BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszer-tudományi Tanszék
No 7 MEMBRÁNTRANSZPORT TANULMÁNYOZÁSA Biokémia laborgyakorlat (VEMB-A-403, VEBE-A-502), No 7
2011/2012 II. félév, felelős: Merész Péter, (
[email protected]) GYAKORLAT HELYE: CH ÉP. ALAGSOR 36. ELMÉLETI ÁTTEKINTÉS A gyakorlathoz kapcsolódó, korábban tanult ismeretek közül feleleveníteni javasolt: Növényi biokémiai ismeretanyag és az analitikai módszerhez kapcsolódó ismeretek felelevenítése. A felkészülés során felelevenítendő ismeret a sejt felépítése, az ismertetőben szereplő fogalmak, a növényi és az állati sejtek felépítésében, működésében fennálló különbségek, a gyümölcssejtek funkcionális és szerkezeti specialitásai, a sejtszintű növényi membránok felépítésének és a membránon történő transzport folyamatok mechanizmusának ismerete, a membránfunkció és szerkezet összefüggése, a gyümölcs biológiai funkciója, a növényi sejt sérülésekor bekövetkező barnulási folyamatok biokémiai háttere. Az almában a fejlődés-érés-tárolás során lejátszódó néhány alapfolyamat Magyarország még ma is jelentős gyümölcs(alma)termelő, és a hazai mezőgazdaságban a kertészeti termelés, ezen belül is a gyümölcs, ill. almatermelés volumenét és értékét tekintve is előkelő helyet foglal el. A nagy mennyiségben termelt gyümölcsöt (almát) értékének megőrzése és a folyamatos ellátás érdekében megfelelően kell tárolni. A leszedett gyümölcsben (almában) tárolás alatt a biokémiai folyamatok (anyagcsere, sejtlégzés) tovább folynak. Ezek következtében a gyümölcs (alma) makroszkópikus tulajdonságai, értéke változnak, pl. húsa puhul, beltartalma károsodik, értéke csökken. Emiatt fontos olyan tárolási körülmények biztosítása, amelyek visszaszorítják ezeket a változásokat és az alma megőrzi minőségének, élvezeti-gazdasági értékének jelentősebb részét. Az alma a klimaktérikus gyümölcsök közé tartozik. Az ebbe a csoportba tartozó gyümölcsöknél (pl. alma, körte, banán, szilvafélék, kajszi és őszibarack) az érés kezdetekor jelentős etiléntermelés figyelhető meg, mely beindítja az érést, hatására a légzési intenzitás hirtelen és jelentősen emelkedik, majd a maximumot túlhaladva ismét csökkenni kezd, de lassan, és a kezdetinél magasabb szinten marad hosszabb ideig. Az etilén növényi hormonként viselkedik, amely felelõs az érés beindításáért. A tárolás alatt a minőség megőrzéséhez, az érési folyamat lassításához részben a közvetlen kiváltó ok megszüntetésére, azaz az etilén koncentrációjának szabályozására, részben a hatásának, azaz a légzésintenzitás növekedésének gátlására van szükség. A „nem-klimaktérikus” gyümölcsök érésének megindításában kevésbé játszik szerepet az etilén, amelynek hatására nem következik be intenzív légzési anyagcsere, a gyümölcs minőségének megóvására elegendő hűtött körülmények között tárolni a gyümölcsöt. Ebbe a csoportba tartoznak a citrusfélék, kivi, szőlő, málna, eper. Az alma szöveteiben, sejtjeiben az érés kezdetekor meginduló fiziológiai változás intenzív metabolizmust jelent. Az érési folyamatok során bekövetkezõ enzimaktivitás változás a sejtekben fennálló egyensúlyt a lebontó folyamatok felé tolja el. Az érés, öregedés folytatódik leszedést követően is. Ha a lebontó, azaz a katabolikus folyamatok már olyan mértékűek, hogy a sejt egyensúlya jelentősen felborul, és megszűnik a sejtek, szövetek integritása, akkor már túlérésnek,
Biokémia laboratóriumi gyakorlat
VEBEA502 / VEMBA403__7.-MP
Membrántranszport tanulmányozása
2011/2012 II. félév
