Chromatografické metody (M. S. Cvět (1872 – 1919) v r. 1906 rozdělil na sloupci práškového uhličitanu vápenatého extrakt listové zeleně na několik frakcí různé barvy)
nejdůležitější a nejčastější analytická a preparační metoda v biochemickém výzkumu dělení látek mezi dvěma fázemi
pevnou - stacionární a pohyblivou – mobilní dochází k opakovanému mnohonásobnému ustavování rovnováhy mezi látkou v mobilní fázi a chromatografickým nosičem
Dělení chromatografických metod podle skupenství mobilní fáze:
• kapalinovou LC (Liquid Chromatography) • plynovou GC (Gas Chromatography) podle skupenství stacionární fáze chromatografie nedělíme: • pojem rozdělovací chromatografie (stacionární fáze je tvořena kapalinou a to buď volnou nebo zakotvenou na pevný nosič)
podle druhu a uspořádání stacionární fáze • kolonovou (pevná stacionární fáze je plněná v kolonách) LC nebo GC • planární (tenkovrstevnou - pevná stacionární fáze je nanesena v tenké vrstvě na inertní podložce – TLC) (papírovou - pevnou stacionární fázi tvoří vlákna celulosy papíru – PC)
Planární chromatografie papírová chromatografie (PC) rozdělovací - stacionární fáze je kapalina zachycená v papíře a mobilní fáze je též kapalná adsorpční - stacionární fáze jsou tuhá vlákna papíru, mobilní fáze je kapalná tenkovrstvá chromatografie (TLC) rozdělovací - stacionární fáze je kapalina zachycená v tenké vrstvě a mobilní fáze je také kapalná adsorpční - stacionární fáze je tuhý adsorbent, který je součástí tenké vrstvy, a mobilní fáze je kapalná
TLC Černý inkoust z popisovače Stabilo. Mobilní fáze: směs ethanol + voda.
Kolonová chromatografie stacionární fáze tvoří sloupec Separace probíhá v koloně, která obsahuje: • stacionární (nepohyblivou) fázi (sorbent) • mobilní (pohyblivou) fázi (eluent) podle tlaku mobilní fáze:
• gravitace – samospád • nízkotlaká a střednětlaká • vysokoúčinné kapalinové chromatografie HPLC (High Performance Liquid Chromatography) - řádově desítky MPa
Schéma kapalinové kolonové chromatografie
Stacionární fáze požívané v chromatografii (Stationary Phase) • • •
pevná gelová kapalná
tato fáze může být:
aktivní nosič (Active Solid) – stacionární fáze je samotný nosič zakotvená (Bonded Phase) - kovalentně vázaná na pevný nosič (Solid Support) imobilizovaná (Immobilized Phase) – imobilizovaná např. polymerací na povrchu nosiče výrazu sorbent nebo pouze nosič se často používá i pro označení chromatografické náplně pro jakýkoli druh chromatografické metody, tj. buď samotný aktivní nosič nebo komplex nosič se zakotvenou fází.
Základní nosiče používané v kapalinové chromatografii •
Mechanická stabilita dovolující maximální průtok za současného minimálního ucpávaní kolony způsobené stlačením částeček nosiče.
•
Chemická stabilita a odolnost proti některých působení látek, změnám pH, odolnost při sterilizaci.
•
Vysoká vazebná kapacita snižuje nároky na objem nosiče a závisí na počtu, hustotě a přístupu k vazebným skupinám.
•
U porézních materiálů je důležité, aby póry nosiče byly větší než je velikost molekul dělených látek.
•
Povrch nosiče by měl být inertní, aby nedocházelo k nespecifickým interakcím mezi nosičem a dělenou látkou.
•
Velikost a tvar částic nosiče ovlivňuje jak rychlost průtoku mobilní fáze tak celkový povrch nosiče a tím i množství vazebných míst. Při použití menších částic dochází sice při stejném průtoku ke zvýšení tlaku v koloně, ale zároveň se zvyšuje celkový povrch a tím i vazebná kapacita.
