Actuele ontwikkelingen in “Dioxinen analyses met GC-MS/MS” binnen de Agrofood
Sabina Hofmeyer Analytisch Hoofdmedewerker Instrumentele chemie Qlip N.V.
1 oktober 2013
Onze activiteiten zijn gericht op… Voedsel kwaliteit Voedsel veiligheid
Voedsel samenstelling
Verduurzaming
(melk)veehouder
fabrikant
producent
consument
Activiteiten Analyse en kwaliteitsborging rauwe melk
Kwaliteitscontrole van productieproces en producten
Borging van productieproces en zuivelketen
•
Routinelaboratorium > 14 miljoen melkmonsters – Uitbetalingsonderzoek (monsters uit boerderijtanks) – Melkproductieregistratie (monsters van individuele dieren)
•
Chemisch Microbiologisch laboratorium (QCM) – O.a. in kaas, melk, melkpoeder en zuigelingenvoeding: 400.000 analyses – Levering van standaard- en kalibratiemonsters en organisator rondzendonderzoek laboratoria
•
Audits, Inspecties en Certificering – Melkveebedrijven & zuivelfabrieken – 10.000 beoordelingen per jaar
QCM Laboratorium •
Kaas & Ondersteuning o
•
Natchemisch o o o o o
•
Vet-, vocht- en zoutgehalte
Eiwitbepalingen volgens Kjeldahl Vetbepalingen, o.a. volgens Röse-Gottlieb Lactose en sacharose ELISA bepalingen Wateronderzoek
Instrumenteel Chemisch Diergeneesmiddelen (LC-MS/MS) o Zware metalen en mineralen (ICP-MS) o Vitaminen (in ontwikkeling) o Dioxinen, dl-PCB’s, indicator PCB’s (GC-MS/MS) o
•
Microbiologisch o o
Salmonella en Listeria Kiemgetallen
Ontwikkelingen rondom ICP-MS •
Rauwe koemelk bestaat uit ca. 87% water, 3,5% eiwitten, 4,4% vetten, 4,5% koolhydraten en bevat mineralen en vitaminen
•
Mineralen in melk zijn o.a. Ca, P, Zn en Mg
•
Ontwikkelingen rondom ICP-MS Nieuwe ICP-MS vervangt…. • Grafietoven: zware metalen (As, Pb en Cd) • Mercury analyzer: Hg • ICP-OES: 9 mineralen (Ca, P, Zn, Mg, Na, K, Cu, Mn, Fe)
ICP-MS • ICP-MS 1000x gevoeliger dan ICP-OES • Efficiënter, meer elementen in één run • Huidige ontwikkeling van 13 naar meer dan 20 elementen
Vitaminen •
Onderzoek van belang in zuigelingenvoeding
•
Huidige methodes met HPLC technieken volgens standaard richtlijnen voor individuele vitaminen (AOAC, CEN)
•
In ontwikkeling, multicomponent analyse van vet- en water oplosbare vitamines met UPLC-MS/MS
B6
C
A
B2
D3
K1
A
Time (min)
Retinol-palmitate
Retinol
B5
B3
Retinol-acetaat
Intensity (cps)
B8
Vet oplosbaar: E
A
B1
Vitamine A, D, E en K Water oplosbaar: Vitamine B en C
Dioxinen Voor onderzoek op dioxinen, dl-PCB’s en indicator PCB’s in melk, melkproducten en eieren heeft Qlip recentelijk de succesvolle overstap gemaakt van GC-HRMS naar GC-MS/MS Scopes
GC-MS/MS analyses
Milk and Dairy
Dioxins, dioxin-like PCB’s (indicator PCB’s and organochloorpesticides)
Eggs
Dioxins, dioxin-like PCB’s and indicator PCB’s
Dioxinen •
Ontstaan bij verbranding van materialen die gechloreerde koolwaterstoffen bevatten
•
Wordt opgeslagen in vet en komt voor in dierlijke producten (vis, vlees, eieren, melk en zuivelproducten)
•
Onder dioxinen vallen 210 dioxinen (PCDD) en furanen (PCDF), waarvan 17 sterk toxisch
•
Meest toxische dioxinen zijn 2,3,7,8-TCDD en 1,2,3,7,8-PeCD
•
Dioxineachtige PCB’s bevatten dezelfde toxische eigenschappen als dioxinen, waarvan PCB 126 en PCB 169 het meest toxisch
Dioxinen met GC-MS/MS
Een interessant alternatief voor GC-HRMS: • Goedkoper • Robuust • Grote gevoeligheid en massa selectiviteit • Lage detectiegrenzen
Ontwikkeltraject •
2010 Prestaties van de GC-MS/MS
•
2011 Implementatie, validatie en accreditatie van de bepaling van dioxinen en dl-PCB’s in melk en zuivelproducten met GC-MS/MS
•
2012 Validatie en accreditatie van de bepaling van dioxinen, dl-PCB’s en indicator PCB’s in eieren “The Committee was informed that an amendment to the Regulation (EU) 252/2012 in order to provide for performance criteria for using GCMS/MS as a confirmatory method as an Alternative for the HRGC-HRMS was discussed at the Expert Committee "POPs in Food“ 18 juni 2012
