N: Specimen Preparation Kit, ART: version 2

COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, version 2.0

HCV IN VITRO DIAGNOSZTIKAI CÉLRA.

Rendelési információ

AMPLICOR HCV Specimen Preparation Kit, version 2.0

HCV PREP

96 Tests

P/N: 21111086 123 ART: 11 1108 6 US: 83126

AMPLICOR HCV Controls Kit, version 2.0

HCV CTL

8 Sets

P/N: 21111175 123 ART: 11 1117 5 US: 83131

AMPLICOR HCV Amplification Kit, version 2.0

HCV AMP

96 Tests

P/N: 21111094 123 ART: 11 1109 4 US: 83127

COBAS AMPLICOR HCV Detection Kit, version 2.0

HCV DK

100 Tests

P/N: 21111132 123 ART: 11 1113 2 US: 83130

COBAS AMPLICOR Detection Reagents Kit

DK

100 Tests

P/N: 20757470 122 ART: 07 5747 0 US: 83276

COBAS AMPLICOR Conjugate Detection Reagent

CN4

200 Tests

P/N: 20764213 123 ART: 07 6421 3 US: 83305

COBAS AMPLICOR Wash Buffer

WB

500 Tests

P/N: 20759899 123 ART: 07 5989 9 US: 83314

Az alábbi készlet az AMPLICOR HCV Amplification Kit, version 2.0. segítségével amplifikált HCV belső kontroll kimutatására használható. A HCV belső kontroll kimutatása egy javasolt felhasználási lehetőség. IC

100 Tests

P/N: 20757608 122 ART: 07 5760 8 US: 83281

P/N: 04741757 190

COBAS AMPLICOR Internal Control Detection Kit

10/2005, Revision 6.0

COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0

1/42

Felhasználás célja A COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus (HCV) Test, version 2.0 (v2.0) egy kvalitatív in vitro vizsgálat a hepatitis C vírus RNS-ének kimutatására klinikai mintákban COBAS AMPLICOR Analizátor segítségével. A HCV RNS jelenléte igazolja a fennálló HCV-fertőzést olyan betegekben, akik májbetegség klinikai és/vagy biokémiai jeleit mutatják. A HCV RNS kimutatására a vizsgálat a következő lépéseket valósítja meg: a target RNS reverz transzkripciója, azaz komplementer DNS (cDNS) szintézise, a cDNS amplifikálása polimerázláncreakcióval (PCR), valamint nukleinsav-hibridizáció. A COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 nem való vér vagy vérkészítmények hepatitis C vírus fertőzöttségének szűrésére.

A vizsgálat összegzése és magyarázata A hepatitis C vírus a poszttranszfúziós non-A, non-B hepatitis1,2 esetek 90-95%-áért felelőssé tehető elsőrendű kóroki ágens. A HCV egyszálú, pozitív RNS-t tartalmazó vírus, amelynek genomja mintegy 3000 aminosavat kódoló megközelítően 10 000 nukleotidot tartalmaz1. Mint vérrel terjedő vírus, a HCV vérrel és vérkészítményekkel átvihető. A HCV-fertőzés előfordulása gyakori szervátültetettekben, vérátömlesztésben vagy kereskedelemben kapható véralvadási faktor adásában részesült betegekben, intravénás kábítószerélvezőkben, valamint vesedializáltakban. Immunszerológiai felmérések alapján a HCV-fertőzés előfordulása Kanadában 0,6%, az Egyesült Államokban 1,8%3. A HCV-fertőzött betegekben az anti-HCV antitestek megjelenése ezekre az ellenanyagokra specifikus immunszerológiai vizsgálatok kifejlesztéséhez vezetett4,5. Ezen vizsgálatok bevezetése máris a poszttranszfúziós hepatitisek gyakoriságának csökkenését eredményezte. Az ellenanyagszűrés során ismételten reaktívnak bizonyuló minták további értékelésére kiegészítő vizsgálatként rekombináns immunoblot assay (RIBA) került bevezetésre. Újabb felmérések kimutatták, hogy ezen kiegészítő vizsgálatnak az értékelése a beteg kockázati státuszától függ. Például egy alacsony kockázatú véradó populáció RIBA-reaktív mintáinak mindössze 50%-a igazolható HCV RNS vizsgálattal6,7,8. Ezért egy pozitív RIBA-eredmény nem valós indikátora az aktív HCV-fertőzésnek, miután a gyógyult betegek még évekig anti-HCV pozitívak maradhatnak5. Továbbá bizonytalan RIBA-eredményeket figyeltek meg akutan fertőzött, éppen szerokonvertáló személyekben, és krónikus HCV-fertőzöttekben egyaránt9,10. Az immunszerológiai vizsgálatok kimutatják az éppen zajló és/vagy a korábbi HCV-fertőzést, de nem tudnak különbséget tenni a kettő között. Ráadásul az akut HCV-fertőzés egyes eseteiben a betegekben nem fejlődik ki antitestes válasz11, ezért az éppen zajló HCV-fertőzést immunológiai technikákkal lehetetlen diagnosztizálni. Ugyanakkor a HCV RNS kimutatása nukleinsav-vizsgálatokkal igazolhatja a zajló fertőzést. Nukleinsav-vizsgálatok alkalmazásával lehetőség van az immunológiai szerokonverziót megelőző HCV viraemia kimutatására12,13. Miután a nukleinsav-vizsgálatok képesek a HCV RNS direkt kimutatására, azaz nem függenek a beteg immunológiai státuszától, ezért egy nukleinsav vizsgálat alkalmas a HCV RNS kimutatására immunkompromittált betegekben is8.

2/42


10/2005, Revision 6.0

Hepatitis C Virus

Az eljárás alapelvei A COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 öt fő lépésből épül fel: minta előkészítése; a target RNS reverz transzkripciója, azaz komplementer DNS (cDNS) szintézise14; a cDNS amplifikálása HCV-specifikus komplementer primerek felhasználásával PCR során14; az amplifikált termékek hibridizációja a targetszekvenciára specifikus oligonukleotid próbákhoz; a kötődött amplifikált termékek kolorimetriás kimutatása. A COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 lehetővé teszi a HCV target és a HCV belső kontroll target RNS-ek szimultán reverz transzkripcióját és PCR-amplifikációját. A master mix reagens egy a HCV-re és a HCV belső kontrollra egyaránt specifikus primer párt tartalmaz. Az amplifikált DNS kimutatása targetspecifikus oligonukleotid próbák segítségével történik, amelyek lehetővé teszik a HCVamplikon és a HCV belső kontroll amplikon független azonosítását. Belső kontroll

Az enzimreakción alapuló amplifikálási műveletek során, amilyen a PCR is, a klinikai mintákban jelen lehetnek gátlóanyagok, amelyek csökkenthetik az amplifikálás hatékonyságát. A COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0-hoz HCV belső kontroll lett hozzáadva, hogy lehetővé váljon az olyan feldolgozott minták azonosítása, amelyekben a PCR-amplifikációt esetleg zavaró anyagok vannak jelen. A HCV belső kontroll egy RNS- transzkriptum a HCV targetszekvenciával identikus régiókhoz kötődő primerrel, a HCV targetszekvenciához hasonló hosszúságú és bázisösszetételű random belső szekvenciával, és egy egyedi próbához kötődő régióval, amely elkülöníti a HCV belső kontrollt a targetamplikontól. Ezeket a jellemzőket azért választották ki, hogy biztosítsák a HCV belső kontroll és a HCV target RNS ekvivalens amplifikálását.

Minta előkészítése

A HCV RNS szérumból vagy a plazmából való izolálása során a víruspartikulumokat először egy chaotróp ágenssel roncsolják, amit azután az RNS alkoholos kicsapása követ. Ezt követően az RNS a mintaoldószerben újra feloldásra kerül. A HCV belső kontroll RNS-t a roncsoló reagenssel együtt adják hozzá az egyes mintákhoz, így az mint extrahálási, amplifikálási és kimutatási kontroll szerepel minden egyes feldolgozott minta esetén.

Reverz transzkripció és PCR-amplifikáció

A targetszekvencia kiválasztása A target RNS-szekvencia kiválasztása a különböző HCV-genotípusok között a genomban maximálisan konzervált régiók azonosításán múlik15,16,17. Ezért a primerek és próbák megfelelő kiválasztása kritikus abból a szempontból, hogy a vizsgálat valamennyi genotípust képes legyen kimutatni (ld. a „Nem-klinikai értékelés, HCV-genotípus inkluzivitás vizsgálata” szakaszt). Az ismert HCVgenotípusok között a HCV-genom 5'-nem átírt szakasza [untranslated region (UTR)] a legnagyobb fokban konzervált RNS-szekvencia18,19. A COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 a HCV-genom nagyfokban konzervált 5'-UTR szakaszán lévő 244 nukleotidszekvenciának megfelelő KY78 és KY80 primereket használja13. A capture próbaszekvencia és a primer szekvenciák az 5'-UTR szakaszon belül a legnagyobb fokban konzervált doméneken helyezkednek el18. Reverz transzkripció A reverz transzkripciót és az amplifikálási reakciókat hőstabil rekombináns enzim, a Thermus thermophilus DNS-polimeráz (rTth pol) segítségével végzik. Mangán (Mn2+) jelenlétében, valamint megfelelő pufferviszonyok között az rTth pol mind reverz transzkriptáz-, mind DNS-polimerázaktivitást mutat14. Ez lehetővé teszi a reverz transzkripció és a PCR-amplifikálás megtörténését ugyanazon reakcióelegyben. A feldolgozott mintákat amplifikációs csövekben (A-csövek) lévő amplifikáló keverékhez adják, ahol tehát mind a reverz transzkripció, mind a PCRamplifikálás megtörténik.

10/2005, Revision 6.0


3/42

A downstream vagy antisense primer (KY78) az 5' végén biotinilált; az upstream vagy sense primer (KY80) nem biotinilált. A reakcióelegyet fel kell hevíteni, hogy lehetővé váljon a downstream primernek a HCV target RNS-hez és a HCV belső kontroll target RNS-hez való specifikus kapcsolódása. Mn2+ és dezoxinukleozidtrifoszfátok (dNTPs), azaz dezoxiadenozin-, dezoxiguanozin-, dezoxicitidin- és dezoxiuridin- (timidin helyett) trifoszfátok feleslegének jelenlétében az rTth pol a kapcsolódott primerhez a target RNS komplementer DNS-szálát (cDNS) szintetizálja. Targetamplifikáció A HCV target és a HCV belső kontroll RNS reverz transzkripcióját követően a reakcióelegyet az RNS:cDNS hibrid denaturálása és a primer targetszekvenciák szabaddá tétele végett fel kell hevíteni. Ahogy az elegy kihűl az upstream primer (KY80) specifikusan kötődik a cDNS-szálhoz, az rTth pol pedig a primerre egy második DNS-szálat szintetizál. Ezzel a PCR első ciklusa véget ért, a HCV RNS és a HCV belső kontroll RNS targetrégiójának egy kettős szálú DNS-másolatát létrehozva. A kettős szálú DNS szeparálása és a primer targetszekvenciák szabaddá tétele végett reakcióelegyet újra fel kell melegíteni. Az elegy kihűlésével a KY78 és KY80 primerek a target DNS-hez kapcsolódnak. Az rTth pol enzim Mn2+ és feleslegben lévő dNTPs jelenlétében a primerekre a targettemplátoknak megfelelően 244 bázispár hosszúságú kettős szálú DNS molekulát szintetizál, amelyet amplikonnak hívnak. A COBAS AMPLICOR Analizátor automatikusan a folyamatot adott számú cikluson keresztül ismétli, az amplikon DNS-mennyisége ciklusonként megduplázódik. A szükséges számú ciklus a COBAS AMPLICOR Analizátorba előre be van programozva. Az amplifikálás a HCV-genomnak csak a primerek közötti régiójában zajlik; a teljes genom nem amplifikálódik. Szelektív amplifikálás A COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 a target-nukleinsav szelektív amplifikálását a klinikai mintából az AmpErase (uracil-N-glikoziláz) enzim és dezoxiuridin-trifoszfát (dUTP) használatával éri el. Az AmpErase enzim felismeri és katalizálja az olyan DNS-szálak megsemmisítését, amelyek dezoxiuridint tartalmaznak20, a dezoxitimidint tartalmazókét viszont nem. A dezoxiuridin a természetes DNS-ben nincs jelen, ugyanakkor az amplikonokban mindig megtalálható, miután a master mix reagens a dNTP-ok egyikeként timidin-trifoszfát helyett dezoxiuridin-trifoszfátot használ; tehát csak az amplikonok tartalmaznak dezoxiuridint. A dezoxiuridinnak köszönhetően a szennyező amplikont az AmpErase enzim még a target DNS amplifikálását megelőzően lebontja. A master mix reagensben lévő AmpErase enzim katalizálja a dezoxiuridint tartalmazó DNS hasítását a dezoxiuridin csoportoknál úgy, hogy a dezoxiribóz lánc felnyílását okozza a C1 helyen. Az első hevítési lépésben a master mix reagens bázikus pH-ján az amplikon DNS-lánc eltörik a dezoxiuridin helyén, tehát a DNS nem lesz amplifikálható. Az AmpErase enzim 55 °C felett, azaz a hevítési lépések során inaktív, azaz nem bontja le a targetamplikont. Az amplifikálást követően a maradék enzim a denaturáló oldat hozzáadásakor denaturálódik, megelőzve ezáltal a targetamplikonok lebontását. A COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 alkalmazásakor az AmpErase enzim mérések szerint legalább 103 darab dezoxiuridint tartalmazó HCV-amplikont inaktivál egy PCR során.

4/42


10/2005, Revision 6.0

Hepatitis C Virus

Hibridizáció

A PCR-amplifikálást követően a COBAS AMPLICOR Analizátor automatikusan denaturáló oldatot adagol az A-csövekhez, ezáltal a HCV-amplikon és a HCV belső kontroll amplikon kémiai denaturálást szenved, és egyszálú DNS lesz. A denaturált amplikonok kis részletei azután a kimutatási csövekbe (D-csövekbe) kerülnek. A HCV (KY150), illetve HCV belső kontroll (SK535) specifikus oligonukleotid próbával fedett mágneses részecskék szuszpenziója a megfelelő D-csövekhez hozzáadásra kerül. A biotinilált HCV és HCV belső kontroll amplikonok a mágneses részecskékhez kötött targetspecifikus oligonukleotid próbákhoz hibridizálnak. Ez a targetspecifikus próbákhoz való amplikonhibridizáció növeli a vizsgálat teljes specificitását.

Kimutatási reakció

A hibridizációt követően a COBAS AMPLICOR Analizátor mossa a mágneses részecskéket a D-csövekben, melynek során a nem kötődött anyag eltávozik, ezután avidin-tormaperoxidáz konjugátumot adagol a csövekbe. Az avidintormaperoxidáz konjugátum a mágneses részecskékhez kötött target (HCV vagy HCV belső kontroll) specifikus oligonukleotid próbákhoz hibridizált biotinilált amplikonokhoz kötődik. A COBAS AMPLICOR Analizátor a mágneses részecskék mosása révén eltávolítja a nem kötődött konjugátumot, majd minden egyes D-csőhöz hidrogén-peroxidot és 3,3',5,5'-tetrametil-benzidint (TMB) tartalmazó szubsztrátoldatot ad. Hidrogén-peroxid jelenlétében a kötődött tormaperoxidáz katalizálja a TMB színes komplexszé történő oxidációját, amelynek abszorbanciáját a COBAS AMPLICOR Analizátor 660 nm-es hullámhosszon méri.

