWP) a PCR testem na alternativní N. gonorrhoeae-specifickou sekvenci terčové DNA (část genu 16S rRNA). Výsledky byly zpracovány dvěma způsoby. Při první metodě (analýza na jeden vzorek) byly identifikovány referenční test-negativní infekce pomocí výsledků PCR pouze pro jeden typ vzorků, tedy buď pro výtěry nebo pro moč. Pacient byl klasifikován jako pozitivní na infekci, jestliže byl pozitivní referenční test nebo jestliže byl hodnocený typ vzorku PCR-pozitivní pro primární i alternativní terč. Při druhé metodě (analýza na jednoho pacienta) byly identifikovány referenční test-negativní infekce pomocí výsledků PCR pro výtěr i moč od jednoho pacienta. Pacient byl klasifikován jako pozitivní na infekci, jestliže byl pozitivní referenční test nebo jestliže byl jeden z obou typů vzorků PCR-pozitivní pro primární i alternativní terč. Výsledky testu byly vypočítány dvěma způsoby. Při výpočtu průkaznosti založeném na pravděpodobných výsledcích jsou AMPLICOR® NG-pozitivní vzorky interpreovány jako pozitivní na N. gonorrhoeae bez ohledu na výsledky opakovaného testování. Při výpočtu průkaznosti založeném na potvrzených výsledcích jsou vzorky považovány za pozitivní na N. gonorrhoeae pouze tehdy, jestliže jsou NG-pozitivní v prvním i v opakovaném testu AMPLICOR®. Průkazné hodnoty v Tabulce 9 jsou srovnatelné s těmi v Tabulce 8, které byly též započítány bez dalšího testvání. Tabulka 9 ukazuje, že míra specifičnosti je jiná když jsou pravděpodobně pozitivní výsledky ověřené retestováním.

25

Tabulka 5 Průkaznost CT bez stanovení vnitřní kontroly vs kultura výtěru

vs rozlišené výsledky na jeden vzorek

Pracov. Kategorie vzorků 1

Mužská moč CTM s mužským

N

Prevalence

Citlivost

114

22,8%

CTM s ženským

100,0%

82,4%

100,0%

98,9%

92,3%

98,9%

(6/6)

(89/108)

(24/24)

(89/90)

(24/26)

(87/88)

85,3%

100,0%

100,0%

81,5%

100,0%

(6/6)

(93/109)

(22/22)

(93/93)

(22/27)

(88/88)

157

22,9%

87,5%

88,7%

93,3%

98,4%

77,8%

98,3%

(14/16)

(125/141)

(28/30)

(125/127)

(28/36)

(119/121)

157

22,9%

87,5%

89,4%

93,1%

98,4%

75,0%

98,3%

(14/16)

(126/141)

(27/29)

(126/128)

(27/36)

(119/121)

100,0%

98,1%

95,8%

98,0%

126

19,0%

100,0%

85,6%

(8/8)

(101/118)

(23/23)

(101/103)

(23/24)

(100/102)

CTM s mužským

108

17,6%

100,0%

85,4%

100,0%

94,6%

78,9%

94,4%

(5/5)

(88/103)

(15/15)

(88/93)

(15/19)

(84/89)

CTM s ženským

150

10,7%

Mužská moč CTM s mužským

85,7%

93,0%

92,3%

97,1%

75,0%

97,0%

(6/7)

(133/143)

(12/13)

(133/137)

(12/16)

(130/134)

137

11,7%

100,0%

92,3%

100,0%

97,6%

87,5%

97,5%

(7/7)

(120/130)

(14/14)

(120/123)

(14/16)

(118/121)

345

16,2%

79,3%

92,9%

88,2%

100,0%

80,4%

100,0%

(23/29)

(290/312)

(45/51)

(290/290)

(45/56)

(285/285)

výtěrem

345

16,2%

výtěrem

93,1%

91,7%

96,2%

99,3%

91,1%

99,3%

(27/29)

(286/312)

(51/53)

(286/288)

(51/56)

(283/285)

100,0%

100,0%

82,4%

100,0%

Ženská moč

193

17,6%

100,0%

94,8%

(19/19)