öregedésnek lehet tekinteni a folyamatot. Az éretlen gyümölcsben (is) szedés után a raktározott tápanyagok - szénhidrátok (keményítõ, pektin), szerves savak (aszkorbinsav, citromsav) stb.mennyisége az enzimek lebontó tevékenysége következtében csökken. Emiatt a gyümölcs puhul, a gyümölcshús keménysége csökken és édesebb ízű lesz. Az érett gyümölcsöt nem megfelelõ körülmények között tárolva víztartalom csökkenés, apadás, és ráncosodás tapasztalható. Az apadás a hőmérséklet növelésével és a relatív páratartalom csökkenésével nő. A katabolikus folyamatok előtérbe kerülésével a fiziológiai változások mellett mikrobiológiai romlások is bekövetkezhetnek. A sejtek integritását a sejt membránrendszerének jól szabályozott együttműködése biztosítja. A tárolás (fiziológiai megfogalmazásban: érés, öregedés) során változik az almasejt belső és külső felületének membrán- és sejtfalszerkezete, amelynek hatására változik a sejtmembrán áteresztőképessége. A sejtmembrán épségét, megfelelő funkcionalitását jellemzi az áteresztőképessége (többek között). Ezt a tulajdonságát jellemezni lehet a sejtből izotóniás oldatba kiáramló komponensek mennyiségével. Az ősztől tavaszig tartó tárolás során az idő függvényében a membránok áteresztőképessége eleinte nő, majd csökken, azaz maximumos lefutású összefüggés kapható. Ennek a magyarázata lehet, hogy a tárolási idõ elõrehaladtával (néhány hónap alatt) a sejtek között található pektinből álló középső lamella lebomlik, a sejtmembrán és a sejtfal elválik, a szerkezet fellazul. Ennek eredményeként nő a sejtfelület áteresztõképessége. További hetekhónapok múlva az egymástól elváló rétegek közé bizonyos degradálódott makromolekulák (pl. oligoszacharidok) rakódnak be, eltömítik a meglevő átjárókat, amely folyamat csökkenti a kiáramlás lehetőségét, és a mérhető diffúzió (áteresztőképesség) csökkenését okozza. A tárolási technológia kialakításának fiziológiai, biokémiai háttere A gyümölcstárolás célja az érési, öregedési folyamatok visszaszorítása az alma minőségének megőrzése érdekében. A legrégibb tárolási technológia a hűtőtárolás, amelynél csak a hőmérséklet csökkentése okozza a fiziológiai folyamatok lassulását, azaz az érési, öregedési folyamatok sebességének csökkenését. A hűtőházakban a gyümölcsöket 1-5 oC-on, minimum 90%-os relatív páratartalom mellett tárolják. Ez a módszer 3-4 hónapig alkalmas a minõség biztosítására. Az önszabályozott légterű tárolás során a hűtőtárolás előnyei mellett az használható ki, hogy a zárt térben a légzés során az O2-koncentráció csökken, ugyanakkor a CO2-koncentráció növekszik. Betároláskor meghatározott összetételű légtér alakul ki, vagy beállítják előre elhatározott értékre, amelyek: 14-15% O2 és 3,5-4,0% CO2. A hőmérséklet 2oC körüli érték, a relatív páratartalom legalább 90%. Az alacsony oxigénszint és magas széndioxid koncentráció hatására lassulnak az aerob folyamatok, csökken a légzési intenzitás, a magas páratartalom miatt lassabban következik be apadás, víztartalom-csökkenés és ráncosodás. Ilyen körülmények között 4-6 hónapig tartó tárolás után is jó minőségű lehet az alma. A szabályozott légterű, azaz CA-tárolás (CA: controlled atmosphere) során a hűtőtárolás előnyei mellett a légtérösszetétel változtatása még fokozottabban érvényesül. Az O2-koncentráció alacsonyabb, mint egy önszabályozó rendszerben; ugyanakkor a CO2-koncentráció viszonylag magas, amelyeket betároláskor meghatározott sebességgel az adott gyümölcsfajtának optimális összetételre állítanak be: kb. 4-5% O2 és 3.5-4% CO2. A hőmérséklet 1-3oC, a relatív páratartalom >90%. Ilyen körülmények között 6-8 hónapig tartó tárolás után is jó minőségű a gyümölcs. A nagyon alacsony oxigénszintű v. ULO-tárolók (ULO: ultra low oxygene) a legkorszerűbb tárolók, az O2-koncentrációt 1-1.5%-ra csökkentik. 0,5-0,7%-nál sokkal alacsonyabb O2-szint nem valósítható meg, mert az anaerob lebontási folyamatok kerülnek előtérbe. Ezzel az eljárással 10-15 hónapig is megőrizhető a gyümölcs minősége, ám nagyon magasak a beruházási költségek.
