N: HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 ART: US: 83369

COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, version 1.5

HIM IN VITRO DIAGNOSZTIKAI CÉLRA.

Rendelési információ

HIM COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, version 1.5

COBAS® AMPLICOR® Wash Buffer

WB

48 Tests

P/N: 21118390 123 ART: 11 1839 0 US: 83369

500 Tests

P/N: 20759899 123 ART: 07 5989 9 US: 83314

Felhasználás célja

A vizsgálat a klinikai megjelenéssel és a betegség progressziójának egyéb laboratóriumi markereivel együtt a HIV-1-fertőzött betegek klinikai gondozásában nyújthat segítséget. A vizsgálat a kiindulási HIV-1 RNS-szint mérése révén használható a beteg prognózisának megállapítására, illetve az antiretrovirális kezelés során a plazma HIV-1 RNS-szint változásainak mérése révén az antiretrovirális kezelés hatásának monitorozására. A polimeráz-láncreakcióval (PCR) megmért HIV-1 RNS-szinteket használták egyebek között helyettes markerként az INVIRASE (saquinavirmezilát), CRIXIVAN® (indinavir-szulfát), NORVIR® (ritonavir) és FORTOVASE (saquinavir) proteáz inhibitor gyógyszerek, a VIRAMUNE® (nevirapine), SUSTIVA® (efavirenz), és ZIAGEN® (abacavir) non-nukleozid reverz transzkriptáz inhibitor gyógyszerek, valamint az EPIVIR® (lamivudin) reverz transzkriptáz inhibitor gyógyszer gyorsított FDA engedélyezési eljárásában. A COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 nem való vér vagy vérkészítmények HIV-1-fertőzöttségének szűrésére, vagy diagnosztikus vizsgálatként HIV-1-fertőzés jelenlétének megerősítésére.

6/2007, Revision 6.0


1/52

P/N: 04741773 190

A COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 (v1.5) egy in vitro nukleinsav-amplifikációs vizsgálat a humán immundeficiencia vírus 1 (HIV-1) RNS mennyiségi meghatározására humán plazmában COBAS® AMPLICOR® Analizátor segítségével. A vizsgálat két minta-előkészítési eljárás, a standard és az ultraszenzitív eljárás segítségével képes a HIV-1 RNS mennyiségi meghatározására az 50–750 000 kópia/ml tartományon.

A vizsgálat összegzése és magyarázata A humán immundeficiencia vírus (HIV) a szerzett immunhiányos szindróma [Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS)] kóroki ágense1-3. A HIVfertőzés átvihető szexuális kontaktussal, fertőzött vérrel vagy vérkészítményekkel, illetve fertőzött anyáról a magzatra4. A HIV átvitelétől számított 3–6 héten belül a fertőzött egyénekben rendszerint egy rövid, náthaszerű tünetekkel jellemezhető akut tünetegyüttes alakul ki, amely a perifériás vérben levő nagyfokú viraemiával kapcsolatos5-8. A legtöbb fertőzött egyénben ezt egy HIV-specifikus immunválasz és a plazma viraemia csökkenése követi, rendszerint a tünetek felléptétől számított 4–6 héten belül9,10. A szerokonverziót követően a fertőzött egyének típusosan egy klinikailag stabil, tünetmentes fázisba kerülnek, amely évekig tarthat11-13. A tünetmentes periódust állandó, alacsony szintű viraemia14 és egy fokozatosan kialakuló CD4+ T limfocita hiány jellemzi, amely súlyos immunhiányhoz, halmozott opportunista fertőzések, malignomák kialakulásához, végül halálhoz vezet15. Bár a fertőzés tünetmentes fázisában a vírusszintek a perifériás vérben viszonylag alacsonyak, úgy tűnik, hogy a vírus szaporodása és kiürülése egy dinamikus folyamat, amelynek során a nagyfokú vírustermelés és CD4+ sejtfertőzés egyensúlyban van a nagyfokú víruskiürüléssel, a fertőzött sejtek pusztulásával és a CD4+ sejtek utánképződésével, ezáltal mind a plazma viraemia, mind a CD4+ sejtek viszonylag stabil szintjeit eredményezve16-18. A perifériás vérben lévő HIV viraemia mennyiségi mérései megmutatták, hogy a magasabb vírusszintek a HIV-betegség klinikai progressziójának emelkedett kockázatával korrelálhatnak, és hogy a plazma vírusszintek csökkenése a klinikai progresszió csökkent kockázatával járhat együtt19-21. A vírusszintek mennyiségi meghatározása perifériás vérben történhet a HIV p24 antigén mérésével szérumban, a HIV kvantitatív tenyésztésével plazmából, vagy a vírus RNS direkt mérésével nukleinsav-amplifikációs vagy szignálamplifikációs technológiákat alkalmazva22-26. A p24 antigén a HIV elsőrendű magfehérjéje, és vagy szabadon vagy antip24 antitesthez kapcsolódva található a szérumban. A szabad p24 antigén kereskedelemben kapható enzim immunoassay-vel (EIA) mérhető, bár a p24 antigén haszna, mint vírusmennyiség marker, korlátozott, miután az antigén a tünetmentes betegek csupán 20%-ában, a tünetes betegek 40–50%-ában mutatható ki. Az antigén-antitest komplexeket disszociáló eljárások ugyan javítják a p24 vizsgálatok érzékenységét, mégis a vírusfehérje a legtöbb tünetmentes betegben kimutathatatlan marad22. A plazmában lévő fertőző HIV normál donorokból származó aktivált perifériás vér mononukleáris sejtekbe (peripheral blood mononuclear cells, PBMC) történő inokulációval tenyészthető. A plazmaminták hígítási sorával történő perifériás vér mononukleáris sejtinokuláció révén mennyiségi meghatározás végezhető. A vírusszintek monitorozásában a kvantitatív tenyésztés korlátozott haszonnal bír, miután a víruspartikulumoknak csak kis hányada fertőző in vitro. Tünetmentes egyénekben fertőző vírus gyakran nem mutatható ki22. A HIV RNS mennyiségi meghatározása a plazmában olyan nukleinsavamplifikációs technológiákkal történhet, mint a polimeráz-láncreakció (PCR)27-29. A COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 PCRtechnológiát alkalmaz, ezáltal maximális érzékenységet és dinamikus tartományt valósít meg a HIV-1 RNS EDTA-s vagy ACD-s antikoagulált plazmában való mennyiségi meghatározásához24. 2/52



HIV-1 MONITOR

Az eljárás alapelvei A COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 öt fő lépésből épül fel: minta előkészítése; a target RNS reverz transzkripciója, azaz komplementer DNS (cDNS) szintézise30; a cDNS amplifikálása HIV-1 specifikus komplementer primerek felhasználásával PCR során30; az amplifikált termékek hibridizációja a targetszekvenciára specifikus oligonukleotid próbákhoz; a kötődött amplifikált termékek kolorimetriás kimutatása. A COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 lehetővé teszi a HIV-1 és a HIV-1 mennyiségi standard RNS szimultán reverz transzkripcióját és PCR-amplifikációját. A master mix reagens egy, a HIV1 RNS-re és a HIV-1 mennyiségi standard RNS-re egyaránt specifikus primer párt tartalmaz, és a HIV-1 M csoportú szubtípusainak ekvivalens mennyiségi meghatározására fejlesztették ki. A vizsgálat teljesítményjellemzőit O csoportú mintákon nem határozták meg. A HIV-1 vírus RNS mennyiségi meghatározása során HIV-1 mennyiségi standard használatos. A HIV-1 mennyiségi standard egy nem fertőző RNS transzkriptum, amely a HIV-1 RNS targethez és egy, a mennyiségi standard amplikon és a HIV-1 amplikon megkülönböztetését lehetővé tevő egyedi próbához kötődő régióval identikus primer kötő helyeket tartalmaz. A HIV-1 mennyiségi standard minden egyes mintához ismert kópiaszámban hozzáadásra kerül, majd a HIV-1 targettel együtt a mintaelőkészítési, reverz transzkripciós, PCR-amplifikációs, hibridizációs és kimutatási lépéseken keresztül megy, és a HIV-1 targettel együtt amplifikálódik. A COBAS® AMPLICOR® Analizátor a vizsgálati mintákban levő HIV-1 RNS-szintet a HIV-1-szignálnak a mennyiségi standardszignállal való összehasonlításával számolja ki minden egyes minta esetén. A mennyiségi standard kompenzálja a gátló hatásokat, és az amplifikációs folyamat szabályozásával lehetővé teszi a HIV-1 RNS pontos mennyiségi meghatározását valamennyi mintában. Minta előkészítése


A COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 két minta-előkészítési eljárás, a standard eljárás vagy az ultraszenzitív eljárás valamelyikével alkalmazható. A standard minta-előkészítési eljárásban a HIV-1 RNS közvetlenül a plazmából való izolálása során a víruspartikulumokat először egy chaotróp ágenssel roncsolják, amit azután az RNS alkoholos kicsapása követ. Az ultraszenzitív minta-előkészítési eljárásban a HIV-1 víruspartikulumokat a plazmában először nagysebességű centrifugálással először koncentrálják, ezt követi a chaotróp ágenssel történő roncsolás és a HIV-1 RNS alkoholos kicsapása. A mennyiségi standard RNS molekula ismert száma kerül a roncsolóreagenssel együtt hozzáadásra valamennyi mintához. A HIV-1 mennyiségi standard a minta-előkészítési, reverz transzkripciós, amplifikációs, hibridizációs és kimutatási lépéseken keresztül megy, és a HIV-1 RNS mennyiségi meghatározására szolgál a mintában.


3/52

Reverz transzkripció és PCR-amplifikáció

A targetszekvencia kiválasztása A HIV-1-hez tartozó target RNS-szekvencia kiválasztása a HIV-1genomban maximálisan konzervált régiók azonosításán múlik. Következésképpen a primerek és a próba megfelelő kiválasztása kritikus a vizsgálat HIV-1-genotípust kimutató képessége szempontjából. A COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 a HIV-1 gag gén nagyfokban konzervált szakaszán lévő 155 nukleotidszekvenciának megfelelő SK145 és SKCC1B primereket használja31. A gag régió kódolja a virion csoportspecifikus antigénjeit, illetve mag szerkezeti fehérjéit. A HIV-1 gag gének általában mintegy 1500 nukleotid hosszúak, és a HIV genomban megközelítőleg a 789–2290 pozícióban helyezkednek el. A primerek nukleotidszekvenciája az M csoportú HIV-1 altípusok ekvivalens amplifikálását biztosítandó lett optimalizálva. Reverz transzkripció A reverz transzkripciót és a PCR-amplifikálási reakciókat hőstabil rekombináns enzim, a Thermus thermophilus DNS-polimeráz (rTth pol) segítségével végzik. Mangán jelenlétében, valamint megfelelő pufferviszonyok között az rTth pol mind reverz transzkriptáz-, mind DNSpolimerázaktivitást mutat30. Ez lehetővé teszi a reverz transzkripció és a PCR-amplifikálás megtörténését ugyanazon reakcióelegyben. A feldolgozott mintákat amplifikációs csövekben (A-csövek) lévő amplifikáló keverékhez adják, ahol tehát mind a reverz transzkripció, mind a PCRamplifikálás megtörténik. A downstream vagy antisense primer (SKCC1B) és az upstream vagy sense primer (SK145) az 5' végükön biotiniláltak. A reakcióelegyet fel kell hevíteni, hogy lehetővé váljon a downstream primernek a HIV-1 target RNS-hez és a HIV-1 mennyiségi standard RNS-hez való specifikus kapcsolódása. Mn2+ és dezoxinukleozid-trifoszfátok (dNTPs), azaz dezoxiadenozin-, dezoxiguanozin-, dezoxicitidin-, dezoxiuridin- és dezoxitimidin-trifoszfátok feleslegének jelenlétében az rTth pol a kapcsolódott primerhez a target RNS komplementer DNS-szálát (cDNS) szintetizálja. Targetamplifikáció A HIV-1 target RNS és a HIV-1 mennyiségi standard RNS reverz transzkripcióját követően a reakcióelegyet az RNS:cDNS hibrid denaturálása és a primer targetszekvenciák szabaddá tétele végett fel kell hevíteni. Ahogy az elegy kihűl, az upstream primer (SK145) specifikusan kötődik a cDNS-szálhoz, az rTth pol pedig a primerre egy második DNSszálat szintetizál. Ezzel a PCR első ciklusa véget ért, a HIV-1 RNS és a HIV-1 mennyiségi standard RNS targetrégiójának egy kettős szálú DNSmásolatát létrehozva. A kettős szálú DNS szeparálása és a primer targetszekvenciák szabaddá tétele végett a reakcióelegyet újra fel kell melegíteni. Az elegy kihűlésével az SK145 és SKCC1B primerek a target DNS-hez kapcsolódnak. Az rTth pol enzim Mn2+ és feleslegben lévő dNTPs jelenlétében a primerekre a targettemplátoknak megfelelően 155 bázispár hosszúságú kettős szálú DNS molekulát szintetizál, amelyet amplikonnak hívnak. A COBAS® AMPLICOR® Analizátor a folyamatot adott számú cikluson keresztül automatikusan ismétli, az amplikon DNSmennyisége ciklusonként megduplázódik. Az amplifikálás a HIV-1genomnak csak a primerek közötti régiójában zajlik; a teljes HIV-1-genom nem amplifikálódik.

4/52



HIV-1 MONITOR

Szelektív amplifikálás A COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 a target-nukleinsav szelektív amplifikálását a klinikai mintából az AmpErase (uracil-Nglikoziláz) enzim és dezoxiuridin-trifoszfát (dUTP) használatával éri el. Az AmpErase enzim felismeri és katalizálja az olyan DNS-szálak megsemmisítését, amelyek dezoxiuridint tartalmaznak32, a dezoxitimidint tartalmazókét viszont nem. A dezoxiuridin a természetes DNS-ben nincs jelen, ugyanakkor az amplikonban mindig megtalálható, miután a master mix reagens a dNTP-ok egyikeként dezoxiuridin-trifoszfátot használ; tehát csak az amplikon tartalmaz dezoxiuridint. A dezoxiuridinnak köszönhetően a szennyező amplikont az AmpErase enzim még a target DNS amplifikálását megelőzően lebontja. A master mix reagensben lévő AmpErase enzim katalizálja a dezoxiuridint tartalmazó DNS hasítását a dezoxiuridin csoportoknál úgy, hogy a dezoxiribóz lánc felnyílását okozza a C1 helyen. Az első hevítési lépésben a master mix reagens bázikus pH-ján az amplikon DNS-lánc eltörik a dezoxiuridin helyén, tehát a DNS nem lesz amplifikálható. Az AmpErase enzim 55 °C felett, azaz a hevítési lépések során inaktív, azaz nem bontja le a targetamplikont. Az amplifikálást követően a maradék enzim a denaturáló oldat hozzáadásakor denaturálódik, megelőzve ezáltal a targetamplikonok lebontását. A COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 alkalmazásakor az AmpErase enzim mérések szerint legalább 103 darab dezoxiuridint tartalmazó HIV-1-amplikont inaktivál egy PCR során. Hibridizációs reakció

A PCR-amplifikálást követően a COBAS® AMPLICOR® Analizátor automatikusan denaturáló oldatot adagol az A-csövekhez, ezáltal a HIV-1 és a HIV-1 mennyiségi standard amplikon kémiai denaturálást szenved, és egyszálú DNS lesz. Nagy dinamikus tartományt átfogó mennyiségi eredmények eléréséhez a COBAS® AMPLICOR® Analizátor hígítási sort készít a denaturált amplikonból a kimutatási csövekbe (D-csövek). A HIV-1 amplikon (SK102), illetve HIV-1 mennyiségi standard amplikon (CP35) specifikus oligonukleotid próbával fedett mágneses részecskék szuszpenziója a négy HIV-1 amplikon hígítás, illetve a két HIV-1 mennyiségi standard amplikon hígítás mindegyikéhez rendre hozzáadásra kerül. A biotinilált amplikon a mágneses részecskékhez kötött targetspecifikus oligonukleotid próbákhoz hibridizál. Minden egyes mennyiségi meghatározáshoz a HIV-1 próba szuszpenziót használva négy független reagens abszorbanciamérésre, valamint a HIV-1 mennyiségi standard próba szuszpenziót használva két abszorbanciamérésre van szükség.

Kimutatási reakció

A hibridizációt követően a COBAS® AMPLICOR® Analizátor mossa a mágneses részecskéket a D-csövekben, melynek során a nem kötődött anyag eltávozik, ezután avidin-tormaperoxidáz konjugátumot adagol a csövekbe. Az avidin-tormaperoxidáz konjugátum a mágneses részecskékhez kötött targetspecifikus oligonukleotid próbákhoz hibridizált biotinilált amplikonokhoz kötődik. A COBAS® AMPLICOR® Analizátor a mágneses részecskék mosása révén eltávolítja a nem kötődött konjugátumot, majd minden egyes D-csőhöz hidrogén-peroxidot és 3,3',5,5'-tetrametil-benzidint (TMB) tartalmazó szubsztrátoldatot ad. Hidrogén-peroxid jelenlétében a kötődött tormaperoxidáz katalizálja a TMB színes komplexszé történő oxidációját, amelynek abszorbanciáját a COBAS® AMPLICOR® Analizátor 660 nm-es hullámhosszon méri.