Celulosa polymer glukosy s β1-4 glykosidickou vazbou tři volné hydroxylové skupiny na jednotku - velmi hydrofilní hydroxylové skupiny - vazba funkčních skupin není moc odolná vůči anorganickým kyselinám, zásadám a oxidačním činidlům
Agarosa Agarosa - polysacharid z agaru (součásti mořských řas Gelidium amansii) velmi porézní hydrofilní gel - nemá velkou odolnost proti působení extrémních hodnot pH síťování dibromopropanolem - odolává pH 3-14 a vysoké teplotě 120 oC síťovacího činidla - velikost pórů v nosiči nesmí být nikdy vysušeny dobré mechanické - nová generace tzv. Fast Flow
Dextran polysacharid - glukosa s β1-6 vazbou jako celulosa - tři hydroxylové skupiny - silně hydrofilní snadno derivatizovatelné funkční skupiny méně odolnější - než celulosa síťovaný dextran - stabilní v rozsahu hodnot pH 2-12 póry - lépe definované než v celulosy výrazné změny v objemu v závislosti na pH a iontové síle
Polyakrylamid Polyakrylamidové gely - polymerizace akrylamidu se síťovacím činidlem N,N’-methylen bisakrylamidem hydrofilní a velmi dobré mechanické vlastnosti velmi odolné vůči působení kyselin a zásad dobře autoklávovatelné gelová a iontoměničová chromatografie
Silikagel na bázi křemíku silanolové skupiny (Si-OH) na povrchu - velmi hydrofilními snadno nahraditelné jinými funkčními skupinami, zakotvenou fází různé druhy chromatografických metod - iontoměničová chromatografie nebo chromatografie na reverzní fázi částice velmi pevné - ideálními nosiči pro HPLC chemicky stabilní - odolávají i působení organických rozpouštědel postupné rozpouštění až při hodnotách vyšších než pH 8 může tvořit buď vlastní porézní částice nebo může být nanesen na skleněné mikrokuličky
Oxid hlinitý (Al2O3) podobné přednosti jako silikagel fyzikální i chemické vlastnosti jsou velmi dobré odolává vysokým tlakům a je odolný vůči rozpouštědlům oproti silikagelu je jeho větší odolnost v širším rozsahu pH neposkytuje povrchové skupiny k chemicky stálým modifikacím se zakotvenou fází
Sklo chemickým působením - porézní sklo CPG (Controlled Pore Glas) velmi dobře definované póry stejně chemicky stálé jako silikagely využití - především v HPLC kolonách
Polymery a pryskyřice syntetické organické polymery (styrén, styréndivinylbenzén, methakrylát a formaldehydové pryskyřice nebo jejich směsi) odolávají relativně vysokým tlaků - nevyrovnají anorganickým nosičům výhoda - velká stabilita vůči silným kyselinám i zásadám separace větších molekul jako jsou proteiny nebo polymery Polymery polystyrénu a formaldehydové pryskyřice se také připravují ve formě asi 1 mm kuliček a jako nosiče iontoměničových skupin k čištění vody.
Vlastnosti nosičů v kapalinové chromatografii
Tvar částic nepravidelné částice • minimální velikost větší něž částic sférických - menší specifický povrch • nízká cena • preparativní velkoobjemové izolace pravidelné sférické částice • hlavní místo v analytických i v preparativních aplikacích • velkém rozsahu velikostí • snadné a reprodukovatelné plnění do kolon • vysoká účinnost • výborná stabilita částic • nízký zpětný tlak v kolonách
Vlastnosti nosičů v kapalinové chromatografii
Velikost částic velikosti od 3 μm pro HPLC kolony až do milimetrů do kolon na čištění vody velikost částic ovlivňuje: • zpětný tlak v chromatografickém systému - nepřímo úměrný druhé mocnině průměru částice • účinnost dělení - menší částice dávají větší účinnost při stejných rozměrech kolony • kolona s částicemi o rozměrech 3 μm má až dvakrát větší účinnost dělení než stejná kolona s částicemi o velikosti 5 μm • zpětný tlak je však až čtyřikrát větší
účinnost dělení - menší částice dávají větší účinnost při stejných rozměrech kolony
Vlastnosti nosičů v kapalinové chromatografii
Specifický povrch částic celkový povrch částic nosiče včetně povrchu pórů vztažený na jednotku hmotnosti - m2/g - nepřímo úměrný velikosti částic - přímo úměrný objemu a nepřímo úměrný velikosti pórů
Rozdělení kapalinových chromatografických metod Typ interakce mezi dělenou látkou a stacionární fází: • adsorpční chromatografii (hydrofobní chromatografie, chromatografie na normální a obrácené fázi, rozdělovací chromatografie) • ionexovou (iotoměničovou) chromatografii
• vylučovací chromatografii (gelová chromatografie, size exclusion chromatografie) • afinitní chromatografii
Adsorpční chromatografie Adsorpce látek na stacionární fázi
historicky děleno na: • Adsorpční chromatografii (Adsorption Chromatography) • Chromatografie na normální a obrácené fázi (Normal and Reverse phase Chromatography) • Hydrofobní chromatografie (Hydrophobic Chromatography – HIC)
Hydrofobní interakce van der Waalsovy síly působící mezi permanentními nebo indukovanými dipóly molekul
Polarita látky počet a polarita funkčních skupin nasycené uhlovodíky < nenasycené uhlovodíky < ethery < estery < aldehydy < ketony < alkoholy < kyseliny.
