Nem-szteroid gyulladásgátlók alkalmazása az 5fluorouracil hatékonyságának növelésére kísérletes rendszerekben Doktori értekezés tézisei
Réti Andrea Országos Onkológiai Intézet Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Patológiai Orvostudományok Doktori Iskola Onkológia Program Programvezető: Dr. Kopper László egyetemi tanár, az MTA doktora
Témavezető:
Dr. Kralovánszky Judit Ph.D. tudományos osztályvezető
Hivatalos bírálók: Dr. Kahán Zsuzsanna Ph.D. habil egyetemi tanár Dr. Kiss András Ph.D. egyetemi docens Szigorlati bizottság: elnöke Dr. Kerpel-Fronius Sándor egyetemi tanár, az MTA doktora tagjai: Dr. Buday László egyetemi docens, az MTA doktora Dr. Rosta András Ph.D. osztályvezető főorvos Budapest 2010
Bevezetés A vastag- és végbélrák ma is az egészségügy egyik legsúlyosabb, megoldatlan problémája, világszerte évente 1 millió új colorectalis daganatot diagnosztizálnak. A colorectalis daganatok kialakulásában környezeti és genetikai faktorok egyaránt szerepet játszanak. A colorectalis daganatok megjelenése az esetek többségében (88-94%) sporadikus és csak 5-10% az öröklődő forma. A vastagbélrák kezelésében alkalmazott gyógyszerek köre az elmúlt évtizedekben jelentősen kibővült, de továbbra is az 5-fluorouracil (5FU) képezi ezen daganattípus terápiájának gerincét. Az 5-FU hatását, nukleotidokká történő aktiválása után a timidilát szintáz enzim gátlásával, a DNS- és az RNS-be való beépülésével fejti ki. Az 5-FU a szervezetbe kerülve az aktiválás mellett igen gyors katabolizmuson megy keresztül. Az alkalmazott dózis több mint 80%-a lebomlik. A lebomlás első, sebességmeghatározó enzime a dihidropirimidindehidrogenáz (DPD) amely az 5-FU-t inaktív dihidro-fluorouracillá (H 2 FU) alakítja át. Az 5-FU szűk terápiás ablaka miatt hatásának fokozására számos törekvés irányul más gyógyszerekkel, illetve biológiai válaszmódosítókka való kombináció formájában. Számos
patofiziológiás
folyamatban
igazolták
a
COX-2
overexpresszióját, többek között különböző daganatokban, például emlő-,
tüdő-,
nyelőcső-
és
vastagbélrákokban.
Colorectális
daganatokban összefüggést találtak a magas COX-2 expresszió, valamint a nagyobb tumor méret, a mélyebb invázió és a 2
nyirokcsomóáttétek
száma
beszámolnak
az
emelkedett
prognosztikai
hatásáról
A
között. COX-2 COX-2
Számos
tanulmányban
expresszió fokozott
kedvezőtlen
expressziója
a
prosztanoidok, elsősorban a PGE 2 akkumulációjával jár. A PGE 2 számos úton befolyásolja a tumorok kialakulását és progresszióját: pl. a sejtproliferáció, a motilitás, az angiogenezis fokozása stb. Már régóta ismeretes, hogy az aszpirin, vagy más nem-szteroid gyulladáscsökkentők (NSAID-ok) hosszú időn át tartó és rendszeres használata 30-50%-al csökkentette a colorectalis rák rizikóját, az adenomatosus polipok számát és méretét valamint a daganatos halálozást. Az NSAID-ok kemopreventív hatása a COX-2 gátlásnak és a prosztaglandin szint csökkentésének tulajdonítható. A COX enzimek az NSAID-ok legismertebb molekuláris célpontjai. Számos experimentális munkában azt találták, hogy az NSAID-ok fokozzák a hagyományos kemoterápiás szerek hatékonyságát. Azonban meg kell jegyezni, hogy a vizsgálatok döntő többségében az NSAID-okat a COX-2 aktivitás gátlásához szükségesnél magasabb koncentrációban alkalmazták, így COX-2-től független hatásaik is megnyilvánulnak.
