NEM-SZTEROID GYULLADÁSGÁTLÓK ALKALMAZÁSA AZ 5-FLUOROURACIL HATÉKONYSÁGÁNAK NÖVELÉSÉRE KÍSÉRLETES RENDSZEREKBEN Doktori értekezés
Réti Andrea Országos Onkológiai Intézet Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Patológiai Orvostudományok Doktori Iskola Programvezető: Dr. Kopper László egyetemi tanár, az MTA doktora
Témavezető:
Dr. Kralovánszky Judit Ph.D. tudományos osztályvezető
Hivatalos Bírálók:
Dr. Kahán Zsuzsanna PhD habil egyetemi tanár Dr. Kiss András PhD egyetemi docens
Szigorlati bizottság elnöke:
Dr. Kerpel-Fronius Sándor egyetemi tanár, az MTA doktora
Szigorlati bizottság tagjai:
Dr. Buday László egyetemi docens, az MTA doktora Dr. Rosta András PhD osztályvezető főorvos
Budapest 2010
Tartalomjegyzék 1.
Bevezetés, irodalmi áttekintés .................................................................................. 7 1.1
A colorectalis daganatok hazai előfordulása .....................................................7
1.2
Etiológiai szempontok .......................................................................................7
1.3
A COX-2 szerepe a carcinogenezisben és a daganatos progresszióban ............8 1.3.1
A ciklooxigenáz enzimek és a PGE 2 szintézis..............................................9
1.3.2
A COX-2 expresszió és a PGE 2 jelentősége a carcinogenezisben és tumorprogresszióban...................................................................................11
1.3.3
A COX-2 szerepe az apoptózissal szembeni rezisztencia kialakulásában, az angiogenezisben és a metasztázis folymatában......................................13
1.3.4 1.4
A COX-2 expresszió, mint prognosztikai és prediktív faktor ....................14 A colorectális daganatok gyógyszeres terápiájának lehetőségei .....................15
1.4.1
Az 5-fluorouracil metabolizmusa, aktiválás és inaktiválás ........................16
1.4.2
A nem-szteroid gyulladásgátlók .................................................................19
1.4.3
Új utak a kemoterápiás kezelés hatékonyságának fokozására colorectalis daganatokban a nem szteroid típusú gyulladásgátlók lehetséges szerepe ..20
2.
Célkitűzések ........................................................................................................... 22
3.
Anyagok és módszerek ........................................................................................... 24 3.1
Tumorsejtvonalak tenyésztése .........................................................................24
3.2
Sejttenyésztés ECM komponensek jelenlétében .............................................24
3.3
A HCA-7 és HT-29 sejtek jellemzése .............................................................24 3.3.1
Western blot vizsgálat.................................................................................24
3.3.2
Immunfluoreszcens festés ...........................................................................25
3.4
Prosztaglandin E 2 mérése ELISA módszerrel .................................................26
3.5
Az 5-FU szenzitivitás vizsgálata .....................................................................26 3.5.1
A timidilát szintáz és MTHFR polimorfizmusok vizsgálata ......................26
3.5.2
Az 5-FU IC 50 értékének meghatározása .....................................................26
3.6
Mintaelőkészítés DPD enzimaktivitás vizsgálathoz ........................................27
3.7
DPD enzimaktivitás meghatározása ................................................................27
3.8
Kezelések .........................................................................................................28
2
3.9
A sejtproliferáció vizsgálata ............................................................................28
3.10
Sejt-fázis megoszlás vizsgálata áramlási citométerrel.....................................29
3.11
Teljes RNS extrakció és cDNS készítés ..........................................................29
3.12
Kvantitatív valós-idejű PCR ............................................................................30
3.13
Endogén uracil koncentráció mérése HPLC-vel .............................................30
3.14
Humán tumor xenograft kialakítása és kezelése..............................................31
3.15
Immunhisztokémiai vizsgálat ..........................................................................32
3.16
Az 5-FU és az NSAID-ok közötti hatóanyag-kölcsönhatások vizsgálata .......33
3.17
Statisztikai analízis ..........................................................................................33
4.
Eredmények ............................................................................................................ 34 4.1
HCA-7 és HT-29 colon adenocarcinoma sejtvonalak és a belőlük kialakított xenograftok jellemzése .................................................................................34 4.1.1
Az 5-FU szenzitivitás farmakogenetikai és farmakobiokémiai jellemzése 34
4.1.2
A COX-2 fehérjeexpresszió és aktivitás meghatározása ............................36
4.2
Az 5-FU és NSAID kezelések citotoxikus és tumorgátló hatásának vizsgálata sejtvonalakon és xenografton .......................................................................38 4.2.1
Az 5-FU, az NSAID-ok és kombinációjuk időfüggő hatása a sejtproliferációra HCA-7 és HT-29 sejtvonalakon .....................................38
4.2.2
Az 5-FU IC 50 értékének változása HCA-7 és HT-29 sejtvonalakon 5-FU ± NSAID kezelések hatására ......................................................................39
4.2.3
Az 5-FU, az NSAID-ok és kombinációjuk hatása a tumornövekedésre HT-29 xenograftokon .................................................................................41
4.2.4
A hatóanyagok kölcsönhatásának vizsgálata az 5-FU + NSAID kombinált kezeléseknél...............................................................................43
4.3
Az 5-FU + NSAID kombináció fokozott citotoxikus hatásában szerepet játszó mechanizmusok ............................................................................................44 4.3.1
Az 5-FU, NSAID-ok és kombinációjuk hatása a sejtciklus és az apoptózis változására ..................................................................................................44 A sejtciklus vizsgálata: 5-FU, NSAID-ok és kombinációjuk hatása...... 44 Az 5-FU által indukált apoptózis változása NSAID kezelés hatására.... 45
4.3.2
Az 5-FU, NSAID és kombinációjuk hatása a COX-2 fehérje expresszióra és enzimaktivitásra......................................................................................47
3
A COX-2 expresszió és aktivitás változásának vizsgálata HCA-7 és HT-29 sejtvonalakon .............................................................................. 47 A COX-2 expresszió és aktivitás változásának vizsgálata HT-29 xenograftokon 5-FU és NSAID kezelés hatására ................................... 50 4.3.3
A hosszú távú indomethacin és NS-398 kezelések hatása a COX-2 expresszióra ................................................................................................51
4.3.4
Az NSAID kezelések hatása a PGE 2 koncentrációra és a DPD enzimaktivitásra ..........................................................................................53
4.3.5
A COX-2 és a DPD enzimek koexpressziója és befolyásuk az 5-FU hatékonyságára ...........................................................................................57 A COX-2 és a DPD enzimek koexpressziójának vizsgálata kollagén indukált HT-29 sejteken ......................................................................... 57 Az indomethacin és az NS-398 hatása az 5-FU citotoxicitásra HT29-C sejteken .......................................................................................... 59
4.3.6
Az 5-FU NSAID kezelések hatása a DPD mRNS expresszióra és enzimaktivitásra HT-29-C és HCA-7 sejteken és HT-29 xenografton .......60
5.
Megbeszélés ........................................................................................................... 63
6.
Következtetések, új megállapítások ....................................................................... 74
7.
Összefoglalás .......................................................................................................... 75
8.
Summary................................................................................................................. 76
9.
Irodalomjegyzék ..................................................................................................... 77
10.
Saját közlemények.................................................................................................. 89
11.
Köszönetnyilvánítás ............................................................................................... 94
4
Rövidítések jegyzéke 5-FdUMP 5-FdUTP 5-FU ABC ADP APC ATP COX-2 CRC DAB DHFR DMEM DPD dTMP dTTP dUMP dUTP ECM EDTA EGF ELISA EP1-4 FACS FAP FCS FGF FITC GAPDH H 2 FU HIF HPLC IC 50 IHC IL-1B MDR MMP MTHFR mtsai
5-fluoro-2’-dezoxiuridin-5’-monofoszfát 5-fluoro-2’-dezoxiuridin-5’-trifoszfát 5-fluorouracil avidin-biotin complex adenozin-difoszfát adenomatosus polyposis coli adenozin-trifoszfát ciklooxigenáz-2 colorectalis carcinoma 3,3'-diaminobenzidin tetrahidroklorid dihidrofolát-reduktáz Dulbecco’s modified Eagle’s medium dihidropirimidin dehidrogenáz dezoxitimidin-5'-monofoszfát dezoxitimidin-5'-trifoszfát 2’-dezoxiuridin-5’-monofoszfát 2’-dezoxiuridin-5'-trifoszfát extracellular matrix etilén-diamin-tetraecetsav epidermal growth factor enzyme-linked-immuno-sorbent-assay prosztaglandin receptorok fluorescence activated cell sorting familiáris adenomatózus polipózis fetal calf serum - magzati borjúsavó fibroblast growth factor - fibroblaszt növekedési faktor fluoreszcein izotiocianát gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenáz dihidro-5-fluorouracil hypoxia-inducible factor - hipoxia-indukálta faktor high pressure liquid chromatography - magas-nyomású folyadék kromatográfia
50% inhibitory concentration - 50%-os gátlás koncentrációja immunohistochemistry interleukin-1B multidrug resistance matrix metalloproteinase 5,10-metilén-tetrahidrofolát-reduktáz munkatársai
5
NADPH NF-κB NK NS-398 NSAID PAGE PBS PDGF PG PGI2 PLA 2 PMSF PPAR RPMI RT-PCR SCID SD SDS SRB TCA TGFB TNFTRIS TS TXA2 UMP VEGF WB
nikotin-adenin-dinukleotid-foszfát nuclear factor-kappa B natural killer (sejt) N-[2-(cyclohexyloxy)-4-nitrophenyl]-methanesulfonamide non-steroidal antiinflammatory drug - nem-szteroid gyulladáscsökkentő szer
poliakrilamid gél elektroforézis phosphate buffered saline - foszfát pufferelt sóoldat platelet-derived growth factor - trombocita növekedési faktor prosztaglandin prosztaciklin foszfolipáz A 2 fenil-metil-szulfonil-fluorid peroxisome proliferator-activated receptor Roswell Park Memorial Institute real-time - polymerase chain reaction sever combined immune deficient standard deviation - szórás nátrium-dodecil-szulfát szulforodamin B triklórecetsav tumor growth factor beta tumornecrosis factor tris-(hidroximetil)-aminometán timidilát szintáz tromboxán A2 uridin-monofoszfát vascular epidermal growth factor Western blot
6
1. Bevezetés, irodalmi áttekintés 1.1
A colorectalis daganatok hazai előfordulása
A vastag- és végbélrák ma is az egészségügy egyik legsúlyosabb, megoldatlan problémája,
világszerte
évente
1
millió
új
colorectalis
daganatot
diagnosztizálnak, ami az összes daganatos megbetegedés 9%-a.
1
(CRC)
A nemzetközi
szakirodalomban megjelent epidemiológiai adatok alapján az Európai Unió országai közül Magyarországon a legmagasabb a colorectalis rák előfordulási gyakorisága és a daganatos halálozás alapján az európai országok között hazánk a nők esetében az első, a férfiaknál pedig a második helyet foglalja el. 2 2006-ban a Nemzeti Rákregiszter adatai alapján 9022 új CRC esetet jelentettek be. 3
1.2
Etiológiai szempontok
A colorectalis daganatok kialakulásában környezeti és genetikai faktorok egyaránt szerepet játszanak. A CRC-k megjelenése az esetek többségében (88-94%) sporadikus és csak 5-10% az öröklődő forma. Ez utóbbi esetekben az epitéliumban létrejövő változások hiperproliferáción keresztül vezetnek a rák kialakulásához, s ebben a folyamatban a genetikai változások akkumulációjának szerepe van. Ezek a változások jellemzően a tumorszuppresszorgén funkciók elvesztése, onkogének aktivációja, elégtelen DNS-javítási mechanizmus, az apoptózis elégtelensége és a genetikai állomány integritásának elvesztése, például a kromoszóma instabilitás miatt. 4 A familiaris adenomatosus polyposis szindróma az egyik legjobban tanulmányozott öröklődő kórkép. Az 5-ös kromoszómán (5q21) elhelyezkedő adenomatosus polyposis coli (APC) gén csírasejtes mutációja okozza az adenomatosus polypok ezreinek kialakulását, és a CRC megjelenését. Molekuláris genetikai vizsgálatok bizonyították be, hogy a sporadikus CRC esetében szintén az APC gén szomatikus mutációi indítják el a kóros, klonális sejtburjánzást.
7
Az öröklődő vastagbélrákok másik leggyakoribb formája a herediter nem-polyposis colorectalis carcinoma, amely a a mismatch repair gének mutációjával hozható összefüggésbe.
5
Az öröklődő formák genetikai hátterének tanulmányozása segített a
sporadikus vastagbélrákok kialakulása során zajló genetikai változások alaposabb megismerésében. A sporadikus vastagbélrákok esetében azonban feltehetően nagyobb szerep jut a betegség kialakulásában felelős géneket befolyásolni képes életviteli különbségeknek is, mint amilyen a táplálkozás vagy a dohányzás. A legtöbb vastagbéldaganat kialakulása többlépcsős, többtényezős folyamat, ép vastagbél-nyálkahártyának
az
ún.
adenoma-carcinoma
szekvencián
keresztül
vastagbélrákká történő átalakulásáért bizonyos genetikai történések felelősek.
1.3
A COX-2 szerepe a carcinogenezisben és a daganatos progresszióban
A molekuláris biológiai alapkutatások rohamos fejlődése folytán jelentős előrehaladás történt a malignus daganatok kialakulásáért és fenntartásáért felelős mechanizmusok tisztázása (pl. a túlfokozott jelátviteli mechanizmusok) és az ezekre ható gyógyszerek kutatásában. Ennek a folyamatnak a részeként terelődött a figyelem a ciklooxigenáz-2 (COX-2) irányába is, amely az emberi colorectális daganatok mintegy 85-90%-ában valamint a gyomor-, pancreas- és emlőrákok többségében túlexpresszálódik. Számos epidemiológiai tanulmány bizonyította, hogy a nem-szteroid típusú gyulladáscsökkentők rendszeres alkalmazása 40%-al csökkentette a colorectalis daganatok kialakulásának kockázatát. 6 Familiáris adenomatosus polyposisban igazolták, hogy a nem-szteroid típusú gyulladáscsökkentő szulindak-szulfoxid metabolitja a szulindak csökkenti a polipok méretét és számát a placebo csoporthoz viszonyítva.
7
A betegség egérmodellje
(APC∆716 knockout egér) szolgáltatta az első bizonyítékot a COX-2 és a carcinogenezis közötti kapcsolatról.
8
Később további állatmodelleken is bizonyították a COX-2
8
szerepét a vastagbélrák kialakulásában: azoximetánnal kezelt patkányokban és APC MIN egerekben, amelyek az APC gén domináns öröklődő mutációját hordozták.6, 9
1.3.1
A ciklooxigenáz enzimek és a PGE 2 szintézis
A ciklooxigenáz (COX) enzimek membrán-kötött hem tartalmú glikoproteinek. A ciklooxigenáz enzim két fő izoformája ismert a COX-1 és a COX-2. Az arahidonsavnak prosztaglandinná történő átalakulását katalizálják. Az arahidonsavat, - amely egy 20 szénatomszámú többszörösen telítetlen zsírsav -, a foszfolipáz A 2 hasítja ki a membrán foszfolipidekből. A COX enzimek első lépésben katalizálják két molekula oxigén beépülését az arahidonsavba, ezáltal prosztaglandin endoperoxid (PGG 2 ) keletkezik, amely a következő lépésben a hidroperoxidáz aktivitás hatására PGH 2 -vé redukálódik. 10
A ciklooxigenáz enzimeket gyakran prosztaglandin H szintáznak is nevezik az
irodalomban. A PGH 2 -ből szövetspecifikus izomerázok hatására számos eikozanoid, azaz prosztaciklin (PGI 2 ), thromboxán A 2 (TxA 2 ) és prosztaglandinok (PGD 2 , PGE 2 , PGF 2α ) képződnek (1. ábra). 11 A PGE 2 szintézisének utolsó lépése a PGE-szintáz enzimhez kötött, amelynek napjainkig legalább 3 típusát azonosították. A mikroszomális, glutation-függő, indukálható forma (mPGES-1) funkcionálisan kapcsolt a COX-2 izoenzimmel, a PGE 2 elnyújtott szintézisét biztosítja
patofiziológiás
folyamatokban
(gyulladás,
láz,
daganatok). A citoszolban lévő konstitutív forma a COX-1 izoenzimmel kapcsolt és a szöveti homeosztázis fenntartásáért felelős PGE 2 szintézisben játszik szerepet. Az mPGES-2 konstitutív, nem glutation függő forma, noha mindkét COX enzimhez kapcsolódik, előnyben részesíti a COX-2 izoformát. Szerepet játszik mind a homeosztázis fenntartásában, mind a daganatok kialakulásában.
9
1. ábra A ciklooxigenáz enzimek és a PGE 2 szintézis. A ciklooxigenáz izoenzimeket kódoló gének más-más kromoszómán helyezkednek el: a COX-1 génje a 9. és a COX-2 az 1. kromoszómán. A gének mérete is eltérő: a COX-1 génje 22 kB és 11 exont tartalmaz, a COX-2 génje kisebb 8,3 kB és 10 exonból áll. A két izoenzim aminosav összetétele nagyon hasonló, mintegy 60%-os homológiát mutat. Bár a két izoenzim katalitikus mechanizmusa, kinetikája hasonló, két strukturális különbség van közöttük, amelynek farmakológiai és biológiai következményei vannak. Az egyik különbség az, hogy a COX-2 szubsztrátkötő zsebe 20%-al nagyobb, mint a COX-1 esetében és a szubsztrátok szélesebb körének megkötésére képes. A különbség egyik oka az, hogy a szubsztrátkötő zsebben három aminosav különbözik, egy hisztidin→arginin az 513-as és két izoleucin→valin csere a COX-2 434-es és 523-as pozíciójában. A másik ok az, hogy a COX-1 alacsony arahidonsav koncentráció esetén negatív allosztérikus formát vesz fel, így a COX-2 hatékonyabban képes megkötni a membránból felszabaduló arahidonsavakat, ha a két izoenzim egyszerre van jelen a sejtben. 12
10
A COX-1 az endoplazmatikus retikulum membránjában lokalizálódik. Konstitutívan expresszálódik a legtöbb szövetben és számos normál fiziológiás funkció fenntartásáért felelős. Működése a szervezetben protektív szerepet, ún. „housekeeping” funkciót tölt be. A COX-1 által képződött prosztaglandinok a normál sejtfunkciók, a vérlemezke aggregáció, valamint a renális és gasztrointesztinális traktus homeosztázisának, a nyálkahártya védelmének fenntartásában játszanak lényeges szerepet. 6 Az ér endotélből felszabaduló prosztaciklin a trombusképződés ellen hat, a gyomor nyálkahártyában keletkező PGI 2 és PGE 2 pedig lokális citoprotektív hatást fejt ki. A trombocitákban termelődő TxA 2 a vérlemezkék aggregációját okozza, kivédve így a nagyobb vérzéseket. A COX-2 a sejtekben az endoplazmatikus retikulum lumen felöli oldalán, valamint a magmembrán külső és belső oldalán helyezkedik el. A legtöbb szövetben nem, vagy alig expresszálódik, kivéve a vesék glomerulusait, a heréket és a központi idegrendszert, ahol a fájdalominger közvetítéséért és a testhőmérséklet szabályozásáért felelős, valamint terhesség idején a méhet. 10
1.3.2
A COX-2 expresszió és a PGE 2 jelentősége a carcinogenezisben és tumorprogresszióban
Az indukálható COX izoforma létezését először 1989-ben Raz és mtsai vetették fel, akik citokinek hatására a COX protein indukált expresszióját észlelték.
13
Öt évvel
később Eberhart és mtsai pedig kimutatták a COX-2 overexpresszióját colon tumorokban. 14 A COX-2 enzim overexpressziója mind a megemelkedett transzkripció, mind a megnövekedett mRNS stabilitás következménye. A stimulustól és a sejttípustól függően számos gyulladásos faktor (bakteriális lipopoliszacharidok, citokinek: IL-1β, IL-2, tumor nekrózis faktor (TNF)-α, növekedési faktorok, pl.: epidermális növekedési faktor (EGF), trombocita növekedési faktor (PDGF), vaszkuláris endotél növekedési faktor (VEGF), nukleáris faktor-κB (NF-κB), tumor promóterek, mint a forbol-12-mirisztát13-acetát, ill. a cigarettafüst a COX-2 stimulációját okozzák. Maga a PGE 2 is - az EGF receptor közvetítésével, pozitív visszacsatolási mechanizmussal - COX-2-indukciót eredményez.
11
A COX-2 indukciójának hatására fokozódik a prosztanoid termelés és ezáltal a COX-2 fontos szerepet tölt be a patofiziológiás folyamatokban, mint pl. a gyulladás, a láz, arthritis vagy az Alzheimer kór.
15
COX-2 fokozott expresszióját írták le számos
daganattípusban: colorectalis-, gyomor, nyelőcső-, máj-, hasnyálmirigy-, petefészek-, húgyhólyag-, méhtest-, emlő-, endometrium-, bőr-, fej-nyaki- és nem-kissejtes tüdőrákban. A COX-2 fokozottan van jelen premalignus léziókban is, mint például a colorectális adenomák, a krónikus hepatitisz, orális leukoplákia, a tüdő atipikus hiperpláziája és egyéb diszpláziás elváltozásokban, valamint a malignus léziók körüli szövetekben. Colorectális daganatokban összefüggést találtak a magas COX-2 expresszió,
valamint
a
nagyobb
tumor
méret,
a
mélyebb
invázió
és
a
nyirokcsomóáttétek száma között. 9 A genetikai „knock-out” és transzgén egereken végzett kísérletek is fontos adatokkal szolgáltak a COX-2 daganatokban, elsősorban a vastagbélrák kialakulásában betöltött szerepével kapcsolatban. COX-2 „knock-out” egér és a FAP állatmodellje az APCΔ716 mutáns egér kereszteződéséből származó -/- utódoknál megfigyelték, hogy a vastagbélpolipok száma jelentősen csökkent, de nem tűnt el teljesen a vad típusú COX2 allélt hordozó egerekhez viszonyítva.
16
Ez a kísérlet volt az egyik meggyőző
bizonyíték a COX-2 carcinogenezisben játszott szerepére. Liu és mtsai bizonyították, hogy a COX-2 in vivo sejttranszformációt okoz. Olyan transzgén egeret hoztak létre, amely az emlőmirigyeiben túltermelte a COX-2-t. Azt tapasztalták, hogy a többször vemhes egérben gyakorivá vált az emlőmirigy carcinoma szemben azokkal, amelyek nem voltak vemhesek.
17
Hasonlóan, transzgén egérben a bazális keratinocitákban a
konstitutív COX-2 expresszió epidermális hiperpláziát és diszpláziát okozott. 18 A COX-2 fokozott expressziója a prosztanoidok, elsősorban a PGE 2 akkumulációjával jár. Colon rákban megfigyelték, hogy ahol a COX-2 expresszió fokozott, ott a PGE 2 koncentrációja megnő. A PGE 2 számos úton befolyásolja a tumorok kialakulását és progresszióját: a sejtproliferáció, a motilitás, az angiogenezis és az immunszuppresszió befolyásolásával (2. ábra). A PGE 2 a G-proteinhez kapcsolt receptorokon az ún. EP receptorokon keresztül fejti ki hatását. Az EP receptorok colorectalis carcinogenezisben játszott
szerepét
egérmodelleken
igazolták.
12
EP
receptor-„knock-out”
egérben
szignifikánsan csökkent az aberráns kripta fókuszok száma a vad típusú kontrollhoz képest. 10
2. ábra A PGE 2 szerepe a carcinogenezisben és tumorprogresszióban Bár a COX-2 pontos szerepe az emberi colorectális carcinogenezisben még nem teljesen tisztázott, számos experimentális adat igazolja fontos szerepét a daganatok kialakulásában és progressziójában.
1.3.3
A COX-2 szerepe az apoptózissal szembeni rezisztencia kialakulásában, az angiogenezisben és a metasztázis folymatában
Az apoptózis regulációja döntően a pro- és antiapoptotikus faktorok arányának függvénye. Premalignus és malignus szöveti elváltozás esetében az apoptózis mértéke csökken, és ez összefüggésbe hozható a COX-2-expresszióval. Patkány intesztinális epitél sejtek COX-2 cDNS-sel történt transzfektálása a sejtek butirát-indukált apoptózissal szembeni rezisztenciáját, valamint a BCL-2 és a TGF-β megnövekedett expresszióját eredményezte.
19
A COX-2 túltermelést összefüggésbe hozták továbbá az
apoptózis mitokondriális útjának gátlásával: csökken a kaszpáz-9 és -3 aktiválás és a citokróm c felszabadulás.
20
Az apoptózis gátlásán túl a COX-2 stimulálja a tumorsejt-
13
proliferációt. A szolid tumorok növekedése és metasztatizáló képessége részben az érújdonképződés függvénye. Az angiogenezis a tumor kialakulás és metasztázisképzés egyik sarokpontja. A COX-2 fokozott képződése stimulálja az angiogenezisért felelős vaszkuláris növekedési faktorok:
VEGF,
FGF,
TGF-β-1,
PDGF
és
az
endothelin-1
termelését.