Polarita stacionární a mobilní fáze polarita stacionární fáze - různé typy zakotvených fází polarita mobilní fáze - směs různých rozpouštědel
Adsorpční chromatografie
Stacionární fáze v adsorpční chromatografii
Chromatografie na normální fázi (Normal Phase Chromatography) Chromatografie na obrácené fázi (ReversedPhase Chromatography)
Chromatografie na normální fázi klasická chromatografická metoda - polární stacionární a nepolární mobilní fázi (původně adsorpční chrom.)
interakcí polárních skupin látky s polárními skupinami na povrchu stacionární fáze Stacionární fáze • silikagel nebo oxid hlinitý • Zakotvené fáze v chromatografii na normální fázi polární skupiny na bázi aminů, nitrilů a diolů na silikagelových nosičích
Chromatografie na obrácené fázi jedna z nejpoužívanějších metod ve vysokoúčinné kapalinové chromatografii stacionární fáze nepolární, mobilní fáze polární
Typická stacionární fáze různě dlouhé alifatické uhlovodíkové řetězce (zakotvená fáze) na silikagelu Typická mobilní fáze směs vody a metanolu, acetonitrilu, acetonu nebo jiných organických rozpouštědel
Adsorpční chromatografie stupeň polarity - typ zakotvené fáze alifatické uhlovodíkové řetězce fenylové skupiny kyanidové skupiny Název
Označení
Amino
NH2
Nitril (Cyano)
CN
Diol
Diol
Methyl
C1
Butyl
C4
Hexyl
C6
Oktyl
C8
Oktyldecyl
Fenyl
C18, ODS
Fenyl
Vzorec
Adsorpční chromatografie Další faktory ovlivňující separaci látek •Carbon loading procentuálním zastoupení uhlíku ve stacionární fázi - se stoupajícím zastoupením uhlíku se zvyšuje i rozlišovací schopnost stacionární fáze
•Endcapping druhotná ochrana silanolových skupin silikagelu
Adsorpční chromatografie
Hydrofobní chromatografie (Hydrophobic Interaction Chromatography HIC)
Specifický termín pro adsorpční chromatografii v proteinové biochemii hydrofobní chromatografie – pouze na dělení proteinů neiontové interakce proteinů se stacionární fází Stacionární fáze - nejčastěji různě dlouhé alifatické řetězce a fenyl síla vazby k bílkovině se zvyšuje v pořadí- methyl, isopropyl, butyl, octyl, fenyl a oktyldecyl
Ionexová (iontoměničová) chromatografie (Ion-Exchange Chromatography)
působení elektrostatických sil mezi kladně a záporně nabitými ionty
reverzibilní vazba iontů funkčních skupin dělené látky s ionizovanými funkčními skupinami na chromatografickém nosiči – ionexu dělení látky na základě: jejich elektrických vlastností množství a druhu nabitých funkčních skupin rozhoduje velikost elektrostatických sil
• ionty s vyšším nábojem vytěsňují ionty s nábojem nižším
• uplatňuje se obecný princip chemické rovnováhy dostatečná koncentrace iontů se slabší vazbou vytěsní i ionty vázané pevněji • toho se využívá při vytěsňování částic uchycených na nosiči Kationty: Ag+ > Cs+ > Rb+ > K+ > NH4+ > Na+ > H+ > Li+ Anionty: I- > NO3- > PO4- > CN- > HSO3- >Cl- > HCO3- > HCOO- > CH3COO- > OH- > F-
V biochemii - ionexová chromatografie nejrozšířenější chromatografickou metodou hlavně při izolaci bílkovin • bílkoviny - na povrchu vedlejší řetězce kyselých a basických aminokyselin
• celkový náboj bílkoviny závisí na počtu jednotlivých kladně a záporně nabitých aminokyselin a na pH prostředí • pI bílkovin – pH při kterém je bílkovina elektroneutrální Protein
pI
pH 4.8
pH 7.2
pH 8
Carbonic Anhydrase
7.0
+16.5
-0.4
-2.7
Carboxypeptidase B
6.2
+12.0
-3.3
-6.3
Chymotrypsin
8.0
+9.0
+2.7
0.0
Lysozyme
9.8
+14.1
+7.9
+6.9