(164/173)

(28/28)

(164/164)

(28/34)

(158/158)

CTM s ženským

193

17,6%

100,0%

92,5%

100,0%

100,0%

94,1%

100,0%

(19/19)

(160/173)

(32/32)

(160/160)

(32/34)

(158/158)

66

16,7%

100,0%

91,5%

100,0%

98,2%

100,0%

98,2%

(7/7)

(54/59)

(11/11)

(54/55)

(11/11)

(54/55)

85,7%

94,9%

90,0%

100,0%

81,8%

100,0%

(6/7)

(56/59)

(9/10)

(56/56)

(9/11)

(55/55)

100,0%

100,0%

100,0%

100,0%

výtěrem Mužská moč CTM s mužským

66

16,7%

výtěrem Ženská moč

252

4,8%

100,0%

98,4%

(8/8)

(240/244)

(12/12)

(240/240)

(12/12)

(240/240)

CTM s ženským

250

4,8%

100,0%

99,2%

100,0%

100,0%

83,3%

100,0%

(8/8)

(240/242)

(10/10)

(240/240)

(10/12)

(238/238)

výtěrem SOUČTY

Specifičnost

Mužská moč

Ženská moč

4

Citlivost

100,0%

výtěrem

3

Citlivost

23,5%

výtěrem 2

Specifičnost

115

výtěrem Ženská moč

Specifičnost

na jednoho pacienta

Mužská moč CTM s mužským

651

18,0%

634

17,8%

752

13,0%

výtěrem Ženská moč CTM s ženským výtěrem

737

13,3%

88,0%

89,4%

94,5%

99,3%

88,0%

99,2%

(44/50)

(534/597)

(103/109)

(534/538)

(103/117)

(526/530)

93,6%

89,7%

97,0%

98,7%

85,8%

98,6%

(44/47)

(523/583)

(97/100)

(523/530)

(97/113)

(510/517)

94,0%

94,4%

96,4%

99,1%

81,6%

99,1%

(47/50)

(662/701)

(80/83)

(662/668)

(80/98)

(647/653)

96,0%

94,2%

97,6%

99,2%

84,7%

99,2%

(48/50)

(646/686)

(83/85)

(646/651)

(83/98)

(633/638)

26

Tabulka 6 Průkaznost CT při zařazení vnitřní kontroly vs kultura výtěru

vs rozlišené výsledky na jeden vzorek

Pracov. Kategorie vzorků 1

Mužská moč

N Prevalence 114

CTM s mužským 115

22,8%

Inhibicea

Citlivost

5,3% (6)b

CTM s ženským

157 157

Mužská moč

Specifičnost

100,0%

81,6%

100,0%

98,8%

92,3%

98,8%

(6/6)

(84/103)

(24/24)

(84/85)

(24/26)

(82/83)

100,0%

100,0%

91,7%

100,0%

78,1%

(6/6)

(57/73)

(22/22)

(57/57)

(22/24)

(55/55)

22,9%

6,4% (10)

100,0%

88,5%

100,0%

98,4%

83,3%

98,3%

(16/16)

(123/139)

(30/30)

(123/125)

(30/36)

(117/119)

100,0%

89,1%

100,0%

98,4%

80,6%

98,3%

(16/16)

(122/137)

(29/29)

(122/124)

(29/36)

(115/117)

100,0%

98,0%

92,0%

98,0%

22,9%

3,2% (5)

126

19,8%

3,2% (4)

100,0%

85,2%

(8/8)

(98/115)

(23/23)

(98/100)

(23/25)

(96/98)

CTM s mužským 108

18,5%

2,8% (3)

100%

84,2%

100,0%

94,4%

80,0%

94,2%

(5/5)

(85/101)

(16/16)

(85/90)

(16/20)

(81/86)

Ženská moč CTM s ženským

150

10,7%

1,3% (2)

CTM s mužským

85,7%

93,0%

92,3%

97,1%

75,0%

97,0%

(6/7)

(133/143)

(12/13)

(133/137)

(12/16)

