PANNON EGYETEM MOLEKULÁRIS- ÉS NANOTECHNOLÓGIÁK DOKTORI ISKOLA
β-D-GALAKTOZIDÁZ IMMOBILIZÁLÁSA NANOSZERKEZETŰ HORDOZÓKRA ÉS AZ ELŐÁLLÍTOTT BIOKATALIZÁTOROK VIZSGÁLATA Doktori (PhD) ÉRTEKEZÉS TÉZISEI KÉSZÍTETTE:
BIRÓ EMESE OKLEVELES VEGYÉSZMÉRNÖK
TÉMAVEZETŐK:
DR. GYENIS JÁNOS PROFESSOR EMERITUS
Dr. SISAK CSABA EGYETEMI DOCENS
PANNON EGYETEM MŰSZAKI KÉMIAI KUTATÓINTÉZET 2012
BEVEZETÉS, CÉLKITŰZÉSEK
Az elmúlt évtizedekben, a biokatalízis a tudományos kutatásban és az iparban egyre inkább vonzó területté vált, mivel a kémiai katalízishez képest nagy specificitás, szelektivitás és előnyös reakciókörülmények jellemzik. A természet nagyszámú biológiai katalizátort kínál, melyek leghatékonyabban fiziológiai körülmények között és természetes szubsztrátokkal működnek. A természetben előforduló enzimek azonban legtöbbször nem alkalmazhatók mesterséges biokatalitikus folyamatokban megfelelő átalakítás és áttervezés nélkül. Ez utóbbiak célja a biokatalizátorok szubsztrát specificitásának és aktivitásának növelése. Az enzimmérnöki technikák látványos fejlődésével olyan enzimek állíthatók elő, amelyek egyre inkább alkalmasak komplex, értékes vegyületek előállítására, de ennek ellenére a biokatalizátorokkal együtt járó instabilitás még megoldandó feladatot jelent. A rögzítés az enzim stabilitás növelésének egyik megoldása lehet, ugyanakkor lehetővé téve a többnyire költséges biokatalizátorok visszanyerését és újrafelhasználását. Ezen kívül a rögzített enzimek használata jelentősen leegyszerűsíti az ipari reaktorok tervezését és a technológiai körülmények szabályozását. Ennek következtében az enzimek immobilizálása rövid időn belül ipari felhasználásuk előfeltételévé válhat. Az utóbbi évtizedekben különböző rögzítési technikákat dolgoztak ki és ezek közül néhányat már jó ideje iparilag is alkalmaznak. Azonban az enzimek és alkalmazhatóságaik változatossága szükségszerűvé teszi új módszerek kidolgozását és a meglevő eljárások tökéletesítését. Az immobilizálási eljárások megfelelő kivitelezése előnyös hatást gyakorolna az egész biokatalízis terület fejlődésére. Doktori munkámban laktóz hasításra alkalmas új heterogén biokatalizátorok előállítási eljárásának kidolgozását tűztem ki célul. Az élelmiszeripar egyik legfontosabb biotechnológiai folyamata a laktóz enzimatikus hidrolízise. A tejben és a tejsavóban található laktóz hasítását a β-D-galaktozidáz vagy más néven a laktáz katalizálja. A hidrolizált laktóz termékek legfőbb előnye, hogy megoldást jelenthetnek a laktózintolerancia csökkentésére, amely a Föld lakosságának több mint felét érinti. A β-Dgalaktozidáz egy másik fontos alkalmazása galakto-oligoszaharidok előállítása, amelyek fontos probiotikumok az emberi szervezet számára. Munkám során két kutatási irányt követtem: (i) eljárást dolgoztam ki β-D-galaktozidáz enzim rögzítésére alkalmas mikro- és nanoméretű kitozán hordozók előállítására, valamint vizsgáltam azoknak a paramétereknek a hatását, amelyek javíthatják a kovalens rögzítés
2
hatékonyságát az általam előállított hordozókon és (ii) szol-géles rögzítési módszer kidolgozása révén magas katalitikus hatékonysággal és nagyobb stabilitással rendelkező nanoszerkezetű biokatalizátorokat állítottam elő. A szol-géles eljárás kiváló lehetőségeket nyújt az immobilizálási folyamat paramétereinek kidolgozására egy adott enzim és alkalmazás specifikus követelményeinek megfelelően. Dolgozatomban kísérlettervezési módszert alkalmaztam, ami lehetővé tette a részecske előállítási folyamat paramétereinek a kapott kitozán mikrorészecskék méretére gyakorolt hatásának tanulmányozását. A kísérlettervezés előnye, hogy csökkenti az “egy paraméteregy időben” módszer esetén szükséges kísérletek nagy számát és megkönnyíti az adott körülmények között legmegfelelőbb változóértékek meghatározását. Doktori disszertációm utolsó fejezetében az előállított heterogén biokatalizátorok tulajdonságait tanulmányoztam. Többek között vizsgáltam stabilitásukat, mivel az enzim rögzítés legfőbb előnye és célja a stabilitás növelése.