Podmínky při ionexové chromatografii (velká nabídka různých nosičů) Funkční skupiny nabity kladně – anexy záporně – katexy Silné - ionizované přes celou oblast pH (pH 3 - 11) Slabé - užší rozmezí pH, jen částečně ionizovány při hodnotách pH nižších než je pI (látka je nabita kladně) – katex při hodnotách pH vyšších než je pI (látka je záporně nabitá) – anex výběr stacionární fáze • závislý na hodnotě pI bílkoviny • na pH při izolaci - omezení pH stabilitou bílkovin rozdělení bílkovin jejichž pI se výrazně liší - nastavit pH pufru mezi hodnoty pI vždy jedna z bílkovin se zachytí na nosiči a druhá proteče
Název
Zkratka
-CH2N+(CH3)3
trimethylaminomethyl
TAM
-C2H4N+(C2H5)3
triethylaminoethyl
TEAE
-C2H4N+(C2H5)2CH2CH(OH)CH3
diethyl-2-hydroxypropylaminoethyl
QAE, Q
-C2H4N+H3
Aminoethyl
AE
-C2H4NH(C2H5)2
diethylaminoethyl
DEAE
-SO3-
sulpho
S
-CH2SO3-
sulphomethyl
SM
-C3H6SO3-
sulphopropyl
SP
-COO-
carboxy
C
-CH2COO-
carboxymethyl
CM
Vzorec Silný anex
Slabý anex
Silný katex
Slabý katex
Silné ionexy - rozdělení slabých elektrolytů (látek, které potřebují ke své ionizaci extrémní hodnoty pH) Slabé ionexy - dělení v rozmezí pH 6-9 nehrozí nebezpečí denaturace bílkovin nevážou na sebe slabě nabité molekuly nečistot nevyžadují tak silné eluční podmínky
Mobilní fáze používané při ionexové chromatografii vodné roztoky pufrů - alespoň o jednu jednotku vyšší nebo nižší než je pI dělené látky nutná určitá iontová síla - zamezení nespecifickým interakcím mezi dělenou látkou a nosičem (např. hydrofobním interakcím) příliš silné vazbě mezi dělenou látkou a ionexovou skupinou vazbám nečistot na nosič předem stanovit - většinou NaCl o koncentraci 10-50 mM.
pK
pufrační rozmezí
Acetátový
4,76
4,8-5,2
Citrátový
4,76
4,2-5,2
MES
6,15
5,5-6,7
fosfátový
7,2
6,7-7,6
HEPES
7,55
7,6-8,2
Histidin
6,15
5,5-6,0
Imidazol
7
6,6-7,1
8,16
7,5-8,0
pufr Typ nosiče katex
anex
Tris
Vytěsnění (eluce) látek z ionexového nosiče
změna iontové síly mobilní fáze - zvýšená koncentrac doplňkových iontů, které vytěsní dělenou látku
změnou pH - dochází ke změně stupně ionizace jak dělené látky tak i ionexového nosiče - oslabení a přerušení jejich vzájemné interakce, např. proteiny při pH lišícím se přibližně o 0,5 jednotky od jejich pI
Tři typy eluce • Isokratická eluce – jeden typ elučního činidla, v průběhu vytěsňování se nemění • Kroková eluce - typ elučního činidla se skokově mění během vytěsňování • Gradientová eluce - typ elučního činidla se mění během vytěsňování postupně
Gradient maker
Gradient maker jsou dvě spojené nádoby
Tvarem nádob se ovlivní tvar gradientu
Různá strmost gradientové eluce ovlivňuje rozlišení
Vylučovací, gelová chromatografie (Size Exclusion Chromatography) rozdělení na základě velikosti a tvaru
molekulové síto • •
menší částice zadržovány v pórech velké částice vyplaveny ven z kolony
čím menší částice tím více je zadržována
Výběr nosiče trojrozměrná síť pórů definované velikosti polyakryamid, agarosa, dextran nebo jejich vzájemně zesíťované kombinace, nosiče z porézního skla ideální případ - nedochází k nespecifické interakci se směsí dělených látek často - adsorpce látek na zvolený nosič potlačení iontových interakcí vyšší iontovou silou v mobilní fázi - koncentrace NaCl 50 – 100 mM interakce hydrofobního charakteru - přítomnost iontů snížit nebo vyloučit komerčně dostupné nosiče – dělící rozsah od Mr 100 až do 1.108
Vliv tvaru dělené látky • • • •
globulární proteiny membránové proteiny podlouhlá vlákna polysacharidy nebo glykoproteiny
podlouhlé částice se zadržují méně • minimalizace použitím denaturačních činidel (močovina) - náhodné klubko • vláknité polysacharidy - prostředí s vysokou iontovou silou - částice kulového tvaru.