(130/134)

100,0%

97,5%

87,5%

97,5%

137

11,7%

4,4% (6)

100,0%

92,1%

(7/7)

(117/127)

(14/14)

(117/120)

(14/16)

(115/118)

66

16,7%

0,0% (0)

100,0%

91,5%

100,0%

98,2%

100,0%

98,2%

(7/7)

(54/59)

(11/11)

(54/55)

(11/11)

(54/55)

16,7%

15,2% (10)c

100,0%

94,7%

100,0%

100,0%

90,9%

100,0%

(7/7)

(54/57)

(10/10)

(54/54)

(10/11)

(53/53)

100,0%

100%

100,0%

100,0%

výtěrem Mužská moč

66

výtěrem Ženská moč

252

4,8%

2,0% (5)

100,0%

98,3%

(8/8)

(238/242)

(12/12)

(238/238)

(12/12)

(238/238)

CTM s ženským

250

4,8%

16,8% (42)c

100,0%

99,1%

100,0%

100,0%

83,3%

100,0%

(8/8)

(225/227)

(10/10)

(225/225)

(10/12)

(223/223)

100,0%

85,2%

100,0%

98,3%

93,5%

98,3%

(21/21)

(263/277)

(58/58)

(236/240)

(58/62)

(232/236)

100,0%

84,8%

100,0%

97,5%

87,3%

97,4%

(18/18)

(196/231)

(48/48)

(196/201)

(48/55)

(189/194)

96,8%

94,3%

98,2%

98,8%

84,4%

98,8%

(30/31)

(494/524)

(54/55)

(494/500)

(54/64)

(485/491)

100,0%

94,5%

100,0%

98,9%

82,8%

98,9%

(31/31)

(464/491)

(53/53)

(464/469)

(53/64)

(453/458)

výtěrem SOUČTY

Citlivost

100,0%

výtěrem

4

Citlivost

31,3% (36)b

výtěrem 2

Specifičnost

20,9%

výtěrem Ženská moč

Specifičnost

na jednoho pacienta

Mužská moč

306

CTM s mužským 289

20,3%

3,3% (10)

19,0%

17,0% (49)

11,4%

3,0% (17)

výtěrem Ženská moč CTM s ženským výtěrem

559 544

11,8%

9,7% (53)

a

# v závorkách jsou uvedeny počty CT-negativních vzorků, které vedou při prvním testování k negativním výsledkům vnitřní kontroly (IC). Mnoho z inhibičních vzorků dává při opakovaném testu správné výsledeky a jsou zařazeny do výpočtů citlivosti a specifičnosti. Tento soubor zahrnuje CT-negativní, IC-negativní vzorky výrazně pozitivní na NG. Protože byl signál IC snížen, nelze vyloučit menší rozsah infekce CT a vzorky jsou zařazeny do skupiny inhibiční na CT.

b

Mezi vzorky, které dávaly velmi silný NG-pozitivní signál bylo pět ze 6 inhibičních vzorků moči, 33 z 36 inhibičních CTM výtěrů a 3 ze 4 inhibičních STM výtěrů. Velký počet vzorků v této kategorii je dán vysokou mírou (77%) rozšíření NG.

c

Četnost inhibice je vysoká, protože zde používaná transportní media (nekomerční směsi obsahují Eagle’s Minimal Essential Medium a 10% fetálního hovězího séra) jsou nějakým způsobem inhibiční pro PCR.

27

Tabulka 7 Průkaznost NG bez zařazení Internal Control, bez opakování testu vs kultura výtěru

vs rozlišené výsledky na jeden vzorek

Pracov. Kategorie vzorků 1

Mužská moč CTM s mužským

N

Prevalence

Citlivost

Specifičnost

Citlivost

Specifičnost

Citlivost

Specifičnost

113

77,0%

98,8%

87,5%

98,8%

100,0%

96,6%

100,0%

(80/81)

(28/32)

(84/85)

(28/28)

(84/87)

(26/26)

