Molekulárně-mikrobiologická diagnostika u pacientů s infekční endokarditidou

MASARYKOVA UNIVERZITA LÉKAŘSKÁ FAKULTA

Mikrobiologický ústav Fakultní nemocnice u svaté Anny a CENTRUM KARDIOVASKULÁRNÍ A TRANSPLANTAČNÍ CHIRURGIE

Molekulárně-mikrobiologická diagnostika u pacientů s infekční endokarditidou Disertační práce

Mgr. Barbora Ţaloudíková

Brno 2011

Molekulárně-mikrobiologická diagnostika u pacientů s infekční endokarditidou

Poděkování Ráda bych na tomto místě poděkovala svému školiteli MUDr. Tomáši Freibergerovi, PhD. za odborné vedení, cenné diskuse a kritické poznámky k této práci, jakoţ i příleţitosti získání zkušeností v oblasti rutinní molekulárně-mikrobiologické diagnostiky patogenů a jejich interpretace v klinickém kontextu. Za cenné podněty k práci a příleţitost podílet se na výuce lékařské mikrobiologie při LF MU děkuji Prof. MUDr. Miroslavu Votavovi, CSc. Za poskytnutí mikrobiologického materiálu, odborné konzultace a kritické poznámky k této práci děkuji Ing. Veronice Holé, Ph D. a doc. MUDr. Filipu Růţičkovi, PhD. Za kritické poznámky k této práci rovněţ děkuji MUDr. Janě Juránkové, PhD. Ráda bych téţ poděkovala za spolupráci při sběru klinických dat MUDr. Jiřímu Polovi z Centra kardiovaskulární a transplantační chirurgie (CKTCH) v Brně, MUDr. Zdeňku Šormovi z Kardiochirurgické kliniky ve Fakultní nemocnici v Hradci Králové a MUDr. Karolíně Novotné a MUDr. Šárce Wurmové z Institutu Klinické a experimentální medicíny v Praze. Za statistické zpracování velmi děkuji doc. RNDr. Ladislavu Duškovi, PhD. Mé velké díky patří mým kolegyním z Genetické laboratoře CKTCH za příjemné pracovní prostředí a dobrou spolupráci. Za velkou osobní i technickou podporu a podnětné diskuse v průběhu přípravy této práce velmi děkuji příteli Michalu Mališovi.

2


3


OBSAH 1

SEZNAM POUŢÍVANÝCH ZKRATEK........................................................................... 7

2

ÚVOD ................................................................................................................................. 8 2.1

Patofyziologie IE ....................................................................................................... 10

2.1.1

Patogeneze IE nativních chlopní ........................................................................ 10

2.1.2

Patogeneze IE prostetických chlopní ................................................................. 11

2.2

Incidence a epidemiologie IE .................................................................................... 11

2.3

Etiologie IE ................................................................................................................ 12

2.4

Faktory virulence grampozitivních bakterií .............................................................. 14

2.5

Antibiotická rezistence u stafylokoků ....................................................................... 14

2.5.1

Epidemiologie kmenů MRSA ............................................................................ 16

2.5.2

Epidemiologie kmenů KNS rezistentních k oxacilinu (MRKNS) ..................... 18

2.6

Predisponující faktory IE ........................................................................................... 19

2.7

Klinické projevy IE ................................................................................................... 20

2.8

Kritéria pro diagnostiku IE ........................................................................................ 22

2.9

Léčba IE ..................................................................................................................... 26

2.9.1

Konzervativní léčba ............................................................................................ 26

2.9.2

Chirurgická léčba ............................................................................................... 27

2.10 Současné metody diagnostiky IE ............................................................................... 28 2.10.1

Echokardiografie ................................................................................................ 28

2.10.2

Standardní mikrobiologická diagnostika ............................................................ 29

2.10.2.1.1 Odlišení stafylokoků od ostatních bakterií způsobujících IE ................ 30 2.10.2.1.2 Rozlišení kmenů S. aureus a KNS. ........................................................ 30 2.10.2.1.3 Stanovení citlivosti stafylokoků k antibiotikům .................................... 31 2.10.3

Histologie ........................................................................................................... 32

2.10.4

Alternativní metody detekce patogenů ............................................................... 32

2.10.4.1

Serologie ..................................................................................................... 32

2.10.4.2

Molekulárně-biologická detekce ................................................................. 33

2.10.4.2.1 Detekce patogenů pomocí širokospektré PCR ....................................... 33 2.10.4.2.2 Detekce patogenů pomocí specifické PCR ............................................ 34 3

CÍLE STUDIE .................................................................................................................. 36