Vastagbéldaganatokban összefüggést találtak a magas COX-2 és a VEGF expresszió, valamint a megnövekedett mikroérdenzitás között. Colon tumorsejtek és endotél sejteket együtt tenyésztve a COX-2 mind közvetlenül, mind közvetve a PGE 2 termelés által stimulálta az angiogén faktorokat, és indukálta az endothél sejtek proliferációját és migrációját. A folyamatot gátolni tudták angiogén faktorok-elleni antitestekkel, aszpirinnel és más nem-szteroid gyulladásgátlóval. 21 Seed és mtsai megfigyelték, hogy, Balb/c egérbe oltott COX-2-t expresszáló Colon-26 sejtek növekedését a nem-szteroid típusú gyulladásgátló diclofenac az angiogenezis gátlásán keresztül csökkentette. 22 A COX-2 a tumorok inváziókészségét is megnövelheti. A COX-2 és a mátrix metalloproteináz, matrilizin, koexpresszióját mutatták ki a humán colorectalis tumorok 80%-ában. A nem-szteroid típusú gyulladásgátló NS-398-al gátolni tudták az MMP-2 és MMP-9 expresszióját humán prosztata sejtvonalon. 23 Yao és mtsai hasonló eredményre jutottak: az NS-398 kezelés csökkentette a májmetasztázisok kialakulását in vitro és in vivo. 24 A tumorképződés komplex folyamatában egyéb mechanizmusok is lényegesek lehetnek: a fokozott COX-2-expresszió gátol bizonyos immunfunkciókat, így a T és B limfociták proliferációját, az NK-sejtek akvititását és hozzájárulhat a gyógyszerrezisztencia kialakulásához.
1.3.4
A COX-2 expresszió, mint prognosztikai és prediktív faktor
Több daganattípus esetében összefüggést találtak a megnövekedett COX-2 expresszió és a progresszióig eltelt rövidebb idő, valamint a rövidebb teljes túlélés között. Hida és mtsai szerint nem-kissejtes tüdőrákban a megnövekedett COX-2 expresszió kapcsolatba hozható a tumorterjedéssel és a nyirokcsomó metasztázisokkal, vagyis az emelkedett COX-2 expresszió összefüggést mutat az invazív, aggresszívabb fenotípussal. 25 Számos
14
tanulmányban beszámolnak az emelkedett COX-2 expresszió kedvezőtlen prognosztikai hatásáról. Achiwa és mtsai kimutatták, hogy nem-kissejtes tüdőrákkal operált betegek esetén az emelkedett COX-2 mRNS szint és a betegek rövidebb túlélése között összefüggés van. 26 A COX-2 túlzott expressziója gyakran társul olyan rossz prognosztikai faktorokkal, mint a HER-2 az emlőrákban vagy a VEGF expresszió nem-kissejtes tüdőrák környező szöveteiben, amelyek már önmagukban is a rosszabb túlélést vetítik elő. 9 Uchida és mtsai a COX-2 prediktív szerepét bizonyították S-1 terápiával kezelt colorectális tumoros betegeknél. Kapcsolatot találtak a magas COX-2 expresszió és a kedvezőtlen klinikai eredmény között. 27 Más szerzők összefüggést mutattak ki a magas COX-2 expresszió és a ciszplatin-alapú kemoterápia rezisztencia között ovárium és cervixrákokban. 28 Rectum daganatos betegek esetében neoadjuváns radio-kemoterápiát megelőzően a biopsziás mintából kimutatott magas COX-2 expresszió a gyenge terápiás válasz prediktora volt. 29
1.4
A colorectális daganatok gyógyszeres terápiájának lehetőségei
A vastagbélrákot korábban a kemoterápiarezisztens daganatok közé sorolták, amelynek gyógyszeres kezelésében egyedül az 5-fluorouracil (5-FU) alkalmazásával értek el klinikai eredményeket. Az utóbbi 2 évtizedben azonban jelentős fejlődés mutatkozott a korai vastag- és végbélrákos betegek gyógyulási arányában, az előrehaladott betegség esetében pedig a túlélési időben. Az eredmények fokozatos javulása egyfelől a fejlett országokban beindult szűrőprogramoknak, az egyre fejlettebb képalkotó diagnosztikai módszereknek, a korszerű sebészeti elveknek és technikáknak, másrészt a kutatások eredményeként az 5-fluorouracil hatékonysága fokozásának, illetve az újonnan kifejlesztett gyógyszereknek (irinotecan, oxaliplatin, stb.) tulajdonítható. 30 Az utóbbi évtizedekben a sejtek életműködését szabályozó mechanizmusok, az angiogenezis, a jelátviteli utak működési zavarainak intenzív kutatása olyan új, biológiai célpontokra (EGFR, VEGF) irányított hatóanyagok (cetuximab, bevacizumab) tervezését és klinikai bevezetését eredményezte, amelyek az 5-FU-val kombinálva a vastagbéldaganatokat a korábbiakhoz képest kemoterápiára érzékenyebb daganattá tette.
15
Bár a vastagbélrák kezelésében alkalmazható gyógyszerek köre az elmúlt évtizedben jelentősen bővült, mind a citotoxikus kombinációk, mind a molekuláris célzott terápiák esetében a kemoterápiás kezelés gerincét ma is az 5-fluorouracil alkalmazása jelenti.
1.4.1
Az 5-fluorouracil metabolizmusa, aktiválás és inaktiválás
Az 5-FU kifejlesztéséhez több mint 40 évvel ezelőtt az a megfigyelés vezetett, hogy a normál sejtekkel ellentétben a tumorsejtek az uracilt, a nukleinsavak szintézisének prekurzorát, fokozottan használják fel. Ennek a DNS és RNS szintézishez nélkülözhetetlen természetes pirimidin molekulának az 5-ös pozícióban lévő hidrogénjének fluorral való szubsztitúciója eredményezte az 5-FU-t, mely önmagában inaktív vegyület, metabolikus aktiválás szükséges ahhoz, hogy hatását kifejthesse. Az 5-FU metabolikus aktiválása során keletkező aktív nukleotidjai, az 5-fluoro-dUMP és a 5-fluoro-UTP, három főbb ponton fejtik ki hatásukat (3. ábra). 31 1) Timidilát szintáz gátlása: A timidilát szintáz, a dezoxitimidin trifoszfát szintézisének egyik kulcsenzime hatására dUMP-ből dTMP keletkezik. Ez a reakció a „de novo” út a dTTP képzéséhez, amely a DNS replikációhoz és javításhoz nélkülözhetetlen. Az 5-fluoro-dUMP gátolja a DNS szintézist azáltal, hogy stabil ternier komplexet képez a timidilát szintázzal és az 5,10metiléntetrahidrofoláttal (MTHF), így blokkolva a dUMP átalakulását dTMP-vé. 2) RNS-be való beépülés: Az 5-fluoro-UTP beépül minden típusú RNS molekulába (mRNS, tRNS, rRNS) ezáltal a fehérjeszintézis károsodását eredményezheti. (Az RNS-be való beépülés az 5-FU i.v. bólus alkalmazás esetén jelentkezik elsősorban.) 3) DNS-be való beépülés: Az 5-FdUMP-ből keletkező 5-FdUTP a DNS-be is beépülhet. Ez a DNS törését és a sejt apoptózisát okozza.
16
5-FU
FUMP
DPD
H2FU
F-β-alanin
FUrd
FdUMP
FUTP
FdUTP
RNS szintézis gátlás
DNS szintézis gátlás
kiürülés
timidilát szintáz gátlás
3. ábra Az 5-FU metabolizmusa.32 5-FU, 5-fluorouracil; H2FU, dihidrofluorouracil; F-β-alanin, 5-fluoro-β-alanin; FUMP, fluorouridin-monofoszfát; FUrd, fluoro-uridin; FdUrd, fluoro-dezoxiuridin; FdUMP, fluorodezoxiuridin-monofoszfát
Az antiproliferatív hatásért elsősorban az S-fázis-függő TS-gátlást tartják felelősnek. A TS gátláson felül, az át nem alakult dUMP akkumulálódhat és átalakulhat dUTP-vé. A dUTP téves beépülése (misincorporation) és a nukleotid excíziós repair útján történő kivágásának és javításának elmaradása DNS lánctörésekhez, sejthalálhoz vezet. Számos tanulmányban a tumorszövetben mért magas TS szinteket (mRNS, protein, enzim aktivitás) kapcsolatba hozták az 5-FU-ra adott rossz terápiás válasszal, különösen előrehaladott colorectalis rákokban. 33 A TS expresszió szabályozásában a TS génnek két polimorfizmusa is szerepet játszik, amelyek jelentősek az 5-FU érzékenység szempontjából. Az egyik a gén promoter enhancer régiójában van, és egy 28-bázispár hosszúságú szekvencia kettős (2R) vagy hármas (3R) tandem ismétlődése, amely a transzkripten is jelen van és a TS expresszió transzlációs autoregulációjának a mechanizmusában játszik szerepet. A második polimorfizmus egy 6 bp ins/del típusú a TS mRNS 3’-UTR-on a 1494 locuson. Ez a polimorfizmus az mRNS stabilitását befolyásolja. 34
17
A TS génpolimorfizmusok összefüggése a TS mRNS és fehérjeexpresszióval számos korábbi vizsgálat tárgya. Egyes munkacsoportok összefüggést mutattak ki a TSER 3R/3R genotípus és a magas TS mRNS és fehérje expresszió között. 35 Ugyanakkor más szerzők a 3R/3R genotípus és az emelkedett fehérje expresszió között találtak korrelációt az mRNS expresszió megnövekedése nélkül, vagyis az mRNS transzlációt tartják felelősnek a megemelkedett TS fehérje expresszióért. 36 A TS gátlás létrejöttéhez a már fent említett ternier komplex kialakulása szükséges, amelyben az FdUMP a timidilát szintáz és az MTHF vesz részt. A MTHF → 5metiltetrahidrofolát átalakulást a metiléntetrahidrofolát-reduktáz (MTHFR) enzim katalizálja, amely a folátanyagcsere kritikus enzime. Elősegíti a homocisztein remetilációját, ezzel metildonort szolgáltatva a DNS-metilációhoz. Az eddig leírt MTHFR
génpolimorfizmusok
közül
a
C677T
(Ala→Val)
SNP
fordul
elő
leggyakrabban. A homozigóta mutáns (TT) esetekben az enzimaktivitás 30%-ra csökken, így felhalmozódik az MTHF, mely a timidilát de novo bioszintézis kofaktora. A megemelkedett intracelluláris MTHF-szint elősegíti a ternier komplex képződését és stabilitását, és ezáltal megnövelheti az 5-FU citotoxikus hatását. 37, 38 A komplexképzés következtében a TS-aktivitás gátlódik, intracelluláris timidinhiány alakul ki, amely végül a DNS-szintézis leállásához vezet. Az 5-FU a szervezetbe kerülve az aktiválás mellett igen gyors lebontáson, katabolizmuson megy keresztül. Az alkalmazott dózis több mint 80%-a lebomlik. A lebomlás első, sebességmeghatározó enzime a dihidropirimidin-dehidrogenáz (DPD) amely az 5-FU-t dihidro-fluorouracillá (H 2 FU) alakítja át, amely két lépésben α-fluor-βureidopropionsavvá, majd fluor-β-alaninná alakul át. A DPD az eukarióta sejtekben a pirimidin bázisok lebontásáért felelős. Aktivitása a legmagasabb a májban és a perifériás mononukleáris sejtekben. A DPD enzimaktivitás és a DPD mutációk perifériás mononukleáris sejtekben történő meghatározása az 5-FU lebontás zavarából adódó súlyos toxicitások elkerülését teszi lehetővé. 39 Az intratumorális DPD hamar a klinikai érdeklődés középpontjába került, mivel az emelkedett DPD enzimaktivitás a tumorban az 5-FU citotoxikus hatásának csökkenését okozhatja, így a kívánt terápiás koncentráció eléréséhez olyan extrém magas dózisok alkalmazása válik szükségessé, ami a neutropenia és mucositis mellett, a magas DPD
18
hatására nagy mennyiségben keletkező 5-fluoro--alaninnak köszönhetően, súlyos idegrendszeri melléhatásokkal járhat. A fentiek irányították a figyelmet olyan orálisan adagolható fluoropirimidin kombinációk további fejlesztése felé, mint amilyen az UFT és az S-1, amelyek az 5-FU mellett valamilyen DPD inhibitort is tartalmaznak, az előbbi az uracilt, mint a DPD enzim természetes szubsztrátját, az utóbbi az 5-klór-2,4dihidroxipiridint.
40
A DPD gátlót tartalmazó kombinációk mellett egyéb DPD
inhibitorokat is vizsgáltak, amelyeket az 5-FU-val együtt adagoltak, mint az 5-etil-2dezoxiuridint 41 és az 5-etiniluracilt (eniluracil). 42 Az eniluracil irreverzibilisen gátolja a DPD-t, ezáltal megnő az 5-FU felezési ideje, nő a terápiás index. A fázis III. vizsgálatokban azonban a túlélési eredmények rosszabbak voltak, feltehetően az irreverzibilis DPD gátlást követő súlyos mellékhatások miatt. Említésre érdemes, hogy az UFT és S-1 terápiák elsősorban Japánban terjedtek el, a DPD inhibitorok használata a standard 5-FU kezelés mellett reménykeltő, de használatuk még nem rutinszerű.
1.4.2
A nem-szteroid gyulladásgátlók
Már régóta ismeretes, hogy az aszpirin, vagy más nem-szteroid gyulladáscsökkentők hosszú időn át tartó és rendszeres használata 30-50%-al csökkentette a colorectalis rák rizikóját, az adenomatózus polipok számát és méretét valamint a daganatos halálozást. Az NSAID-ok kemopreventiv hatása a COX-2 gátlásnak és a prosztaglandin szint csökkentésének tulajdonítható. Noha a COX enzimek az NSAID-ok legismertebb molekuláris célpontjai, COX-tól független hatásaikra is számos bizonyíték van, például a Bcl-x L, az NF-B és a PPARδ gátlása, ill. az Akt aktiválódás blokkolása. 10 A COX gátlás vagy a COX-független hatás az alkalmazott dózis függvénye: az alacsonyabb koncentráció elsősorban a COX-függő mechanizmusokra hat. Az NSAID-ok általában nem szelektív COX-gátlók (a COX-1 és -2 enzimet egyaránt blokkolják), ezért tartós alkalmazásuk olyan kedvezőtlen mellékhatásokat okozhat, mint a gastrointestinalis fekélyképződés, a trombocita aggregáció-gátlás, a vesekárosítás, mivel az élettani funkciókat biztosító prosztaglandinok szintézisét is blokkolják. A terápiás cél tehát a szelektív COX-2-gátlás a COX-1 gátlása nélkül. 43 Egy NSAID COX-2 szelektivitását a COX-2, valamint a COX-1 enzim működésének 50%-os gátlásához szükséges koncentrációk hányadosával (IC 50 COX-2/IC 50 COX-1)
19
jellemzik. Minél szelektívebb egy gyógyszer annál kisebb ennek a hányadosnak az értéke. Ennek alapján megkülönböztetünk: nem szelektív COX-2 gátlókat, mint pl. a szalicilsav, indomethacin, diclofenac; szelektív COX-2 gátlókat, amelyek elsősorban a COX-2-t gátolják, de magasabb koncentrációban a COX-1-et is. Ezeken kívül ismertek a specifikus COX-2 gátlók, amelyek nem fejtenek ki COX-1 gátló hatást. Ilyen, pl. a celecoxib. Az acetilszalicilsav a COX-1 enzim irreverzibilis gátlószere a többi NSAID kompetitív antagonista, hatásuk reverzibilis. 44
1.4.3
Új utak a kemoterápiás kezelés hatékonyságának fokozására colorectalis daganatokban a nem szteroid típusú gyulladásgátlók lehetséges szerepe
A citotoxikus szerek terápiás ablaka meglehetősen szűk így a hatásosságuk fokozása a dózis emelésével csak igen korlátozottan lehetséges. Alkalmazásuk másik korlátját a tumorsejtekben kialakuló rezisztencia jelenti. Már évtizedekkel ezelőtt is felmerült az igény a kemoterápiás szerek citotoxikus hatásának fokozására. Noha részleges sikerek születtek, napjainkban is több preklinikai és klinikai tanulmány foglalkozik azzal, hogy a hagyományos onkoterápiás protokollokat molekuláris támadáspontú daganatellenes gyógyszerrel kombinálják. A klinikai onkológiában sokáig csak kemopreventív szerként gondoltak az NSAIDokra. Az NSAID-ok első monoterápiás adagolásának vizsgálatára csak az 1990-es években került sor, amikor randomizált vizsgálatban indomethacinnal kezeltek előrehaladott rákban (elsősorban colorectalis rákban) szenvedő betegeket. Az indomethacin növelte az átlagos túlélést a placebo kontrollhoz képest. 9 Számos experimentális munkában azt találták, hogy az NSAID-ok fokozzák a hagyományos kemoterápiás szerek hatékonyságát. Benett és mtsai kimutatták, hogy az indomethacin szignifikánsan javította a methotrexát citotoxikus hatását in vitro és in vivo.
45
Egy másik munkában az indomethacin fokozta a vincristin és az adriamycin
hatását humán tüdő adenocarcinoma sejtvonalakon.
46
A szulindak, illetve az NS-398
fokozta a gemcitabin proliferáció gátló hatását pancreas sejtvonalakon. 47 A colorectalis daganatok kemoterápiás kezelésének alapját ma is az 5-fluorouracil képezi, amely monoterápiában azonban kevésbé hatékony. A kezelés hatékonyságának
20
fokozására az 5-FU-t különböző biomodulánsokkal kombinálva tanulmányozták, többek között DPD inhibitorokkal, antioxidánsokkal, folinsavval. (Ez utóbbi együttes alkalmazása az 5-FU-val kétszeresére növelte a válaszarányt az 5-FU monoterápiához képest). Az indomethacin Colon-26 sejteken fokozta az 5-FU citotoxikus hatását. 48 Az etodolac és a rofecoxib S-1 terápiával kombinálva hatásosabbnak bizonyult erősen metasztatizáló colon carcinoma sejtvonalon, mint az S-1 kezelés önmagában. 49 A klinikai fázis-vizsgálatokban az NSAID-ok közül a leggyakrabban a celecoxibot kombinálták kemoterápiás szerekkel. Emlőkarcinómás betegeken exemestannal (aromatáz gátló) kombinálva jobb klinikai választ tapasztaltak és meghosszabbodott a progresszióig eltelt idő.
50
Colorectalis carcinomás betegcsoportokban olyan II.-III.
fázisú, összehasonlító vizsgálatokat végeztek, ahol a hagyományos daganatellenes kezelést kombinálták celecoxibbal. A capecitabin-celecoxib kombináció nagyobb arányban okozott stabil betegséget, mint a capecitabin monoterápia.
51
Egy másik
vizsgálatban viszont azt találták, hogy a celecoxib nem fokozta szignifikánsan az irinotecan-capecitabin kombináció hatásosságát.
52
Szintén nem találtak jobb
tumorválaszt abban a vizsgálatban, ahol rofecoxibot kombináltak 5-FU-leukovorin terápiával, sőt a rofecoxib fokozta a gasztrointesztinális toxicitást. Az experimentális tanulmányok bíztató eredményei ellenére sajnos a klinikai vizsgálatokból egyelőre nem lehet egyértelmű következtetéseket levonni. Ennek egyik lehetséges oka, hogy a vizsgálatok kis betegszámúak, statisztikailag nem minden esetben megbízhatóak, továbbá több esetben nem vizsgálták a betegek COX-2 státuszát. Nasir és mtsai szerint az optimális betegbeválasztáshoz a tumor lokalizációját is figyelembe kellene venni, mivel vizsgálataik szerint a bal colonfélben található tumorok gyakrabban mutatnak magas COX-2 expressziót.
53
Chan és mtsai legújabb
munkájukban szintén a daganatok COX-2 expressziójának fontosságára hívják fel a figyelmet, ugyanis vizsgálatukban az aszpirin azoknál a betegeknél csökkentette a daganatos halálozást, akiknél a tumor COX-2 overexpressziót mutatott. 54
21
2. Célkitűzések A colorectális rák gyógyszeres kezelésének alapját több mint 40 éve az 5-FU jelenti. A gyógyszer terápiás hatásának fokozására, számos törekvés irányult így az 5-FU kombinálása más gyógyszerekkel és metabolizmusának befolyásolása különböző biomodulánsokkal. Az utóbbi két évtized intenzív kutatásainak eredményeként a COX-2 szerepe a colonrákok kialakulásában és a tumor progresszióban valamint az aktivitását korlátozó nem-szteroid típusú gyulladásgátlók (NSAID) preventív, antiproliferatív és apoptózist indukáló hatása már jól ismert. A COX-2 expresszió alacsony értéke a normál colon nyálkahártyában szemben a daganatos sejtekben kimutatható magas értékkel felvetik a lehetőséget a COX-2 gátlók alkalmazására monoterápia formájában és még inkább az ismert daganatellenes gyógyszerekkel kombinálva. Munkámban a COX-2 gátlók és az 5-FU kombinált hatásának kísérleti rendszereken történő vizsgálatát helyeztem középpontba, azzal a céllal, hogy megállapítsam a következőket: 1.) Van-e összefüggés a COX-2-t konstitutívan expresszáló HCA-7 és a COX-2-t alacsonyan expresszáló HT-29 sejtvonalak és a belőlük kialakított xenograftok COX-2 expressziója és az 5-FU citotoxikus ill. tumorgátló hatása között? 2.) A COX-2 gátlása a szelektív COX-2 gátló NS-398-cal és a nem szelektív COX-2 gátló indomethacinnal fokozza-e az 5-FU hatékonyságát a fent említett sejtvonalakon és xenograftokon? 3.) Milyen mechanizmusok játszanak szerepet az 5-FU hatékonyságának NSAIDok útján történő fokozásában?
A feltett kérdések megválaszolásához az alábbi feladatok megoldását tűztük ki célul: 1) Kérdés a) A HCA-7 és HT-29 colon adenocarcinoma sejtvonalak és a belőlük kialakított xenograftok
jellemzése
farmakobiokémiai
az
paraméterei
5-FU
szenzitivitás
alapján
(timidilát
farmakogenetikai szintáz,
és
és 5,10-
metiléntetrahidrofolát reduktáz génpolimorfizmusok és a DPD aktivitás meghatározása). b) Összefüggés keresése a sejtvonalak és xenograftok COX-2 fehérje expressziója (IHC, Western blot és immunfluoreszcencia) és az 5-FU hatékonysága között. 2) Kérdés a) A sejtvonalakon és a xenograft tumorokon az 5-FU, a nem-szteroid gyulladáscsökkentők és kombinációjuk antiproliferatív (IC 50 értékek) és tumorgátló hatásának (relatív tumornövekedés gátlás) vizsgálata. b) Hatóanyag-kölcsönhatás vizsgálata az 5-FU + NSAID kombinált kezelések esetében. 3) Kérdés a) A sejtéletciklus fázisainak megoszlása és az apoptózis változása 5-FU, NSAIDok és kombinált alkalmazásuk hatására (FACS analízis) b) Az 5-FU, NSAID-ok és kombinációjuk hatása a COX-2 fehérje expresszióra és enzimaktivitásra sejtvonalakon és xenografton (IHC, WB, ELISA) c) A COX-2 és DPD enzimaktivitás és mRNS expresszió változása az 5-FU, NSAID-ok és kombinált alkalmazásuk hatására (ELISA, DPD aktivitás meghatározása, RT-PCR)
23
3. Anyagok és módszerek 3.1
Tumorsejtvonalak tenyésztése
A HCA-7 colony 29 és HT-29 humán adenocarcinoma sejtvonalakat az európai sejtbankból (ECACC, Salisbury, Anglia) szereztük be. A HCA-7 sejteket DMEM (4500 mg/l glükóztartalommal), a HT-29 sejteket RPMI-1640 tápfolyadékban tenyésztettük 10% FCS hozzáadásával, 37 ˚C-on, 5% CO 2 atmoszférában. A sejttenyésztéshez használt anyagok a Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) termékei. A sejtek életképességét 0,04%-os tripánkék kizárási teszttel ellenőriztük
3.2
Sejttenyésztés ECM komponensek jelenlétében
Hat- és 96-lyukú tenyésztőlemezeket, ill. üveg fedőlemezeket az alábbi ECM komponensekkel kezeltük: 10 μg/ml fibronektin, laminin vagy IV-es típusú humán kollagén (Sigma). Ezután 37 ºC-on 60 perces inkubálás után eltávolítottuk a kezelőoldatot és a kezelt felületet PBS-sel átmostuk. A HT-29 sejteket, amelyeket a keletkezett bevonaton 4 órán keresztül tenyésztettük HT-29-C sejteknek neveztük. A 4 órás inkubációt követően a felülúszóból PGE 2 koncentrációmérést, a sejteken immunfluoreszcenciás festést végeztünk. Nyolc órás kezelést követően vizsgáltuk az 5FU, NSAID és kombinált kezelések hatását a sejtproliferációra, a DPD enzimaktivitásra és az mRNS expresszióra.
