NEM STERIL TERMÉKEK MIKROBIOLÓGIAI VIZSGÁLATA: VIZSGÁLAT MEGHATÁROZOTT MIKROORGANIZMUSOKRA

2.6.13. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.6.0. – 1

01/2008:20613 javított 6.0

2.6.13. NEM STERIL TERMÉKEK MIKROBIOLÓGIAI VIZSGÁLATA: VIZSGÁLAT MEGHATÁROZOTT MIKROORGANIZMUSOKRA Ez az általános fejezet két vizsgálatcsoportot foglal magában. Az 1. csoport a cikkelyeknek való megfelelés meghatározására szolgáló referenciamódszereket tartalmazza. Ezért amennyiben egy cikkely jelen fejezetre hivatkozik, úgy a hivatkozás az 1. csoport követelményeinek való megfelelésre vonatkozik, hacsak a 2. csoport vizsgálatait nem engedélyezték. A 2. csoportban közölt vizsgálatok szintén az Európai Gyógyszerkönyv részét képezik, tehát ilyen értelemben lehet rájuk hivatkozni, különösen forgalomba hozatali engedéllyel kapcsolatos eljárás esetén. A tervek szerint az érintett cikkelyek felülvizsgálata során az 1. csoport vizsgálatai helyébe a 2. csoport vizsgálatai lépnek. A 2. csoport vizsgálati módszereit a Japán Gygyszerkönyvvel és az Egyesült Államok Gyógyszerkönyvével (USP) együttműködésben fejlesztették ki, a követelményrendszer harmonizálása céljából. A. AZ EURÓPAI GYÓGYSZERKÖNYV MÓDSZERE Ebben az általános módszerben bizonyos szelektív táptalajok használata javasolt. Szelektív táptalajok felhasználásával általában szubletálisan károsodott mikroorganizmusok nem mutathatók ki. Minthogy a szubletálisan károsodott mikroorganizmusok jelentősen befolyásolják a termékek minőségét, a szelektív táptalajokon végzett vizsgálatoknak reaktiválási eljárást is kell tartalmazniuk. Amennyiben a vizsgálandó termék antimikrobás hatással rendelkezik, ezt megfelelő módon semlegesíteni kell. Enterobaktériumok és néhány más Gram-negatív baktérium Noha a vizsgálatot az Enterobacteriaceae családba tartozó baktériumok kimutatására dolgozták ki, ismeretes, hogy a vizsgálattal más típusú mikroorganizmusok (pl. Aeromonas, Pseudomonas) is kimutathatók. A baktériumok kimutatása. A vizsgálandó terméket a 2.6.12 fejezetben leírt általános módszer szerint készítjük elő, azzal a különbséggel, hogy nátrium-klorid– pepton–tompítóoldat (pH 7,0) helyett „D” folyékony táptalajt használunk. A keveréket homogenizáljuk, majd 35–37 °C-on annyi ideig inkubáljuk, amennyi a


baktériumok reaktiválásához elegendő, de szaporodásukhoz nem (ez általában 2 óra, de legfeljebb 5 óra). A keveréket tartalmazó tartályt felrázzuk („A” homogenizátum), kiveszünk belőle a termék 1 g-jának (vagy 1 ml-ének) megfelelő részletet, ezt 100 ml „E” dúsító táptalajba visszük és 18-48 órán keresztül 35– 37 °C-on inkubáljuk. A dúsító táptalajból ezután „F” agar táptalaj-lemezekre oltunk. Az inkubálás 18-24 órán keresztül 35-37 °C-on történik. A termék megfelel a vizsgálat követelményének, ha egyetlen lemezen sem fejlődnek ki Gram-negatív baktériumtelepek. Mennyiségi értékelés. Az „E” folyékony dúsító táptalaj megfelelő mennyiségeit beoltjuk „A” homogenizátummal és/vagy ennek hígításaival, amelyek 0,1, 0,01, ill. 0,001 g-ot (vagy 0,1, 0,01, ill. 0,001 ml-t) tartalmaznak a vizsgálandó termékből. A beoltott táptalajokat 24-48 órán keresztül 35-37 °C-on inkubáljuk. A szelektív izoláció érdekében mindegyik tenyészetet átoltjuk „F” agar táptalaj-lemezre, és 1824 órán keresztül 35-37 °C-on inkubáljuk. Jól kifejlett, általában vörös vagy vöröses Gram-negatív baktériumtelepek megjelenése pozitív eredményt jelent. A terméknek azt a legkisebb mennyiségét, amely pozitív eredményt ad és azt a legnagyobb mennyiségét, amely negatív eredményt ad, feljegyezzük. A 2.6.13.-1. táblázat alapján megállapítjuk a valószínű baktériumokszámot. 2.6.13.-1. táblázat Az egyes termékmennyiségek esetén kapott eredmények 0,1 g vagy 0,1 ml

0,01 g vagy 0,01 ml

0,001 g vagy 0,001 ml

Valószínű baktériumszám 1 g termékre vonatkoztatva

+

+

+

>103

+

+

–

>102 és <103

+

–

–

>10 és <102

–

–

–

<10

Transzdermális tapaszok vizsgálatakor 50 ml B-kivonatot (amelyet a 2.6.12 fejezetben leírt általános módszer szerint készítettünk elő) steril membránszűrőn megszűrünk, a membránt 100 ml „E” folyékony dúsító táptalajba helyezzük és 1824 órán keresztül 35-37 °C-on inkubáljuk. Inkubálás után enterobaktériumok és más Gram-negatív mikroorganizmusok kimutatása céljából „F” agar táptalajon szélesztjük.


Escherichia coli A 2.6.12 fejezetben leírt általános módszer szerint előkészített vizsgálandó termék 10 ml-ével vagy 1 g-jának (ill. 1 ml-ének) megfelelő mennyiséggel beoltunk 100 ml „A” folyékony táptalajt. A beoltott táptalajt homogenizáljuk és 18-48 órán keresztül 35-37 °C-on inkubáljuk. A tartályt összerázzuk, tartalmából 1 ml-t 100 ml „G” folyékony táptalajba oltunk át és 18-24 órán keresztül 43-45 °C-on inkubáljuk. „H” agar táptalaj-lemezekre átoltva 18-72 órán keresztül 35-37 °C-on folytatjuk a tenyésztést. Vörös, nem-mukoid Gram-negatív pálcákból álló baktériumtelepek keletkezése E. coli jelenlétére utal, amit megfelelő biokémiai vizsgálatokkal, pl. indol-reakcióval megerősítünk. A termék megfelel a vizsgálat követelményének, ha az említett telepek nem láthatók, vagy ha a megerősítő biokémiai reakciók negatívak. Salmonella A vizsgálandó terméket a 2.6.12 fejezetben leírt általános módszer szerint készítjük elő, azzal a különbséggel, hogy nátrium-klorid–pepton–tompítóoldat (pH 7,0) helyett „A” folyékony táptalajt használunk. A beoltott táptalajt homogenizáljuk, majd 18-24 órán keresztül 35-37 °C-on inkubáljuk. A dúsított tenyészet 1 ml-ét 10 ml „I” folyékony táptalajba oltjuk át és 18-24 órán keresztül 41-43 °C-on inkubáljuk. Három agar-táptalaj („J”, „K” és „L”) közül legalább két különbözőre továbboltunk és ezeket 18-72 órán keresztül 35-37 °C-on inkubáljuk. Salmonellabaktériumok valószínű jelenlétére utal a következő telepek megjelenése: −

„J” agar-táptalajon: jól kifejlődött, színtelen telepek,

−

„K” agar-táptalajon: jól kifejlődött, vörös telepek, fekete középponttal vagy anélkül,

−

„L” agar-táptalajon: kicsi, áttetsző, színtelen vagy rózsaszínű, máskor átlátszatlan, fehér telepek, melyeket gyakran rózsaszínű vagy vörös zóna övez.