114

77,2%

výtěrem Ženská moč CTM s ženským

146

32,9%

146

32,9%

126

27,8%

výtěrem 2

Mužská moč CTM s mužským

108

28,7%

výtěrem

97,7%

100,0%

96,6%

100,0%

(85/87)

(27/27)

(85/88)

(26/26)

74,4%

93,5%

77,3%

98,0%

70,8%

98,0%

(29/39)

(100/107)

(34/44)

(100/102)

(34/48)

(96/98)

94,9%

94,4%

95,6%

100,0%

89,6%

100,0%

(37/39)

(101/107)

(43/45)

(101/101)

(43/48)

(98/98)

93,8%

96,8%

94,1%

98,9%

91,4%

98,9%

(30/32)

(91/94)

(32/34)

(91/92)

(32/35)

(90/91)

89,3%

90,0%

90,3%

93,5%

90,3%

93,5%

(25/28)

(72/80)

(28/31)

(72/77)

(28/31)

(72/77)

66,7%

97,9%

54,5%

97,8%

7,3%

50,0%

95,8%

(3/6)

(138/144)

(6/9)

(138/141)

(6/11)

(136/139)

CTM s ženským

137

8,0%

83,3%

93,1%

90,0%

96,1%

81,8%

96,0%

(5/6)

(122/131)

(9/10)

(122/127)

(9/11)

(121/126)

Mužská moč

345

22,3%

345

22,3%

193

11,9%

výtěrem Ženská moč CTM s ženským

193

11,9%

výtěrem

93,2%

93,7%

94,4%

98,2%

88,3%

98,1%

(55/59)

(267/285)

(68/72)

(267/272)

(68/77)

(262/267)

96,6%

91,6%

97,3%

97,0%

94,8%

97,0%

(57/59)

(261/285)

(73/75)

(261/269)

(73/77)

(259/267)

86,7%

92,7%

90,0%

95,4%

78,3%

95,3%

(13/15)

(165/178)

(18/20)

(165/173)

(18/23)

(162/170)

100,0%

94,9%

100,0%

99,4%

100,0%

99,4%

(15/15)

(168/177)

(23/23)

(168/169)

(23/23)

(168/169)

100,0%

96,6%

100,0%

96,6%

Mužská moč

66

10,6%

100,0%

93,4%

(5/5)

(57/61)

(7/7)

(57/59)

(7/7)

(57/59)

CTM s mužským

66

10,6%

100,0%

96,7%

100,0%

100,0%

100,0%

100,0%

(5/5)

(59/61)

(7/7)

(59/59)

(7/7)

(59/59)

75,0%

96,0%

80,0%

96,4%

80,0%

96,4%

(3/4)

(238/248)

(4/5)

(238/247)

(4/5)

(238/247)

40,0%

98,8%

40,0%

98,8%

výtěrem Ženská moč CTM s ženským

252

2,0%

250

2,0%

25,0%

98,4%

(1/4)

(242/246)

(2/5)

(242/245)

(2/5)

(242/245)

650

31,7%

96,0%

93,9%

96,5%

98,2%

92,7%

98,2%

(170/177)

(443/472)

(191/198)

(443/451)

(191/206)

(435/443)

výtěrem SOUČTY

84,4% (27/32)

150

CTM s mužským

4

97,6% (80/82)

Ženská moč

výtěrem 3

na jednoho pacienta

Mužská moč CTM s mužským

633

32,1%

výtěrem Ženská moč

741

11,7%

CTM s ženským

726

12,0%

výtěrem

96,0%

91,5%

96,5%

97,0%

95,1%

97,0%

(167/174)

(419/458)

(193/200)

(419/432)

(193/203)

(416/429)

75,0%

94,7%

79,5%

96,7%

71,3%

96,6%

(48/64)

(641/677)

(62/78)

(641/663)

(62/87)

(632/654)

90,6%

95,8%

92,8%

98,6%

88,5%

98,6%

(58/64)

(633/661)

(77/83)

(633/642)

(77/87)

(629/638)