5/52

A HIV-1 RNS mennyiségi meghatározása A COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 a HIV-1 vírus RNS-t mennyiségileg meghatározza egy második targetszekvencia (HIV-1 mennyiségi standard) felhasználásával, amely a vizsgálandó mintához ismert koncentrációban hozzá van adva. A HIV-1 mennyiségi standard egy nem fertőző, 233 nukleotidból álló in vitro átírt RNS molekula, amely a HIV-1 targetszekvencia kötő régióival identikus primer kötő régiókat tartalmaz. A HIV-1 mennyiségi standard SK145 és SKCC1B primer kötő helyeket tartalmaz, és egy ugyanolyan hosszúságú (155 bázis) és bázisösszetételű amplifikációs terméket szintetizál, mint a HIV-1 target RNS. A HIV-1 mennyiségi standard amplikon próbakötő régióját úgy módosították, hogy a HIV-1 mennyiségi standard amplikon különbözzön a HIV-1 targetamplikontól. A vizsgálat lineáris tartományán belül az abszorbancia 660 nm-en (A660) minden egyes D-csőben arányos a csőben lévő HIV-1 amplikon vagy HIV-1 mennyiségi standard amplikon mennyiségével. A COBAS® AMPLICOR® Analizátor kiszámítja a teljes HIV-1 és HIV-1 mennyiségi standard abszorbanciát úgy, hogy a D-cső abszorbanciáját megszorozza az adott D-csőben lévő amplikon hígítási faktorával, majd kiválasztja a maximális abszorbanciájú D-csövet. A számított teljes abszorbancia arányos minden reverz transzkripció/PCR-amplifikáció reakcióban jelen lévő HIV-1 RNS, illetve HIV-1 mennyiségi standard RNS mennyiségével. Valamennyi mintában a HIV-1 RNS mennyisége a teljes HIV-1 abszorbancia és teljes HIV-1 mennyiségi standard abszorbancia aránya, valamint a HIV-1 mennyiségi standard molekulák bevitt száma alapján számítható ki a következő egyenlet felhasználásával: HIV-1 A [Teljes Teljes QS A ] Ahol:

6/52

KF

x bevitt HIV-1 QS kópia/PCR x mintatérfogat-faktor = HIV-1 RNS kópia/ml

Teljes HIV-1 A = számított teljes abszorbancia a HIV-1 amplikonra Teljes QS A = számított teljes abszorbancia a mennyiségi standard amplikonra Bevitt HIV-1 QS kópia/PCR = a mennyiségi standard kópiák száma minden egyes reakcióban; ez az információ tételspecifikus Mintatérfogat faktor = a kópia/PCR-t kópia/ml-re átváltó faktor KF = Korrekciós faktor a COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR v1.5 test eredményeknek az AMPLICOR® HIV-1 MONITOR v1.5 test eredményekhez való illesztéséhez (Korrekciós faktor = 1,11). Mintatérfogat faktor = 40 (a standard minta-előkészítési eljárás esetén) Mintatérfogat faktor = 4 (az ultraszenzitív minta-előkészítési eljárás esetén)



HIV-1 MONITOR

Reagensek COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 Minta-előkészítő reagensek

HIM

48 teszt P/N: 21118390 123 ART: 11 1839 0 US: 83369

HIM PREP

HIV-1 LYS (HIV-1 MONITOR roncsoló reagens) trisz-HCl puffer 68% guanidin-tiocianát 3% ditiotreitol < 1% glikogén 68% (w/w) guanidin-tiocianát

+

Xn

4 × 9,0 ml

Ártalmas HIV-1 QS, v1.5 4 × 0,1 ml (HIV-1 MONITOR mennyiségi standard, 1.5-ös verzió) < 0,001% nem fertőző in vitro átírt (mikrobiális) RNS, amely HIV-1 primer kötő szekvenciákat és egy egyedi próbához kötődő régiót tartalmaz < 0,005% poli rA RNS (szintetikus) EDTA 0,05% nátrium-azid HIV-1 DIL (HIV-1 MONITOR mintaoldószer) trisz-HCl puffer < 0,005% poli rA RNS (szintetikus) EDTA 0,05% nátrium-azid Kontrollreagensek

4 × 4,8 ml

HIM CTL

NHP 4 × 1,6 ml [Negatív plazma (humán)] Humán plazma, US FDA engedélyezett tesztekkel nem reaktív HCV antitestre, HIV-1/2 antitestre, HIV p24 antigénre és HBsAg-re; HIV-1 RNS, HCV RNS vagy HBV DNS a gyűjtött donoregységekben PCR-technikával nem kimutatható; HBV core antitest FDA engedélyezett vizsgálattal a gyűjtött donoregységekben nem kimutatható. 0,1% ProClin® 300 konzerváló HIV-1 (–) C [HIV-1 (–) kontroll] < 0,005% poli rA RNS (szintetikus) EDTA 0,05% nátrium-azid 6/2007, Revision 6.0


4 × 0,05 ml

7/52

HIV-1 L(+)C 4 × 0,05 ml [HIV-1 MONITOR alacsony (+) kontroll] < 0,001% nem fertőző in vitro átírt (mikrobiális) RNS, amely HIV-1-szekvenciákat tartalmaz < 0,005% poli rA RNS (szintetikus) EDTA 0,05% nátrium-azid HIV-1 H(+)C 4 × 0,05 ml [HIV-1 MONITOR magas (+) kontroll] < 0,001% nem fertőző in vitro átírt (mikrobiális) RNS, amely HIV-1-szekvenciákat tartalmaz < 0,005% poli rA RNS (szintetikus) EDTA 0,05% nátrium-azid Amplifikálási reagensek

HIM AMP

HIV-1 MMX, v1.5 4 × 0,7 ml (HIV-1 MONITOR master mix, 1.5-ös verzió) bicin puffer glicerol < 0,01% rTth DNS polimeráz (rTth pol, mikrobiális) kálium-acetát < 0,07% dATP, dCTP, dGTP, dUTP, dTTP < 0,001% SKCC1B és SK145 primerek, biotinilált < 0,01% AmpErase (uracil-N-glikoziláz) enzim (mikrobiális) 0,05% nátrium-azid HIV-1 Mn2+, v1.5 (HIV-1 MONITOR mangánoldat, 1.5-ös verzió) < 2% mangán ecetsav amarántvörös festék 0,05% nátrium-azid Specifikus kimutatási reagensek

HIM DK

AD3 (Amplikon hígítási reagens) EDTA 0,8% nátrium-hidroxid

2 × 75 teszt

0,8% (w/w) nátrium-hidroxid

+

Xi

4 × 0,1 ml

Irritatív IM PS1, v1.5 2 × 100 teszt (HIV-1 MONITOR próba szuszpenzió 1, 1.5-ös verzió) MES puffer < 0,01% Dynabeads® szuszpenzió (paramágneses részecskék) HIV-1-specifikus oligonukleotid capture próbával (SK102) fedve 0,09% nátrium-azid 8/52



HIV-1 MONITOR

IM4, v1.5 2 × 100 teszt (HIV-1 MONITOR próba szuszpenzió 2, 1.5-ös verzió) nátrium-foszfát puffer < 0,2% detergens 24,9% nátrium-tiocianát IQ PS1, v1.5 1 × 100 teszt (HIV-1 MONITOR mennyiségi standard próba szuszpenzió 1, 1.5-ös verzió) MES puffer < 0,01% Dynabeads szuszpenzió (paramágneses részecskék) HIV-1 mennyiségi standard-specifikus oligonukleotid capture próbával (CP35) fedve 0,09% nátrium-azid IQ4, v1.5 (HIV-1 MONITOR mennyiségi standard próba szuszpenzió 2, 1.5-ös verzió) nátrium-foszfát puffer < 0,2% detergens 24,9% nátrium-tiocianát Általános kimutatási reagensek

1 × 100 teszt

DK

DN4 (denaturáló oldat) 1,6% nátrium-hidroxid EDTA timolkék 1,6% (w/w) nátrium-hidroxid

+

Xi

1 × 100 teszt

Irritatív CN4 (avidin-tormaperoxidáz konjugátum) trisz-HCl puffer < 0,001% avidin-tormaperoxidáz konjugátum marha-szérumalbumin (emlős) Emulsit 25 (Dai-ichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.) 0,1% fenol 1% ProClin® 150 konzerváló SB3 (szubsztrát A) citrátoldat 0,01% hidrogén-peroxid 0,1% ProClin® 150 konzerváló



3 × 100 teszt

5 × 75 teszt

9/52

SB (szubsztrát B) 0,1% 3,3',5,5'-tetrametil-benzidin (TMB) 40% dimetil-formamid (DMF) T

5 × 5 ml

40% (w/w) dimetil-formamid (DMF)

Mérgező R: 61-20/21-36 A születendő gyermekre ártalmas lehet. Belélegezve és bőrrel érintkezve ártalmas. Szemizgató hatású. S: 53-45

Kerülni kell az expozíciót – használata előtt szerezze be a külön használati utasítást. Baleset vagy rosszullét esetén azonnal orvoshoz kell fordulni. Ha lehetséges, a címkét meg kell mutatni.

COBAS® AMPLICOR® WB Wash Buffer COBAS® AMPLICOR® mosópuffer

500 teszt P/N: 20759899 123 ART: 07 5989 9 US: 83314

WB (10X-mosókoncentrátum) < 2% foszfátpuffer < 9% nátrium-klorid EDTA < 2% detergens 0,5% ProClin® 300 konzerváló

2 × 250 teszt

Figyelmeztetések és óvintézkedések In vitro diagnosztikai célra. Csak EDTA vagy ACD véralvadásgátlókkal gyűjtött plazmamintákhoz. A heparinról kimutatták, hogy gátolja a PCR-t, ezért tilos a használata. Ne pipettázzon szájjal. Ne egyen, igyon vagy dohányozzon a laboratórium területén. Viseljen egyszer használatos védőkesztyűt, védőruhát és szemvédőt a minták és a készlet reagensei kezelése közben. A minták és a tesztreagensek kezelését követően gondosan mosson kezet. A reagensflakonokból való anyagkivétel során kerülje el a reagensek mikrobiális és ribonukleáz-szennyezését. Steril, egyszer használatos pipetták és RNáz-mentes pipettahegyek használata javasolt. Ne öntsön össze különböző tételekből, vagy azonos tételből, de különböző flakonokból származó reagenseket. A fel nem használt reagensek és a hulladék kezelésének összhangban kell lennie a megfelelő országos, szövetségi, állami és helyi szabályozásokkal. Ne használja a készletet a lejárati idő után. 10/52



HIV-1 MONITOR

Az anyagok biztonsági adatlapjai (MSDS) igény esetén hozzáférhetők a helyi Roche-irodában. A laboratóriumi munkafolyamatnak egyirányú módon kell zajlania, kezdve a preamplifikálási területtől a posztamplifikálási (amplifikálási/kimutatási) területig haladva. A preamplifikálási műveleteket a reagens-előkészítéssel kell kezdeni, és a minta előkészítésével folytatni. Valamennyi preamplifikálási művelethez tartozó felszerelést és eszközt jelölni kell, és tilos használni más művelethez vagy más munkaterületre átvinni. Valamennyi munkaterületen kesztyűt kell viselni, és a terület elhagyása előtt le kell venni. A reagenselőkészítéshez használt felszerelést és eszközöket tilos használni mintaelőkészítési műveletekhez, amplifikált DNS vagy más target DNS-forrás pipettázásához vagy feldolgozásához. A posztamplifikálási műveletekhez tartozó felszerelést és eszközöket mindenkor a posztamplifikálási munkaterületen kell tartani. A mintákat fertőzőnek kell tekinteni, tehát kezelésüket a Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories33 című dokumentumban, illetve az M29-A334 jelű CLSI-dokumentumban ismertetett biztonságos laboratóriumi eljárásokat alkalmazva kell végezni. Gondosan tisztítson meg, és ioncserélt vagy desztillált vízzel frissen készített 0,5% nátrium-hipoklorit oldattal fertőtlenítsen minden munkaterületet. Megjegyzés

A kereskedelemben kapható háztartási fehérítő rendszerint 5,25%-ban tartalmaz nátrium-hipokloritot. 1:10 arányban hígított háztartási fehérítő megfelel 0,5% nátrium-hipoklorit oldatnak. FIGYELMEZTETÉS: A készlet tartalmaz olyan összetevőt (NHP), amely humán vérből származik. A forrásanyag US FDA engedélyezett tesztekkel vizsgálva nem bizonyult reaktívnak HCV antitestre, HIV-1/2 antitestre, HIV p24 antigénre és Hepatitis B surface antigénre (HBsAg). Továbbá a gyűjtött donoregységeket is vizsgálták; PCR-vizsgálattal HIV-1 RNS, HCV RNS és HBV DNS nem volt kimutatható, valamint FDA engedélyezett vizsgálattal HBV core antitest nem volt kimutatható. Egyetlen vizsgálati módszer sem nyújthat teljes garanciát arra, hogy a humán vérkészítményekben nincs jelen fertőző anyag. Emiatt minden humán eredetű anyagot potenciálisan fertőzőnek kell tekinteni. Az NHP fertőzőként kezelendő a Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories33 című dokumentum és az M29-A334 jelű CLSI-dokumentum előírásainak megfelelő biztonságos laboratóriumi eljárásokat alkalmazva. Gondosan tisztítson meg, és ioncserélt vagy desztillált vízzel készített 0,5% nátrium-hipoklorit oldattal fertőtlenítsen minden munkaterületet. A HIV-1 QS, v1.5; HIV-1 DIL; HIV-1 MMX, v1.5; HIV-1 Mn2+, v1.5; HIV-1 (–) C; HIV-1 L(+)C; HIV-1 H(+)C; IM PS1, v1.5 és IQ PS1, v1.5 nátrium-azidot tartalmaz. A nátrium-azid ólom- és rézcsövekkel erősen robbanékony fémazidokat képezve reakcióba léphet. Amikor nátrium-azid tartalmú oldatokat önt ki a laboratóriumi mosogatóba, az azidlerakódás megakadályozására nagy mennyiségű vízzel öblítse ki a lefolyót. Viseljen szemvédőt, laboratóriumi védőruhát és egyszer használatos védőkesztyűt a következő anyagok kezelése során: HIV-1 LYS; HIV-1 MMX, v1.5; DN4; AD3; IM4, v1.5; IQ4, v1.5; CN4; SB3; SB és szubsztrát munkareagens (kevert SB3 és SB reagens). Ezen anyagok bőrrel, szemmel és nyálkahártyákkal való érintkezése kerülendő. Ha mégis előfordul érintkezés, azonnal mossa le nagy mennyiségű vízzel. Ellenkező esetben égő érzés előfordulhat. Ezen reagensek kiömlése esetén szárazra törlés előtt vízzel hígítsa.



11/52

Az SB vagy a szubsztrát munkareagens bőrrel vagy nyálkahártyával való érintkezése kerülendő. Ha előfordul bőrrel való érintkezés, azonnal mossa le nagy mennyiségű vízzel. Az SB és a szubsztrát munkareagens dimetil-formamidot tartalmaz, amelyről ismert, hogy nagy orális adagban mérgező, továbbá a születendő gyermekre nézve ártalmas hatású lehet. A bőrrel való érintkezést, a gőzök belégzését és az anyag lenyelését el kell kerülni. Ha mégis előfordul a bőrrel érintkezés, gondosan mossa le szappanos vízzel, és azonnal forduljon orvoshoz. Ügyeljen rá, hogy a HIV-1 LYS, amely guanidin-tiocianátot tartalmaz, vagy az IM4, v1.5 és IQ4, v1.5, amelyek nátrium-tiocianátot tartalmaznak, ne kerüljenek kapcsolatba nátrium-hipoklorit (fehérítő) oldattal. Az ilyen keverékekből erősen mérgező gáz fejlődhet. A minták kiloccsanását és keresztszennyeződését megelőzendő, a minta- és a kontroll-előkészítéshez csavarókupakos csöveket kell használni. Ne használjon pattintókupakos csöveket.

Tárolási és kezelési követelmények A reagenseket tilos lefagyasztani. A HIV-1 LYS, HIV-1 QS, v1.5 és HIV-1 DIL 2–8 °C-on tárolandók. Felbontás nélkül ezek a reagensek a jelölt lejárati dátumig stabilak. Felbontást követően a fel nem használt részt ki kell dobni. 2–8 °C-on való tárolás során a HIV-1 LYS reagensben csapadék képződik. Használat előtt a HIV-1 LYS reagens 25–37 °C-ra melegítésével oldja fel a csapadékot. Maximum 30 percig melegítse a HIV-1 LYS reagenst, azután keverje erőteljesen, amíg a kristályok feloldódnak. Használatot megelőzően fehér háttér előtt vizsgáljon meg minden egyes HIV-1 LYS üveget, hogy nem ereszt-e, vagy nincs-e sárgásan elszíneződve. Sárgás elszíneződés vagy szivárgás esetén az üveget ne használja fel. Csere céljából lépjen kapcsolatba a helyi Roche-irodával. Felbontást követően a fel nem használt részt ki kell dobni. A roncsoló munkareagenst (HIV-1 QS, v1.5 reagenst adva a HIV-1 LYS reagenshez) szobahőmérsékleten kell tárolni, és az elkészítést követően 4 órán belül fel kell használni. A HIV-1 MMX, v1.5 és HIV-1 Mn2+, v1.5 2–8 °C-on tárolandók. Ezek a reagensek a jelölt lejárati dátumig stabilak. Felbontás után a fel nem használt részt ki kell dobni. A master mix munkareagenst (HIV-1 Mn2+, v1.5-öt HIV-1 MMX, v1.5-höz hozzáadva készül) 2–8 °C-on kell tárolni, és 2–8 °C-on 4 óra hosszat stabil. Az NHP, HIV-1 (–) C, HIV-1 L(+)C és HIV-1 H(+)C 2–8 °C-on tárolandók. Ezek a reagensek a jelölt lejárati dátumig stabilak. Felbontást követően a fel nem használt részt ki kell dobni. Az AD3 2–25 °C-on tárolandó. A COBAS® AMPLICOR® Analizátorba töltést követően az AD3 2–8 °C-on 30 napig vagy a lejárati dátumig stabil, amelyik előbb következik. Az AD3-at legfeljebb 4 gépi cikluson keresztül lehet használni (24 óra ciklusonként), és a gépi ciklusok között 2–8 °C-on kell tárolni.

12/52



HIV-1 MONITOR

Az IM PS1, v1.5 és IM4, v1.5 2–8 °C-on tárolandók. Ezek a reagensek a jelölt lejárati dátumig stabilak. Az IM PS1, v1.5 és IM4, v1.5 összekeverése után a munkareagens 14 napig stabil 2–8 °C-on. A munkareagenst legfeljebb 2 gépi cikluson keresztül lehet használni (24 óra ciklusonként), és a gépi ciklusok között 2–8 °C-on kell tárolni. Az IQ PS1, v1.5 és IQ4, v1.5 2–8 °C-on tárolandók. Ezek a reagensek a jelölt lejárati dátumig stabilak. Az IQ PS1, v1.5 és IQ4, v1.5 összekeverése után a munkareagens 30 napig stabil 2–8 °C-on. A munkareagenst legfeljebb 4 gépi cikluson keresztül lehet használni (24 óra ciklusonként), és a gépi ciklusok között 2–8 °C-on kell tárolni. A DN4 2–25 °C-on tárolandó. A DN4 a jelölt lejárati dátumig stabil. Felbontást követően a DN4 2–8 °C-on 30 napig vagy a lejárati dátumig stabil, amelyik előbb következik. A DN4-et legfeljebb 4 gépi cikluson keresztül lehet használni (24 óra ciklusonként), és a gépi ciklusok között 2–8 °C-on kell tárolni. A CN4 2–8 °C-on tárolandó. A CN4 a jelölt lejárati dátumig stabil. Felbontást követően a CN4 reagens 2–8 °C-on 30 napig vagy a lejárati dátumig stabil, amelyik előbb következik. A CN4-et legfeljebb 4 gépi cikluson keresztül lehet használni (24 óra ciklusonként), és a gépi ciklusok között 2–8 °C-on kell tárolni. Az SB3 és SB 2–8 °C-on tárolandók. Felbontatlanul ezek a reagensek a jelölt lejárati dátumig stabilak. A szubsztrát munkareagenst minden nap el kell készíteni az SB3 és az SB összekeverésével. A szubsztrát munkareagens a COBAS® AMPLICOR® készülékben 16 óráig stabil. Az SB3-at, SB-t vagy a szubsztrát munkareagenst ne tegye ki fémeknek, oxidáló anyagoknak vagy direkt fénynek. A WB 2–30 °C-on tárolandó. A WB a jelölt lejárati dátumig stabil. A WB oldatot hígítás előtt vizsgálja meg, és szükség esetén a csapadék visszaoldására melegítse 30–37 °C-ra. A WB desztillált vagy ioncserélt vízzel való 1:10 hígításával készített mosó munkapuffert (1X) 2–25 °C-on, a COBAS® AMPLICOR® mosópuffertartályában kell tárolni, és az elkészítéstől számított 2 hétig stabil. A részben felhasznált kimutatási reagensek 2–8 °C-on tárolandók két gépi ciklus között. Ellenőrizze a felbontott reagensek, illetve a munkareagens lejárati idejét a COBAS® AMPLICOR® készülékbe betöltés előtt.

