Next Generation Sequencing: meer met minder Robert van der Geize Klinisch Moleculair Bioloog in de Pathologie (KMBP) Xs2HiTek-workshop 'Diagnostiek in de Pathologie' 2015
www.labpon.nl Boerhaavelaan 59 | Postbus 516, 7550 AM Hengelo | T 088 537 4500 |
[email protected]
Afdeling Moleculaire Pathologie LabPON SOMATISCHE MUTATIE ANALYSE CHROMOSOMALE AFWIJKINGEN (FISH) EPIGENETISCHE VERANDERINGEN (METHYLATIE) B-CEL CLONALITEIT MICROSATELLIET INSTABILITEIT WEEFSELIDENTIFICATIE HPV
Afdeling Moleculaire Pathologie LabPON SOMATISCHE MUTATIE ANALYSE: NEXT GENERATION SEQUENCING CHROMOSOMALE AFWIJKINGEN (FISH) EPIGENETISCHE VERANDERINGEN (METHYLATIE) B-CEL CLONALITEIT MICROSATELLIET INSTABILITEIT WEEFSELIDENTIFICATIE HPV
Mutatie analyse 1. 2. 3.
Amplificatie (PCR) van elke moleculaire marker Mutatie voorscreening (HRM analyse) DNA sequentie analyse: Sanger sequencing Sanger sequencing
PCR
Steeds meer moleculaire aanvragen…
2015: extrapolatie
Steeds meer analyses… 2010
2015
2015
Longtumoren
EGFR exon 18-21 KRAS exon 2
EGFR exon 18-21 KRAS exon 2 BRAF exon 15 ERBB2 exon 20
ALK FISH ROS1 FISH RET FISH
Darmtumoren
KRAS exon 2
KRAS exon 2-4 NRAS exon 2-4 BRAF exon 15
MSI MLH1
Melanomen
-
BRAF exon 15 NRAS exon 2-4
Gliomen
-
IDH1 exon 4 IDH2 exon 4
MGMT 1p19q FISH
Beschikbare hoeveelheid patiëntmateriaal is zeer beperkt
Next Generation Sequencing Parallelle analyse van meerdere markers (exonen) Relatief weinig input DNA nodig (ca. 5-10 ng) Poolen van patientmateriaal mogelijk Hogere sensitiviteit t.o.v. huidige (Sanger) sequentieanalyse Relatief eenvoudig nieuwe markers toe te voegen Kwalitatieve data (aanwezigheid mutatie) Kwantitatieve data (amplificatie/deletie, genexpressie niveaus) Nadeel: langere doorlooptijd (3-4 dagen)
Darmtumoren Sanger sequencing
Next Generation Sequencing
meer met minder
7 single-plex qPCR reactions 70 ng DNA Per patient 10 ng
10 ng
10 ng
10 ng
10 ng
10 ng
10 ng
1 multi-plex PCR reaction 5 ng DNA Meerdere patienten 5 ng
Sequencers Ion Torrent
Illumina
PGM
HiSeq
PROTON
MiSeq
ION S5
NextSeq
Ion Torrent PGM
Workflow NGS - Aanvraag (dag 1 tot 16:00 uur) - Moleculair patholoog tekent tumorgebied af (dag 1) - Dissectie tumorcellen (dag 1) - DNA isolatie (dag 2) 7,5 uur
5,5-16 uur (overnacht)
DNA library Clonale amplificatie Maken+qPCR van de DNA library (dag 2) (emulsie PCR, dag 2)
3,5 uur
2,5 uur
0,5
Opwerken Sequencing Data analyse clonale (dag 3) (dag 3) amplificaten (dag 3)
DNA library maken
DNA barcode (patient identificatie)
Clonale amplificatie mbv emulsie PCR
1 DNA read
Data analyse
Ion314 chip Ion316 chip Ion318 chip
Data analyse SeqNext (JSI Medical Systems) - intuïtieve software - correcte nomenclatuur - CNV analyse - mutatie database - gebruikerbeheer (loggen) - TV (analisten) en MV (moleculair bioloog/patholoog) mogelijk - meerdere labs in NL Ion Torrent Reporter (Life Technologies/ThermoFisher) NextGene (SoftGenetics) Lasergene Genomics Suite (DNAstar) …
genenpanel
genen exonen
varianten
coverage