4

MATERIÁL A METODY ................................................................................................ 37 4.1

Optimalizace PCR pro průkaz stafylokoků ............................................................... 37

4.1.1 4.1.1.1 4.2

Testované kmeny................................................................................................ 37 Stanovení antibiotické citlivosti .................................................................. 37

Analyzovaná skupina ................................................................................................. 39

4


4.3

Kontrolní skupina ...................................................................................................... 39

4.4

Sběr klinických dat .................................................................................................... 39

4.5

Metody průkazu patogenů ......................................................................................... 40

4.5.1

Hemokultury....................................................................................................... 40

4.5.2

Kultivace z chirurgického materiálu .................................................................. 40

4.5.3

Molekulárně-biologická detekce ........................................................................ 40

4.6 5

Izolace DNA z bakteriální / houbové suspenze .......................................... 40

4.5.3.2

Izolace DNA z chirurgického materiálu ..................................................... 41

4.5.3.3

Specifická PCR pro průkaz stafylokoků ..................................................... 41

4.5.3.4

Širokospektrá PCR a sekvencování ............................................................ 42

Statistika .................................................................................................................... 44

VÝSLEDKY ..................................................................................................................... 45 5.1

Přínos širokospektré detekce bakterií pro klinickou praxi ........................................ 45

5.2

Optimalizace podmínek PCR specifické pro stafylokoky ......................................... 46

5.2.1

Analytická sensitivita PCR pro stafylokoky ...................................................... 46

5.2.2

Analytická specificita PCR pro stafylokoky ...................................................... 47

5.2.3

PCR pro intranasální screening MRSA .............................................................. 49

5.3

6

4.5.3.1

Detekce stafylokoků u chirurgicky léčených pacientů s IE ....................................... 50

5.3.1

Srovnání specifické a širokospektré PCR .......................................................... 52

5.3.2

Srovnání PCR se standardní kultivací u pacientů s IE ....................................... 53

5.3.3

Stanovení etiologie IE u jednotlivých pacientů .................................................. 54

5.3.4

Stanovení úlohy PCR v diagnostice IE .............................................................. 57

5.3.5

Etiologie a klinické projevy IE ........................................................................... 58

DISKUSE .......................................................................................................................... 60 6.1

Vyuţití širokospektré PCR a sekvencování v diagnostické praxi ............................. 60

6.2

Výsledky testování PCR specifické pro stafylokoky ................................................ 60

6.3

Vyuţití specifické PCR pro intranasální screening MRSA ....................................... 63

6.4

Vyuţití specifické PCR pro detekci stafylokoků v krvi ............................................ 63

6.4.1

Sensitivita specifické PCR v krvi ....................................................................... 63

6.4.2

Komerční soupravy pro detekci patogenů v krvi ............................................... 63

6.4.2.1

Soupravy závislé na předchozí kultivaci patogena ..................................... 63

6.4.2.2

Soupravy pro přímou detekci patogenů v krvi ............................................ 64

6.5

Efektivita PCR pro průkaz stafylokoků v chirurgickém materiálu ........................... 66

6.6

Srovnání PCR se standardními metodami průkazu etiologie .................................... 66

6.7

Etiologie IE v našem souboru .................................................................................... 68

6.8

Role PCR v diagnostice IE ........................................................................................ 69

5


6.9

Klinické projevy IE způsobené stafylokoky .............................................................. 69

6.10 International Collaboration on Endocarditis (ICE) ................................................... 70 7

ZÁVĚR ............................................................................................................................. 71

8

LITERATURA ................................................................................................................. 73

9

SEZNAM PŘÍLOH ........................................................................................................... 81

6


1 SEZNAM POUŢÍVANÝCH ZKRATEK CA-MRSA

komunitní kmen S. aureus rezistentní k meticilinu (oxacilinu)

CKTCH

Centrum kardiovaskulární a transplantační chirurgie

NCCLS

National Comittee for Clinical Laboratory Standards

EUCAST

European Comittee on Antibiotic Susceptibility Testing

HACEK

Haemophillus sp., Actinobacillus sp., Cardiobacterium sp., Eikenella sp., Kingella sp.