A készlet tartalma HIM

COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 Minta-előkészítő reagensek

P/N: 21118390 123 ART: 11 1839 0 US: 83369

HIM PREP

HIV-1 LYS (HIV-1 MONITOR roncsoló reagens) HIV-1 QS, v1.5 (HIV-1 MONITOR mennyiségi standard, 1.5-ös verzió) HIV-1 DIL (HIV-1 MONITOR mintaoldószer)



13/52

Kontrollreagensek

HIM CTL

NHP [Negatív plazma (humán)] HIV-1 (–) C [HIV-1 (–) kontroll] HIV-1 L(+)C [HIV-1 MONITOR alacsony (+) kontroll] HIV-1 H(+)C [HIV-1 MONITOR magas (+) kontroll] Amplifikálási reagensek

HIM AMP

HIV-1 MMX, v1.5 (HIV-1 MONITOR master mix, 1.5-ös verzió) HIV-1 Mn2+, v1.5 (HIV-1 MONITOR mangánoldat, 1.5-ös verzió) Specifikus kimutatási reagensek

HIM DK

AD3 (Amplikon hígítási reagens) IM PS1, v1.5 (HIV-1 próba szuszpenzió 1, 1.5-ös verzió) IM4, v1.5 (HIV-1 próba szuszpenzió 2, 1.5-ös verzió) IQ PS1, v1.5 (HIV-1 mennyiségi standard próba szuszpenzió 1, 1.5-ös verzió) IQ4, v1.5 (HIV-1 mennyiségi standard próba szuszpenzió 2, 1.5-ös verzió) Általános kimutatási reagensek

DK

DN4 (denaturáló oldat) CN4 (avidin-tormaperoxidáz konjugátum) SB3 (szubsztrát A) SB (szubsztrát B) COBAS® AMPLICOR® Wash Buffer COBAS® AMPLICOR® mosópuffer

WB

P/N: 20759899 123 ART: 07 5989 9 US: 83314



WB (10X-mosókoncentrátum)

14/52

HIV-1 MONITOR

Szükséges, de nem biztosított anyagok Preamplifikálás – Reagens-előkészítő terület – COBAS® AMPLICOR® A-gyűrű 12 A-csövekkel ellátva – COBAS® AMPLICOR® A-gyűrűtartó – Eppendorf Multipette® pipetta 1,25 ml Eppendorf Combitip® tartóval (steril, egyenként csomagolt) – Pipettahegyek (kapacitás 50 µl és 100 µl)* aeroszolbarrierrel vagy pozitív kiszorításos RNáz-mentes hegyek – Egyszer használatos kesztyűk, púdermentes Preamplifikálás – Minta- és kontroll-előkészítő terület – 2,0 ml csavarókupakos csövek, steril (Sarstedt 72.694.006, vagy ekvivalens)** – 1,5 ml csavarókupakos csövek, steril (Sarstedt 72.692.105, vagy ekvivalens)** – Csőállvány (Sarstedt 93.1428 vagy ekvivalens) – 95% etanol, molekuláris biológiai vagy szövettani használatra (desztillált vagy ioncserélt vízzel frissen hígítva 70%-ra) – Izopropil-alkohol, reagens minőség – Steril, finomhegyű átvivőpipetták, RNáz-mentes – Steril, egyszer használatos, polisztirol szerológiai pipetták (5 ml, 10 ml és 25 ml) – Pipettahegyek (kapacitás 12,5 µl, 25 µl, 50 µl, 100 µl, 200 µl, 400 µl, 500 µl, 600 µl, 800 µl és 1000 µl)* aeroszolbarrierrel vagy pozitív kiszorításos RNáz-mentes hegyek – Mikrocentrifuga (max. RCF 16 000 × g, min. RCF 12 500 × g); Eppendorf 5415C, HERMLE Z230M, vagy ekvivalens – Hűtött ultracentrifuga és rögzített szögű rotor (45 fok, legalább huszonnégy db 1,5 ml cső kapacitás) RCF 23 600 × g (Heraeus 17RS HFA 22,1 rotorral, Biofuge 28RS vagy ekvivalens) – Vortex keverő – Egyszer használatos kesztyűk, púdermentes Posztamplifikálás – Amplifikálási/Kimutatási terület – COBAS® AMPLICOR® készülék és nyomtató – Felhasználói kézikönyv a COBAS® AMPLICOR® Analizátorhoz • Opcionális: AMPLILINK szoftver, beleértve: – AMPLILINK szoftver adatállomás, nyomtatóval – AMPLILINK szoftver 2.4-es verziójú sorozat Felhasználói kézikönyve COBAS® AMPLICOR® készülék használatához (az AMPLILINK szoftver v2.41-es verziójához) vagy AMPLILINK szoftver 3.2-es verziójú sorozat Alkalmazási kézikönyve COBAS® AmpliPrep készülék, COBAS® TaqMan® készülék, COBAS® TaqMan® 48 készülék és COBAS® AMPLICOR® készülék használatához (az AMPLILINK szoftver v3.2-es sorozatához) – – – – –


D-cső állványok Desztillált vagy ioncserélt víz 5 ml szerológiai pipetták Vortex keverő Egyszer használatos kesztyűk, púdermentes


15/52

*

A pipetták pontossága a névleges térfogat 3%-án belül legyen. Aeroszolbarrieres vagy pozitív kiszorításos RNáz-mentes pipettahegyeket kell használni ott, ahol alapvető megelőzni a minta és az amplikon keresztszennyeződését.

**

A minták és kontrollok kiloccsanását és keresztszennyeződését megelőzendő, a minta és a kontroll előkészítéshez csavarókupakos csöveket kell használni. Ne használjon pattintókupakos csöveket.

A minta levétele, transzportja és tárolása Megjegyzés

Valamennyi mintát fertőzések átvitelére alkalmasként kell kezelni.

A minta levétele

A COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 kizárólag plazmamintákhoz való használatra alkalmas. A vért EDTA (levendulakék kupak) vagy ACD (sárga kupak) alvadásgátlót tartalmazó steril csövekbe kell levenni. A heparinnal alvadásgátolt minták nem megfelelőek erre a vizsgálatra. A vért ne hagyja 2–25 °C-on 6 óránál tovább. A vérvételi csőben lévő 1,5 ml ACD alvadásgátló hígító hatása következtében az ACD alvadásgátolt minták vizsgálati eredményei mintegy 15%-kal alacsonyabbak, mint az EDTA alvadásgátolt minták eredményei. Az 1. ábra mutatja az ACD és EDTA alvadásgátlók hatását a HIV-1 RNSeredményekre, plazmaminták esetén.

ACD-s minták átlagos AMPLICOR® HIV-1 MONITOR eredmény (HIV RNS kópia/ml plazma, n = 2)

1. ábra ACD és EDTA a lvadásgátlók összehasonlítása* AMPLICOR® HIV-1 MONITOR EDTA-s és ACD-s minták eredményei 10 5

y = 1,4381 * x^(0,93286) R= 0,90097 EDTA = ACD

10 4

10 3

10 3

10 4 10 5 EDTA-s minták átlagos AMPLICOR® HIV-1 MONITOR eredmény (HIV RNS kópia/ml plazma, n = 2)

* Az 1. ábrán látható adatokat AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test segítségével a standard minta-előkészítő eljárást alkalmazva nyerték. A plazmát a levételtől számított 6 órán belül szeparálja el a teljes vérből centrifugálással (800–1600 × g, 20 perc, szobahőmérséklet). Vigye át a plazmát egy steril polipropilén csőben. A minta transzportja

16/52

A teljes vér vagy plazma transzportja meg kell, hogy feleljen a kóroki ágensek transzportjára vonatkozó országos, szövetségi, állami és helyi szabályozásoknak35. A teljes vér 2–25 °C-on transzportálandó, és a levételtől számított 6 órán belül fel kell dolgozni. A plazma 2–8 °C-on vagy -20 °C – -80 °C-ra fagyasztva transzportálandó.



HIV-1 MONITOR

A minta tárolása

A plazmaminták szobahőmérsékleten 1 napig, 2–8 °C között 5 napig, illetve -20 °C – -80 °C-ra fagyasztva tárolhatóak. A minták tárolása 2,0 ml polipropilén csavarókupakos csövekben (pl. Sarstedt 72.694.006) 600–700 µl részletekben javasolt. A plazmaminták legfeljebb három alkalommal fagyaszthatók le és olvaszthatók fel. A 2. ábra ezen fagyasztás/olvasztás vizsgálatok adatait mutatja.

2. ábra Három HIV-1 pozitív plazmaminta átlagos HIV-1 eredményei 2, 3 és 4 fagyasztás/olvasztás ciklust követően* HIV-1 RNS kópia/ml Első felolvasztásra normalizálva

2,0

1,5

1,0

0,5

0,0 1

2

3

4

Felolvasztások száma

* A 2. ábrán látható adatokat AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test segítségével, a standard minta-előkészítő eljárást alkalmazva nyerték.

Használati utasítás Megjegyzés

A részletes üzemeltetési utasításokért, az eredmények kinyomtatásáért és a jelzők, megjegyzések és hibaüzenetek értelmezéséért forduljon a következő kézikönyvekhez: (1) a COBAS® AMPLICOR® készülék Felhasználói kézikönyve és (2) az AMPLILINK szoftver v2.41 használata esetén az AMPLILINK szoftver 2.4-es verziójú sorozat Felhasználói kézikönyve a COBAS® AMPLICOR® készülékkel való használatra vagy az AMPLILINK szoftver v3.2-es sorozatának használata esetén az AMPLILINK szoftver 3.2-es verziójú sorozat Alkalmazási kézikönyve a COBAS® AmpliPrep készülékkel, COBAS® TaqMan® készülékkel, a COBAS® TaqMan® 48 készülékkel és a COBAS® AMPLICOR® készülékkel való együttes használatra.

Megjegyzés

Felhasználás előtt valamennyi reagensnek szobahőmérsékletűnek kell lennie. A vizsgálati eljárás megkezdése előtt valamennyi reagenst vizsgáljon meg, hogy elégséges térfogat áll-e rendelkezésre.

Megjegyzés

Felhasználás előtt a plazmamintáknak szobahőmérsékletűeknek kell lenniük. Használjon aeroszolbarrieres pipettákat vagy pozitív kiszorításos hegyeket, ahol indokolt. A szelektív amplifikálás érdekében rendkívüli gondossággal járjon el.

Megjegyzés

A minták kiloccsanását és keresztszennyeződését megelőzendő, a minta- és a kontroll-előkészítéshez csavarókupakos csöveket kell használni. Ne használjon pattintókupakos csöveket.

Megjegyzés

A COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 csak a Basic módban futtatható.



17/52

Futtatási mennyiség

Valamennyi készlet elegendő reagenst tartalmaz négy darab 12 mintás futtatáshoz, amelyek kivitelezhetőek külön-külön vagy két 24 tesztes futtatásként. Futtatásonként legfeljebb 24 mintát (21 mintát + 3 kontrollt) lehet feldolgozni. Valamennyi futtatásnak legalább egy AMPLICOR® HIV-1 (–) kontrollt, egy AMPLICOR® HIV-1 MONITOR alacsony (+) kontrollt és egy AMPLICOR® HIV-1 MONITOR magas (+) kontrollt kell tartalmaznia (ld. „Minőség-ellenőrzés”). A minta-előkészítő és az amplifikálási reagensek 12 tesztre elegendő, egyszer használatos üvegekben vannak. A reagensek leghatékonyabb felhasználása céljából a mintákat és a kontrollokat a 12 többszörösének megfelelő tételekben kell feldolgozni.

Megjegyzés


Munkafolyamat

A COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 egy vagy két nap alatt végezhető el. Ha a vizsgálatot egyetlen munkanap alatt kell elvégezni, kövesse sorban az utasításokat a Reagens előkészítése, Minta és kontroll előkészítése, Reverz transzkripció, Amplifikálás és Kimutatás lépéseknek megfelelően. A vizsgálat 2 nap alatt végezhető el, ha az 1. nap a Minta és kontroll előkészítése lépést végzi, majd a 2. nap folytatja a Reagens előkészítése, Reverz transzkripció, Amplifikálás és Kimutatás lépésekkel. Ha a minta és kontroll előkészítését az 1. napon, a reverz transzkripciót, amplifikálást és kimutatást pedig a 2. napon kívánja elvégezni, akkor végezze el vagy a Standard minta- és kontroll-előkészítést (A.1.–A.14.) vagy pedig az Ultraszenzitív minta- és kontroll-előkészítést (B.1.–B.19.), és tárolja a feldolgozott mintákat az A.14., illetve B.19. lépésben leírtaknak megfelelően. A 2. napon kezdje a Reagens előkészítése lépéssel, majd olvassza fel a feldolgozott mintákat és kontrollokat szobahőmérsékleten, és folytassa a Standard minta- és kontroll-előkészítés (A.15.), illetve az Ultraszenzitív minta- és kontroll-előkészítés (B.20.) lépéssel, majd a Reverz transzkripció, Amplifikálás és Kimutatás lépésekkel.

Reagens előkészítése

Munkaterület: Preamplifikálás – Reagens-előkészítő terület 1. Határozza meg a betegminta- és a kontrollvizsgálatokhoz szükséges A-gyűrűk számát. Helyezze az A-gyűrű(ke)t az A-gyűrűtartóba. 2. Készítse el a master mix munkareagenst 100 µl HIV-1 Mn2+, v1.5 egy ampulla HIV-1 MMX, v1.5 reagenshez való hozzáadásával. A master mix térfogatát nem szükséges megmérnie. Mérjen 100 µl HIV-1 Mn2+, v1.5 oldatot egy teljes ampulla HIV-1 MMX, v1.5 reagenshez. Csavarja rá a kupakot, majd a cső 10–15-szöri fordítgatásával keverje jól össze az oldatokat. A master mix munkareagenst ne vortexelje. A HIV-1 Mn2+, v1.5 rózsaszín színe alkalmas, hogy meggyőződjön róla, hogy a HIV-1 Mn2+, v1.5 oldatot a master mix reagenshez adta. A maradék HIV-1 Mn2+, v1.5 oldatot dobja ki. A master mix munkareagens 2–8 °C-on tárolandó, és az elkészítést követő 4 órán belül fel kell használni. 3. Mérjen valamennyi A-csőbe 50 µl master mix munkareagenst ismétlő pipettával vagy aeroszolbarrierrel vagy pozitív kiszorításos heggyel ellátott pipettával. Ezután ne zárja le az A-csöve(ke)t. A fel nem használt master mix munkareagenst dobja ki. 4. Helyezze a master mix munkareagenst tartalmazó A-gyűrű(ke)t egy újrazárható műanyag tasakba, és gondosan zárja le a tasakot. Az A-gyűrű(ke)t vigye át a Preamplifikálás – Minta-előkészítő területre. A minta és kontroll előkészítése befejezéséig tárolja a master mix

18/52



HIV-1 MONITOR

reagenst tartalmazó A-gyűrű(ke)t 2–8 °C-on a Preamplifikálás – Mintaelőkészítő területen. A master mix munkareagens az A-csövekben, lezárt műanyag tasakban 2–8 °C-on 4 óra hosszat stabil. Minta és kontroll előkészítése

Munkaterület: Preamplifikálás – Minta- és kontroll-terület

Megjegyzés

Korábban előkészített minták és kontrollok amplifikálásához először a „Reagens előkészítése” szakasz lépéseit végezze el. Olvassza fel a mintákat és a kontrollokat szobahőmérsékleten, majd folytassa a „Standard minta- és kontroll-előkészítés” (A.15.) vagy az „Ultraszenzitív minta- és kontroll-előkészítés” (B.20.) lépéssel.

Megjegyzés

2–8 °C-on való tárolás során a HIV-1 LYS reagensben csapadék képződik. Felhasználást megelőzően melegítse 25–37 °C-ra és a kicsapódott anyag feloldása céljából erőteljesen keverje az oldatot.

Megjegyzés

Használatot megelőzően fehér háttér előtt vizsgáljon meg minden egyes HIV-1 LYS üveget, hogy nem ereszt-e, vagy nincs-e sárgásan elszíneződve. Sárgás elszíneződés vagy szivárgás esetén az üveget ne használja fel. Csere céljából lépjen kapcsolatba a helyi Roche-irodával.

Standard minta- és kontroll-előkészítés A.1. Készítsen 70%-os etanolt. 12 teszthez: keverjen össze 11,0 ml 95%-os etanolt és 4,0 ml ioncserélt vagy desztillált vizet. A.2. Címkézzen meg egy-egy 2,0 ml-es csavarókupakos csövet minden egyes betegmintához és további három csövet, mint „HIV-1 (–) C”, „HIV-1 L(+)C” és „HIV-1 H(+)C”. A.3. Készítsen standard roncsoló munkareagenst. Használat előtt vortexelje a HIV-1 QS, v1.5 oldatot legalább 10 másodpercig. Minden egyes, legfeljebb 12 mintát és kontrollt tartalmazó tételre számolva, mérjen 100 µl HIV-1 QS, v1.5 oldatot egy üveg HIV-1 LYS reagenshez, és keverje össze jól. A HIV-1 LYS térfogatát nem szükséges megmérnie. A HIV-1 QS, v1.5 rózsaszín színe alkalmas, hogy meggyőződjön arról, hogy a HIV-1 QS, v1.5 oldatot a HIV-1 LYS reagenshez adta. A maradék HIV-1 QS, v1.5 oldatot dobja ki. A standard roncsoló munkareagens szobahőmérsékleten 4 óra hosszat stabil. Megjegyzés

Fagyasztott minták használatakor olvassza fel a mintákat szobahőmérsékleten, majd vortexelje őket 3–5 másodpercig. A mintának a cső aljába gyűjtéséhez a csövet rövid időre tegye centrifugába. A mintákkal való munka során ügyeljen a kesztyűk szennyezésének elkerülésére. A.4. Mérjen 600 µl standard roncsoló munkareagenst minden egyes megcímkézett csőbe, és csavarja a csövekre a kupakokat. Ellenőrizze a roncsoló munkareagens rózsaszín színét, hogy meggyőződjön arról, hogy a HIV-1 QS, v1.5 oldatot a HIV-1 LYS reagenshez adta. A.5. Készítse el a standard kontrollokat a következők szerint:


–

Vortexelje az NHP, HIV-1 (–) C, HIV-1 L(+)C és HIV-1 H(+)C kontrollokat 3–5 másodpercig.

–

Mérjen 200 µl NHP-t a három kontrollcső mindegyikébe. Csavarja a csövekre a kupakokat, és vortexelje őket 3–5 másodpercig.

–

Mérjen 50 µl HIV-1 (–) C-t a standard roncsoló munkareagenst és NHP-t tartalmazó „HIV-1 (–) C” címkézésű csőbe. Csavarja a csőre a kupakot, és vortexelje 3–5 másodpercig.


19/52

–

Mérjen 50 µl HIV-1 L(+)C-t a standard roncsoló munkareagenst és NHP-t tartalmazó „HIV-1 L(+)C” címkézésű csőbe. Csavarja a csőre a kupakot, és vortexelje 3–5 másodpercig.

–

Mérjen 50 µl HIV-1 H(+)C-t a standard roncsoló munkareagenst és NHP-t tartalmazó „HIV-1 H(+)C” címkézésű csőbe. Csavarja a csőre a kupakot, és vortexelje 3–5 másodpercig.