Reagensek HCV PREP AMPLICOR HCV 96 teszt Specimen Preparation Kit, version 2.0 AMPLICOR HCV minta-előkészítő készlet, 2.0-s verzió HCV LYS, v2.0 (HCV roncsoló reagens, 2.0-s verzió)

P/N: 21111086 123 ART: 11 1108 6 US: 83126

8 x 6,9 ml

trisz-HCl puffer 68% guanidin-tiocianát 3% ditiotreitol < 1% glikogén 68% (w/w) guanidin-tiocianát

+

Xn

Ártalmas HCV DIL, v2.0 (HCV mintaoldószer, 2.0-s verzió)

8 x 4,8 ml

trisz-HCl puffer < 0,005% poli rA RNS (szintetikus) EDTA 0,05% nátrium-azid

10/2005, Revision 6.0


5/42

HCV IC, v2.0 (HCV belső kontroll, 2.0-s verzió)

8 x 0,1 ml

< 0,001% nem fertőző in vitro átírt (mikrobiális) RNS, amely HCV primer kötő szekvenciákat és egy egyedi próbához kötődő régiót tartalmaz. < 0,005% poli rA RNS (szintetikus) EDTA 0,05% nátrium-azid HCV CTL AMPLICOR HCV Controls Kit, version 2.0 AMPLICOR HCV kontrollkészlet, 2.0-s verzió

8 szett

P/N: 21111175 123 ART: 11 1117 5 US: 83131

NHP [Negatív plazma (humán)]

8 x 0,6 ml

Humán plazma, US FDA engedélyezett tesztekkel nem reaktív HCV-antitestre, HIV-1/2 antitestre, HIV p24 antigénre és HBsAg-re; HIV-1 RNS, HCV RNS és HBV DNS PCR-technikával nem kimutatható 0,1% ProClin® 300 HCV (–) C, v2.0 [HCV (–) kontroll, 2.0-s verzió]

8 × 0,1 ml

< 0,005% poli rA RNS (szintetikus) EDTA 0,05% nátrium-azid HCV (+) C, v2.0 [HCV (+) kontroll, 2.0-s verzió]

8 x 0,1 ml

< 0,001% nem fertőző in vitro átírt (mikrobiális) RNS, amely HCV-szekvenciákat tartalmaz < 0,005% poli rA RNS (szintetikus) EDTA 0,05% nátrium-azid HCV AMP AMPLICOR HCV 96 teszt Amplification Kit, version 2.0 AMPLICOR HCV amplifikáló készlet, 2.0-s verzió

P/N: 21111094 123 ART: 11 1109 4 US: 83127

HCV MMX, v2.0 (HCV master mix, 2.0-s verzió)

8 x 0,7 ml

bicin puffer 16% DMSO glicerol < 0,01% rTth DNS polimeráz (rTth pol, mikrobiális) kálium-acetát < 0,001% dATP, dCTP, dGTP, dUTP < 0,005% KY78 és KY80 primerek (egyik biotinilált) < 0,01% AmpErase (uracil-N-glikoziláz) enzim (mikrobiális) 0,05% nátrium-azid

6/42


10/2005, Revision 6.0

Hepatitis C Virus

HCV Mn2+, v2.0 (HCV mangánoldat, 2.0-s verzió)

8 x 0,1 ml

< 2% mangán ecetsav amarántvörös festék 0,05% nátrium-azid HCV DK COBAS AMPLICOR 100 teszt HCV Detection Kit, version 2.0 COBAS AMPLICOR HCV kimutatási készlet, 2.0-s verzió CX PS1, v2.0 (HCV próba szuszpenzió 1, 2.0-s verzió)

P/N: 21111132 123 ART: 11 1113 2 US: 83130

1 x 100 teszt

MES puffer < 0,4% Dynabeads® szuszpenzió (paramágneses részecskék) HCV-specifikus oligonukleotid capture próbával (KY150) fedve 0,09% nátrium-azid CX4, v2.0 (HCV próba szuszpenzió 2, 2.0-s verzió)

1 x 100 teszt

nátrium-foszfát puffer < 0,2% oldószer 42,2% nátrium-tiocianát 42,2% (w/w) nátrium-tiocianát

+

Xn

Ártalmas

COBAS AMPLICOR 100 teszt DK Detection Reagents Kit COBAS AMPLICOR kimutatási reagensek készlete DN4 (denaturáló oldat)

P/N: 20757470 122 ART: 07 5747 0 US: 83276 1 x 100 teszt

1,6% nátrium-hidroxid EDTA timolkék 1,6% (w/w) nátrium-hidroxid

+

Xi

Irritatív

CN4 (avidin-tormaperoxidáz konjugátum)

1 × 100 teszt

trisz-HCl puffer < 0,001% avidin-tormaperoxidáz konjugátum marha-szérumalbumin (emlős) Emulsit 25 (Dai-ichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.) 0,1% fenol 1% ProClin 150

10/2005, Revision 6.0


7/42

SB3 (szubsztrát A)

5 x 75 teszt

citrátoldat 0,01% hidrogén-peroxid 0,1% ProClin 150 SB (szubsztrát B)

5 x 5 ml

0,1% 3,3',5,5'-tetrametil-benzidin (TMB) 40% dimetil-formamid (DMF) T

40% (w/w) dimetil-formamid (DMF)

Mérgező R: 61-20/21-36

A születendő gyermekre ártalmas lehet. Belélegezve és bőrrel érintkezve ártalmas. Szemizgató hatású.

S: 53-45

Kerülni kell az expozíciót – használata előtt szerezze be a külön használati utasítást. Baleset vagy rosszullét esetén azonnal orvoshoz kell fordulni. Ha lehetséges, a címkét meg kell mutatni.

CN4 COBAS AMPLICOR 200 teszt Conjugate Detection Reagent COBAS AMPLICOR konjugátum kimutatási reagens CN4 (avidin-tormaperoxidáz konjugátum)

P/N: 20764213 123 ART: 07 6421 3 US: 83305 2 x 100 teszt

trisz-HCl puffer < 0,001% avidin-tormaperoxidáz konjugátum marha-szérumalbumin (emlős) Emulsit 25 (Dai-ichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.) 0,1% fenol 1% ProClin 150 WB COBAS AMPLICOR Wash Buffer COBAS AMPLICOR mosópuffer WB (10X-mosókoncentrátum)

500 teszt

P/N: 20759899 123 ART: 07 5989 9 US: 83314 2 x 250 teszt

< 2% foszfátpuffer < 9% nátrium-klorid EDTA < 2% detergens 0,5% ProClin 300

8/42


10/2005, Revision 6.0

Hepatitis C Virus

Figyelmeztetések és óvintézkedések In vitro diagnosztikai célra. Csak EDTA vagy ACD véralvadásgátlókkal gyűjtött szérum- vagy plazmamintákhoz. A heparinról kimutatták, hogy gátolja a PCR-t, ezért tilos a használata. Ne pipettázzon szájjal. Ne egyen, igyon vagy dohányozzon a laboratórium területén. Viseljen egyszer használatos védőkesztyűt, védőruhát és szemvédőt a minták és a készlet reagensei kezelése közben. A minták és a tesztreagensek kezelését követően gondosan mosson kezet. A reagensflakonokból való anyagkivétel során kerülje el a reagensek mikrobiális és ribonukleáz-szennyezését. Steril egyszer használatos pipetták és RNáz-mentes pipettahegyek használata javasolt. Ne öntsön össze különböző tételekből, vagy azonos tételből, de különböző flakonokból származó reagenseket. A fel nem használt reagensek és a hulladék kezelésének összhangban kell lennie a megfelelő országos, szövetségi, állami és helyi szabályozásokkal. Ne használja a készletet a lejárati idő után. Az anyagok biztonsági adatlapjai (MSDS) igény esetén hozzáférhetők a helyi Roche-irodában. A laboratóriumi munkafolyamatnak egyirányú módon kell zajlania, kezdve a preamplifikálási területtől a posztamplifikálási (amplifikálási/kimutatási) területig haladva. A preamplifikálási műveleteket a reagens-előkészítéssel kell kezdeni, és a minta-előkészítéssel folytatni. Valamennyi preamplifikálási művelethez tartozó felszerelést és eszközt jelölni kell, és tilos használni más művelethez vagy más munkaterületre átvinni. Valamennyi munkaterületen kesztyűt kell viselni, és a terület elhagyása előtt le kell venni. A reagens-előkészítéshez használt felszerelést és eszközöket tilos használni minta-előkészítési műveletekhez, amplifikált DNS vagy más target DNS-forrás pipettázásához vagy feldolgozásához. A posztamplifikálási műveletekhez tartozó felszerelést és eszközöket mindenkor a posztamplifikálási munkaterületen kell tartani. A mintákat fertőzőként kell kezelni a Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories21 és az CLSI Dokumentum M29-A22 előírásoknak megfelelő biztonságos laboratóriumi eljárásokat alkalmazva. Gondosan tisztítson meg, és ioncserélt vagy desztillált vízzel frissen készített 0,5% nátrium-hipoklorit oldattal fertőtlenítsen minden munkaterületet. Megjegyzés

10/2005, Revision 6.0

A kereskedelemben kapható háztartási fehérítő rendszerint 5,25%-ban tartalmaz nátrium-hipokloritot. 1:10 arányban hígított háztartási fehérítő megfelel 0,5% nátrium-hipoklorit oldatnak.


9/42

FIGYELEM: A készlet tartalmaz olyan összetevőt (NHP), amely humán vérből származik. A forrásanyag US FDA által engedélyezett tesztekkel vizsgálva nem bizonyult reaktívnak HCV-antitestre, HIV-1/2 antitestre, HIV p24 antigénre és Hepatitis B surface antigénre (HBsAg). A negatív humán plazma PCR-technikával történő vizsgálata során HIV-1 RNS, HCV RNS vagy HBV DNS nem volt kimutatható. Egyetlen vizsgálati módszer sem nyújthat teljes garanciát arra, hogy a humán vérkészítményekben nincs jelen fertőző anyag. Emiatt minden humán eredetű anyagot potenciálisan fertőzőnek kell tekinteni. Az NHP fertőzőként kezelendő a Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories21 és az CLSI Dokumentum M29-A22 előírásoknak megfelelő biztonságos laboratóriumi eljárásokat alkalmazva. Gondosan tisztítson meg, és ioncserélt vagy desztillált vízzel frissen készített 0,5% nátrium-hipoklorit oldattal fertőtlenítsen minden munkaterületet. A HCV IC, v2.0; HCV DIL, v2.0; HCV MMX, v2.0; HCV Mn2+, v2.0; HCV (–) C, v2.0; HCV (+) C, v2.0 és CX PS1, v2.0 nátrium-azidot tartalmaz. A nátrium-azid ólom- és rézcsövekkel erősen robbanékony fém-azidokat képezve reakcióba léphet. Amikor nátrium-azid tartalmú oldatokat önt ki a laboratóriumi mosogatóba, az azidlerakódás megakadályozására nagy mennyiségű vízzel öblítse ki a lefolyót. Viseljen szemvédőt, laboratóriumi védőruhát és egyszer használatos védőkesztyűt a következő anyagok kezelése során: HCV LYS, v2.0; HCV MMX, v2.0; CX4, v2.0, DN4, CN4, SB3, SB és szubsztrát munkareagens (kevert SB3 és SB reagens). Ezen anyagok bőrrel, szemmel és nyálkahártyákkal való érintkezése kerülendő. Ha mégis előfordul érintkezés, azonnal mossa le nagy mennyiségű vízzel. Ellenkező esetben égő érzés előfordulhat. Ezen reagensek kiömlése esetén szárazra törlés előtt vízzel hígítsa. Az SB vagy a szubsztrát munkareagens bőrrel vagy nyálkahártyával való érintkezése kerülendő. Ha előfordul bőrrel való érintkezés, azonnal mossa le nagy mennyiségű vízzel. Az SB és a szubsztrát munkareagens dimetil-formamidot tartalmaz, amelyről ismert, hogy nagy orális adagban mérgező, továbbá a születendő gyermekre nézve ártalmas hatású lehet. A bőrrel való érintkezést, a gőzök belégzését és az anyag lenyelését el kell kerülni. Ha mégis előfordul a bőrrel érintkezés, gondosan mossa le szappanos vízzel, és azonnal forduljon orvoshoz. Ügyeljen rá, hogy a HCV LYS, v2.0, amely guanidin-tiocianátot tartalmaz, vagy a CX4, v2.0, amely nátrium-tiocianátot tartalmaz ne kerüljön kapcsolatba nátriumhipoklorit (fehérítő) oldattal. Az ilyen keverékből erősen mérgező gáz fejlődhet. A minták kiloccsanását és keresztszennyeződését megelőzendő a minta- és a kontrollelőkészítéshez csavarókupakos csöveket kell használni. Ne használjon pattintókupakos csöveket.

10/42


10/2005, Revision 6.0

Hepatitis C Virus

Tárolási és kezelési követelmények A reagenseket tilos lefagyasztani. A HCV LYS, v2.0, HCV DIL, v2.0 és HCV IC, v2.0 2–8 °C-on tárolandók. Felbontás nélkül ezek a reagensek a jelölt lejárati dátumig stabilak. Felbontást követően a fel nem használt részt ki kell dobni. 2–8 °C-on való tárolás során a HCV LYS, v2.0 reagensben csapadék képződik. Felhasználást megelőzően melegítse 25–37 °C-ra, és a csapadék feloldása céljából erőteljesen keverje az oldatot. Maximum 30 percig melegítse a HCV LYS, v2.0 reagenst, azután keverje erőteljesen, amíg a kristályok feloldódnak. Használatot megelőzően fehér háttér előtt vizsgáljon meg minden egyes HCV LYS, v2.0 üveget, hogy nem ereszt-e, vagy nincs-e sárgásan elszíneződve. Sárgás elszíneződés vagy szivárgás esetén az üveget ne használja fel. Csere céljából lépjen kapcsolatba a helyi Rocheirodával. Felbontást követően a fel nem használt részt ki kell dobni. A roncsoló munkareagenst (HCV IC, v2.0 reagenst adva a HCV LYS, v2.0 reagenshez) szobahőmérsékleten kell tárolni, és az elkészítést követően 8 órán belül fel kell használni. A HCV MMX, v2.0 és HCV Mn2+, v2.0 2–8 °C-on tárolandók. Ezek a reagensek a jelölt lejárati dátumig stabilak. Felbontást követően a fel nem használt részt ki kell dobni. A master mix munkareagenst (HCV Mn2+, v2.0 reagenst adva a HCV MMX, v2.0 reagenshez) 2–8 °C-on kell tárolni, és az elkészítést követően 4 órán belül fel kell használni. A NHP, HCV (–) C, v2.0 és HCV (+) C, v2.0 2–8 °C-on tárolandók. Ezek a reagensek a jelölt lejárati dátumig stabilak. Felbontást követően a fel nem használt részt ki kell dobni. A CX PS1, v2.0 és CX4, v2.0 2–8 °C-on tárolandók. Ezek a reagensek a jelölt lejárati dátumig stabilak. A CX PS1, v2.0 és a CX4, v2.0 összekeverése után a munkareagens 30 napig stabil 2–8 °C-on. A munkareagenst legfeljebb hat gépi cikluson keresztül lehet használni (12 óra ciklusonként), és a gépi ciklusok között 2–8 °C-on kell tárolni. A DN4 2–25 °C között tárolandó. A DN4 a jelölt lejárati dátumig stabil. Felbontást követően a DN4 2–8 °C-on 30 napig vagy a lejárati dátumig stabil, amelyik előbb következik. A DN4-et legfeljebb hat gépi cikluson keresztül lehet használni (12 óra ciklusonként), és a gépi ciklusok között 2–8 °C-on kell tárolni. A CN4 2–8 °C-on tárolandó. A CN4 a jelölt lejárati dátumig stabil. Felbontást követően a CN4 2–8 °C-on 30 napig vagy a lejárati dátumig stabil, amelyik előbb következik. A CN4-et legfeljebb hat gépi cikluson keresztül lehet használni (12 óra ciklusonként), és a gépi ciklusok között 2–8 °C-on kell tárolni. Az SB3 és SB 2–8 °C-on tárolandó. Felbontás nélkül ezek a reagensek a jelölt lejárati dátumokig stabilak. A szubsztrát munkareagenst minden nap el kell készíteni az SB3 és az SB összekeverésével. A szubsztrát munkareagens a COBAS AMPLICOR készülékben 16 óráig stabil. Az SB3-t, SB-t vagy a szubsztrát munkareagenst ne tegye ki fémeknek, oxidáló anyagoknak vagy direkt fénynek. A WB 2–30 °C között tárolandó. A WB a jelölt lejárati dátumig stabil. A WB oldatot hígítás előtt vizsgálja meg, és szükség esetén a csapadék visszaoldására melegítse 30–37 °C-ra. A WB desztillált vagy ioncserélt vízzel való 1:10 hígításával készített mosó munkapuffer (1X) 2–25 °C-on, a COBAS AMPLICOR mosópuffertartályában tárolandó, és az elkészítéstől számított 2 hétig stabil.