HA-MRSA

nemocniční kmen S. aureus rezistentní k meticilinu (oxacilinu)

HK

hemokultura

ICE

International Collaboration on Endocarditis

ICD

intrakardiálně uloţené těleso

IE

infekční endokarditida

KT

kultivace z chirurgického materiálu (tkáně)

CFU

kolonie tvořící jednotka (kolonie vzniklé dělením jedné buňky)

MIC

minimální inhibiční koncentrace

mecA

gen kódující rezistenci k meticilinu (oxacilinu)

NIE

nativní infekční endokarditida

NRL ATB

Národní referenční laboratoř pro antibiotika

MRKNS

koagulázanegativní stafylokoky rezistentní k meticilinu (oxacilinu)

MRSA

S. aureus rezistentní k meticilinu (oxacilinu)

MSSA

S. aureus citlivý k meticilinu (oxacilinu)

MSKNS

koagulázanegativní stafylokoky citlivé k meticilinu (oxacilinu)

PBP-2A

alternativní

transpeptidáza, která zabraňuje

antibiotik (je kódovaná genem mecA) PCR

polymerázová řetězová reakce

PIE

prostetická infekční endokarditida

TEE

transesofageální echokardiografie

TTE

transtorakální echokardiografie

16S rRNA

malá ribozomální podjednotka 16S

7

působení

betalaktamových


2 ÚVOD Kulturní svět si letos připomíná 150. výročí narození světoznámého hudebního skladatele, Gustava Mahlera (1860-1911), který 18. května 1911 podlehl následkům infekční endokarditidy (IE): „…I přes vysokou horečku trvá Gustav Mahler v únoru 1911 na účasti na svém koncertě v Carnegie Hall, v New Yorku, posledním v jeho životě. Po týdnech upoutaných na lůžku lékaři Mahlerovi sdělují diagnózu revmatické choroby srdeční a bakteriální endokarditidy. Mahler je léčen antibakteriálním sérem, které dočasně zmírňuje klinické příznaky. V dubnu 1911 se v doprovodu rodiny a zdravotní pečovatelky vrací lodní dopravou z Ameriky zpět do Evropy. Po deseti dnech cesty je Mahler hospitalizován na klinice v Neuilly, v Paříži, kde francouzský bakteriolog A. Chantemesse potvrzuje pozitivní výsledky hemokultur z NewYorské laboratoře: “Now Madame Mahler, come and look. Even I - my self - have never seen streptococci in such a marvelous state of development. Just look at these threads – its like a seaweed!” (Prendergast 2006, Christy, Christy a Wood 1971) & Muzeum G. Mahlera v Jihlavě

V důsledku antibiotické terapie streptokokových infekcí stále ubývá klasických případů IE jako následku revmatické choroby srdeční. I přesto však zůstává letalita tohoto onemocnění 20-30 % (Habib et al. 2009, Baddour et al. 2005, Westphal, Plicht a Naber 2009, Murdoch et al. 2009). V posledních desetiletích dochází k významným změnám v epidemiologických i klinických charakteristikách IE. S prodluţující se průměrnou délkou ţivota populace, se setkáváme s častějším výskytem degenerativního postiţení chlopní nebo přítomností prostetických srdečních materiálů. Riziko bakteriémií zvyšují i stále častější invazivní zdravotnické výkony, v komunitě je rizikovým faktorem intravenózní uţívání drog (Habib et al. 2009, Baddour et al. 2005, Beneš 2010). V souvislosti s uvedenými změnami došlo v posledních letech, především ve vyspělých zemích, ke změně etiologie IE od původně nejčastějších streptokoků ke stafylokokům (Prendergast 2006, Habib et al. 2009, Pol et al. 2010, Pazdernik, Baddour a Pelouch 2009, Hill et al. 2006, Fitzsimmons, Bamber a Smalley 2010, Fowler et al. 2005). Narozdíl od endokarditid způsobených jinými bakteriálními agens

8


probíhají stafylokokové endokarditidy agresivněji, s vyšším rizikem mortality (Miro et al., 2005; Murdoch et al., 2009). Výběr antibiotik pro terapii stafylokokové IE je omezen rezistencí k isoxazolylovým semisyntetickým penicilinům (meticilin, oxacilin atd.) a všem betalaktamům, často včetně jejich kombinace s inhibitory betalaktamáz. Standardní kultivační metody průkazu stafylokoků mohou selhat především u pacientů, kteří jiţ podstoupili konzervativní léčbu vysokými dávkami antibiotik. Alternativní molekulárně-biologické metody rychlého průkazu stafylokoků a jejich rezistence k oxacilinu a ostatním betalaktamům nejsou závislé na růstu mikrobů a mohou pomoci při rychlé detekci etiologického agens a stanovení jeho citlivosti k oxacilinu u pacientů pod antibiotickou clonou.