•
2013 Het besluit
•
2014 GC-MS/MS in EU verordening!
Van GC-HRMS naar GC-MS/MS Samen met Interscience zijn de prestaties van de dioxinen bepaling met GC-MS/MS (TSQ Quantum XLS) vastgesteld: • Full scan spectra • Selectie van precursor ionen (m/z) • MS/MS spectra bij toenemende collision energieën • Selectie fragmentionen bij optimale collision energie • Single Reaction Monitoring (SRM) methode
Validatie Validatie conform EU regelgeving: • • • •
EG Verordening 1883/2006 EU Verordening 252/2012 EG Beschikking van de Commissie 2002/657 NEN 7777: Milieu en voedingsmiddelen
Uitvoering: •
Door selectie van 20 verschillende monsters • •
•
Eén eindextract verdeeld over 2 vials Parallel lopende analyses op GC-MS/MS en GC-HRMS
Door een direct vergelijk tussen GC-HRMS vs GC-MS/MS • •
Voor beoordeling gelijkwaardigheid zijn prestatiekenmerken vergeleken Prestatiekenmerken zijn getoetst aan geldende EU criteria
Prestatiekenmerken GC-MS/MS vs GC-HRMS Herhaalbaarheid (r) • Binnenlabreproduceerbaarheid (Rw) • Laboratoriummeetonzekerheid (U) • Detectiegrenzen •
- Aantoonbaarheidsgrens (AGRw) - Rapportagegrens (RG) - Actiegrens/ actiedrempel
Juistheid op basis van terugvinding (J) • Ionratio (R) bepaald conform EG criteria 657/2002 •
Vergelijk detectiegrenzen
2,3,7,8,-TCDD
2,3,7,8,-TCDD
GC-HRMS Aanwezige achtergrondruis S/N ≥ 3
Standaard dioxinen c 0,003 ng/ml GC-HRMS
GC-MS/MS Elektronische ruis ? S/N …?
Standaard dioxinen c 0,003 ng/ml GC-MS/MS
Detectiegrens GC-MS/MS Additieniveau’s •
Onder de actiedrempel (EU aanbeveling 2011/516)
•
Op normniveau (WHO-TEQ) (EU verordening 2011/1259) De totale concentratie (som) aan dioxineachtige verbindingen wordt uitgedrukt in toxiciteitequivalenten (TEQ) (WHO-TEQ) Rauwe melk en overige zuivelproducten Parameters
Jaar
PCDD/F
No-PCB
Mo-PCB
PCB (totaal)
PCDD/F-PCB
Normniveau (pg/g vet)
t/m 2011
3,0
…
…
3,0
6,0
Normniveau (pg/g vet)
2012
2,5
…
…
3,0
5,5
Actiedrempel (pg/g vet)
t/m 2011
2,0
…
…
2,0
…
Actiedrempel (pg/g vet)
2012
1,75
…
…
2,0
…
•
Op rapportagegrens (RG) 10x ≤ normniveau, RG ≥ AGRw
•
Detectiegrens op aantoonbaarheidsgrens, AGRw= 3*sRw
GC-MS/MS vs GC-HRMS rapportagegrens WHO-TEQ PCDD/F-PCB in 2011 6,0 pg/g vet, nu 5,5 pg/g vet Rapportagegrens 10x ≤ normniveau (WHO-TEQ): 0,6 pg/g vet
• •
WHO-PCDD/F-PCB-TEQ
0,70
0,80 0,60 0,40 0,20
GC-HRMS
GC-MS/MS
c o n c e n tr a tie (p g /g v e t)
0,60
0,50
0,40
0,30
0,20
0,00
ka as m el kp oe de r bo te r m elk lle
elk
vo
m
elk m
as ka
te r bo
as ka
om
m elk m el kp oe de r vo lle m e m lk el kp oe de r m elk
lle vo
ro
elk m
te r
0,10
bo
concentratie (pg/g vet)
1,00
0,00
GC-HRMS
GC-MS/MS
Juistheid GC-MS/MS vs GC-HRMS • •