Biokémia laboratóriumi gyakorlat Membrántranszport tanulmányozása
VEBEA502 / VEMBA403__7.-MP 2011/2012 II. félév
A GYAKORLATI FELADAT ISMERTETÉSE 7/1. A gyakorlat célja: A növényi tárolószövet sejtjeiből a membránokon és felületén keresztül lezajló transzportfolyamat vizsgálata alapján megválaszolandó kérdések: - Hogyan jellemezné a sejtfelület állapotát a mérés és számításai, megfigyelései alapján? - Hogyan hat az alkalmazott kezelés a vizsgált transzport folyamatokra ? 7/2. Az alkalmazott módszer elve: az almaszeleteket izotóniás, nemvezető oldatba (0.3M mannitoldat) helyezve konduktométerrel mérhető az áztatóoldat vezetõképességének növekedése, amely utal a kiáramlott ionok mennyiségének, a környező oldatban levő koncentrációjának növekedésére, azaz a transzportfolyamat sebességének és ezen keresztül a membránok ion-diffuzivitásának, a sejtfelület permeabilitásának változására. A vezetőképességgel arányos áramerősség (µA) mérése számítógéphez kapcsolt 100 cellás konduktométerrel (Labvig) és egy hozzátartozó mérőprogram segítségével történik. A mintákat a mérés elején membránkárosításnak kitéve (hő, mikrohullám, ozmotikus stressz, stb.) a hatás mérhető változást okozhat, amelynek jellege, mértéke megfigyelhető. 7/3. A gyakorlati munka menete:. A gyakorlat során 1 almafajtával kell vizsgálni 5 féle kezelés hatását, kezelésenként 15-15 mintával, melyek 3 db almából származnak. Az almákat fel kell szeletelni néhány mm-es szeletekre, majd dugófúróval korong alakú mintákat készíteni. A készített korongokat 6 csoportba kell osztani a kezelések céljára, ügyelve arra, hogy a különböző mintacsoportokba kerülő korongok esetleges eltérő viselkedése minél kevésbé származzon a mintavételből. A kezelésekkel 5 különböző hő-terheléssel történő hatás vizsgálható (hőkezelést nem kapott) kontrolhoz képest. A mintaelőkészítés mellett el kell készíteni egy 0,3 M izotóniás mannitoldatot: 54,5 g mannitot deszt. vízben oldani, hozzáadni 0,5 cm3 2-merkaptoetanolt (a barnulás meggátlására), majd 1 dm3-re feltölteni. A konduktométer celláiba 3-3 cm3 mannitoldatot kell tölteni. A kezelések megtörténte után az almaszeleteket be kell helyezni gyorsan a cellákba. “Azonnal” (lehetőleg 1 percen belül) kell mérni az áramerősséget, majd a minták cellába behelyezésétől (az első szelet első oldatba helyezésétől) számítva: 2, 4, 6, 8, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 30, 35, 40, 45, 50 perc elteltével. A mérési eredmények nyers adatsorait DOS és BASIC programok segítségével konvertálni kell excel formátumra, és a fájlba rendezett adatokkal kell az értékelést elvégezni. 7/4. A mérési adatok értékelése, feldolgozása számítógépes programok segítségével, lépései. 1. A mintákra eső fajlagos hőterhelés kiszámítása: A gyakorlat keretében megfigyelendő és feljegyzendő adatok: hőkezelő teljesítménye, hőkezelés ideje, hőfelvevő közeg mennyisége, minősége, minták geometriai adatai, sűrűsége. Ezen adatok felhasználásával számítandó az egyes mintákra eső fajlagos (tömegegységre vonatkoztatott) hőterhelés (független változó). 2. Korrekció a mintát nem tartalmazó cellákban található oldat vezetőképesség értékeinek adott időponthoz tartozó átlagértékeivel. Valamennyi értékeléshez szükséges az adatok normálása, azaz a következő két lépés: - Az egyensúlyi vezetőképesség értékének megállapítása mintánként, amely a referencia minta végtelen idő utáni várható értékének becslését jelenti. A kiáramlás egyensúlyi folyamat az ezt leíró matematikai összefüggés: I = x*t / (y + z*t); linearizált formájának (1/I=a/t+b) ábrázolását kell elvégezni. Ennek megfelelően 1/t fv.-ben ábrázolva a mért áramerősség értékek reciprokát, t=∞ értéknél, azaz 1/t=0 értéknél meghatározott függvényérték az I∞ reciproka. Ebből számítható az I∞, azaz I∞=1/b.