A.6. Mérjen minden egyes betegmintából 200 µl-t a megfelelően címkézett standard roncsoló munkareagenst tartalmazó csövekbe. Csavarja a csövekre a kupakokat, és vortexelje őket 3–5 másodpercig. A.7. Inkubálja a minta- és kontrollcsöveket 10 percig szobahőmérsékleten. A.8. Minden egyes minta- és kontrollcső esetén vegye le a kupakot, mérjen be 800 µl 100%-os izopropil-alkoholt (szobahőmérsékleten) az adott csőbe, csavarja vissza a kupakot, és vortexelje 3–5 másodpercig. Ne legyen egyszerre egynél több cső nyitva. A.9. Tegyen orientációs jelzést valamennyi csőre, majd helyezze a csöveket a mikrocentrifugába úgy, hogy az orientációs jelzés kifelé nézzen, vagyis az üledék a jelzésnek megfelelően helyezkedjen majd el. Centrifugálja le a mintákat és a kontrollokat szobahőmérsékleten maximum sebességen (12 500–16 000 × g) 15 percig. A.10. Minden egyes csőhöz új, finom hegyű transzferpipettát használva óvatosan távolítsa el és dobja ki a felülúszót minden csőből, ügyeljen rá, hogy ne zavarja fel az üledéket (amely esetleg nem is látható). Távolítsa el a lehető legtöbb folyadékot anélkül, hogy felzavarná az üledéket. A felülúszót lassan szívja ki, lehetőséget adva a folyadéknak, hogy teljesen leszivárogjon a cső faláról. Ne használjon vákuum szívót. A.11. Mérjen be 1,0 ml 70%-os etanolt (szobahőmérsékleten) mindegyik csőbe, csavarja vissza a kupakokat, és vortexelje őket 3–5 másodpercig. A.12. Helyezze a csöveket egy mikrocentrifugába az orientációs jelzésekkel kifelé, és centrifugálja a csöveket szobahőmérsékleten maximum sebességen (12 500–16 000 × g) 5 percig. A.13. Minden egyes csőhöz új, finom hegyű átvivőpipettát használva óvatosan távolítsa el a felülúszót az üledék felzavarása nélkül. Az üledék ebben a lépésben tisztán látható. Távolítsa el a lehető legtöbb felülúszót. Az etanolmaradványok gátolhatják az amplifikálást. A.14. Mérjen be 400 µl HIV-1 DIL-t mindegyik csőbe. Csavarja vissza a csőre a kupakot. Az extrahált RNS reszuszpendálása végett vortexeljen erőteljesen 10 másodpercig. Némi oldhatatlan anyag visszamaradhat. Amplifikálja a feldolgozott mintákat és kontrollokat az előkészítéstől számított 2 órán belül. Ha az amplifikálást nem kezdi meg az előkészítéstől számított 2 órán belül, akkor a minták -20 °C-ra vagy az alá fagyasztva maximum egy hétig tárolhatóak, legfeljebb egyszeri fagyasztás/olvasztás mellett. Egynél több fagyasztás/olvasztás ciklus kópiaszámbeli veszteséget eredményezhet. Megjegyzés

20/52

Fagyasztva tárolt minták és kontrollok használatakor az amplifikálást megelőzően olvassza fel a mintákat szobahőmérsékleten, majd vortexelje őket 5 másodpercig, mielőtt az A.15. lépéssel folytatná. COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, version 1.5


HIV-1 MONITOR

A.15. Mérjen aeroszolbarrierrel vagy pozitív kiszorításos heggyel ellátott pipettával minden egyes mintából és kontrollból 50 µl-t a megfelelő, master mix munkareagenst tartalmazó A-csövekbe. Használjon új hegyet minden egyes mintához és kontrollhoz. Ügyeljen arra, hogy ne vigyen át semminemű csapadékos anyagot, amely nem ment vissza oldatba. Csavarja az A-csövekre a kupakokat. A.16. Jegyezze fel az A-gyűrű(k)ben levő kontrollok és minták helyzetét. Az amplifikálást a mintáknak és kontrolloknak a master mix munkareagenst tartalmazó A-csövekhez adásától számított 45 percen belül meg kell kezdeni. Vigye át az A-gyűrűkben lévő előkészített mintákat és kontrollokat az amplifikálási/kimutatási területre. A feldolgozott minták maradéka -20 °C-ra vagy az alá fagyasztva legfeljebb egy hétig tárolható, legfeljebb egyszeri fagyasztás/olvasztás mellett. Egynél több fagyasztás/olvasztás ciklus kópiaszámbeli veszteséget eredményezhet. Ultraszenzitív minta- és kontroll-előkészítés B.1. Hűtse le az ultracentrifugát és a rotort 2–8 °C-ra, ahogy az az ultracentrifuga használati utasításában le van írva. B.2. Készítsen 70%-os etanolt. 12 teszthez: keverjen össze 11,0 ml 95%-os etanolt és 4,0 ml ioncserélt vagy desztillált vizet. B.3. Címkézzen meg egy-egy 1,5 ml-es csavarókupakos csövet minden egyes betegmintához és további három csövet, mint „HIV-1 (–) C”, „HIV-1 L(+)C” és „HIV-1 H(+)C”. B.4. Készítsen ultraszenzitív roncsoló munkareagenst. Használat előtt vortexelje a HIV-1 QS, v1.5 oldatot legalább 10 másodpercig. Minden egyes, legfeljebb 12 mintát és kontrollt tartalmazó tételre számolva, mérjen 25 µl HIV-1 QS, v1.5 oldatot egy üveg HIV-1 LYS reagenshez, és keverje össze jól. A HIV-1 LYS térfogatát nem szükséges megmérnie. A HIV-1 QS, v1.5 rózsaszín színe alkalmas, hogy meggyőződjön arról, hogy a HIV-1 QS, v1.5 oldatot a HIV-1 LYS reagenshez adta. A maradék HIV-1 QS, v1.5 oldatot dobja ki. Az ultraszenzitív roncsoló munkareagens szobahőmérsékleten 4 óra hosszat stabil. Megjegyzés

Fagyasztott minták használatakor olvassza fel a mintákat szobahőmérsékleten, majd vortexelje őket 3–5 másodpercig. A mintának a cső aljába gyűjtéséhez a csövet rövid időre tegye centrifugába. A mintákkal való munka során ügyeljen a kesztyűk szennyezésének elkerülésére. B.5. Mérjen minden betegmintából 500 µl-t a megfelelően címkézett csövekbe. B.6. Mérjen 500 µl NHP-t a megfelelően címkézett kontrollcsövekbe. B.7. Tegyen orientációs jelzést valamennyi csőre, majd helyezze a csöveket az ultracentrifugába úgy, hogy az orientációs jelzés kifelé nézzen, vagyis az üledék a jelzésnek megfelelően helyezkedjen majd el. Centrifugálja le a mintákat és kontrollokat 2–8 °C-on 23 600 × g sebességen 60 percig. B.8. Minden egyes csőhöz új, finom hegyű transzferpipettát használva óvatosan távolítsa el és dobja ki a felülúszót minden csőből, ügyeljen rá, hogy ne zavarja fel az üledéket (amely esetleg nem is látható). Távolítsa el a lehető legtöbb folyadékot anélkül, hogy felzavarná az üledéket. A felülúszót lassan szívja ki, lehetőséget adva a folyadéknak, hogy teljesen leszivárogjon a cső faláról. Ne használjon vákuum szívót.



21/52

Megjegyzés

Az ultraszenzitív minta-előkészítő eljárás B.8. lépésében képződő vírusüledék szobahőmérsékleten legfeljebb 6 óra hosszat, -20 °C vagy az alatti hőmérsékleten legalább 14 napig stabil. B.9. Mérjen 600 µl roncsoló munkareagenst minden egyes megcímkézett csőbe, és csavarja a csövekre a kupakokat. Ellenőrizze a roncsoló munkareagens rózsaszín színét, hogy meggyőződjön arról, hogy a HIV-1 QS, v1.5 oldatot a HIV-1 LYS reagenshez adta. Az üledék reszuszpendálása végett vortexelje a csövet 3–5 másodpercig. B.10. Készítse el az ultraszenzitív kontrollokat a következők szerint: –

Vortexelje a HIV-1 (–) C, HIV-1 L(+)C, és HIV-1 H(+)C kontrollokat 3–5 másodpercig.

–

Mérjen 12,5 µl HIV-1 (–) C-t az ultraszenzitív roncsoló munkareagenst tartalmazó „HIV-1 (–) C” címkézésű csőbe. Csavarja a csőre a kupakot, és vortexelje 3–5 másodpercig.

–

Mérjen 12,5 µl HIV-1 L(+)C-t az ultraszenzitív roncsoló munkareagenst tartalmazó „HIV-1 L(+)C” címkézésű csőbe. Csavarja a csőre a kupakot, és vortexelje 3–5 másodpercig.

–

Mérjen 12,5 µl HIV-1 H(+)C-t az ultraszenzitív roncsoló munkareagenst tartalmazó „HIV-1 H(+)C” címkézésű csőbe. Csavarja a csőre a kupakot, és vortexelje 3–5 másodpercig.

B.11. Inkubálja a minta- és kontrollcsöveket 10 percig szobahőmérsékleten. B.12. Minden egyes minta- és kontrollcső esetén vegye le a kupakot, mérjen be 600 µl 100%-os izopropil-alkoholt (szobahőmérsékleten) az adott csőbe, csavarja vissza a kupakot, és vortexelje 3–5 másodpercig. Ne legyen egyszerre egynél több cső nyitva. B.13. Tegyen orientációs jelzést valamennyi csőre, majd helyezze a csöveket a mikrocentrifugába úgy, hogy az orientációs jelzés kifelé nézzen, vagyis az üledék a jelzésnek megfelelően helyezkedjen majd el. Centrifugálja le a mintákat és a kontrollokat szobahőmérsékleten maximum sebességen (12 500–16 000 × g) 15 percig. B.14. Minden egyes csőhöz új, finom hegyű transzferpipettát használva óvatosan távolítsa el és dobja ki a felülúszót minden csőből, ügyeljen rá, hogy ne zavarja fel az üledéket (amely esetleg nem is látható). Távolítsa el a lehető legtöbb folyadékot anélkül, hogy felzavarná az üledéket. A felülúszót lassan szívja ki, lehetőséget adva a folyadéknak, hogy teljesen leszivárogjon a cső faláról. Ne használjon vákuum szívót. B.15. Mérjen be 1,0 ml 70%-os etanolt (szobahőmérsékleten) mindegyik csőbe, csavarja vissza a kupakokat, és vortexelje őket 3–5 másodpercig. B.16. Helyezze a csöveket a mikrocentrifugába az orientációs jelzésekkel kifelé, és centrifugálja a csöveket szobahőmérsékleten maximum sebességen (12 500–16 000 × g) 5 percig. B.17. Minden egyes csőhöz új, finom hegyű átvivőpipettát használva óvatosan távolítsa el a felülúszót az üledék felzavarása nélkül. Az üledék ebben a lépésben tisztán látható. Távolítsa el a lehető legtöbb felülúszót. Az etanolmaradványok gátolhatják az amplifikálást. B.18. Ismételje meg a B.17. lépést, és távolítsa el a lehető legtöbb felülúszót. Az etanolmaradványok gátolhatják az amplifikálást.

22/52



HIV-1 MONITOR

B.19. Mérjen be 100 µl HIV-1 DIL-t mindegyik csőbe. Csavarja vissza a csőre a kupakot. Az extrahált RNS reszuszpendálása végett vortexeljen erőteljesen 10 másodpercig. Némi oldhatatlan anyag visszamaradhat. Amplifikálja a feldolgozott mintákat és kontrollokat az előkészítéstől számított 2 órán belül. Ha az amplifikálást nem kezdi meg az előkészítéstől számított 2 órán belül, akkor a minták -20 °C-ra vagy az alá fagyasztva maximum egy hétig tárolhatóak, legfeljebb egyszeri fagyasztás/olvasztás mellett. Egynél több fagyasztás/olvasztás ciklus kópiaszámbeli veszteséget eredményezhet. Megjegyzés

Fagyasztva tárolt minták és kontrollok használatakor az amplifikálást megelőzően olvassza fel a mintákat szobahőmérsékleten, majd vortexelje őket 5 másodpercig, mielőtt a B.20. lépéssel folytatná. B.20. Mérjen aeroszolbarrierrel vagy pozitív kiszorításos heggyel ellátott pipettával minden egyes mintából és kontrollból 50 µl-t a megfelelő, master mix munkareagenst tartalmazó A-csövekbe. Használjon új hegyet minden egyes mintához és kontrollhoz. Ügyeljen arra, hogy ne vigyen át semminemű csapadékos anyagot, amely nem ment vissza oldatba. Csavarja az A-csövekre a kupakokat. B.21. Jegyezze fel az A-gyűrű(k)ben levő kontrollok és minták helyzetét. Az amplifikálást a mintáknak és kontrolloknak a master mix munkareagenst tartalmazó A-csövekhez adásától számított 45 percen belül meg kell kezdeni. Vigye át az A-gyűrűkben lévő előkészített mintákat és kontrollokat az amplifikálási/kimutatási területre. A feldolgozott minták maradéka -20 °C-ra vagy az alá fagyasztva legfeljebb egy hétig tárolható, legfeljebb egyszeri fagyasztás/olvasztás mellett. Egynél több fagyasztás/olvasztás ciklus kópiaszámbeli veszteséget eredményezhet.

Reverz transzkripció, Amplifikálás és Kimutatás

Munkaterület: Posztamplifikálás – Amplifikálási/Kimutatási terület Végezze el a készülék napi karbantartását, beleértve: – –

–

Törölje le az indítóhelyet szálmentes nedves ruhával, és szárítsa meg. Törölje le a D-csőtartó hegyet szálmentes nedves ruhával, és szárítsa meg. Ellenőrizze a mosópuffertartályt, és ha szükséges, töltse fel. Készítse el a mosó munkapuffert (1X) a következők szerint: A WB oldatot vizsgálja meg, és szükség esetén a csapadék visszaoldására melegítse 30–37 °C-ra. Adjon 1 térfogatrész WB oldatot 9 térfogatrész ioncserélt vagy desztillált vízhez. Keverje jól össze. Mindig tartson legalább 3–4 liter mosó munkapuffert (1X) a készülék mosópuffertartályában. Ürítse ki a hulladéktárolót.

– – –

Indítsa be a COBAS® AMPLICOR® készüléket. A beindítás során ellenőrizze a fecskendőket és a csövezést. A beindítás során ellenőrizze a transzferhegyet.

– –

Minden egyes futtatás előtt – –


–

Ellenőrizze a hulladéktárolót, és ürítse ki, ha szükséges. Ellenőrizze a mosópuffertartályt, és ha szükséges, töltsön hozzá puffert. Cserélje ki a használt D-cső állványokat.

–

Indítsa be a COBAS® AMPLICOR® készüléket.


23/52

A COBAS® AMPLICOR® Analizátor betöltése és a rendszer működtetése 1. Vizsgálja meg az asztali reagensek mennyiségeit a COBAS® AMPLICOR® készüléken. Készítsen elegendő reagenskazettát a műveletekhez való feltöltéshez. 2. Vortexelje jól össze az IM PS1, v1.5 szuszpenziót. Mérjen 2,5 ml IM PS1, v1.5 szuszpenziót egy IM4, v1.5 kazettába. Helyezze a kazettát a tesztspecifikus reagensállványra. Dobja ki a használt IM PS1, v1.5 ampullát. Jegyezze fel a reagens készítési dátumát az IM4, v1.5 kazettára. 3. Vortexelje jól össze az IQ PS1, v1.5 szuszpenziót. Mérjen 2,5 ml IQ PS1, v1.5 szuszpenziót egy IQ4, v1.5 kazettába. Helyezze a kazettát a tesztspecifikus állványra. Dobja ki a használt IQ PS1, v1.5 ampullát. Jegyezze fel a reagens készítési dátumát az IQ4, v1.5 kazettára. 4. Készítsen 5 ml SB egy SB3 kazettába való pipettázásával szubsztrát munkareagenst. Fel-le pipettázással keverje össze. Dobja ki a felnyitott SB ampullát. Jegyezze fel a reagens készítési dátumát az SB3 kazettára. 5. Helyezze a szubsztrát munkareagenst a generikus reagensállványba. 6. Helyezze az AD3 kazettát a tesztspecifikus reagensállványra. Jegyezze fel a dátumot az AD3 kazettára. 7. Helyezze a DN4 és CN4 kazettákat a generikus reagensállványba. Jegyezze fel a felnyitás dátumát mindegyik kazettára. 8. A billentyűzet, a vonalkód-leolvasó vagy az AMPLILINK szoftver segítségével azonosítsa a reagensállványokat generikusként vagy vizsgálatspecifikusként. 9. Végezze el a reagensállványok konfigurálását úgy, hogy a billentyűzet, a vonalkód-leolvasó vagy az AMPLILINK szoftver segítségével beolvassa a reagenspozíciókat és tételeket a COBAS® AMPLICOR® Analizátorba. 10. A billentyűzet, a vonalkód-leolvasó vagy az AMPLILINK szoftver segítségével töltse be a reagensállványokat a COBAS® AMPLICOR® Analizátorba. Győződjön meg arról, hogy minden egyes reagenskazetta a jelölt pozíciójában van, és szorosan illeszkedik az állványba. 11. Helyezze a D-cső állványt a D-cső platformra. Hat D-cső szükséges minden egyes mintához és kontrollhoz, és kettő D-cső szükséges minden egyes szubsztrát munkaoldat kazettához, tekintettel a COBAS® AMPLICOR® készülék általi kiürítésre. 12. Helyezze az A-gyűrű(ke)t a COBAS® AMPLICOR® készülék ciklikus termosztátszegmense(i)be. 13. A billentyűzet, a vonalkód-leolvasó vagy az AMPLILINK szoftver segítségével töltse be az A-gyűrűket a COBAS® AMPLICOR® Analizátorba. 14. Hozzon létre A-gyűrű munkalistát. Megjegyzés

24/52

Ekkor a felhasználónak meg kell adnia a COBAS® AMPLICOR® Analizátor számára a COBAS® AMPLICOR® HIV-1 Test, v1.5 adatkártyán található tételspecifikus mennyiségi standard kópiaszámot, valamint az alacsony (+) és magas (+) kontroll tartományokat. Adja meg a megfelelő kontolltartományokat az alkalmazott minta-előkészítési eljárás (standard vagy ultraszenzitív) alapján. Ezek a tartományok COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, version 1.5


HIV-1 MONITOR

a COBAS® AMPLICOR® Analizátorba billentyűzet, vonalkód-leolvasó vagy az AMPLILINK szoftver segítségével vihetők be az A-gyűrű munkalista beállítás során. 15. Szorosan zárja le a PCR-készülék-szegmens(ek) tetejét. 16. Indítsa el a COBAS® AMPLICOR® készüléket. 17. Várja meg, míg a COBAS® AMPLICOR® készülék kijelzi, hogy a töltés ellenőrzése megtörtént. Megjegyzés

A COBAS® AMPLICOR® készülék minden egyes A-cső tartalmának 2 önálló mennyiségi meghatározását teszi lehetővé. A kimutatási reagens szükséges mennyiségét minden esetben a COBAS® AMPLICOR® készülék kiszámolja, és minden egyes futtatás kezdetén egy töltésellenőrzés határozza meg, hogy az adott teszthez elegendő reagens áll-e rendelkezésre. 18. A COBAS® AMPLICOR® készülék a reverz transzkripciót, amplifikálást, amplikon hígítást és kimutatást automatikusan végzi. Az eredmények HIV-1 RNS kópia/ml egységben vannak megadva.