9


2.1 Patofyziologie IE Infekční endokarditida (IE) je zánětlivé onemocnění vnitřní výstelky srdce, které je vyvoláno infekčním agens bakteriálního nebo houbového původu. Podmínkou vzniku primární infekce srdečních chlopní je bakteriémie nebo fungémie, tj. infekční agens kolující v krvi, a jeho usazení na chlopni nebo jejím závěsném aparátu (viz dále). Intenzita bakteriémie a délka jejího trvání hrají důleţitou roli pro uchycení agens na chlopni (Habib et al. 2009, Baddour et al. 2005, Beneš, Mokráček a Gregor 2007). Většina patogenů přednostně napadá mechanicky nebo zánětlivě poškozené nativní chlopně a umělé srdeční materiály. V místě poškození dochází ke vzniku trombů, v nichţ se zachytí infekční agens kolující v krvi. Infikovaná vegetace tvořená trombocyty, infekčním agens a granulocyty se působením monocytů, cytokinů a tkáňového faktoru zvětšuje a narušuje správnou funkci chlopně. Část vegetace (infekční embolus) se můţe uvolnit do krevního řečiště a diseminovat do tenkých periferních kapilár v mozku, slezině, ledvinách aj. 2.1.1 Patogeneze IE nativních chlopní V důsledku hemodynamických nebo mechanických změn na srdečních chlopních a v jejich okolí vzniká v krevním řečišti turbulentní proudění, které vede k vytvoření mechanických lézí na chlopních. Z místa poškozené tkáně (léze) poté dochází k uvolnění tkáňového faktoru, který je v průběhu standardního procesu hojení signálem k následné reparaci fibrinem a krevními destičkami. V rámci tohoto procesu na endotelu vznikají drobné tromby, které se stávají základem pro vznik nebakteriální trombotické vegetace měnící povrchové vlastnosti endotelu chlopní a jejich šlašinek. Tyto tromby slouţí jako záchytné místo pro infekční agens, která v krvi cirkulují při bakteriémii. Krevní destičky mají zásadní vliv na to, zda se infekční agens na chlopeň přichytí a začne infekční proces nebo se odplaví zpět do krevního řečiště. Druhou moţností vzniku primární infekce chlopně je zánětlivý proces probíhající na endotelu, který vede endoteliální buňky k produkci transmembránových proteinů, tzv. integrinů. Tyto proteiny váţí na povrch endotelií (resp. chlopní) cirkulující fibronektin. Aktivované endotelové buňky se tak stanou ideálním adhezivním povrchem pro cirkulující mikroby s proteiny vázajícími fibronektin na povrchu (FBP), především Staphylococcus aureus nebo některé intracelulární patogeny způsobující IE. Stafylokoky a intracelulární bakterie jsou na rozdíl od většiny ostatních typických agens IE buňkami endotelu pohlceny. Intracelulárně umístěné stafylokoky chráněné před účinkem antibiotik pak produkují toxiny

10


poškozující celou chlopeň a okolní tkáň se vznikajícími opouzdřenými abscesy (Que et al. 2005, Seifert et al. 2003). 2.1.2 Patogeneze IE prostetických chlopní Povrch mechanické chlopně nebo bioprotézy se bezprostředně po jeho umístění v těle potahuje fibrinem, jenţ můţe atrahovat fibrin-vázající mikroby kolující v krvi při bakteriémii (Fitzgerald et al. 2006). Pro infekci prostetického materiálu stačí niţší bakteriální náloţ neţ v případě nativní IE (Senining et al. 2001). Infekce bývá lokalizována nejčastěji v místě přišití implantátu a vede k jeho uvolnění (Piper, Körfer a Horstkotte 2001, Mahesh et al. 2005). Časná prostetická endokarditida (PIE) vzniká pravděpodobně díky kontaminaci materiálu jiţ při implantaci umělé chlopně a to do několika měsíců od chirurgické výměny. Oproti tomu pozdní PIE vzniká endogenně, nejčastěji jako následek předchozí bakteriémie, např. po zubním zákroku nebo při infekci jiné části těla, a to nejdříve po jednom roce od implantace (Habib et al. 2009).