Biokémia laboratóriumi gyakorlat
VEBEA502 / VEMBA403__7.-MP
Membrántranszport tanulmányozása
2011/2012 II. félév
- Normálás az előzőek szerint megállapított referencia egyensúlyi vezetőképességre az eredeti mérési adatokkal, cellánként: IN(i,j) = [I(i,j) - Ib(j)] / [I∞ - Ib(j)] 3. Maximális (kezdeti) transzport (kiáramlási, diffúziós) sebesség (értékelendő paraméter): Az egy kezeléshez tartozó normált mérési pontok közül az első 5-6 pontra illesztett egyenes meredekségével jellemezhető a maximális transzportsebességgel arányos kezdeti kiáramlási sebesség, azaz a görbék kezdeti meredeksége. Értékelés: A hőterhelés függvényében ábrázolandó a számított sebesség, és megfogalmazandó, hogy milyen hatással van a maximális diffúzió-sebességgel arányos értékre a hőterhelés növelése. 4. Átlagos transzportsebesség (értékelendő paraméter): a mérés alatt bekövetkezett „bruttó” változások összehasonlítása ”t próba” segítségével: E jellemző az egy kezeléshez tartozó normált mérési pontok közül az átlagosnak tekinthető diffúziósebességgel arányos, a 35, 40, 45, v. 50 perc és a 6, 8, v. 10 perc elteltével mért értékek különbségével () jellemezhető. Értékelés: A hőterhelés függvényében ábrázolandó a számított átlagos transzport sebesség, és megválaszolandó kérdés, hogy az alkalmazott kezelések közül melyiknél értük el azt a ∆I értéket, amely már szignifikánsan (P>95%) eltér a kontrol (kezeletlen) mintáétól? A fentiek szerint számított átlagos transzportsebességgel arányos ∆IN értékekkel elvégzendő t próba paraméterei excelben történő számítás esetén: párosítatlan nem egyenlő varianciájú adatok. Az értékeléshez szükséges minimális biometriai ismeret, azaz excelben a matematikai-statisztikai számítások értelemszerű alkalmazása a következtetések alátámasztására (t-próba, F-próba, de nem varianciaanalízis, regresszió, v. korreláció-számítás), az esetleges eltérések igazolására. 5. A mért diffúziós görbe elemzése (értékelendő paraméter), a normált mérési pontokra fektetett görbe segítségével, a görbék alakjának összehasonlítása. Feladat a pontok által alkotott görbék alakjának verbális megfogalmazása, annak leírása, vizuális összehasonlítással a kezelés hatására létrejövő jellemző különbségek ismertetése. Nem ajánlott (de nem is tilos) feladat: A mérési pontokra tetszés szerinti matematikai függvényekkel jellemezhető görbék illeszthetõk, és vizsgálható, melyik írja le jobban az ionkiáramlás mechanizmusát. A görbék értékeléséhez a korrelációs koefficiensek, maradványvizsgálat, stb. alapján az illeszkedés jósága meghatározható, számítógép és mélyebb biometriai ismeretek hiányában a görbe alakja alapján csak szubjektív értékelés végezhető, ezért nem kötelező feladat a gyakorlat értékelése során BSc hallgatók számára.
A mérési eredményekből egyénenként meghatározandó, értelmezendő a hőterhelés és a passzív transzport „értékelendő paraméterei” közötti összefüggés, kapcsolat, A jegyzőkönyv a gyakorlaton elvégzett feladat korrekt, szakszerű ismertetését kell tartalmazza. Formailag a félév elején, a gyakorlatok általános ismertetésekor elhangzó formában, jegyzőkönyvszerűen. Tartalmilag nincs szükség az elméleti ismeretek leírására, de ismertetni kell a mérés célját, elvét röviden (1-2 mondat), a gyakorlati feladatot, végrehajtásának precíz leírását, a számítások módszerének ismertetését, az elvégzett számításokat, és az eredmények rövid, érthető, áttekinthető ismertetését, valamint a jegyzőkönyv végén az értékelt eredmények összefoglaló értelmezését, következtetéseket néhány mondatban. A jegyzőkönyv készülhet kézzel írott, rajzolt és számítógéppel szerkesztett formában is. Amennyiben a jegyzőkönyv számítógéppel, táblázatkezelővel készül, akkor benyújtandó excel file formájában is (tetszőleges adathordozón, vagy villámpostán) a számítások követhetőségének, ellenőrizhetőségének érdekében.