Néhány gyanús telepet, felületi és mély beoltást alkalmazva, külön-külön átoltunk kémcsövekben lévő „M” agar-táptalajra. szalmonellák jelenlétének gyanúját ideiglenesen megerősíti, ha a szín a mélykultúrában vörösről sárgára változik (a felületi tenyészetben azonban nem), miközben az agarban rendszerint gázfejlődés tapasztalható, hidrogén-szulfid képződésével vagy anélkül. Biztos igazolást megfelelő biokémiai és szerológiai vizsgálatokkal nyerhetünk. A termék megfelel a vizsgálat követelményének, ha a fent leírt típusnak megfelelő telepek nem jelennek meg, vagy ha az igazoló biokémiai és szerológiai próbák negatívak. Pseudomonas aeruginosa


A 2.6.12 fejezetben leírt általános módszer szerint előkészített vizsgálandó termék 10 ml-ével vagy 1 g-jának (ill. 1 ml-ének) megfelelő mennyiséggel beoltunk 100 ml „A” folyékony táptalajt. A beoltott táptalajt homogenizáljuk, majd 18-48 órán keresztül 35-37 °C-on inkubáljuk. Ezután átoltjuk „N” agar-táptalaj-lemezre, és 1872 órán keresztül 35-37 °C-on tovább inkubáljuk. Amennyiben mikroorganizmusnövekedés nem észlelhető, a termék megfelel a vizsgálat követelményének. Ha Gram-negatív pálcák szaporodását észleljük, néhány morfológiailag eltérő izolált telepet átoltunk „A” folyékony táptalajba és 18-24 órán keresztül 41-43 °C-on inkubáljuk. A termék megfelel a vizsgálat követelményének, ha 41-43 °C-on a baktériumtelepek nem észlelhetők. Transzdermális tapaszok vizsgálatakor a 2.6.12 fejezetben leírt általános módszer szerint előkészített A-kivonat 50 ml-ét steril membránszűrőn megszűrjük, a membránt 100 ml „A” folyékony táptalajba helyezzük és 18-48 órán keresztül 3537 °C-on inkubáljuk. Inkubálás után „N” agar táptalajon szélesztjük. Staphylococcus aureus A 2.6.12 fejezetben leírt általános módszer szerint előkészített vizsgálandó termék 10 ml-ével vagy 1 g-jának (ill. 1 ml-ének) megfelelő mennyiséggel beoltunk 100 ml „A” folyékony táptalajt. A beoltott táptalajt homogenizáljuk és 18-48 órán keresztül 35-37 °C-on inkubáljuk. Ezután átoltjuk „O” agar táptalaj-lemezre és 1872 órán keresztül 35-37 °C-on tovább inkubáljuk. Jól látható zónával körülvett, Gram-pozitív coccusokból álló fekete telepek S. aureus jelenlétére utalnak. Ezt megfelelő biokémiai próbákkal, pl. koaguláz- és dezoxiribonukleáz-próbával erősíthetjük meg. A termék megfelel a vizsgálat követelményének, ha a leírt típusú telepek „O” agar-táptalajon nem észlelhetők, vagy ha az igazoló biokémiai próbák negatívak. Transzdermális tapaszok vizsgálatakor a 2.6.12 fejezetben leírt általános módszer szerint előkészített A-kivonat 50 ml-ét steril membránszűrőn megszűrjük, a membránt 100 ml „A” folyékony táptalajba helyezzük és 18-48 órán keresztül 3537 °C-on inkubáljuk. Inkubálás után „O” agar táptalajon szélesztjük. A táptalajok mikroorganizmus-növekedést elősegítő képessége és szelektív tulajdonságai; a vizsgálat érvényessége A dehidratált táptalaj-készítmények minden egyes gyártási tételét alá kell vetni a következőkben leírt vizsgálatoknak. A következőképpen járunk el: az alább felsorolt referenciatörzseket a megfelelő (pl. az itt megadott) táptalajt tartalmazó kémcsövekben külön-külön 18-24 órán át 30-35 °C-on inkubáljuk.

2.6.13. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.6.0. – 5 Staphylococcus aureus

pl. ATCC 6538 (NCIMB 9518, CIP 4.83): „A” folyékony táptalajban,

Pseudomonas aeruginosa


Escherichia coli


Salmonella typhimurium

nincs ajánlott referencia-törzsszám (emberre ártalmatlan Salmonella, pl. Salmonella abony [NCTC 6017, CIP 80.39] is használható): „A” folyékony táptalajban.

Nátrium-klorid–pepton–tompítóoldattal (pH 7,0) hígítva mindegyik tenyészetből milliliterenként kb. 1000 életképes mikroorganizmust tartalmazó referenciaszuszpenziót készítünk. A S. aureus, P. aeruginosa, E .coli és Salmonella baktérium- szuszpenziók azonos térfogatú részleteiből keveréket készítünk, melynek 0,4 ml-ét használjuk inokulumként (törzsenként kb. 100 mikroorganizmus) a vizsgálandó termék jelenlétében és anélkül is. A megfelelő mikroorganizmusokra pozitív eredményt kell kapnunk. Clostridiumok Az alább leírt vizsgálatok célja különböző. Az első módszer olyan termékek ellenőrzésére szolgál, amelyeknél a patogén clostridiumokat feltétlenül ki kell zárni, és ellenőrizni kell, hogy a termék mentes-e ezektől. Az ilyen termékekben általában alacsony az összes mikroorganizmus-szám. A második módszer félkvantitatív vizsgálat Clostridium perfringensre, és olyan termékek vizsgálatára szolgál, amelyeknél az e fajhoz tartozó mikroorganizmusok száma minőségi követelmény. 1. Vizsgálat Clostridiumokra A 2.6.12 fejezetben leírt általános módszer szerint előkészített vizsgálandó termék két egyenlő (1-1 g-jának vagy 1-1 ml-ének megfelelő) részletét vizsgáljuk. Az egyik részletet 10 percig 80 °C-on melegítjük, majd gyorsan lehűtjük. A másik részletet nem melegítjük. A két homogenizált részlet 10-10 ml-ét két olyan 38×200 mm-es tartályba vagy más alkalmas edénybe töltjük, amelyek mindegyike 100 ml „P” táptalajt tartalmaz; ezeket 48 órán át 35-37 °C-on anaerob körülmények között inkubáljuk. Inkubálás után mindegyik edényből „Q” táptalajra oltunk át, amelyhez előzetesen gentamicint adtunk, majd a táptalajt 48 órán át 35-37 °C-on anaerob körülmények között inkubáljuk. A termék megfelel a vizsgálatnak, ha mikroorganizmus-növekedés nem észlelhető. Ha mikroorganizmus-növekedés észlelhető, minden eltérő formájú telepből gentamicint nem tartalmazó „Q” táptalajra oltunk át, és ezeket mind aerob, mind anaerob körülmények között inkubáljuk. A csak anaerob körülmények között


növekedő, negatív kataláz-próbát adó Gram-pozitív bacillusok megjelenése (endospórával vagy anélkül) Clostridium fajok jelenlétére utal. Szükség esetén összehasonlítjuk a két lemezen kialakult telep morfológiáját és kataláz-próbát végzünk, hogy kizárjuk a pozitív kataláz-próbát adó aerob és fakultatív anaerob Bacillus fajokat. A kataláz-próba – amelyet egy csepp R hígított hidrogén-peroxid– oldat hozzáadásával végzünk – alkalmas különálló telepek vizsgálatára közvetlenül az agar-lemezen vagy indirekt módon, tárgylemezre vitel után. Gázbuborékok képződése pozitív kataláz-próbát jelez. 2. Clostridium perfringens-szám A 2.6.12 fejezetben leírt általános módszer szerint előkészített vizsgálandó termékből nátrium-klorid–pepton–tompítóoldattal (pH 7,0) 1:100 és 1:1000 hígításokat készítünk. Az összes életképes aerob mikroorganizmus-számot tárgyaló 2.6.12 fejezetben leírtak szerint, kis Durham-csövekkel ellátott kémcsövekbe vagy más alkalmas edényekbe töltött „R” táptalajon meghatározzuk a legvalószínűbb baktériumszámot. A keverést a lehető legkevesebb rázással, az inkubálást 24-48 órán át 45,5-46,5 °C-on végezzük. Ha vas-szulfidtól eredő feketedés mutatkozik és a Durham-csövekben bőséges (a térfogat legalább tizedrészének megfelelő) gázfejlődést észlelünk, ez Cl. perfringens jelenlétére utal. A legvalószínűbb Cl. perfringens számot a 2.6.13.-2. táblázat segítségével állapítjuk meg. Ellenőrzés. A következő törzseket használjuk: Az 1. módszerhez: Clostridium sporogenes, pl. ATCC 19404 (NCTC 532) vagy CIP 79.3; A 2. módszerhez:

Clostridium perfringens, pl. ATCC 13124 (NCIMB 6125, NCTC 8237, CIP 103409).