3
Célkitűzések Munkámban a COX-2 gátlók és az 5-FU kombinált hatásának kísérleti rendszereken történő vizsgálatát helyeztem középpontba, azzal a céllal, hogy megállapítsam a következőket: 1.) Van-e összefüggés a COX-2-t konstitutívan expresszáló HCA-7 és a COX-2-t alacsonyan expresszáló HT-29 sejtvonalak és a belőlük kialakított xenograftok COX-2 expressziója és az 5-FU citotoxikus ill. tumorgátló hatása között? 2.) A COX-2 gátlása a szelektív COX-2 gátló NS-398-cal és a nem szelektív COX-2 gátló indomethacinnal fokozza-e az 5FU
hatékonyságát
a
fent
említett
sejtvonalakon
és
xenograftokon? 3.) Milyen
mechanizmusok
játszanak
szerepet
az
5-FU
hatékonyságának NSAID-ok útján történő fokozásában? A feltett kérdések megválaszolásához az alábbi feladatok megoldását tűztük ki célul: 1) a) A HCA-7 és HT-29 colon adenocarcinoma sejtvonalak és a belőlük
kialakított
xenograftok
jellemzése
az
5-FU
szenzitivitás főbb farmakogenetikai és farmakobiokémiai paraméterei
–
timidilát
szintáz
(TS)
és
5,10-
metiléntetrahidrofolát reduktáz (MTHFR) génpolimorfizmusok és a DPD aktivitás - meghatározása alapján. 4
b) Összefüggés keresése a sejtvonalak és xenograftok COX-2 fehérje
expressziója
(IHC,
Western
blot
és
immunfluoreszcencia) és az 5-FU hatékonysága között. 2) a) A sejtvonalakon és a xenograft tumorokon az 5-FU, a nemszteroid
gyulladáscsökkentők
és
kombinációjuk
antiproliferatív (IC 50 értékek) és tumorgátló hatásának (relatív tumornövekedés gátlás) vizsgálata. b) Hatóanyag-kölcsönhatás vizsgálata az 5-FU + NSAID kombinált kezelések esetében. 3) a) A sejtéletciklus fázisainak megoszlása és az apoptózis változása 5-FU, NSAID-ok és kombinált kezelések hatására (FACS analízis) b) Az 5-FU, az NSAID-ok és kombinációjuk hatása a COX-2 fehérje expresszióra és enzimaktivitására sejtvonalakon és xenografton (IHC, WB, ELISA) c) A COX-2 és a DPD enzimaktivitás és mRNS expresszió változása az 5-FU, az NSAID-ok és kombinált alkalmazásuk hatására (ELISA, DPD aktivitás meghatározása, RT-PCR)
5
Anyagok és Módszerek Az 5-FU szenzitivitás farmakogenetikai jellemzése HCA-7 és HT-29 sejtvonalakon és xenograftokon az 5-FU érzékenység meghatározása céljából a TS 5’-TSER és 3’TSUTR polimorfizmusok vizsgálata PCR analízissel, az MTHFR C677T polimorfizmus vizsgálata PCR-RFLP módszerrel történt. Az 5-FU IC 50 értékeket nem-lineáris dózis-hatás görbe felvételével határoztuk meg. Immunfluoreszcens festés, immunhisztokémia és Western blot analízis A vizsgálatokat a COX-2 protein expresszió kimutatása céljából végeztük. Prosztaglandin E 2 (PGE 2 ) koncentráció meghatározása A PGE 2 mérést ELISA kittel végeztük, sejttenyészetek esetén a tápfolyadékból vett mintákból, xenograft tumorok esetén citoszólból. Sejtnövekedés vizsgálata Az 5-FU, az NSAID-ok, illetve az 5-FU+NSAID kezelések sejtproliferációra gyakorolt hatásának vizsgálatához szulforodamin B (SRB) kolorimetriás tesztet használtunk. Kollagén IV hatásának vizsgálata HT-29 sejteken Hat- és 96-lyukú tenyésztőlemezeken, ill. üveg fedőlemezeken IV-es típusú humán kollagénnel bevonatot képeztünk. A HT-29 sejteket, 6