Genenpanels voor targeted gene sequencing Ion AmpliSeq Colon and Lung Cancer Research Panel
KRAS PTEN CTNNB1 NOTCH1
EGFR NRAS MET ERBB4
BRAF STK11 TP53 FGFR1
PIK3CA MAP2K1 SMAD4 FGFR2
FFPE (125-175 bp) 1 Multiplex PCR: 92 amplicons (22 genen) Community panel: gevalideerd
AKT1 ALK FBX7
ERBB2 DDR2 FGFR3
Genenpanels voor targeted gene sequencing Ion AmpliSeq Colon and Lung Cancer Research Panel
KRAS PTEN CTNNB1 NOTCH1
EGFR NRAS MET ERBB4
BRAF STK11 TP53 FGFR1
PIK3CA MAP2K1 SMAD4 FGFR2
AKT1 ALK FBX7
ERBB2 DDR2 FGFR3
Diagnostiek: Selectieve analyse van markers met klinische relevantie (software)
Validatie NGS Horizon Diagnostics referentie samples (commercieel) - bekende mutaties en tumorpercentages Patient materiaal uit diagnostiek met bekende uitslag
Minimale tumorpercentage - >10% mutant allel (=20% tumor): mutatie aantoonbaar - achtergrond van random varianten (ruis) 2-8% (Hi-Q DNA polymerase) Sensitiviteit - Minimaal aantal benodigde reads bij 10% mutant allel
Sensitiviteit NGS BRAF V600E (10% allel)
KRAS A146T (10% allel)
NRAS G12A (6% allel)
EGFR H773insNPH (10% allel)
1
1420
2407
4529
2249
2
855
1636
3604
1435
3
456
707
1398
716
4
419
697
1304
661
5
314
659
1231
643
6
317
523
882
605
7
213
341
768
300
8
110
179
243
152
9
60
125
238
129
10
0
104
229
116
Eigen genenpanel Multiplex PCR: 20 amplicons (11 genen) Ion AmpliSeqTM Designer: “vastzetten ” van amplicons
EGFR (4) PIK3CA (2)
KRAS (3) IDH1 (1)
NRAS (3) IDH2 (1)
HRAS (2)
BRAF (1) AMELX
Voordelen - Klinische relevante genen/markers - Meer reads per marker - Meer samples op een chip - Makkelijk uitbreidbaar met nieuwe markers - Sexe identificatie mbv AMELX/AMELY (signaleren verwisselingen)
ERBB2(1) AMELY
Kosten van NGS in de diagnostiek
Werkuren Afschrijving (€13.000/jaar) Onderhoud (€5.000/jaar) Software server + 3 clients (€20.000 + €2.000/jaar) Validatie (€35.000)
Troubleshooting tijdens validatie DNA input: 15 ng/ml (100 pM ) library DNA (protocol)
X Qubit 2.0 DNA concentratie -
Ongebalanceerd aantal reads per sample bij multiplexing Hoog percentage polyclonalen
V Ion Library TaqMan™ Quantitation Kit -
Gebalanceerde reads bij multiplexing Ct waarde als referentie voor DNA input Kosten €1000/250 reacties aanpassen assay: €1/sample Polyclonalen 20-30% (soms >40%)
? Ion Library Equalizer Kit
Troubleshooting Chip loading V
Troubleshooting Chip loading X
Moleculaire Pathologie Analisten
Moleculair pathologen
Abdel Ayoub Sandra ten Brinke Martine Bult Miranda Gouma Christel Jolink Kim Olde-Boerrigter Inge Raspe Nicole de Waal Hans Wilke
Sietske Riemersma Maria Tebar Casper Jansen Klinisch moleculair bioloog (KMBP) Robert van der Geize
Workflow Emulsie PCR: clonale PCR
Exact 1 DNA molecuul per bead nodig
OK =!
Polyclonaal (niet OK)
Chromosomale afwijkingen Translocaties (FISH) met Next Generation Sequencing
DNA
DNA
RNA
NGS RNAseq
Chromosomale afwijkingen Ion AmpliSeq RNA Fusion Lung Cancer Research Panel Translocaties ALK, ROS1, RET Community panel Multiplex PCR RNAseq