Szükség esetén Cl. sporogenesszel együtt alkalmazzuk, a szelektivitás és az anaerob körülmények ellenőrzésére. 2.6.13.-2. táblázat – A legvalószínűbb mikroorganizmusszámok (Most-probablenumber – MPN)

2.6.13. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.6.0. – 7 Minden hígításhoz 3 kémcső Pozitív kémcsövek száma

MPN/g

0,1 g

0,01 g

0,001 g

0

0

0

<3

0

1

0

3

1

0

0

3

1

0

1

7

1

1

0

7

1

2

0

11

2

0

0

9

2

0

1

14

2

1

0

15

2

1

1

20

2

2

0

21

3

0

0

3

0

3

Besorolás* 1

2

95%-os konfidenciahatárok –

–

<1

17

1

21

2

27

2

28

4

35

2

38

5

48

5

50

8

61

x

8

63

23

x

7

129

1

38

x

10

180

1

0

43

x

20

210

3

1

1

75

x

20

280

3

2

0

93

x

30

390

3

2

1

150

x

50

510

3

2

2

210

80

640

3

3

0

240

x

100

1400

3

3

1

460

x

200

2400

3

3

2

1100

x

300

4800

3

3

3

>1100

–

–

x x x x x x x x x

x

*

1. kategória: normálisnak tekinthető (elfogadható) eredmények; az esetek 95%-ában fordulnak elő.

2. kategória: kevésbé valószínű (kevésbé elfogadható) eredmények; mindössze az esetk 4%-ában fordulnak elő. Fontos döntéseknél nem használhatók! A 2. kategóriánál kevésbé valószínű eredmények a táblázatban nem szerepelnek és soha nem tekinthetők elfogadhatónak.

A fejezet következő része tájékoztató jellegű.


AJÁNLOTT OLDAT ÉS TÁPTALAJOK A következő oldat és táptalajok bizonyultak alkalmasnak a mikrobiológiai szennyezésekre előírt gyógyszerkönyvi vizsgálatokhoz. Más táptalajok is használhatók, ha a vizsgálandó mikroorganizmusokra nézve hasonló növekedést elősegítő és szelektív tulajdonságokkal rendelkeznek. Nátrium-klorid–pepton–tompítóoldat (pH 7,0) Kálium-dihidrogén-foszfát Dinátrium-hidrogén-foszfát-dihidrát

3,6 g 7,2 g; 0,067 M foszfáttal egyenértékű

Nátrium-klorid

4,3 g

Pepton (hús- vagy kazeinpepton)

1,0 g

Tisztított víz

1000 ml

Az oldathoz felületaktív anyagokat vagy antimikrobás szereket semlegesítő inaktivátorokat adhatunk, mint pl.: Poliszorbát 80

1–10 g/l

Az oldatot autoklávban 121 °C-on 15 percen át sterilezzük. „A” folyékony táptalaj (szója-kazein folyékony táptalaj) Kazeinpepton (pankreász-hidrolizátum)

17,0 g

Szójapepton (papain-hidrolizátum)

3,0 g

Nátrium-klorid

5,0 g

Dikálium-hidrogén-foszfát

2,5 g

Glükóz-monohidrát

2,5 g

Tisztított víz

1000 ml

A táptalaj pH-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 7,3 ± 0,2 legyen. A táptalajt autoklávban 121 °C-on 15 percen át sterilezzük. „B” agar-táptalaj (szója-kazein agar-táptalaj) Kazeinpepton (pankreász-hidrolizátum)

15,0 g


5,0 g

Nátrium-klorid

5,0 g

Agar Tisztított víz

15,0 g 1000 ml


A táptalaj pH-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 7,3 ± 0,2 legyen. A táptalajt autoklávban 121 °C-on 15 percen át sterilezzük. „C” agar-táptalaj (antibiotikum-tartalmú Sabouraud-glükóz-agar) Pepton (hús- és kazeinpepton)

10,0 g


40,0 g

Agar

15,0 g

Tisztított víz

1000 ml

A táptalaj pH-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 5,6 ± 0,2 legyen. A táptalajt autoklávban 121 °C-on 15 percen át sterilezzük. Közvetlenül felhasználás előtt a táptalajhoz literenként 0,10 g benzilpenicillin-nátrium és 0,10 g tetraciklin steril oldatát elegyítjük, vagy a sterilezés előtt literenként 50 mg klóramfenikolt keverünk a táptalajhoz. „D” folyékony táptalaj (laktóz-tartalmú folyékony táptalaj) Marhahúskivonat

3,0 g

Zselatin (pankreász-hidrolizátum)

5,0 g

Laktóz-monohidrát

5,0 g

Tisztított víz

1000 ml

A táptalaj pH-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 6,9 ± 0,2 legyen. A táptalajt autoklávban 121 °C-on 15 percen át sterilezzük, majd azonnal lehűtjük. „E” folyékony dúsító táptalaj (Mossel-féle folyékony dúsító táptalaj enterobaktériumok vizsgálatához) Zselatin (pankreász-hidrolizátum)

10,0 g


5,0 g

Szárított marhaepe

20,0 g

Kálium-dihidrogén-foszfát

2,0 g

Dinátrium-hidrogén-foszfát-dihidrát

8,0 g

Brillantzöld Tisztított víz

15 mg 1000 ml

A táptalaj pH-ját úgy állítjuk be, hogy értéke a melegítés után 7,2 ± 0,2 legyen. A táptalajt 100 °C-on 30 percen át melegítjük, majd azonnal lehűtjük.


„F” agar-táptalaj (kristályibolya-neutrálvörös-epesavas-agar glükózzal) Élesztőkivonat

3,0 g


7,0 g

Epesavas sók

1,5 g

Laktóz-monohidrát Nátrium-klorid

10,0 g 5,0 g


10,0 g

Agar

15,0 g

Neutrálvörös

30 mg

Kristályibolya

2 mg

Tisztított víz

1000 ml

A táptalaj pH-ját úgy állítjuk be, hogy értéke melegítés után 7,4 ± 0,2 legyen. A táptalajt forrásig melegítjük. Autoklávban nem szabad hevíteni. „G” folyékony táptalaj (MacConkey folyékony táptalaj) Zselatin (pankreász-hidrolizátum)

20,0 g

Laktóz-monohidrát

10,0 g


5,0 g

Brómkrezolbíbor Tisztított víz

10 mg 1000 ml

A táptalaj pH-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 7,3 ± 0,2 legyen. A táptalajt autoklávban 121 °C-on 15 percen át sterilezzük. „H” agar-táptalaj (MacConkey agar) Zselatin (pankreász-hidrolizátum) Pepton (hús- és kazeinpepton) Laktóz-monohidrát

17,0 g 3,0 g 10,0 g

Nátrium-klorid

5,0 g

Epesavas sók

1,5 g

Agar Neutrálvörös Kristályibolya

13,5 g 30,0 mg 1 mg

2.6.13. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.6.0. – 11 Tisztított víz

1000 ml

A táptalaj pH-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 7,1 ± 0,2 legyen. A táptalajt állandó rázogatás közben 1 percen át forraljuk, majd autoklávban 121 °Con 15 percen át sterilezzük. „I” folyékony táptalaj (tetrationát-epe-brillantzöld-táptalaj) Pepton

8,6 g


8,0 g

Nátrium-klorid

6,4 g

Kalcium-karbonát

20,0 g

Kálium-tetrationát

20,0 g

Brillantzöld

70 mg

Tisztított víz

1000 ml

A táptalaj pH-ját úgy állítjuk be, hogy értéke melegítés után 7,0 ± 0,2 legyen. A táptalajt forrásig melegítjük. Újramelegíteni nem szabad. „J” agar-táptalaj (dezoxikolát-citrát-agar) Marhahúskivonat