28

Tabulka 8 Průkaznost NG při zařazení Internal Control, bez opakování testu vs kultura výtěru

vs rozlišené výsledky na jeden vzorek

Pracov. Kategorie vzorků 1

Mužská moč

N Prevalence 113

CTM s mužským 114

77,0% 77,2%

Citlivost

Specifičnost

Citlivost

Specifičnost

Citlivost

Specifičnost

0,9% (1)

100,0%

87,5%

100,0%

100,0%

97,7%

100,0%

(81/81)

(28/32)

(85/85)

(28/28)

(85/87)

(26/26)

0,9% (1)

výtěrem Ženská moč

146

32,9%

4,1% (6)

CTM s ženským

146

32,9%

4,8% (7)

výtěrem 2

Mužská moč

126

CTM s mužským 108

27,8%

0,8% (1)

28,7%

0,9% (1)

7,3%

1,3% (2)

výtěrem Ženská moč CTM s ženským

150 137

8,0%

4,4% (6)

výtěrem 4

98,8%

84,4%

98,9%

100,0%

97,7%

100,0%

(81/82)

(27/32)

(86/87)

(27/27)

(86/88)

(26/26)

79,5%

93,5%

81,8%

98,0%

75,0%

98,0%

(31/39)

(100/107)

(36/44)

(100/102)

(36/48)

(96/98)

94,9%

94,1%

95,6%

100,0%

89,6%

100,0%

(37/39)

(95/101)

(43/45)

(95/95)

(43/48)

(92/92)

96,9%

96,8%

97,1%

98,9%

94,3%

98,9%

(31/32)

(91/94)

(33/34)

(91/92)

(33/35)

(90/91)

92,9%

90,0%

93,5%

93,5%

93,5%

93,5%

(26/28)

(72/80)

(29/31)

(72/77)

(29/31)

(72/77)

50,0%

95,8%

66,7%

97,9%

54,5%

97,8%

(3/6)

(138/144)

(6/9)

(138/141)

(6/11)

(136/139)

83,3%

93,0%

90,0%

96,0%

81,8%

95,9%

(5/6)

(119/128)

(9/10)

(119/124)

(9/11)

(118/123)

100,0%

96,6%

100,0%

96,6%

Mužská moč

66

10,6%

0,0% (0)

100,0%

93,4%

(5/5)

(57/61)

(7/7)

(57/59)

(7/7)

(57/59)

CTM s mužským

66

10,6%

15,2% (10)b

100,0%

96,6%

100,0%

100,0%

100,0%

100,0%

(5/5)

(57/59)

(7/7)

(57/57)

(7/7)

(57/57)

75,0%

95,9%

80,0%

96,3%

80,0%

96,3%

(3/4)

(236/246)

(4/5)

(236/245)

(4/5)

(236/245)

40,0%

98,7%

40,0%

98,7%

výtěrem Ženská moč CTM s ženským

252

2,0%

2,0% (5)

250

2,0%

18,4% (46)b

25,0%

98,3%

(1/4)

(226/230)

(2/5)

(226/229)

(2/5)

(226/229)

305

42,3%

0,7% (2)

99,2%

94,1%

99,2%

98,3%

96,9%

98,3%

(117/118)

(176/187)

(125/126)

(176/179)

(125/129)

(173/176)

výtěrem SOUČTY

na jednoho pacienta

Inhibicea

Mužská moč

CTM s mužským 288

43,8%

4,2% (12)

výtěrem Ženská moč

548

11,7%

2,4% (13)

CTM s ženským

533

12,0%

11,1% (59)

výtěrem

97,4%

91,2%

97,6%

96,9%

96,8%

96,9%

(112/115)

(156/171)

(122/125)

(156/161)

(122/126)

(155/160)

75,5%

95,4%

79,3%

97,1%

71,9%

97,1%

(37/49)

(474/497)

(46/58)

(474/488)

(46/64)

(468/482)

87,8%

95,9%

90,0%

98,2%

84,4%

98,2%

(43/49)

(440/459)

(54/60)

(440/448)

(54/64)

(436/444)

a

# v závorkách jsou uvedeny počty NG-negativních vzorků, které vedou při prvním testování k negativním výsledkům Internal Control (IC). Mnoho z inhibičních vzorků dává při opakovaném testu správné výsledeky a jsou zařazeny do výpočtů citlivosti a specifičnosti. Tento soubor zahrnuje NG-negativní, IC-negativní vzorky, které byly silně pozitivní na CT. Protože byl signál IC snížen, nelze vyloučit malý rozsah infekce NG a vzorky jsou zařazeny do kategorie inhibiční na NG.

b

Inhibice je častá, protože transportní media (nekomerční směsi obsahují Eagle’s Minimal Essential Medium a 10% fetálního hovězího séra) zde užívaná jsou nějakým způsobem inhibiční pro PCR.