amelyeket a keletkezett bevonaton 4 órán keresztül tenyésztettünk HT-29-C sejteknek neveztük. DPD enzimaktivitás meghatározása A DPD aktivitásmérés radioenzimatikus méréssel történt A citoszólt [6-14C] 5-FU-val, mint szubsztráttal inkubáltuk. Az 5-FU-t és a keletkezett H 2 FU-t HPLC-vel választottuk szét. A radioaktivitást BioScan detektorral mértük. A DPD aktivitást 1 mg fehérjére vonatkoztatott
percenként
keletkezett
katabolit
a
dihidro-5-
fluorouracil (H 2 FU) mennyiségével jellemeztük (pmol/min/mg protein). Kezelések A vizsgálatok során a HCA-7 és a HT-29 sejteket az 5-FU-val az általunk meghatározott IC 50 koncentráción kezeltük. Alapvetően fontosnak tartottuk, hogy a COX-2 enzimaktivitás 50%-os gátlásához szükséges koncentráción dolgozzunk. Irodalmi adatokra alapozva az in vitro vizsgálatok során a nem-szelektív COX-2 gátló indomethacin koncentrációja 10 μM, a szelektív COX-2 gátló NS-398 esetében pedig 1,77 μM volt. Sejt-fázis megoszlás és apoptózis vizsgálata Az 5-FU, az NSAID-ok és a kombinált kezelések hatásának vizsgálatát a sejtciklusra és az apoptózisra FACScan áramlási citométerrel végeztük. 7
Kvantitatív valós-idejű PCR A DPD és COX-2 mRNS expressziók meghatározása RT-PCR technikával történt. Humán tumor xenograft kialakítása és kezelése A HCA-7, illetve a HT-29 sejteket 6 hetes nőstény SCID egerek hátbőre alá (s.c.) oltottuk. A tumoros állatokat 2 nagy vizsgálati csoportra osztottuk: 1.) Az 5-FU és az 5-FU + indomethacin ill. az 5FU + NS-398 kezelések daganatellenes hatásának vizsgálata. A kezelések 5 napig tartottak. Az NSAID-ok hatását egy alacsony (6mg/kg/nap) és egy magas (30 mg/kg/nap) 5-FU dózissal történt kombináció esetén vizsgáltuk. A tumorgátló hatást a relatív tumornövekedés változása alapján állapítottuk meg. 2.) A 3 x 5 napig tartó indomethacin és NS-398 kezelések COX-2 és DPD aktivitásra gyakorolt hatásának vizsgálata. Az 5-FU és az indomethacin illetve NS-398 közötti hatóanyagkölcsönhatások vizsgálata Az 5-FU és az indomethacin ill. az NS-398 kombinációk kölcsönhatásának vizsgálatát Kern és mtsai leírása alapján (1988) végeztük.
8
Eredmények 1. A HCA-7 és HT-29 sejtvonalak és xenograftok jellemzése az 5-FU szenzitivitás és a COX-2 expresszió alapján A HCA-7 sejtvonal igen mérsékelt érzékenységet mutatott az 5-FUval szemben (IC 50 =1,1 mM). Az eredmények összefüggést mutattak a farmakobiológiai paraméterekkel, azaz a 5’TSER 3R homozigóta, az MTHFR C677T heterozigóta genotípus és a magas DPD enzimaktivitás feltételezhetően hozzájárul a HCA-7 5-FU-val szemben mutatott csökkent érzékenységéhez. HT-29 sejtek esetében a 5’TSER régióban talált 2R homozigóta genotípus, valamint a gén 3’UTR régiójában megfigyelt 6bp homozigóta genotípus az alacsonyabb TS expressziót, az MTHFR T homozigóta mutáns genotípus, valamint az alacsony DPD aktivitás a magasabb 5-FU érzékenységet jelzik (IC 50 =10 μM) A HCA-7 sejteken magas, a HT-29 sejteken alacsony COX-2 fehérje expressziót figyeltünk meg. A HT-29 xenograftok esetében a sejtekhez képest magasabb COX-2 expressziót tapasztaltunk. COX-2 aktivitást a PGE 2 koncentrációval jellemeztük, amely mind a sejtvonalak, mind a xenograftok esetében összevethető volt a COX-2 fehérje expresszióval.