10,0 g

Húspepton

10,0 g

Laktóz-monohidrát

10,0 g

Nátrium-citrát

20,0 g

Vas(III)-citrát

1,0 g

Nátrium-dezoxikolát

5,0 g

Agar

13,5 g

Neutrálvörös

20 mg

Tisztított víz

1000 ml

A táptalaj pH-ját úgy állítjuk be, hogy értéke melegítés után 7,3 ± 0,2 legyen. A táptalajt óvatosan forrásig melegítjük, 1 percen át forraljuk, majd 50 °C-ra lehűtve Petri-csészékbe osztjuk szét. Autoklávban nem szabad melegíteni. „K” agar-táptalaj (xilóz-lizin-dezoxikolát-agar) Xilóz

3,5 g

L-lizin

5,0 g

2.6.13. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.6.0. – 12 Laktóz-monohidrát

7,5 g

Szacharóz

7,5 g

Nátrium-klorid

5,0 g

Élesztőkivonat

3,0 g

Fenolvörös

80 mg

Agar

13,5 g


2,5 g

Nátrium-tioszulfát

6,8 g

Ammónium-vas(III)-citrát

0,8 g

Tisztított víz

1000 ml

A táptalaj pH-ját úgy állítjuk be, hogy értéke melegítés után 7,4 ± 0,2 legyen. A táptalajt forrásig melegítjük, majd 50 °C-ra lehűtve Petri-csészékbe osztjuk szét. Autoklávban nem szabad melegíteni. „L” agar-táptalaj (brillantzöld-fenolvörös-laktóz-szacharóz-agar) Pepton (hús- és kazeinpepton)

10,0 g

Élesztőkivonat

3,0 g

Nátrium-klorid

5,0 g

Laktóz-monohidrát

10,0g

Szacharóz

10,0 g

Agar

20,0 g

Fenolvörös

80 mg

Brillantzöld

12,5 mg

Tisztított víz

1000 ml

A táptalajt forrásig melegítjük és egy percig ezen a hőmérsékleten tartjuk; pH-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 6,9 ± 0,2 legyen. Közvetlenül felhasználás előtt autoklávban 121 °C-on 15 percen át sterilezzük, majd 50 °C-ra lehűtve Petri-csészékbe osztjuk szét. „M” agar-táptalaj (vas(III)-három cukor-agar) Marhahúskivonat

3,0 g

Élesztőkivonat

3,0 g

Pepton (kazein- és marhahús-pepton)

20,0 g

2.6.13. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.6.0. – 13 Nátrium-klorid

5,0 g

Laktóz-monohidrát

10,0 g

Szacharóz

10,0 g


1,0 g

Vas(III)-ammónium-citrát

0,3 g


0,3 g

Fenolvörös

25 mg

Agar

12,0 g

Tisztított víz

1000 ml

Rázogatás közben a táptalajt forrásig melegítjük és egy percig ezen a hőmérsékleten tartjuk; pH-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 7,4 ± 0,2 legyen. A kémcsöveket magasságuk egyharmadáig töltjük táptalajjal, autoklávban 121 °C-on 15 percen át sterilezzük, majd olyan helyzetben hagyjuk lehűlni, hogy mély réteg és ferde felszín keletkezzék. „N” agar-táptalaj (cetrimid-agar) Zselatin (pankreász-hidrolizátum) Magnézium-klorid Kálium-szulfát Cetrimid Agar

20,0 g 1,4 g 10,0 g 0,3 g 13,6 g

Tisztított víz

1000 ml

Glicerin

10,0 ml

Rázogatás közben a táptalajt forrásig melegítjük és egy percig ezen a hőmérsékleten tartjuk; pH-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 7,2 ± 0,2 legyen. A táptalajt végül autoklávban 121 °C-on 15 percen át sterilezzük. „O” agar-táptalaj (Baird-Parker-agar) Kazeinpepton (pankreász-hidrolizátum)

10,0 g

Marhahúskivonat

5,0 g

Élesztőkivonat

1,0 g

Lítium-klorid

5,0g

Agar

20,0 g

2.6.13. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.6.0. – 14 Glicin

12,0 g

Nátrium-piruvát

10,0 g

Tisztított víz

950 ml

Rázogatás közben a táptalajt forrásig melegítjük és egy percig ezen a hőmérsékleten tartjuk; pH-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 6,8 ± 0,2 legyen. A táptalajt ezután autoklávban 121 °C-on 15 percen át sterilezzük, majd 45-50 °C-ra lehűtjük és 10 ml steril, 10 g/l töménységű kálium-tellurit–oldatot, valamint 50 ml tojássárgája-emulziót elegyítünk hozzá. „P” táptalaj (folyékony megerősített táptalaj clostridiumokhoz) Marhahúskivonat

10,0 g

Pepton

10,0 g

Élesztőkivonat

3,0 g

Oldható keményítő

1,0 g


5,0 g

Cisztein-hidroklorid

0,5 g

Nátrium-klorid

5,0 g

Nátrium-acetát

3,0 g

Agar

0,5 g

Tisztított víz

1000 ml

Az agart duzzasztjuk, majd folyamatos keverés közben forrásig melegítve oldjuk. Amennyiben szükséges, a táptalaj pH-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után kb. 6,8 legyen. A táptalajt autoklávban 121 °C-on 15 percen át sterilezzük. „Q” táptalaj (Columbia-agar) Kazeinpepton (pankreász-hidrolizátum)

10,0 g

Húspepton (pepszin-hidrolizátum)

5,0 g

Szívpepton (pankreász-hidrolizátum)

3,0 g

Élesztőkivonat

5,0 g

Kukoricakeményítő

1,0 g

Nátrium-klorid

5,0 g

Agar (gélképző-képességtől függően) Tisztított víz

10,0–15,0 g 1000 ml


Az agart duzzasztjuk, majd folyamatos keverés közben forrásig melegítve oldjuk. Amennyiben szükséges, a táptalaj pH-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 7,3 ± 0,2 legyen. Autoklávban 121 °C-on 15 percen át sterilezzük, majd 45-50 °C-ig hagyjuk lehűlni. A táptalajhoz szükség esetén 20 mg gentamicinbázisnak megfelelő mennyiségű gentamicin-szulfátot adunk, majd Petri-csészékbe osztjuk szét. „R” táptalaj (folyékony laktóz–szulfit táptalaj) Kazeinpepton (pankreász-hidrolizátum)

5,0 g

Élesztőkivonat

2,5 g

Nátrium-klorid

2,5 g

Laktóz-monohidrát

10,0 g


0,3 g

Tisztított víz

1000 ml

Az alkotórészek oldása után az oldat pH-ját 7,1 ± 0,1 értékre beállítjuk. A táptalaj 8 ml-es részleteit kis Durham-csövet tartalmazó, 16 × 160 mm méretű kémcsövekbe töltjük, majd autoklávban 121 °C-on 15 percen át sterilezzük és 4 °C-on tároljuk. A táptalajt felhasználás előtt 5 percig vízfürdőben melegítjük, majd lehűtjük. Mindegyik kémcsőbe 0,5 ml-t mérünk R nátrium-diszulfit 12 g/l töménységű oldatából és 0,5 ml-t ammónium-vas(III)-citrát 10 g/l töménységű oldatából. Mindkét oldatot frissen készítjük és membránszűrőn szűrjük (pórusméret: 0,45 µm). „S” agar-táptalaj (R2A-táptalaj)) Élesztőkivonat

0,5 g

Proteáz pepton

0,5 g

Kazein-hidrolizátum

0,5 g

Glükóz

0,5 g

Keményítő

0,5 g


0,3 g

Magnézium-szulfát (vízmentes) Nátrium-piruvát Agar Tisztított víz

0,024 g 0,3 g 15,0 g 1000 ml


A táptalaj pH-ját úgy állítjuk be, hogy értéke a sterilezés után 7,4 ± 0,2 legyen. A táptalajt autoklávban 121 °C-on 15 percen át sterilezzük. SEMLEGESÍTŐSZEREK A semlegesítőszereket antimikrobás szerek hatásának semlegesítésére használhatjuk. Ezeket, célszerűen még a sterilezés előtt, a nátrium-klorid–pepton– tompítóoldathoz (pH 7,0) keverjük. Használatuk esetén bizonyítani kell hatékonyságukat és azt, hogy a mikroorganizmusokkal szemben nem toxikusak. Egy tipikus semlegesítő folyadék összetétele a következő: Poliszorbát 80

30 g

Lecitin (tojásból)