29

Tabulka 9 Průkaznost NG bez opakování testu i při opakování testu a při zařazení Internal Control vs kultura výtěru Kategorie

vs rozlišené výsledky na jeden vzorek

na jednoho pacienta

vzorků

Druh analýzy

N

Prevalence

Inhibice

Citlivost Specifičnost Citlivost Specifičnost Citlivost Specifičnost

Mužská

bez opakovaného

50

28,0%

0,0% (0)

100,0%

100,0%

100,0%

100,0%

100,0%

100,0%

moč

testováni

(14/14)

(36/36)

(14/14)

(36/36)

(14/14)

(36/36)

92,9% (13/14)b

100,0%

100,0% (36/36)

92,9% (13/14)b

100,0%

(36/36)

92,9% (13/14)b

100,0%

97,2%

100,0%

97,2%

100,0%

97,2%

(14/14)

(35/36)

(14/14)

(35/36)

(14/14)

(35/36)

100,0%

100,0%

100,0%

100,0%

100,0%

100,0%

(14/14)

(36/36)

(14/14)

(36/36)

(14/14)

(36/36)

50,0%

97,3%

98,2%

(216/222)

(216/220)

57,1% (4/7)c

98,2%

(2/4)

66,7% (4/6)c

50,0%

98,6%

66,7%

99,5%

57,1%

99,5%

(2/4)

(219/222)

(4/6)c

(219/220)

(4/7)c

(218/219)

100,0%

98,2%

100,0%

99,5%

100,0%

99,5%

(4/4)

(216/220)

(7/7)

(216/217)

(7/7)

(216/217)

100,0%

99,1%

85,7%

100,0%

85,7%

100,0%

(4/4)

(218/220)

(6/7)d

(217/217)

(6/7)d

(217/217)

s opakovaným

50

28,0%

0,0% (0)

testováním CTM

bez opakovaného

s mužským

testováni

výtěrem

s opakovaným

50

50

28,0%

28,0%

0,0% (0)

0,0% (0)

testováním Ženská moč

bez opakovaného 226

3,1%

1,8% (4)

testováni s opakovaným

226

3,1%

1,8% (4)

testováním CTM

bez opakovaného 226

s ženským

testováni

výtěrem

s opakovaným

226

3,1%

3,1%

2,7% (6)a

2,7% (6)a

testováním Všechny vzorky

bez opakovaného 552

7,6%

1,8% (10)

testováni s opakovaným

552

7,6%

1,8% (10)

testováním

(36/36)

(215/219)

94,4%

97,9%

92,9%

98,8%

92,9%

98,8%

(34/36)

(503/514)

(39/42)

(503/509)

(39/42)

(502/508)

91,7%

99,0%

88,1%

99,8%

88,1%

99,8%

(33/36)

(509/514)

(37/42)

(508/509)

(37/42)

(507/508)

a

Dva ze 6 vzorků byly opakovaně inhibiční pro PCR.

b

Jeden retestovaný vzorek negativní nar NG; třetí alikvót z tohoto vzorku byl v průběhu diskrepačního testu pozitivní na NG a 16S.

c

Jeden pacient s negativní kulturou měl NG-pozitivní vzorek z výtěru, který se ukázal být positivnína 16S; odpovídajícího vzorku moči byl NG-negativní.

d

Jeden vzorek negativní v kultuře a pozitivní na NG byl v opakovaném testu negativní na NG a třetí alikvót byl v diskrepačním testu pozitivní na NG a 16S.