9
2. Az 5-FU és NSAID kezelések citotoxikus és tumorgátló hatásának vizsgálata sejtvonalakon és xenografton A magas COX-2 expressziót mutató HCA-7 sejtek esetében az indomethacin és az NS-398 48 órás kezelés során szignifikánsan fokozták az 5-FU proliferációgátló hatását. Az alacsony COX-2 expressziót mutató HT-29 sejtek esetén az 5-FU + NSAID kombinált kezelések proliferációgátló hatása azonos volt az önálló 5-FU kezeléssel. A COX-2 expressziót mutató HT-29 xenograftokon a 6 mg/kg/nap 5FU citotoxikus hatását mind az indomethacin mind az NS-398 szignifikánsan fokozta. A 6 mg/kg/nap 5-FU + NSAID kombinált kezelések által kiváltott tumornövekedés gátlás összevethető volt a nagydózisú, (30 mg/kg/nap) 5-FU monoterápia citotoxikus hatásával. Az NSAID-ok a 30 mg/kg/nap dózisú 5-FU citotoxikus hatását nem fokozták tovább. A hatóanyag-kölcsönhatás meghatározásával kapott eredményeink szerint a magas COX-2 expressziót mutató HCA-7 sejtek és HT-29 xenograftok esetén, az 5-FU + NSAID kölcsönhatás típusa erősen szinergista, míg az alacsony COX-2 expressziót mutató HT-29 sejtek esetén a kölcsönhatás a gyengén antagonista és az additív hatás között volt.
10
3. Az 5-FU + NSAID kombináció fokozott citotoxikus hatásában szerepet játszó mechanizmusok 1. Az 5-FU, az NSAID-ok és kombinációjuk hatása a sejtciklusra és az apoptózisra HCA-7 sejteken a 48 órás 5-FU + NSAID kombinált kezelések szignifikánsan megnövelték az S-fázisú sejtek arányát és az apoptotikus sejtek számát az önálló 5-FU kezeléshez képest. Ezzel szemben, HT-29-sejteken 48 órás kezelés esetén az önálló 5-FU kezelés jelentősebb S-fázis felhalmozódást okozott, míg a kombinált kezelések nem voltak hatással a sejtek cikluson belüli eloszlására az 5-FU monoterápiához viszonyítva. A kombinált kezelések nem befolyásolták az apoptotikus sejtek számát. 2. Az 5-FU, az NSAID-ok és kombinációjuk hatása a COX-2 fehérje expresszióra Megállapítottuk, hogy a magas COX-2 expressziót mutató HCA-7 sejteken és a HT-29 xenograftokon az NSAID kezelések nem a COX-2 protein expresszió befolyásolásán keresztül fokozták az 5-FU citotoxikus hatását. 3. Az NSAID kezelések hatása a PGE 2 koncentrációra és a DPD enzimaktivitásra Vizsgálatainkból arra a következtetésre jutottunk, hogy az NSAIDok nem a COX-2 fehérje expresszió megváltoztatásán keresztül 11
fokozták az 5-FU citotoxicitását így felmerült a kérdés, hogy esetleg befolyásolják-e az 5-FU metabolizmusát. A továbbiakban vizsgáltuk az NSAID-ok hatását a DPD enzim aktivitására. A magas COX-2 expressziót mutató HCA-7 sejteken és HT-29 xenograftokon az indomethacin és NS-398 szimultán csökkentette a COX-2 és a DPD aktivitást, amely a HCA-7 sejtek esetén már 24 órás NSAID kezelés után megfigyelhető. Az NSAID kezelések szignifikáns csökkenést okoztak a COX-2 és DPD enzim mRNS expressziójában a kontrollhoz viszonyítva. 4. A COX-2 és a DPD enzimek koexpressziójának vizsgálata kollagén indukált HT-29 sejteken A két enzim koexpressziójának vizsgálatára HT-29 sejtekben kollagénnel
indukáltuk
a
COX-2
expressziót,
amelynek