10/2005, Revision 6.0


11/42

A részben felhasznált kimutatási reagensek 2–8 °C-on tárolandók két gépi ciklus között. Ellenőrizze a felbontott reagensek, illetve a munkareagens lejárati idejét a COBAS AMPLICOR készülékbe betöltés előtt.

A készlet tartalma AMPLICOR HCV HCV PREP Specimen Preparation Kit, version 2.0 AMPLICOR HCV minta-előkészítő készlet, 2.0-s verzió

P/N: 21111086 123 ART: 11 1108 6 US: 83126

HCV LYS, v2.0 (HCV roncsoló reagens, 2.0-s verzió) HCV DIL, v2.0 (HCV mintaoldószer, 2.0-s verzió) HCV IC, v2.0 (HCV belső kontroll, 2.0-s verzió) HCV CTL AMPLICOR HCV Controls Kit, version 2.0 AMPLICOR HCV kontrollkészlet, 2.0-s verzió

P/N: 21111175 123 ART: 11 1117 5 US: 83131

NHP [Negatív plazma (humán)] HCV (–) C, v2.0 [HCV (–) kontroll, 2.0-s verzió] HCV (+) C, v2.0 [HCV (+) kontroll, 2.0-s verzió] AMPLICOR HCV HCV AMP Amplification Kit, version 2.0 AMPLICOR HCV amplifikáló készlet, 2.0-s verzió

P/N: 21111094 123 ART: 11 1109 4 US: 83127

HCV MMX, v2.0 (HCV master mix, 2.0-s verzió) HCV Mn2+, v2.0 (HCV mangánoldat, 2.0-s verzió) HCV DK COBAS AMPLICOR HCV Detection Kit, version 2.0 COBAS AMPLICOR HCV Kimutatási készlet, 2.0-s verzió

P/N: 21111132 123 ART: 11 1113 2 US: 83130

CX PS1, v2.0 (HCV próba szuszpenzió 1, 2.0-s verzió) CX4, v2.0 (HCV próba szuszpenzió 2, 2.0-s verzió)

12/42


10/2005, Revision 6.0

Hepatitis C Virus

COBAS AMPLICOR DK Detection Reagents Kit COBAS AMPLICOR kimutatási reagensek készlete

P/N: 20757470 122 ART: 07 5747 0 US: 83276

DN4 (denaturáló oldat) CN4 (avidin-tormaperoxidáz konjugátum) SB3 (szubsztrát A) SB (szubsztrát B) COBAS AMPLICOR CN4 Conjugate Detection Reagent COBAS AMPLICOR konjugátum kimutatási reagens

P/N: 20764213 123 ART: 07 6421 3 US: 83305

CN4 (avidin-tormaperoxidáz konjugátum) COBAS AMPLICOR Wash Buffer COBAS AMPLICOR mosópuffer

WB

P/N: 20759899 123 ART: 07 5989 9 US: 83314

WB (10X-mosókoncentrátum)

Szükséges, de nem biztosított anyagok Preamplifikálás – Reagens-előkészítő terület –

COBAS AMPLICOR A-gyűrű 12 A-csövekkel ellátva (ART: 10 4563 6; P/N: 21045636001)

–

COBAS AMPLICOR A-gyűrűtartó

–

Műanyag újrazárható tasak

–

Eppendorf Multipette® pipetta 1,25 ml Combitip® tartóval (steril, egyenként csomagolt)

–

Pipettahegyek (kapacitás 50 µl és 100 µl)* aeroszolbarrierrel vagy pozitív kiszorításos RNáz-mentes hegyek

–

Egyszer használatos kesztyűk, púdermentes

Preamplifikálás – Minta- és kontroll-előkészítő terület

10/2005, Revision 6.0

–

1,5 ml polipropilén csavarókupakos csövek, steril, nem szilikonozott, kúpos (Sarstedt 72.692.005 vagy ekvivalens)**

–

Csőállvány (Sarstedt 93.1428 vagy ekvivalens)

–

95% etanol, reagens minőség molekuláris biológiai vagy szövettani használatra (desztillált vagy ioncserélt vízzel frissen hígítva 70%-ra)

–

Izopropil-alkohol, reagens minőség

–

Steril, finomhegyű átvivőpipetták, RNáz-mentes

–

Steril, egyszer használatos, polisztirol szerológiai pipetták (5 ml, 10 ml és 25 ml)


13/42

–

Pipettahegyek (kapacitás 20 µl, 50 µl, 100 µl, 200 µl, 400 µl, 600 µl és 1000 µl)* aeroszolbarrierrel vagy pozitív kiszorításos RNáz-mentes hegyek

–

Mikrocentrifuga (max. RCF 16 000 × g, min. RCF 12 500 × g); Eppendorf 5415C, HERMLE Z230M vagy ekvivalens

–

Vortex keverő

–

60 °C ± 2 °C szárazfűtőblokk

–


Posztamplifikálás – Amplifikálási/Kimutatási terület –

COBAS AMPLICOR Analizátor és nyomtató

–

Felhasználói kézikönyv a COBAS AMPLICOR Analizátorhoz

–

COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 módszertani kézikönyv

–

D-cső állványok (ART: 10 4564 4: P/N: 21045644001)

–

Desztillált vagy ioncserélt víz

–

5 ml szerológiai pipetták

–


*

Pipetták pontossága a névleges térfogat 3%-án belül legyen. Aeroszolbarrieres vagy pozitív kiszorításos RNáz-mentes pipettahegyeket kell használni ott, ahol alapvető megelőzni a minta és az amplikon keresztszennyeződését.

** A minták és kontrollok kiloccsanását és keresztszennyeződését megelőzendő a minta és a kontroll előkészítéshez csavarókupakos csöveket kell használni. Ne használjon pattintókupakos csöveket.

A minta levétele, transzportja és tárolása Megjegyzés

Valamennyi mintát fertőzések átvitelére alkalmasként kell kezelni.

A minta levétele

A COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 kizárólag szérum- vagy plazmamintákhoz való használatra alkalmas. A vért SST® szérumvételező csövekbe vagy EDTA (levendulakék kupak), illetve ACD (sárga kupak) véralvadásgátlót tartalmazó steril csövekbe kell levenni. A heparinnal alvadásgátolt minták nem megfelelőek erre a vizsgálatra. A vért ne hagyja 2–25 °C-on 6 óránál tovább. A szérumot vagy a plazmát a levételtől számított 6 órán belül szeparálja el a teljes vérből centrifugálással (1500 × g, 20 perc, szobahőmérséklet). Vigye át a szérumot vagy a plazmát egy steril polipropilén csőben.

A minta transzportja

A teljes vér, szérum vagy plazma transzportja meg kell feleljen a kóroki ágensek transzportjára vonatkozó országos, szövetségi, állami és helyi szabályozásoknak23. A teljes vér 2–25 °C-on transzportálandó, és a levételtől számított 6 órán belül fel kell dolgozni. A szérum vagy a plazma 2–8 °C-on vagy -70 °C alá fagyasztva transzportálandó, és az alább részletezett időkorlátokon belül fel kell dolgozni.

A minta tárolása

A szérum és az EDTA-s plazma 2–8 °C-on 72 óráig, vagy fagyasztva -70 °C alatt tárolható. A minták tárolása 1,5 ml polipropilén csavarókupakos csövekben (pl. Sarstedt 72.692.105) 250–300 µl részletekben javasolt. A szérum- és plazmaminták két alkalommal fagyaszthatóak le és olvaszthatóak fel.

14/42


10/2005, Revision 6.0

Hepatitis C Virus

Használati utasítás Megjegyzés

A részletes használati utasításokat illetően lásd a COBAS AMPLICOR Analizátor Felhasználói kézikönyvét.

Megjegyzés

Felhasználás előtt valamennyi reagensnek szobahőmérsékletűnek kell lennie. A vizsgálati eljárás megkezdése előtt a reagenseket vizsgálja meg, hogy elégséges térfogatuk áll-e rendelkezésre.

Megjegyzés

Felhasználás előtt a szérum- és plazmamintáknak szobahőmérsékletűnek kell lennie.

Megjegyzés

Használjon aeroszolbarrieres pipettákat vagy pozitív kiszorításos hegyeket, ahol indokolt. A szelektív amplifikálás érdekében rendkívüli gondossággal járjon el.

Megjegyzés

A minták és kontrollok kiloccsanását és keresztszennyeződését megelőzendő a minta és a kontroll előkészítéshez csavarókupakos csöveket kell használni. Ne használjon pattintókupakos csöveket.

Futtatási mennyiség

Valamennyi készlet elegendő reagenst tartalmaz nyolc darab 12 mintás futtatáshoz, amelyek kivitelezhetőek külön-külön vagy párhuzamosan. Valamennyi futtatásnak legalább egy AMPLICOR HCV (–) kontrollt és egy AMPLICOR HCV (+) kontrollt kell tartalmaznia (lásd „Minőség-ellenőrzés”). A minta-előkészítő és az amplifikálási reagensek 12 tesztre elegendő egyszer használatos üvegekben vannak. A HCV (–) és HCV (+) kontrollok egyszer használatos ampullákban vannak. A reagensek leghatékonyabb felhasználása céljából a mintákat és a kontrollokat 12 többszörösének megfelelő tételekben kell feldolgozni.

Munkafolyamat

A COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 egy vagy két nap alatt végezhető el. Ha a vizsgálatot egyetlen munkanap alatt kell elvégezni, kövesse sorban az utasításokat a Reagens előkészítése, Minta és kontroll előkészítése, Reverz transzkripció, Amplifikálás és Kimutatás lépéseknek megfelelően. A vizsgálat két nap alatt végezhető el, ha az 1. nap a Minta és kontroll előkészítése lépést végzi, majd a 2. nap folytatja a Reagens előkészítése, Reverz transzkripció, Amplifikálás és Kimutatás lépésekkel, vagy az 1. nap a Minta és kontroll előkészítése, Reverz transzkripció és Amplifikálás lépéseket végzi el, majd a 2. nap a Kimutatást. Ha a minta és kontroll előkészítését az 1. napon, a reverz transzkripciót, amplifikálást és kimutatást pedig a 2. napon kívánja elvégezni, akkor csinálja meg a Minta és kontroll előkészítést (1–15. lépés), és tárolja a feldolgozott mintákat és kontrollokat a 15. lépésben leírtaknak megfelelően. A 2. napon kezdje a Reagens előkészítése lépéssel, azután olvassza fel a mintákat és kontrollokat szobahőmérsékleten, majd folytassa a Minta és kontroll előkészítéssel (16. lépés), a Reverz transzkripció, Amplifikálás és Kimutatás lépésekkel. Ha a minta és kontroll előkészítését, reverz transzkripciót és amplifikálást az 1. napon kívánja elvégezni, akkor kövesse a Reagens előkészítése és Minta és kontroll előkészítése lépéseket. Programozza a COBAS AMPLICOR készüléket Parallel (párhuzamos) módba, és végezze el az amplifikálási lépéseket (a részletes utasításokat illetően lásd a COBAS AMPLICOR készülék Felhasználói kézikönyvét). Tárolja a denaturált amplikonokat egy éjszakán át 2–8 °C-on, majd folytassa a Kimutatás lépéssel a 2. napon.

10/2005, Revision 6.0


15/42

Reagens előkészítése

Munkaterület: Preamplifikálás – Reagens-előkészítő terület 1. Határozza meg a beteg minta- és a kontrollvizsgálatokhoz szükséges A-gyűrű(k) számát. Helyezze az A-gyűrű(ke)t az A-gyűrűtartóba. 2.

Készítse el a master mix munkareagenst 100 µl HCV Mn2+, v2.0 egy ampulla HCV MMX, v2.0 reagenshez való hozzáadásával. A master mix térfogatát nem szükséges megmérnie. Mérjen 100 µl HCV Mn2+, v2.0 oldatot egy teljes ampulla HCV MMX, v2.0 reagenshez. Csavarja rá a kupakot, majd a cső 10–15-szöri fordítgatásával keverje jól össze az oldatokat. A master mix munkareagenst ne vortexelje. A HCV Mn2+, v2.0 rózsaszín színe alkalmas, hogy meggyőződjön róla, hogy a HCV Mn2+, v2.0 oldatot a HCV MMX, v2.0 reagenshez adta. A maradék HCV Mn2+, v2.0 oldatot dobja ki. A master mix munkareagens 2–8 °C-on tárolandó, és az elkészítést követő 4 órán belül fel kell használni.

3.

Mérjen valamennyi A-csőbe 50 µl master mix munkareagenst ismétlő pipettával vagy aeroszolbarrierrel vagy pozitív kiszorításos heggyel ellátott pipettával. Ezután ne zárja le az A-csöve(ke)t.

4.

Helyezze a master mix munkareagenst tartalmazó A-gyűrű(ke)t egy újrazárható műanyag tasakba, és gondosan zárja le a tasakot. Az A-gyűrű(ke)t vigye át a Preamplifikálás – Minta- és kontroll-előkészítő területre. A minta és kontroll előkészítése befejezéséig tárolja a master mix reagenst tartalmazó A-gyűrű(ke)t 2–8 °C-on a Preamplifikálás – Minta- és kontroll-előkészítő területen. A master mix munkareagens az A-csövekben lezárt műanyag tasakban 2–8 °C-on 4 óra hosszat stabil.

Minta és kontroll előkészítése

Munkaterület: Preamplifikálás – Minta- és kontroll-előkészítő terület

Megjegyzés

Korábban előkészített minták és kontrollok amplifikálásához először a „Reagens előkészítése” szakasz lépéseit végezze el. Olvassza fel a mintákat és a kontrollokat szobahőmérsékleten, majd folytassa a „Minta és kontroll előkészítése”, 16. lépéssel.