30

REFERENCE 1.

Schachter, J. and Stamm, W.E. 1999. Chlamydia in Manual of Clinical Microbiology, Balows, A., W.J.Hausler, Jr., K.H. Herrmann, H.D. Isenberg, H.J. Shadomy (Eds.), 7th Ed., Washington, D.C. 795-800.

2.

Grayston, J.T., Kuo, C.C., Campbell, L.A. et al. 1989. Chlamydia pneumoniae sp. nov. for Chlamydia sp. strain TWAR. International Journal of Systematic Bacteriology 39: 88-90.

3.

Grayston, J.T. 1990. Chlamydia pneumoniae, strain TWAR, in Chlamydial Infections: Proceedings of the Seventh International Symposium on Human Chlamydial Infections, W.R. Bowie, et al., Cambridge University Press, New York, 389-401.

4.

Screening Tests to detect Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae Infections 2002 Morbidity and Mortality Weekly Reports 2002. 51 (No. RR-15): 1-48.

5.

Gerbase, A., Rowley J.T., and Mertens, T.E. 1998. Global epidemiology of sexually transmitted diseases. Lancet 351:(S3) 2-4.

6.

Thompson, S.E. and Washington, A.E. 1983. Epidemiology of sexually transmitted Chlamydia trachomatis infections. Epidemiologic Reviews 5: 96-123.

7.

Pao, C.C., Lin, S-S, Yang, T-E, et al. 1987. Deoxyribonucleic acid hybridization analysis for the detection of urogenital Chlamydia trachomatis infections in women. American Journal of Obstetrics and Gynecology 156: 195-199.

8.

Loeffelholz, M.J., Lewinski, C.A., Silver, S.R. et al. 1992. Detection of Chlamydia trachomatis in endocervical specimens by polymerase chain reaction. Journal of Clinical Microbiology 30: 2847-2851.

9.

Chernesky, M.A., Lee, H., Schachter, J. et al. 1994. Diagnosis of Chlamydia trachomatis urethral infection in symptomatic and asymptomatic men by testing first-void urine in a ligase chain reaction assay. Journal of Infectious Diseases 179: 1308-1311.

10.

Schachter, J., Stamm, W.E., Chernesky, M.A. et al. 1992. Nonculture tests for genital tract chlamydial infection: What does the package insert mean, and will it mean the same thing tomorrow? Sexually Transmitted Diseases 19: 243-244.

11.

Sparling, P.F. 1990. Biology of Neisseria gonorrhoeae, in Sexually Transmitted Diseases (Holmes, K.K., Mardh, P-A, Sparling, P.F. and Wiesner, P.J. (ed.) Second Edition, McGraw-Hill, New York, 131-147.

12.

Knapp, J.S. and Rice, R.J. 1995. Neisseria and Branhamelia, in Manual of Clinical Microbiology (Patrick R. Murray, ed.) 6th Edition, ASM Press, Washington, D.C., 324-340.

13.

Mardh, P-A and Danielson, D. 1990. Neisseria gonorrhoeae, in Sexually Transmitted Diseases (Holmes, K.K., Mardh, P-A, Sparling, P.F., and Wiesner, P.J. (ed.) Second Edition, McGraw-Hill, New York, 131-147.

14.

Hook III, E.W. and Handsfield, H.H. 1990. Gonococcal infections in the adult, in Sexually Transmitted Diseases. Holmes, K.K., Mardh, P-A, Sparling, P.F., and Wiesner, P.J. (ed.) Second Edition, McGrawHill, New York, 131-147.

15.

Guide for the Diagnosis of Gonorrhea Using Culture and Gram Stained Smear. 1991. US Department of Health and Human Services, Public Health Service, Atlanta, GA 30333.

16.

Laboratory Methods for the Diagnosis of Sexually Transmitted Diseases. 1991. American Public Health Association.

17.

Saiki, R.K., Scharf, S., Faloona, F. et al. 1985. Enzymatic amplification of ß-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230: 1350-1354.

18.

Mullis, K.B. and Faloona, F.A. 1987. Specific synthesis of DNA in-vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods in Enzymology 155: 335-350.