3.3
A HCA-7 és HT-29 sejtek jellemzése
3.3.1
Western blot vizsgálat
A HCA-7 és HT-29 sejteket PBS-sel mostuk, majd hideg pufferben (20 mM Tris-HCl, pH=7,5, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 1% nátrium dezoxikolát, 5 mM EDTA, 2 g/ml leupeptin, 2 g/ml aprotinin, 2 g/ml pepsztatin és 1 mM PMSF) lizáltuk, majd 10 percig 10.000 g-n 4 C-on centrifugáltuk. Az összfehérje mennyiségét
Bio-Rad Protein assay kittel határoztuk meg (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). A minták 60 g fehérjetartalmú aliquotjait Laemmli-oldattal egészítettük ki és 12%-os denaturáló poliakrilamid gélen futtattuk. A gélen elválasztott fehérjéket elektrotranszferrel (25 V, 18 óra, 4 °C) PVDF membránra (Perkin-Elmer, Boston, MA, USA) vittük át. A membránokat a nem-specifikus kötődések elkerülésére 6 órán át „Superblock Blocking Buffer in TBS” blokkolóval (Pierce, Rockford, IL, USA) inkubáltuk. Következő lépésben a membránokat egy éjszakán keresztül a következő antitestekkel inkubáltuk: anti-humán COX-2 egér monoklonális antitest, illetve anti-egér COX-1 juh monoklonális antitest (Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI, USA) 1:1000 hígításban. Referencia fehérjeként a β-actint használtuk (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) 1:2000 higításban. Az antigén-antitest reakciót peroxidázzal jelölt másodlagos antitesttel (Pierce, Rockford, IL, USA), 1:200.000 higításban kiviteleztük. Az előhívást kemilumineszcens módszerrel (SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate, Pierce, Rockford, IL, USA) röntgenfilmen végeztük. A kiértékelés GelDoc2000 képanalizátorral és QuantityOne programmal (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) történt. Pozitív kontrollként humán rekombináns COX-2 fehérjét használtunk (Alpha Diagnostic, San Antonio, TX, USA).
3.3.2
Immunfluoreszcens festés
A HCA-7 és HT-29 sejteket üveg fedőlemezen növesztettük normál tenyésztési körülmények között. A sejteket 10 percig 20 °C-on metanollal fixáltuk és permeabilizáltuk, majd 2x mostuk PBS-sel. A lemezeket anti-COX-2 (Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI, USA) és anti-DPD (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) elsődleges antitesttel, 1:100 ill. 1:50 higításban, 18 órás reakcióban 4 °C-on inkubáltuk, majd a PBS-el történt lemosás után FITC-konjugált másodlagos antitesttel (Alexa Fluor 488; Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA, USA) 1:20.000 hígításban, 2 órás reakcióban 4 °C-on inkubáltuk. A fluoreszcenciát Olympus CKX41 fázis-kontrasztfluoreszcens microszkóppal (Olympus, Tokió, Japán) detektáltuk. A fényképeket nagylátószögű C-5060 fényképezőgéppel készítettük (Olympus).
25
3.4
Prosztaglandin E 2 mérése ELISA módszerrel
A prosztaglandin E 2 mérést ELISA kittel (Assay Designs, Ann Arbor, MI, USA) végeztük, a kithez mellékelt gyártói utasítások alapján. A mérés a sejttenyészetek esetén a tápfolyadékból vett mintákból történt. A mért koncentrációt 106 sejtre vonatkoztattuk. Xenograft tumorok esetén a vizsgálat a DPD enzimaktivitás vizsgálatához előkészített citoszólból történt A méréseket háromszor ismételtük mérésenként 3 párhuzamos mintával.
3.5
Az 5-FU szenzitivitás vizsgálata
3.5.1
A timidilát szintáz és MTHFR polimorfizmusok vizsgálata
A DNS izolálás a sejtekből DNS tisztító kittel történt (MasterPure, Epicentre Technologies, Madison, WI, USA) a gyártó utasításai alapján. 1) 5’-TSER (2R/3R) polimorfizmus vizsgálata: A 5’-TSER polimorfizmust PCR analízissel határoztuk meg Adleff és mtsai munkájában leírtak alapján. 34 A PCR reakció során kapott termékeket nem-denaturáló 10%-os PAG-elektroforézissel elemeztük és a 28 bp allélhossz különbség alapján diszkrimináltunk az allélek között etidium-bromid (Sigma) festés segítségével. 2) A 3’TSUTR és az MTHFR C677T genotípusokat PCR amplifikációval vizsgáltuk, melyet RFLP analízis követett. esetén
DraI
endonukleázzal,
az
34, 55,
MTHFR
A PCR termékeket a 3’TSUTR genotipizálása
során
HinfI
endonukleázzal emésztettük. A termékeket 10%-os nem-denaturáló PAGelektroforézissel választottuk szét. A géleket etídium bromiddal festettük és UV fényben azonosítottuk. A kiértékelés BioRad 2000 képanalizátorral (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) történt.
3.5.2
Az 5-FU IC 50 értékének meghatározása
Az 5-FU IC 50 értékének meghatározásához a sejteket 96-lyukú platen (1x104 sejt/lyuk) 24 órán keresztül tenyésztettük. A tápfolyadékot lecseréltük és a sejteket 2x24 óráig 5-
26
FU-val (TEVA, Magyarország ill. Sigma) kezeltük. Az 5-FU koncentrációja 1 nM-10 M között változott. A kezelés után a proliferáció változását SRB teszttel vizsgáltuk. Az IC 50 értékeket nem-lineáris dózis-hatás görbe felvételével határoztuk meg GraphPad PRISM 2.01 (San Diego, CA, USA) program segítségével.
3.6
Mintaelőkészítés DPD enzimaktivitás vizsgálathoz
Sejtek: A mérésekhez a sejteket összegyűjtöttük, háromszor mostuk PBS-ben, majd hemocitométerrel számoltuk, és 107 sejt/ml koncentrációjú sejtszuszpenziót készítettünk Hanks’ oldatban. A sejtfeltárás folyékony N 2 -ben háromszori 30 másodpercig történő fagyasztással-olvasztással történt. A centrifugálással (20.000 g) nyert felülúszót használtuk az enzimvizsgálathoz. Xenograft tumorok: A szövetmintákat felhasználásig folyékony N 2 -ben tároltuk. Az enzimvizsgálatok időpontjában a fagyott szövetmintákat mikrodiszmembrátorral porítottuk (Braun Biotech International, Melsungen, Németország), majd a szöveti port Hanks’ oldatban (pH=6,9) szuszpendáltuk. A citoszolt 100.000 g-n történő centrifugálással nyertük és a DPD vizsgálathoz azonnal felhasználtuk.
3.7
DPD enzimaktivitás meghatározása
A DPD aktivitásmérés radioenzimatikus méréssel történt Naguib és mtsai módosított módszere szerint.
56
A citoszólt [6-14C] 5-FU-val (52 mCi/mmol), mint szubsztráttal
inkubáltuk (Moravek Biochemicals, Brea, USA). A reakcióelegy összetétele a következő volt: 2 mM ditiotreitolt tartalmazó 2 mM foszfát puffer pH7,6, 3 mM MgCl 2 , 0,8 mM nikotinamid, 0,3 mM NADPH, 28 µM [6-14C] 5-FU. Inkubálási idő 0 és 20 perc 37 C-on. A reakciót jéghideg etanollal állítottuk le, majd 20 percig 4 C tartottuk. A reakcióelegyet 0,2 μm mikroszűrőn (Vecta Spin Micro polipropilén, Whatman, Maidstone, Anglia) centrifugáltva szűrtük és HPLC-vel (Merck-Hitachi, Tokió, Japán) választottuk szét az 5-FU-t és a keletkezett H 2 FU-t. Az elválasztás két, sorbakötött HPLC oszlopon történt: 1. oszlop Hypersil ODS 5 μM (Thermo HypersilKeystone, Runcorn, Anglia); 2. oszlop Spherisorb ODS 5 μM (MZ Analysentechnik,
27
Mainz, Németország). Az eluens 2,5 mM tetrabutilammónium-hidrogénszulfátot és 0,7 mM kálium-dihidrogén-foszfátot tartalmazott (pH=7,8). A radioaktivitást BioScan detektorral (Hidex, Turku, Finnország) mértük. A DPD aktivitást az 1 mg fehérjére vonatkoztatott percenként keletkezett katabolit, a H 2 FU mennyiségével jellemeztük (pmol/min/mg protein). A méréseket párhuzamos mintákkal kétszer ismételtük.
3.8
Kezelések
Az in vitro vizsgálatok során a HCA-7 és HT-29 sejteket az 5-FU-val az előzőleg meghatározott IC 50 koncentráción kezeltük. A HT-29-C sejteket a HT-29 sejteken megállapított IC 50 koncentrációval kezeltük. Az indomethacinból (Sigma), illetve az NS-398-ból (Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI, USA) dimetil-szulfoxiddal 10 mM törzsoldatot készítettünk. A törzsoldatot sejttenyésztő tápfolyadékkal hígitottuk a kezelési koncentrációhoz. A dimetil-szulfoxid végső koncentrációja a tenyészetben 0,03% volt, amely nem befolyásolta a sejtek életképességét. A legtöbb publikációban a COX-2 enzimaktivitás gátlásához szükségesnél magasabb koncentrációban alkalmazzák az NSAID-okat, amelyek így COX-2–től független hatásokat eredményeznek.
57, 58
Alapvetően fontosnak tartottuk, hogy a COX-2
enzimaktivitás 50%-os gátlásához szükséges koncentráción dolgozzunk, így az in vitro vizsgálatok
során
a
nem-szelektív
COX-2
gátló
indomethacin
alkalmazott
koncentrációja 10 μM, a szelektív COX-2 gátló NS-398 esetében pedig 1,77 μM volt, ami összevethető az irodalomban közölt 50%-os COX-2 enzimaktivitásgátló koncentrációkkal.59,60,61,62
3.9
A sejtproliferáció vizsgálata
Az 5-FU, az NSAID-ok, illetve az 5-FU + NSAID kezelések sejtproliferációra gyakorolt hatásának vizsgálatához a sejteket 1x104 denzitásban 96-lyukú platen 24 órán keresztül tenyésztettük. Ezután a médiumot eltávolítottuk és a sejteket a választott hatóanyagokkal 24, illetve 48 órán át kezeltük. A sejtproliferáció vizsgálatára szulforodamin B (SRB) kolorimetriás tesztet használtunk. A sejteket a kezelés végén 10%-os TCA-val rögzítettük 4 °C-on 60 percig, majd desztilláltvízzel történt ötszöri
28
mosás után 1%-os ecetsavban oldott 0,4%-os SRB-vel 15 percig festettük szobahőmérsékleten. A nem-kötött festéket 1%-os ecetsavval három mosással eltávolítottuk. Száradás után a fehérje kötött festéket 200 l 10 mM-os Tris oldattal (pH=10,5) Heidolph Titramax rázógépen (Schwabach, Németország) feloldottuk. Az abszorbancia mérés spektrofotométerrel (BIO-TEK Instruments, VM, USA) 570 nm-en történt. A vizsgálatot 3x ismételtük mintánként 6 párhuzamos méréssel.
3.10 Sejt-fázis megoszlás vizsgálata áramlási citométerrel A sejtciklus és az apoptózis vizsgálatához a sejteket 1.500 g-n lecentrifugáltuk, -20 Con 70%-os etanollal fixáltuk majd 200 mM-os Na 2 HPO 4 (pH=7,8) pufferben vettük fel és etidium bromiddal festettük. A fluoreszcencia mérését FACScan áramlási citométerrel végeztük (Becton-Dickinson, San Diego, CA, USA). A sejtciklus egyes fázisaiban lévő sejtek százalékos arányát az Winlist szoftverrel (Verity Software House, Topshan, ME, USA) számoltuk.
3.11 Teljes RNS extrakció és cDNS készítés A totál RNS izoláláshoz és a reverz transzkripcióhoz kétféle protokolt használtunk. 1. A HCA-7 sejteken történt 24 és 48 órás NSAID kezelések után a totál RNS izolálását és reverz transzkripcióját Superscript III (Invitrogen Inc, Carlsbad, CA, USA) kittel végeztük a gyártó utasításai szerint. 2. A további kísérletekben a totál RNS-t RNeasy mini prep kittel (Qiagen, Valencia, CA, USA) nyertük ki. Az RNS koncentrációját spektrofotométerrel (BIO-TEK Instruments, VM, USA) 260 nm hullámhosszon történt méréssel határoztuk meg. A reverz-transzkripcióhoz a Fermentas (Glen Burnie, MD, USA) termékeit használtuk. 20 μl reakcióelegyet készítettünk az alábbiak szerint: 2 μl dNTP (10mM), 2 μl oligo (dT) primer (100 μM); 4 μl RT puffer (5x); 0,5 μl RNáz inhibitor (25 egység/μl); 1 μl RevertAid M-MuLV reverztranszkriptáz (200 egység/μl); 2 μg RNS templát; a végtérfogat kiegészítéshez nukleáz mentes vizet használtunk.
29
3.12 Kvantitatív valós-idejű PCR A DPD és COX-2 mRNS expressziók vizsgálata real time RT-PCR technikával történt. A Superscript III kittel kinyert cDNS minták esetén expressziós referenciaként a GAPDH-ot használtuk, amelynek primereit a kit tartalmazta. A további vizsgálatokban referenciaként a β-actint használtuk. A COX-2 mRNS expresszió meghatározásához alkalmazott
primer
pár
bázis
sorrendje
a
következő:
5’-TTCAAA-
TGAGATTGTGGGAAAATTGCT és 5’-AGTTCATCTCTGCCTGAGTATCTT, a DPD-hez: 5’-GAAATGGCCGGATTGAAGTTT és 5’-TCGAAGAGCTTTTGAAGCTGG, a β-actin-hoz 5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA és 5’-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC
bázissorrendű
primereket
használtuk.
Az
amplifikációt
RotorGene 2000 készülékkel (Corbett Research, Mortlake, Ausztrália) 10 μl térfogatban az alábbiak szerint végeztük: 1 μl cDNS, 0,2 μl primerenként, 5 μl IQ SybrGreen Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) és 3,6 μl nukleáz mentes víz (Fermentas). A PCR körülmények a következők: 3 perc denaturáció 95 ºC-on, 40 ciklus 20 mp 95 ºCon, 20 mp 62 ºC-on és 30 mp 72 ºC-on. Az amplikon tisztaságát olvadáspont analízissel ellenőriztük. A HCA-7 sejteken történt 24 és 48 órás NSAID kezelések esetén a relatív expressziót a DPD/GAPDH ill. COX-2/GAPDH arányból számoltuk, a további vizsgálatok kiértékelésekor a relatív expressziót Pfaffl által leírt képlet alapján számoltuk.
63
A
méréseket vizsgálatonként háromszor ismételtük.
3.13 Endogén uracil koncentráció mérése HPLC-vel A 24 órás NSAID kezelés után a sejteket 5 percig 10.000 g-n 4 ºC-on centrifugáltuk. A felülúszót leszívtuk. Az üledékhez 500 ng brómuracilt (belső standard), Tris puffert (2 M, pH=6) és etilacetátot adtunk, vortexeltük és 15 percig 3.000 g-n centrifugáltuk. A etilacetátos fázist különválasztottuk és N 2 áramban szárazra pároltuk. A száraz maradékot a kromatográfiás eluensbe (12,5 mM foszfát puffer, 0,4% metanol és 0,04% tetrahidrofurán ) oldottuk vissza. A HPLC-s elválasztás Aquasil C18 oszlopon (1504,6 mm, 3 μm) (Thermo Hypersil-Keystone, Runcorn, Anglia) az eluens 0,6 ml/perc
30
áramlási sebességnél, szobahőmérsékleten történt. Az uracilt 214 nm hullámhosszon UV fényben detektáltuk. Az eredmény három független mérés átlaga.
3.14 Humán tumor xenograft kialakítása és kezelése HCA-7, illetve HT-29 sejteket 2106 denzitásban 0,1 ml fiziológiás sóoldatban szuszpendálva 6 hetes nőstény SCID egerek hátbőre alá (s.c.) oltottuk. Az állatokat légkondicionált állatházban tartottuk, 22-24 ºC hőmérséklet és 50-60% relatív páratartalom mellett. Az egerek etetése autoklávozott táppal (Charles River VFR 1 Németország), itatása sósavval pH=3-ra savanyított deszt. vízzel történt. Miután a tumorméret elérte a 100-150 mm3 térfogatot, (a transzplantálást követő 19. napon) az állatokat randomizáltuk, a kezeléseket a elvégeztük (22.-27.nap). Az állatkísérleteket a Semmelweis Egyetem állatkísérletekre vonatkozó 61/2003. (VI. 19.) ET. számú határozattal megalkotott állatvédelmi szabályzata szerint végeztük. 1. Az 5-FU és 5-FU+indomethacin ill. 5-FU+NS-398 kezelések daganatellenes hatásának vizsgálatához az állatokat az alábbi kezelési csoportokra osztottuk (négy állat/ csoport). 1. kontroll (fiziológiás sóoldat) 2. 5-FU, 6 mg/kg, 5xqd, i.p. 3. 5-FU, 6 mg/kg, 5xqd, i.p.+ indomethacin, 2,5 mg/kg, 5xqd, p.o. 4. 5-FU, 6 mg/kg, 5xqd, i.p.+ NS-398, 5 mg/kg, 5xqd, p.o. 5. 5-FU, 30 mg/kg, 5xqd, i.p 6. 5-FU, 30 mg/kg, 5xqd, i.p.+ indomethacin, 2,5 mg/kg, 5xqd, p.o. 7. 5-FU, 6 mg/kg, 5xqd, i.p.+ NS-398, 5 mg/kg, 5xqd, p.o. A kezelés naponta történt összesen öt napig. Az 5-FU adagolása intraperitoneálisan, az indomethacin és az NS-398 adagolása pedig gyomorszondával történt. A 30 mg/kg/nap 5-FU alkalmazása, mint maximáltan tolerálható dózis irodalmi adat alapján történt kiválasztásra.
64
Szintén irodalmi adatokra támaszkodtunk az alacsony indomethacin és
NS-398 dózisok kiválasztásakor. 65,66 A vizsgálatokhoz használt 5-FU, ill. indomethacin 0,2 ml fiziológiás sóoldatban, az NS-398 0,2 ml PBS-ben oldva került beadásra.
31
Az állatok testtömegét táramérlegen, a tumor térfogatát a 2., 4. és 6. napon tolómérővel mértük. A tumortérfogatot a következő, irodalomban használt 67 képlettel számoltuk: ahol a a rövidebb átmérő és b a hosszabb átmérő. Az állatok leölése után (41. nap) a tumorokat azonnal eltávolítottuk. A tumorok egy darabját (a 6. és 7. csoport esetén az egész tumort) 10%-os pufferolt formalinban fixáltuk a későbbi immunhisztokémiai vizsgálatig, a minták többi részét folyékony N 2 -ben tároltuk a további feldolgozásig. A tumorgátló hatást a relatív tumornövekedés (RTN) változása alapján állapítottuk meg a következő képlet szerint:
ahol V 6 és V 0 a 6. és 0. napon mért
tumortérfogat. 2.
Az indomethacin és NS-398 kezelések COX-2 és DPD aktivitásra gyakorolt
hatásának vizsgálatához az egereket 3 csoportra osztottuk (négy állat/csoport). A kezeléseket 3x5 napig, három egymást követő héten végeztük. Az adagolás gyomorszondával történt. 1. kontroll (fiziológiás sóoldat) 2. 2,5 mg/kg/nap indomethacin 3. 5 mg/kg/nap NS-398 Az állatok testtömegét táramérlegen, a tumorok térfogatát tolómérővel hetente 2 alkalommal mértük A tumorokat eltávolítás után folyékony N 2 -ben tároltuk a PGE 2 koncentráció és a DPD enzimaktivitás vizsgálatáig.
3.15 Immunhisztokémiai vizsgálat A COX-2 protein immunhisztokémiai kimutatását xenograft tumorokból végezük el. A formalinban fixált, paraffinba ágyazott mintákból 5 μm vastag metszeteket készítettünk, amelyeket deparaffináltunk és rehidratáltunk majd PBS-sel mostuk. Az antigén feltárás 1mM citrát pufferrrel történt (pH:6) majd a PBS-sel való mosás után az endogén peroxidáz aktivitás blokkolását 0,3% hidrogén-peroxidot tartalmazó metanollal történő 20 perces inkubálással végeztük. A nem-specifikus kötődések elkerülésére a
32
metszeteket normál kecskeszérummal (DAKO, Dánia) 10 percig inkubáltuk. A PBS-sel történt mosás után a metszeteket poliklonális anti-humán COX-2 antitesttel (Lab Vision, Warm Springs CA, USA) 1:50 higításban 30 percig inkubáltuk szobahőmérsékleten. Másodlagos antitestként biotinilált anti-nyúl IgG-t és sztreptavidin-peroxidáz komplexet használtunk (DAKO, Dánia). PBS-sel való mosás után az immunreakciót DAB (Sigma) kromogénnel hívtuk elő. A háttérfestés hematoxilinnel történt. Az antitestek specificitását pozitív és negatív kontrollokkal ellenőriztük.
3.16 Az 5-FU és az NSAID-ok közötti hatóanyag-kölcsönhatások vizsgálata Az 5-FU és az indomethacin ill. az NS-398 kombinációk kölcsönhatásának vizsgálatát Kern és mtsai 68 leírása alapján az alábbi képlet szerint végeztük: R=S exp /S obs , ahol R a gyógyszerinterakciót jelenti, az S exp a várt túlélés a monoterápiás 5-FU, ill. indomethacin vagy NS-398 kezelés után, az S obs pedig a kapott túlélés az 5FU+indomethacin vagy 5-FU+NS-398 kombinált kezelés után. Amennyiben az R=1, akkor additív, ha R>1, akkor szinergista, ha R<1, akkor antagonista hatásról beszélünk. Xenograftok esetén a kezelt állatok tumortérfogata és a kontroll állatok tumortérfogata közötti százalékos megoszlást használtuk az R index számításához.
3.17 Statisztikai analízis A statisztikai számításokat és az 5-FU IC 50 értékeinek meghatározását GraphPad PRISM 2.01 (San Diego, CA, USA) szoftverrel végeztük. A szignifikanciát varianciaanalízissel (ANOVA) és Tukey post hoc teszttel állapítottuk meg, kivéve a kollagén indukált és a kontroll sejtek közötti eltéréseket, valamint a hosszútávú NSAID kezelések hatását a COX-2 expresszióra, amelyeket Student t teszttel állapítottuk meg. Statisztikailag akkor tekintettük szignifikánsnak a különbséget, ha p<0,05.
33
4. Eredmények 4.1
HCA-7 és HT-29 colon adenocarcinoma sejtvonalak és a belőlük kialakított xenograftok jellemzése
4.1.1
Az 5-FU szenzitivitás farmakogenetikai és farmakobiokémiai jellemzése
Az 5-FU és a nem-szteroid gyulladáscsökkentő hatóanyagok antiproliferatív és tumorellenes hatásának vizsgálatához munkánk első lépéseként a kísérletekhez felhasználni kívánt HCA-7 és HT-29 sejtvonalak és a belőlük kialakított xenograftok 5FU-szenzitivitást befolyásoló néhány fontosabb farmakogenetikai és farmakobiokémiai jellemzőjét határoztuk meg. Az 5-FU legfontosabb molekuláris célpontjaként szolgáló timidilát-szintáz és az 5-FU hatásához szükséges folát kofaktort biztosító MTHFR polimorfizmusait PCR analízissel vizsgáltuk. Mivel a HCA-7 sejtvonal közel diploid kariotípusú homozigóta hármas (3R), a hipertriploid
70
69
a 5’TSER régióban látszólagos
HT-29 sejtekben látszólagos homozigóta
kettes (2R) ismétlődést figyeltünk meg. A gén 3’UTR régiójában a HCA-7 sejteken 6bp/0bp heterozigóta, a HT-29 sejteken 6bp/6bp homozigóta genotípust figyeltünk meg. A HCA-7 sejteken talált farmakogenetikai jellemzők korábbi vizsgálataink szerint
33,34
magasabb TS expressziót és következményesen alacsonyabb 5-FU érzékenységet, ugyanakkor a HT-29 sejtek esetében találtak alacsonyabb TS expressziót és magasabb 5-FU érzékenységet jeleznek. Az MTHFR C677T polimorfizmus szempontjából a HCA-7 sejteket CT heterozigótának, a HT-29 sejteket TT homozigóta mutánsnak találtuk (1. táblázat). A TT homozigóta mutáns genotípus esetében megnövekedik az intracelluláris MTHF koncentráció, a timidilátszintáz működéséhez szükséges kofaktor, amely elősegíti a timidilát szintáz-MTHF- és FdUMP között létrejövő ternier komplex stabilitását, ezáltal fokozódik az 5-FU hatékonysága.38 A dihidropirimidin dehidrogenáz enzim aktivitása a HCA-7 sejtek esetén magas (10115 pmol/min/mg fehérje) volt, ami az 5-FU fokozott lebontását eredményezi, míg a HT-29 sejtek esetén alacsony (9 3 pmol/min/mg fehérje) volt, ami kedvez az 5-FU antiproliferatív hatásának (1. táblázat).