Juistheid op basis van terugvinding in melk en zuivelproducten Vergelijking m.b.v. de T-toets van gehalten rond normniveau (WHO-TEQ) PCDD/F
No-PCB
Mo-PCB
PCB (totaal)
PCB-PCDD/F
Melk (n = 8) Gemiddelde (pg/g vet)
HRMS
MS/MS
HRMS
MS/MS
HRMS
MS/MS
HRMS
MS/MS
HRMS
MS/MS
3,42
3,46
2,51
2,44
0,84
0,86
3,36
3,30
6,78
6,75
Juistheid MS/MS t.o.v. HRMS (%)
101
97
102
98
100
Significant verschil
Nee
Nee
Nee
Nee
Nee
PCDD/F
No-PCB
Mo-PCB
PCB (totaal)
PCB-PCDD/F
Zuivelproducten (n = 11) Gemiddelde (pg/g vet)
HRMS
MS/MS
HRMS
MS/MS
HRMS
MS/MS
HRMS
MS/MS
HRMS
MS/MS
3,47
3,36
2,43
2,56
0,84
0,88
3,28
3,44
6,75
6,80
Juistheid MS/MS t.o.v. HRMS (%)
97
94
98
95
96
Significant verschil
Nee
Nee
Nee
Nee
Nee
Ionratio (R) •
Voor de juiste kwantificering en identificatie
•
GC-HRMS: isotoopratio mag niet meer afwijken dan 15%, EPA1613
•
GC-MS/MS: ionratio bepaald conform EG beschikking 2002/657 •
4 identificatiepunten: 2 geselecteerde precursor-ionen met elk 1 dochterion óf 1 precursor-ion met 2 dochterionen
•
Ionratio (R) =
Piekopperv lakte Confir ming piek (m/z) × 100% Piekopperv lakte Quantifier piek (m/z)
EG criteria 2002/657 voor maximaal toegestane afwijking in ionratio (∆R) Ionratio (R)
Toegestane relatieve afwijking (∆ ∆R)
R > 50%
20%
20% < R ≤ 50%
25%
10% < R ≤ 20%
30%
R ≤ 10%
50%
Identificatie 1,2,3,7,8-PeCDD • • •
Door selectie van 2 precursor-ionen, elk met 1 dochterion Toevoeging op 0,5*TEQ ≈ 0,5 pg/g vet 1,2,3,7,8-PeCDD aan boter Gemiddelde ionratio in standaard is 53%, relatieve afwijking is 20% Ionratio 1,2,3,7,8-PeCDD is 54% Géén interferentie op 0,5*TEQ niveau
Quantifier piek 355.90 > 292.90 m/z
Confirming piek 357.90 > 294.9 m/z
Conclusie GC-MS/MS vs HRMS GC-MS/MS is geschikt als: •
Screeningstechniek Voor het aantonen van verdachte monsters met gehalten ≥ actiedrempel (EU aanbeveling 2011/516)
•
Bevestigingstechniek Voor identificeren en nauwkeurig kwantificeren van doelstoffen Gelijkwaardigheid van de GC-MS/MS vs GC-HRMS is aangetoond Voldoet aan de criteria uit EU verordening 252/2012 met uitzondering van de detector, MS/MS i.p.v. HRMS Opmerking: goede sample prep is wel een vereiste
Samenvatting • Zware metalen en mineralen met ICP-MS • •
Geschikt voor analyse > 20 elementen in één run Efficiënt en grote gevoeligheid
• Vitaminen met UPLC-MS/MS • •
Multicomponent analyse voor alle vet- en water oplosbare vitamines is mogelijk Snel en eenvoudig
• Dioxinen met GC-MS/MS • • • • •
Geschikt alternatief voor GC-HRMS Voor screening en bevestiging Vanaf 2014 ook in geldende EU verordening Een goedkopere en robuuste techniek Ook geschikt voor multicomponent analyses als pesticiden