Biokémia laboratóriumi gyakorlat
VEBEA502 / VEMBA403__7.-MP
Membrántranszport tanulmányozása
2011/2012 II. félév
Felkészülést segítő kérdések: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38. 39. 40. 41. 42.
Milyen sejtalkotókat ismer? (növényi, állati) Milyen biokémiai alapelv segítségével lehet a gyümölcsöket hosszú ideig tárolni? Mit jelent az, hogy membrán? (definíció) Milyen funkciói vannak a membránoknak? Milyen fajtái vannak a membránoknak? (nemcsak biológiai) Hogyan lehet a membránokat szerepük alapján csoportosítani? Membránok felépítése? Milyen funkciója van a foszfolipid-kettősrétegnek? Miért képes erre a funkcióra? Mi történik, ha ion, poláros részecske akar átjutni a foszfolipid-kettősrétegen? Hogyan létezik apoláros molekula a sejt poláros, hidrofil közegében? A víz átjut-e a foszfolipid-kettősrétegen? A „víz” mennyire pici, mekkora a vízmolekula-részecske a közegben? Mi a feltétele annak, hogy egy részecske átjusson a foszfolipid-kettősrétegen? Milyen a foszfolipid-kettősréteg halmazállapota, mivel igazolható, és hogyan függ össze a részecskék mobilitásával, illetve a környezeti állapotjellemzőkkel? Hogyan integrálódnak a fehérjék a membránba? Mi stabilizálja azt az apoláros rétegben? A transzportfolyamatok definíciója. A transzportfolyamatok energetikai háttere . A transzportfolyamatok molekuláris – szerkezeti háttere. Mi a passzív transzport mechanizmusa? Hogyan alakul ki a szükséges energia, hogyan tárolódik és hogyan alakul át mozgási energiává? Mi az aktív transzport mechanizmusa? Hogyan alakul ki a szükséges energia, hogyan tárolódik és hogyan alakul át mozgási energiává? Mi a különbség állati és növényi sejt között? Miben különböznek a gyümölcssejtek a levélsejtektől? Mi a sejtfal, milyen a kémiai felépítése? Hogy jön létre a láncokból fal? Milyen a cellulóz, keményítő, pektin szerkezete, mi a különbség közöttük? Mit jelent, hogy autotróf, heterotróf? Mely sejtek autotrófok, heterotrófok? Mi történik az anyagcseretermékekkel a növényi és állati sejtekben, szervezetben? Mi a célja a fának a gyümölccsel, mi a szerepe a növény életében, hogyan tölti be? Mekkora egy almasejt? Miben speciális a gyümölcsben lévő vakuólum, sejtfal, színtest? Milyen részfolyamatokat jelent a gyümölcsök fejlődése, érése? Hogyan lehet a gyümölcs érési folyamatait szabályozni, követni, mi az értelme? Miért erjed a gyümölcs, milyen anaerob folyamat játszódik le, és miért ép olyan? Miért baj, ha a fermentáció történik, miért rossz a tárolt almának? A vakuólumban lévő ionok, molekulák hogyan jutnak ki? Miért olyan, amilyen az összetétele az oldatnak, amiben a mérés történik? Hogyan változnak a membránkomponensek hőkezelés hatására? Milyen hatása van a membránkomponensek változásának a transzportfolyamatok sebességére? Milyen összefüggés van a transzportfolyamatok sebessége és a gyümölcs állapota között? Milyen komponensek, anyagcsere termékek vannak a vakuólumban? Mikor, mitől barnul az alma, milyen kapcsolata van a membránokkal? Milyen biokémiai / kémiai reakciósor az enzimes barnulásnak nevezett folyamat? Mi befolyásolja az enzimreakció sebességét? Hogyan, milyen eszközökkel, módszerekkel, milyen elven lehet ezt a barnulást gátolni?