Az 5-FU kezelés a HCA-7 és HT-29 sejtek proliferációját dózis-függően gátolta. A 48 órás kezelés után a dózis-hatás görbe alapján számolt IC 50 érték a HCA-7 sejtek esetén 1,1 mM, míg a HT-29 sejtek esetén 10 μM volt (4. ábra), ami összefüggést mutat a sejtvonalak farmakogenetikai és farmakobiokémiai jellemzői által meghatározott 5-FU érzékenységgel. Eredményeink alapján az 5-FU szenzitivitás szempontjából a HCA-7 sejtvonalat viszonylag rezisztens, ezzel szemben a HT-29 sejtvonalat 5-FU kezelésre érzékeny sejtvonalnak találtuk. A további kísérletekben az alkalmazott 5-FU koncentráció a HCA-7 sejtek kezelésénél 1 mM, a HT-29 sejteknél pedig 10 μM volt. A HCA-7 és HT-29 sejtvonalakból kialakított xenograftok esetén a TS polimorfizmusok meghatározásakor a humán-specifikus primerek használatával a tumorszövet sejtjeinek döntően humán eredetét is igazoltuk. A vizsgált polimorfizmusok tekintetében a xenograftok genotípusa a kiindulási sejtvonal genotípusával megegyezett, ugyakkor a tumorok DPD aktivitása a sejtvonalakban mérthez képest megváltozott, a HCA-7 xenograftban alacsonyabb (24 ± 4,2 pmol/perc/mg protein), míg a HT-29 xenograftban magasabb aktivitást (58,5 ± 4,51 pmol/perc/mg protein) mértünk (1. táblázat).
1. Táblázat HCA-7 és HT-29 sejtvonalak és xenograftok 5-FU-szenzitivitását befolyásoló farmakogenetikai és farmakobiokémiai paraméterek HCA-7 sejt
HT-29
xenograft
sejt
xenograft
5'TSER polimorfizmus
3R/3R
3R/3R
2R/2R
2R/2R
3'TSUTR polimorfizmus
6bp/0bp
6bp/0bp
6bp/6bp
6bp/6bp
MTHFR C677T polimorfizmus
CT
CT
TT
TT
DPD enzimaktivitás*
101 ± 15
24 ± 4,2
9±3
58,5 ± 4,5
A timidilát szintáz (5’ és 3’ vég) és az MTHFR gén polimorfizmusait PCR, illetve PCR-RFLP módszerrel, a DPD enzimaktivitást radioenzimatikus módszerrel vizsgáltuk. Az enzimaktivitás két független mérés átlaga ± SD. * pmol/perc/mg fehérje
35
Sejt növekedés (kontroll %)
100
50
0
-7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 log [5-FU] (mM) HCA-7
HT-29
4. ábra A HCA-7 és HT-29 sejtvonalak 5-FU IC 50 értékének meghatározása. A sejtvonalak 5-FU érzékenységének meghatározását az 5-FU dózis-hatásgörbéből kalkulált IC 50 érték számításával határoztuk meg. Az 5-FU koncentrációja 1 nM-tól 10 M-ig változott. Az egyes pontok 6 független mérés átlaga ± SD.
Fenti vizsgálataink alapján megállapítottuk, hogy az általunk kiválasztott két tumor sejtvonal az 5-FU-val szemben különböző szenzitivitást mutat, az érzékeny HT-29 sejtek esetében az 5-FU IC 50 értéke két nagyságrenddel alacsonyabb.
4.1.2
A COX-2 fehérjeexpresszió és aktivitás meghatározása
Ellenőrizni kívántuk a sejtvonalak és a belőlük kialakított xenograftok COX-2 expresszióját. A sejtvonalak esetében immunfluoreszcens festéssel kimutatott COX-2 protein a sejtek citoplazmatikus régiójában lokalizálódott (5a és b ábra). A HCA-7 sejteken magas, a HT-29 sejteken alacsony COX-2 fehérje expressziót figyeltünk meg. A várakozásokkal ellentétben a xenograftokban immunhisztokémiai vizsgálattal kimutatható COX-2 expresszió nem tükrözte a sejteknél megfigyelteket. A HT-29 xenograftok esetében a sejtekhez képest magasabb COX-2 expressziót tapasztaltunk, amely a tumorsejtekben lokalizálódott, a strómális elemekben csak gyenge festődés volt megfigyelhető. Ezzel szemben a HCA-7 xenograftokban a tumorsejtekben nem, a stromális fibroblasztokban viszont megfigyelhető volt a COX-2 festődés (5c és d ábra).
36
Ellenőrzés céljából, a HT-29 sejtekből további egy, a HCA-7 sejtekből további két alkalommal alakítottunk ki xenograftokat. A HT-29 xenograftok esetén ismételten emelkedett COX-2 expressziót találtunk a tumorsejtekben Az újonnan létrehozott HCA7 xenograftokban a COX-2 expresszió lokalizációja viszont nem volt konzekvens. A jelenség tisztázására további vizsgálatok szükségesek, ezért a további kísérletekben a HCA-7 xenograftok vizsgálatától eltekintettünk. Mivel irodalmi adatok alapján a COX-2 aktivitás a prosztanoidok közül elsősorban a PGE 2 akkumulációjával jár
71
így a COX-2 aktivitást az ELISA módszerrel
meghatározott PGE 2 koncentrációval jellemeztük, amely mind a sejtvonalak, mind a xenograftok esetében összevethető volt a COX-2 fehérje expresszióval. HCA-7 sejtek esetén a PGE 2 koncentráció magas (20,4 ± 4,8 ng/ml/106 sejt), míg HT-29 sejtek esetén a detekciós szint alatt volt. HT-29 xenograftok esetében a PGE 2 koncentráció 2,8 ± 0,1 ng/mg fehérje volt.
a
b
c
d
5. ábra Reprezetatív COX-2 immunfluoreszcens festés és IHC HCA-7 és HT-29 sejteken és xenograftokon. a) HCA-7 sejtek; b) HT-29 sejtek c) HCA-7 xenograft, d) HT-29 xenograft. A HCA-7 és HT-29 sejteken a COX-2 fehérjét immunfluoreszcens festéssel, xenograftok esetén immunhisztokémiai módszerrel mutattuk ki.
37
4.2
Az 5-FU és NSAID kezelések citotoxikus és tumorgátló hatásának vizsgálata sejtvonalakon és xenografton
4.2.1
Az
5-FU,
az
NSAID-ok
és
kombinációjuk
időfüggő
hatása
a
sejtproliferációra HCA-7 és HT-29 sejtvonalakon Vizsgálatunk célja volt annak megállapítása, hogy 24 és 48 órás NSAID kezelések befolyásolák-e az 5-FU proliferációgátló hatását. A sejtproliferáció vizsgálatát szulforodamin B (SRB) kolorimetriás teszttel végeztük. A HCA-7 és HT-29 sejteken az NSAID-ok önmagukban nem befolyásolták a sejtproliferációt sem 24, sem 48 órás kezelés során. A magas COX-2 expressziót mutató HCA-7 sejtek esetén a 24 órás 5-FU + NSAID kezelések proliferációgátló hatása nem tért el szignifikánsan az 5-FU kezeléshez viszonyítva. Ezzel szemben a 48 órás kezelés során az indomethacin 20%-al (p<0,01), az NS-398 pedig 22%-al (p<0,001) fokozta az 5-FU által kiváltott 42%-os sejtproliferáció csökkenést (6. ábra). Ezzel ellentétben, az alacsony COX-2 expressziót mutató HT-29 sejteken az 5-FU 24 és a 48 órás kezelés esetén önmagában is szignifikáns proliferációgátlást okozott a kontrollhoz viszonyítva. (p<0,0001 vs. kontroll). A kombinált kezelés ebben az esetben azonban nem módosította az 5-FU antiproliferatív hatását (6. ábra). Mivel a magas COX-2 expressziót mutató HCA-7 sejteken az indomethacin, ill. NS-398 kezelés 24 és 48 órán át alkalmazva nem befolyásolta a proliferációt, felmerült a hosszabb ideig alkalmazott NSAID kezelés hatásának vizsgálata. A 10 napig tartó indomethacin
kezelés
28%-os
(p<0,05),
az
NS-398
~70%-os
proliferációgátlást okozott a HCA-7 sejtek esetében a kontrollhoz viszonyítva.
38
(p<0,001)
Sejtproliferáció (kontroll %)
120 100
100
80
80
60
60
40
* *
HCA-7
40
HT-29
20
20 0
24 Idő (óra) indomethacin
NS-398
48
5-FU
0
24 Idő (óra)
5-FU + indomethacin
48
5-FU + NS-398
6. ábra A 24 és 48 órás 5-FU, NSAID és kombinált kezelések hatása a HCA-7 és HT29 sejtek proliferációjára. A HCA-7 sejteket 1 mM 5-FU-val, 10 μM indomethacinnal és 1,77 μM NS-398-al kezeltük. A HT-29 sejtek kezelése 10 μM 5-FU-val, 10 μM indomethacinnal és 1,77 μM NS-398-al történt. A sejtpopuláció növekedését SRB technikával vizsgáltuk. A feltüntetett átlagértékek ± SD 3 független mérés 6 párhuzamos értékéből származnak. # p<0,001 vs kontroll; * p<0,01 vs 5-FU.
4.2.2
Az 5-FU IC 50 értékének változása HCA-7 és HT-29 sejtvonalakon 5-FU ± NSAID kezelések hatására
Korábbi vizsgálatunkban (ld. 4.1.1 pont) már megállapítottuk, hogy a HCA-7 sejtek esetében az 5-FU IC 50 értéke magas (1,1 mM), míg a HT-29 sejtek esetében két nagyságrenddel alacsonyabb (10 μM). Jelen vizsgálatunk során arra a kérdésre kerestünk választ, hogy az NSAID kezelések befolyásolák-e az 5-FU IC 50 értékét. A 7. ábrán látható, hogy HCA-7 sejtek esetében az 5-FU IC 50 értéke szignifikánsan alacsonyabb volt a kombinált kezelések esetében az önmagában alkalmazott 5-FU kezeléshez viszonyítva. Az 5-FU + indomethacin kezelésnél az IC 50 =0,44 mM (p<0,001 vs 5-FU) és az 5-FU + NS-398 kezelésnél az IC 50 =0,28 mM (p<0,001 vs 5-FU) volt. A HT-29 sejteken az NSAID-ok nem okoztak változást az 5-FU citotoxikus hatásában: az 5-FU + indomethacin kezelésnél az IC 50 =11,62 μM és az 5-FU + NS-398 kezelésnél az IC 50 =12,32 μM volt (7. ábra).
39
Sejtnövekedés (kontroll %)
HCA-7
100
100
HT-29
50
50 5-FU 5-FU + indomethacin 5-FU + NS-398
0
0
-5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 log [5-FU] (mM)
5-FU 5-FU + indomethacin 5-FU + NS-398
-7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 log [5-FU] (mM)
7. ábra A 48 órás 5-FU ± NSAID kezelések dózis-függő hatásának vizsgálata HCA-7 és HT-29 sejteken. A sejtproliferáció változását 48 órás kezelés után SRB teszttel viszgáltuk. Az 5-FU koncentrációja HCA-7 sejtek esetén 10 nM - 10 M, HT-29 sejtek esetében 1 nM - 0,1 M között változott. Az indomethacin koncentrációja 10 μM; az NS-398 koncentrációja 1,77 μM volt. Az egyes pontok 6 független mérés átlaga ± SD.
Eredményeinket összefoglalva elmondható, hogy a magas COX-2 expressziót mutató HCA-7 sejtek esetében az indomethacin és az NS-398 szignifikánsan fokozták az 5-FU proliferációgátló hatását. Az indomethacin és az NS-398 kezelések között nem tapasztaltunk különbséget. Az alacsony COX-2 expressziót mutató HT-29 sejtek esetén az 5-FU + NSAID kombinált kezelések proliferációgátló hatása azonos volt az önálló 5FU kezeléssel. A HCA-7 sejteken megvizsgáltuk, hogy az NSAID-ok 5-FU toxicitást fokozó hatása esetleg függ-e a hatóanyagok alkalmazásának sorrendjétől és időtartamától. A 2. táblázat eredményei azt mutatják, hogy az 5-FU és az NSAID kezelések sorrendje befolyásolta az 5-FU citotoxikus hatását. A vizsgált variációk közül, az első 24 órában alkalmazott 5-FU + NSAID és a második 24 órában adott önálló 5-FU kezelés szignifikánsan csökkentette a sejtproliferációt az önálló 5-FU kezeléshez viszonyítva. A leghatásosabb proliferációgátlást a 48 órán keresztül alkalmazott 5-FU + NSAID kezelés eredményezte.
40
2. Táblázat Az 5-FU ± indomethacin, illetve NS-398 kezelések sorrendjének hatása a sejtproliferációra Kezelés első 24 óra
Sejtproliferáció második 24 óra
(kontroll %-ában ± SD)
5-FU
5-FU
58 ± 9
5-FU
5-FU + indomethacin
52 ± 13
5-FU + indomethacin
5-FU
45 ± 7*
5-FU + indomethacin
5-FU + indomethacin
38 ± 3#
5-FU
5-FU + NS-398
47 ± 1
5-FU + NS-398
5-FU
43 ± 7*
5-FU + NS-398
5-FU + NS-398
36 ± 3#
A HCA-7 sejteket 1 mM 5-FU-val, 10 μM indomethacinnal és 1,77 μM NS-398-al kezeltük. A sejtpopuláció növekedését SRB technikával vizsgáltuk. A feltüntetett átlagértékek ± SD hat független mérésből származnak. * p<0,05 vs 5-FU/5-FU kezelés; # p<0,01 vs 5-FU/5-FU kezelés
4.2.3
Az 5-FU, az NSAID-ok és kombinációjuk hatása a tumornövekedésre HT29 xenograftokon
A COX-2 expressziót mutató HT-29 xenograftokon is igazolni kívántuk az NSAID-ok potenciáló hatását az 5-FU kezelés által okozott tumorgátlásra. A kezelés időtartamának megállapítására elővizsgálatokat végeztünk. Tapasztalataink szerint a 6 mg/kg/nap dózisú 5-FU, a 2,5 mg/kg/nap indomethacin és az 5 mg/kg/nap NS-398, ill. az 5-FU + NSAID kombinációk az állatok általános állapotát nem befolyásolták, mellékhatásokat nem figyeltünk meg. Az 5 napig tartó 30 mg/kg/nap 5-FU ± NSAID kezelést az állatok jól tűrték, ennél hosszabb kezelés esetén viszont akut toxicitási tüneteket – súlyvesztés, hasmenés - figyeltünk meg, amely végül az állatok elhullásához vezetett. Mivel a kezelés időtartamát a 30 mg/kg/nap 5-FU dózis toxicitása limitálta, ezért mind a 6, mind pedig a 30 mg/kg/nap 5-FU dózisú kezeléseket 5 napig végeztük.
41
A kezelések végeztével az állatokat felboncoltuk. Szervi elváltozásokat, metasztázisokat (májban, tüdőben, lépben) egyik kezelési csoportban sem találtunk Az 5-FU és az 5-FU + NSAID kezelések tumorgátló hatását a 8. ábra szemlélteti. Az 5FU 6 mg/kg/nap dózisban nem befolyásolta a tumorok növekedését, a kezelt állatokban a tumor növekedése a kontroll állatokéval azonos volt. A 6 mg/kg/nap 5-FU citotoxikus hatását az indomethacin 33%-al, az NS-398 42%-al növelte. A két NSAID hatása között nem volt szignifikáns különbség. A 6 mg/kg/nap 5-FU + NSAID kezelések által kiváltott tumornövekedés gátlás összevethető volt a 30 mg/kg/nap 5-FU monoterápia tumorgátló hatásával. A 30 mg/kg/nap dózisú 5-FU citotoxikus hatását az NSAID-ok tovább fokozni nem tudták. Az alkalmazott 5 napos kezelés után sem az indomethacin sem az NS-398 kezelés önmagában nem okozott tumornövekedés gátlást.
RTN (kontroll %)
a
b
120 100
*
*
#
##
120 100
80
80
60
60
40
40
20
20
0
0 5-FU 5-
55-FU + INDO
* *
*
5-FU + NS-398
8. ábra 5-FU ± NSAID hatása HT-29 xenograftok növekedésére (átlag ±SD). (a) 6 mg/kg/nap és (b) 30 mg/kg/nap 5-FU. Az állatokat 5 napig kezeltük, a tumor térfogatát a 2., 4. és 6. napon tolómérővel mértük. A tumorgátló hatást a relatív tumornövekedés (RTN) változása alapján állapítottuk meg a következő képlet szerint: * p<0,001 vs kontroll, # p<0,05 vs 5-FU, ## p<0,001 vs 5-FU
A HCA-7 sejthez hasonlóan vizsgáltuk, hogy a magas COX-2 expressziót mutató HT29 xenograft esetén a hosszú távú NSAID kezelés befolyásolja-e tumornövekedést. A 3
42
hetes indomethacin kezelés 27%-os (p<0,05), az NS-398 64%-os (p<0,001) tumornövekedésgátlást okozott a kezeletlen kontrollhoz viszonyítva.
4.2.4
A hatóanyagok kölcsönhatásának vizsgálata az 5-FU + NSAID kombinált kezeléseknél
A terápiás előny megállapítására az 5-FU és az NSAID-ok közötti hatóanyagkölcsönhatást vizsgáltuk az Anyagok és Módszerek fejezetben részletesen ismertetett Kern és mtsai 68 által kidolgozott és leírt képlet szerint. Az eredményeket összefoglalva a 3. táblázatban tüntettük fel. A HCA-7 sejteken a kölcsönhatás típusa 48 órás kezelés után erősen szinergista, ezzel szemben a HT-29 sejtek esetében az 5-FU + indomethacin kombináció antagonista, az 5-FU + NS-398 kombinációja additív hatású. A HT-29 xenograftok esetében az 5 napos 6 mg/kg 5-FU dózis esetén mindkét NSAID esetében jelentős szinergista hatást figyeltünk meg. A fentiek magyarázatot adhatnak a sejtproliferáció- és a tumornövekedésgátlással kapcsolatos eredményekre.
3. Táblázat Az 5-FU + indomethacin ill. az 5-FU + NS-398 kombinációk közötti hatóanyag-kölcsönhatás (R)a.
R indomethacin
R NS-398
HCA-7 sejtek
1,57
1,57
HT-29 sejtek
0,85
1
HT-29 xenograft 6 mg/kg 5-FU
1,48
1,47
HT-29 xenograft 30 mg/kg 5-FU
1,19
1,13
Az 5-FU és az indomethacin ill. az NS-398 kombinációk hatását a HCA-7 és HT-29 sejtek 48 órás kezelése ill. a HT-29 xenograft 5 napos kezelése után vizsgáltuk. A HCA-7 sejteket 1 mM, a HT-29 sejteket 10 μM 5-FU-val kezeltük. Mindkét sejtvonal esetén az indomethacin koncentrációja 10 μM, az NS-398 koncentrációja 1,77 μM. A HT-29 xenograftok esetén 6 mg/kg/nap és 30 mg/kg/nap 5-FU, 2,5 mg/kg/nap indomethacin és 5mg/kg/nap NS-398 dózisokat használtunk. a A hatóanyag-kölcsönhatás erőssége: R<1 antagonista hatás; R=1 additív hatás; R>1 szinergista hatás.
43
4.3
Az 5-FU + NSAID kombináció fokozott citotoxikus hatásában szerepet játszó mechanizmusok
Előző vizsgálataink során megállapítottuk, hogy az alacsony dózisban alkalmazott indomethacin és az NS-398, a magas COX-2 expressziót mutató HCA-7 sejteken és az ugyancsak magas expressziójú HT-29 xenografton szinergista módon fokozta az 5-FU hatékonyságát, míg a COX-2-t alacsonyan expresszáló HT-29 sejteken az 5-FU-val kombinált indomethacin antagonista és a szelektív COX-2 gátló, NS-398, additív kölcsönhatást mutatott. További kísérleteink célja az volt, hogy megpróbáljunk adatokat gyűjteni arra vonatkozóan, hogy milyen mechanizmusok játszhatnak szerepet az alacsony dózisban alkalmazott NSAID-ok 5-FU hatékonyságot fokozó tulajdonságában.
4.3.1
Az 5-FU, NSAID-ok és kombinációjuk hatása a sejtciklus és az apoptózis változására
A sejtciklus vizsgálata: 5-FU, NSAID-ok és kombinációjuk hatása Az 5-FU a sejtciklus S fázisában fejti ki hatását. Áramlási citométer segítségével összehasonlítottuk a 24 és a 48 órás 5-FU, NSAID-ok ill. kombinációjuk hatását a sejtciklus fázisaira. Mindkét sejtvonal esetében az 5-FU ill. az 5-FU + NSAID kezelések után az S-fázisban lévő sejtek aránya megnőtt, ezzel párhuzamosan a G2/M fázisban lévők aránya lecsökkent a kezeletlen sejtekhez képest. Úgy tűnik, hogy a kombinált kezelés után az S fázisban lévő sejtek aránya az önálló 5-FU, illetve NSAID kezelések által okozott S fázis felhalmozódástól függött. A HCA-7 sejteken 48 órás kezelés után az 5-FU önmagában 27%-kal, az indomethacin és az NS-398 önmagukban 8-15%-kal növelték az S fázisban lévő sejtek mennyiségét a kontrollhoz képest, azonban a két NSAID hatása között nem volt különbség. Ugyanakkor az 5-FU + NSAID kombinált kezelések szignifikánsan megnövelték az S-fázisú sejtek arányát az önálló 5-FU kezeléshez képest. Ezzel szemben a HT-29-sejteken 48 órás kezelés esetén az önálló 5-FU kezelés jelentősebb S fázis felhalmozódást okozott, (66%-os növekedés a kontrollhoz viszonyítva), míg a kombinált kezelések nem voltak hatással a sejtek
44
cikluson belüli eloszlására az 5-FU monoterápiához viszonyítva. A sejtfázis megoszlásokat összefoglalóan a 4. táblázat tartalmazza.
4. Táblázat A sejtciklus fázisainak %-os megoszlása az 5-FU (F), indomethacin (I), NS-398 (N) ill. kombinációjukkal kezelt HCA-7 és HT-29 sejtek esetén. Kezelések Sejt
24 óra
48 óra
Fázis C+
F
I
N
F+I F+N
F
I
N
F+I
F+N
45±4
34±2#
36±6#
HCA-7 G1 48±4 39±3#
47±5
44±11 36±3#
38±3#
39±7#
44±3
S 48±2 61±3#
48±1
51±11 64±3#
62±3#
61±1#
55±1# 52±2# 66±1# * 64±1# *
0±0#
5±2
0±0#
0±0#
0±0#
1±2
3±1
0±0#
0±0#
32±9#
62±7
61±3
32±9#
36±8#
G2/M 4±3
5±1
HT-29 G1 57±7 45±12 59±16 60±15 44±17 47±16
S 41±5 55±12 37±16 37±16 56±17 53±16 68±18# 37±13 36±4 68±19# 64±16# G2/M 2±1
0±0#
4±1#
3±1
0±0#
0±0#
0±0#
1±1
3±1
0±0#
0±0#
A sejteket 24 és 48 óráig kezeltük. A HCA-7 sejteket 1 mM, a HT-29 sejteket 10 μM 5-FU-val kezeltük. Mindkét sejtvonal esetén az indomethacin koncentrációja 10 μM, az NS-398 koncentrációja 1,77 μM. Négy független kísérlet átlagának ± SD %-ban kifejezett értékét adtuk meg. A kontroll sejtek (C) sejtéletciklus megoszlása a kezelési időszak alatt változatlan maradt. # p<0,05 vs kontroll, * p<0,05 vs 48 órás önálló 5-FU kezelés
Az 5-FU által indukált apoptózis változása NSAID kezelés hatására Vizsgáltuk, hogy az NSAID-ok által fokozott 5-FU hatékonyság esetén az apoptotikus sejtek száma módosul-e. A kezeletlen sejtekhez viszonyítva a 48 órás 5-FU kezelés az apoptotikus sejtek számát mindkét sejtvonalon közel kétszeresére emelte, ugyanakkor önmagában sem az indomethacin, sem az NS-398 nem indukált apoptózist, amely összevethető a proliferáció gátlás vizsgálatakor kapott eredményekkel (ld. 4.2.1. pont).
45
A kombinált kezelés kizárólag a HCA-7 sejtek esetében növelte (30-40%) szignifikánsan az apoptotikus sejtek számát az önálló 5-FU kezeléshez viszonyítva (9. ábra). 300
Apoptózis (kontroll %)
#
*
#
5-FU indomethacin NS-398 5-FU + indomethacin 5-FU + NS-398
*
250 #
200
#
150 100 50 0
24 óra
2 óra 24 ó
48 óra
° átlag SD
48 óra ó HT-29 -
HCA -7
23 16 15 21 24
33 15 15 43 47
9
4,1 3,7 5,8 2,7 7,5
4,1 6,8 6,1 6,5 3,7
2,1 1,3 1,5 2,2 1,3
8 6
8 7
12 9
5 11 15
1,8 2,5 2,2 1,4 2,8
9. ábra Az 5-FU, NSAID és kombinációjuk hatása a HCA-7 és HT-29 sejtek apoptózisára. A sejteket 24 és 48 óráig kezeltük. A HCA-7 sejteket 1 mM, a HT-29 sejteket 10 μM 5-FU-val kezeltük. Mindkét sejtvonal esetén az indomethacin koncentrációja 10 μM, az NS-398 koncentrációja 1,77 μM. Az apoptotikus sejtek számát áramlási citométerrel mértük. Az egyes oszlopok négy független mérés átlagát ± SD ábrázolja kontroll %-ban. # p<0,05 vs kontroll; * p<0,05 vs 48 órás önálló 5-FU kezelés; ° apoptotikus sejtek száma az összsejtszám %-ában.