19.

Palmer, L. and Falkow, S. 1986. A common plasmid of Chlamydia trachomatis. Plasmid 16: 52-63.

20.

Peterson, E.M. and de la Maza, L.M. 1988. Restriction endonuclease analysis of DNA from Chlamydia trachomatis biovars. Journal of Clinical Microbiology 26: 625-629.

21.

Miyada, C.G. and Born, T.L. 1991. A DNA sequence for the discrimination of Neisseria gonorrhoeae from other Neisseria species. Molecular and Cellular Probes 5: 327-335.

31

22.

Longo, M.C., Berninger, M.S. and Hartley, J.L. 1990. Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions. Gene 93: 125-128.

23.

Richmond, J.Y. and McKinney, R.W. (eds.).1999. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. HHS Publication Number (CDC) 93-8395.

24.

Clinical and Laboratory Standards Institute. Protection of Laboratory Workers from Infectious Disease Transmitted by Blood, Body Fluids, and Tissue. Approved Guideline. CLSI Document M29-A Villanova, PA:CLSI, 1997.

25.

International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations, 41st Edition. 2000. 704 pp.

26.

Van Der Pol, B., Martin, D.H., Schacter, J., Quinn, T.C., Gaydos, C.A., Jones, R.B., Crotchfelt, K., Moncada, J., Jungkind, D., Turner, B., Peyton, C., Kelly, J.F., Weiss, J.B. and Rosenstraus, M. Enhancing the specificity of the COBAS AMPLICOR CT/NG Test for Neisseria gonorrhoeae by Retesting Specimens with Equivocal Results. Journal of Clinical Microbiology 2001 39:3092-3098.

27.

Toye, B., Woods, W., Bobrowska, M., and Ramotar K. 1998. Inhibition of PCR in genital and urine specimens submitted for Chlamydia trachomatis testing. Journal of Clinical Microbiology 36:2356-2358.

32

33

" Distributed by

Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ 08876 USA Člen Roche Group

Roche Diagnostics Indianapolis, IN 46256 USA (For Technical Assistance call the Roche Response Center® toll-free: 1-800 526 1247)

Roche Diagnostics H7V 4A2 Laval, Quebec (For Technical Assistance call: Pour toute assistance technique, appeler le: 1-877 273 3433)

Roche Diagnostics (Schweiz) AG CH-6343 Rotkreuz

Distributore in Italia: Roche Diagnostics F-38240 Meylan

Roche Diagnostics GmbH D-68298 Mannheim, Germany

Roche Diagnostics SpA Piazza Durante 11 I-20131 Milano

Roche Diagnostics S.L. E-08006 Barcelona

Distribuidor em Portugal: Roche Farmacêutica Química, Lda P-2700 Amadora

ROCHE, AMPLICOR, AMPERASE, AMPLITAQ a GENEAMP jsou obchodní značky společnosti Roche. ROCHE RESPONSE CENTER je servisní značka společnosti Roche.

ChlamTrans™ je obchodní známka společnosti Bartels Inc. Costar® je registrovaná obchodní známka Corning Costar Corporation. Eppendorf Multipette® a Eppendorf Combitip® jsou registrované obchodní známky společnosti Eppendorf-NethelerHinz GmbH, Hamburg, Německo. Impact® je registrovaná obchodní známka společnosti MATRIX Technologies, Inc. MicroAmp® a GeneAmp® jsou registrované obchodní známky společnosti Applera Corporation nebo jejích dceřiných společností ve Spojených státech a některých dalších zemích. Pipetman® je registrovaná obchodní známka společnosti Gilson Medical Electronics, Inc. ProClin® je registrovaná obchodní známka společnosti Rohm and Haas Company. Copyright 2007, Roche Molecular Systems, Inc. Všechna práva vyhrazena. 1/2007

(00058002910-04EN) 04496426001-03

Doc Rev. 2.0

For AMPLICOR®/COBAS® AMPLICOR® CT Tests:

For AMPLICOR®/COBAS® AMPLICOR® NG Tests:

34