KÍSÉRLETI MÓDSZEREK
β-D-galaktozidáz rögzítésére alkalmas kitozán alapú hordozó részecskéket állítottam elő különféle módszerekkel, makrogömbök, mikrogömbök és nanorészecskék formájában. A kitozán makrogömböket kicsapatásos, míg a nanorészecskéket ionotrópos gélképzéssel hoztam létre, majd az enzim rögzítése érdekében glutáraldehiddel funkcionalizáltam. A kitozán mikrogömböket emulziós - glutáraldehides keresztkötéses módszerrel állítottam elő. Az enzimrögzítésre alkalmas minél kisebb mikrorészecskék előállítása érdekében az emulziós keresztkötés során nyerhető mikrorészecskék átlagos méretének változását egy 4faktoriális 3-szintes Box-Behnken féle kísérleti terv alkalmazásával tanulmányoztam, és a kísérleti eredményeket statisztikai elemzéssel értékeltem ki. Előzetes kísérletek alapján ehhez négy független változót választottam ki, így a lehetséges technológiai paraméterek közül a keverési sebesség, a Tween 80 felületaktívanyag koncentráció, a kitozán oldat koncentrációja, valamint a glutáraldehid koncentráció hatásait vizsgáltam. Figyelembe véve a faktorok összes lineáris és négyzetes hatásainak mértékét, valamint a faktorok közötti kölcsönhatásokat, egy statisztikus matematikai modellt állítottam fel. A nem szignifikáns négyzetes hatások és kölcsönhatások elhagyásával, és a regressziós koefficiensek kiszámolásával egy egyszerűsített egyenletet kaptam, amelyben csak négy lineáris hatás és öt kölcsönhatás maradt. Ez a matematikai modell alkalmasnak bizonyult 3
az egyes technológiai paramétereknek az átlagos részecskeméret értékére gyakorolt hatásának megjóslására. Modell enzimként a Kluyveromyces lactis törzsből származó β-D-galaktozidázt választottam, amelyet két módszerrel immobilizáltam: (i) kovalens kötéssel a fent említett általam előállított kitozán hordozó részecskékre; (ii) bezárással nanoszerkezetű szol-gél mátrixokba, újdonságnak számító, nem-hidrolizálható alkil csoportokat tartalmazó szilán prekurzorok alkalmazásával. A kovalens kötés paraméterei közül a kötésre vitt enzim tartalmat, a glutáraldehid koncentrációt és a rögzítési időt vizsgáltam. A szol-géles bezárási eljárást az alkil csoport és az adalékanyagok fajtájának, a különféle szilán prekurzorok mólarányának, valamint a kötésre vitt enzim tartalom vizsgálatával optimalizáltam. Az előállított heterogén biokatalizátorok tulajdonságait pH függésük, termostabilitásuk és működési stabilitásuk szempontjából vizsgáltam. A natív és a rögzített biokatalizátorok kinetikus
állandóit
az
enzim
mesterséges
(o-nitrofenil-β-D-galaktopiranozid)
és
természetes (laktóz) szubsztrátjával is meghatároztam.
ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK 1. Tézis Kicsapatásos - glutáraldehid keresztkötéses, emulziós - glutáraldehid keresztkötéses, és ionotrópos - glutáraldehid keresztkötéses eljárások változatait dolgoztam ki enzim rögzítésre alkalmas kitozán makrogömbök, mikrogömbök és nanorészecskék előállítására. Megállapítottam, hogy a célra legalkalmasabbaknak a mikrogömbök bizonyultak. 1.1. A kicsapatásos - glutáraldehid keresztkötéses módszerrel porozitás nélküli, 3,2 mm-es átlag átmérőjű, szűk méreteloszlású makrogömböket állítottam elő. Megállapítottam, hogy az enzim kötés érdekében 1% és 5% glutáraldehiddel funkcionalizált makrogömbök az eljárás során megszilárdultak és törékenyebbé váltak. 1.2. A mikrogömbök előállítására három eljárást tanulmányoztam: porlasztásoskicsapatást, amelyben kitozán oldatot porlasztottam egy kevertetett kicsapató reagensbe, folyamatos kevertetéses ionotrópos gélképzést és az emulziós keresztkötés módszerét. Megállapítottam, hogy az emulziós keresztkötés a legmegfelelőbb módszer, mivel szűk méreteloszlást és nem agglomerálódó részecskéket kaptam. Az olajfázis összetételének, fajtájának és az emulgeálószer koncentrációjának megfelelő kiválasztásával 20 és 500 µm között, széles mérettartományban állítottam elő részecskéket. Az irodalomban leírt
4
petroléter-paraffin olaj keverékét, környezetbarát napraforgóolaj–n-hexadekán keverékre cseréltem.
Megállapítottam,
hogy
az
adott
körülmények
között
az
előállított
mikrorészecskék morfológiája és enzim rögzítés szempontjából is a 40% napraforgóolaj– 60% n-hexadekán olajfázis keveréke és 3% Tween 80 felületaktívanyag koncentráció bizonyult a legmegfelelőbbnek. 1.3. Nanoméretű kitozán részecskék előállítására az ionotrópos gélképzés módszert találtam a legalkalmasabbnak, majd a megszilárdítás és enzim kötés érdekében a nanorészecskéken glutáraldehides keresztkötést alkalmaztam. Kimutattam, hogy a gélképző ágens fajtája jelentősen befolyásolja az előállított nanorészecskék méretét: nátrium-szulfáttal átlagosan 517 nm-es míg nátrium-tripolifoszfáttal 152 nm-es részecskéket kaptam. (Kapcsolódó publikációk: [1], [4], [5], [9]) 2. Tézis A részecske előállítási folyamat változóinak a kitozán mikrorészecskék átlagméretére gyakorolt szignifikáns hatásait 4-faktoriális 3-szintes Box-Behnken kísérleti tervezéssel tanulmányoztam. Vizsgáltam a keverési sebesség, a Tween 80 felületaktívanyag koncentráció, a kitozán oldat koncentráció és a glutáraldehid koncentráció hatását az előállított részecskék méretére. 2.1. Megállapítottam, hogy nagy keresztkötő ágens koncentrációnál a keverési sebesség növelésével a megnövekedett diszperziós hatás következtében csökkent az elérhető átlagos részecskeméret. Alacsony keresztkötő ágens koncentrációnál a keverés ellentétes irányú hatása érvényesült, valószínűleg a kevésbé szilárd részecskék nagyobb összetapadási hajlama következtében. 2.2. Kimutattam, hogy a felületaktívanyag koncentráció növelése általában csökkentette a részecskék átlagméretét, de magasabb keresztkötő ágens koncentrációnál ez a hatás megszűnt, feltehetően a magasabb viszkozitás vagy a gyorsabban megszilárduló részecskék nehezebb apríthatósága következtében. 2.3. Megállapítottam, hogy a kitozán oldat koncentrációjának van a legjelentősebb hatása, és kimutattam, hogy az emulziós keresztkötéssel előállított részecske mérete annál kisebb minél magasabb a kitozán koncentráció értéke, valószínűleg annak következtében hogy magasabb koncentrációnál a kitozán cseppek gyorsabban megszilárdulnak és kevésbé hajlamosak az összetapadásra. Ebből arra következtettem, hogy a kitozán cseppek
5