Megjegyzés


Eredmények Az eredmények kiszámítása

Megjegyzés

Valamennyi minta és kontroll esetén a COBAS® AMPLICOR® Analizátor automatikusan: •

Kiválasztja valamennyi HIV-1 és mennyiségi standard amplikon hígítást, amelyik a vizsgálat lineáris abszorbanciatartományán belül esik (0,15–2,0 A660). Az eredmény számításához legalább egy HIV-1 hígításnak és egy mennyiségi standard amplikon hígításnak a lineáris tartományon belül kell esni.

•

Korrigálja valamennyi kiválasztott abszorbanciaértéket a háttérabszorbanciának megfelelően.

•

Meghatározza, hogy a HIV-1 QS A660 értéke elfogadható-e, megerősítve, hogy a mintafeldolgozási, reverz transzkripciós, amplifikálási és kimutatási lépések helyesen lettek kivitelezve.

•

Meghatározza valamennyi HIV-1 (–) C target hígítást, amelyik A660 értéke ≤ 0,099.

•

Meghatározza valamennyi kiválasztott hígítás teljes HIV-1 és QS A660 értékeit, és a maximális teljes A660 érték segítségével kiszámítja a kópiaszámot a HIV-1 L(+)C és HIV-1 H(+)C kontrollokra és minden egyes mintára.

•

Meghatározza, hogy a számított HIV-1 L(+)C és HIV-1 H(+)C kópiaszám a megadott tartományba esik-e.

•

Valamennyi HIV-1 és mennyiségi standard hígítás A660 értékeit, valamint minden egyes minta és kontroll számított kópiaszám (HIV-1 RNS kópia/ml) értékeit feltüntető nyomtatást készít. A kópiaszám az eredménylapon a mintaazonosító alatt normál alakban van feltüntetve.

A felhasználónak lehetősége van rá, hogy a vizsgálat eredményeit kópia/ml-ről manuálisan nemzetközi egységekre (IU/ml) váltsa. Egy együttműködésben szervezett közös vizsgálat alapján az első HIV-1 RNS nemzetközi standardra a váltószám 0,51 HIV-1 RNS kópia/nemzetközi egység (IU).36



25/52

Futtatás validálás

Jelző

Eredmény

_Q_

QS_INVALID

_N_

NC_INVALID

_H_

HPC_INVALID

_L_

Ellenőrizze a kinyomtatott eredménylapon a jelzőket és megjegyzéseket, hogy meggyőződjön arról, hogy a futtatás érvényes. A futtatás nem érvényes, ha a HIV-1 MONITOR kontrollok az alábbi jelzők vagy megjegyzések bármelyikét kapják. Értékelés A HIV-1 QS A660 érték bármelyik kontroll esetén az elfogadható tartomány felett vagy alatt van. A HIV-1 (–) C A660 érték meghaladja az elfogadható korlátot (> 0,099). A HIV-1 H(+)C kópiaszám a kijelölt tartomány felett vagy alatt van.

LPC_INVALID

A HIV-1 L(+)C kópiaszám a kijelölt tartomány felett vagy alatt van.

OD_SEQUENCE

Egy nem sorrendbe eső target A660 értéket jelöl. Nem lesz számított eredmény. Ismételje meg a teljes vizsgálati eljárást (beleértve a minta és kontroll előkészítését, amplifikációt és kimutatást is).

QS_SEQUENCE

Egy nem sorrendbe eső QS A660 értéket jelöl. Nem lesz számított eredmény. Ismételje meg a teljes vizsgálati eljárást (beleértve a minta és kontroll előkészítését, amplifikációt és kimutatást is).

TARGETOD_HI

Valamennyi OD érték nagyobb a megadott tartomány legmagasabb értékénél. Ha ez a jelző jelenik meg alacsony vagy magas pozitív kontroll esetén, a COBAS® AMPLICOR® Analizátor nem számít titert. Számított titer hiányában az érintett kontrolleredmény és a futtatás érvénytelen.

TARGETOD_LO

Valamennyi OD érték kisebb a megadott tartomány legalacsonyabb értékénél. Ha ez a jelző jelenik meg alacsony vagy magas pozitív kontroll esetén, a COBAS® AMPLICOR® Analizátor nem számít titert. Számított titer hiányában az érintett kontrolleredmény és a futtatás érvénytelen.

TARG_RANGE

Legalább egy target OD érték a megadott tartomány alatt, és legalább egy afölött van, de a megadott tartományon belül egy sincs. Ha ez a jelző jelenik meg alacsony vagy magas pozitív kontroll esetén, a COBAS® AMPLICOR® Analizátor nem számít titert. Számított titer hiányában az érintett kontrolleredmény és a futtatás érvénytelen.

•

Az adatok áttekintése

Ha a futtatás érvénytelen (invalid), ismételje meg a teljes vizsgálatot (minta- és kontroll-előkészítés, reverz transzkripció, amplifikálás és kimutatás).

A COBAS® AMPLICOR® Analizátor az A660 eredményeket, valamint a minták és kontrollok számított kópiaszám-értékeit tartalmazó eredménylapot nyomtat. A target és QS amplikon hígítási sorok A660 értékeinek a növekvő hígítási faktorral csökkenő A660 értékek tendenciáját kell követni, kivéve azokat a hígításokat, ahol az A660 értékek meghaladják a vizsgálat lineáris tartományát (magas titerű minták), illetve azokat a hígításokat, ahol az A660 értékek megközelítik a hátteret (alacsony titerű minták). HIV-1 amplikon hígítások Az #1, #2, #3 és #4 HIV-1 hígítások a HIV-1 amplikon hígítási sort reprezentálják, rendre: tiszta, 1:9, 1:81 és 1:729. Az abszorbanciaértékek a hígítási sorral csökkennek úgy, hogy a legmagasabb minta és kontroll A660 értéke tartozik az első hígításhoz (#1) és a legalacsonyabb A660 érték az utolsóhoz (#4). Ha a HIV-1 A660 értékek nem sorrendben következnek, akkor az adott mintára vagy kontrollra az OD_SEQUENCE hibaüzenet jelenik meg. HIV-1 QS amplikon hígítások Az #1 és #2 HIV-1 QS hígítások a HIV-1 QS amplikon hígítási sort reprezentálják, rendre: tiszta és 1:9. Ha a #2 hígítás A660 értéke nagyobb, mint az #1 hígítás A660 értéke, akkor hiba történt, és a QS_SEQUENCE üzenet jelenik meg. Az ilyen minta vagy kontroll eredménye érvénytelen. Az adott mintára vagy kontrollra vonatkozó teljes eljárást (beleértve a mintaelőkészítést, amplifikálást és kimutatást) meg kell ismételni.

26/52



HIV-1 MONITOR

A nem sorrendbe eső A660 értékű eredmények értékelése •

•

A HIV-1 amplikon hígítások A660 értékeinek a növekvő hígítási faktorral csökkenő A660 értékek tendenciáját kell követni, kivéve azokat a hígításokat, amelyek telítettek, illetve azokat, ahol az A660 értékek megközelítik a hátteret. Olyan reakciókban, ahol a HIV-1 RNS kópia/ml magas, az #1, #2 és #3 Hígítások telítettek lehetnek, ezáltal alacsonyabb A660 értékeket eredményezhetnek (lásd 1. példa az 1. táblázatban). Ezek az eredmények érvényesek annak ellenére, hogy a HIV-1 hígítások nem mutatnak csökkenő A660 értékeket #1–#4 között.

•

Olyan reakciókban, ahol a HIV-1 RNS kópia/ml alacsony, a #2, #3 és #4 Hígítások háttér A660 értékeket adhatnak (lásd 2. példa az 1. táblázatban). Ezek az eredmények érvényesek annak ellenére, hogy a HIV-1 hígítások nem mutatnak csökkenő A660 értékeket #1–#4 között.

•

Valamennyi hígítás 0,15 és 2,0 közé eső A660 értékeinek #1 hígítástól #4 hígításig csökkenő A660 értékek tendenciáját kell követni. Ha a 0,15 és 2,0 közé eső A660 értékek nem követik az #1 hígítástól #4 hígításig csökkenő A660 értékek tendenciáját, akkor hiba történt (lásd 3., 4. és 5. példa az 1. táblázatban). Az ilyen minta vagy kontroll eredménye érvénytelen. Az adott mintára vonatkozó teljes eljárást (beleértve a minta-előkészítést, amplifikálást és kimutatást) meg kell ismételni.

1. táblázat Példák a nem sorrendbe eső A660 eredményekre

*

1. példa

Target A660 QS A660 (Hígítási faktor) (Hígítási faktor) 1:1 1:9 1:81 1:729 1:1 1:9 2,578 3,603 3,201 *0,700 2,618 *0,397

2. példa

*0,216

0,004

0,016

0,007

3,236

*0,743

3. példa

0,002

0,007

0,004

0,339

4,218

*0,883

ÉRVÉNYTELEN: OD_SEQUENCE üzenet jelenik meg.

4. példa

3,052

1,597

3,384

2,887

1,357

*0,158


5. példa

0,016

0,267

0,007

0,004

3,612

*0,793


Az eredmények értékelése ÉRVÉNYES: Magas titerű minta A660 a lineáris abszorbanciatartomány felett. ÉRVÉNYES: Alacsony titerű minta A660 a kimutatási határon vagy annak közelében.

A COBAS® AMPLICOR® Analizátor által eredményszámításra kiválasztott A660 értéket jelöli, ahogy az eredménylapon szerepel. A nem sorrendbe eső A660 értéket adó minták eredményei nincsenek kiválasztva.

Az eredmények értékelése

Érvényes futtatás esetén ellenőrizze, hogy az egyes minták nem kaptak-e jelzőt vagy megjegyzést az eredménylapon. Értékelje az eredményeket az alábbiak szerint:

Megjegyzés

A COBAS® AMPLICOR® Analizátor úgy van programozva, hogy megjelölje a leggyakoribb hibákat és ellentmondásos eredményeket. Ennek ellenére azt javasoljuk, hogy az eredmények maximális integritásának biztosítására a rutin laboratóriumi adatértékelés részeként nézze át az A660 leolvasásokat. • •

•


Azon minták eredményeit, amelyek nem kaptak jelzőt vagy megjegyzést, adja ki úgy, ahogy azok az eredménylapon szerepelnek. Egy érvényes futtatás mind érvényes, mind érvénytelen mintaeredményeket is tartalmazhat, attól függően, hogy a jelzők és/vagy megjegyzések az egyes mintákra vonatkoznak-e. A jelzőkkel és/vagy megjegyzésekkel ellátott minták az alábbiak szerint értékelendők:


27/52

28/52

Jelző

Eredmény

Értékelés

_Q_

QS_INVALID

Nincs QS hígítás, amelynek A660 értéke a vizsgálat lineáris abszorbanciatartománya alá esne. Az ilyen minta eredménye érvénytelen. Az érvénytelen eredményű mintákat újra kell tesztelni a minta és kontroll előkészítése, reverz transzkripció, amplifikálás és kimutatás megismétlésével.

TARGETOD_LO

A660 értékek valamennyi HIV-1 hígítás esetén a vizsgálat lineáris abszorbanciatartománya alá esnek. Adja ki az eredményt, mint „HIV-1 RNS nem kimutatható (kevesebb mint 400 HIV-1 RNS kópia/ml)” vagy mint „HIV-1 RNS nem kimutatható (kevesebb, mint 50 kópia/ml)”, attól függően, hogy a standard vagy az ultraszenzitív minta-előkészítési eljárást alkalmazta.

TARGETOD_HI

A660 értékek valamennyi HIV-1 hígítás esetén a vizsgálat lineáris abszorbanciatartománya fölé esnek. Adja ki az eredményt, mint „Nem meghatározott”. Ha a standard minta-előkészítési eljárást alkalmazta, készítsen egy hígítást az eredeti mintából HIV-negatív humán plazmával és ismételje meg a vizsgálatot a standard minta-előkészítési eljárást alkalmazva. Szorozza meg a mért eredményt a hígítási faktorral. Ha az ultraszenzitív minta-előkészítési eljárást alkalmazta, tesztelje újra az eredeti plazmamintát a standard mintaelőkészítési eljárást alkalmazva.

RESULT_LO

A számított kópia/ml a vizsgálat lineáris tartománya alatt van. A standard minta-előkészítési eljárás esetén adja ki az eredményt, mint „HIV-1 RNS kimutatható, kevesebb, mint 400 HIV-1 RNS kópia/ml”. Amennyiben mennyiségi eredményre van szükség, az eredeti plazmamintát tesztelje újra az ultraszenzitív minta-előkészítési eljárást alkalmazva. Az ultraszenzitív mintaelőkészítési eljárás esetén adja ki az eredményt, mint „HIV-1 RNS kimutatható, kevesebb, mint 50 HIV-1 RNS kópia/ml”.

RESULT_HI

A számított kópia/ml a vizsgálat lineáris tartománya felett van. A standard minta-előkészítési eljárás esetén adja ki az eredményt, mint „több, mint 7,5 x 105 HIV-1 RNS kópia/ml.” Amennyiben mennyiségi eredményre van szükség, az eredeti mintát hígítsa fel HIV-1- negatív humán plazmával, és a vizsgálat megismételhető. A kiadott eredményeket szorozza meg a hígítási faktorral. Az ultraszenzitív minta-előkészítési eljárás esetén adja ki az eredményeket, mint „nagyobb, mint 1,0 x 105 HIV-1 RNS kópia/ml)”. Amennyiben mennyiségi eredményre van szükség, az eredeti mintát tesztelje újra a standard mintaelőkészítési eljárást alkalmazva.

TARG_RANGE

Valamennyi target A660 érték a vizsgálat lineáris tartományán kívül esik. Adja ki az eredményt, mint „Nem meghatározott.” Tesztelje újra az eredeti mintát, megismételve a minta-előkészítést, reverz transzkripciót, amplifikálást és kimutatást.

OD_SEQUENCE

Egy nem sorrendbe eső target A660 értéket jelöl. Nem lesz számított eredmény. Az adott mintára vonatkozó teljes eljárást (beleértve a minta és kontroll előkészítését, amplifikációt és kimutatást is) meg kell ismételni.

QS_SEQUENCE

Egy nem sorrendbe eső target QS A660 értéket jelöl. Nem lesz számított eredmény. Az adott mintára vonatkozó teljes eljárást (beleértve a minta és kontroll előkészítését, amplifikációt és kimutatást is) meg kell ismételni.



HIV-1 MONITOR

Minőség-ellenőrzés Valamennyi futtatásnak legalább egy AMPLICOR® HIV-1 MONITOR (–) kontrollt, egy AMPLICOR® HIV-1 MONITOR alacsony (+) kontrollt és egy AMPLICOR® HIV-1 MONITOR magas (+) kontrollt kell tartalmaznia. Mint minden új laboratóriumi eljárás esetében, a vizsgálatot végző használjon további kontrollokat minden alkalommal, amíg az eljárás kivitelezését nagyfokú megbízhatósággal nem képes elvégezni. Nincsenek követelmények a kontrolloknak az A-gyűrű(k)ben való elhelyezését illetően. Ellenőrizze a kinyomtatott eredménylapon a jelzőket és megjegyzéseket, hogy meggyőződjön arról, hogy a futtatás érvényes. Negatív kontroll

A HIV-1 (–) kontrollnak „HIV-1 RNS Not Detected” eredményt kell adnia, azaz valamennyi HIV-1 A660 érték ≤ 0,099. Ha a HIV-1 (–) kontroll nem felel meg ennek a feltételnek, a teljes futtatás érvénytelen. A teljes eljárást (minta és kontroll előkészítése, reverz transzkripció, amplifikálás és kimutatás) meg kell ismételni. Ha a HIV-1 (–) kontroll abszorbanciája rendszeresen nagyobb, mint 0,099, kérjen technikai segítséget a helyi Roche-irodától.

Pozitív kontrollok

Az AMPLICOR® HIV-1 MONITOR alacsony (+) és magas (+) kontrollokhoz tartozó kijelölt tartomány specifikus minden egyes tételre, az alkalmazott minta-előkészítési eljáráson (standard vagy ultraszenzitív) alapul és a készlettel adott COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 adatkártyán van feltüntetve. Ezek a tartományok a COBAS® AMPLICOR® Analizátorba billentyűzet, vonalkód-leolvasó vagy az AMPLILINK szoftver segítségével vihetők be az A-gyűrű munkalista beállítás során. Mind a HIV-1 MONITOR alacsony (+) kontroll, mind a HIV-1 MONITOR magas (+) kontroll HIV-1 RNS kópiaszám/ml értéknek a COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 adatkártyán jelzett tartományba kell esnie. Ha egyik vagy mindkettő HIV-1 MONITOR (+) kontroll nem felel meg ennek a feltételnek, a teljes futtatás érvénytelen. A teljes eljárást (minta és kontroll előkészítése, reverz transzkripció, amplifikálás és kimutatás) meg kell ismételni. Ha egyik vagy mindkettő HIV-1 MONITOR (+) kontroll HIV-1 RNS kópiaszám/ml száma rendszeresen kívül esik a kijelölt tartományon, kérjen technikai segítséget a helyi Roche-irodától.

Eljárással kapcsolatos óvintézkedések A laboratóriumi munkafolyamatnak egyirányú módon kell zajlania, kezdve a preamplifikálási területtől a posztamplifikálási (amplifikálási/kimutatási) területig haladva. A preamplifikálási műveleteket a reagens-előkészítéssel kell kezdeni, és a minta-előkészítéssel folytatni. Valamennyi preamplifikálási művelethez tartozó felszerelést és eszközt jelölni kell, és tilos használni más művelethez vagy más munkaterületre átvinni. Valamennyi munkaterületen kesztyűt kell viselni, és a terület elhagyása előtt le kell venni. A reagens-előkészítéshez használt felszerelést és eszközöket tilos használni minta-előkészítési műveletekhez, amplifikált DNS vagy más target DNS-forrás pipettázásához vagy feldolgozásához. A posztamplifikálási műveletekhez tartozó felszerelést és eszközöket mindenkor a posztamplifikálási munkaterületen kell tartani.



29/52

Mint minden vizsgálati eljárásnál, a helyes laboratóriumi technika alapvető a vizsgálat megfelelő kivitelezéséhez. A vizsgálat magas érzékenysége miatt rendkívüli gondossággal kell ügyelni a reagensek, illetve az amplifikálási elegyek tisztaságának megőrzésére. Minden reagens tisztaságát szorosan figyelemmel kell kísérni. Dobjon ki bármilyen gyanús reagenst.

Eljárással kapcsolatos korlátozások A vizsgálatot csak ACD vagy EDTA alvadásgátlóval levett humán plazma használatára validálták. Más típusú minták vizsgálata álnegatív vagy álpozitív eredménnyel járhat. A heparin gátolja a PCR-t; az COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 használata tilos olyan minták esetén, amelyek levételekor alvadásgátlóként heparint használtak. A COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 vizsgálatot HIV-1 M csoportú A-H szubtípusokra optimalizálták. A COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 teljesítőképessége HIV-1 O csoport és HIV-2 esetén ismeretlen. Ez a vizsgálat nem használható HIV-2 vagy HIV-1 O csoportú fertőzött betegek klinikai gondozása során. A megbízható eredmény a megfelelő mintalevételen, transzporton, tároláson és feldolgozáson múlik. Az AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Master Mix, v1.5 reagensben jelen lévő AmpErase csökkenti az amplikonszennyezés kockázatát. Ugyanakkor a HIV-1 pozitív kontrollokból vagy klinikai mintákból származó szennyeződés csak helyes laboratóriumi gyakorlattal és ezen Módszertani kézikönyvben meghatározott eljárások gondos betartásával kerülhető el. A terméket csak a PCR-technikák terén képzett személy használhatja. Ez a termék kizárólag COBAS® AMPLICOR® Analizátorral használható együtt. A COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 csak a Basic módban futtatható.