Megjegyzés

Használatot megelőzően fehér háttér előtt vizsgáljon meg minden egyes HCV LYS, v2.0 üveget, hogy nem ereszt-e, vagy nincs-e sárgásan elszíneződve. Sárgás elszíneződés vagy szivárgás esetén az üveget ne használja fel. Csere céljából lépjen kapcsolatba a helyi Roche-irodával.

Megjegyzés

2–8 °C-on való tárolás során a HCV LYS, v2.0 reagensben csapadék képződik. Felhasználást megelőzően melegítse 25–37 °C-ra maximum 30 percig, és a csapadék feloldása céljából erőteljesen keverje az oldatot.

Megjegyzés

16/42

1.

Készítsen 70%-os etanolt. 12 teszthez: keverjen össze 11,0 ml 95%-os etanolt és 4,0 ml ioncserélt vagy desztillált vizet.

2.

Címkézzen meg egy-egy 1,5 ml-es csavarókupakos csövet minden egyes betegmintához és további két csövet, mint „HCV (–) C” és „HCV (+) C”.

3.

Készítsen roncsoló munkareagenst. Használat előtt vortexelje a HCV IC, v2.0 oldatot 5–10 másodpercig. Minden egyes legfeljebb 12 mintát és kontrollt tartalmazó tételre számolva, mérjen 100 µl HCV IC, v2.0 oldatot egy üveg HCV LYS, v2.0 reagenshez, és keverje össze jól. A HCV LYS, v2.0 térfogatát nem szükséges megmérnie.

A HCV IC, v2.0 oldatot hozzá kell adni a HCV LYS, v2.0 reagenshez akkor is, ha a HCV belső kontrollt nem fogják kimutatni. A maradék HCV IC, v2.0 oldatot dobja ki. A roncsoló munkareagens szobahőmérsékleten 8 óra hosszat stabil.


10/2005, Revision 6.0

Hepatitis C Virus

Megjegyzés

Fagyasztott minták használatakor olvassza fel a mintákat szobahőmérsékleten, majd vortexelje őket 3-5 másodpercig. A mintának a cső aljába gyűjtéséhez a csövet rövid időre tegye centrifugába. A mintákkal való munka során ügyeljen a kesztyűk szennyezésének elkerülésére. 4.

Mérjen 400 µl roncsoló munkareagenst minden egyes megcímkézett csőbe, és csavarja a csövekre a kupakokat.

5.

Készítse el a kontrollokat a következők szerint: – Vortexelje az NHP, HCV (–) C, v2.0 és HCV (+) C, v2.0 reagenseket legalább 5–10 másodpercig. – Mérjen 200 µl NHP-t a két kontrollcső mindegyikébe. Csavarja a csövekre a kupakokat, és vortexelje őket legalább 3–5 másodpercig. – Mérjen 20 µl HCV (–) C, v2.0-t a roncsoló munkareagenst és NHP-t tartalmazó „HCV (–) C” címkézésű csőbe. Csavarja a csőre a kupakot, és vortexelje legalább 3–5 másodpercig. – Mérjen 20 µl HCV (+) C, v2.0-t a roncsoló munkareagenst és NHP-t tartalmazó „HCV (+) C” címkézésű csőbe. Csavarja a csőre a kupakot, és vortexelje legalább 3–5 másodpercig.

6.

Mérjen minden egyes beteg mintából 200 µl-t a megfelelően címkézett roncsoló munkareagenst tartalmazó csőbe. Csavarja a csövekre a kupakokat, és vortexelje őket legalább 3–5 másodpercig.

7.

Inkubálja a minta- és kontrollcsöveket egy szárazfűtőblokkban 60 °C ± 2 °C-on 10 percig. Azután vortexelje őket legalább 10 másodpercig.

8.

Vegye le a kupakokat, és mérjen 600 µl 100% izopropil-alkoholt (szobahőmérsékleten) mindegyik csőbe. Csavarja újra a csövekre a kupakokat, és vortexelje őket legalább 3–5 másodpercig. Inkubálja a csöveket 2 percig szobahőmérsékleten.

9.

Tegyen egy orientációs jelzést valamennyi csőre, majd helyezze a csöveket a mikrocentrifugába úgy, hogy az orientációs jelzés kifelé nézzen, vagyis az üledék a jelzésnek megfelelően helyezkedjen majd el. Centrifugálja le a mintákat és a kontrollokat szobahőmérsékleten maximum sebességen (12 500–16 000 × g) 15 percig.

10. Minden egyes csőhöz új finom hegyű transzferpipettát használva óvatosan távolítsa el és dobja ki a felülúszót minden csőből, ügyeljen rá, hogy ne zavarja fel az üledéket (amely esetleg nem is látható). Távolítsa el a lehető legtöbb folyadékot anélkül, hogy felzavarná az üledéket. A felülúszót lassan szívja ki, lehetőséget adva a folyadéknak, hogy teljesen leszivárogjon a cső faláról. Ne használjon vákuum szívót. 11. Mérjen be 1,0 ml 70%-os etanolt (szobahőmérsékleten) mindegyik csőbe, csavarja vissza a kupakokat, és vortexelje őket legalább 3–5 másodpercig. 12. Helyezze a csöveket a mikrocentrifugába az orientációs jelzésekkel kifelé, és centrifugálja a csöveket szobahőmérsékleten maximum sebességen (12 500–16 000 × g) 5 percig. 13. Minden egyes csőhöz új finom hegyű átvivőpipettát használva óvatosan távolítsa el és dobja ki a felülúszót az üledék felzavarása nélkül. Az üledék ebben a lépésben tisztán látható. Távolítsa el a lehető legtöbb felülúszót.

10/2005, Revision 6.0


17/42

14. Csavarja vissza a csövekre a kupakokat, és centrifugálja őket maximum sebességen 3–5 másodpercig. Minden egyes csőhöz új hegyet használva egy 200 µl-es pipettával óvatosan távolítsa el a felülúszót anélkül, hogy felzavarná az üledéket. Az üledék ebben a lépésben tisztán látható. Távolítsa el a lehető legtöbb felülúszót. Az etanolmaradványok gátolhatják az amplifikálást. 15. Mérjen be 200 µl HCV DIL, v2.0-t mindegyik csőbe. Egy aeroszolbarrierrel ellátott hegyű 200 µl-es pipettával a lehető legjobban zavarja fel az üledéket. Csavarja vissza a csövekre a kupakokat. Vortexelje őket erőteljesen 10 másodpercig. Némi oldhatatlan anyag visszamaradhat. Amplifikálja a feldolgozott mintákat és kontrollokat az előkészítéstől számított 3 órán belül, vagy tárolja őket -70 °C-ra vagy az alá fagyasztva maximum egy hónapig, legfeljebb kétszeri fagyasztás/olvasztás mellett. Több, mint két fagyasztás/olvasztás ciklus a HCV vagy a HCV belső kontroll jelének elvesztését eredményezheti. Megjegyzés

Fagyasztva tárolt minták és kontrollok használatakor az amplifikálást megelőzően olvassza fel a mintákat szobahőmérsékleten, majd vortexelje őket 5 másodpercig mielőtt a 16. lépéssel folytatná. 16. Mérjen aeroszolbarrierrel vagy pozitív kiszorításos heggyel ellátott mikropipettával minden egyes beteg mintából és kontrollból 50 µl-t a megfelelő, master mix munkareagenst tartalmazó A-csőbe. Használjon új hegyet minden egyes mintához és kontrollhoz. Ügyeljen arra, hogy ne vigyen át semminemű csapadékos anyagot, amely nem ment vissza oldatba. Csavarja az A-csövekre a kupakokat. 17. Jegyezze fel az A-gyűrűkben levő kontrollok és minták helyzetét. Az amplifikálást a mintáknak és kontrolloknak a master mix munkareagenst tartalmazó A-csövekhez adásától számított 45 percen belül meg kell kezdeni. Vigye át az A-gyűrűkben lévő előkészített mintákat és kontrollokat az amplifikálási/kimutatási területre. A feldolgozott minták és kontrollok maradéka -70 °C-ra vagy az alá fagyasztva legfeljebb egy hónapig tárolható. A feldolgozott minták legfeljebb két alkalommal fagyaszthatóak le és olvaszthatóak fel. Több, mint két fagyasztás/olvasztás ciklus HCV RNSveszteséget eredményezhet.

Reverz transzkripció, Amplifikálás és Kimutatás

18/42

Munkaterület: Posztamplifikálás – Amplifikálási/Kimutatási terület Végezzen napi eszközkarbantartást a COBAS AMPLICOR Analizátor Felhasználói kézikönyvében leírtaknak megfelelően: –

Törölje le az indítóhelyet szálmentes nedves ruhával, és szárítsa meg.

–

Törölje le a D-csőtartó hegyet szálmentes nedves ruhával, és szárítsa meg.

–

Ellenőrizze a mosópuffertartályt, és ha szükséges, töltse fel.

–

Készítse el a mosó munkapuffert (1X) a következők szerint: A WB oldatot vizsgálja meg, és szükség esetén a csapadék visszaoldására melegítse 30–37 °C-ra. Adjon 1 térfogatrész WB oldatot 9 térfogatrész ioncserélt vagy desztillált vízhez. Keverje jól össze. Mindig tartson legalább 3–4 liter mosó munkapuffert (1X) a készülék mosópuffertartályában.

–

Ürítse ki a hulladéktárolót.

–

Indítsa be a készüléket.

–

A beindítás során ellenőrizze a fecskendőket és a csövezést.

–

A beindítás során ellenőrizze a transzferhegyet.


10/2005, Revision 6.0

Hepatitis C Virus

Minden egyes futtatás előtt –

Ellenőrizze a hulladéktárolót, és ürítse ki, ha szükséges.

–

Ellenőrizze a mosópuffertartályt, és ha szükséges, töltsön hozzá puffert.

–

Cserélje ki a használt D-cső állványokat.

–

Indítsa be a készüléket.

Eszköz feltöltése és a rendszer működtetése 1.

Vizsgálja meg az asztali reagensek mennyiségeit a COBAS AMPLICOR készüléken. Készítsen elegendő reagenskazettát a műveletekhez való feltöltéshez.

2.

Vortexelje jól össze a CX PS1, v2.0 szuszpenziót. Mérjen 2,5 ml CX PS1, v2.0 szuszpenziót egy CX4, v2.0 kazettába. Helyezze a kazettát a tesztspecifikus reagensállványra. Dobja ki a használt CX PS1, v2.0 ampullát. Jegyezze fel a reagens készítési dátumát a CX4, v2.0 kazettára.

3.

HCV belső kontroll kimutatásakor vortexelje az IC PS1 szuszpenziót jól össze. Mérjen 2,5 ml IC PS1 szuszpenziót egy IC4 kazettába. Helyezze a kazettát a tesztspecifikus reagensállványra. Dobja ki a használt IC PS1 ampullát. Jegyezze fel a reagens készítési dátumát az IC4 kazettára.

4.

Készítsen 5 ml SB egy SB3 kazettába való pipettázásával szubsztrát munkareagenst. Fel-le pipettázással keverje össze. Dobja ki az üres SB ampullát. Jegyezze fel a reagens készítési dátumát az SB3 kazettára.

5.

Helyezze a szubsztrát munkareagenst a generikus reagensállványba.

6.

Helyezze a DN4 és CN4 kazettákat a generikus reagensállványba. Jegyezze fel a felnyitás dátumát mindegyik kazettára.

7.

Azonosítsa a reagensállványokat mint generikus vagy tesztspecifikus, a COBAS AMPLICOR készülék Felhasználói kézikönyvében leírtaknak megfelelően, billentyűzet vagy vonalkód-leolvasó segítségével, illetve az AMPLILINK szoftver segítségével, az AMPLILINK szoftver Felhasználói kézikönyvében leírtaknak megfelelően.

8.

Konfigurálja a reagensállványokat a reagenspozícióknak és tételszámoknak a készülékbe való bevitelével a COBAS AMPLICOR készülék Felhasználói kézikönyvében leírtaknak megfelelően, billentyűzet vagy vonalkód-leolvasó segítségével, illetve az AMPLILINK szoftver segítségével, az AMPLILINK szoftver Felhasználói kézikönyvében leírtaknak megfelelően.

9.

Töltse a reagensállványokat a készülékre a COBAS AMPLICOR készülék Felhasználói kézikönyvében leírtaknak megfelelően, billentyűzet vagy vonalkód-leolvasó segítségével, illetve az AMPLILINK szoftver segítségével, az AMPLILINK szoftver Felhasználói kézikönyvében leírtaknak megfelelően. Győződjön meg arról, hogy minden egyes reagenskazetta a jelölt pozíciójában van, és szorosan illeszkedik az állványba.

10. Helyezze a D-cső állványt a D-cső platformra. Egy D-cső szükséges minden egyes kimutatási reakcióhoz, és kettő D-cső szükséges minden egyes szubsztrát munkaoldat kazettához, tekintettel a COBAS AMPLICOR készülék általi kiürítésre.

10/2005, Revision 6.0


19/42

11. Helyezze az A-gyűrű(ke)t készülékszegmense(i)be.

a

COBAS

AMPLICOR

készülék

PCR-

12. Töltse be az A-gyűrű(ke)t a készülékbe a COBAS AMPLICOR készülék Felhasználói kézikönyvében leírtaknak megfelelően, billentyűzet vagy vonalkód-leolvasó segítségével, illetve az AMPLILINK szoftver segítségével, az AMPLILINK szoftver Felhasználói kézikönyvében leírtaknak megfelelően. 13. Készítsen egy A-gyűrű munkalistát a COBAS AMPLICOR Analizátor Felhasználói kézikönyvében leírtaknak megfelelően. 14. Szorosan zárja le a PCR-készülékszegmens(ek) tetejét. 15. Indítsa el a COBAS AMPLICOR készüléket a COBAS AMPLICOR Analizátor Felhasználói kézikönyvben leírtaknak megfelelően. 16. Várja meg, míg a készülék kijelzi, hogy a töltés ellenőrzése megtörtént. Megjegyzés

A COBAS AMPLICOR készülék minden egyes A-cső tartalmának hatszori önálló detektálását teszi lehetővé. A kimutatási reagens szükséges mennyiségét minden esetben a készülék kiszámolja, és minden egyes futtatás kezdetén egy töltésellenőrzés határozza meg, hogy az adott teszthez elegendő reagens áll-e rendelkezésre. 17. A COBAS AMPLICOR készülék a reverz transzkripciót, amplifikálást és kimutatást automatikusan végzi. Az eredmények 660 nm-en mért abszorbancia értékben, valamint Pozitív, Negatív, illetve Bizonytalan megjelöléssel vannak megadva.

20/42


10/2005, Revision 6.0

Hepatitis C Virus

Eredmények Az eredmények értékelése

Belső kontroll kimutatással

Megjegyzés

Az eredmények kinyomtatását, valamint a jelzők és megjegyzések értelmezését illetően lásd a COBAS AMPLICOR készülék Felhasználói kézikönyvét. 1.

Ellenőrizze a kinyomtatott eredménylapon a jelzőket (FLG) és megjegyzéseket, hogy meggyőződjön arról, hogy a futtatás érvényes. Ha a futtatás érvénytelen (invalid), ismételje meg a teljes eljárást (mintaelőkészítés, amplifikálás és kimutatás).

2.

Ha a futtatás érvényes, a minta eredmények az alábbiak szerint értékelendők:

HCV A660 eredmény

HCV IC A660 eredmény

A660

COBAS jelző

A660

COBAS jelző

< 0,15

NEGATIVE

≥ 0,15

POSITIVE

Nincs kimutatott HCV RNS. A negatív eredmény nem zárja ki a HCV-fertőzés jelenlétét, mivel az eredmény a megfelelő mintavételen, a gátlóanyagok hiányán és az elegendő mennyiségű kimutatható RNS jelenlétén is múlik.