3g

Hisztidin-hidroklorid

1g


1g

Nátrium-klorid

4,3 g


3,6 g


7,2 g

Tisztított víz

1000 ml

A keveréket autoklávban 121 °C-on 15 percig sterilezzük. Amennyiben az oldat semlegesítő hatékonysága nem kielégítő, megnövelhetjük a poliszorbát 80 vagy a lecitin koncentrációját. Úgy is eljárhatunk, hogy a 2.6.13.-3. táblázatban feltüntetett semlegesítőszereket használjuk. 2.6.13.-3. táblázat – Antimikrobás szerek hatását megszüntető szerek (inaktivátorok), amelyeket a nátrium-klorid–pepton–tompítóoldathoz (pH 7,0) adunk Az antimikrobás szer típusa

Inaktivátor

Koncentráció

Megjegyzés

fenolok

nátrium-lauril-szulfát

4 g/l

poliszorbát 80 és lecitin

30 g/l és 3 g/l

tojássárgája

5–50 ml/l

A nátrium-klorid– pepton–tompítóoldat (pH 7,0) sterilezése után adjuk az oldathoz

szerves higanyvegyületek

nátrium-tioglikolát

0,5–5 g/l

halogének

nátrium-tioszulfát

5 g/l


kvaterner ammóniumvegyületek

tojássárgája

5–50 ml/l

A nátrium-klorid– pepton–tompítóoldat (pH 7,0) sterilezése után adjuk az oldathoz

B. A HARMONIZÁLT MÓDSZER 1. BEVEZETÉS Az alábbiakban leírt vizsgálatok lehetővé teszik az adott körülmények között kimutatható, meghatározott mikroorganizmusok távollétének vagy korlátozott jelenlétének megállapítását. A vizsgálatok kialakításának fő szempontja az volt, hogy egy adott anyagról vagy termékről megállapítható legyen: megfelel-e a mikrobiológiai minőségre megállapított követelménynek. Amennyiben a vizsgálatokat ebből a célból végezzük, az alábbi útmutatások szerint járjunk el, az előírt mintaszámot is figyelembe véve, és az eredményeket a következők szerint értelmezzük. Más mikrobiológiai eljárások, például automatizált módszerek is használhatók, amennyiben igazolták, hogy egyenértékűek a Gyógyszerkönyvben leírt módszerrel. 2. ÁLTALÁNOS ELJÁRÁSOK A mintákat a 2.6.12 általános fejezetben („B. A harmonizált módszer”) leírtak szerint készítjük elő. A termék esetleges antimikrobás hatását – adott esetben – amennyire lehetséges meg kell szüntetni vagy semlegesíteni kell, a 2.6.12. általános fejezetben („B. A harmonizált módszer”) leírtak szerint. Amennyiben a mintaelőkészítésnél felületaktív anyagokat használunk, úgy a 2.6.12 általános fejezetben („B. A harmonizált módszer”) leírtak szerint igazolni kell, hogy a mikroorganizusokra nem toxikusak és az inaktiválószerekkel nem összeférhetetlenek. 3. A TÁPTALAJOK MIKROORGANIZMUS-NÖVEKEDÉST ELŐSEGÍTŐ ÉS GÁTLÓ TULAJDONSÁGAI ÉS A VIZSGÁLAT ALKALMASSÁGA Meg kell állapítani, hogy a vizsgálat alkalmas-e mikroorganizmusok kimutatására a vizsgálandó termék jelenlétében. A módszer alkalmasságát újra igazolni kell, ha a módszerben vagy a termékben olyan változás történik, amely befolyásolhatja a vizsgálat eredményét.


3-1. REFERENCIATÖRZSEK KÉSZÍTÉSE A referenciatörzsek stabilizált szuszpenzióit használjuk, illetve az alábbiak szerint referenciatörzseket készítünk. Oltócsíra-tenyészetet fenntartó módszereket (oltócsíra-rendszerek) alkalmazunk, oly módon, hogy a beoltáshoz használt életképes mikroorganizmusok az oltócsíra-törzstételhez képest legfeljebb 5 átoltásból származzanak. 3-1-1. Aerob mikroorganizmusok. Az egyes baktérium referenciatörzseket különkülön folyékony szója-kazein táptalajon vagy szója-kazein-agar táptalajon 30–35 °C-on 18–24 órán át inkubáljuk. A Candida albicans referenciatörzset külön Sabouraud-glükóz-agar táptalajon vagy folyékony Sabouraud-glükóz táptalajon 20–25 °C-on 2–3 napig inkubáljuk. −

Staphylococcus aureus pl. ATCC 6538, NCIMB 9518, CIP 4.83 vagy NBRC 13276;

−

Pseudomonas aeruginosa pl. ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118 vagy NBRC 13275;

−

Escherichia coli pl. ATCC 8739, NCIMB 8545, CIP 53.126 vagy NBRC 3972;

−

Salmonella enterica ssp. enterica typhimurium szerotípus, pl. ATCC 14028, vagy más lehetőségként Salmonella enterica ssp. enterica abony szerotípus, pl. NBRC 100797, NCTC 6017 vagy CIP 80.39;

−

Candida albicans pl. ATCC 10231, NCPF 3179, IP 48.72 vagy NBRC 1594.

A szuszpenziók készítéséhez nátrium-klorid–pepton–tompítóoldatot (pH 7,0) vagy foszfát–tompítóoldatot (pH 7,2) használunk. A szuszpenziókat 2 órán belül, illetve ha 2–8 °C-on tároltuk 24 órán belül felhasználjuk. 3-1-2. Clostridiumok. A Clostridium sporogenes következő törzseit használjuk: pl. ATCC 11473 (NBRC 14293, NCIMB 12343, CIP 100651) vagy ATCC 19404 (NCTC 532 vagy CIP 79.03) vagy NBRC 14293. A clostridium-referenciatörzset anaerob körülmények között, clostridiumokhoz készült megerősített táptalajon 30– 35 °C-on 24–48 órán át szaporítjuk. A vizsgálati beoltásra – a Cl. sporogenes vegetatív sejtjei friss szuszpenziójának készítése és azt követő hígítása alternatívájaként – stabil spóraszuszpenzió is használható. A stabil szuszpenzió 2–8 °C-on egy validált időtartamig eltartható. 3-2. NEGATÍV KONTROLL


A vizsgálati körülmények ellenőrzésére negatív kontroll vizsgálatot végzünk, melynek során a vizsgálandó készítmény helyett a választott hígítófolyadékot alkalmazzuk. Ebben mikroorganizmus-növekedés nem következhet be. 3-3. TÁPTALAJOK MIKROORGANIZMUS-NÖVEKEDÉST ELŐSEGÍTŐ ÉS GÁTLÓ TULAJDONSÁGAI A kész táptalajok, valamint a szárított táptalajból vagy az összetevőiből készített táptalajok minden gyártási tételét vizsgáljuk. A 2.6.13.-4. táblázat szerint ellenőrizzük a releváns táptalajok megfelelő tulajdonságait. 2.6.13.-4. táblázat – A táptalajok mikroorganizmus-növekedést elősegítő, gátló és jelző tulajdonságai

Vizsgálat epeálló Gram-negatív baktériumokra

Vizsgálat Escherichia coli-ra

Táptalaj

Tulajdonság

Mossel-féle folyékony dúsító táptalaj enterobaktériumokhoz

Szaporodás-serkentő

Referenciatörzs E. coli P. aeruginosa

Gátló

S. aureus

Szaporodás-serkentő + jelző

E. coli P. aeruginosa

MacConkey-féle folyékony táptalaj


E. coli

Gátló

S. aureus

MacConkey-féle agartáptalaj


E. coli


Salmonella enterica ssp. enterica typhimurium szerotípus vagy Salmonella enterica ssp. enterica abony szerotípus

Gátló

S. aureus

kristályibolya-neutrálvörösepesavas-agar táptalaj glükózzal

Rappaport Vassiliadis-féle folyékony Salmonella-dúsító táptalaj Vizsgálat Salmonella-ra Xilóz-lizin-dezoxikolát-agar táptalaj

Salmonella enterica ssp. enterica Szaporodás-serkentő + typhimurium szerotípus jelző vagy Salmonella enterica ssp. enterica abony szerotípus Jelző

E. coli

2.6.13. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.6.0. – 20 Vizsgálat Pseudomonas aeruginosa-ra