Eljárással kapcsolatos irányelvek Az a döntés, hogy standard vagy ultraszenzitív minta-előkészítési eljárást alkalmaz-e, az adott laboratórium jellemző beteganyagától függ. Javasolt, hogy minden laboratórium értékelje a beteganyagának jellemzőit annak megállapítására, hogy melyik a legjobb laboratóriumi eljárás az indító vizsgálatra, és mikor kell az alternatív minta-előkészítési eljárást használni. Például, ha a beteganyagban nincsenek még soha nem kezelt betegek, vagy ha valamennyi betegről ismert, hogy antiretrovirális kezelést kap, akkor a laboratórium az ultraszenzitív minta-előkészítési eljárást választhatja, mint rutinmódszert, és a standard eljárást csak akkor használja, amikor a vírusmennyiségek nagyobbak mint 100 000 kópia/ml. Ha a beteganyagról nem ismert, hogy kap-e kezelést, illetve hogy mekkorák a kiindulási vírusmennyiség-eredmények, akkor a laboratórium a standard minta-előkészítési eljárást választhatja, mint rutineljárást, és az ultraszenzitív minta-előkészítési eljárást csak akkor, miután a standard minta-előkészítési eljárás 400 kópia/ml alatti vírusmennyiséget eredményezett.

30/52



HIV-1 MONITOR

Zavarást okozó anyagok A heparin gátolja a PCR-t. Ne használjon heparinba levett mintákat. A mintákban lévő lipidek, bilirubin és hemoglobin emelkedett szintjei nem zavarják a vizsgálat HIV-1 RNS mennyiségi meghatározását. Az alábbi gyógyszerkomponensekről ugyancsak kimutatták, hogy nem zavarják az AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 HIV-1 RNS mennyiségi meghatározását. HIV-proteáz inhibitorok • Indinavir • Ritonavir • Nelfinavir • Saquinavir

Non-nukleozid reverz transzkriptáz inhibitorok • HBY 097 • Nevirapin • Delavirdin

HIV nukleozid reverz transzkriptáz inhibitorok • Zidovudin • Didanosin • Zalcitabin • Stavudin • Lamivudin CMV-kezelésre szolgáló vegyületek • Ganciclovir • Ganciclovir-valinat

Nem klinikai értékelés A vizsgálat leírása

A COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 kimutatási határát, pontosságát és lineáris tartományát HIV-1 vírustenyészet ismert törzsoldatából HIV-1-negatív humán plazmával készült hígítási sor analízisével határozták meg. A vírus törzsoldatot biztosította: az AIDS Clinical Trials Group (ACTG) virológiai minőségbiztosítási [Virology Quality Assurance (VQA)] laboratóriuma, Division of AIDS, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA. A törzsoldat vírus RNS-koncentrációjának becslését a következők segítségével végezték: elektronmikroszkópos vizsgálat, p24 antigén koncentráció, AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test és elágazó láncú DNS analízis. Valamennyi módszer hasonló eredményeket adott36. A minták előkészítését és analízisét a COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 segítségével házon belül végezték. A hígítási sor panel analízisét tizenkét adott napon két tétel COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 segítségével mind a standard, mind pedig az ultraszenzitív minta-előkészítési eljárást alkalmazva végezték.

Kimutatási határ

A fent ismertetett vizsgálatok megmutatták, hogy a COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 ultraszenzitív minta-előkészítési eljárást alkalmazva képes kimutatni 50 RNS kópia/ml koncentrációjú virion-kapcsolt HIV-1 RNS-t plazmában több mint 95%-os pozitivitással, valamint standard minta-előkészítési eljárást alkalmazva 400 RNS kópia/ml koncentrációkat több mint 95%-os pozitivitással (2. táblázat), feltéve ha a kiválasztott D-cső OD értéke a megadott OD tartományon (0,15–2,00) belül esik.



31/52

2. táblázat A COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 kimutatási határa Standard minta-előkészítés

Ultraszenzitív minta-előkészítés

Névleges Névleges bevitel Ismétlések Pozitívok Pozitivitási bevitel Ismétlések Pozitívok Pozitivitási (HIV-1 RNS száma száma arány (HIV-1 RNS száma száma arány kópia/ml) kópia/ml)

Pontosság

850 000

36

36

100%

100 000

36

36

100%

750 000

36

36

100%

75 000

36

36

100%

650 000

36

36

100%

50 000

36

36

100%

500 000

36

36

100%

35 000

36

36

100%

350 000

36

36

100%

25 000

35

35

100%

100 000

36

36

100%

5000

35

35

100%

35 000

36

36

100%

1000

36

36

100%

7000

36

36

100%

400

32

32

100%

2000

36

36

100%

100

36

36

100%

600

36

36

100%

80

36

36

100%

500

48

46

96%

60

36

35

97%

400

36

36

100%

50

36

35

97%

250

36

29

81%

40

36

32

89%

175

36

27

75%

25

36

29

81%

Az egy adott futtatáson belüli és a teljes pontosságot az CLSI EP5-T2 irányelvben („Klinikai kémiai eszközök pontosságának értékelése”) definiált módszerekkel összhangban értékelték. Ez az eljárás lehetővé teszi mind az egy futtatáson belüli, mind a teljes pontosság meghatározását egyetlen többnapos, több vizsgáló részvételével zajló vizsgálat lefolytatása során. Minden minta 3 ismétlését tartalmazó futtatást végeztek 12 napon keresztül naponta. Minden egyes minta keresztülment a teljes COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 eljáráson (minta-előkészítés, reverz transzkripció, amplifikálás és kimutatás). Ezért az itt közölt pontosság a vizsgálati eljárás valamennyi aspektusát reprezentálja. Ezen pontossági vizsgálat eredményei a 3. és 4. táblázatban láthatóak.

3. táblázat A COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 pontossága standard minta-előkészítési eljárás esetén Minta

1. minta

2. minta

3. minta

4. minta

36

36

36

36

705

10 056

162 119

535 083

Szórás

341

3082

44 188

148 708

CV

48%

31%

27%

28%

Szórás

340

2916

53 556

190 702

CV

48%

29%

33%

36%

Ismétlések teljes száma

Átlagos HIV-1 RNS titer (kópia/ml) Egy futtatáson belül

Összesen

32/52



HIV-1 MONITOR

4. táblázat A COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 pontossága ultraszenzitív minta-előkészítési eljárás esetén Minta

1. minta

2. minta

3. minta

4. minta

Ismétlések teljes száma

36

36

35*

36

Átlagos HIV-1 RNS titer (kópia/ml)

84

1045

5578

39 825

44

331

823

12 451

52%

32%

15%

31%

39

382

1350

12 074

47%

37%

24%

30%

Egy futtatáson belül Szórás CV Összesen Szórás CV

* Egy érvénytelen QS eredmény született a 3. minta esetén, és ez nem lett figyelembe véve a pontosság számításánál. Lineáris tartomány

Ahogy az a 3. ábrán látszik, a COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 lineáris választ adott 50 (Log10 = 1,70) HIV-1 RNS kópia/ml és legalább 100 000 (Log10 = 5,00) HIV-1 RNS kópia/ml között az ultraszenzitív mintaelőkészítési eljárást alkalmazva, valamint 400 (Log10 = 2,60) HIV-1 RNS kópia/ml és legalább 750 000 (Log10 = 5,87) HIV-1 RNS kópia/ml között a standard minta-előkészítési eljárást alkalmazva. Ráadásul a standard és ultraszenzitív minta-előkészítési eljárás között a COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 közös lineáris tartományán belül (azaz 400 és 100 000 kópia/ml között) erős korrelációt találtak.

7,0 Standard minta-előkészítés y = -0,16731 + 1,06x R=0,99912 Ultraszenzitív minta-előkészítés y = -0,18823 + 1,0465x R=0,99946

6,0

5,0

4,0

3,0

10

COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 eredmények Log (HIV-1 RNS kópia/ml)

3. ábra A COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 Linearitása standard és ultraszenzitív minta-előkészítés esetén

2,0

1,0 Hibatartomány = 1 standard deviáció (szórás) N = 27-36 0,0 0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

Névleges koncentráció Log (HIV-1 RNS kópia/ml) 10



33/52

Inkluzivitás (Teljesítményjellemzők M csoportú szubtípusokon)

A világszerte gyűjtött HIV-1 izolátumok jelentős genetikai diverzitást mutatnak, és a nukleotidszekvencia alapján filogenetikai rokonságot mutató csoportokba sorolhatók38,39. Az M csoport (mint Major) tömöríti a HIV-1 izolátumok túlnyomó többségét; az O csoport (mint Outliers) egy kisebb számú izolátumot képvisel, többnyire Kamerunból és Gabonból. Az M csoport további legalább 9 szubtípusra (vagy clade-re) osztható (A-tól I-ig jelölve). A COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 teljesítményét 30 ismert A–G szubtípusú HIV-1 izolátumtenyészet analízise során értékelték (5. táblázat). Valamennyi izolátum in vitro tenyésztett volt. A vírus törzsoldatok koncentrációit elektronmikroszkópos partikulumszámlálással becsülték meg Layne és mtsai módszere szerint.40 Valamennyi vírus törzsoldatot negatív humán plazmával hígítottak megközelítőleg 12 500 és 1250 víruspartikulum/ml koncentrációra. Minden egyes vírus törzsoldat hígítást házon belül három ismétlésben vizsgáltak mind a standard, mind az ultraszenzitív minta-előkészítési eljárást alkalmazva. Tekintettel arra, hogy minden egyes víruspartikulum két vírus genomot tartalmaz, a várt HIV RNSkoncentrációk megközelítőleg 25 000 kópia/ml és 2500 kópia/ml voltak. A COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 ekvivalens eredményeket adott mind a 30 izolátumon; a kópiaszámok valamennyi vizsgált szubtípus esetén jó egyezésben voltak egymással és a várt víruspartikulum-számokkal (4. ábra). A 25 000 kópia/ml minták esetén a standard minta-előkészítési eljárást alkalmazva az átlageredmény 43 906 kópia/ml volt 4,5-szeres szórási tartomány mellett (18 567–82 917 kópia/ml), az ultraszenzitív minta-előkészítési eljárást alkalmazva az átlageredmény 29 019 kópia/ml volt 6,3-szeres szórási tartomány mellett (12 233–77 250 kópia/ml). A 2500 kópia/ml minták esetén a standard minta-előkészítési eljárást alkalmazva az átlageredmény 4045 kópia/ml volt 6,4-szeres szórási tartomány mellett (1379–8807 kópia/ml), az ultraszenzitív minta-előkészítési eljárást alkalmazva az átlageredmény 3710 kópia/ml volt 5,7-szeres szórási tartomány mellett (1390–7977 kópia/ml). Ezek az eredmények erős korrelációt mutatnak a standard és ultraszenzitív minta-előkészítési eljárások között. O csoportú izolátumokat nem vizsgáltak. A COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 teljesítménye O csoportú izolátumokon ismeretlen.

34/52



HIV-1 MONITOR

5. táblázat COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 Szubtípus inkluzivitás vizsgálat – vizsgált HIV-1 izolátumok


Izolátum

Származási ország

UG273 DJ258 DJ263 US1 US2 US3 US4 CM237 BK132 BZ167 ZAM18 UG268 ETH2220 SE364 SM145 SE365 UG270 UG274 CM235 CM238 CM240 CM243 POC30506 ID12 ID17 NP1465 BZ126 BZ162 BZ163 HH8793

Uganda Dzsibuti Dzsibuti USA USA USA USA Thaiföld Thaiföld Brazilia Zambia Uganda Etiópia Szenegál Szomália Szenegál Uganda Uganda Thaiföld Thaiföld Thaiföld Thaiföld Thaiföld Indonézia Indonézia Thaiföld Brazília Brazília Brazília Kenya

Altípus

Hivatkozás

Génbank azonosítószám

A A A B B B B B B B C C C C C D D D E E E E E E E E F F F G

43 41, 43 43, 47 44 44 44 44 44 45 41, 42 43, 46, 50 41, 43, 46 46, 52 43 41, 43 41, 43 41 41, 43, 46 45 41, 44 41, 44, 48 45 46, 49 46, 51 46, 51 46 42 41, 42 42 46, 47

L22957 L11763, L22939 AF063223, L22941 L14573 L14574 L14575 L14576 L14570 L03696, L03697 L11752, L22087 L03705, L22945 L11799, L22948 U46016 L22944 L11803, L22946 L11797, L22945 L11800 L11801, L22950 L03698 L11760, L14571 U54771, L11761, L14572 L03702, L03703 U48272 U68193 U68191 nincs a Génbankban L22083, L22082 L11751, L22084 L22086, L22085 AF061640


35/52

BZ163 / F

HH8793 / G

BZ162 / F

BZ126 / F

ID17 / E

NP1465 / E

ID12 / E

CM243 / E

POC30506 / E

CM240 / E

CM238 / E

UG274 / D

CM235 / E

SE365 / D

UG270 / D

SE364 / C

1

SM145 / C

10

UG268 / C

2

ETH2220 / C

10

BZ167 / B

3

ZAM18 / C

10

BK132 / B

4

US4 / B

10

CM237 / B

5

US3 / B

10

US2 / B

6

US1 / B

10

Ultraszenzitív - 2500 k/ml Ultraszenzitív - 25 000 k/ml Standard - 2500 k/ml Standard - 25 000 k/ml

DJ263 / A

7

DJ258 / A

10

UG273 / A

COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 eredmények (HIV-1 RNS kópias/ml)

4. ábra A COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 Teljesítménye HIV-1 A–G szubtípusokon

Izolátum és szubtípus

Klinikai specificitás

A COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 klinikai specificitását anti-HIV-1-negatív véradók analízise során határozták meg. Összesen 507, EDTA (267) vagy ACD (240) alvadásgátolt mintát vizsgáltak a standard minta-előkészítési eljárással; 504, EDTA (307) vagy ACD (197) alvadásgátolt mintát vizsgáltak az ultraszenzitív minta-előkészítési eljárással. Ebben a vizsgálatban három tétel COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 került felhasználásra. Valamennyi minta HIV-1 RNSnegatív volt a standard eljárást alkalmazva, és 503 minta volt negatív az ultraszenzitív eljárást alkalmazva. Az ultraszenzitív minta-előkészítési eljárással HIV-1 RNS-pozitív egyetlen minta HIV A660 értéke 0,156 volt a tiszta D-cső hígításban (6.táblázat). Amikor ezt a mintát két párhuzamos ismétlésben újratesztelték ultraszenzitív eljárást alkalmazva, mindkét ismétlés negatív eredményt adott (HIV A660 a tiszta D-csőben = 0,002 és 0,002). A HIV-1-fertőzés zérus prevalenciáját feltételezve a szeronegatív véradók között, a COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 klinikai specificitása a standard mintafeldolgozással 100%, az ultraszenzitív mintafeldolgozással 99,8%.

6. táblázat A COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 klinikai specificitása Anti-HIV-1-negatív véradók MintaHIV-1 RNS HIV-1 A660 előkészítési N kópia/ml (tiszta D-cső hígításban) eljárás Nem kimutatható Pozitív

Standard Ultraszenzitív

36/52

507 504

507 503

0 1

Minimum

Átlag

Maximum

SD

0,000 0,000

0,004 0,005

0,082 0,156

0,006 0,010



HIV-1 MONITOR

Analitikai specificitás

A COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 analitikai specificitását a 7. táblázatban felsorolt organizmusok és vírusok sejt-, illetve víruskultúráinak vagy tisztított nukleinsavának HIV-negatív humán plazmához való hozzáadásával tesztelték (A „Használati utasítás” A.6. lépését követően). Minden egyes mintát a COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 segítségével standard mintafeldolgozást alkalmazva analizáltak. A vizsgált nem-HIV organizmusok, vírusok vagy tisztított nukleinsavak egyike sem adott pozitív HIV-1 RNS-eredményt. A négy vizsgált HIV-2 izolátum közül kettő (7824A és 60415K) pozitív eredményt adott; azonban nem támasztható specifikus követelmény ezen teszt HIV-2 izolátumot amplifikáló képessége irányában.

7. táblázat Analitikai specificitás minták Adenovírus 2-es típus Adenovírus 3-as típus Adenovírus 7-es típus Cytomegalovírus AD-169 Cytomegalovírus Davis Cytomegalovírus Towne Epstein Barr vírus P-3 (Burkitt lymphoma sejtek) Epstein-Barr vírus HR1 (Burkitt lymphoma sejtek) Epstein-Barr vírus (RAJI Burkitt lymphoma sejtek) Varicella-Zoster Ellen Varicella Oka Hepatitis B vírus Hepatitis C vírus 1a genotípus Hepatitis C vírus 1b genotípus Hepatitis C vírus 2b genotípus Hepatitis C vírus 3a genotípus Hepatitis C vírus 4c genotípus HIV-2 BEN HIV-2 A/B szubtípus (7312A izolátum) HIV-2 A/B szubtípus (7824A izolátum)

Teljesítőképesség összehasonlítása az AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 vizsgálattal


HIV-2 A/B szubtípus (60415K izolátum)

Humán herpes vírus 6 Humán herpes vírus 7 Herpes simplex 1, F Herpes simplex 1, HF Herpes simplex 1, MacIntyre Herpes simplex 2, G Herpes simplex 2, MS Humán papilloma vírus 6B Humán papilloma vírus 11 Humán papilloma vírus 16 Humán papilloma vírus 18 HTLV-1 MT-2 sejtek HTLV-1 MoT sejtek Mycobacterium avium Pneumocystis carinii Propionibacterium acnes Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis

A COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 és az AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 teljesítőképességének összehasonlítását HIV-1fertőzött alanyokból származó plazmaminták analízisével végezték. A mintákat a Bioclinical Partners, Inc. (Franklin, MA) biztosította. Ezeknek a mintáknak nem volt korábbi AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test eredményük, és B szubtípusúnak voltak tekintve. Összesen 289 mintát hasonlítottak össze a standard minta-előkészítési eljárást alkalmazva, és 332 mintát hasonlítottak össze az ultraszenzitív minta-előkészítési eljárást alkalmazva. Azon minták között, amelyek esetén mennyiségi eredmények születtek mind a COBAS® AMPLICOR®, mind pedig az AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test vizsgálatokkal egyaránt (225 minta a standard mintaelőkészítési eljárással és 259 minta az ultraszenzitív minta-előkészítési eljárással), korrelációt határoztak meg. Azon mintákon, amelyek az 5. ábrán mutatott standard minta-előkészítési eljárás lineáris tartományába (400–750 000 kópia/ml), valamint amelyek a 6. ábrán mutatott ultraszenzitív minta-előkészítési eljárás lineáris tartományába (50–100 000 kópia/ml) eső COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, version 1.5

37/52

eredményeket adtak, lineáris regressziós analízist végeztek. A COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 és az AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 során kapott eredmények igen nagy fokban korreláltak mindkét minta-előkészítési eljárás esetén.