eredményeként a COX-2 változásával párhuzamosan a DPD fehérjeés mRNS expressziója, valamint enzimaktivitása is emelkedett a kollagén-indukált HT-29 (HT-29-C) sejtekben az eredeti sejtekhez képest. A fenti eredményeket megerősíti az a tény is, hogy az eredeti HT-29 sejteknél alacsony PGE 2 koncentrációt és DPD aktivitást találtunk. Megfigyeltük továbbá, hogy a kollagénnel indukált COX-2 és DPD expresszió a HT-29-C sejteken csökkenti az 5-FU érzékenységet, miközben az NSAID-ok fokozzák az 5-FU citotoxikus hatását. Az eredmények hasonlóak a konstitutívan magas COX-2 expressziót mutató HCA-7 sejteken az 5-FU + NSAID kombinációknál már 12
korábban megfigyeltekhez, ahol a szignifikáns hatás létrejöttéhez 48 órás kezelés szükséges. HT-29-C sejteknél viszont, ahol indukáltuk a COX-2 és DPD aktivitást, az NSAID-ok már 8 órás kezelés után szignifikánsan fokozzák az 5-FU hatását. Az 5-FU és az NSAID-ok közötti hatóanyag-kölcsönhatást vizsgálva megállapítottuk, hogy a HT-29-C sejteken, hasonlóan a szintén magas COX-2 expressziót mutató HCA-7 sejtekhez és HT-29 xenograftokhoz, az 5-FU + NSAID kombinációk esetén mind az indomethacin mind az NS-398 szinergista módon fokozta az 5-FU proliferációgátló hatását. 5. Az 5-FU NSAID kezelések hatása a DPD mRNS expresszióra és enzimaktivitásra HT-29-C és HCA-7 sejteken valamint HT-29 xenografton Megállapítottuk, hogy a magas COX-2 expessziót mutató HCA-7 és HT-29-C sejteken és HT-29 xenograft tumorokon egyaránt, az 5-FU + NSAID kombinált kezelések hatására a DPD enzimaktivitása és mRNS expressziója szignifikánsan lecsökkent az önálló 5-FU kezeléshez viszonyítva, amelynek oka az indomethacin és NS-398 által okozott szimultán COX-2 és DPD enzimaktivitás gátlás.
13
Következtetések, új megállapítások A HCA-7 és HT-29 colon tumorsejtek és xenograftok esetén fordított összefüggés van a COX-2 expresszió és az 5-fluorouracil érzékenység között, amely felveti annak szükségességét, hogy a kemoterápiák tervezésekor vegyék figyelembe a tumorok COX-2 státuszát. Az indomethacin és NS-398 szignifikánsan fokozták az 5-FU érzékenységet és a citotoxikus hatást magas COX-2 expressziót mutató sejtvonalakon és xenograft modellen. Tanulmányunkban elsőként figyeltük meg a COX-2 és DPD enzimek koexpresszióját sejtvonalakon és xenografton, amelyet modellkísérletben
is
bizonyítottuk, mivel
HT-29 sejteken
kollagén IV hatására a COX-2 indukciója párhuzamosan emelkedett DPD aktivitást eredményezett. További vizsgálatok szükségesek, hogy megerősítsük megfigyelésünket, továbbá, hogy a két enzim koexpressziójának mechanizmusát feltárjuk. A indomethacin és NS-398 a COX-2 gátlása mellett csökkenti az 5-FU
lebontásában
jelentős
szerepet
játszó
DPD
enzim
aktivitását, ami korrelációt mutat az 5-FU hatékonyság fokozódásával.
14
Az indomethacin és NS-398 által okozott szimultán COX-2 és DPD enzimaktivitás gátlás magyarázhatja az 5-FU citotoxikus hatásának fokozódását, és felveti a nem- szteroid gyulladásgátlók 5-FU modulátorként való alkalmazását elsősorban a COX-2-t magasan expresszáló daganatokban.
15
Saját közlemények Az értekezés témájával kapcsolatos közlemények Réti A, Barna G, Pap E, Adleff V, L Komlósi V, Jeney A, Kralovánszky J, Budai B. Enhancement of 5-fluorouracil efficacy on high COX-2 expressing HCA-7 cells by low dose indomethacin and NS-398 but not on low COX-2 expressing HT-29 cells. Pathol Oncol Res. 2009 Sep;15(3):335-44.