elsődleges szétdarabolódása után a kisebb összetapadási hajlam kisebb részecskéket eredményezett. 2.4. Bebizonyítottam, hogy az átlagos részecskeméretet második legjelentősebb hatásként a glutáraldehid koncentrációja befolyásolta, részben a részecskék keménysége, részben azok kisebb összetapadási hajlama következtében, amelyek emiatt szorosan összefüggésbe hozhatók más paraméterek értékeivel. Megállapítottam, hogy magas keverési sebességnél a glutáraldehid koncentráció csökkentése a részecskék átlagméretének hirtelen növekedését eredményezte, a nagyobb mértékű összetapadás következtében. 2.5. A kísérleti adatok statisztikai elemzése révén és nem-lineáris regresszió módszerével az átlagos szemcseméretnek a vizsgált technológiai paraméterek függvényében történő megjóslására elfogadható megbízhatósággal és átlagos hibával rendelkező statisztikus matematikai modellt állítottam fel. Az egyenlet alkalmazhatónak bizonyult a technológiai paraméterek optimalizálására, abból a célból, hogy biokatalizátor hordozóként alkalmas átlagos szemcseméretű, kitozán mikrogömböket állíthassak elő. (Kapcsolódó publikációk: [2], [10], [11]) 3. Tézis Immobilizálási vizsgálataim alapján kimutattam, hogy a β-D-galaktozidáz kovalens rögzítésére a kitozán mikrogömbök bizonyultak legalkalmasabb potenciális hordozóknak, glutáraldehidet használva keresztkötő ágensként. A rögzítést befolyásoló fő tényezők vizsgálata révén az adott körülmények között legmegfelelőbb technológiai paraméterekre a következő megállapításokat tettem: 3.1. Kimutattam, hogy 2%-os és 3%-os glutáraldehid koncentráció hasonló rögzítési hatékonyságot eredményezett, de az utóbbi (3%) koncentrációt választottam, mivel a kisebb szemcseméret és a részecskék magasabb fajlagos felülete következtében ez több kapcsolódási helyet biztosíthat a részecskéken. 3.2.
Megállapítottam,
hogy
a
3%-os
glutáraldehiddel
keresztkötött
kitozán
mikrorészecskék 27 mg fehérje/ g száraz hordozó kötési kapacitással rendelkeztek. 3.3. Kimutattam, hogy a kitozán mikrorészecskékre kötött enzim kapcsolásának legmegfelelőbb reakció ideje 6 óra, mivel ez alatt az idő alatt értem el a kötésre vitt enzimatikus aktivitás visszanyerésének maximális értékét.
6
3.4. Megállapítottam, hogy az adott körülmények között legmegfelelőbb esetben, 3,7 mg kötésre vitt fehérje per 1 g vizes kitozán szemcse értéknél, a fehérje rögzítés hatásfoka elérte a 99%-ot és a kötésre vitt enzimatikus aktivitás visszanyerési hozama a 13,06%-ot. A kovalens kötést követően, a Schiff bázisok nátrium-borohidrides redukciója rugalmasabb és stabilabb amino kötéseket eredményezve, csaknem kétszeresére növelte a katalitikus hatékonyságot. Így a kötésre vitt aktivitás visszanyerése 23,5%-ra nőtt, ami elfogadható eredmény a kovalens kötés esetében. (Kapcsolódó publikációk: [1], [3], [8], [12]) 4. Tézis A β-D-galaktozidázt rögzítettem kovalensen kötött alkil csoportokat tartalmazó szervesszervetlen kompozit mátrixokba szol-géles bezárással vagy szol-gél bezárásos-adszorpciós kombinált módszerrel. Ezen tanulmányaim során nanoszerkezetű biokatalizátorokat állítottam elő magas rögzítési hozammal és aktivitással. 4.1. Kimutattam, hogy a tanulmányozott szilán prekurzorok közül a tetraetoxiszilán és metiltrietoxiszilán 7:1 mólarányával rögzített β-D-galaktozidáz mutatta a legmagasabb aktivitást 3252,78 µmol ONP×min-1×g-1, 6,22 mg fehérje per mmol szilán prekurzor kötésre vitt enzim tartalom mellett. 4.2. A legmagasabb rögzítési hatásfokot ennél alacsonyabb, 4,1 mg fehérje per mmol szilán kötésre vitt enzim tartalomnál értem el, amely 400%-nál magasabb kötésre vitt aktivitás visszanyerési hozamot eredményezett. Ez a magas hozam azt mutatja, hogy a nanoszerkezetű szol-gél mátrixban az enzim aktivitása növekedett a bezárást követően. Ennek lehetséges magyarázata az, hogy az enzim egyenletesebben oszlik el a porózus mátrix belsejében, megakadályozva a biomolekulák aggregálódását és a mátrix belső mikrokörnyezete megvédi az enzimet az inaktiválódási hatásokkal szemben. 4.3. A szol-géles bezárás módszerét adszorpcióval kombináltam és azt tapasztaltam, hogy a legjobb katalitikus hatásfokot kitozán adszorbens használatával értem el. Az így nyert aktivitás nagyon közeli értéket mutatott a szimpla szol-gélbe rögzített β-D-galaktozidáz aktivitásával (körül-belül 3300 enzimatikus egység per g hordozó).