< 0,15

NEGATIVE

< 0,15

NEGATIVE

Gátlóanyagot tartalmazó minták. HCV RNS, ha jelen is van, nem kimutatható. Az eredeti minta egy másik részletével ismételje meg a vizsgálatot. A gátlóanyagok gyakran labilisak, és az eredetileg ilyen tartalmú minták az ismétléskor már nem mutatnak gátlást. Ha az eredeti minta nem érhető el, új mintát kell venni.

≥ 1,0

POSITIVE

BÁRMI

BÁRMI

Kimutatott HCV RNS. A minta HCV jelenlétére nézve pozitív.

≥ 0,15, < 1,0

GZ 0.15 – 0.99

BÁRMI

BÁRMI

Bizonytalan. Az eredmények HCV RNS jelenlétére nézve nem meggyőzőek. Ismételje meg két párhuzamos mintával a teljes vizsgálati eljárást betegminta új részletével. Ha a megismételt vizsgálatok egyik vagy mindkét esetben ≥ 0,15 A660 eredményt adnak, a mintát HCV RNS jelenlétére nézve pozitívnak kell tekinteni. Az ismételten vizsgált minták HCV RNS jelenlétére nézve negatívnak tekintendők, ha az eredmények < 0,15 A660 feltéve, ha az IC-eredmények mindkét ismétlés esetén ≥ 0,15 A660.

10/2005, Revision 6.0

Értékelés


21/42

Belső kontroll kimutatása nélkül 1.

Ellenőrizze a kinyomtatott eredménylapon a jelzőket (FLG) és megjegyzéseket, hogy meggyőződjön arról, hogy a futtatás érvényes. Ha a futtatás érvénytelen (invalid), ismételje meg a teljes eljárást (mintaelőkészítés, amplifikálás és kimutatás).

2.

Ha a futtatás érvényes, a minta eredmények az alábbiak szerint értékelendők:

HCV-eredmény A660

COBAS jelző

Értékelés

< 0,15

NEGATIVE

Nincs kimutatott HCV RNS. A negatív eredmény nem zárja ki a HCVfertőzés jelenlétét, mivel az eredmény a megfelelő mintavételen s gátlóanyagok hiányán, és az elegendő mennyiségű kimutatható RNS jelenlétén is múlik.

≥ 1,0

POSITIVE

Kimutatott HCV RNS. A minta HCV jelenlétére nézve pozitív.

≥ 0,15, < 1,0

GZ 0.15 – 0.99

Bizonytalan. Az eredmények HCV RNS jelenlétére nézve nem meggyőzőek. A teljes vizsgálati eljárást ismételje meg a betegminta új részletéből. Ha a megismételt vizsgálatok egyik vagy mindkét esetben ≥ 0,15 A660 eredményt adnak, a mintát HCV RNS jelenlétére nézve pozitívnak kell tekinteni. Az ismételten vizsgált minták HCV RNS jelenlétére nézve negatívnak tekintendők, ha az eredmény < 0,15 A660.

Minőség-ellenőrzés Valamennyi futtatásnak legalább egy AMPLICOR HCV (–) kontrollt és egy AMPLICOR HCV (+) kontrollt kell tartalmaznia. Mint minden új laboratóriumi eljárás esetében a vizsgálatot végző használjon további kontrollokat minden alkalommal, amíg az eljárás kivitelezését nagyfokú megbízhatósággal nem képes elvégezni. Továbbá a belső kontrollt a minta előkészítése során minden egyes mintához hozzá kell adni. Annak végső kimutatása a COBAS AMPLICOR Analizátoron egy javasolt felhasználási lehetőség. Nincsenek követelmények a kontrolloknak az A-gyűrű(k)ben való elhelyezését illetően. Ellenőrizze a kinyomtatott eredménylapon a jelzőket és megjegyzéseket, hogy meggyőződjön arról, hogy a futtatás érvényes. A jelzők és megjegyzések nyomtatását és értelmezését illetően lásd a COBAS AMPLICOR készülék Felhasználói kézikönyvét. A helyi, állami és/vagy szövetségi szabályozások vagy akkreditáló szervezetek által megfogalmazott irányelveknek vagy kívánalmaknak megfelelően további kontrollok vizsgálhatóak. Negatív kontroll

Az AMPLICOR HCV (–) kontrollra a vizsgálat eredménye kisebb kell legyen, mint 0,1 A660. Ha az AMPLICOR HCV (–) kontroll abszorbanciája nagyobb vagy egyenlő, mint 0,1 A660, a teljes futtatás érvénytelen. A teljes eljárást (minta és kontroll előkészítése, reverz transzkripció, amplifikálás és kimutatás) meg kell ismételni. Ha az AMPLICOR HCV (–) kontroll abszorbanciája rendszeresen nagyobb, mint 0,1 A660, kérjen technikai segítséget a helyi Roche-irodától.

Pozitív kontroll

Az AMPLICOR HCV (+) kontrollra a vizsgálat eredménye nagyobb vagy egyenlő kell legyen, mint 1,0 A660. Ha az AMPLICOR HCV (+) kontroll abszorbanciája kisebb, mint 1,0 A660, a teljes futtatás érvénytelen. A teljes eljárást (minta és kontroll előkészítése, reverz transzkripció, amplifikálás és kimutatás) meg kell ismételni. Ha az AMPLICOR HCV (+) kontroll abszorbanciája rendszeresen kisebb, mint 1,0, kérjen technikai segítséget a helyi Roche-irodától.

22/42


10/2005, Revision 6.0

Hepatitis C Virus

Eljárással kapcsolatos óvintézkedések A laboratóriumi munkafolyamatnak egyirányú módon kell zajlania, kezdve a preamplifikálási területtől a posztamplifikálási (amplifikálási/kimutatási) területig haladva. A preamplifikálási műveleteket a reagens-előkészítéssel kell kezdeni, és a minta-előkészítéssel folytatni. Valamennyi preamplifikálási művelethez tartozó felszerelést és eszközt jelölni kell, és tilos használni más művelethez vagy más munkaterületre átvinni. Valamennyi munkaterületen kesztyűt kell viselni, és a terület elhagyása előtt le kell venni. A reagens-előkészítéshez használt felszerelést és eszközöket tilos használni minta-előkészítési műveletekhez, amplifikált DNS vagy más target DNS-forrás pipettázásához vagy feldolgozásához. A posztamplifikálási műveletekhez tartozó felszerelést és eszközöket mindenkor a posztamplifikálási munkaterületen kell tartani. Mint minden vizsgálati eljárásnál, a helyes laboratóriumi technika alapvető a vizsgálat megfelelő kivitelezéséhez. A vizsgálat magas érzékenysége miatt rendkívüli gondossággal kell ügyelni a reagensek, illetve az amplifikálási elegyek tisztaságának megőrzésére. Minden reagens tisztaságát szorosan figyelemmel kell kísérni. Dobjon ki bármilyen gyanús reagenst.

Eljárással kapcsolatos korlátozások A vizsgálatot csak EDTA vagy ACD véralvadásgátlókkal gyűjtött szérum- vagy plazmaminták használatára validálták. Más típusú minták vizsgálata álnegatív vagy álpozitív eredménnyel járhat.

A heparin gátolja a PCR-t; az COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 használata tilos olyan minták esetén, amelyek levételekor alvadásgátlóként heparint használtak. A megbízható eredmény a megfelelő mintalevételen, transzporton, tároláson és feldolgozáson múlik. A HCV kimutatása a mintában jelen lévő víruspartikulumok jelenlététől függ, ezért befolyásolhatják a mintalevételi módszerek, betegfaktorok (azaz kor, tünetek megléte) és/vagy a fertőzés stádiuma. Álnegatív eredmények előfordulhatnak polimerázgátlás miatt. A COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0-hoz HCV belső kontroll lett hozzáadva, hogy lehetővé váljon az olyan feldolgozott minták azonosítása, amelyekben a PCR-amplifikációt esetleg zavaró anyagok vannak jelen. A HCV master mixben jelen lévő AmpErase enzim csökkenti az amplikonszennyezés kockázatát. Ugyanakkor a HCV-pozitív kontrollokból vagy klinikai mintákból származó szennyeződés csak helyes laboratóriumi gyakorlattal és ezen Módszertani kézikönyvben meghatározott eljárások gondos betartásával kerülhető el. A cryoglobulinok COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0-ra gyakorolt hatását nem értékelték. Ismerten magas cryoglobulin szinteket tartalmazó minták negatív HCV RNS eredményeit fokozott óvatossággal kell értékelni. A bakteriális és gombafertőzésekben alkalmazott gyógyszerek COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0-ra gyakorolt hatását nem határozták meg. Mint minden diagnosztikus vizsgálat esetén, a COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 eredményeinek értékelését a klinikai és laboratóriumi leletekkel együtt kell megtenni. A terméket csak a PCR-technikák terén képzett személy használhatja. Ez a termék kizárólag COBAS AMPLICOR Analizátorral használható együtt.

10/2005, Revision 6.0


23/42

Nem klinikai értékelés Analitikai érzékenység

WHO Nemzetközi Szabvány HCV RNS-re, 96/790 Értékelés, COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 kimutatási határok EDTA-s plazmában és szérumban. A COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 érzékenységét a HCV RNS-re vonatkozó WHO Nemzetközi Szabvány szerinti analízissel határozták meg (NIBSC kód 96/790). A fenti analízis a National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC) [Egyesült Királyság] és a Central Laboratory of the Netherlands Red Cross Blood Transfusion Service (CLB) intézetek együttműködésében szervezett közös tanulmányból származott. Ez a szabvány HCV 1 genotípust tartalmaz 105 nemzetközi egység (IU)/ml koncentrációban. A HCV RNS-re vonatkozó WHO Nemzetközi Szabvány (NIBSC kód 96/790) hígításai a szabványnak HCV-negatív humán plazmában és HCV-negatív humán szérumban való visszaoldásával készültek 100, 75, 60 és 50 IU/ml (a 105 IU/ml névleges érték alapján számított) koncentrációkban. Mind szérum-, mind plazmamintával a 75, 60 és 50 IU/ml koncentrációkból hat (6) ismételt analízist, a 100 IU/ml koncentrációból négy (4) ismételt analízist tesztelt négy (4) vizsgáló öt (5) napon keresztül (összesen tehát rendre 120, illetve 80 ismétlés). A kimutatási határt a legalacsonyabb HCV-koncentrációban határozták meg, amely 95% vagy nagyobb kimutatási arányt adott a COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 vizsgálattal. EDTA-s plazma esetén 50 IU/ml, szérum esetén 60 IU/ml koncentrációnál figyelték meg a 95%-os kimutatási határt. A 95%-os kimutatási határ Probit analízissel EDTA-s plazmában 43 IU/ml és szérumban 53 IU/ml volt. Az 1. és 2. táblázatban az EDTA-s plazmában, ill. szérumban mért kimutatási határok vannak feltüntetve.

1. táblázat A HCV RNS-re vonatkozó WHO Nemzetközi Szabvány kimutatási határok EDTA-s plazmában HCV RNS (IU/ml)

Ismétlések (n)

HCV RNSpozitív (n)

HCV RNSpozitív (%)

*Konfidenciahatárok

100

80

80

100%

95,5 – 100%

75

120

118

98,3%

94,1 – 99,8%

60

120

118

98,3%

94,1 – 99,8%

50

119**

115

96,6%

91,6 – 99,1%

* Pontosan 95%-os binomiális konfidenciahatárok ** Egyik ismétlés HCV- és IC-negatív volt

24/42


10/2005, Revision 6.0

Hepatitis C Virus

2. táblázat A HCV RNS-re vonatkozó WHO Nemzetközi Szabvány kimutatási határok szérumban

HCV RNS (IU/ml)

Ismétlések (n)

HCV RNSpozitív (n)

HCV RNSpozitív (%)

*Konfidenciahatárok

100

80

79

98,8%

93,2 – 100%

75

120

117

97,5%

92,9 – 99,5%

60

120

117

97,5%

92,9 – 99,5%

50

120

112

93,3%

87,3 – 97,1%

* Pontosan 95%-os binomiális konfidenciahatárok HCV-genotípus értékelése A COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 relatív érzékenységét a fő HCVgenotípusokra HCV-fertőzött egyénekből származó klinikai minták (n=8) analízisével határozták meg. A vizsgált minták az Egyesült Államokban talált gyakoribb (1a, 1b, 2a, 2b, 3a) és kevésbé gyakori (4a, 5a, 6a) HCV-genotípusokat és altípusokat egyaránt tartalmazták3. A kiindulási HCV RNS-koncentrációk alapján valamennyi minta negatív humán plazmával való hígításával megközelítően (± 2 SD) 100, 75 és 50 IU/ml végső koncentrációjú végponthígítások készültek. Valamennyi koncentrációt 24 ismétlés során tesztelték. Az COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 eredményei alátámasztják a HCV RNS ekvivalens, genotípustól független kimutatását (100% kimutatási arány) 100 IU/ml (2 SD = 48–208 IU/ml) kimutatási határ közeli célkoncentrációnál. HCV szerokonverziós panelek vizsgálata A HCV-fertőzés legkorábbi kimutatási időpontját hasonlították össze a COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 és a hagyományos szerológiai tesztek esetén, kereskedelemben kapható HCV szerokonverziós panelek (n=9) segítségével. Minden szerokonverziós panel egyetlen személytől az anti-HCV megjelenését megelőzően és azt követően gyűjtött minták jellemző sorozatából áll. Minden egyes panel minta három részletét vizsgálták COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 segítségével, és egy további részletet HCV-antitestekre vizsgáltak a Laboratory Corporation of America intézetben Abbott 2.0 Test, valamint RIBA 3.0, mint megerősítő teszt segítségével. A HCV RNS legkorábbi kimutatási időpontja a vizsgált panelekben COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 esetén átlagosan harminckettő (32) nappal előzi meg a HCV-antitestek legkorábbi kimutatási időpontját, ezzel a HCV-fertőzésnek a hagyományos szerológiai teszteknél korábbi kimutatási lehetőségét nyújtva. Analitikai specificitás

HCV-genotípus inkluzivitás vizsgálat A HCV RNS-t kimutató COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 specificitását a fő HCV-genotípusokat hordozó klinikai minták vizsgálatával határozták meg. Az Egyesült Államokban előforduló tizenöt (15) HCV altípust3 (1a, 1b, 2a, 2b, 2c, 2d, 3a, 3b, 4a, 4c, 4f, 4g, 4h, 5a és 6a) mutató 6 genotípust tartalmazó klinikai mintákból (n=87) álló panelt vizsgáltak. A COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 vizsgálattal valamennyi klinikai minta pozitív volt HCV RNS-re (ld. 3. táblázat).