Cetrimid-agar táptalaj

Vizsgálat Staphylococcus aureus-ra

Mannit-nátrium-klorid táptalaj

Vizsgálat clostridiumokra

Vizsgálat Candida albicans-ra


P. aeruginosa

Gátló

E. coli


S. aureus

Gátló

E. coli

Megerősített táptalaj clostridiumokhoz


Cl. sporogenes

Columbia-agar táptalaj


Cl. sporogenes

Sabouraud-glükóz folyékony táptalaj


C. albicans

Sabouraud-glükóz-agar táptalaj


C. albicans

A mikroorganizmus-növekedést elősegítő tulajdonság vizsgálata folyékony táptalajok esetén: a megfelelő táptalaj adott mennyiségét kisszámú (legfeljebb 100 CFU) megfelelő mikroorganizmussal beoltjuk. A beoltott táptalajt a megadott hőmérsékleten legfeljebb a vizsgálatban megadott legrövidebb időtartamig inkubáljuk. A mikroorganizmus-növekedés tisztán látható legyen, és mértéke hasonló legyen a táptalaj egy korábban vizsgált és előzetesen jóváhagyott gyártási tételéhez. A mikroorganizmus-növekedést elősegítő tulajdonság vizsgálata szilárd táptalajok esetén: a felszíni szélesztéses módszert alkalmazzuk. A lemezeket kisszámú megfelelő mikroorganizmussal (legfeljebb 100 CFU) oltjuk be. A lemezeket a megadott hőmérsékleten legfeljebb a vizsgálatban megadott legrövidebb időtartamig inkubáljuk. A mikroorganizmus-növekedés hasonló mértékű legyen a táptalaj egy korábban vizsgált és előzetesen jóváhagyott gyártási tételéhez. A gátló tulajdonság vizsgálata folyékony vagy szilárd táptalajok esetén: a megfelelő táptalajt a megfelelő mikroorganizmus legalább 100 CFU mennyiségével beoltjuk. A táptalajokat a megadott hőmérsékleten legalább a vizsgálatban megadott leghosszabb időtartamig inkubáljuk. Mikroorganizmusszaporodás ne legyen megfigyelhető. A jelző tulajdonság vizsgálata: a felszíni szélesztéses módszert alkalmazzuk. A lemezeket kisszámú megfelelő mikroorganizmussal (legfeljebb 100 CFU) oltjuk be. A lemezeket a megadott hőmérsékleten annyi ideig inkubáljuk, ami a vizsgálatban megadott legrövidebb és leghosszabb időtartam közé esik. A mikroorganizmus-telepeknek – küllemüket és jelző reakciójukat tekintve – hasonlónak kell lenniük a táptalaj egy korábban vizsgált és előzetesen jóváhagyott gyártási tételéhez.


3-4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ALKALMASSÁGA A mintaelőkészítést minden egyes vizsgálandó termék esetében a 4. rész megfelelő pontjában előírtak szerint végezzük el. Az egyes referenciatörzseket keverés közben adjuk az előírt táptalajhoz. A referenciatörzseket egyenként oltjuk be. A beoltott vizsgálati készítményben a mikroorganizmusok legfeljebb 100 CFU-nak megfelelő mennyiségét alkalmazzuk. A vizsgálatot a 4. rész megfelelő pontja szerint végezzük; a legrövidebb előírt inkubálási időt alkalmazzuk. A megadott mikroorganizmusokat a 4. részben előírt jelző reakciókkal kell kimutatni. A termék bármilyen antimikrobás hatása a vizsgálati módszer változtatását teszi szükségessé [lásd a 2.6.12 általános cikkely 4-5-3. pontját („B. A harmonizált módszer”)]. Amennyiben nem semlegesíthető az adott termék antimikrobás aktivitása a vizsgálandó mirkoorganizmussal szemben, úgy azt kell feltételezni, hogy a gátolt mikroorganizmus nem lesz jelen a termékben. 4. A TERMÉKEK VIZSGÁLATA 4-1. EPEÁLLÓ GRAM-NEGATÍV BAKTÉRIUMOK 4-1-1. Mintaelőkészítés és inkubálás. A 2.6.12 általános cikkelyben („B. A harmonizált módszer”) leírtak alapján a vizsgálandó termék legalább 1 g-jának tízszeres hígításából mintát készítünk, azzal az eltéréssel, hogy hígítófolyadékként szója-kazein folyékony táptalajt használunk. Az összekeverést követően a mintát 20–25 °C-on annyi ideig inkubáljuk, amely elegendő a baktériumok újraélesztéséhez, szaporodásukhoz azonban nem (általában 2, de legfeljebb 5 óra). 4-1-2. Vizsgálat mikroorganizmus távollétére. Hacsak nincs más előírás. A termék 4-1-1. szerint készített, 1 g-nak megfelelő térfogatát enterobaktériumok dúsítására szánt Mossel-féle táptalajba oltjuk. A beoltott táptalajt 30–35 °C-on 18– 24 órán át inkubáljuk. A termék megfelel a vizsgálat követelményének, ha telepek nem fejlődnek ki. 4-1-3. Kvantitatív vizsgálat. 4-1-3-1. Kiválasztás és átoltás. A 4-1-1. szerint készített terméket és/vagy annak rendre 0,1, 0,01 és 0,001 g (vagy 0,1, 0,01 és 0,001 ml) terméket tartalmazó hígításait megfelelő mennyiségű enterobaktériumok dúsítására szánt Mossel-féle táptalajba oltjuk. A beoltott táptalajt 30–35 °C-on 24–48 órán át inkubáljuk. Ezt


követően a tenyészeteket egyenként glükóztartalmú kristályibolya-neutrálvörösepesavas-agar táptalaj lemezre oltjuk át. A lemezeket 30–35 °C-on 18–24 órán át inkubáljuk. 4-1-3-2. Értékelés. A telepek megjelenése pozitív eredményt jelent. Feljegyezzük a termék legkisebb pozitív és a legnagyobb negatív eredményt adó mennyiségét. A 2.6.13.-5. táblázat alapján meghatározzuk a valószínű baktériumszámot. 2.6.13.-5. táblázat – Az eredmények értékelése

0,1 g vagy 0,1 ml

0,01 g vagy 0,01 ml

0,001 g vagy 0,001 ml

Valószínű baktériumszám 1 g termékre vonatkoztatva

+

+

+

>103

+

+

–

>102 és <103

+

–

–

>10 és <102

–

–

–

<10

Az egyes termékmennyiségek esetén kapott eredmények

4-2. ESCHERICHIA COLI 4-2-1. Mintaelőkészítés és inkubálás. A 2.6.12 általános cikkelyben („B. A harmonizált módszer”) leírtak alapján a vizsgálandó termék legalább 1 g-jának tízszeres hígításából mintát készítünk. A minta 10 ml-ét vagy 1 g, ill. 1 ml terméknek megfelelő mennyiségét megfelelő mennyiségű (a 3-4. pont szerint vizsgált) szója-kazein folyékony táptalajba oltjuk. Az összekeverést követően a beoltott táptalajt 30–35 °C-on 18–24 órán át inkubáljuk. 4-2-2. Kiválasztás és átoltás. A tartály összerázását követően 1 ml szója-kazein folyékony táptalajt 100 ml MacConkey-táptalajba viszünk át, és a keveréket 42–44 °C-on 24–48 órán át inkubáljuk. Ezt követően Mac Conkey-agar-lemezre átoltva a lemezt 30–35 °C-on 18–72 órán át inkubáljuk. 4-2-3. Értékelés. A telepek megjelenése E. coli lehetséges jelenlétére utal. Az eredmény azonosítási vizsgálatokkal erősíthető meg. A termék megfelel a vizsgálat követelményének, ha telepek nem jelennek meg, vagy ha az azonosítási vizsgálatok negatív eredményt adnak. 4-3. SALMONELLA