IF:1,260
Réti A, Pap E, Zalatnai A, Jeney A, Kralovánszky J, Budai B. Coinhibition
of
cyclooxygenase-2
and
dihydropyrimidine
dehydrogenase by non-steroidal anti-inflammatory drugs in tumor cells and xenografts. Anticancer Res. 2009 Aug;29(8):3095-101. IF:1,390 Réti A, Pap E, Adleff V, Jeney A, Kralovánszky J, Budai B. Enhanced 5-fluorouracil cytotoxicity in high cyclooxygenase-2 expressing colorectal cancer cells and xenografts induced by nonsteroidal
anti-inflammatory
drugs
via
downregulation
of
dihydropyrimidine dehydrogenase. Cancer Chemother Pharmacol. 2009 Oct 15. DOI: 10.1007/s00280-009-1149-8
16
IF:2,740
Egyéb onkológiai témájú közlemények Kralovánszky J, Adleff V, Hitre E, Pap E, Réti A, Komlósi V, Budai B. [Pharmacogenetic studies on the prediction of efficacy and toxicity of fluoropyrimidine-based adjuvant therapy in colorectal cancer] Magy Onkol. 2007;51(2):113-25. Szoboszlai N, Réti A, Budai B, Szabó Zs, Kralovánszky J, Záray Gy. Direct elemental analysis of cancer cell lines by total reflection X-ray fluorescence Spectrochimica Acta Part B: Atomic Spectroscopy. 2008 December 63(12):1480-1484.
17
IF:2,853
Köszönetnyilvánítás Köszönettel tartozom Prof. Dr. Kásler Miklós egyetemi tanárnak, az Országos Onkológiai Intézet Főigazgatójának, hogy munkámat lehetővé tette és támogatta. Kiemelkedően témavezetőmnek,
hálás
köszönetemet
Dr.
Kralovánszky
szeretném Judit
kifejezni tudományos
osztályvezetőnek, aki munkám során mindvégig nagy odafigyeléssel irányított, mind szakmailag, mind emberileg maximálisan támogatott és biztosította a lehetőséget, hogy a laboratóriumában dolgozzam. Köszönetet szeretnék mondani Dr. Budai Barna munkatársamnak, az egész kutatás alatt nyújtott szakmai segítségért. A munkám során felmerülő kérdések közös megvitatásából rengeteget tanultam. Külön köszönöm Pap Éva munkatársamnak a DPD aktivitás mérésében nyújtott segítségét, precíz munkavégzése példamutató számomra. Hálás vagyok Dr. Adleff Vilmos munkatársamnak, aki hasznos tudományos tanácsaival és széleskörű kísérleti tapasztalataival számos nehézségen segített át. Szeretném megköszönni a Semmelweis Egyetem I. Patológiai Intézetéből Dr. Jeney András egyetemi tanárnak, hogy segítségére, értékes tanácsaira mindig számíthattam. Köszönöm továbbá Dr. Zalatnai
Attila
egyetemi
docensnek
az
immunhisztokémiai
vizsgálatokban nyújtott segítségét, Dr Barna Gábor tudományos munkatársnak az áramlási citométerrel végzett vizsgálatokat, Oláh Lászlóné gyógyszerésznek segítségét és gyakorlati tanácsait. 18
Köszönettel tartozom Dr. Gaál Dezső osztályvezetőnek és Dr. Péter Ilona osztályvezető helyettesnek (Országos Onkológiai Intézet) a munkámhoz nyújtott értékes segítségükért. Munkacsoportunk valamennyi, eddig nem említett tagjának Kútvölgyi Ferencné Makácsné Polényi Csilla, Mousáné Éber Andrea, Nagy Attila, Osztafin Sándorné - szeretném megköszönni, hogy a kísérletek kivitelezése során nyújtott segítségükre mindig számíthattam, továbbá az állatkísérletek során nyújtott értékes segítségükért köszönettel tartozom Sztodola András és Borza A. Mónika munkatársaknak (Semmelweis Egyetem I. Patológiai Intézet). Végül, de nem utolsó sorban hálás vagyok Családomnak, hogy céljaim elérésében támogattak, és szeretetükre, megértésükre mindig támaszkodhattam.
19