10/2005, Revision 6.0


25/42

3. táblázat HCV-genotípus-inkluzivitás

HCV-genotípus

Vizsgált minták (n)

HCV RNS-pozitív n (% helyes)

1

1a

9

9

(100)

2

1b

9

9

(100)

3

2a

12

12

(100)

4

2b

14

14

(100)

5

2c

4

4

(100)

6

2d

1

1

(100)

7

3a

17

17

(100)

8

3b

1

1

(100)

9

4a

3

3

(100)

10

4c

5

5

(100)

11

4f

1

1

(100)

12

4g

1

1

(100)

13

4h

2

2

(100)

14

5a

4

4

(100)

15

6a

4

4

(100)

ÖSSZESEN

87

87

(100%)

Non-HCV virális hepatitis vizsgálata A COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 specificitását HCV RNS kimutatására közönséges non-C virális hepatitises (HBV és HAV) mintákkal való potenciális keresztreakciót vizsgálva értékelték. Emelkedett HAV-IgM szinteket mutató egyénekből származó mintákat (n=10), egy HAV izolátum mintát (n=1), HBsAg-t tartalmazó mintákat (n=10), valamint egy HBV DNS plazmid mintát (n=1) vizsgáltak és találtak negatívnak HCV RNS-re a COBAS AMPLICOR HCV Test v2.0 vizsgálattal. A COBAS AMPLICOR HCV Test v2.0 vizsgálat a HCV RNS kimutatására specifikus, és a közönséges hepatitis vírusokkal, mint a HAV és a HBV nem ad álpozitív eredményt. Mikroorganizmus-exkluzivitás A COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 specificitását patogén mikroorganizmusokkal és a normál bőrflóra potenciális szennyezőivel (amelyek tehát a mintákban jelen lehetnek) való potenciális keresztreakciót vizsgálva értékelték. Virális (n=25) vagy bakteriális (n=4) izolátumokat tartalmazó mintákat (összesen n=29) vizsgáltak. A COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 vizsgálattal valamennyi klinikai minta negatív volt HCV RNS-re (ld. 4. táblázat). Az eredmények azt mutatják, hogy a COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 specifikus HCV RNS-re, és nem keresztreagál a mintákban potenciálisan jelenlévő különböző vírusokkal és baktériumokkal.

26/42


10/2005, Revision 6.0

Hepatitis C Virus

4. táblázat Analitikai specificitás: Mikroorganizmus-exkluzivitás

Izolátum/Minta-leírás

HCV RNSpozitív (n)

Minták (n)

IC-pozitív (n)

1

Adenovírus (2, 3 és 7 típusok)

3

0

3

2

Enterovírusok (köztük Echovírus 1 és Coxsackievírus B1)

2

0

2

3

Herpeszvírusok [köztük Herpes Simplex vírus (1 és 2 típusok), humán Herpes vírus (6 és 7), Cytomegalovírus (AD-169, Davis és Towne), Varicella Zoster vírus]

12

0

12

4

HIV-1 (A-F szubtípusok)

6

0

6

5

HTLV (I és II)

2

0

2

6

Propionibacterium acnes

1

0

1

7

Staphylococcus (aureus és epidermidis)

3

0

3

Összesen

29

0

29

Zavaró tényezők

Endogén anyagok Endogén anyagok (hemoglobin, albumin, trigliceridek, immunglobulin, illetve bilirubin) emelt szintjeit tartalmazó különböző mintákat vizsgáltak COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0. segítségével, azok potenciális zavaró hatását keresve. Az emelt hemoglobin (n=12), albumin (n=10), triglicerid (n=13), bilirubin (n=11) és immunglobulin (n=11) tartalmú (a tartományokat illetően lásd 5. táblázat) mintákat tisztán (nem HCV-fertőzött), és a COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 kimutatási határa (100 IU/ml) körüli HCV mennyiséggel fertőzve (HCV-fertőzött) egyaránt vizsgálták.

5. táblázat Zavarási vizsgálatok során használt endogén anyagok koncentrációtartományai Magas normál szintek (mg/dl)

NCCLS teszt szint (mg/dl) (referencia)

Vizsgált értéktartomány (mg/dl)

Albumin

5000

6000

4630 – 6100

Bilirubin

0,.2

40

1,1 – 60

Hemoglobin

2,5

500

12,2 – 5000

Triglicerid

190

3000

364 – 3000

Immunglobulinok

1200

6000

1860 – 8610

Emelkedett anyag

Valamennyi esetben három-három párhuzamos mintát vizsgáltak. A nem várt (ellentmondó) HCV RNS teszt eredmények értékelésére tesztenként váltakozó HCV primer párokat használtak. Valamennyi HCV-fertőzött (100 IU/ml) minta pozitív volt HCV RNS-re a COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 vizsgálattal, tehát a vizsgált endogén anyagok emelt szintjei nem zavarják a teszt HCV RNS kimutatását a kimutatási határ közelében. Valamennyi tiszta (nem HCV-fertőzött), a vizsgált endogén anyagok emelt szintjeit tartalmazó minta negatív volt HCV RNS-re a COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 vizsgálattal, két bilirubint tartalmazó minta kivételével. Az emelt bilirubin tartalmú minták HCV RNS pozitivitását ezután váltakozó primer pár vizsgálattal ellenőrizték. Normálérték feletti mennyiségű

10/2005, Revision 6.0


27/42

albumint, hemoglobint, triglicerideket, illetve immunglobulinokat tartalmazó minták a COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0. vizsgálattal nem mutattak álpozitív, illetve álnegatív eredményeket. Exogén gyógyszerek HCV, HIV, HBV és CMV kezelésére alkalmazott gyógyszereket vizsgáltak COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0. segítségével, azok potenciális zavaró hatását keresve. HCV RNS-pozitív (100 IU/ml, a kimutatási határ körüli) vagy HCV RNS-negatív humán plazmában vizsgálták valamennyi gyógyszert három szinten (ld. 6. táblázat): zérus koncentráción (0X Cmax), csúcskoncentráción (1X Cmax) és a csúcskoncentráció 3-szorosán (3X Cmax).

6. táblázat Zavarási vizsgálatok során használt exogén gyógyszerek összefoglalása #

Gyógyszermárka Gyógyszerhatóanyag

Gyártó

1X

3X

Cmax

Cmax

Merck & Co., Inc.

8,98

26,94

µg/ml

Hoffmann-La Roche

1,18

3,54

µg/ml

1,5

4,5

µg/ml

2,477

7,431

µg/ml

75,6

ng/ml

0,3

0,9

ng/ml

273

819

IU/ml

11,04

µg/ml

neve

neve

1

CRIXIVAN®

Indinavir sulfate

2

CYTOVENE®

Ganciclovir

3

Epivir-HBV®

Lamivudine, 3TC

GlaxoSmithKline

4

FORTOVASE®

Saquinavir

Hoffmann-La Roche

5

HIVID®

Zalcitabine, ddC

Hoffmann-La Roche

25,2

6

INFERGEN®

Interferon alfacon-1

AMGEN Inc.

7

INTRON® A

Interferon alfa-2b

Schering-Plough Corp.

8

INTRON®A/ REBETOL®

Interferon alfa-2b/ribavirin

Schering-Plough Corp.

3,68

Egység

9

NORVIR®

Ritonavir

Abbott Laboratories

11,2

33,6

µg/ml

10

Paxil®

Paroxetine HCl

GlaxoSmithKline

61,7

185,1

ng/ml

11

PEGASYS®

Peginterferon alpha-2a

Hoffmann-La Roche

18

54

ng/ml

12

PROZAC®

Fluoxetine HCl

Eli Lilly & Co.

302

906

ng/ml

13

RESCRIPTOR®

Delavirdine mesylate

Agouron Pharmaceuticals Inc.

19,3

57,9

µg/ml

14

Retrovir®

Zidovudine

GlaxoSmithKline

1,06

3,18

µg/ml

15

ROFERON®A

Interferon alfa-2b

Hoffmann-La Roche

2,58

7,74

ng/ml

16

Symmetrel®

Amantadine HCl

Endo Pharmaceuticals Inc.

0,51

1,53

µg/ml

17

VIDEX®

Didanosine, ddI

Bristol-Myers Squibb Co.

2,32

6,96

µg/ml

18

VIRACEPT®

Nelfinavir mesylate

Agouron Pharmaceuticals Inc.

4

12

µg/ml

19

VIRAMUNE®

Nevirapine

Roxane Laboratories, Inc.

4,5

13,5

µg/ml

20

ZADAXIN®

Thymosin alpha 1

SciClone

100

300

ng/ml

21

ZERIT®

Stavudine, d4T

Bristol-Myers Squibb Co.

4,15

12,45

µg/ml

22

ZOLOFT®

Sertraline HCl

Pfizer Inc.

190,2

570,6

ng/ml

Három-három párhuzamos mintát vizsgáltak. A gyógyszerek vizsgálata nem adott álnegatív vagy álpozitív eredményt. Valamennyi gyógyszerszint mellett minden HCV-pozitív minta HCV RNS-pozitív, és minden HCV-negatív minta HCV RNSnegatív volt a COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 vizsgálattal. A vizsgált gyógyszerek nem zavarják a COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 HCV RNS kimutatását. Tehát a COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 HCV-infekció és HCVkoinfekció kezelésére használt különböző gyógyszereket szedő betegekből származó minták vizsgálatára alkalmazható.

28/42


10/2005, Revision 6.0

Hepatitis C Virus

HCV-koinfekció HCV-koinfekciókban (HAV, HBV és HIV) szenvedő betegekből származó mintákat vizsgáltak COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0. segítségével, azok potenciális zavaró hatását keresve. Az alábbi szerológiailag pozitív mintákat vizsgálták: HBV/HCV (n=8), HIV/HCV (n=10), HIV/HBV/HCV (n=5) és HAV/HBV/HCV (n=2). Három-három párhuzamos mintát vizsgáltak és a szerológiai eredményeknek ellentmondó HCV RNS teszt eredmények értékelésére tesztenként váltakozó HCV primer párokat használtak. A COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 vizsgálattal 4 HCV-szeropozitív minta bizonyult HCV RNS-negatívnak: egy (1) HBV/HCV, egy (1) HIV/HBV/HCV és kettő (2) HAV/HBV/HCV. A belső kontroll eredménye valamennyi minta esetén pozitív volt, jelezve, hogy a PCR-reakció nem volt gátolt, és a teszteredmények a követelményeknek megfeleltek. Mind a négy minta esetén a három váltakozó primer párral végzett vizsgálati eredmények ugyancsak negatívak voltak, jelezve a HCV RNS hiányát. A HAV-, HBV- és/vagy HIV-koinfekciók jelenléte HCV-szeropozitív mintákban nem zavarja a COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 HCV RNS kimutatását. Az eredményeket a 7. táblázat tartalmazza.

7. táblázat HCV-koinfekció zavaró hatása Koinfekciós minta

1

Minták (n)

HCV RNS-pozitív (n)

Igazolt IC (n)

HBV/HCV

8

7*

8

2

HIV/HCV

10

10

10

3

HIV/HBV/HCV

5

4*

5

4

HAV/HBV/HCV

2

0*

2

Összesen

25

21

25

*A COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 vizsgálattal HCV RNS-negatív négy minta váltakozó primer párral végzett vizsgálat (ellentmondás-tesztelés) során ugyancsak HCV RNS-negatívnak bizonyult.

10/2005, Revision 6.0


29/42

Klinikai tanulmány Klinikai vizsgálati Egy prospektív multicentrikus tanulmányt végeztek az Egyesült Államok négy célkitűzések és módszerek különböző földrajzi elhelyezkedésű hepatológiai centrumában a COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 klinikai hasznának értékelésére olyan betegek aktív HCV-fertőzésének diagnózisában, akiknél a májbetegségnek biokémiai, klinikai és/vagy szövettani bizonyítékai vannak. A teszt alkalmazását két ellenponttal szemben értékelték: (1) anti-HCV szerológia, és (2) anti-HCV szerológia, szérum ALT-szintek és máj szövettan kombinációja. A betegek két csoportját vizsgálták: 1. Az „Általános csoport”. HCV-fertőzés és/vagy májbetegség miatt vizsgált betegek, akiket korábban nem kezeltek HCV-fertőzés miatt, és akik nem estek át májátültetésen. 2. A „Korábban kezelt csoport”. Olyan betegek, akiket korábban kezeltek HCVfertőzés miatt, és akik nem estek át májátültetésen. Az olyan betegeket, akik a vizsgálatot megelőzően 6 hónapon belül antivirális kezelést kaptak, kizárták a vizsgálatból. A betegeket értékelő orvosok a kórtörténet, a fizikális vizsgálat és a megelőzően rendelkezésre álló laboratóriumi eredmények alapján rögzítették a klinikai diagnózist (krónikus HCV-fertőzés, alkoholos májbetegség, primer biliaris cirrhosis stb.). Sok esetben a vizsgálók hozzáférhettek az anti-HCV szerológiai eredményekhez a szűréskor, de a HCV RNS eredményeket nem láthatták. Szérumalanin-transzferáz (ALT) mérést valamennyi betegen végeztek. Azokban az esetekben, amikor korábban májszövettani vizsgálat volt, a szövettani leletek rendelkezésre álltak. Szérum- és/vagy EDTA-s plazmaminták kerültek levételre, és COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 vizsgálattal HCV RNS-re, enzim immunoassay-vel (anti-HCV EIA) pedig HCV-ellenes antitestekre vizsgálták őket. Az ismételten anti-HCV EIA reaktívnak bizonyult valamennyi mintát rekombináns immunoblot assay (RIBA) segítségével ugyancsak tesztelték. RIBA vizsgálatot csak az EIA pozitív mintákon végeztek. Az EIA-negatív mintákat RIBA vizsgálattal nem tesztelték. Az anti-HCV EIA és RIBA eredmények értékelése a gyártó által mellékelt használati utasításnak megfelelően történt. A COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 eredmények értékelése a Módszertani útmutató használati utasítása szerint történt. A COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 alkalmazását az anti-HCV EIA és RIBA szerológiai eredményekkel hasonlították össze. Azon betegek alcsoportjában, akiknél májszövettani lelet állt rendelkezésre, a COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 alkalmazását értékelték továbbá az anti-HCV szerológiával, a szérumtranszamináz (ALT) szintekkel és a májszövettani leletekkel szemben is. Klinikai vizsgálati eredmények

A vizsgálatba beválasztott 848 betegtől összesen 1 038 mintát vettek le. A betegek átlag életkora 46 év volt, 54,5% férfi és 71,8% kaukázusi rasszba tartozó volt. A hepatológiai klinikákon való megjelenés okai korábbi HCV diagnózis (40,2%), HCV kivizsgálása (34,7%) és májbetegség kivizsgálása (25,8%) voltak. A vizsgálatba beválasztott betegeknek átlag 95,5 IU/ml (7–668 IU/ml) ALT értékük volt, májszövettani lelet 51,7%-ban állt rendelkezésre, továbbá 18,2%-ot kezeltek korábban HCV miatt, de a kezelést legalább 6 hónappal a beválasztást megelőzően befejezték. A klinikai diagnózisok a beválasztáskor a következők voltak: krónikus HCV-fertőzés (72,9%), autoimmun hepatitis (2,2%), alkoholos májbetegség (5,5%), krónikus hepatitis B-vírusfertőzés (4,4%), primer biliaris cirrhosis (5,3%), és 13,7% egyéb diagnózis.

30/42


10/2005, Revision 6.0

Hepatitis C Virus

A vizsgálat során értékelt minták számát, típusát és tárolási körülményeit a 8. táblázat foglalja össze.

8. táblázat COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0: A klinikai vizsgálati helyszíneken értékelt minták száma, típusa és tárolási körülményei Mintatípus

1. hely

3. hely

4. hely

Összesen

Szérum (-20 °C – -80 °C)

101

321

228

158

808

Szérum (2 °C – 8 °C)

35

0

35

0

70

EDTA-s plazma (-20 °C – -80 °C)

0

0

35

125

160

136

321

298

283

1038

Összesen

Klinikai értékelés az anti-HCV szerológiával összehasonlítva

2. hely

A COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 alkalmazása az anti-HCV szerológiával összevetésben a négy vizsgálati helyszínen hasonló volt. Valamennyi helyszín adatait együttesen a 9. táblázat foglalja össze. Ez a táblázat tartalmazza az általános és a korábban kezelt betegcsoportok szérum és EDTA-s plazma eredményeit.