Použití Izolace, čištění a analýza vzorků Stanovení relativní molekulové hmotnosti • Eluční objem resp. retenční čas - závislý relativní molekulové hmotnosti (Mr) • v určitém rozsahu je eluční objem lineárně úměrný přirozenému logaritmu relativní molekulové hmotnosti (log Mr) • kalibrační křivka z proteinů o známých hmotnostech - určení hmotností dělených proteinů Zahušťování Voda a malé molekuly jsou nasáty do polymeru zahuštění makromolekulárních látek v roztoku Odsolování odstranění jiných nízkomolekulárních z roztoku jako např. fenolu nebo sacharózy.
látek
Afinitní chromatografie (Affinity Chromatography) dělení látek - jedinečné, vysoce specifické a reverzibilní biologické interakce s ligandy původně - čištění enzymů reakcí enzymového substrátu jako ligandu s enzymem
Ligandy - nízkomolekulární látky (substráty pro enzymy, peptidy) - celé bílkoviny (interakce protilátka antigen) mnohdy - záměna ligandu a izolované látky (izolovaná látka např. lektin - ligand k izolaci cukrů)
ligand
typ interakce
izolovaná látka
enzymový substrát
enzym substrát
enzym
lektin
cukr-lektin
glykoprotein
protilátka
protilátka-antigen
bílkovina
protein A (protein G)
protein A(G)-protilátka
imunoglobulin
iont kovu
kov-aminokyselina
bílkovina
hormon
hormon-receptor
bílkovina
pigment (triazin)
pigment-protein
protein
thiol
kovalentní chromatografie
protein
inhibitor proteáz
proteázy
mastné kyseliny
proteiny
nukleotidy
nukleové kyseliny
biotin
avidin
heparin
protein
Podmínky nutná znalost struktury a vlastností dělené látky - nastavení specifických podmínek - vazba na ligand a vytěsnění prostorová dostupnost vazebného místa - vazebné místo nemusí být přímo na povrchu částice vazba ligandu na nosič pomocí raménka - několikauhlíkový řetězec vzdálenost mezi nosičem a dělenou látkou - snížení pravděpodobnosti nespecifické interakce délka raménka – individuální, nutno stanovit pomocí experimentu většinou s 6 – 8 atomy uhlíku za optimálních podmínek - pouze vazba ligandu a námi požadované látky ostatní látky a nečistoty jsou vymyty narušení vazba ligand a izolovaná látka – vytěsnění
Nosiče v afinitní chromatografii vhodné vedlejší chemické skupiny k vazbě ligandu nebo raménka s ligandem stálost nosiče i vazby nosič ligand minimální nespecifické interakce s molekulami ostatních látek a nečistot dobré fyzikální vlastnosti - odolnost vůči tlaku, dostatečné průtokové rychlosti. • síťované polysacharidů dextran, agarosa, celulosa nebo polyakrylamidových gelů, polystyrenu, porézního skla nebo silikagelu. Vazba ligandu na nosič příprava nosiče - komerčně dostupný nosič • aktivovaný a připravený k navázání ligandu • s navázaným ligandem
Několik účinných metod používaných k vazbu ligandu na nosič Bromkyanová metoda. nejrozšířenější kladně nabitá (pKa ~ 9,5) a může částečně působit jako ionexová skupina. extrémní pH - pomalá hydrolýza bromkyan - toxický - běžně dostupné komerční nosiče předem aktivované bromkyanem
Bisepoxidová metoda. dochází ke vložení raménka mezi nosič a ligand délka se řídí výběrem vhodného bis-epoxidu
Triazinová metoda. Sulfonyl chloridová metoda.