5. ábra Korreláció a COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 és az AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 vizsgálatok között HIV-1-fertőzött betegekből származó plazmamintákon standard minta-előkészítési eljárással COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 Log HIV-1 RNS kópia/ml

7,0 y = 0,33206 + 0,95588x R=0,93668 6,0

5,0

10

4,0

3,0

2,0

1,0 1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 Log HIV-1 RNS kópia/ml 10

6. ábra Korreláció a COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 és az AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 vizsgálatok között HIV-1-fertőzött betegekből származó plazmamintákon ultraszenzitív minta-előkészítési eljárással 7,0

6,0

5,0

4,0

3,0

10

COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 Log de HIV-1 RNS kópia/ml

y = 0,27412 + 0,93427x R=0,91887

2,0

1,0

0,0 0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 Log HIV-1 RNS kópia/ml 10

38/52



HIV-1 MONITOR

Klinikai alkalmazás Az alább ismertetett vizsgálatokban a vírusmennyiség-analízist az AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test segítségével végezték. A vizsgálatokat az Egyesült Államokban végezték, és a vizsgálatba beválasztott valamennyi beteg HIV-1 B szubtípussal fertőzöttnek volt tekintve. A COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 klinikai teljesítménye meghatározható ezen vizsgálatok alapján, miután az AMPLICOR® HIV-1 MONITOR és a COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5 vizsgálatokról kimutatták, hogy ekvivalens teljesítményűek (kivéve a HIV-1 non-B szubtípusain), és B szubtípusú mintákon ekvivalens eredményeket adnak (az adatok fájlon). Betegprognózis

Az AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test vizsgálatnak HIV-fertőzött egyének betegség-progresszió kockázatának jóslására való használatát az ACTG 116A és 116B/117 vizsgálatokban értékelték. A HIV-1 RNS-szint alapján a betegség progressziójának gyakoriságát értékelendő, ezen vizsgálatok adatait Cox-féle arányos veszélymodell segítségével analizálták. Az ACTG 116A vizsgálat egy kettős-vak vizsgálat volt, amely a zidovudin (ZDV) két különböző dózisú 2',3'-didezoxiinozinnal (ddI) való kombinációjának hatékonyságát hasonlította össze előrehaladott HIV-betegségben szenvedő betegekben, akik legfeljebb 16 hétig kaptak megelőzően zidovudin kezelést. Az ACTG 116B/117 vizsgálat egy hatékonysági vizsgálat volt, amely olyan HIV-fertőzött betegek 2',3'-didezoxiinozin (ddI) és zidovudin kezelését hasonlította össze, akik több, mint 16 hétig voltak megelőzően zidovudinon. Mindkét vizsgálat betegei között a vizsgálat kezdetekor AIDS diagnózisú betegek, ARC diagnózisú betegek, valamint tünetmentes betegek voltak. A betegség-progresszió definíció szerint AIDS-hez, új AIDS definiáló eseményhez, illetve halálhoz vezető progresszió volt. Az ACTG 116A HIV-1 RNS alvizsgálatba a klinikai vizsgálat olyan 186 betege került, akiknek a vizsgálatba való belépésekor plazma és perifériás vér mononukleáris sejtmintái lettek levéve, és akiknek a mintái megfelelően lettek tárolva, és vizsgálatra hozzáférhetőek voltak. Az ACTG 116B/117 HIV-1 RNS alvizsgálatba a gyógyszervizsgálat olyan 99 véletlenszerűen kiválasztott betege került, akiknek a vizsgálatba való belépéskor plazmamintái lettek levéve, és akiknek a mintái megfelelően lettek tárolva, és vizsgálatra hozzáférhetőek voltak. Cox-féle arányos veszélymodell segítségével értékelték a nem illesztett és illesztett relatív veszélyt a betegség-progresszióra (mint kiindulási HIV-1 RNS-szintet mérve), a HIV-1 RNS-szint változását 8 hét alatt és a CD4+ sejtszámot. A nem illesztett relatív veszély a változó által önmagában jelentett kockázatot, míg az illesztett relatív veszély az adott változó által a modellben szereplő egyéb változókkal való összevetést követően jelentett kockázatot reprezentálja. Ezek a modellek a modellbe bevitt változókkal kapcsolatos betegség-progressziónak az emelt kockázatát (ha van egyáltalán) eredményezik. Az analíziseket úgy végezték, hogy ötszörös különbségű relatív veszélyt tételeztek fel a vizsgálati változóban. Ezen analízisek eredményeit a 8.–11. táblázat mutatja be. Ezek az adatok megmutatják, hogy előrehaladott HIV-betegségben szenvedő és specifikus anti-reverz transzkriptáz kezelésben részesülő betegekben ötször magasabb kiindulási HIV-1 RNS-szintek kapcsolatban vannak a betegségprogresszió emelkedett kockázatával. Azon betegek esetén, akik előzőleg több mint 16 hetes ZDV-kezelést kaptak (az ACTG 116B/117 betegei), az ötször nagyobb kiindulási HIV-1 RNS-szintek nem voltak statisztikailag szignifikánsan prognosztikus értékűek. Azon betegek esetén, akik előzőleg nem részesültek ZDV-kezelésben, illetve 16 hetes vagy annál rövidebb ZDVkezelést kaptak, az ötszörös változásnak a kiindulási és a 8. heti RNS-



39/52

szintek között statisztikailag szignifikánsan prognosztikus értéke van. Azon betegek esetén, akik előzőleg több mint 16 hetes ZDV-kezelést kaptak, az ötszörös változás a kiindulási és a 8. heti RNS-szintek között nem bizonyult szignifikánsan prognosztikus értékűnek. A betegség-progresszió gyakoriságát szintén analizálta mindegyik vizsgálat úgy, hogy a beteganyagot kiindulási HIV-1 RNS-sorrend szerint decilisekbe (a beteglétszám tizede) osztotta. A deciliseket a betegség-progresszió gyakoriságát illetően értékelték. Mindegyik vizsgálatban a betegségprogresszió 60%-os gyakoriságát találták minden olyan beteg esetén, akinek a kiindulási HIV-1 RNS-szintjei 250 000 kópia/ml felett voltak. A 116A vizsgálatban a betegség-progresszió mintegy 35%-os gyakoriságát találták az első négy decilis betegei esetén (< 11 912, < 34 661, < 72 438 és < 103 806 HIV-1 RNS kópia/ml). A betegség-progresszió gyakorisága 40% és 50% közé esett a következő három decilisben (< 15 695, < 194 312 és < 247 229). Az utolsó három decilisben, ahol a HIV-1 RNS-szintek > 250 000 HIV-1 RNS kópia/ml, a betegség-progresszió gyakorisága nagyobb volt mint 60%. A 116B/117 vizsgálatban a betegség-progresszió gyakoriságát változékonyabbnak találták, de még mindig mutatkozott az emelkedett HIV-1 RNS-szintekkel együtt járó magasabb progressziós arány általános trendje. Ebben a vizsgálatban átlagosan 30%-os betegség-progressziós arányt (tartomány = 10%–60%) találtak az első hat decilisben (< 11 571, < 31 292, < 49 743, < 62 132, < 97 781 és < 150 866). A betegség-progressziós arány 50%-ra, illetve 60%-ra emelkedett a következő két decilisben (rendre < 251 627 és < 403 146). A betegség-progressziós arány több mint 80% volt az utolsó két decilis esetén (< 794 027 és < 1 456 302), ahol a HIV-1 RNSszintek nagyobbak voltak, mint 403 000. Ezen analízisek összefoglaló táblázatait és oszlopdiagramjait a 7. és 8. ábra mutatja be. Antiretrovirális kezelésre adott válasz mérése Az AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test vizsgálatnak antiretrovirális kezelés hatásainak mérésére való használatát a következő antiretrovirális vegyületekkel folytatott klinikai vizsgálatban értékelték: a reverz transzkriptáz inhibitor zalcitabin (ddC, márkanév HIVID), a proteáz inhibitor saquinavir (SAQ, márkanév INVIRASE), valamint ezen két gyógyszer kombinációja. A vizsgálat (NV14256) egy kettős-vak, fázis III randomizált vizsgálat volt, amelynek elsődleges célkitűzése a három kezelés (ddC, SAQ és SAQ ddC-vel kombinálva) biztonságosságának, tolerálhatóságának és hatékonyságának klinikai végpontokon alapuló értékelése volt olyan betegekben, akik abbahagyták (vagy nem tudták szedni) a zidovudin (ZDV) kezelést, valamint a túlélés összehasonlítása a három kezelési csoportban (az AIDS definiáló eseményt (ADE) követő halált, illetve a dózis-korlátozó toxicitást is beleértve). Az NV14256 vizsgálatba a korábbi ZDV-kezelés beválasztó kritérium volt, a betegek többsége egy évet meghaladó korábbi ZDV-kezelést kapott. Az NV14256 vizsgálatba összesen 970 beteg került be negyvenkilenc klinikai helyszínen. A vizsgálat a következő három kezelési karból (betegcsoportból) állt: ddC (325), Saquinavir (327) és Saquinavir + ddC (318). Az NV14256 vizsgálat betegeinek demográfiai és kiindulási betegség jellemzői változatos beteganyagot reprezentáltak előrehaladott HIV-1-fertőzéssel és korábbi antiretrovirális kezelési rezsimek széles skálájával. Az AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test vizsgálatnak a gyógyszeres kezelés hatásainak az időben történő mérésére való felhasználását a HIV-1 RNSszint kiindulásitól számított közepes változásának, valamint a DAVGt-nek [időben átlagolt differencia (difference averaged over time) – a kiindulásitól számított közepes változás t héten át] az analízisével értékelték. Az

40/52



HIV-1 MONITOR

AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test vizsgálatnak a HIV-1 RNS-szintek változásait kimutató képességének értékelésére a kiindulásitól számított közepes változást analizálták az időben a vizsgálat mindegyik kezelési karja esetén. A 9. ábra a kiindulásitól számított közepes változást mutatja egy 48 hetes időtartamon keresztül az NV14256 vizsgálat mindegyik kezelési karja esetén. Az AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test által meghatározott HIV-1 RNS-szintek mérhető és hosszútávú csökkenését figyelték meg. A HIV-1 RNS-szintek legnagyobb és leghosszabb távú közepes változását valamennyi időpontban a kombinált kezelési karban (SAQ+ddC) látták. Az antiretrovirális kezelésre adott virológiai válasz felmérésére végzett HIV-1 RNS-sorozat mérések hasznát a Cox-féle arányos veszélymodell segítségével ugyancsak vizsgálták. Ebben az analízisben a három kezelési csoportot kombinálták, és egy kezelési csoport szerint rendezett Coxmodellt illesztettek a következő kovariánsokat, mint lineáris tagokat használva: log10(kiindulási HIV-1 RNS), log10(utolsó HIV-1 RNS), kiindulási CD4 és utolsó CD4. A veszélyarányt ebben a modellben mint a HIV-1 RNS tízszeres növekedését, illetve a CD4-szám 100-zal való csökkenését definiálták. Ahogy a 12. táblázat mutatja, e modell esetén a log10(utolsó HIV-1 RNS) tag együtthatója statisztikailag szignifikáns és pozitív a 40. hétig. Ennek megfelelően a HIV-1 RNS veszélyarányok a 40. hétig azt jelzik, hogy a HIV-1 RNS-szinteknek valamennyi időpontban statisztikailag szignifikáns és folyamatos prognosztikus értékük van. Az adatok egy kapcsolt analízisében a HIV-1 RNS-szintek és a túlélési idő közti összefüggést mérték fel. Ezen analízis esetén a túlélési időt, mint a beteg által AIDS definiáló esemény (ADE), illetve halál bekövetkeztéig a vizsgálatban eltöltött időt definiálták. Az analíziseket Kaplan-Meier túlélési görbék készítésével végezték mindegyik kezelési kar esetén úgy, hogy a kezelési kar beteganyagát a HIV-1 RNS-szintek alapján elharmadolták, nevezetesen alsó, középső és felső harmadokra. A túlélési görbéket százalékos ADE túlélés függvényként ábrázolták mindegyik betegcsoport esetén (alsó, középső, felső) a 8. hetet követő heteknek megfelelően. A Kaplan-Meier becsült túlélési analízisek megmutatják, hogy az alacsony HIV-1 RNS-szintekkel rendelkező betegek (alsó harmad) sokkal valószínűbben élnek ADE nélkül hosszabb ideig, mint a magas HIV-1 RNSszintekkel rendelkező betegek. A Kaplan-Meier túlélési görbéket az egyes vizsgálati kezelési karok esetén a 10., 11. és 12. ábrák mutatják. Az NV14256 vizsgálat adatainak egy külön analízise során a betegek ADE vagy halál kockázatát mérték fel különböző vizsgálati hetekben, mint az utolsó (legutóbbi) HIV-1 RNS-szint függvényét. Nevezetesen az utolsó HIV-1 RNS-mérés befolyását mérték fel az első ADE, illetve a halál kialakulásának a veszélyére (a vizsgálatban később látható klinikai események alapján). Az analízist Cox-modell túlélési analízis segítségével végezték, a következő kovariánsokat használva: log10(kiindulási HIV-1 RNS), log10 (utolsó HIV-1 RNS), kiindulási CD4 és utolsó CD4. A model az ADE veszély (arány) logaritmusát megjósló kovariánsok egy lineáris függvénye volt. A lineáris függvényt azután a kockázati index meghatározására használták a vizsgálat valamennyi betege esetén. Azokat a betegeket, akik ADE nélkül éltek túl a vizsgálat 4. hetéig, a kockázati indexük alapján rendezték úgy, hogy a betegek első 25%-a képezte az „alacsony kockázatú” csoportot, és a maradék beteg egyenlően lett elosztva hat különálló csoportba a kockázati indexüknek megfelelően. A hat csoport mindegyikét azután egy túlélési modellt használva összehasonlították az alacsony kockázatú csoporttal, és mindegyik csoport átlagos HIV-1 RNS-szintjét megfelelő exponenciális modell segítségével számolt ADE veszélyarány ellenében ábrázolták A 13. és 14. ábrák az első ADE-ig eltelt időhöz tartozó veszélyarányokat mutatják



41/52

a log10(utolsó HIV-1 RNS) függvényében azon betegek esetén, akik rendre a 4., illetve a 16. hétig éltek túl ADE nélkül. Ezek az adatok azt mutatják, hogy egy, a vizsgálatban szereplő beteg esetén, akinek a 4. héten 100 000 kópia/ml HIV-1 RNS-szintje volt (log10 = 5,0), 6-szor valószínűbben alakult ki ADE, illetve halt meg, mint az a beteg, akinek 8000 kópia/ml HIV-1 RNSszintje volt. Egy, a vizsgálatban szereplő beteg esetén, akinek a 16. héten 1 000 000 kópia/ml HIV-1 RNS-szintje volt (log10 = 6,0), 20-szor valószínűbben alakult ki ADE, illetve halt meg, mint az a beteg, akinek 8000 kópia/ml HIV-1 RNS-szintje volt. Az AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test vizsgálatnak antiretrovirális kezelés hatásainak monitorozására való használatát és a klinikai hasznát érintő itt közölt adatok két gyógyszert és három kezelési rezsimet egy specifikus betegcsoport esetén összehasonlító egyetlen klinikai vizsgálatból származtak. Mivel egyetlen klinikai vizsgálat esetleg nem megfelelően demonstrálja a kvantitatív HIV RNS-vizsgálat klinikai hasznát valamennyi betegpopuláció, minden klinikai helyzet, illetve valamennyi antiretrovirális kezelés esetén, kellő körültekintéssel lehet csak az itt bemutatott vizsgálatból származó adatok értelmezését kiterjeszteni bármely egyedi beteg esetére. Mint minden diagnosztikus vizsgálat esetén, az AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test eredményeinek értékelését valamennyi releváns klinikai és laboratóriumi lelettel együtt kell megtenni minden beteg esetén.

8. táblázat Kiindulási vizsgálati változók összefüggése a betegség-progresszióval ACTG 116A vizsgálat (N = 153 beteg, 73 progressziót jelentő esemény) Nem illesztett relatív veszély (95% CI)

Illesztett relatív veszély (95% CI) p érték2

Változó Log HIV-1 RNS kópiaszám1 Log CD4+ sejtszám1 Kiindulási AIDS-terápia ddI kezelés

1,58 (1,20–2,09)

1,44 (1,07–1,93)

0,02

0,39 (0,28–0,54) 2,00 (1,22–3,27) 0,95 (0,59–1,53)

0,45 (0,31–0,64) 1,39 (0,82–2,37) 1,12 (0,68–1,84)

0,0001 0,22 0,66

1 - A relatív veszély a HIV-1 RNS ötszörös növekedéséből vagy a CD4+ sejtszám ötszörös csökkenéséből származó veszélyarány 2 - A p érték az illesztett relatív veszélyre vonatkozik

9. táblázat Kiindulásitól a 8. hétig történő HIV-1 RNS-változás összefüggése a betegség-progresszióval ACTG 116A vizsgálat (N = 114 beteg, 62 progressziót jelentő esemény) Nem illesztett relatív veszély (95% Cl)

Illesztett relatív veszély (95% Cl) p érték2

Változó Log HIV-1 RNS kópiaszám1 Log HIV-1 RNS változás az indulástól a 8. hétig1 Log CD4+ sejtszám1 Kiindulási AIDS-terápia ddI kezelés

1,46 (1,11–1,93)

1,63 (1,16–2,28)

0,0005

1,18 (0,93–1,48)

1,54 (1,09–2,16)

0,013

0,43 (0,30–0,62) 1,83 (1,09–3,09) 0,76 (0,45–1,27)

0,50 (0,34–0,73) 1,28 (0,74–2,21) 0,87 (0,51–1,49)

0,0004 0,38 0,61


42/52



HIV-1 MONITOR

10. táblázat Kiindulási vizsgálati változók összefüggése a betegség-progresszióval ACTG 116B/117 vizsgálat (N = 86 beteg, 39 progressziót jelentő esemény) Nem illesztett relatív veszély (95% CI)


Változó Log HIV-1 RNS kópiaszám1 Log CD4+ sejtszám1 Kiindulási AIDS-terápia ddI kezelés

1,90 (1,28–2,82)

1,25 (0,81–1,94)

0,32

0,28 (0,16–0,48) 3,13 (1,66–5,92) 0,89 (0,47–1,69)

0,33 (0,18–0,62) 2,38 (1,24–4,58) 0,88 (0,46–1,71)

0,0006 0,01 0,71


11. táblázat Kiindulásitól a 8. hétig történő HIV-1 RNS-változás összefüggése a betegség-progresszióval ACTG 116B/117 vizsgálat (N = 65 beteg, 29 progressziót jelentő esemény) Nem illesztett relatív veszély (95% CI)


Változó Log HIV-1 RNS kópiaszám1 Log HIV-1 RNS változás az indulástól a 8. hétig1 Log CD4+ sejtszám1 Kiindulási AIDS-terápia ddI kezelés

2,10 (1,32–3,34)

1,58 (0,93–2,69)

0,09

1,41 (0,71–2,79)

1,58 (0,68–3,68)

0,29

0,25 (0,13–0,46) 2,43 (1,17–5,05) 1,07 (0,51–2,27)

0,29 (0,14–0,60) 1,87 (0,88–3,97) 0,98 (0,39–2,48)

0,001 0,10 0,96


7. ábra Betegség-progresszió gyakorisága a kiindulási HIV-1 RNS-szint szerint 116A vizsgálat

80 70 60 50 40 30 20 10 <2 162 193

<775 841

<417 316

<247 229

<194 312

<150 695

<103 806

<72 438

<34 661

0 <11 912

Betegség-progresszió (%)

Betegség-progresszió a HIV-1 RNS kündulási szintje függvényében

HIV-1 RNS kündulási szint (kópia/ml)