9 Táblázat A COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 alkalmazása szérumban és EDTA-s plazmában az anti-HCV szerológiával összevetve az általános és a korábban kezelt betegcsoportokban Szérum Szerológiai eredmények

PCR-pozitív: (A minták közül n)

PCR-negatív: (A minták közül n)

EDTA-s plazma Az EIA vizsgálattal egyező eredmények aránya (%) (95% konfidenciahatár)*



Az EIA vizsgálattal egyező eredmények aránya (%) (95% konfidenciahatár)*

Általános betegcsoport: EIA+/RIBA +

437

21

95,4 (93,08; 97,14)

89

5

94,7 (88,02; 98,25)

EIA+/RIBA IND

16

10

61,5 (40,57; 79,77)

2

2

50,0 (6,76; 93,24)

EIA+/RIBA –

0

1

0 (0; 97,50)

0

0

EIA –

3

¥

217

98,6 (96,07; 99,72)

1

24

96,0 (79,65; 99,90)

EIA+/RIBA +

148

11

93,1 (87,96; 96,50)

31

6

83,8 (67,99; 93,81)

3

0

100,0 (29,24; 100,0)

0

0

Korábban kezelt betegcsoport:

EIA+/RIBA IND

* Pontos binomiális konfidenciahatárok ¥ Egy további mintának a vizsgálatban eredetileg bizonytalan eredménye az újrateszteléskor PCR-pozitívnak bizonyult két párhuzamos mérésben (ismétlés eredménye 1=negatív, ismétlés eredménye 2=bizonytalan).

10/2005, Revision 6.0


31/42

Mindkét csoport RIBA által megerősített EIA-pozitív betegei között a minták túlnyomó többségében (84%–95%) a HCV RNS-t kimutatták. Az általános csoport betegeiben a szérum- és plazmaminták rendre 62%, illetve 50%-ában kimutatták a HCV RNS-t , amit a bizonytalan RIBA szerológiájú korábban kezelt betegek közül senkiben sem sikerült kimutatni. Valamennyi EIA-negatív beteg az általános csoportba tartozott, és ezen mintáknak a többségében (szérum és EDTA-s plazma rendre 99% és 96%-ában) a HCV RNS-negatív volt. Vagyis a COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 és az anti-HCV szerológiai eredmények jól egyeztek egymással mind az általános, mind a korábban kezelt betegcsoportokban szérumban és EDTA-s plazmában egyaránt. Klinikai értékelés szerológiai, biokémiai és szövettani leletekkel összehasonlítva

A COBAS AMPLICOR vizsgálat alkalmazását értékelték továbbá az anti-HCV szerológiával, a szérumtranszamináz (ALT) szintekkel és a májszövettani leletekkel szemben is. A COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 alkalmazását a szerológiai, biokémiai és szövettani leletekkel összevető adatokat a 10. táblázat mutatja.

10. táblázat A COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 alkalmazása szérumban és EDTA-s plazmában a szerológiai, biokémiai és szövettani leletekkel összevetve – Általános csoport EDTA-s plazma

Szérum Szerológiai eredmények

PCR-pozitív: (Az esetek közül n)

PCR-negatív: (Az esetek közül n)


PCR-pozitív: (Az esetek közül n)

PCR-negatív: (Az esetek közül n)


0

100,0 (83,89;, 100,0)

0

100,0 (2,50; 100,0)

Emelkedett ALT (GPT) és szövettanilag igazolt hepatitis EIA+/RIBA +

162

2

98,8 (95,67; 99,85)

21

EIA+/RIBA IND

4

0

100,0 (39,76; 100,0)

1

EIA+/RIBA –

0

EIA –

0

0 16

100,0 (79,41; 100,0)

0

1

100,0 (2,50; 100,0)

100,0 (69,15; 100,0)

Normál ALT (GPT) és szövettanilag igazolt hepatitis EIA+/RIBA +

57

0

100,0 (93,73; 100,0)

10

0

EIA+/RIBA IND

1

0

100,0 (2,50; 100,0)

0

0

EIA –

0

9

100,0 (66,37; 100,.0)

0

0

Emelkedett ALT (GPT) és szövettanilag nincs hepatitis EIA+/RIBA +

3

EIA+/RIBA IND

0

1

75,0 (19,41; 99,37)

1

0

EIA+/RIBA –

0

EIA –

1

EIA+/RIBA +

1

2

33,3 (0,84; 90,57)

0

0

EIA+/RIBA IND

1

0

100,0 (2,50; 100,0)

0

0

EIA –

1

32

97,0 (84,24; 99,92)

0

1

100,0 (2,50; 100,0)

0 0 28

96,6 (82,24; 99,91)

0

0

Normál ALT (GPT) és szövettanilag nincs hepatitis

100,0 (2,50; 100,0)

* Pontos binomiális konfidenciahatárok

32/42


10/2005, Revision 6.0

Hepatitis C Virus

Az általános csoport emelkedett ALT-szintű, szövettanilag igazolt hepatitises betegei között, akik anti-HCV EIA- és RIBA-pozitívak voltak, a HCV RNS-t a szérum és EDTA-s plazmaminták 98,8, illetve 100%-ában kimutatták. A HCV RNS-t az EIA-pozitív, RIBA-bizonytalan szérum és EDTA-s plazmaminták 100%ában kimutatták. Az ebbe a kategóriába tartozó EIA-negatív betegek szérummintáinak, illetve EDTA-s plazmamintáinak 100%-ában nem mutattak ki HCV RNS-t. Ezen EIA-negatív betegekben bár a szövettan hepatitist igazolt, annak jellege nem felelt meg a HCV-fertőzésnek, inkább autoimmun hepatitisnek, hepatitis B vírus betegségnek vagy nemspecifikus májgyulladásnak. Az általános csoport normál ALT-szintű, szövettanilag igazolt hepatitises betegei között, akik RIBA-megerősített EIA-pozitívak voltak, a HCV RNS-t a szérum és az EDTA-s plazmaminták 100%-ában kimutatták. Az EIA-negatív esetek 100%-ában nem mutattak ki HCV RNS-t szérumban. Ebbe a kategóriába tartozó betegektől EDTA-s plazmaminták nem voltak. A HCV RNS-t kimutattak egy EIA-pozitív esetben, ahol a RIBA bizonytalan volt. Az EIA-negatív esetekben a hepatitis szövettani jellege ugyancsak inkább más betegségnek felelt meg, mint HCV-fertőzésnek. Az emelkedett ALT-szintű betegek között, akiknek szövettani vizsgálata nem igazolt hepatitist, a HCV RNS-t a szérum minták 75%-ában, az EDTA-s plazmaminták 100%-ában kimutatták a RIBA-megerősített EIA-pozitív esetek közül. Ezen kategóriában, ahol a májbetegség (vagyis az emelkedett ALT) oka nem hepatitis volt, az EIA az esetek többségében (29/33 vagy 88%) negatív volt. Ezen EIA-negatív esetek 96,6%-ában nem mutattak ki HCV RNS-t szérumban. Ebbe a kategóriába tartozó betegektől EDTA-s plazmaminták nem voltak. Ebben a kategóriában EIA-pozitív, RIBA-bizonytalan esetek nem voltak. Azon betegek között, akiknek az ALT-szintje normális volt, és szövettani vizsgálatuk nem igazolt hepatitist, az esetek többsége anti-HCV EIA-negatív volt. Ebben a kategóriában három RIBA-megerősített EIA-pozitív eset volt. EDTA-s plazma nem állt rendelkezésre, és HCV RNS-t egy esetben (33,3%) mutattak ki szérumban. Az EIA-negatív betegek szérum mintáinak 97,0%-ában nem mutattak ki HCV RNS-t. Bár a májbetegség szövettanilag igazolt volt ezekben az esetekben, annak jellege nem felelt meg hepetitisnek. A HCV RNS-t kimutattak egy szérummintában, amelyben az EIA pozitív, a RIBA bizonytalan volt. A COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 alkalmazását a szerológiai, biokémiai és szövettani leletekkel összevető adatokat a megelőzően kezelt csoport betegeinek szérum- és EDTA-s plazmamintái esetén a 11. táblázat foglalja össze.

10/2005, Revision 6.0


33/42

11. táblázat A COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 alkalmazása szérumban és EDTA-s plazmában a szerológiai, biokémiai és szövettani leletekkel összevetve – Megelőzően kezelt csoport Szérum Szerológiai eredmények



EDTA-s plazma





94,1 (71,31; 99,85)

Emelkedett ALT (GPT) és szövettanilag igazolt hepatitis EIA+/RIBA +

82

2

97,6 (91,66; 99,71)

16

1

EIA+/RIBA IND

3

0

100,0 (2,50; 100,0)

0

0

EIA+/RIBA –

0

0

0

EIA –

0

0

0

Normál ALT (GPT) és szövettanilag igazolt hepatitis EIA+/RIBA +

22

4

EIA+/RIBA IND

0

0

84,6 (65,13; 95,64)

3

2

0

0

0

EIA+/RIBA

0

0

0

0

0

EIA –

0

0

0

0

0

EIA+/RIBA +

2

1

EIA+/RIBA IND

0

0

EIA+/RIBA –

0

0

0

0

EIA –

0

0

0

0

EIA+/RIBA +

2

0

EIA+/RIBA IND

0

0

0

EIA+/RIBA –

0

0

0

EIA–

0

0

60,0 (14,66; 94,73)

Emelkedett ALT (GPT) és szövettanilag nincs hepatitis 66,7 (9,43, 99,16)

1

0

0

100,0 (2,50; 100,0)

0

Normál ALT (GPT) és szövettanilag nincs hepatitis 100,.0 (15,81;, 100,.0)

1

0

100,.0 (2,50; 100,0)

0 0 0

0

* Pontos binomiális konfidenciahatárok A megelőzően kezelt csoport betegei közül senki nem volt EIA-negatív; ezen kategória betegeiből származó valamennyi minta anti-HCV EIA-pozitív volt. A megelőzően kezelt csoport emelkedett ALT-szintű, szövettanilag igazolt hepatitises betegei között, akik RIBA-megerősített EIA-pozitívak voltak, a HCV RNS-t a szérum minták 97,6%-ában, az EDTA-s plazmaminták 94,1%-ában kimutatták. A HCV RNS-t kimutatták mindhárom (100%) EIA-pozitív szérumban, amelyeknél a RIBA bizonytalan volt. A megelőzően kezelt csoport normál ALT-szintű, szövettanilag igazolt hepatitises betegei között, akik RIBA-megerősített EIA-pozitívak voltak, a HCV RNS-t a szérumminták 84,6%-ában, az EDTA-s plazmaminták 60%-ában kimutatták. Az emelkedett ALT-szintű betegek között, akiknek szövettani vizsgálata nem igazolt hepatitist, a HCV RNS-t a szérum minták 66,7%-ában, az EDTA-s plazmaminták 100%-ában kimutatták a RIBA-megerősített EIA-pozitív esetek közül.

34/42


10/2005, Revision 6.0

Hepatitis C Virus

A normál ALT-szintű betegek között, akiknek szövettani vizsgálata nem igazolt hepatitist, a HCV RNS-t a RIBA-megerősített EIA-pozitív szérum- és EDTA-s plazmaminták 100%-ában kimutatták. Összegzés és következtetések

A COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 vizsgálata az általános és a megelőzően kezelt betegcsoportokban megmutatta, hogy a teszt nagyfokú korrelációt mutat az anti-HCV szerológiával mind szérumban, mind EDTA-s plazmában. A COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 vizsgálata az általános és a megelőzően kezelt betegcsoportokban ugyancsak nagyfokú egyezést mutatott a szerológiai, biokémiai és szövettani eredményekkel mind szérumban, mind EDTA-s plazmában. Egészében véve a vizsgálati eredmények megmutatták, hogy a COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 hasznos a HCV-fertőzés és/vagy májbetegség irányában vizsgált betegek klinikai diagnosztikájában. A teszt hasznos az aktív HCV-fertőzés diagnózisának megerősítésében.

Reprodukálhatóság

A COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 reprodukálhatóságának felmérésére két (egy fagyasztott szérumból, egy fagyasztott EDTA-s plazmából készített) hat tagból álló mintasorozatot vizsgáltak. Négy HCV-pozitív mintahígítást (névleges HCV RNS koncentrációk: 50, 75, 100 és 200 IU/ml) készítettek három darab 1-es genotípusú klinikai HCV-mintából. A fennmaradó két minta nem tartalmazott kimutatható HCV RNS-t. A reprodukálhatóságot a vizsgálati helyszínek, napok és reagenstételek kapcsán értékelték. Mindegyik sorozatot két vizsgáló tesztelte három helyszínen (két klinikai referencialaboratórium és egy Roche Molecular Systems laboratórium). Valamennyi vizsgáló 5 napos tesztsorozatot végzett három reagenstétel mindegyikével. Az egy adott napon belüli reprodukálhatóság megállapítására valamennyi minta három részletét vizsgálták minden futtatás alkalmával. A tanulmány 3209 eredményét a szérummintákra a 12. táblázat, az EDTA-s plazmamintákra a 13. táblázat foglalja össze. Mindegyik mintasorozat > 500 HCV RNS-negatív mintájából 100% bizonyult negatívnak összességében és az egyes vizsgált változókra nézve (12.A, 12.C, 13.A és 13.C táblázat). A HCV RNS-negatív mintákra nézve a vizsgálat teljes reprodukálhatóságot mutatott. A HCV RNS-pozitív minták a vizsgált változókra nézett reprodukálhatóságának megállapítása a pozitív eredmények gyakoriságának összehasonlításával történt. (12.B és 13.B táblázat). Mindegyik HCV RNS-koncentráció esetén a konfidenciaintervallumok átfednek valamennyi vizsgált változóra nézve (lásd a 12. és 13. táblázat második lábjegyzetét). Ezért bármely pozitív eredmény gyakoriságai között megfigyelhető különbség egy változón belül adott HCV RNS-koncentrációnál valószínűleg emiatt van. Ezek az eredmények a HCV RNS tartalmú mintákra nézve reprodukálhatóságot mutatnak. Néhány megfigyelést érdemes tenni. A legmagasabb HCV RNS-koncentrációjú (200 IU/ml) szérumminták esetén a pozitív eredmények gyakoriságai helyszín és tétel szerint 99–100%, nap szerint 98–100% voltak; ezek reprezentálják tehát a pozitív eredmények gyakoriságának legszűkebb (legjobban reprodukálható) tartományát a szérumminták között. Az 50 IU/ml koncentrációjú szérumminták esetén a pozitív eredmények gyakoriságai helyszín szerint 85-89%, tétel szerint 78–91% és nap szerint 80–93% voltak. Az utóbbi két tartomány reprezentálja a pozitív eredmények gyakoriságának legszélesebb (legkevésbé reprodukálható) tartományát valamennyi minta között. Ezeket a legalacsonyabb HCV RNSkoncentrációval érték el. Az EDTA-s plazmaminták között a reprodukálhatóság hasonlóan a HCV RNS-koncentrációval változott.