7
5. Tézis A kovalens kötés és szol-géles bezárás módszerével előállított rögzített β-D-galaktozidáz biokatalizátorok tulajdonságai vizsgáltam. Tanulmányoztam pH függésüket, hőmérséklet, működési és tárolási stabilitásukat. 5.1. Megállapítottam, hogy a kovalensen kötött β-D-galaktozidáz a natív enzimhez viszonyítva kissé stabilabbnak mutatkozott magasabb pH értékeken, pH 9-en 50% körüli remanens aktivitást mutatva. A szol-gélbe zárt enzim kitűnő stabilitással rendelkezett bázikus pH értékeken, pH 11-en az aktivitása 90%-át őrizte meg a pH 8,5-ön tapasztalt maximális értékhez viszonyítva. 5.2. A szol-gélbe rögzített β-D-galaktozidáz esetében láthatólag jobb hőstabilitást mutattam ki a natív és a kovalensen kötött enzimekhez viszonyítva. A szol-géles heterogén biokatalizátor inaktiválódását csak 60ºC-on 8 óra inkubálás után tapasztaltam, míg a natív enzim 40ºC-on 3 óra után aktivitásának 50%-át elveszítette. 5.3. A laktóz hidrolízis kinetikai vizsgálatával meghatároztam a Michaelis állandókat (Km) és a következő értékeket kaptam: 140,7 mM a kovalensen kötött, 123,7 mM a szol-gélbe rögzített β-D-galaktozidázra, valamint 84,4 mM a nem-rögzített enzimre. Megállapítottam, hogy a laktóz iránti specificitás csökkenés valószínűleg a magasabb anyagátadási ellenállás és diffuziós gátlás miatt következett be, amely rendszerint fellép a rögzített enzimek alkalmazásánál. 5.4. Kimutattam, hogy a szol-gélbe rögzített enzim magas tárolási és elfogadható működési stabilitással rendelkezett. Öt újrafelhasználási ciklus után az aktivitás 50% körüli értéket mutatott az eredeti aktivitáshoz képest.
KAPCSOLÓDÓ PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE
PUBLIKÁCIÓK
[1] Biró, E., Sz. Németh, A., Sisak, C., Feczkó, T., Gyenis, J., Preparation of chitosan particles suitable for enzyme immobilization, J. Biochem. Biophys. Methods, 2008, 70, 1240-1246. (IF2008 1.994)
8
[2] Biró, E., Németh A.Sz., Feczkó T., Tóth J., Sisak Cs., Gyenis J., Three-step experimental design to determine the effect of process parameters on the size of chitosan microspheres, Chemical Engineering and Processing: Process Intensification, 2009, 48, 771-779. (IF2009 1.742) [3] Biró, E., Sz. Németh, Á., Sisak, C., Feczkó, T., Gyenis, J., Comparative Assessment of Soluble and Solid-Phase β-galactosidase Immobilized on Chitosan Microspheres, Annals of West University of Timisoara, Series of Chemistry 16 (4) (2007) 23-28, Special Issue Dedicated to «The IX International Symposium “Young People and Multidisciplinary Research”» ISYPMR 2007, ACM-V, Timisoara, Romania, 15-16 November 2007 (ISSN 1224-9513)
PROCEEDINGEK
[4] Biró, E., Németh, Á. Sz., Sisak, C., Feczkó, T., Gyenis, J., “Preparation of various chitosan support particles to be applied for enzyme immobilization”, Proceedings of Conference of Chemical Engineering, Veszprém, Hungary, April 25-27, 2006, pp. 98-101.