4-3-1. Mintaelőkészítés és inkubálás. A 2.6.12 általános cikkelyben („B. A harmonizált módszer”) leírtak alapján a vizsgálandó termékből mintát készítünk. A minta 10 g, ill. 10 ml terméknek megfelelő mennyiségét megfelelő mennyiségű (a 3-4. pont szerint vizsgált) szója-kazein folyékony táptalajba oltjuk. Az összekeverést követően a beoltott táptalajt 30–35 °C-on 18–24 órán át inkubáljuk. 4-3-2. Kiválasztás és átoltás. 10 ml szója-kazein folyékony táptalajt 10 ml Salmonella dúsítására szánt Rappaport Vassiliadis-táptalajba viszünk át, és a keveréket 30–35 °C-on 18–24 órán át inkubáljuk. Ezt követően xilóz-lizindezoxikolát-agar táptalajra átoltást végzünk, majd a lemezeket 30–35 °C-on 18–48 órán át inkubáljuk. 4-3-3. Értékelés. Jól fejlett, vörös, esetleg fekete centrummal rendelkező telepek megjelenése Salmonella lehetséges jelenlétére utal. Az eredmény azonosítási vizsgálatokkal erősíthető meg. A termék megfelel a vizsgálat követelményének, ha a leírt küllemű telepek nem jelennek meg, vagy ha az azonosítási vizsgálatok negatív eredményt adnak. 4-4. PSEUDOMONAS AERUGINOSA 4-4-1. Mintaelőkészítés és inkubálás. A 2.6.12 általános cikkelyben („B. A harmonizált módszer”) leírtak alapján a vizsgálandó termék legalább 1 g-jának tízszeres hígításából mintát készítünk. A minta 10 ml-ét vagy 1 g, ill. 1 ml terméknek megfelelő mennyiségét megfelelő mennyiségű (a 3-4. pont szerint vizsgált) szója-kazein folyékony táptalajba oltjuk. Amennyiben transzdermális tapaszokat vizsgálunk, a minta 2.6.12 általános cikkelyben („B. A harmonizált módszer” 4-5-1. pont) leírtak alapján készült 1 tapasznak megfelelő térfogatát steril membránszűrőn szűrjük, majd 100 ml szója-kazein folyékony táptalajba visszük. Az összekeverést követően a beoltott táptalajt 30–35 °C-on 18–24 órán át inkubáljuk. 4-4-2. Kiválasztás és átoltás. Az átoltás cetrimid-agar-lemezre történik. Az inkubálás hőmérséklete 30–35 °C, időtartama 18–72 óra. 4-4-3. Értékelés. A telepek megjelenése P. aeruginosa lehetséges jelenlétére utal. Az eredmény azonosítási vizsgálatokkal erősíthető meg. A termék megfelel a vizsgálat követelményének, ha a telepek nem jelennek meg, vagy ha az azonosítási vizsgálatok negatív eredményt adnak. 4-5. STAPHYLOCOCCUS AUREUS


4-5-1. Mintaelőkészítés és inkubálás. A 2.6.12 általános cikkelyben („B. A harmonizált módszer”) leírtak alapján a vizsgálandó termék legalább 1 g-jának tízszeres hígításából mintát készítünk. A minta 10 ml-ét vagy 1 g, ill. 1 ml terméknek megfelelő mennyiségét megfelelő mennyiségű (a 3-4. pont szerint vizsgált) szója-kazein folyékony táptalajba oltjuk. Amennyiben transzdermális tapaszokat vizsgálunk, a minta 2.6.12 általános cikkelyben („B. A harmonizált módszer” 4-5-1. pont) leírtak alapján készült 1 tapasznak megfelelő térfogatát steril membránszűrőn szűrjük, majd 100 ml szója-kazein folyékony táptalajba visszük. Az összekeverést követően a beoltott táptalajt 30–35 °C-on 18–24 órán át inkubáljuk. 4-5-2. Kiválasztás és átoltás. Az átoltás mannit-nátrium-klorid-agar-lemezre történik. Az inkubálás hőmérséklete 30–35 °C, időtartama 18–72 óra. 4-5-3. Értékelés. Sárga/fehér, sárga zónával körülvett telepek megjelenése S. aureus lehetséges jelenlétére utal. Az eredmény azonosítási vizsgálatokkal erősíthető meg. A termék megfelel a vizsgálat követelményének, ha a leírt küllemű telepek nem jelennek meg, vagy ha az azonosítási vizsgálatok negatív eredményt adnak. 4-6. CLOSTRIDIUMOK 4-6-1. Mintaelőkészítés és hőkezelés. A 2.6.12 általános cikkelyben („B. A harmonizált módszer”) leírtak alapján a vizsgálandó termékből mintát készítünk. A mintából 2 egyenlő, a vizsgálandó termék 1 g-jának vagy 1 ml-ének megfelelő mennyiségű adagot veszünk., amelyek közül az egyiket 10 percig 80 °C-on melegítjük, majd gyorsan lehűtjük, a másikat viszont nem melegítjük. 4-6-2. Kiválasztás és átoltás. A homogenizált aliquotok 10–10 ml-ét két, egyenként 100 ml clostridiumokhoz készült megerősített táptalajt tartalmazó (38 × 200 mm-es vagy más alkalmas méretű) tartályba visszük. A tartályokat anaerob körülmények között 30–35 °C-on 48 órán át inkubáljuk, majd mindkét edényből Columbia-agar táptalajra átoltást végzünk, amelyet ismét 30–35 °C-on 48 órán át inkubálunk. 4-6-3. Értékelés. Endospórás vagy endospóráktól mentes, negatív kataláz-reakciót adó anaerob pálcák telepeinek megjelenése clostridiumok jelenlétére utal. A termék megfelel a vizsgálat követelményének, ha a Columbia-agaron nem fejlődnek ki anaerob telepek, vagy ha a kataláz-reakció pozitív. 4-7. CANDIDA ALBICANS


4-7-1. Mintaelőkészítés és inkubálás. A 2.6.12 általános cikkelyben („B. A harmonizált módszer”) leírtak alapján a vizsgálandó termékből mintát készítünk. A minta 10 ml-ét vagy legalább 1 g, ill. 1 ml terméknek megfelelő mennyiségét 100 ml Sabouraud-glükóz folyékony táptalajba oltjuk. Az összekeverést követően a beoltott táptalajt 30–35 °C-on 3–5 napig inkubáljuk. 4-7-2. Kiválasztás és átoltás. Az átoltás Sabouraud-glükóz-agar-lemezre történik. Az inkubálás hőmérséklete 30–35 °C, időtartama 24–48 óra. 4-5-3. Értékelés. Fehér telepek megjelenése C. albicans lehetséges jelenlétére utal. Az eredmény azonosítási vizsgálatokkal erősíthető meg. A termék megfelel a vizsgálat követelményének, ha a leírt küllemű telepek nem jelennek meg, vagy ha az azonosítási vizsgálatok negatív eredményt adnak. A fejezet következő része tájékoztató jellegű. 5. AJÁNLOTT OLDATOK ÉS TÁPTALAJOK A következő oldatok és táptalajok bizonyultak alkalmasnak a mikrobiológiai szennyezésekre előírt gyógyszerkönyvi vizsgálatokhoz. Más táptalajok is használhatók, ha a vizsgálandó mikroorganizmusokra nézve hasonló növekedéselősegítő és gátló tulajdonságokkal rendelkeznek. Tompító törzsoldat. Egy 1000 ml-es mérőlombikban 34 g kálium-dihidrogénfoszfátot 500 ml tisztított vízben oldunk. Az oldat pH-ját nátrium-hidroxiddal 7,2 ± 0,2-re állítjuk be, majd térfogatát tisztított vízzel 1000 ml-re egészítjük ki. Homogenizálást követően a tompítóoldatot tartályokba töltjük, sterilezzük és 2–8 °C-on tároljuk. Foszfát–tompítóoldat (pH 7,2). A tompító törzsoldatot tisztított vízzel 1:800 V/V arányban elegyítjük. Az oldatot sterilezzük. Nátrium-klorid–pepton–tompítóoldat (pH 7,0) Kálium-dihidrogén-foszfát Dinátrium-hidrogén-foszfát-dihidrát

3,6 g 7,2 g; 0,067 M foszfáttal egyenértékű

Nátrium-klorid

4,3 g


1,0 g

Tisztított víz

Az oldatot autoklávban validált ciklust alkalmazva sterilezzük.