Regisztráció száma

Decilis

n=

Progressziók száma

AIDS-hez, ill. halálhoz vezető progressziók száma

%

18

<11912

18

15

5

33,33

36 54 72 90 108 126 144 162 179

<34661 <72438 <103806 <150695 <194312 <247229 <417316 <775841 <2162193

18 18 18 18 18 18 18 18 17

14 17 14 16 16 14 16 17 14

5 6 5 7 8 6 10 12 9

35,71 35,29 35,71 43,75 50,00 42,86 62,50 70,59 64,29


43/52

8. ábra Betegség-progresszió gyakorisága a kiindulási HIV-1 RNS-szint szerint 116B/117 vizsgálat Betegség-progresszió a HIV-1 RNS kiindulási szintje függvényében Betegség-progresszió (%)

90 80 70 60 50 40 30 20 10

HIV-1 RNS kiindulási szint (kópia/ml)

< 1 456 302

< 794 027

< 403 146

< 251 627

< 150 866

< 97 781

< 62 132

< 49 743

< 31 292

< 11 571

0

Regisztráció száma

Decilis

n=

Progressziók száma

AIDS-hez, ill. halálhoz vezető progressziók száma

%

10 20 30 40 50 60 70 80 90 96

<11 571 <31 292 <49 743 <62 132 <97 781 <150 866 <251 627 <403 146 <794 027 <1 456 302

10 10 10 10 10 10 10 10 10 6

10 10 10 10 10 10 10 10 10 6

4 2 3 6 1 3 5 6 9 5

40,00 20,00 30,00 60,00 10,00 30,00 50,00 60,00 90,00 83,33

9. ábra Kiindulásitól 48 héten át történő HIV-1 RNS-változás középértékei NV14256 vizsgálat 4. hét 8. hét n1 = 98 n1 = 90 n2 = 91 n2 = 85 n3 = 92 n3 = 91

12. hét 16. hét n1 = 89 n1 = 93 n2 = 88 n2 = 81 n3 = 85 n3 = 86

24. hét n1 = 86 n2 = 83 n3 = 84

32. hét n1 = 71 n2 = 73 n3 = 79

24. hét

32. hét

40. hét n1 = 63 n2 = 71 n3 = 69

48. hét n1 = 52 n2 = 62 n3 = 56

0,4 0,2 0 -0,2 -0,4 -0,6 -0,8 4. hét

8. hét

12. hét

ZDV+ddC

44/52

16. hét

SAQ 600mg+ZDV

40. hét

48. hét

SAQ 600mg+ZDV+ddC



HIV-1 MONITOR

12. táblázat ADE kockázat a Log10 (utolsó RNS) és egyéb kovariánsok függvényében az adott vizsgálati hét idejének alapján az adott hétig túlélő betegek esetén Cox-modell eredmények összefoglalása – kezelési csoport szerint rendezett modell NV14256 vizsgálat Vizsgálat hete 4

8

16

24

32

40

48

56

64

Változó

Cox modell együttható

Veszélyarány*

p érték

log10(kiindulási RNS) log10(utolsó RNS) Kiindulási CD4 Utolsó CD4 log10(kiindulási RNS) log10(utolsó RNS) Kiindulási CD4 Utolsó CD4 log10(kiindulási RNS) log10(utolsó RNS) Kiindulási CD4 Utolsó CD4 log10(kiindulási RNS) log10(utolsó RNS) Kiindulási CD4 Utolsó CD4 log10(kiindulási RNS) log10(utolsó RNS) Kiindulási CD4 Utolsó CD4 log10(kiindulási RNS) log10(utolsó RNS) Kiindulási CD4 Utolsó CD4 log10(kiindulási RNS) log10(utolsó RNS) Kiindulási CD4 Utolsó CD4 log10(kiindulási RNS) log10(utolsó RNS) Kiindulási CD4 Utolsó CD4 log10(kiindulási RNS) log10(utolsó RNS) Kiindulási CD4 Utolsó CD4

0,798 0,4197 -0,0009 -0,0040 0,8096 0,4186 -0,0019 -0,0049 0,8714 0,5385 -0,0015 -0,0049 0,6910 0,7135 -0,0003 -0,0064 0,5926 0,9000 -0,0040 -0,0023 0,8003 0,7086 -0,0030 -0,0031 0,5993 0,5631 -0,0011 -0,0079 1,0917 0,0835 -0,0022 -0,0072 1,2803 -0,2500 0,0006 -0,0085

2,22 1,52 0,91 0,67 2,25 1,52 0,83 0,62 2,39 1,71 0,87 0,62 2,00 2,04 0,97 0,53 1,81 2,46 0,67 0,79 2,23 2,03 0,74 0,73 1,82 1,76 0,89 0,45 2,98 1,09 0,80 0,49 3,60 0,78 1,07 0,43

0,0012 0,0219 0,5806 0,0084 0,0004 0,0138 0,2107 0,0006 0,005 0,0046 0,3510 0,0010 0,0136 0,0017 0,8667 0,0001 0,0492 0,0003 0,0252 0,1523 0,0159 0,0096 0,1282 0,0955 0,0978 0,0629 0,6168 0,0016 0,0127 0,8025 0,4560 0,0201 0,0135 0,4988 0,8531 0,0213

* Veszélyarány a HIV-1 RNS tízszeres növekedése vagy a CD4-szám 100-zal való csökkenése miatt.

10. ábra Kaplan-Meier becsült túlélések – NV14256 vizsgálat Kezelési csoport: SAQ 600 mg ADE nélkül a 8. hétig túlélő betegek ADE túlélés (%)

Utolsó RNS-szint: 8. hét

Alsó harmad Középső harmad Felső harmad

8. hetet követő hetek



45/52

11. ábra Kaplan-Meier becsült túlélések – NV14256 vizsgálat Kezelési csoport: ddC ADE nélkül a 8. hétig túlélő betegek ADE túlélés (%)




12. ábra Kaplan-Meier becsült túlélések – NV14256 vizsgálat Kezelési csoport: ddC + SAQ 600 mg ADE nélkül a 8. hétig túlélő betegek ADE túlélés (%)




46/52



HIV-1 MONITOR

13. ábra Első ADE-ig eltelt időhöz tartozó veszélyarány - ADE nélkül a 4. hétig túlélő betegek NV14256 vizsgálat Veszélyarány 21

16

11

6

1 3,8

4,2

4,6

5,0

5,4

5,8

log10 (Utolsó RNS)

14. ábra Első ADE-ig eltelt időhöz tartozó veszélyarány - ADE nélkül a 16. hétig túlélő betegek NV14256 vizsgálat Veszélyarány 21

16

11

6

1 3,8

4,2

4,6

5,0

5,4

5,8

log10 (Utolsó RNS)



47/52

Hivatkozások 1. Barre-Sinoussi, F., Chermann, J.C., Rey, F. 1983. Isolation of a T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk for acquired immunodeficiency syndrome. Science 220:868-871. 2. Popovic, M., Sarngadharan, M.G., Read, E., et al. 1984. Detection, isolation and continuous production of cytopathic retroviruses (HTLVIII) from patients with AIDS and pre-AIDS. Science 224:497-500. 3. Gallo, R.C., Salahuddin, S.Z., Popovic, M., et al. 1984. Frequent detection and isolation of cytopathic retroviruses (HTLV-III) from patients with AIDS and at-risk for AIDS. Science 224:500-502. 4. Curran, J.W., Jaffe, H.W., Hardy, A.M., et al. 1988. Epidemiology of HIV Infection and AIDS in the United States. Science 239:610-616. 5. Gaines, H., von Sydow, M.A., von Stedingk, L.V. 1990. Immunological changes in primary HIV-1 infection. AIDS 4:995-999. 6. Tindall, B., and Cooper, D.A. 1991. Primary HIV-1 infection: host responses and intervention strategies. AIDS 5:1-14. 7. Daar, E.S., Moudgil, T, Meyer. R.D., et al. 1991. Transient high levels of viremia in patients with primary human immunodeficiency virus type 1 infection. New England Journal of Medicine 324:961-964. 8. Clark, S.J., Saag, M.S., Decker, W.D. 1991. High titers of cytopathic virus in plasma of patients with symptomatic primary HIV-1 infection. New England Journal of Medicine 324:954-960. 9. Albert, J., Abrahamsson, B., Nagy, K. 1990. Rapid development of isolate-specific neutralizing antibodies after primary HIV-1 infection and consequent emergence of virus variants which resist neutralization by autologous sera. AIDS 4:107-112. 10. Hornsburgh, C.R., Jason, J., Longini, I.M., et al. 1989. Duration of human immunodeficiency virus infection before detection of antibody. Lancet 26:637-640. 11. Schnittman, S.M., Psallidopoulos, M.C., Lane, H.C., et al. 1989. The reservoir for HIV-1 in human peripheral blood is a T cell that maintains expression of CD4. Science 245:305-308. 12. Schnittman, S.M., Greenhouse, J.J., Psallidopoulos, M.C. 1990. Increasing viral burden in CD4+ T cells from patients with human immunodeficiency virus (HIV) infection reflects rapidly progressive immunosuppression and clinical disease. Annals of Internal Medicine 113:438-443. 13. Pantaleo, G., Graziosi, C., Fauci, A.S. 1993. New concepts in the immunopathogenesis of human immunodeficiency virus (HIV) infection. New England Journal of Medicine 328:327-335.

48/52



HIV-1 MONITOR

14. Piatak, N., Saag, M.S., Yang, L.C., et al. 1993. High levels of HIV-1 in plasma during all stages of infection determined by competitive PCR. Science 259:1749-1754. 15. Fauci, A.S., Schnittman, S.M., Poli, G., et al. 1991. NIH conference: immunopathogenic mechanisms in human immunodeficiency virus (HIV) infection. Annals of Internal Medicine 114:678-693. 16. Coffin, J.M. 1995. HIV-1 population dynamics in vivo: Implications for genetic variation, pathogenesis, and therapy. Science 267:483-489. 17. Ho, D.D., Neumann, A.U., Perelson, A.S., et al. 1995. Rapid turnover of plasma virions and CD4 lymphocytes in HIV-1 infection. Nature 373:123-126. 18. Wei, X., Ghosh, S.K., Taylor, M.E., et al. 1995. Viral dynamics in human immunodeficiency virus type 1 infection. Nature 373:117-122. 19. O’Brien, W.A., Hartigan, P.M., Martin, D. et al. 1996. Changes in plasma HIV-1 RNA and CD4 lymphocyte counts and the risk of progression to AIDS. New England Journal of Medicine 334:426-431. 20. Welles, S.L., Jackson, J.B., Yen-Leiberman, B., et al. 1996. Prognostic value of plasma Human Immunodeficiency Virus Type I (HIV-1) RNA levels in patients with advanced HIV-1 disease and with little or no zidovudine therapy. Journal of Infectious Diseases 174:696-703. 21. Coombs, R.W., Welles, S.L., Hooper, C., et al. 1996. Association of plasma Human Immunodeficiency Virus Type I RNA level with risk of clinical progression in patients with advanced infection. Journal of Infectious Diseases 174:704-712. 22. Hammer, S., Crumpacker, C., D’Aquila, R., et al. 1993. Use of virologic assays for detection of human immunodeficiency virus in clinical trials: Recommendations of the AIDS Clinical Trials Group Virology Committee. Journal of Clinical Microbiology 31:2557-2564. 23. Schochetman, G., George, J.R., ed. AIDS testing: a comprehensive guide to technical, medical, social, legal and management issues. 2nd ed. New York: Springer-Verlag, 1994. 24. Mulder, J. McKinney, N., Christopherson, C., et al. 1994. Rapid and simple PCR assay for quantitation of human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma: Application to acute retroviral infection. Journal of Clinical Microbiology 32:292-300. 25. Dewar, R.L., Highbarger, H.C., Sarmiento, M.B., et al. 1994. Application of branched DNA signal amplification to monitor human immunodeficiency virus type 1 burden in human plasma. Journal of Infectious Diseases 170:1172-1179. 26. van Gemen, B., Kievits, T., Schukkink, R., et al. 1993. Quantification of HIV-1 RNA in plasma using NASBA during HIV-1 primary infection. Journal Virological Methods 43:177-188. 6/2007, Revision 6.0


49/52

27. Saiki, R.K. Scharf, S., Faloona, F., et al. 1985. Enzymatic amplification of β−globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of Sickle Cell Anemia. Science 230:1350-1354. 28. Saiki, R.K., Gelfand, D.H., Stoffel, S., et al. 1988. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239:487-491. 29. Mullis, K.B., Faloona, F.A. 1987. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods in Enzymology 155:335-350. 30. Myers, T.W., and Gelfand, D.H. 1991. Reverse transcription and DNA amplification by a Thermus thermophilus DNA polymerase. Biochemistry 30:7661-7666. 31. Kwok, S., Sninsky, J.J. 1993. PCR detection of human immunodeficiency virus type 1 proviral DNA sequences. In: Diagnostic Molecular Biology: Principles and Applications. eds. Persing, D.H., Smith, T.F., Smith, F.C., et al. ASM, Washington, D.C. 32. Longo, M.C., Berninger, M.S., Hartley, J.L. 1990. Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions. Gene 93:125-128. 33. Richmond, J.Y. and McKinney, R.W. eds. 1999. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. HHS Publication Number (CDC) 93-8395. 34. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Protection of Laboratory Workers From Occupationally Acquired Infections; Approved Guideline–Third Edition. CLSI Document M29-A3 Wayne, PA: CLSI, 2005. 35. International Air Transport Association Regulations, 41st Edition. 2000. 704 pp.

Dangerous

Goods

36. Holmes, H., Davis, C., Heath, A., et al. 2001. An international collaborative study to establish the 1st international standard for HIV-1 RNA for use in nucleic acid-based techniques. Journal Virological Methods 92:141-150. 37. Yen-Lieberman, B., Brambilla, D., Jackson, B. et al. 1996. Evaluation of a quality assurance program for quantitation of Human Immunodeficiency Virus Type 1 RNA in plasma by the AIDS Clinical Trials Group Virology. Journal of Clinical Microbiology 34:2695-2701. 38. Dale, J., Dondero, T.J., Rayfield, M.A. et al. 1996. The emerging genetic diversity of HIV. JAMA 275:210-216. 39. Gao, F., Morrison, S.G., Robertson, D.L. et al. 1996. Molecular cloning and analysis of functional envelope genes from Human Immunodeficiency Virus Type 1 sequence subtypes A through G. Journal of Virology 70:1651-1667. 50/52



HIV-1 MONITOR

40. Layne, S.P., Merges, M.J., Dembo, M. et al. 1992. Factors underlying spontaneous inactivation and susceptibility to neutralization of Human Immunodeficiency Virus. Virology 189:695-714. 41. Louwagie, J.J., McCutchan, F., Brennan, T. et al. 1993. Phylogenetic analysis of gag genes from seventy international HIV-1 isolates provides evidence for multiple genotypes. AIDS 7:769-780. 42. Louwagie, J.J., Delwart, E.L., Mullins, J.I. et al. 1994. Genetic analysis of HIV-1 isolates from Brazil reveals presence of two distinct genetic subtypes. AIDS Research and Human Retroviruses 10:561-567. 43. Louwagie, J.J., Janssens, W., Mascola, J.J. et al. 1995. Genetic diversity of the envelope glycoprotein from Human Immunodeficiency Virus Type 1 isolates of African origin. Journal of Virology 69:263-271. 44. Mascola, J.J., Louwagie, J.J., McCutchan, F.E. et al. 1993. Two antigenically distinct subtypes of human immunodeficiency virus type 1: viral genotype predicts neutralization serotype. Journal of Infectious Diseases 169:48-54. 45. McCutchan, F.E., Hegerich, P.A., Brennan, T.P. et al. 1992. Genetic variants of HIV-1 in Thailand. AIDS Research and Human Retroviruses 8:1887-1895. 46. Michael, N. The Walter Reed Army Institute of Research, Washington, D.C. Personal communication. 47. Carr, J.K., Salminen, M.O., Albert, J. et al. 1998. Full genome sequences of human immunodeficiency virus type 1 subtypes G and A/G intersubtype recombinants. Virology. 247:22-31. 48. Carr, J.K., Salminen, M.O., Koch, C. et al. 1996. Full-length sequence and mosaic structure of a human immunodeficiency virus type 1 isolate from Thailand. Journal of Virology 70:5935-5943. 49. McCutchan, F.E., Artenstein, A.W., Sanders-Buell, E. et al. 1996. Diversity of the envelope glycoprotein among human immunodeficiency virus type 1 isolates of clade E from Asia and Africa. Journal of Virology 70:3331-3338. 50. McCutchan, F.E., Ungar, B.L., Hegerich, P. et al. 1992. Genetic analysis of HIV-1 isolates from Zambia and an expanded phylogenetic tree for HIV-1. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndrome 5:441-449. 51. Porter, K.R., Mascola, J.R., Hupudio, H. et al. 1997. Genetic, antigenic and serologic characterization of human immunodeficiency virus type 1 from Indonesia. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndrome and Human Retrovirology 14:1-6. 52. Salminen, M.O., Johansson, B., Sonnerborg, A. et al. 1996. Full-length sequence of an ethiopian human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) isolate of genetic subtype C. AIDS Research and Human Retroviruses. 12:1329-1339. 6/2007, Revision 6.0


51/52

" Distributed by

Roche Molecular Systems, Inc. Branchburg, NJ 08876 USA A Roche csoport tagja Roche Diagnostics Indianapolis, IN 46256 USA (For Technical Assistance call the Roche Response Center toll-free: 1-800 526 1247)

Roche Diagnostics H7V 4A2 Laval, Quebec (For Technical Assistance call: Pour toute assistance technique, appeler le: 1-877 273 3433)

Roche Diagnostics (Schweiz) AG CH-6343 Rotkreuz

Roche Diagnostics F-38240 Meylan

Roche Diagnostics GmbH D-68298 Mannheim, Germany

Distributore in Italia: Roche Diagnostics SpA Piazza Durante 11 I-20131 Milano

Roche Diagnostics S.L. E-08006 Barcelona

Distribuidor em Portugal: Roche Farmacêutica Química, Lda P-2700 Amadora

A ROCHE, a COBAS, az AMPLICOR, az AMPLILINK, az AMPERASE, az AMPLIPREP, a TAQMAN, az AMPLICOR HIV-1 MONITOR, a FORTOVASE, a HIVID és az INVIRASE a Roche védjegye. A ROCHE RESPONSE CENTER a Roche szolgáltatási védjegye. A CRIXIVAN® a Merck & Co., Inc. bejegyzett védjegye. A Dynabeads® paramágneses részecskék szabadalmai a Dynal Biotech ASA, Oslo, Norway birtokában vagy általa licencelve vannak. A Dynabeads® a Dynal Biotech ASA, Oslo, Norway bejegyzett védjegye, engedélyezve a Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, Indiana számára. Az Eppendorf Multipette® és Eppendorf Combitip® az Eppendorf-NethelerHinz GmbH, Hamburg, Németország, bejegyzett védjegye. Az EPIVIR® és ZIAGEN® a GlaxoSmithKline bejegyzett védjegyei. A NORVIR® az Abbott Laboratories bejegyzett védjegye. A ProClin® a Rohm and Haas Company bejegyzett védjegye. A SUSTIVA® a DuPont Pharmaceuticals Company bejegyzett védjegye. A VIRAMUNE® a Roxane Laboratories, Inc. bejegyzett védjegye.

Copyright 2007. Roche Molecular Systems, Inc. Minden jog fenntartva.

6/2007

(00058003436-05ENGL) 04741781001-03

52/52



N: HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 ART: US: 83369

Recommend Documents