46
4.3.2
Az 5-FU, NSAID és kombinációjuk hatása a COX-2 fehérje expresszióra és enzimaktivitásra
A COX-2 expresszió és aktivitás változásának vizsgálata HCA-7 és HT-29 sejtvonalakon A továbbiakban arra a kérdésre kerestük a választ, hogy a HCA-7 sejteken megfigyelt 5FU + NSAID kombinált kezelések által okozott fokozott proliferációgátlás összefüggésbe hozható-e a COX-2 fehérje expressziójának megváltozásával. A COX-2 expressziót Western blot analízissel és immunfluoreszcens festéssel vizsgáltuk. A magas COX-2 expressziót mutató HCA-7 sejteken a 48 órás 5-FU, ill. az 5-FU + NSAID kezelések megemelték a COX-2 fehérje expresszióját a kezeletlen sejtekhez viszonyítva, de ez a különbség nem érte el a szignifikancia határt. Az indomethacin és az NS-398 kezelések önmagukban csökkentették a COX-2 expresszióját, de ez az eltérés sem érte el a szignifikancia határt (10. ábra). Vizsgáltuk, hogy a kezelések befolyásolták-e a HT-29 sejtek alacsony COX-2 expresszióját, azonban egyik kezelés sem okozott változást. A Western blot analízis eredményét (10. ábra), a COX-2 immunfluoreszcens festéssel is igazoltuk (11. ábra). Western blot analízissel vizsgáltuk mindkét sejtvonalon a COX-1 expresszióját is, amelyet a kezelések nem befolyásoltak, így azt nem tüntettük fel.
47
HCA-7 -
COX -22 ß-aktin o.d.a. SD
0,65 0,09
0,87 0,15
0,46 0,06
0,59 0,08
0,78 0,17
0,059 0,012
0,089 0,015
0,054 0,016
0,090 0,017
0,077 0,009
c.
d.
e.
0,72 0,12
HT- 29
COX -2 ß --aktin o.d.a SD
a.
b.
0,080 0,011
f.
10. ábra COX-2 fehérje expresszió változása 48 órás 5-FU, NSAID és kombinált kezeléseket követően HCA-7 és HT-29 sejteken. Reprezentatív kép a) kontroll; b) 5-FU; c) indomethacin; d) NS-398; e) 5-FU + indomethacin; f) 5-FU + NS-398. A HCA-7 sejteket 1 mM, a HT-29 sejteket 10 μM 5-FU-val kezeltük. Mindkét sejtvonal esetén az indomethacin koncentrációja 10 μM, az NS-398 koncentrációja 1,77 μM. Referencia fehérje: β-aktin; o.d.a: COX-2/β-aktin optikai denzitás arány; az értékek 3 független mérés átlaga±SD.
Bár a COX-2 fehérje expressziója a kezelések hatására szignifikánsan nem változott, a COX-2 enzimaktivitás jelzője, a PGE 2 koncentráció, vizsgálatakor megállapítottuk, hogy HCA-7 sejteken 48 órás kezelést követően az NSAID-ok több mint 90%-os csökkenést okoztak a PGE 2 koncentrációban a kontrollhoz viszonyítva. Az 5-FU + NSAID kezelések esetében is hasonló gátlást figyeltünk meg (5. táblázat). Az önálló 5FU kezeléshez képest az 5-FU + NSAID kezelések szignifikáns csökkenést okoztak a PGE 2 koncentrációban. HT-29 sejtek esetében a PGE 2 koncentráció mind a kontroll sejtekben, mind a kezelések után a detekciós szint alatt volt.
48
11. ábra Reprezentatív COX-2 immunfluoreszcens festés 48 órás 5-FU, NSAID és kombinált kezeléseket követően HCA-7 és HT-29 sejteken. A 48 órás kezelések után a sejteket fixáltuk és monoklonális COX-2 ellenes antitesttel, majd FITC-jelölt másodlagos ellenanyaggal inkubáltuk.
5. Táblázat Az 5-FU, az NSAID-ok és kombinációjuk hatása a PGE 2 koncentrációra HCA-7 sejteken 48 órás kezelést követően Kezelések
PGE 2 koncentráció (ng/ml/106 sejt)
kontroll
20,4 ± 0,60
indomethacin
0,4 ± 0,04*
NS-398
0,2 ± 0,02*
5-FU
16,7 ± 1,30
5-FU + indomethacin
0,2 ± 0,12**
5-FU + NS-398
0,2 ± 0,05**
A HCA-7 sejteket 1 mM 5-FU-val, 10 μM indomethacinnal és 1,77 μM NS-398-al kezeltük. A kezelések után a méréseket a tápfolyadékból ELISA módszerrel végeztük. Három független mérés átlaga ± SD. * p<0,001 vs kontroll, ** p<0,001 vs 5-FU kezelés
A COX-2 expresszió és aktivitás változásának vizsgálata HT-29 xenograftokon 5-FU és NSAID kezelés hatására Korábban megállapítottuk (ld. 4.2.3. pont), hogy 5 napos kezelés során az NSAID-ok fokozták a 6 mg/kg/nap dózisban alkalmazott 5-FU citotoxikus hatását a xenograftokon. A sejtekhez hasonlóan megvizsgáltuk, hogy a kezelések befolyásolták-e a tumorok COX-2 expresszióját. A HT-29 xenograftokon immunhisztokémiai festéssel mutattuk ki a COX-2 fehérje expressziót, amely egyik kezelés hatására sem változott számottevően (12. ábra).
a
b
c
d
e
f
g
h
i
12. ábra HT-29 xenograftok COX-2 immunhisztokémiai vizsgálata 5 napos 5-FU, NSAID és kombinált kezelést követően. Reprezentatív metszek. a) kontroll; b) 2,5 mg/kg/nap indomethacin; c) 5 mg/kg/nap NS-398; d) 6 mg/kg/nap 5-FU; e) 6 mg/kg/nap 5-FU + indomethacin; f) 6 mg/kg/nap 5-FU + NS-398; g) 30 mg/kg/nap 5-FU; h) 30 mg/kg/nap 5-FU + indomethacin; i) 30 mg/kg/nap 5-FU + NS-398.
4.3.3
A hosszú távú indomethacin és NS-398 kezelések hatása a COX-2 expresszióra
Az előzőekben megállapítottuk, hogy 1.) a magas COX-2 expressziót mutató HCA-7 sejtvonalon a 48 órás és HT-29 xenograftokon az 5 napos NSAID kezelés nem befolyásolta a proliferációt, a COX-2 expressziót pedig nem szignifikáns módon csökkentette. 2.) HCA-7 sejteken a 10 napos, HT-29 xenograftok esetén a 3 hetes indomethacin és NS-398 kezelések szignifikáns proliferációgátlást és tumortérfogat csökkenést okozott. Felmerült a kérdés, hogy vajon a hosszú távú indomethacin, ill. NS-
51
398 kezelés által okozott proliferációgátlás összefüggésbe hozható-e a COX-2 fehérje expressziójának változásával. HCA-7 sejteken a COX-2 fehérje expresszióját Western blot analízissel és immunfluoreszcens festéssel vizsgáltuk. A 10 napos indomethacin, ill. NS-398 kezelés, - a 48 órás kezeléshez hasonlóan –, enyhén, nem szignifikáns módon csökkentette a COX-2 expressziót (13. és 14. ábra). HT-29 xenograftok esetében Western blot analízissel és immunhisztokémiai festéssel vizsgáltuk a COX-2 expresszió változását. A 3 hétig tartó indomethacin ill. NS-398 kezelés, a HCA-7 sejteknél tapasztaltakhoz hasonlóan, szintén nem okozott szignifikáns változást a COX-2 expresszióban (13. és 14. ábra).
HCA-7 sejtek
kontroll
INDO
NS-398
COX-2 β-Aktin o.d.a.
0.136
0.077
0.071
SD
0.009
0.013
0.011
HT-29 xenograft
kontroll
INDO
NS-398
12.038
9.95
10.66
COX-2 β-Aktin o.d.a. SD
2.1
1.5
1.6
13. ábra Az indomethacin és NS-398 kezelés hatása a COX-2 és β-actin expresszióra HCA-7 sejtvonalon és HT-29 xenografton. Reprezentatív kép. A HCA-7 sejteket 10 napig, a HT-29 xenograftokat 3 hétig indomethacinnal (INDO) és NS398-cal kezeltük. o.d.a: COX-2/β-aktin optikai denzitás arány. A megadott értékek 3 mérés átlaga ± SD.
52
Kontrol
INDO
NS-398
a
b
14. ábra A hosszú távú indomethacin ill. NS-398 kezelés hatása a COX-2 fehérje expresszióra HCA-7 sejtvonalon és HT-29 xenograftokon. Reprezentatív kép. (a) COX-2 fehérje immunfluoreszcens kimutatása HCA-7 sejteken 10 napos indomethacin ill. NS-398 kezelés után; (b) COX-2 immunhisztokémiai festés HT-29 xenograftokon 3 hétig tartó indomethacin és NS-398 kezelés után
4.3.4
Az NSAID kezelések hatása a PGE 2 koncentrációra és a DPD enzimaktivitásra
Előző vizsgálatainkból arra a következtetésre jutottunk, hogy az NSAID-ok nem a COX-2 fehérje expresszió megváltoztatásán keresztül fokozták az 5-FU citotoxicitását felmerült a kérdés, hogy esetleg befolyásolják-e az 5-FU metabolizmusát. Noha az 5-FU hatékonyságát nagymértékben az aktiválás és az azt követő timidilát szintáz gátlás határozza meg, ugyanakkor az aktiválás számára rendelkezésre álló 5-FU mennyiségét és ezáltal a keletkező aktív nukleotidok szintjét az 5-FU igen gyors lebontásában kulcsfontosságú szerepet játszó DPD enzim jelentősen befolyásolja. A továbbiakban tehát tanulmányoztuk az NSAID-ok hatását a DPD enzim aktivitására. HCA-7 sejtekben a DPD enzimaktivitásban időfüggő csökkenést tapasztaltunk az NSAID kezelések hatására. A 24 órás kezelés következtében 65%-kal csökkent a DPD
53
enzimaktivitás, amely a 48 órás kezelés hatására még 17%-kal csökkent. A 10 napos kezelés hatására további változás már nem történt (6. táblázat). Az indomethacin és az NS-398 kezelések időfüggő-módon befolyásolták a PGE 2 koncentrációját is. A 24 órás kezelés több mint 80%-os, a 48 órás kezelés több mint 90%-os csökkenést okozott. További csökkenést a 10 napos kezelést követően sem tapasztaltunk. A PGE 2 koncentráció és a DPD aktivitás párhuzamos csökkenését a 15. ábra szemléletesen mutatja. 6. Táblázat Az indomethacin és NS-398 kezelések hatása a PGE 2 koncentrációra és a DPD enzimaktivitásra magas COX-2 expressziót mutató HCA-7 sejteken és HT-29 xenograftokon. Minta / időpont
Mért paraméter
Kezelések Indomethacin
NS-398
PGE 2 1
3,1 ± 0,4 (15)*
3,6 ± 0,1 (18)*
DPD aktivitás2
36,0 ± 1,4 (35)*
34,0 ± 1,9 (34)*
PGE 2
0,4 ± 0,1 (2)*
0,2 ± 0,1 (1)*
DPD aktivitás
18,1 ± 1,1 (18)*
16,2 ± 1,3 (16)*
PGE 2
0,4 ± 0,1 (2)*
0,2 ± 0,1 (1)*
DPD aktivitás
18,1 ± 0,9 (18)*
20,8 ± 2,3 (21)*
PGE 2 3
0,4 ± 0,3 (14)*
1,1 ± 0,3 (39)*
DPD aktivitás
3,5 ± 0,9 (6)*
1,7 ± 0,7 (3)*
HCA-7 sejtek 24 óra
48 óra
10 nap HT-29 xenograft 3 hét
Az eredmények független mérések átlagai ± SD; 1 ng/ml/106; 2 pmol/perc/mg protein; 3 ng/mg protein; (kontroll %) * p<0,001 vs. kontroll. A kontroll értéke a különböző időpontokban mért értékek átlaga ± SD, ami a PGE 2 esetében a HCA-7 sejteken 20,4 ± 4,8 ng/ml, a HT-29 xenograftokban 2,8 ± 0,1 ng/mg; a DPD esetében HCA-7 sejteken 101,3 ± 15,6 pmol/perc/mg protein, HT-29 xenograftokban 58,5 ± 4,51 pmol/perc/mg protein.
54
120
25
2
80
20
1
20
PGE 2
40
15
60 0
0 0
1
2
10
3
hét
40
PGE2 [ng/ml/106 sejt]
HT-29 xenograft
100 DPD
DPD [pmol/perc/mg protein]
HCA-7 sejt
3
60
5
20
0
0 0
2
DPD INDO
4
6
nap DPD NS-398
8
10
PGE2 INDO
PGE2 NS-398
15. ábra Az indomethacin és NS-398 kezelések időfüggő hatása a PGE 2 koncentrációra és a DPD enzimaktivitásra magas COX-2 expressziót mutató HCA-7 sejteken és HT-29 xenograftokon.
A HT-29 xenograftok esetén a 3 hétig tartó indomethacin és NS-398 kezelések szignifikánsan csökkentették a PGE 2 termelést és a DPD aktivitást a kontrollhoz viszonyítva (6. táblázat). Az NSAID kezelések szignifikáns csökkenést okoztak a HCA-7 sejtek COX-2 mRNS expressziójában a kontrollhoz viszonyítva. Vizsgáltuk, hogy DPD enzimaktivitás csökkenése összefüggést mutat-e az enzim transzkripciójában történt változással. Az NSAID
kezelések
szignifikáns
csökkenést
okoztak
expressziójában a kontrollhoz viszonyítva (16 a és b ábra).
55
a
DPD
enzim
mRNS
DPD/GAPDH arány (kontroll %)
COX-2/GAPDH arány (kontroll %)
b
a 20
10
0 24
40 30 20 10 0 24
48
48
idő (óra)
idő (óra) INDO
NS-398
16. ábra Az indomethacin és NS-398 kezelések hatása a COX-2 és DPD mRNS expressziókra HCA-7 sejteken. a) COX-2/GAPDH mRNS arány változása kontroll %-ban; b) DPD/GAPDH mRNS arány változása kontroll %-ban. A HCA-7 sejteket 24, illetve 48 óráig kezeltük indomethacinnal vagy NS-398-cal.
Ex vivo enzimrendszerben meghatároztuk, hogy az indomethacin és az NS-398 a DPD aktivitást nem gátolják-e közvetlenül. Kezeletlen HCA-7 sejtekből nyert citoszolhoz az NSAID-okat közvetlenül hozzáadtuk és a DPD aktivitás vizsgálatot az „Anyagok és módszerek” fejezetben ismertetett módszer szerint elvégeztük. A DPD aktivitásban nem tapasztaltunk változást. A DPD enzim endogén szubsztrátja az uracil. Vizsgáltuk, hogy a DPD aktivitás csökkenését esetleg az uracil koncentráció NSAID általi fokozódása okozhatja-e feedback mechanizmus útján. A 24 órás indomethacin és NS-398 kezelés után megmértük a HCA-7 sejtek intracelluláris uracil koncentrációját. Az endogén uracil koncentrációja az NSAID kezelések után a kontroll sejtekben mérthez volt hasonló (7. táblázat).
56
7. Táblázat Az NSAID-ok hatása az endogén uracil koncentrációra HCA-7 sejteken. Uracil koncentráció (ng/106 sejt) kontroll
0,57 ± 0,11
indomethacin
0,52 ± 0,08
NS-398
0,53 ± 0,06
Az uracil koncentrációját HPLC módszerrel mértük 24 órás indomethacin, illetve NS-398 kezelések után. A megadott értékek 3 mérés átlaga ± SD.
4.3.5
A COX-2 és a DPD enzimek koexpressziója és befolyásuk az 5-FU hatékonyságára
A COX-2 és a DPD enzimek koexpressziójának vizsgálata kollagén indukált HT-29 sejteken Az alacsony COX-2 expressziót mutató HT-29 sejtekből a transzplantálás után megemelkedett COX-2 expressziót mutató xenograft keletkezett. (ld. 4.1.2. pont) Kérdésként merült fel, hogy a HT-29 xenograftoknál tapasztalt emelkedett COX-2 expresszió kialakulásában szerepe lehet-e az ECM komponenseknek, továbbá hogy a COX-2 indukciója párhuzamosan emelkedett DPD aktivitást is eredményez-e. HT-29 sejteket ECM komponensekkel (fibronekin, laminin, IV típusú humán kollagén) együtt tenyésztettük. A fenti komponensek közül csak a IV-es típusú kollagén indukált COX-2 és DPD expressziót (17. ábra), a fibronektin és a laminin hatástalan volt. A 8. táblázaton bemutatjuk, hogy kollagén hatására a PGE 2 koncentráció és ezzel párhuzamosan a DPD enzimaktivitás, valamint mindkét enzim mRNS expressziója is szignifikánsan fokozódott a stimulált sejtekben (HT-29-C) a kollagén nélkül tenyészett sejtekhez viszonyítva.
57
HT-29
HT-29-C
COX-2
DPD
17. ábra Reprezentatív COX-2 és DPD immunfluoreszcens festés HT-29 és kollagénnel indukált HT-29 (HT-29-C) sejteken. A HT-29 sejteket IV-es típusú kollagénnel bevont felületen inkubáltuk 4 órán át, majd a vizsgálatokat elvégeztük.
8. Táblázat A COX-2 és DPD státusz összehasonlítása kezeletlen és kollagén-indukált HT-29 sejteken (HT-29-C).
DPD aktivitás (pmol/perc/mg protein) PGE 2 koncentráció (pg/ml/106 sejt)
a
HT-29
HT-29-C
9 ± 2,7
17,44 ± 2,87#
ND
50,85 ± 12,3#
Relatív DPD mRNS expresszióa
(8,09 ± 0,4) x 10-3
(2328 ± 464) x10-3 #
Relatív COX-2 mRNS expresszióa
(4,8 ± 1,4) x 10-6
(3624 ± 1221) x10-6 #
ß-aktin mRNS-re vonatkoztatva; # p<0,05 vs. nem indukált sejtek; ND: nem detektálható
58
Az indomethacin és az NS-398 hatása az 5-FU citotoxicitásra HT-29-C sejteken A HT-29 sejtek magas 5-FU érzékenységét és azt az eredményünket, hogy az NSAIDok nem fokozták az 5-FU proliferáció gátló hatását ezen a sejtvonalon, már bemutattuk ezen fejezet 4.1.1 és 4.2.1 pontjában. Jelen kísérletünkben igazolni kívántuk, hogy a kollagénnel indukált COX-2 és DPD expresszió a HT-29-C sejteken csökkenti az 5-FU érzékenységet, miközben az NSAIDok az 5-FU citotoxikus hatását fokozzák. A kezeletlen és a kollagénnel indukált HT-29 sejteket (HT-29-C) 8 órán át kezeltük 10 μM 5-FU-val. A kezeletlen HT-29 sejteknél az 5-FU mérsékelt proliferáció gátlást okozott. Ezt a hatást az NSAID-ok nem befolyásolták. Ezzel szemben a HT-29-C sejteknél az önálló 5-FU kezelés gyakolatilag hatástalannak bizonyult, ugyanakkor az indomethacin 37%-kal, az NS-398 41%-kal fokozta az 5-FU hatását a kontroll sejtekhez viszonyítva (18. ábra). Az eredmények hasonlóak a HCA-7 sejteken az 5-FU + NSAID kombinációknál már korábban megfigyeltekhez, ahol 48 órás kezelés esetén az indomethacin 20%-kal, az NS-398 22%-kal növelte az 5-FU citotoxikus hatását (ld. 6. ábra). Fontos azonban megjegyezni, hogy a HT-29-C sejteknél, ahol indukáltuk a COX-2 és DPD aktivitást, az NSAID-ok már 8 órás kezelés után szignifikánsan fokozzák az 5-FU hatását, szemben a konstitutívan magas COX-2-t és magas DPD-t expresszáló HCA-7 sejtekkel, ahol a szignifikáns hatás létrejöttéhez 48 órás kezelés szükséges. Az 5-FU és az NSAID-ok közötti hatóanyagkölcsönhatást vizsgálva megállapítottuk, hogy a HT-29-C sejteken a kölcsönhatás típusa az 5-FU + indomethacin kombináció esetén R=1,57; az 5-FU + NS-398 kombinációnál R=1,71 azaz 5-FU + NSAID kombinációk esetén mind az indomethacin mind az NS-398 szinergista módon fokozta az 5-FU proliferációgátló hatását.
59
HT-29
sejtproliferáció (kontroll %)
120
120
100
100
80
80
60
60
40
40
20
20
0
0 5-FU
5-FU + indomethacin
HT-29-C
*
*
5-FU + NS-398
18. ábra Az 5-FU ± indomethacin, ill. NS-398 kezelések hatása a HT-29 és kollagénindukált HT-29 (HT-29-C) sejtek proliferációjára. Az 5-FU koncentrációja 10 M, az indomethaciné 10 M, az NS-398-é 1,77 M. A feltüntetett átlagértékek ± SD hat független mérésből származnak; # p< 0,05 vs 5-FU.
4.3.6
Az 5-FU NSAID kezelések hatása a DPD mRNS expresszióra és enzimaktivitásra HT-29-C és HCA-7 sejteken és HT-29 xenografton
A konstitutívan COX-2-t expresszáló HCA-7 és az indukált COX-2-t expresszáló HT29-C sejteken bemutattuk, tattuk, hogy az NSAID-ok fokozzák az 5-FU hatékonyságát. Vizsgálni kívántuk, hogy a korábban megfigyelt, az NSAID-ok által okozott DPD aktivitás és mRNS expresszió csökkenés (ld. 7. táblázat és 16. és 17.ábra) az 5-FU+ NSAID kezelésben is megnyilvánul-e. A HT-29-C sejtekben az 5-FU kezelés szignifikánsan csökkentette a DPD mRNS expressziót (p<0,01). Ezt a hatást az NSAID-ok fokozták (p<0,05 vs 5-FU). A HCA-7 sejtek esetében a DPD mRNS expresszió nem csökkent szignifikánsan az 5-FU hatására, azonban az indomethacin, ill. az NS-398 szignifikánsan fokozta az 5-FU DPD mRNS expressziót csökkentő hatását (p<0,05). E hatás tekintetében a két NSAID között nem volt különbség. A DPD enzimaktivitást az 5-FU önmagában mindkét sejtvonalon csak mérsékelten, nem szignifikáns módon csökkentette, ugyanakkor az indomethacin,
60
illetve az NS-398 kombináció hatására DPD aktivitás csökkenés jelentős, erősen szignifikáns volt (9. táblázat). HT-29 xenograftokon a 6 mg/kg/nap dózisú 5-FU szignifikánsan csökkentette a DPD enzimaktivitást a kezeletlen kontrollhoz képest. Ezt az enzimaktivitás csökkentő hatást az indomethacin és az NS-398 szignifikánsan fokozta. A kombináció által okozott DPD aktivitás gátlás összevethető volt a 30 mg/kg dózisú 5-FU által okozott aktivitás csökkentéssel (19.ábra).
9. Táblázat A DPD státusz változása 5-FU ± NSAID kezelés hatására kollagén indukált HT-29 (HT-29-C) és HCA-7 sejteken. HT-29-C sejtek
HCA-7 sejtek
mRNS
enzim
mRNS
enzim
expresszióa
aktivitásb
expresszióa
aktivitásb
kontroll
2,3 ± 0,5
17,4 ± 2,9
10,4 ± 3,7
99,6 ± 13,1
5-FU
0,9 ± 0,08*
14,6 ± 3,6
9,6 ± 1,4
90,2 ± 1,7
0,06 ± 0,04#
5,1 ± 1,6#
1,2 ± 0,4#
54,3 ± 7,6#
0,005 ± 0,004#
5,9 ± 1,1#
0,6 ± 0,07#
55,0 ± 6,3#
5-FU + indomethacin 5-FU + NS-398
A HT-29 sejteket 10 M 5-FU-val önmagában, illetve 10 M indomethacinnal vagy 1,77 M NS-398-al kombinálva kezeltük. A HCA-7 sejteket 1 mM 5-FU-val önmagában ill. 10 M indomethacinnal vagy 1,77 M NS-398-al kombinálva kezeltük. a referenciaként a ß-aktin mRNS-t használtuk; b pmol/perc/mg protein, * p<0,01 vs kontroll; # p<0,05 vs 5-FU.
61
DPD aktivitás (kontroll %)
a
100
*
80
*
*
#
##
b 100 80
60
60
40
40
20
20
0
0
5-FU
5-FU + indomethacin
*
*
*
5-FU + NS-398
19. ábra Az 5 napos 5-FU + NSAID kezelés hatása a HT-29 xenograftok DPD aktivitására. a) 6 mg/kg/nap 5-FU; b) 30 mg/kg/nap 5-FU. Az állatokat 5 napig kezeltük, a DPD enzimaktivitást (pmol/perc/mg fehérje) radioenzimatikus módszerrel mértük. * p<0,001 vs kontroll, # p< 0,05 vs 5-FU, ## p<0,01 vs 5-FU.
