HPLC/MS tělních tekutin – nový rozměr v medicinální diagnostice Lukáš Chytil Ústav organické technologie VŠCHT Praha
Medicinální diagnostika a hmotnostní spektrometrie Medicinální diagnostika:
Hmotnostní spektrometrie:
- „Klasické“ biochemické metody - Metody zobrazovací - HPLC, GC/MS
- Kvalitativní a kvantitativní metoda - Citlivost – detekční limit (fmol/µl) - Hmotnostní rozsah (400 000 Da) Medicína
HPLC/MS METODA PRO MEDICINÁLNÍ DIAGNOSTIKU Hmotnostní spektrometrie počet přístrojů v různých odvětvích: 2004
Biochemie
2010
Chemie Fyzika
Biochemie
Chemie Medicína
Fyzika
Hlavní separační techniky pro MS
Plynová chromatografie - GC Plyny, těkavé nízkomolekulární
látky (< 600 Da)
regulace tlaku
nástřik vzorku
Kapalinová chromatografie HPLC Vysokomolekulární (netěkavé) látky ( až 400 000 Da)
dávkovač vzorku pomocí ventilů
zásobník mobilní fáze
regulace průtoku
kolona pro HPLC
kolona pro plynovou chromatografii
manometr vstup do MS
tlumič tlakových nárazů
čerpadlo termostat filtr
vstup do MS
Ionizace při analýze HPLC/MS biomolekul Podmínka pro MS analýzu:MOLEKULA V PLYNNÉ FÁZI (!) V IONIZOVANÉM STAVU MOLEKULA S MOLEKULOVOU HMOTNOSTNí > 600 Da: Termické zplynění (CI nebo EI) nelze Vývoj nových metod: ESI, APCI, MALDI !!!
EI
ESI
W nebo Re katoda
sprejovací kapilára vakuum
M.+ vstup vzorku
anoda
- - - + -- -- + + - - - + - ++ + + oxidace
+ Zdroj vysokého napětí
Taylorův kužel + +
+ + + +
redukce
Analyzátory iontů
IONTOVÁ PAST
kvadrupolové tyče
uzavírací elektrody
+ + + + + + +
KVADRUPOL
+ +
+
+ prstencové elektrody
-
+
Biologický vzorek ODBĚR VZORKU
PŘÍPRAVA VZORKU
ODEBRANÝ VZOREK
MS ANALÝZA
Cesta GC/MS
Cesta HPLC/MS EXTRAKCE MONITOROVANÝCH LÁTEK
IMUNOAFINITNÍ REAKCE
VLASTNÍ HPLC/MS ANALÝZA
KVALITATIVNÍ KVANTITATIVNÍ INFORMACE O MARKERU
DIAGNÓZA
EXTRAKCE MONITOROVANÝCH LÁTEK
DERIVATIZACE
VLASTNÍ GC/MS ANALÝZA
„ASTHMA BRONCHIALE“ – Bronchiální astma
Opakované epizodické stavy dušnosti způsobené bronchokonstrikcí na základě zánětu dýchacích cest
Civilizační onemocnění – rostoucí počet případů – snižující se věk první incidence (2-3 roky života)
Obtížná diagnostika – opakované vyvolávání „umělého astmatického záchvatu“ – pro atmatického pacienta stresující INVAZIVNÍ VYŠETŘENÍ
DECHOVÉ OBTÍŽE
SPRÁVNÁ DIAGNÓZA
DIAGNOSTIKA
HPLC/MS
TERAPIE
„Dechový kondenzát“ • Kondenzát aerosolových částic obsažených ve vydechovaném vzduchu • Složení „Dechového kondenzátu“ odráží složení bronchoalveolární extracelulární plicní tekutiny, které koresponduje s ději odehrávajícími se v plicích • Složení „Dechového kondenzátu“: - Plynná fáze - těkavé látky (CO, NO) - Kapalná fáze – vodní fáze, H2O2 a netěkavé látky (eikosanoidy – MARKERY zánětlivé reakce) ZAŘÍZENÍ K ZÍSKÁNÍ „DECHOVÉHO KONDENZÁTU“:
Leukotrieny a 8-izoprostany v lidském organismu Markery oxidativního stresu a „asthma bronchiale“ H2C
O
mastná kyselina
H2C
O
arachidonát O P R O
C H2
O
peroxoskupina nebo radikál
H 2C O
mastná kyselina
H 2C O
peroxokyselina O P R O
C O H2
1. přestavba 2. redukce peroxidázou
H 2C O
mastná kyselina
H 2C
isoprostan O P R O
O
C O H2
fosfolipid metabolismus cestou 5 - lipoxygenázy
fosfolipáza A2
OH OH
COOH S
COOH
CH2
O
CH2
C
NH
C
CH2
NH2
O Leukotrien C4
CH2 CH2
COOH CH NH2
COOH
HO OH 8 - isoprostan
Příprava vzorku pro HPLC
Imunoafinitní extrakce izoprostanů a leukotrienů
dechový kondenzát
roztok k HPLC/MS
Výsledky měření
LTE4 LTD4 LTC4
8-isoprostan
Mez detekce: 0,05 pg/µl Mez kvantifikace: 0,1 pg/µl
Hmotnostní spektrometrie v diabetologii
Diabetes mellitus – závažné onemocnění Aplikace insulinu – komplikace v pozdních fázích života (poruchy vidění, atd.) Studium dějů po aplikaci insulinu – kombinace MRI a MS
Krevní plazma ACN
-proteiny
odpaření
HCl/BuOH
estrifikované AMK
vzorek plazmy
HPLC/MS
ACN
SPE
Metoda neutrální ztráty Využívá schopnosti skupin látek odštěpovat při fragmentaci stejný elektroneutrální fragment Scan 14 from c:\varianws\data\my files\mk\aminokyseliny\ile-bu01.xms
Scan 142 from c:\varianws\data\my files\mk\aminokyseliny\ile-bu01.xms
Spectrum 1A BP 64 (4.325e+6=100%) ile-bu01.xms 100%
0.238 min. Scan: 14 Channel: Merged Ion: NA RIC: 2.610e+8 (BC)
64
MS spektrum
188
105
75%
MS/MS spektrum
Spectrum 1A BP 85 (4.654e+6=100%) ile-bu01.xms
2.360 min. Scan: 142 Channel: Merged Ion: NA RIC: 7.599e+7 (BC) 85
100%
85
75%
50%
50%
188
25%
25%
188
80 145
76
68
124 94
132
102
155
140
161
188
166 0%
0% 75
100
125
150
175
m/z
50
75
100
125
150
175
m/z
Shrnutí •Byly vyvinuty metody pro detekci leukotrienů jako markerů pro asthma bronchiale, pro detekci markeru oxidativního stresu v organismu-8 isoprostanu a pro sledování hladiny aminokyselin a neurotransmiterů v krevní plazmě. •Metody jsou připraveny pro klinické využití, které bude probíhat v následujících dvou letech na 1.LF UK případně v IKEM. KVALITA
BIOLOGICKÝ VZOREK
HPLC/MS
KVANTITA