Karbonyldiimidazolová metoda. Polysacharidový nosič karbonyldiimidazol (CDI) není toxický nevznikají vedlejší skupiny, které by měly iontoměničový charakter
Glutaraldehydová metoda. Aminové skupiny polyakrylamidového gelu nebo agarosy - aktivace glutaraldehydem jednoduchá, účinná a levná metoda OHC-(CH2)3-CHO + NH2-R -> OHC-(CH2)3-CH=N-R Konkrétní postupy - součástí návodu dodaného výrobcem daného nosiče
PLYNOVÁ CHROMATOGRAFIE, GC
Plynový CHROMATOGRAF SEPARACE v GC probíhá v kapilární nebo náplňové koloně, která obsahuje • stacionární (nepohyblivou) fázi (sorbent) • mobilní (pohyblivou) fázi (nosný plyn, inertní plyn či eluent). Rozdílné analyty mají rozdílnou afinitu k sorbentu - jsou rozdílně zadržovány a zpožďovány
NOSNÝ PLYN
N2 , H2 , He , Ar VZORKY plyny a nízkomolekulární organické látky, těkavé DÁVKOVÁNÍ VZORKU se provádí do nástřikové hlavy opatřené septem, která je vyhřívána na zvolenou teplotu a proplachována nosným plynem. plynné vzorky injekční stříkačky o objemu 10 až 1000 mL kapalné vzorky injekční stříkačky o objemu 1 až 100 mL tuhé vzorky roztok ve vhodném rozpouštědle
KOLONY a) náplňové kolony skleněné nebo z nerezové oceli o průměru 1 až 6 mm a délce 0,5 až 10 m s adsorbentem (GSC) se stacionární fází na inertním nosiči (GLC) b) kapilární kolony dříve skleněné nebo z nerezové oceli dnes výhradně křemenné s polyimidem o průměru 0,1 až 0,5 mm o délce 10 až 100 m s chemicky vázanou stacionární fází na stěnách kolony
Nosiče v GC aktivní uhlí, grafitizované uhlí dělení plynů a lehkých uhlovodíků silikagel dělení anorganických plynů a nízkovroucích kapalin
molekulová síta (krystalické hlinitokřemičitany) dělení plynů a lehčích uhlovodíků jako sušidla porézní polymery (vinylbenzenové kopolymery), komerčně tzv. Porapaky dělení nízkomolekulárních uhlovodíků, anorganických plynů, alkoholů, esterů a ketonů
STACIONÁRNÍ FÁZE v GC Carbowaxy (polyethylenglykoly) Ucony (polypropylenglykoly) polární stacionární fáze s rostoucí Mr klesá polarita Polyestery (např. polyethylenglykoladipáty, polypropylenglykoladipáty, polyethylenglykolsukcináty) polární stacionární fáze Silikonové stacionární fáze (polysiloxany) (např. methylpolysiloxan SE-30, fenylmethylpolysiloxan OV-17, fenylpolysiloxan SE-54, kyanopropylpolysiloxan SP-2340) často používané široký rozsah polarity
Detektory v GC Tepelně vodivostní TCD – THERMAL CONDUCTIVITY DETECTOR Změna tepelné vodivosti vlákna (W aj.) při eluci analytu z kolony Univerzální detekce, ale neselektivní, nepříliš citlivý Nosný plyn – malé molekuly, např. vodík Jedinečné řešení pro analýzu nízkomolekulárních plynů Plamenově ionizační FID – FLAME IONIZATION DETECTOR Univerzální odezva pro organické spalitelné látky ve vodíkovém plaménku. Vzniklé ionty způsobí proud mezi elektrodami v detektoru a tím signál. Při eluci látky z kolony se mění proud, vzniká signál, odezva Elektronový záchyt – ELECTRON CAPTURE DETECTOR V detektoru je zdroj elektronů – beta zářič Při eluci elektronegativní látky z kolony nastane pokles proudu elektronů, snížení signálu, vznik odezvy Výhodná detekovatelnost až do řádu pg v nástřiku pro látky s halogeny, nitroskupinami, konjugovanými vazbami Balasty jako tuky se nedetekují, ale kontaminují detektor, zhoršují jeho funkci, je nutná periodická údržba. Hmotnostní – MASS SELECTIVITY DETECTOR Ideální selektivní detektor pro stopovou detekci a identifikaci neznámých nox. Spojení GC-MS.