1000 ml


Szója-kazein folyékony táptalaj Kazeinpepton (pankreász-hidrolizátum)

17,0 g


3,0 g

Nátrium-klorid

5,0 g


2,5 g


2,5 g

Tisztított víz

1000 ml

A táptalaj pH-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 25 °C-on 7,3 ± 0,2 legyen. A táptalajt autoklávban validált ciklus alkalmazásával sterilezzük. Szója-kazein-agar táptalaj Kazeinpepton (pankreász-hidrolizátum)

15,0 g


5,0 g

Nátrium-klorid

5,0 g

Agar Tisztított víz

15,0 g 1000 ml

A táptalaj pH-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 25 °C-on 7,3 ± 0,2 legyen. A táptalajt autoklávban validált ciklus alkalmazásával sterilezzük. Sabouraud-glükóz-agar táptalaj Glükóz

40,0 g

Állati szövet (pepszin-hidrolizátum) és kazeinpepton (pankreász-hidrolizátum) 1:1 arányú elegye

10,0 g

Agar

15,0 g

Tisztított víz

1000 ml

A táptalaj pH-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 25 °C-on 5,6 ± 0,2 legyen. A táptalajt autoklávban validált ciklus alkalmazásával sterilezzük. Burgonya-glükóz-agar táptalaj Burgonyafőzet

200 g

Glükóz

20,0 g

Agar

15,0 g

2.6.13. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.6.0. – 27 Tisztított víz

1000 ml

A táptalaj pH-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 25 °C-on 5,6 ± 0,2 legyen. A táptalajt autoklávban validált ciklus alkalmazásával sterilezzük. Sabouraud-glükóz folyékony táptalaj Glükóz

20,0 g

Állati szövet (pepszin-hidrolizátum) és kazeinpepton (pankreász-hidrolizátum) 1:1 arányú elegye

10,0 g

Tisztított víz

1000 ml

A táptalaj pH-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 25 °C-on 5,6 ± 0,2 legyen. A táptalajt autoklávban validált ciklus alkalmazásával sterilezzük. Mossel-féle folyékony dúsító táptalaj enterobaktériumok vizsgálatához Zselatin (pankreász-hidrolizátum)

10,0 g


5,0 g


20,0 g


2,0 g


8,0 g

Brillantzöld Tisztított víz

15 mg 1000 ml

A táptalaj pH-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 25 °C-on 7,2 ± 0,2 legyen. A táptalajt 100 °C-on 30 percig melegítjük, majd késedelem nélkül lehűtjük. Kristályibolya-neutrálvörös-epesavas-agar táptalaj glükózzal Élesztőkivonat

3,0 g


7,0 g

Epesavas sók

1,5 g

Nátrium-klorid

5,0 g


10,0 g

Agar

15,0 g

Neutrálvörös

30 mg

2.6.13. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.6.0. – 28 Kristályibolya Tisztított víz

2 mg 1000 ml

A táptalaj pH-ját úgy állítjuk be, hogy melegítés után 25 °C-on mért értéke 7,4 ± 0,2 legyen. A táptalajt forrásig melegítjük. Autoklávban nem szabad hevíteni. MacConkey-féle folyékony táptalaj Zselatin (pankreász-hidrolizátum)

20,0 g

Laktóz-monohidrát

10,0 g


5,0 g

Brómkrezolbíbor Tisztított víz

10 mg 1000 ml

A táptalaj pH-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 25 °C-on 7,3 ± 0,2 legyen. A táptalajt autoklávban validált ciklus alkalmazásával sterilezzük. MacConkey-agar táptalaj Zselatin (pankreász-hidrolizátum) Pepton (hús- és kazeinpepton) Laktóz-monohidrát

17,0 g 3,0 g 10,0 g

Nátrium-klorid

5,0 g

Epesavas sók

1,5 g

Agar Neutrálvörös Kristályibolya Tisztított víz

13,5 g 30,0 mg 1 mg 1000 ml

A táptalaj pH-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 25 °C-on 7,1 ± 0,2 legyen. A táptalajt állandó rázogatás közben 1 percen át forraljuk, majd autoklávban validált ciklus alkalmazásával sterilezzük. Rappaport Vassiliadis folyékony dúsító táptalaj Salmonella-hoz Szójapepton Magnézium-klorid-hexahidrát

4,5 g 29,0 g

Nátrium-klorid

8,0 g

Dikálium-foszfát

0,4 g

2.6.13. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.6.0. – 29 Kálium-dihidrogén-foszfát

0,6 g

Malachitzöld

0,036 g

Tisztított víz

1000 ml

Az oldást enyhe melegítés mellett végezzük. A táptalajt autoklávban validált ciklus alkalmazásával sterilezzük, 115 °C-ot meg nem haladó hőmérsékleten. A melegítést és az autoklávozást követően a táptalaj pH-ja 25 °C-on mérve 5,2 ± 0,2 legyen. Xilóz-lizin-dezoxikolát-agar táptalaj Xilóz

3,5 g

L-lizin

5,0 g

Laktóz-monohidrát

7,5 g

Szacharóz

7,5 g

Nátrium-klorid

5,0 g

Élesztőkivonat

3,0 g

Fenolvörös

80 mg

Agar

13,5 g


2,5 g


6,8 g

Ammónium-vas(III)-citrát

0,8 g

Tisztított víz

1000 ml

A táptalaj pH-ját úgy állítjuk be, hogy melegítés után 25 °C-on mért értéke 7,4 ± 0,2 legyen. A táptalajt forrásig melegítjük, majd 50 °C-ra lehűtve Petri-csészékbe osztjuk szét. Autoklávban nem szabad melegíteni. Cetrimid-agar táptalaj Zselatin (pankreász-hidrolizátum) Magnézium-klorid Kálium-szulfát Cetrimid Agar

20,0 g 1,4 g 10,0 g 0,3 g 13,6 g

Tisztított víz

1000 ml

Glicerin

10,0 ml


A táptalajt rázogatás közben forrásig melegítjük és egy percig ezen a hőmérsékleten tartjuk; pH-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 25 °C-on mérve 7,2 ± 0,2 legyen. A táptalajt végül autoklávban validált ciklus alkalmazásával sterilezzük. Mannit-nátrium-klorid-agar táptalaj Kazeinpepton (pankreász-hidrolizátum)

5,0 g

Állati szövet (pepszin-hidrolizátum)

5,0 g

Marhahúskivonat

1,0 g

D-mannit

10,0 g

Nátrium-klorid

75,0 g

Agar

15,0 g

Fenolvörös

0,025 g

Tisztított víz

1000 ml

A táptalajt rázogatás közben forrásig melegítjük és egy percig ezen a hőmérsékleten tartjuk; pH-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 25 °C-on mérve 7,4 ± 0,2 legyen. A táptalajt végül autoklávban validált ciklus alkalmazásával sterilezzük. Folyékony megerősített táptalaj clostridiumokhoz Marhahúskivonat

10,0 g

Pepton

10,0 g

Élesztőkivonat

3,0 g

Oldható keményítő

1,0 g


5,0 g


0,5 g

Nátrium-klorid

5,0 g

Nátrium-acetát

3,0 g

Agar

0,5 g

Tisztított víz

1000 ml

Az agart duzzasztjuk, majd folyamatos keverés közben forrásig melegítve oldjuk. Amennyiben szükséges, a táptalaj pH-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 25 °C-on mérve 6,8 ± 0,2 legyen. A táptalajt autoklávban validált ciklus alkalmazásával sterilezzük.


Columbia-agar táptalaj Kazeinpepton (pankreász-hidrolizátum)

10,0 g

Húspepton (pepszin-hidrolizátum)

5,0 g

Szívpepton (pankreász-hidrolizátum)

3,0 g

Élesztőkivonat

5,0 g

Kukoricakeményítő

1,0 g

Nátrium-klorid

5,0 g

Agar (gélképző-képességtől függően) Tisztított víz

10,0–15,0 g 1000 ml

Az agart duzzasztjuk, majd folyamatos keverés közben forrásig melegítve oldjuk. Amennyiben szükséges, a táptalaj pH-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 25 °C-on mérve 7,3 ± 0,2 legyen. Autoklávban validált ciklus alkalmazásával sterilezzük, majd 45-50 °C-ig hagyjuk lehűlni. A táptalajhoz szükség esetén 20 mg gentamicinbázisnak megfelelő mennyiségű gentamicin-szulfátot adunk, majd Petricsészékbe osztjuk szét.

NEM STERIL TERMÉKEK MIKROBIOLÓGIAI VIZSGÁLATA: VIZSGÁLAT MEGHATÁROZOTT MIKROORGANIZMUSOKRA

Recommend Documents