[5] Biró, E., Németh, Á., Sz., Sisak, C., Feczkó, T., Gyenis, J., “Preparation of chitosan microspheres by water in oil emulsion method for enzyme immobilization”, Proceedings of The VIIIth International Symposium “YOUNG PEOPLE AND MULTIDISCIPLINARY RESEARCH”, Timisoara, Romania, May 11-12, 2006, Section C: Chemisty, pp. 517-521.
[6] Gyenis, J., Feczkó, T., Biró, E., Németh, Á. Sz., Tóth, J., Sisak, Cs., “Functional nano/microparticles: properties, preparation and applications”, Proceedings of MiniConference “Biopowders – PROPERTIES, PRODUCTION & HANDLING”, SIK, Gothenburg, Sweden, 29th and 30th June, 2006, pp. 8-15 (available online http://www.biopowders.net/frameT1-4.htm, Conferences / Sweden in 2006 / Conference Proceedings).
[7] Sisak, C., Biró, E., Németh, Á., Sz., Feczkó, T., Tóth, J., Gyenis, J., “Formation of chitosan micro- and nanoparticles to be used for enzyme immobilization”, 6th European Symposium on Biochemical Engineering Science, Salzburg, Austria, August 27-30, 2006, Section of Miniaturisation in Bioengineering, Book of Abstracts, pp. 269. 9
[8] Biró, E., Sz. Németh, Á., Sisak, C., Feczkó, T., Gyenis, J., “Enzimrögzítésre alkalmas kitozán
részecskék
előállítása
és
a
rögzített
biokatalizátorok
összehasonlítása”
(“Preparation of chitosan particles suitable for enzyme immobilization and comparison of immobilized biocatalysts”), 12th International Conference of Chemistry, Miercurea Ciuc, Romania, October 3-8, 2006, Section of Biochemistry and Pharmaceutic Chemistry, Book of Abstracts, pp. 43. [9] Biró, E., Németh, Á. Sz., Sisak, C., Feczkó, T., Gyenis, J., “Preparation and functionalisation of chitosan nanoparticles”, Proceedings of 31st Scientific Day in Ovar “PRODUCTION OF FOOD RAW MATERIALS – QUO VADIS?”, Mosonmagyaróvár, Hungary, October 5, 2006, Section of Agricultural Engineering, Book of Abstracts pp. 107, full text on CD: pp. 1-5. [10] Biró, E., Németh, Á. Sz., Sisak, C., Gyenis, J., Feczkó, T., “The influence of process parameters on the size of chitosan microspheres studied by experimental design”, Proceedings of PARTEC 2007, International Congress on Particle Technology, Nuremberg, Germany, March 27-29, 2007, Food Application, Book of Abstracts pp. P_905, full text on CD pp. P_905: 1-4. [11] Biró, E., Sz. Németh, Á., Gyenis, J., Sisak, C., Feczkó, T., “Kitozán mikrorészecskék előállítási körülményeinek optimalizálása” (“Determination of optimal conditions for chitosan microsphere formation”), Proceedings of Conference of Chemical Engineering, Veszprém, Hungary, April 25-27, 2007, pp. 276-279 (ISBN 978-963-9696-15-0).
[12] Biró, E., Sz. Németh, Á., Sisak, C., Gyenis, J., Szajáni, B., “β-galactosidase immobilization on chitosan microspheres”, Journal of Biotechnology 131 (2S), 2007, Symbiosis Science, Industry & Society, 13th European Congress on Biotechnology, Barcelona, Spain, 16-19 September 2007, Industrial Biotechnology, Biocatalyst Function and Optimization, S98 (ISSN 0168-1656) [13] Biró, E., Sz. Németh, Á., Sisak, C., Feczkó, T., Gyenis, J., Production of solid-phase biocatalysts by immobilization of β-galactosidase onto different sized chitosan particles and comparing their catalytic properties, Proceedings of International Symposium Reliable Flow of Particulate Solids IV (RELPOWFLO IV), Tromsø, Norway, 10th – 12th June 2008, pp. 178-183.
10