10/2005, Revision 6.0


35/42

Valamennyi HCV RNS-koncentráció esetén a pozitív eredmények gyakoriságának helyszín szerinti intervalluma kevésbé szélesebbnek (vagyis reprodukálhatóbbnak) bizonyult, mint a tétel, illetve a nap szerinti intervallumok. Ezek az adatok a COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 reagenstételek, vizsgálati helyszínek, napok és mintasorozatok szerinti reprodukálhatóságát mutatják. A bizonytalan (GZ) eredményekre vonatkozó megjegyzések

A reprodukálhatósági vizsgálatok során bizonytalan (GZ) eredményt adó mintákat nem tesztelték újra (az „Eredmények értelmezése” szakasz szerint), tehát ezen mintáknak végső eredménye nem született. Ha a vizsgálatokat megismételnék, feltételezhetően a pozitív eredmények gyakorisága növekedne. A bizonytalan eredmények figyelmen kívül hagyásával például az 50 (vagy 1,8 log10) IU/ml-es szérum- és EDTA-s plazmaminta esetén a pozitív eredmények elérték 95%-os küszöböt. Ezek az eredmények hasonlóak azokhoz, amelyeket a WHO szabvánnyal végzett LOD vizsgálat adatai alapján ugyanezen számítás elvégzésével nyertek (lásd az „Analitikai érzékenység” szakaszt). A COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 a vizsgált HCV 1 genotípus alacsonyabb koncentrációi esetén adott ≥ 95%-os pozitív eredményeket EDTA-s plazmában, mint szérumban (1., 2., 12. és 13. táblázat). Másrészt ez a mintasorozatok közti különbség kicsi volt (=0,3 log10 IU/ml), és nem valószínű, hogy befolyásolná a javasolt használatot (lásd a „Felhasználás célja” és a „Klinikai értékelés” szakaszokat). 12. táblázat Reprodukálhatóság: Szérumminták A. Teljes gyakoriságok COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 eredményei

HCV RNS

Tesztek száma*

IU/ml

(log10 IU)/ml

200 100 75 50

2,3 2,0 1,9 1,7

267 268 266 269

Bizonytalan tartomány (0,15 ≤ A660 < 1,0)

Pozitív tartomány (A660 ≥ 1,0)

szám

%

szám

%*

CI **

1 7 12 32

0,4% 3% 5% 12%

266 257 249 233

99,6% 96% 94% 87%

98–100% 93–98% 90–96% 82–91%

Bizonytalan tartomány 0

36/42

–

531

0

Negatív tartomány (A660 < 0,15) 531


100%

99 - 100%

10/2005, Revision 6.0

Hepatitis C Virus

B. Vizsgált változók: Pozitív eredmények gyakorisága (A660 = 1,0)* HCV RNS tartalmú minták esetén

Hely

Helyenként Eset/Tesztek száma

%

Tétel

Tételenként Eset/Tesztek száma

%

Nap

2,3

A B C

86/87 90/90 90/90

99% 100% 100%

1 2 3

90/90 87/88 89/89

100% 99% 100%

1 2 3 4 5

54/54 54/54 53/53 55/55 50/51

100% 100% 100% 100% 98%

100

2,0

A B C

83/88 88/90 86/90

94% 98% 96%

1 2 3

84/89 88/90 85/89

94% 98% 96%

1 2 3 4 5

50/53 51/54 52/54 55/57 49/50

94% 94% 96% 97% 98%

75

1,9

A B C

82/86 83/90 84/90

95% 92% 93%

1 2 3

80/88 83/90 86/88

91% 92% 98%

1 2 3 4 5

49/53 53/54 48/52 51/56 48/51

93% 98% 92% 91% 94%

50

1,7

A B C

76/89 80/90 77/90

85% 89% 86%

1 2 3

70/90 82/90 81/89

78%** 91%** 91%

1 2 3 4 5

50/54 46/54 48/54 49/57 40/50

93% 85% 89% 86% 80%

IU

HCV RNS/ml log10 IU

200

Naponként Eset/Tesztek száma

%

C. Vizsgált változók: Negatív eredmények gyakorisága (A660 < 0,15) HCV RNS-t nem tartalmazó minták esetén

HCV RNS száma

Hely


%

Tétel


%

Nap


%

A B C

172/172 179/179 180/180

100% 100% 100%

1 2 3

176/176 180/180 175/175

100% 100% 100%

1 2 3 4 5

106/106 107/107 106/106 114/114 98/98

100% 100% 100% 100% 100%

* A bizonytalan eredmények szerepelnek a számítások nevezőiben (Tesztek száma), de a potenciálisan gátolt eredmények nem. ** Pontosan 95%-os binomiális konfidenciahatárok a B. táblázatban csak a legnagyobb gyakoriságbeli különbséget mutató változóra (50 IU/ml, tételenként): 1. tétel CI = 68-86% és 2. tétel CI = 83-96%; valamennyi analóg konfidenciaintervallum szintén átfedhet.

13. táblázat Reprodukálhatóság: EDTA-s plazmaminták A. Teljes gyakoriságok HCV RNS

Tesztek száma*

IU/ml

(log10 IU)/ml

200 100 75 50

2,3 2,0 1,9 1,7

268 269 270 269

COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 eredményei Bizonytalan tartomány Pozitív tartomány (0,15 ≤ A660 < 1,0) (A660 ≥ 1,0) szám

%

szám

%*

CI **

1 6 6 20

0,4% 2% 2% 7,4%

266 262 262 240

99,3% 97% 97% 89%

97–100% 95–99% 94–99% 85–93%

Bizonytalan tartomány 0

–

10/2005, Revision 6.0

532

0

Negatív tartomány (A660 < 0,15) 532


100%

99–100%

37/42

B. Vizsgált változók: Pozitív eredmények gyakorisága (A660 = 1,0)* HCV RNS tartalmú minták esetén

Hely


%

Tétel


%

Nap

2,3

A C D

88/89 89/90 89/89

99% 99% 100%

1 2 3

87/89 90/90 89/89

98% 100% 100%

1 2 3 4 5

53/53 54/54 53/54 55/56 51/51

100% 100% 98% 98% 100%

100

2,0

A C D

84/89 89/90 89/90

94% 99% 99%

1 2 3

88/89 88/90 86/90

99% 98% 96%

1 2 3 4 5

53/53 53/54 52/54 54/57 50/51

100% 98% 96% 95% 98%

75

1,9

A C D

88/90 88/90 86/90

98% 98% 96%

1 2 3

86/90 87/90 89/90

96% 97% 99%

1 2 3 4 5

51/54 52/54 54/54 55/57 50/51

94% 96% 100% 97% 98%

50

1,7

A C D

80/89 83/90 77/90

90% 92% 86%

1 2 3

79/90 81/89 80/90

88% 91% 89%

1 2 3 4 5

45/53 52/54 50/54 49/57 44/51

85%** 96%** 93% 86% 86%

IU

HCV RNS/ml log10 IU

200


%

C. Vizsgált változók: Negatív eredmények gyakorisága (A660 < 0,15) HCV RNS-t nem tartalmazó minták esetén

HCV RNS száma

Hely


%

Tétel


%

Nap

A C D

172/172 180/180 180/180

100% 100% 100%

1 2 3

178/178 175/175 179/179

100% 100% 100%

1 2 3 4 5

Naponként Eset/Tesztek száma 107/107 105/105 107/107 113/113 100/100

% 100% 100% 100% 100% 100%

* A bizonytalan eredmények szerepelnek a számítások nevezőiben (Tesztek száma), de a potenciálisan gátolt eredmények nem. ** Pontosan 95%-os binomiális konfidenciahatárok a B. táblázatban csak a legnagyobb gyakoriságbeli különbséget mutató változóra (50 IU/ml, nap szerint) vannak: 1. nap CI = 72-93% és 2. nap CI = 87-100%; valamennyi analóg konfidenciaintervallum szintén átfedhet.

38/42


10/2005, Revision 6.0

Hepatitis C Virus

Hivatkozások 1.

Choo, Q-L., Weiner, A.J., Overby, L.R. et al. 1990. Hepatitis C Virus: The major causative agent of viral non-a, non-b hepatitis. British Medical Bulletin 46:423-441.

2.

Alter, H. 1991. Descartes before the horse: I clone, therefore I am: The hepatitis C virus in current perspective. Annals of Internal Medicine 115:644-649.

3.

Alter, M.J., D. Kruszon-Moran, O.V. Nainan, G.M. McQuillan, F. Gao, L.A. Moyer, R.A. Kaslow and H.S. Margolis. The prevalence of hepatitis C virus infection in the United States, 1988 through 1994. N Engl J Med 1999; 341(8):556-562.

4.

Gretch, D.R. 1996. Diagnostic tests for hepatitis C. Hepatology 26 (suppl. 1): 43S-47S.

5.

Schiff, E.R., M. de Medina and R.S. Kahn. 1999. New Perspectives in the Diagnosis of Hepatitis C. Seminars In Liver Disease 19 (suppl.1): 3-15.

6.

Lok, A.S. and N.T. Gunaratnam. 1997. Diagnosis of hepatitis C. Hepatology 26 (suppl.1): 48S-56S.

7.

Damen, M., H.L. Zaaijer, H.T. Cuypers, H. Vrielink, C.L. van der Poel, H.W. Reesink and P.N. Lelie. 1995. Reliability of the third-generation recombinant immunoblot assay for hepatitis C virus. Transfusion 35: 745-749.

8.

NIH. 1997. Management of Hepatitis C. National Institutes of Health Consensus Development Conference Statement #105.

9.

1998. Recommendations for Prevention and Control of Hepatitis C Virus (HCV) Infection and HCV-Related Chronic Disease. MMWR, Vol. 47, No. RR-19.

10. Pawlotsky, J-M, A. Bastie, C. Pellet, J. Remire, F. Darthuy, L. Wolfe, C. Sayada, J. Duval and D. Dhumeaux. 1996. Significance of Indeterminate ThirdGeneration Hepatitis C Virus Recombinant Immunoblot Assay. Journal of Clinical Microbiology. 34: 80-83. 11. Lu, R.H., S.J. Hwang, C.Y. Chan, F.Y. Chang and S.D. Lee. 1998. Quantitative measurement of serum HCV RNA in patients with chronic hepatitis C: comparison between AMPLICOR HCV monitor system and branched DNA signal amplification assay. Journal of Clinical Laboratory Analysis 12: 121-125. 12. Gretch, D., D. de la Rosa, L. Corey and R. Carithers. 1996. Assessment of hepatitis C viremia using molecular amplification technologies. Viral Hepatitis Reviews 2: 85-96. 13. Young, K.Y., Resnick, R. and Myers, T.W. 1993. Detection of hepatitis C virus RNA by a combined reverse transcriptase-polymerase chain reaction assay. Journal of Clinical Microbiology 31:882-886. 14. Myers, T.W. and Gelfand, D.H. 1991. Reverse transcription and DNA amplification by a Thermus thermophilus DNA polymerase. Biochemistry 30:7661-7666.

10/2005, Revision 6.0


39/42

15. Stuyver, L., Rossau, R., Wyseur, A. et al. 1993. Typing hepatitis C virus isolates and characterization of new subtypes using a line probe assay. Journal of General Virology 74:1093-1102. 16. Machida, A., Ohnuma, H., Tsuda, F. et al. 1992. Two distinct subtypes of hepatitis C virus defined by antibodies directed to the putative core protein. Hepatology 16:886-891. 17. Bukh, J. R. Purcell and R. Miller. 1992. Importance of primer selection for the detection of hepatitis C virus RNA with the polymerase chain reaction assay. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 89: 187-191. 18. Bukh, J., Purcell, R.H. and Miller, R.H. 1992. Sequence analysis of the 5' noncoding region of hepatitis C virus. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 89:4942-4946. 19. Okamoto, H., Okada, S., Sugiyama, Y. et al. 1990. The 5'-terminal sequence of hepatitis C virus genome. Japanese Journal of Experimental Medicine 60:167-177. 20. Longo, M.C., Berninger, M.S. and Hartley, J.L. 1990. Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions. Gene 93:125-128. 21. Richmond, J.Y. and McKinney, R.W. eds. 1999. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. HHS Publication Number (CDC) 93-8395. 22. Clinical and Laboratory Standards Institute. Protection of Laboratory Workers from Infectious Disease Transmitted by Blood, Body Fluids, and Tissue. Approved Guideline. CLSI Document M29-A Villanova, PA:CLSI, 1997. 23. International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations, 41st Edition. 2000. 704 pp.

40/42


10/2005, Revision 6.0

Hepatitis C Virus

" Distributed by

Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ 08876 USA A Roche csoport tagja Roche Diagnostics Indianapolis, IN 46256 USA (For Technical Assistance call the Roche Response Center toll-free: 1-800 526 1247)

Roche Diagnostics H7V 4A2 Laval, Quebec (For Technical Assistance call: Pour toute assistance technique, appeler le: 1-877 273 3433)

Roche Diagnostics (Schweiz) AG CH-6343 Rotkreuz

Roche Diagnostics F-38240 Meylan

Roche Diagnostics GmbH D-68298 Mannheim, Germany

Distributore in Italia: Roche Diagnostics SpA Piazza Durante 11 I-20131 Milano

Roche Diagnostics S.L. E-08006 Barcelona

Distribuidor em Portugal: Roche Farmacêutica Química, Lda P-2700 Amadora

A ROCHE, a CYTOVENE, a FORTOVASE, a HIVID, a PEGASYS, a ROFERON, az AMPLICOR, az AMPLILINK, az AMPERASE és a COBAS a Roche védjegye. A ROCHE RESPONSE CENTER a Roche szolgáltatási védjegye.

A CRIXIVAN® a Merck & Co., Inc. bejegyzett védjegye. A Dynabeads® paramágneses részecskék szabadalmai a Dynal Biotech ASA, Oslo, Norway birtokában vagy általa licencelve vannak. A Dynabeads® a Dynal Biotech ASA, Oslo, Norway bejegyzett védjegye, engedélyezve a Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, Indiana számára. Az Epivir-HBV®, Paxil® és Retrovir® a GlaxoSmithKline bejegyzett védjegye. Az Eppendorf Multipette® és Eppendorf Combitip® az Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Hamburg, Németország, bejegyzett védjegye. Az INFERGEN® az Amgen, Inc. bejegyzett védjegye. Az INTRON®A és INTRON®A/REBETOL® a Schering-Plough Corporation bejegyzett védjegye. A NORVIR® az Abbott Laboratories bejegyzett védjegye. A ProClin® a Rohm and Haas Company bejegyzett védjegye. A PROZAC® az Eli Lilly and Company bejegyzett védjegye.

10/2005, Revision 6.0


41/42

A RESCRIPTOR® és VIRACEPT® az Agouron Pharmaceuticals Inc. bejegyzett védjegye. Az SST® a Becton Dickinson and Co. bejegyzett védjegye. A Symmetrel® az Endo Pharmaceuticals, Inc. bejegyzett védjegye. A VIDEX® és ZERIT® a Bristol-Myers Squibb Company vagy valamelyik osztályának vagy leányvállalatának bejegyzett védjegye. A VIRAMUNE® a Roxane Laboratories, Inc. bejegyzett védjegye. A ZADAXIN® a SciClone Pharmaceuticals, Inc. bejegyzett védjegye. A ZOLOFT® a Pfizer, Inc. és leányvállalatai, vállalatai vagy azok licencet adói vagy vegyesvállalati partnerei bejegyzett védjegye. Copyright 2005, Roche Molecular Systems, Inc. Minden jog fenntartva.

10/2005

(00058003595-03ENGL) 04741765001-02

42/42


10/2005, Revision 6.0

N: Specimen Preparation Kit, ART: version 2

Recommend Documents