62
5. Megbeszélés
A vastagbélrák kezelésében alkalmazott gyógyszerek köre az elmúlt évtizedekben jelentősen kibővült, de továbbra is az 5-fluorouracil képezi ezen daganattípus terápiájának gerincét. Az 5-FU hatását, nukleotidokká történő aktiválása után a timidilát szintáz enzim gátlásával, a DNS- és az RNS-be való beépülésével fejti ki. Az alkalmazott 5-FU dózis több mint 80 %-a azonban a DPD enzim által lebontásra kerül. Az elmúlt 2 évtizedben számos hatóanyag alkalmazásával próbálták fokozni az 5-FU citotoxikus hatását, többek között leukovorinnal, DPD gátlószerekkel, -interferonnal vagy antioxidánsokkal. Számos patofiziológiás folyamatban igazolták a COX-2 overexpresszióját, többek között különböző daganatokban, például emlő-, tüdő-, nyelőcső- és vastagbélrákokban. A COX-2 (döntõen a képzõdõ PGE 2 révén) a multifaktoriális carcinogenesis folyamatát számos helyen befolyásolhatja, szerepet játszik a daganatos progresszióban, az apoptózis rezisztenciában, az angiogenezisben valamint a tumorinvázióban és a metasztázisképzésben.
Több
daganattípus
esetében
összefüggést
találtak
a
megnövekedett COX-2 expresszió és a tumorterjedés, nyirokcsomó metasztázisok, rövidebb progresszióig eltelt idő, valamint a teljes túlélés között. Kapcsolat van továbbá a megnövekedett intratumorális COX-2 expresszió és a kemo/radioterápiával szembeni rezisztencia között is. Mindezeken túl a COX-2 túlzott expressziója gyakran társul olyan rossz prognosztikai faktorokkal, mint a HER-2 az emlőrákban, vagy mint a VEGF expresszió nem kissejtes tüdőrák környező szöveteiben, amelyek már önmagukban is a rosszabb túlélést vetítik elő. Az aszpirin, vagy más nem-szteroid gyulladáscsökkentők hosszú időn át tartó és rendszeres használata 30-50%-al csökkentheti a colorectális rák rizikóját, az adenomatózus polipok számát és méretét valamint a daganatos halálozást. Az NSAIDok kemopreventív hatása elsősorban a COX gátlásnak és következményesen a prosztaglandin szint csökkenésének tulajdonítható. Számos experimentális munkában azt találták, hogy az NSAID-ok fokozták a hagyományos kemoterápiás szerek citotoxikus hatását, ugyanakkor, a klinikai
vizsgálatok nem igazolták egyértelműen az NSAID-ok és a kemoterápiás szerek kombinációjának fokozott hatékonyságát. Ennek egyik lehetséges oka, hogy nem minden esetben vizsgálták az intratumorális COX-2 expressziót és annak összefüggését a terápiás hatás kialakulásával. Munkánkban célul tűztük ki a COX-2 expresszió és az 5-FU citotoxikus hatása közötti összefüggés vizsgálatát, valamint az 5-FU és a COX-2 aktivitást gátló koncentrációban alkalmazott
indomethacin,
illetve
NS-398
kombinált
kezelések
hatásának
tanulmányozását alacsony és magas COX-2 expressziót mutató humán colon adenocarcinoma sejtvonalakon és xenograftokon. Vizsgálataink első lépéseként az alkalmazott HCA-7 és HT-29 sejtvonalak 5-FU szenzitivitást befolyásoló farmakogenetikai és farmakobiokémiai tulajdonságait állapítottuk meg. Az 5-FU elsődleges célpontja a timidilát szintáz. Az enzimet kódoló gén két, általunk is vizsgált, polimorfizmusa saját és irodalmi adatok alapján is befolyásolja az 5-FU érzékenységet.
34,
37
A HCA-7 sejtvonal igen mérsékelt
érzékenységet mutatott az 5-FU-val szemben (IC 50 =1,1 mM). Az eredmények összefüggést mutattak a farmakobiológiai paraméterekkel, azaz a 5’TSER 3R homozigóta, az MTHFR 677 heterozigóta genotípus és a magas DPD enzimaktivitás feltételezhetően hozzájárul a HCA-7 sejtek 5-FU-val szemben mutatott csökkent érzékenységéhez. HT-29 sejtek esetében a 5’TSER régióban talált 2R/2R genotípus, valamint a gén 3’UTR régiójában megfigyelt 6bp/6bp homozigóta genotípus az alacsonyabb TS expressziót és magasabb 5-FU érzékenységet jelzik (IC 50 =10 μM). 72 Etienne és mtsai kimutatták, hogy a 5’TSER 3R homozigóta genotípus magasabb TS aktivitást és az 5-FU-val szemben csökkent választ eredményez, szemben a 2R homozigóta genotípussal.
37
Az MTHFR 677 T homozigóta (mutáns) eseteiben az
enzimaktivitás 30%-ra csökken, így felhalmozódik az MTHF, amely a timidilát de novo bioszintézis kofaktora. A megemelkedett intracelluláris MTHF-szint 5-FU kezelés esetén elősegíti a ternier komplex képződését, ezáltal megnövelve a gyógyszer citotoxikus hatását. 37,73 A HCA-7 sejtekben megfigyelt magas COX-2 expresszió és enzimaktivitás megfelelt az irodalmi adatoknak,
74
ugyanakkor a HT-29 sejtekben alacsony COX-2 expressziót
64
figyeltünk meg. Említésre érdemes, hogy a HT-29 sejtek COX-2 expressziójával kapcsolatos irodalmi adatok nem konzekvensek.74, 75 A HT-29 xenograftok esetén a megemelkedett COX-2 expresszió irodalmi adatok alapján összefüggésbe hozható az epitél és a strómális sejtek közötti kölcsönhatásokkal, 76
valamint a COX-2 indukciójában különböző extracelluláris mátrixkomponensek
szerepe is feltételezhető 77, 78 Bár
több
munka
is
foglalkozik
a
különböző
tumortípusokban
megfigyelt,
megemelkedett COX-2 expresszióval és kedvezőtlen prognosztikai értékével, a COX-2 expresszió hatását a kemoterápiára adott tumorválaszban még kevéssé tanulmányozták. Eredményeink szerint a konstitutív COX-2 expressziót mutató HCA-7 sejtvonalon, a kollagén indukált HT-29 sejteken (HT-29C) és a HT-29 xenografton megfigyelt magas COX-2 expresszió összefüggésbe hozható a csökkent 5-FU érzékenységgel. Takaoka és mtsai munkájukban összefüggést mutattak ki a magas COX-2 expresszió és a ciszplatinrezisztencia között, ugyanakkor nem találtak különbséget az alacsony és a magas COX-2 expressziót mutató sejtek 5-FU érzékenysége között.
79
Más szerzők a
COX-2 expresszió és az irinotecánnal szemben mutatott csökkent érzékenység között találtak kapcsolatot. 80 A fentiek alapján feltételezhető, hogy a magas COX-2 expresszió egyéb kemoterápiás szerek hatását is befolyásolja. Mivel a jelenség tisztázása a terápiás protokolok optimalizálása szempontjából is fontos lehet, így minden bizonnyal a közeljövőben további publikációk várhatóak ezzel kapcsolatban. Saját eredményeink szerint a COX-2 enzimaktivitás gátlásához szükséges dózisban alkalmazott indomethacin és NS-398 fokozta az 5-FU proliferációgátló hatását a COX-2 expressziót mutató HCA-7 és HT-29-C sejteken. A HT-29 xenograftokban szintén magas COX-2 expressziót figyeltük meg és az alacsony dózisú rövidtávú NSAID kezelés ebben az esetben is fokozta a kis dózisban alkalmazott 5-FU citotoxikus hatását. Említésre érdemes, hogy a nem-szelektív COX-2 gátló indomethacin és a szelektív COX-2 gátló NS-398 hatása a rövid távú kezelések esetén nem különbözött szignifikánsan egymástól. Számos experimentális munkában tanulmányozták az NSAID-ok és a kemoterápiás szerek kombinációjának hatékonyságát, pl. a flurbiprofen vagy az indomethacin kombinációját methotrexáttal ill. melfalannal, vagy az indomethacin kombinációját 65
vincristinnel és doxorubicinnal.10, 47, 81 Ugyanakkor kevesebb olyan publikáció található, amelyben alacsony dózisú NSAID-ok és az 5-FU kombinációjának hatását vizsgálták. Alacsony koncentrációban (2,8 μM) alkalmazott indomethacin a konstitutív COX-2 expressziót mutató Colon-26 sejteken szignifikánsan csökkentette (~60%) az 5-FU IC 50 értékét. Más szerzők, a SKG-2 és HKUS humán méhnyakrák sejtvonalakon tapasztaltak hasonló eredményt: 0,3 μM indomethacin szignifikánsan fokozta az 5-FU citotoxikus hatását: 72% ill. 63%-os az IC 50 érték csökkenés.
82
Mizutani és mtsai munkájában a
szelektív COX-2 gátló, JTE-522, fokozta az 5-FU citotoxikus hatását a COX-2 expressziót mutató 83 T24 és HT1197 húgyhólyag sejtvonalakon. 84 Másfelől, humán tüdő adenokarcinóma sejtvonalakon (DLKP, A549, COR L23P, COR L23R, HL60/ADR, 76-2 és 77-4), az alacsony dózisú indomethacin (5,6-7 μM) nem fokozta az 5-FU citotoxicitását. 45, 85, 86Meg kell jegyezni azonban, hogy az irodalomban nem található utalás a fenti tüdőrák sejtvonalak COX-2 expressziójára, kivéve az A549 sejtvonalat, amely nem expresszál COX-2-t.
87
Eichele és mtsai hasonló eredményre
jutottak HeLa humán méhnyakrák sejtvonalakon, az alacsony dózisú (1 μM) NS-398, nem befolyásolta a ciszplatin, paclitaxel ill. az 5-FU hatékonyságát. Érdemes itt is megjegyezni, hogy a HeLa sejtvonal szintén nem expresszál COX-2-t. 88 A fent említett szerzők munkáinak eredményei szintén arra engednek következtetni, hogy a COX-2 expresszió és az 5-FU érzékenység között összefüggés van. Az NSAIDok hatását az 5-FU citotoxicitásra in vivo is bizonyították. Senzaki és mtsai munkájában a szelektív COX-2 inhibitor, CS-706, fokozta a ciszplatin és az 5-FU tumorellenes hatását.
89
Más szerzők a szelekív COX-2 gátló, JTE-522, és az S-1 kombinált kezelés
hatékonyságát bizonyították OCUM-2MD3 sejtekből kialakított xenograft modellen. 90 Munkánkban a hatóanyag-kölcsönhatás meghatározásával kapott eredményeink is alátámasztották az NSAID-ok 5-FU potencírozó hatását. Az NSAID-ok fokozták az 5FU citotoxikus hatását a magas COX-2 expressziót mutató HCA-7 és HT-29-C sejtekben és HT-29 xenograftokban. Bár az irodalomban több értékelési mód is ismert a hatóanyagkombináció vizsgálatára, így pl. a klasszikus izobologram módszer, vagy a Chou és Talalay által kidolgozott képlet, ezek azonban elsősorban akkor használhatók, ha mindkét hatóanyagnak van citotoxikus hatása, vagy dózishatás görbéje. 91 Mivel a 48 órás és az 5 napos kezelések során az indomethacin, és az NS-398 az alkalmazott koncentrációban nem befolyásolta a proliferációt, így a Kern és mtsai által kidolgozott
66
képletet használtuk.
68
Számításaink szerint magas COX-2 expresszió esetén a
kölcsönhatás típusa erősen szinergista, míg az alacsony COX-2 expressziót mutató HT29 sejtek esetén a kölcsönhatás a gyengén antagonista és az additív hatás között volt. Érdekes eredménynek tartjuk, hogy az alacsony dózisú indomethacin és NS-398 önmagában hosszú távú kezelés során (HCA-7 sejtek esetén 10 napos, HT-29 xenograft esetén 3 hetes) szignifikáns csökkenést okozott a proliferációban, illetve a tumornövekedésben. Eredményünk összhangban van más szerzők megállapításaival: Minter és mtsai kimutatták, hogy 12 napig tartó 5 μM NS-398 kezelés szignifikáns proliferációgátlást okozott a kontrollhoz viszonyítva a COX-2-t expresszáló H357 fejnyakrák sejteken.
92
Eli és mtsai tüdő carcinóma xenografton 25 napos, 2 mg/kg/nap
dózisú indomethacin kezelés után,
65
ill. Matsuo és mtsai humán glioma xenografton
három hetes, 5 mg/kg/nap dózisú NS-398 kezelés után
93
szignifikáns tumornövekedés
gátlást tapasztaltak. Mivel a HCA-7 sejtek és HT-29 xenograftok rövidtávú NSAID kezelése során nem tapasztaltunk szignifikáns csökkenést a sejtproliferációban a hosszútávú kezelés kapcsán általunk megfigyelt proliferációgátlás valószínűleg inkább a COX-2 krónikus gátlásán keresztül valósul meg, mint más COX-független mechanizmusok révén. Ezzel az elképzeléssel összhangban van az a megfigyelésünk is, hogy a hosszútávú NSAID kezelések proliferációgátló hatását tekintve az NS-398 szignifikánsan hatékonyabb volt, mint az indomethacin. A proliferációgátlás lehetséges okaként Minter és mtsai az NSAID-ok által okozott arahidonsav felhalmozódást említik,
92
amely stimulálva a
szfingomielin-ceramid átalakulást, apoptózishoz vezet. 94 További vizsgálataink során arra a kérdésre kerestük a választ, hogy milyen más mechanizmusok játszhatanak még szerepet az 5-FU + NSAID kombinált kezelések fokozott hatásában. Méréseink azt igazolták, hogy az 5-FU + NSAID kezelés után, mind a HCA-7, mind a HT-29 sejtek esetében az S-fázisban lévő sejtek aránya megnőtt a kezeletlenekhez képest. A HT-29 sejtek esetében az akut apoptózis hiányát szintén megfigyeltük. Peták és mtsai szerint a mutáns p53 gént hordozó sejtekben az 5-FU kezelés az S fázis felhalmozódásával és az akut apoptózis elmaradásával jár.
95
Irodalmi adatok alapján a
HT-29 sejtek a p53 gén szempontjából mutáns homozigóta genotípusúak, ami inaktív
67
fehérjét eredményez. genotípusúak,
97
96
Ugyanakkor, a HCA-7 sejtek p53 mutáns heterozigóta
ami összefüggést mutat azon eredményeinkkel, miszerint a HCA-7
sejteken az 5-FU csak mérsékelt S fázis felhalmozódást, valamint a HT-29 sejtekhez képest fokozott apoptózist okozott. Több vizsgálatban is kimutatták, hogy az NSAID kezelések a sejtek G0/G1 fázisban való felhalmozódását okozzák. Fontos kiemelni, hogy az NSAID kezelések ezen hatását az irodalomban főként magas, a COX-2 aktivitás gátlásához szükségesnél nagyobb, koncentrációban való alkalmazásuk esetén figyelték meg.
98
Az általunk használt
alacsony dózisú NSAID-ok az S fázis felhalmozódását okozták a kontrollhoz képest, ami azt látszik bizonyítani, hogy az alacsony és a magas NSAID dózisok más mechanizmusokon keresztül fejtik ki sejtciklusgátló hatásukat. Meade és mtsai kimutatták, hogy az NSAID-ok a COX-2 gátlása révén növelik az intracelluláris arahidonsav mennyiségét, őssejtekben,
100
99
amely S fázis felhalmozódást eredményez embrionális
valamint, a korábban már említettek szerint, a szfingomielin-ceramid
átalakulást stimulálva apoptózishoz vezet.
94
Vizsgálatainkban az alacsony dózisú
NSAID-okkal kezelt HCA-7 sejtekben S fázis felhalmozódást találtunk. Eredményeinkhez hasonlóan más szerzők is beszámolnak az alacsony dózisú indomethacin 5-FU citotoxicitást fokozó hatásáról, amelynek okaként több lehetséges mechanizmust jelölnek meg: Ogino és Hanazono munkájukban bemutatták, hogy az indomethacin fokozta az 5-FU intracelluláris koncentrációját. Feltételezésük szerint az indomethacin megváltoztatja a zsírsavösszetételt a tumorsejtekben ezáltal befolyásolva a membránfluiditást és permeabilitást, ami hatással lehet az 5-FU sejtekbe történő bejutására. 48 Oguri és mtsai szerint, a MRP8/ABCC11 multidrug-rezisztencia-fehérje a nukleotid analógokat és az 5-fluoro-2’-deoxiuridin-5’-monofoszfátot (FdUMP) kipumpálja, 101 így az MRP8 közvetlenül felelős az 5-FU rezisztenia kialakulásáért. Chen és mtsai munkájukban bizonyították, hogy 10 M indomethacin 30%-kal képes csökkenteni az MRP8 mediált transzportot.
102
Ezen eredmények szerint, az alacsony dózisban
alkalmazott NSAID-ok azáltal fokozzák az intracelluláris 5-FU koncentrációját és ezzel a citotoxicitását, hogy gátolják az MRP8 mediált 5-FU effluxot.
68
Irodalmi adatok alapján ismeretes, hogy az NSAID-ok a COX-2 enzimaktivitás gátlásához szükségesnél magasabb dózisokban gátolják a proliferációt és apoptózist indukálnak.
103
Vizsgálatainkban HCA-7 sejteken a 48 órás indomethacin, illetve NS-
398 kezelés után a COX-2 expresszió gyakorlatilag nem változott, amely összevethető más szerzők eredményeivel. 104 Az NSAID-ok a COX-2 aktivitás gátlása révén a PGE 2 koncentrációját szignifikánsan csökkentették, azonban nem okoztak proliferációgátlást. Az 5-FU + NSAID kezelések után az NSAID-ok szignifikánsan fokozták az 5-FU proliferációgátló hatását. Érdekes megfigyelésnek tartjuk, hogy az 5-FU + NSAID kombinált kezelések hatékonyságát befolyásolta az NSAID kezelések időtartama és sorrendje is: HCA-7 sejteken 48 órás kezelés első 24 órájában alkalmazott indomethacin vagy NS-398-al szignifikánsan jobb 5-FU hatást lehetett elérni, mint ha azokat a kezelés második 24 órájában adtuk volna. A HT-29 sejtekből kialakított xenograftokban szintén megfigyeltük, hogy az alacsony dózisú indomethacin és NS-398 önmagában 5 napos kezelés után nem okozott tumornövekedés gátlást, a kis dózisban alkalmazott 5-FU citotoxikus hatását viszont szignifikánsan fokozta. Megemlítendő továbbá, hogy az NSAID valamint az 5-FU + NSAID kezelések után gyakorlatilag változatlan maradt a COX-2 expresszió. Bár a HT29 xenograftokból is végeztünk PGE 2 koncentrációmérést, a tumorok kis mérete miatt az eredmény nem volt konkluzív. Feltételezhető azonban, hogy az NSAID kezelések hatására a PGE 2 koncentráció csökkenése a HCA-7 sejteknél tapasztaltakhoz volt hasonló. Jól ismert, hogy az 5-FU hatékonyságát nagymértékben a metabolikus aktiválás és az azt követő TS-gátlás határozza meg, mégis a citotoxikus hatás kialakulásában szignifikáns szerepet játszik a vegyület igen gyors, a DPD enzim általi katabolikus inaktiválása is. Az osztályunkon, klinikai beteganyagon folytatott vizsgálatok a DPD szerepét igazolták az 5-FU toxicitásának, farmakokinetikájának és a kezelés hatékonyságának befolyásolásában. 105 Választ kerestünk tehát arra a kérdésre, hogy az alacsony dózisú NSAID-ok esetleg befolyásolják-e az 5-FU lebontását, a katabolizmus első, sebesség-meghatározó enzimének, a DPD-nek módosítása útján. A magas COX-2 expressziót mutató HCA-7 sejteken az indomethacin és NS-398 szimultán csökkentette a COX-2 és a DPD aktivitását, amely már 24 órás NSAID kezelés után megfigyelhető volt. Azt a korábban említett eredményünket, - miszerint az
69
NSAID kezelések időtartama és sorrendje befolyásolja az 5-FU proliferációgátló hatását -, magyarázhatja az NSAID kezelések hatására igen gyorsan jelentkező DPD aktivitás csökkenés. A két enzim szimultán csökkenése felvetette a kérdést, hogy indukció hatására párhuzamos emelkedésük is kimutatható-e. Ennek vizsgálatára HT-29 sejtekben kollagénnel indukáltuk a COX-2 expressziót, amelynek eredményeként a COX-2 változásával párhuzamosan a DPD fehérje és mRNS expressziója, valamint enzimaktivitása is emelkedett az indukált HT-29-C sejtekben az eredeti sejtekhez képest. A fenti két független vizsgálatban megfigyelt párhuzamos esemény felveti a két enzim koexpressziójának lehetőségét, amelyet alátámaszt az a tény, hogy HCA-7 sejtek és HT-29 xenograftok esetén a magas COX-2 aktivitás mellett magas DPD aktivitást, HT-29 sejteknél viszont alacsony COX-2 és DPD aktivitást figyeltünk meg. A IV-es típusú kollagén által indukált COX-2 expressziót már más szerzők is leírták, miszerint HUVEC sejteken a különböző ECM komponensek, míg epitél sejteken az I és IV típusú kollagén COX-2 expressziót okoznak.
77,78
Ugyanakkor, az irodalomban nem
találtunk olyan publikációt, amely az ECM komponensek által indukált jelátvitel és a DPD expresszió közötti összefüggést írna le. Ismeretes, hogy a DPD enzimaktivitás az 5-FU citotoxicitásának befolyásolása miatt régóta a figyelem középpontjában van, viszont kevés irodalmi adat található a DPD szabályozásával kapcsolatban. Ugyanakkor egyre több szerző számol be arról, hogy nem csak az ismert DPD-gátló szerek befolyásolhatják az enzimaktivitást, hanem a jelátvitel mechanizmusát módosító hatóanyagokkal (TRAIL, IFN) történő kezelés is. 106, 107
Zhao és mtsai nem régen publikált munkájukban az 5-FU és egy bioaktív flavonoid, az oroxilin A, szinergisztikus hatásáról számoltak be in vitro és in vivo. A kombinált kezelés szignifikánsan csökkentette a DPD mRNS expresszióját az önálló 5-FU kezeléshez viszonyítva. Fontos tény, hogy az oroxilin-A egyéb hatásai mellett gátolja a lipopoliszacharid-indukált COX-2 expressziót is. 108 Az NSAID-ok esetleges, közvetlen DPD gátló hatásának vizsgálatára azokat közvetlenül a citoszólhoz adva nem tapasztaltunk DPD aktivitás csökkenést, tehát az NSAID-ok nem közvetlenül, hanem közvetve, valamely jelátviteli útvonalon keresztül befolyásolják a DPD aktivitást.
70
A 20. ábrán megpróbáltuk összefoglalni és összefüggéseiben ábrázolni azokat az általunk lehetségesnek vélt mechanizmusokat, amelyek magyarázhatják a COX-2 és a DPD koexpresszióját, illetve, hogy miként okozhatnak az NSAID-ok a COX-2 mellett DPD enzimaktivitás gátlást is.
S
G2/M
hibás beépülés a DNS-be
TS MTHF
DHF TMP
dUMP
DHFR THF COX-2
DPYD
NSAID-ok
Sp-1
uracil / 5-FU
H2U / H2FU DPD
NADPH
NADP+ ATP
ADP ANT
G6PDH
20. ábra Az NSAID-ok lehetséges célpontjai és hatásmechanizmusai a DPD aktivitás gátlás szempontjából 5-FU, 5-Fluorouracil; ADP, adenozin difoszfát; ANT, adenozin nukleotid transzlokáz; ATP, adenozin trifoszfát; COX-2, ciklooxigenáz-2; DHF, dihidrofolát; DHFR, DHF reduktáz; DPD, dihidropirimidin dehidrogenáz; DPYD, DPD gén; G6PDH, glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz; H 2 FU, dihidrofluorouracil; H 2 U, dihidrouracil; MTHF, metiléntetrahidrofolát; NADP/NADPH, nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát; NSAID, nem-szteroid gyulladáscsökkentő; SP-1, specifikus protein 1; THF, tetrahidrofolát; TMP, timidin-monofoszfát; TS, timidilát szintáz; UMP, uridin-monofoszfát
71
Bár a DPD gén (DPYD) transzkripciós és transzlációs szabályozása kevéssé tanulmányozott, Zhang és mtsai azt találták, hogy az Sp-1 transzkripciós faktor kötődik a DPYD gén promóteréhez, és aktiválja a DPD transzkripciót. 109 Ismert, hogy a COX-2 promóter régió több transzaktiváló elemet tartalmaz, amelyek számos transzkripciós faktor kötőhelyei, mint amilyen az Sp-1 is. Ugyanakkor a PGE 2 képes aktiválni az Sp1-et.
110
Említésre méltó, hogy az NSAID-ok aktiválják az Sp-1 proteoszóma-függő
lebontását. 111 A fentiek alapján elképzelhető, hogy az Sp-1-en keresztül valósul meg a COX-2 és a DPD közötti kapcsolat. A két enzim koexpresszióját mutató eredményeinket, illetve a fenti feltételezést Takahra és mtsai azon megfigyelése is alátámasztja, miszerint HSC sejtek 3 dimenziós, I-es típusú kollagént tartalmazó tenyészetében az Sp1 transzkripciós faktor expressziója megnőtt. 112 Az NSAID-ok befolyásolják a glükóz lebontás alternatív útvonalát, a pentóz-foszfát ciklust is. A glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz (G6PDH) gátlása révén csökkentik a NADPH mennyiségét, alakítása során.
114
113
amely a DPD kofaktora az uracilnak 5,6-dihidrouracillá
Így a lecsökkent NADPH szint szintén befolyásolhatja a DPD-t.
Továbbá az NSAID-ok befolyásolják a sejtek energiametabolizmusát azáltal, hogy lecsökkentik az adenozin nukleotid transzlokáz (ANT) aktivitását, ATP átalakítást végzi,
116
115
amely az ADP-
így az alacsonyabb ATP szint szintén hozzájárulhat az
alacsonyabb NADPH szint kialakulásához. Több NSAID esetében azt találták, hogy kompetitiven gátolják, a folsavat tetrahidrofolsavvá redukáló, dihidrofolát reduktázt (DHFR),
117
mely folát deficienciát
és a dezoxi-uridin monofoszfát (dUMP) relatív növekedését okozza. Az dUMP a TS enzim szubsztrátja. A magas dUMP szint indukálja saját katabolizmusát, ezáltal növelve az uracil szintjét. 118 Ugyanakkor Mashiyama és mtsai munkájukban bemutatták, hogy a folát deficiencia a sejtproliferáció lelassulását vagy megakadását, valamint S-fázis felhalmozódását okozza és megnöveli az uracil nukleotidok hibás beépülését a DNS-be. 119
Ily módon, a fenti két folyamat, - az dUMP szint megemelkedése a folát hiány miatt,
illetve lecsökkenése a DNS-be való beépülés miatt -, az uracil szint szempontjából egymással ellentétesen hathat, és esetleg magyarázhatják eredményeinket, mivel az NSAID-ok hatására megnövekedett az S-fázisú sejtek aránya, ugyanakkor nem változott az endogén uracil szintje a kezeletlen sejtekhez képest. Így megállapítható, hogy az NSAID-ok által okozott DPD aktivitáscsökkenés nem az endogén uracil szint változásának következménye.
72
Mivel a DNS szintéziséhez, sejtszaporodáshoz és regenerációhoz szükséges timidilát de novo bioszintézisében szerepe van a DHFR-nek, az az eredményünk, miszerint a HCA7 sejteken és a HT-29 xenograftokon a hosszú távú indomethacin és NS-398 kezelések szignifikánsan csökkentették a proliferációt és a tumornövekedést, elméleti megfontolás alapján magyarázható a DHFR gátlással is. A DPD enzim aktivitás csökkenése mellett vizsgáltuk, hogy az NSAID-ok befolyásolják-e a DPD mRNS expresszióját. Az irodalmi adatokkal összhangban összefüggést találtunk a DPD aktivitás és az mRNS expresszió között, 120, 121 ugyanis HCA-7 sejtek esetén a 24 és 48 órás indomethacin ill. NS-398 kezelések egyaránt csökkentették a DPD enzim aktivitását és az mRNS expressziót. A DPD enzimaktivitás 105
ill. mRNS expresszió 122 prognosztikai értékét az 5-FU-alapú kemoterápiával kezelt
betegek esetében már bizonyították. Más szerzők viszont nem találtak összefüggést a DPD aktivitás, fehérje és mRNS expresszió között. Az ellentmondás valószínűleg a vizsgálatokban alkalmazott különböző mérési módszerekre vezethető vissza. 123 Megemlítendő, hogy munkánkban mindkét modellrendszerben az 5-FU kezelés önmagában is egyaránt csökkentette a DPD enzimaktivitást. Az irodalmi adatok az 5FU-nak a DPD aktivitását csökkentő hatásával kapcsolatosan nem egyértelműek. 124, 125, A jelenség tisztázására további vizsgálatok szükségesek. A magas COX-2 expessziót mutató HCA-7 és HT-29-C sejteken és HT-29 xenograft tumorokon egyaránt az 5-FU + NSAID kombinált kezelések hatására a DPD enzim aktivitása és mRNS expressziója szignifikánsan lecsökkent az önálló 5-FU kezeléshez viszonyítva. Az indomethacin és NS-398 által okozott szimultán COX-2 és DPD enzimaktivitás gátlás magyarázhatja az 5-FU citotoxikus hatásának fokozódását és felveti a nemszteroid gyulladásgátlók 5-FU modulátorként való alkalmazásának lehetőségét elsősorban a COX-2-t magasan expresszáló vastagbél daganatokban.
73
6. Következtetések, új megállapítások
A HCA-7 és HT-29 colon tumorsejtek és xenograftok esetén fordított összefüggés van a COX-2 expresszió és az 5-fluorouracil érzékenység között, amely felveti annak szükségességét, hogy a kemoterápiák tervezésekor vegyék figyelembe a tumorok COX-2 státuszát. Az indomethacin és NS-398 szignifikánsan fokozták az 5-FU érzékenységet és a citotoxikus hatást magas COX-2 expressziót mutató sejtvonalakon és xenograft modellen. Tanulmányunkban
elsőként
figyeltük
meg
a
COX-2
és
DPD
enzimek
koexpresszióját sejtvonalakon és xenografton, amelyet modellkísérletben is bizonyítottuk, mivel HT-29 sejteken kollagén IV hatására a COX-2 indukciója párhuzamosan emelkedett DPD aktivitást eredményezett. További vizsgálatok szükségesek, hogy megerősítsük megfigyelésünket, továbbá, hogy a két enzim koexpressziójának mechanizmusát feltárjuk. A indomethacin és NS-398 a COX-2 gátlása mellett csökkenti az 5-FU lebontásában jelentős szerepet játszó DPD enzim aktivitását, ami korrelációt mutat az 5-FU hatékonyság fokozódásával. A hatásmechanizmus tisztázása érdekében további kutatás szükséges. Az indomethacin és NS-398 által okozott szimultán COX-2 és DPD enzimaktivitás gátlás magyarázhatja az 5-FU citotoxikus hatásának fokozódását, és felveti a nemszteroid gyulladásgátlók 5-FU modulátorként való alkalmazását elsősorban a COX-2-t magasan expresszáló daganatokban.
74
7. Összefoglalás A fokozott COX-2 expresszió számos úton befolyásolja a tumorok kialakulását és progresszióját. A COX-2 overexpresszió a sporadikus colorectális carcinomák 80%-ban igazolható. A COX-2 enzim a nem-szteroid gyulladásgátlók legismertebb molekuláris célpontja. A colorectális rák gyógyszeres kezelésének alappillérét több mint 40 éve az 5-fluorouracil jelenti. Az 5-FU terápiás hatásának fokozására számos törekvés irányul más gyógyszerekkel, illetve biomodulátorokkal. Az 5-FU a szervezetbe kerülve az aktiválás mellett igen gyors katabolizmuson megy keresztül. A lebomlás első, sebességmeghatározó
enzime
a
dihidropirimidin-dehidrogenáz
(DPD).
Az
intratumorális DPD hamar a klinikai érdeklődés középpontjába került, mivel az emelkedett DPD aktivitás az 5-FU citotoxikus hatásának csökkenését okozhatja. A disszertáció alapját képező kísérleteink legfőbb célja a COX-2 gátlók és az 5-FU kombinált kezelések hatásának vizsgálata kísérleti rendszereken. Ehhez HCA-7 és HT29 humán colon adenocarcinoma sejtvonalakat és HT-29 sejtekből kialakított xenograftokat használtunk. Kísérleteink során vizsgáltuk, hogy a magas COX-2 expresszió, valamint a COX-2 expresszió gátlása nem-szelektív COX-2 gátló indomethacinnal és szelektív COX-2 gátló NS-398-al befolyásolja-e az 5-FU citotoxikus, illetve tumorgátló hatását. Továbbá, hogy a 5-FU hatékonyságának NSAID-ok útján történő fokozásában milyen mechanizmusok játszanak szerepet. Eredményeink alapján elmondható, hogy a COX-2 expresszió befolyásolja az 5-FU kezeléssel szemben mutatott érzékenységet HCA-7 és kollagén indukált HT-29 sejtekben, valamint HT-29 xenograftokban, amelynek valószínűsíthető oka elsősorban a COX-2 és a DPD enzimek koexpressziója. Az indomethacin és NS-398 szignifikánsan és szinergista módon fokozta az 5-FU érzékenységet és a citotoxikus hatást magas COX-2 expressziót mutató sejtvonalakon és xenograft modellen azáltal, hogy a COX-2 aktivitás csökkentése mellett párhuzamosan gátolta a DPD enzim mRNS expresszióját és aktivitását. Mindez a továbbiakban felveti olyan átfogó, nagy betegszámú prospektív klinikai vizsgálat szükségét, amelyben az 5-FU-alapú kemoterápiák esetén a tumorok COX-2 státusza mellett figyelembe vennék a daganatos fájdalmak vagy egyéb okokból alkalmazott nem-szteroid gyulladásgátlók alkalmazását.
8. Summary The elevated cyclooxygenase-2 (COX-2) expression has been shown to affect the carcinogenesis and tumor progression processes. COX-2 is overexpressed in approximately 80% of sporadic colorectal carcinomas and is the best defined target of non-steroidal anti-inflammatrory drugs (NSAIDs). In the chemotherapy of colorectal carcinomas 5-fluorouracil (5-FU) has been the most important of the basic drugs for more than 40 years. In order to improve the effectiveness of 5-FU therapy different biological modifiers have been studied recently. The rate-limiting enzyme of 5-FU catabolism is dihydropyrimidine dehydrogenase (DPD) since more than 80% of the administered 5-FU is catabolised by DPD. Tumoral DPD has become of clinical interest because elevated intratumoral DPD can decrease the tumor response to 5-FU therapy. The main purpose of our experiments was to investigate the effect of COX inhibitors on the efficacy of 5-FU on high and low COX-2 expressing HCA-7 and HT-29 human colon adenocarcinoma cell lines, respectively and also on xenografts derived from HT29 cells. The cytotoxic and antitumor effects of 5-FU in the presence of low doses of indomethacin (non-selective COX-2 inhibitor) and that of NS-398 (highly selective COX-2 inhibitor) on the cell lines and xenografts were investigated. In addition our aim was to understand the mechanism(s) by which NSAIDs could enhance the cytotoxic effect of 5-FU. Our data indicated that, the elevated COX-2 expressions of the HCA-7, the collageninduced HT-29-C cells and of the HT-29 xenograft were associated with reduced 5-FU sensitivity. Based on the fact that at the same time the DPD activity was also increased it might be conceivable that a possible explanation for the decrease of 5-FU sensitivity is the co-existence of high COX-2 and DPD activity. Indomethacin or NS-398 enhanced in a simultaneous and significant manner the sensitiviy and cytotoxic effect of 5-FU on high COX-2 expressing cells and xenografts through the modulation of DPD – decrease of its mRNA expression and/or enzyme activity. Based on our results further clinical studies are warranted to decide if NSAIDs in the therapeutic protocol might improve the antitumor potency of 5-FU.
76
9. Irodalomjegyzék 1.
West NJ, Boustière C, Fischbach W et al.: Colorectal cancer screening in Europe:
differences in approach; similar barriers to overcome. Int J Colorectal Dis. 2009;24:731740. 2.
Kasler M: Current state and future perspectives of oncology care in Hungary based
on epidemiologic data. Orv Hetil 2005;146:1519-1530. 3.
Kásler M, Ottó S: European and Hungarian national tasks in oncology. Magy Onkol.
2008;52:21-33. 4.
Nagy F: A colorectalis rák megjelenése miatt fokozott kockázatú betegek szűrése és
követése. In: Tulassay Zsolt (szerk.); A vastagbélrák megelőzése és kezelése. Springer Tudományos kiadó, Budapest, 2004: 125-137 5.
Kopper L: A szerzett és öröklött génhibák felhalmozódása In: Kopper L, Jeney A
(szerk) Onkológia. Medicina, Budapest, 2002: 63-86 6.
Sinicrope FA, Gill S: Role of cycloxygenase-2 in colorectal cancer Cancer Metastasis
Rev. 2004;23:63-75. 7.
Prescott SM, Fitzpatrick FA: Cyclooxygenase-2 and carcinogenesis. Biochim Biophys
Acta. 2000;1470:69-78 8.
Oshima M, Dinchuk JE, Kargman SL et al.: Suppression of intestinal polyposis in
Apc delta716 knockout mice by inhibition of cyclooxygenase 2 (COX-2). Cell. 1996;87:803-809. 9.
de Groot DJ, de Vries EG, Groen HJ and de Jong S: Non-steroidal anti-inflammatory
drugs to potentiate chemotherapy effects: from lab to clinic. Crit Rev Oncol Hematol 2007;61: 52-69 10.
Zha S, Yegnasubramanian V, Nelson WG. et al.: Cyclooxygenases in cancer:
progress and perspective. Cancer Lett. 2004;215(1):1-20. 11.
Subbaramaiah K, Dannenberg AJ. Cyclooxygenase 2: a molecular target for cancer
prevention and treatment. Trends Pharmacol Sci. 2003;24:96-102. 12.
Smith Wl, DeWitt DL, Garavito RM Cyclooxygenases: structural, cellular, and
molecular biology. Annu Rev Biochem. 2000;69:145-182. 13.
Raz A, Wyche A, Fagan D and Needleman P: The cell biology of fibroblast
cyclooxygenase. Adv Exp Med Biol. 1989;259:1-21.
77
14.
Eberhart CE, Coffey RJ, Radhika A et al.: Up-regulation of cyclooxygenase 2 gene
expression in human colorectal adenomas and adenocarcinomas. Gastroenterology. 1994;107:1183-1188. 15.
Műzes Gy: A nem szteroid gyulladáscsökkentők és alkalmazásuk újabb lehetőségei
LAM. 2005;15:9-14. 16.
Oshima M, Dinchuk JE, Kargman SL et al.: Suppression of intestinal polyposis in
Apc delta716 knockout mice by inhibition of cyclooxygenase 2 (COX-2). Cell. 1996;87:803-809. 17.
Liu CH, Chang SH, Narko K et al.: Overexpression of cyclooxygenase-2 is sufficient
to induce tumorigenesis in transgenic mice. J Biol Chem. 2001;276:18563-18569. 18.
Neufang G, Furstenberger G, Heidt M et al.:Abnormal differentiation of epidermis in
transgenic mice constitutively expressing cyclooxygenase-2 in skin. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001;98:7629-7634. 19.
Tsujii M, DuBois RN: Alterations in cellular adhesion and apoptosis in epithelial
cells overexpressing prostaglandin endoperoxide synthase 2. Cell. 1995;83:493-501. 20.
Sun Y, Tang XM, Half E et al.: Cyclooxygenase-2 overexpression reduces apoptotic
susceptibility by inhibiting the cytochrome c-dependent apoptotic pathway in human colon cancer cells. Cancer Res. 2002;62:6323-6328. 21.
Tsujii M, Kawano S, Tsuji S et al.: Cyclooxygenase regulates angiogenesis induced
by colon cancer cells. Cell. 1998;93:705-716. 22.
Seed MP, Brown JR, Freemantle CN et al.: The inhibition of colon-26
adenocarcinoma development and angiogenesis by topical diclofenac in 2.5% hyaluronan. Cancer Res. 1997;57:1625-1629. 23.
Attiga FA, Fernandez PM, Weeraratna AT et al.: Inhibitors of prostaglandin
synthesis inhibit human prostate tumor cell invasiveness and reduce the release of matrix metalloproteinases. Cancer Res. 2000;60:4629-4637. 24.
Yao M, Lam EC, Kelly CR et al.: Cyclooxygenase-2 selective inhibition with NS-
398 suppresses proliferation and invasiveness and delays liver metastasis in colorectal cancer. Br J Cancer. 2004;90:712-719. 25.
Hida T, Leyton J, Makheja AN et al.: Non-small cell lung cancer cycloxygenase
activity and proliferation are inhibited by non-steroidal antiinflammatory drugs. Anticancer Res. 1998;18:775-7782.
78
26.
Achiwa H, Yatabe Y, Hida T et al.: Prognostic significance of elevated
cyclooxygenase 2 expression in primary, resected lung adenocarcinomas. Clin Cancer Res 1999;5:1001-1005. 27.
Uchida K, Schneider S, Yochim JM et al.: Intratumoral COX-2 gene expression is a
predictive
factor
for
colorectal
cancer
response
to
fluoropyrimidine-based
chemotherapy. Clin Cancer Res 2005;11:3363-3368. 28.
Ferrandina G, Lauriola L, Distefano MG et al.: Increased cyclooxygenase-2
expression is associated with chemotherapy resistance and poor survival in cervical cancer patients. J. Clin Oncol. 2002;20:973-981. 29.
Min BS, Choi YJ, Pyo HR et al.: Cyclooxygenase-2 expression in pretreatment
biopsy as a predictor of tumor responses after preoperative chemoradiation in rectal cancer. Arch Surg. 2008;143:1091-1097. 30.
Lakatos László, Lakatos Péter László: A colorectalis daganatok korszerű kezelése.
LAM 2005;15:177-186. 31.
Weckbecker G: Biochemical pharmacology and analysis of fluoropyrimidines alone
and in combination with modulators. Pharmac Ther. 1991;50:367-424. 32.
Walther A, Johnstone E, Swanton C et al.: Genetic prognostic and predictive markers
in colorectal cancer. Nat Rev Cancer. 2009;9:489-499. 33.
Kralovánszky J, Köves I, Orosz Z et al.: Prognostic significance of the thymidylate
biosynthetic enzymes in human colorectal tumors. Oncology. 2002;62:167-174. 34.
Adleff V, Hitre E, Köves I et al.: Heterozygote deficiency in thymidylate synthase
enhancer region polymorphism genotype distribution in Hungarian colorectal cancer patients. Int J Cancer. 2004;108:852-856. 35.
Calascibetta A, Cabibi D, Martorana A et al.: Thymidylate synthase gene promoter
polymorphisms are associated with TSmRNA expressions but not with microsatellite instability in colorectal cancer. Anticancer Res. 2004;24:3875-3880. 36.
Ishida Y, Kawakami K, Tanaka Y et al.: Association of thymidylate synthase gene
polymorphism with its mRNA and protein expression and with prognosis in gastric cancer. Anticancer Res. 2002;22:2805-2809.
79
37.
Etienne MC, Ilc K, Formento JL et al.: Thymidylate synthase and
methylenetetrahydrofolate reductase gene polymorphisms: relationships with 5fluorouracil sensitivity. Br J Cancer. 2004;90:526-534. 38.
Budai
B,
Hitre
E,
Adleff
V
et
al.:
The
clinical
importance
of
methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) C677T polymorphism in the 5fluoropyrimidine-based therapy of metastatic colorectal tumours Magy Onkol. 2004;48:253-237. 39.
Kralovánszky J, Adleff V, Hitre E et al.: Pharmacogenetic studies on the prediction
of efficacy and toxicity of fluoropyrimidine-based adjuvant therapy in colorectal cancer. Magy Onkol. 2007;51:113-125. 40.
Hoff PM: The tegafur-based dihydropyrimidine dehydrogenase inhibitory
fluoropyrimidines, UFT/leucovorin (ORZELTM) and S-1: a review of their clinical development and therapeutic potential. Invest New Drugs. 2000;18:331-342. 41.
Kralovánszky J, Katona C, Jeney A et al.: 5-Ethyl-2'-deoxyuridine, a modulator of
both antitumour action and pharmacokinetics of 5-fluorouracil. J Cancer Res Clin Oncol. 1999;125:675-684. 42.
Ahmed FY, Johnston SJ, Cassidy J et al.: Eniluracil treatment completely inactivates
dihydropyrimidine dehydrogenase in colorectal tumors. J Clin Oncol. 1999;17:24392445. 43.
Yamamoto DS, Viale PH: Cyclooxygenase-2: from arthritis treatment to new
indications for the prevention and treatment of cancer. Clin J Oncol Nurs. 2003;7:21-29. 44.
Patrignani P: Nonsteroidal anti-inflammatory drugs, COX-2 and colorectal cancer.
Toxicol Lett. 2000;112-113:493-498. 45.
Bennett A, Gaffen JD, Melhuish PB and Stamford IF: Studies on the mechanism by
which indomethacin increases the anticancer effect of methotrexate. Br J Pharmacol. 1987;91:229-235. 46.
Kobayashi S, Okada S, Yoshida H and Fujimura S: Indomethacin enhances the
cytotoxicity of VCR and ADR in human pulmonary adenocarcinoma cells. Tohoku J Exp Med. 1997; 181:361-370. 47.
Yip-Schneider MT, Sweeney CJ, Jung SH et al.: Cell cycle effects of nonsteroidal
anti-inflammatory drugs and enhanced growth inhibition in combination with gemcitabine in pancreatic carcinoma cells. J Pharmacol Exp Ther. 2001;298:976-985.
80
48.
Ogino M, Hanazono M: Indomethacin preferentially augments 5-fluorouracil
cytotoxicity in Colon 26 tumors by increasing the intracellular inflow of 5-fluorouracil. Int J Clin Oncol. 1999;4:22-25. 49.
Tachimori A, Yamada N, Amano R et al.: Combination therapy of S-1 with selective
cyclooxygenase-2 inhibitor for liver metastasis of colorectal carcinoma. Anticancer Res. 2008;28:629-638. 50.
Canney PA, Machin MA, Curto J: A feasibility study of the efficacy and tolerability
of the combination of Exemestane with the COX-2 inhibitor Celecoxib in postmenopausal patients with advanced breast cancer. Eur J Cancer. 2006;42:2751-6. 51.
Lin E, Morris JS, Ayers GD: Effect of celecoxib on capecitabine-induced hand-foot
syndrome and antitumor activity. Oncology (Williston Park). 2002;16:31-37. 52.
El-Rayes BF, Zalupski MM, Manza SG et al.: Phase-II study of dose attenuated
schedule of irinotecan, capecitabine, and celecoxib in advanced colorectal cancer. Cancer Chemother Pharmacol. 2008;61:283-289. 53.
Nasir A, Kaiser HE, Boulware D et al.: Cyclooxygenase-2 expression in right- and
left-sided colon cancer: a rationale for optimization of cyclooxygenase-2 inhibitor therapy. Clin Colorectal Cancer. 2004;3:243-247. 54.
Chan AT, Ogino S, Fuchs CS: Aspirin use and survival after diagnosis of colorectal
cancer. JAMA. 2009;302:649-658. 55.
Frosst P, Blom HJ, Milos R et al.: A candidate genetic risk factor for vascular
disease: a common mutation in methylenetetrahydrofolate reductase. Nat Genet. 1995;10:111-113 56.
Naguib FN, el Kouni MH, Cha S: Enzymes of uracil catabolism in normal and
neoplastic human tissues. Cancer Res. 1985;45:5405-5412. 57.
Huang RH, Chai J, Tarnawski AS: Identification of specific genes and pathways
involved in NSAIDs-induced apoptosis of human colon cancer cells. World J Gastroenterol. 2006;12:6446-6452. 58.
Kim WH, Yeo M, Kim MS et al.: Role of caspase-3 in apoptosis of colon cancer
cells induced by nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Int J Colorectal Dis. 2000;105111. 59.
Hull MA, Gardner SH, Hawcroft G: Activity of the non-steroidal anti-inflammatory
drug indomethacin against colorectal cancer Cancer Treat Rev. 2003;29:309-320.
81
60.
Barnett J, Chow J, Ives D et al.: Purification, characterization and selective inhibition
of human prostaglandin G/H synthase 1 and 2 expressed in the baculovirus system. Biochim Biophys Acta. 1994;1209:130-139. 61.
Sánchez-Alcázar JA, Bradbury DA, Pang L and Knox AJ: Cyclooxygenase (COX)
inhibitors induce apoptosis in non-small cell lung cancer through cyclooxygenase independent pathways. Lung Cancer 2003; 40:33-44 62.
Han JH, Roh MS, Park CH, et al.: Selective COX-2 inhibitor, NS-398, inhibits the
replicative senescence of cultured dermal fibroblasts. Mech Ageing Dev. 2004;125:359366. 63.
Pfaffl MW: A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-
PCR. Nucleic Acids Res 2001;29:e45 64.
Guichard S, Cussac D, Hennebelle I et al.: Sequence-dependent activity of the
irinotecan-5FU combination in human colon-cancer model HT-29 in vitro and in vivo. Int J Cancer 1997;73:729-734. 65.
Eli Y, Przedecki F, Levin G et al.: Comparative effects of indomethacin on cell
proliferation and cell cycle progression in tumor cells grown in vitro and in vivo. Biochem Pharmacol. 2001;61: 565-571. 66.
Sawaoka H, Kawano S, Tsuji S et al.: Cyclooxygenase-2 inhibitors suppress the
growth of gastric cancer xenografts via induction of apoptosis in nude mice. Am J Physiol 1998;274: G1061-1067. 67.
Tomayko MM, Reynolds CP: Determination of subcutaneous tumor size in athymic
(nude) mice. Cancer Chemother Pharmacol. 1989;24:148-154. 68.
Kern DH, Morgan CR, Hildebrand-Zanki SU: In vitro pharmacodynamics of 1-beta-
D-arabinofuranosylcytosine: synergy of antitumor activity with cis-diamminedichloroplatinum(II). Cancer Res 1988;48:117-121. 69.
Abdel-Rahman WM, Katsura K, Rens W et al.: Spectral karyotyping suggests
additional subsets of colorectal cancers characterized by pattern of chromosome rearrangement. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001;98:2538-2543. 70.
Klevi K, Teixeira MR, Eknǽs M et al. : Genome signatures of colon carcinoma cell
lines Cancer Genet and Cytogenet. 2004;155:119-131 71.
Park JY, Pillinger MH, Abramson SB: Prostaglandin E2 synthesis and secretion: The
role of PGE2 synthases Clin Immunol. 2006;119:229-240.
82
72.
Beck A, Etienne MC, Chéradame S et al.: A role for dihydropyrimidine
dehydrogenase and thymidylate synthase in tumor sensitivity to fluorouracil. Eur J Cancer 1994,30A;1517-1522. 73.
Budai
B,
Hitre
E,
Adleff
V
et
al.:
The
clinical
importance
of
methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) C677T polymorphism in the 5fluoropyrimidine-based therapy of metastatic colorectal tumours Magy Onkol. 2004;48:253-237. 74.
Shao J, Sheng H, Inoue H et al.: Regulation of constitutive cyclooxygenase-2
expression in colon carcinoma cells. J Biol Chem. 2000;275:33951-33956. 75.
O'Callaghan G, Kelly J, Shanahan F and Houston A: Prostaglandin E2 stimulates Fas
ligand expression via the EP1 receptor in colon cancer cells. Br J Cancer 2008;99:502512 76.
Hu M, Peluffo G, Chen H et al.: Role of COX-2 in epithelial-stromal cell interactions
and progression of ductal carcinoma in situ of the breast. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009;106:3372-3377. 77.
Broom OJ, Massoumi R, Sjölander A: Alpha2beta1 integrin signalling enhances
cyclooxygenase-2 expression in intestinal epithelial cells. J Cell Physiol. 2006;209:950958 78.
Zaric J, Rüegg C: Integrin-mediated adhesion and soluble ligand binding stabilize
COX-2 protein levels in endothelial cells by inducing expression and preventing degradation. J Biol Chem. 2005;280:1077-1085. 79.
Takaoka K, Kishimoto H, Segawa E et al.: In vitro susceptibility to anticancer agents
of the human KB carcinoma cell line transfected with COX-2 cDNA. Oncol Rep. 2008;20:645-649. 80.
Horikawa Y, Otaka M, Komatsu K et al.: MEK activation suppresses CPT11-induced
apoptosis in rat intestinal epithelial cells through a COX-2-dependent mechanism. Dig Dis Sci. 2007;52:2757-2765. 81.
Duffy CP, Elliott CJ, O'Connor RA et al.: Enhancement of chemotherapeutic drug
toxicity to human tumour cells in vitro by a subset of non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs). Eur J Cancer. 1998;34:1250-1259.
83
82.
Ogino M, Minoura S: Indomethacin increases the cytotoxicity of cis-platinum and 5-
fluorouracil in the human uterine cervical cancer cell lines SKG-2 and HKUS by increasing the intracellular uptake of the agents. Int J Clin Oncol. 2001;6:84-89. 83.
Smakman N, Schaap N, Snijckers CM.JT et al.: NS-398, a selective cyclooxygenase-
2 inhibitor, reduces experimental bladder carcinoma outgrowth by inhibiting tumor cell proliferation. Urology 2005;66:434-440. 84.
Mizutani Y, Kamoi K, Ukimura O et al.: Synergistic cytotoxicity and apoptosis of
JTE-522, a selective cyclooxygenase-2 inhibitor, and 5-fluorouracil against bladder cancer. J Urol. 2002;168:2650-2654. 85.
Touhey S, O'Connor R, Plunkett S et al.: Structure-activity relationship of
indomethacin analogues for MRP-1, COX-1 and COX-2 inhibition identification of novel chemotherapeutic drug resistance modulators. Eur J Cancer 2002;38:1661-1670. 86.
Kobayashi S, Okada S, Yoshida H and Fujimura S: Indomethacin enhances the
cytotoxicity of VCR and ADR in human pulmonary adenocarcinoma cells. Tohoku J Exp Med. 1997;181:361-370. 87.
Hanaka H, Pawelzik SC, Johnsen JI et al.: Microsomal prostaglandin E synthase 1
determines tumor growth in vivo of prostate and lung cancer cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009;106:18757-18762. 88.
Eichele K, Ramer R, Hinz B: Decisive role of cyclooxygenase-2 and lipocalin-type
prostaglandin D synthase in chemotherapeutics-induced apoptosis of human cervical carcinoma cells. Oncogene. 2008;27:3032-3044 89.
Senzaki M, Ishida S, Yada A et al.: CS-706, a novel cyclooxygenase-2 selective
inhibitor, prolonged the survival of tumor-bearing mice when treated alone or in combination with anti-tumor chemotherapeutic agents. Int J Cancer. 2008;122:13841390. 90.
Tendo M, Yashiro M, Nakazawa K et al.: A synergic inhibitory-effect of
combination with selective cyclooxygenase-2 inhibitor and S-1 on the peritoneal metastasis for scirrhous gastric cancer cells. Cancer Lett. 2006;244:247-251. 91.
Leonetti C, Scarsella M, Zupi G et al.: Efficacy of a nitric oxide-releasing
nonsteroidal anti-inflammatory drug and cytotoxic drugs in human colon cancer cell lines in vitro and xenografts. Mol Cancer Ther. 2006;5:919-926.
84
92.
Minter HA, Eveson JW, Huntley S et al.: The cyclooxygenase 2-selective inhibitor
NS398 inhibits proliferation of oral carcinoma cell lines by mechanisms dependent and independent of reduced prostaglandin E2 synthesis. Clin Cancer Res 2003;9:1885-1897. 93.
Matsuo M, Yoshida N, Zaitsu M et al.: Inhibition of human glioma cell growth by a
PHS-2 inhibitor, NS398, and a prostaglandin E receptor subtype EP1-selective antagonist, SC51089. J Neurooncol. 2004;66:285-292. 94.
Chan TA, Morin PJ, Vogelstein B and Kinzler KW: Mechanisms underlying
nonsteroidal antiinflammatory drug-mediated apoptosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998;95:681-686 95.
Petak I, Tillman DM, Houghton JA: p53 dependence of Fas induction and acute
apoptosis in response to 5-fluorouracil-leucovorin in human colon carcinoma cell lines. Clin Cancer Res. 2000;6:4432-4441. 96.
Rodrigues NR, Rowan A, Smith ME et al.: p53 mutations in colorectal cancer. Proc
Natl Acad Sci USA. 1990; 87:7555-7559 97.
Liu Y, Bodmer WF: Analysis of P53 mutations and their expression in 56 colorectal
cancer cell lines. Proc Natl Acad Sci USA 2006;103:976-981. 98.
Yip-Schneider MT, Sweeney CJ, Jung SH et al.: Cell cycle effects of nonsteroidal
anti-inflammatory drugs and enhanced growth inhibition in combination with gemcitabine in pancreatic carcinoma cells. J Pharmacol Exp Ther. 2001;298:976-985. 99.
Meade EA, Smith WL, DeWitt DL: Differential inhibition of prostaglandin
endoperoxide synthase (cyclooxygenase) isozymes by aspirin and other non-steroidal anti-inflammatory drugs. J Biol Chem. 1993;268:6610-6614. 100.
Lee SH, Lee MY, Han HJ: Short-period hypoxia increases mouse embryonic stem
cell proliferation through cooperation of arachidonic acid and PI3K/Akt signalling pathways. Cell Prolif. 2008;41:230-247. 101.
Oguri T, Bessho Y, Achiwa H: MRP8/ABCC11 directly confers resistance to 5-
fluorouracil. Mol Cancer Ther. 2007;6:122-127. 102.
Chen ZS, Guo Y, Belinsky MG et al.:: Transport of bile acids, sulfated steroids,
estradiol 17-beta-D-glucuronide, and leukotriene C4 by human multidrug resistance protein 8 (ABCC11). Mol Pharmacol. 2005;67:545-557.
85
103.
Smith ML, Hawcroft G, Hull MA: The effect of non-steroidal anti-inflammatory
drugs on human colorectal cancer cells: evidence of different mechanisms of action. Eur J Cancer. 2000;36:664-674. 104.
Higashi Y, Kanekura T, Kanzaki T: Enhanced expression of cyclooxygenase
(COX)-2 in human skin epidermal cancer cells: evidence for growth suppression by inhibiting COX-2 expression. Int J Cancer. 2000;86:667-671. 105.
Kralovánszky J, Adleff V, Hitre E et al.: Pharmacogenetic studies on the prediction
of efficacy and toxicity of fluoropyrimidine-based adjuvant therapy in colorectal cancer. Magy Onkol. 2007; 51:113-125. 106.
Mizutani Y, Nakanishi H, Yoshida O et al.: Potentiation of the sensitivity of renal
cell carcinoma cells to TRAIL-mediated apoptosis by subtoxic concentrations of 5fluorouracil. Eur J Cancer. 2002;38:167-176 107.
Dou J, Iwashita Y, Sasaki A et al.: Consensus interferon enhances the anti-
proliferative effect of 5-fluorouracil on human hepatoma cells via downregulation of dihydropyrimidine dehydrogenase expression. Liver Int. 2005;25:148-152. 108.
Zhao L, Chen Z, Wang J et al.: Synergistic effect of 5-fluorouracil and flavonoid
oroxylin A on HepG2 human hepatocellular carcinoma and on H 22 transplanted mice. Cancer Chemother Pharmacol 2009;doi 10.1007/s00280-009-1053-2 109.
Zhang X, Li L, Fourie J et al.: The role of Sp1 and Sp3 in the constitutive DPYD
gene expression. Biochim Biophys Acta. 2006;1759:247-256. 110.
Wu CC, Lin JC, Yang SC et al: Modulation of the expression of the invasion-
suppressor CRMP-1 by cyclooxygenase-2 inhibition via reciprocal regulation of Sp1 and C/EBPalpha. Mol Cancer Ther. 2008;7: 1365-1375. 111.
Abdelrahim M, Safe S: Cyclooxygenase-2 inhibitors decrease vascular endothelial
growth factor expression in colon cancer cells by enhanced degradation of Sp1 and Sp4 proteins. Mol Pharmacol. 2005;68:317-329. 112.
Takahra T, Smart DE, Oakley F and Mann DA: Induction of myofibroblast MMP-9
transcription in three-dimensional collagen I gel cultures: regulation by NF-kappaB, AP-1 and Sp1. Int J Biochem Cell Biol. 2004;36:353-363. 113.
Porter SN, Howarth GS and Butler RN: Non-steroidal anti-inflammatory drugs and
apoptosis in the gastrointestinal tract: potential role of the pentose phosphate pathways. Eur J Pharmacol. 2000;397: 1-9.
86
114.
Schnackerz KD, Dobritzsch D, Lindqvist Y and Cook PF: Dihydropyrimidine
dehydrogenase: a flavoprotein with four iron-sulfur clusters. Biochim Biophys Acta 2004;1701: 61-74. 115.
Sasahara K, Uchida Y, Matsuda K et al.: Role of energy metabolism in drug-induced
acute gastric mucosal injuries in humans. J Gastroenterol Hepatol. 2000;15:127-132. 116.
Krause MM, Brand MD, Krauss S et al.: Nonsteroidal antiinflammatory drugs and a
selective cyclooxygenase 2 inhibitor uncouple mitochondria in intact cells. Arthritis Rheum 2003;48:1438-1444. 117.
Baggott JE, Morgan SL, Ha T et al.: Inhibition of folate-dependent enzymes by non-
steroidal anti-inflammatory drugs. Biochem J. 1992;282:197-202. 118.
Neuhard J, Thomassen E: Deoxycytidine triphosphate deaminase:Identification and
function in Salmonella typhimurium. J Bacteriol. 1971;105:657-665 119.
Mashiyama ST, Courtemanche C, Elson-Schwab I et al: Uracil in DNA, determined
by an improved assay, is increased when deoxynucleosides are added to folate-deficient cultured human lymphocytes. Anal Biochem. 2004;330:58-69. 120.
Johnson MR, Wang K, Smith JB et al.: Quantitation of dihydropyrimidine
dehydrogenase expression by real-time reverse transcription polymerase chain reaction. Anal Biochem. 2000;278:175-184. 121.
Johnston SJ, Ridge SA, Cassidy J and McLeod HL: Regulation of
dihydropyrimidine dehydrogenase in colorectal cancer. Clin Cancer Res. 1999;5:25662570. 122.
Yamada H, Iinuma H, Watanabe T: Prognostic value of 5-fluorouracil metabolic
enzyme genes in Dukes' stage B and C colorectal cancer patients treated with oral 5fluorouracil-based adjuvant chemotherapy. Oncol Rep. 2008;19:729-735. 123.
Miyamoto S, Ochiai A, Boku N et al.: Discrepancies between the gene expression,
protein
expression,
and
enzymatic
activity
of
thymidylate
synthase
and
dihydropyrimidine dehydrogenase in human gastrointestinal cancers and adjacent normal mucosa. Int J Oncol. 2001;18:705-713 124.
Nishiyama M, Yamamoto W, Park JS et al.: Low-dose cisplatin and 5-fluorouracil
in combination can repress increased gene expression of cellular resistance determinants to themselves. Clin Cancer Res. 1999;5:2620-2628.
87
125
Sakurai Y, Uraguchi T, Imazu H et al.: Changes in thymidylate synthase and its
inhibition rate and changes in dihydropyrimidine dehydrogenase after the administration of 5-fluorouracil with cisplatin to nude mice with gastric cancer xenograft SC-1-NU. Gastric Cancer 2004;7:110-116.
88
10. Saját közlemények 10.1 A disszertáció témájával kapcsolatos közlemények Réti A, Barna G, Pap E, Adleff V, L Komlósi V, Jeney A, Kralovánszky J, Budai B. Enhancement of 5-fluorouracil efficacy on high COX-2 expressing HCA-7 cells by low dose indomethacin and NS-398 but not on low COX-2 expressing HT-29 cells. Pathol Oncol Res. 2009 Sep;15(3):335-44.
IF:1,260
Réti A, Pap E, Zalatnai A, Jeney A, Kralovánszky J, Budai B. Co-inhibition of cyclooxygenase-2 and dihydropyrimidine dehydrogenase by non-steroidal antiinflammatory drugs in tumor cells and xenografts. Anticancer Res. 2009 Aug;29(8):3095-101.
IF:1,390
Réti A, Pap E, Adleff V, Jeney A, Kralovánszky J, Budai B. Enhanced 5-fluorouracil cytotoxicity in high cyclooxygenase-2 expressing colorectal cancer cells and xenografts induced
by
non-steroidal
anti-inflammatory
drugs
via
downregulation
of
dihydropyrimidine dehydrogenase. Cancer Chemother Pharmacol. 2009 Oct 15. DOI: 10.1007/s00280-009-1149-8
IF:2,740
10.2 Egyéb onkológiai témájú közlemények Kralovánszky J, Adleff V, Hitre E, Pap E, Réti A, Komlósi V, Budai B. [Pharmacogenetic studies on the prediction of efficacy and toxicity of fluoropyrimidinebased adjuvant therapy in colorectal cancer] Magy Onkol. 2007;51(2):113-25. Szoboszlai N, Réti A, Budai B, Szabó Zs, Kralovánszky J, Záray Gy. Direct elemental analysis of cancer cell lines by total reflection X-ray fluorescence Spectrochimica Acta Part B: Atomic Spectroscopy. 2008 December 63(12):1480-1484.
89
IF:2,853
10.3
A disszertáció témájához kapcsolódó előadások
Réti A, Budai B, Komlósi V, Adleff V, Zalatnai A, Jeney A, Kralovánszky J: The effect of cyclooxygenase-2 (Cox-2) inhibitors on the response of colorectal cancer (CRC) cell lines and xenografts on 5-fluorouracil (5-FU) treatment. ESO Colorectal Cancer Conference, London, Anglia, 2005, Abstr:39 Réti A, Budai B, Komlósi V, Adleff V, Zalatnai A, Jeney A, Kralovánszky J: A COX2-gátlás szerepe az 5-FU kezelés hatékonyságában sejtvonalakon és xenograft tumoron. Magyar Onkológia 2005, 49/3S:75. Réti A, Budai B, Komlósi V, Adleff V, Jeney A, Kralovánszky J: The influence of COX-2 inhibition on the effect of 5-fluorouracil on HT-29 and HCA-7 colon carcinoma cell lines. Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Ph.D. Tudományos Napok, 2006, Abstr:17 Réti A, Budai B, Komlósi V, Adleff V, Zalatnai A, Jeney A, Kralovánszky J: The effect of non-selective cyclooxygenase-2 (COX-2) inhibitor indomethacin on the response of colorectal cancer (CRC) cell lines and xenografts on 5-fluorouracil (5-FU) treatment. CNIO Symposium, Madrid, Spanyolország, 2006, Abstr:85 Réti A, Budai B, Komlósi V, Adleff V, Zalatnai A, Jeney A, Kralovánszky J: The combined effect of non-selective cyclooxygenase-2 inhibitor indomethacin and 5fluorouracil treatment on colorectal cancer cell lines and xenografts. Eur J Cancer Supplements 2007, 5(4):72 Réti A, Budai B, Komlósi V, Adleff V, Barna G, Jeney A, Kralovánszky J: The combined effect of a non selective and a selective cyclooxygenase-2 inhibitor and 5fluorouracil treatment on HCA-7 human colorectal carcinoma cell line. Eur J Cancer Supplements 2008, 6(9):30 Réti A., Pap É., Budai B., Adleff V., Zalatnai A., Jeney A., Kralovánszky J. Ciklooxigenáz-2 (COX-2) és dihidropirimidin dehidrogenáz (DPD) együttes gátlása nem szteroid gyulladásgátlókkal magas COX-2 expressziót mutató sejtvonalon és xenografton Magyar Onkológia 2009, 59:102
90
10.4
Egyéb onkológiai témájú előadások
Komlósi V, Adleff V, Pap É, Hitre E, Réti A, Budai B, Kralovánszky J: Szerin hidroximetil transzferáz C1420T génpolimorfizmus vizsgálata colorectális daganatos betegek DNS mintáiban MGB-TaqMan próbás technikával. Magyar Farmakológiai Társaság Kongresszusa, Debrecen, 2004 Komlósi V, Adleff V, Pap É, Réti A, Hitre E, Budai B, Kralovánszky J: Szerinhidroximetil transzferáz C1420T génpolimorfizmus vizsgálat colorectalis daganatos betegek DNS mintáiban MGB-TaqMan próbás technikával. Semmelweis Egyetem Doktori Iskola PhD Tudományos Napok, 2005, Abstr:76 Adleff V, Komlósi V, Budai B, Réti A, Hitre E, Hajnal A, Kralovánszky J: Folátmetabolizmus-enzimek génpolimorfizmusai kolorektális rákokban. Magy Onkol 2005, 49/3S:3 Adleff V, Komlósi V, Budai B, Réti A, Hitre E, Hajnal A, Kralovánszky J: Interactions of genetic polymorphisms of folate metabolizing enzymes in modifying colorectal cancer risk in Hungarian population-based case-control study. European Journal of Cancer 2005, 3:69. Budai B, Hitre E, Adleff V, Komlósi V, Réti A, Láng I, Kralovánszky J: A génpolimorfizmusok szerepe a metasztatikus colorectalis tumorok kezelésében. Magy Onkol 2005, 49/3S:14 Kralovánszky J, Budai B, Hitre E, Adleff V, Orosz Zs, Réti A, Komlósi V, Láng I: Farmakogenetikai vizsgálatok jelentősége az adjuváns kezelés hatékonyságának predikciójában colorectalis daganatokban (CRC). Magy Onkol 2005, 49/3S:44 Komlósi V, Pap É, Adleff V, Budai B, Réti A, György M, Kralovánszky J: A folsav- és pirimidin-anyagcsere enzimek polimorfizmusai és a szérum-homocisztein-szint vizsgálata colorectalis carcinomában. Magy Onkol 2005, 49/3S:41
91
Komlósi V, Pap É, Adleff V, Budai B, Réti A, György M, Tóth B, Kralovánszky J: The effect of cytosolic serine-hydroxymethyl-transferase (CSHMT) C1420T poly-morphism on the colorectal cancer (CRC) risk and on the homocysteine (HCy) levels. ESO Colorectal Cancer, London, Anglia, 2005, Abstr:31 Kralovánszky J, Budai B, Pandi E, Hitre E, Adleff V, Katona Cs, Réti A, Komlósi V, Orosz Zs, Láng I: The effect of dihydropyrimidine dehydrogenase (DPD) activity and germline thymidylate synthase (TS) gene polymorphisms on the survival of colorectal cancer patients treated by adjuvant 5-fluorouracil. Eur J Cancer Supplements 2005, 3:187. Budai B, Hitre E, Adleff V, Komlosi V, Réti A, Láng I, Kralovánszky J: Role of thymidilate synthase (TS), methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) and cytosolic serine hydroxymethyltransferase (SHMT) gene polymorphism in the chemotherapy of metastatic colorectal cancer. AACR Special Conference in Cancer Research, Charleston, SC, USA, 2006, Abstr:5 Komlósi V, Budai B, Hitre E, Adleff V, Réti A, Láng I, Kralovánszky J: Effect of the folate cycle key enzyme, serine hydroxymethyltransferase (SHMT) in advanced colorectal cancer. Semmelweis Egyetem Doktori Iskola PhD Tudományos Napok, 2006, Abstr:11 Budai B, Hitre E, Komlósi V, Adleff V, Pap É, Réti A, Orosz Zs, Láng I, Kralovánszky J: Metasztatikus colorectalis carcinómás (CRC) betegek genotípusa és a különböző fluorouracil alapú első és második vonalbeli kemoterápia eredménye közti összefüggések tanulmányozása Magyar Onkológia 51/4:304. Adleff V, Komlósi V, Budai B, Réti A, Hitre E, Hajnal A, Kralovánszky J Metilcsoport-anyagcsere
gének
polimorfizmusainak
szerepe
és
interakciója
kolorektális daganatok genetikai vizsgálatában Magyar Onkológia 51/4:287.
92
a
Szoboszlai N, Réti A, Budai B, Kralovánszky J, Záray Gy: Direct elemental analysis of human colorectal adenocarcinoma cell lines by total reflection X-ray fluorescence 12th Conference on Total Reflection X-Ray Fluorescence Analysis and Related Methods Trento Olaszország 2007
93
11. Köszönetnyilvánítás Köszönettel tartozom Prof. Dr. Kásler Miklós egyetemi tanárnak, az Országos Onkológiai Intézet Főigazgatójának, hogy munkámat lehetővé tette és támogatta. Kiemelkedően
hálás
köszönetemet
szeretném
kifejezni
témavezetőmnek,
Dr.
Kralovánszky Judit tudományos osztályvezetőnek, aki munkám során mindvégig nagy odafigyeléssel irányított, mind szakmailag, mind emberileg maximálisan támogatott és biztosította a lehetőséget, hogy a laboratóriumában dolgozzam. Köszönetet szeretnék mondani Dr Budai Barna munkatársamnak, az egész idő alatt nyújtott segítségért. A munkám során felmerülő kérdések megvitatásából rengeteget tanultam. Külön köszönöm Pap Éva munkatársamnak a DPD aktivitás mérésében nyújtott segítségét, precíz munkavégzése példamutató számomra. Hálás vagyok Dr. Adleff Vilmos munkatársamnak, aki hasznos tanácsaival és kísérleti tapasztalataival számos nehézségen segített át. Szeretném megköszönni a Semmelweis Egyetem I. Patológiai Intézetből Dr. Jeney András egyetemi tanárnak, hogy segítségére, értékes tanácsaira mindig számíthattam. Köszönöm továbbá Dr. Zalatnai Attila egyetemi docensnek az immunhisztokémiai vizsgálatokban nyújtott segítségért, Dr Barna Gábor tudományos munkatársnak az áramlási
citométerrel
végzett
vizsgálatokért.
Oláh
Lászlóné
gyógyszerésznek
segítségéért és gyakorlati tanácsaiért. Köszönettel tartozom Dr. Gaál Dezső osztályvezetőnek és Dr. Péter Ilona osztályvezető helyettesnek (Országos Onkológiai Intézet) a munkámhoz nyújtott értékes segítségért. Munkacsoportunk valamennyi, eddig nem említett tagjának - Kútvölgyi Ferencné Makácsné Polényi Csilla, Mousáné Éber Andrea, Nagy Attila, Osztafin Sándorné szeretném megköszönni, hogy a kísérletek kivitelezése során nyújtott segítségükre mindig számíthattam, továbbá az állatkísérletek során nyújtott értékes segítségükért köszönettel tartozom Sztodola András és Borza A. Mónika munkatársaknak (Semmelweis Egyetem I. Patológiai Intézet). Végül, de nem utolsó sorban hálás vagyok Családomnak, hogy céljaim elérésében támogattak, és szeretetükre, megértésükre mindig támaszkodhattam.
94