2.2 Incidence a epidemiologie IE Incidence nativní IE se mezi jednotlivými zeměmi liší, leč v průměru se pohybuje přibliţně mezi 3-10 případy na 100 000 obyvatel/rok (Beneš 2010). PIE je diagnostikována u 10-30 % všech pacientů s infekční endokarditidou, mezi pacienty s prostetickým materiálem je to přibliţně 1-6 % (Wang et al. 2007, Habib et al. 2009). U pacientů nad 50 let věku se incidence zvyšuje na 15 případů na 100 000 obyvatel/rok. U intravenózních narkomanů je incidence IE aţ 100x vyšší neţ v běţné populaci. U muţů je onemocnění dvakrát častější neţ u ţen, coţ není zatím spolehlivě vysvětleno (Beneš et al. 2007, Habib et al. 2009). Z hlediska epidemiologie rozlišujeme endokarditidu získanou v komunitě od endokarditidy nozokomiální, která bývá spojena s intravenózními zákroky. Ve vyspělých zemích představuje nozokomiální IE 5-29 % z celkového počtu případů IE (Habib et al. 2009). Mortalita IE závisí především na klinickém obrazu a typu etiologického agens. Zatímco mortalita IE vyvolaná dobře citlivými streptokoky nepřesahuje 3 %, mortalita nozokomiální IE vyvolané stafylokoky se pohybuje mezi 25-40 % (Beneš et al. 2007). Levostranná IE způsobená S. aureus je spojená především s vysokým výskytem mozkových embolizací, které mají na svědomí vysokou mortalitu (Fernandez Guerrero et al. 2009, Beneš et al. 2007). Mortalita nozokomiální IE způsobená multirezistentními mikroby (např. S.

11


aureus rezistentní k meticilinu (oxacilinu) (MRSA), vankomycin rezistentními enterokoky aj.) dosahuje 40-56 % (Beneš et al. 2007). Nemocniční mortalita IE způsobené S. aureus se neliší od IE způsobené koagulázanegativními stafylokoky (KNS). Jedním z moţných vysvětlení je zpoţdění stanovení diagnózy IE , jelikoţ KNS mohou být povaţovány za pouhou kontaminaci (Chu 2008, Chu et al. 2004). Po jednom roce sledování je však vyšší mortalita pozorována u pacientů se S. aureus (Rasmussen et al. 2009). Špatnou prognózu vykazují častěji pacienti na dlouhodobé hemodialýze a s IE způsobenou MRSA (Kuo et al. 2007). U nativní IE způsobené oběma typy stafylokoků se mortalita příliš neliší (Chu et al. 2004), zatímco u prostetické IE způsobené KNS je mortalita podstatně niţší (přibliţně 24 %) neţ mortalita prostetické IE způsobené S. aureus (36 %). Při PIE způsobené KNS existuje signifikantně vyšší procento výskytu intrakardiálního abscesu neţ u PIE způsobené S. aureus nebo viridujícími streptokoky (Chu et al. 2009). Mortalita mykotických endokarditid přesahuje 80 %, ale na rozdíl od stafylokokové endokarditidy je IE vyvolaná houbami poměrně vzácná (Beneš et al. 2007).

2.3 Etiologie IE Z výše uvedeného je zřejmé, ţe typ etiologického agens IE a jeho citlivost k antimikrobním látkám má přímý vliv na prognózu IE (Wang et al. 2007, Tornos et al. 1997). Ač byly dlouho nejčastějším etiologickým agens a hlavní příčinou infekční endokarditidy především viridující streptokoky, v souvislosti s přibývajícím pouţíváním dlouhodobých centrálních katetrů a hemodialýz jsou v posledních letech především ve vyspělých zemích nejčastějším agens IE stafylokoky (Prendergast 2006, Pazdernik et al. 2009, Fitzsimmons et al. 2010, Hill et al. 2006, Pol et al. 2010, Westphal et al. 2009, Fowler et al. 2005, Fernandez Guerrero et al. 2009, Beneš et al. 2000). Podle výsledků velkých multicentrických studií je nejčastější příčinou nativní akutní IE především v souvislosti se zdravotnickými zákroky a intravenózním uţíváním drog S. aureus (Murdoch et al. 2009, Fowler et al. 2005). Časná forma prostetické endokarditidy bývá spojována spíše s KNS, nejčastěji S. epidermidis (85 %), dále S. hominis (6 %), S. lugdunensis (5 %), S. capitis, S. caprae a S. simulans (Petti et al. 2008, Chu et al. 2009, Chu 2008). Výsledky prospektivní multicentrické studie provedené skupinou ICE (International Collaboration on Endocarditis) ukazují stále častější výskyt KNS i v souvislosti s nativní IE (Chu et al. 2008). Zatímco IE způsobené S. aureus jsou akutní a destruktivní, IE způsobené

12


KNS (s výjimkou S. lugdunensis a některých kmenů S. capitis) mají více protrahovaný průběh (Piette a Verschraegen 2009). Streptokoky bývají spojovány především se subakutní nativní IE, vzácněji mohou způsobovat i prostetickou endokarditidu. Nejčastěji izolovanými zástupci viridujících streptokoků jsou S. sanguis, S. mitis, S. salivarius, S. mutans aj., které bývají spojovány s nedostatečnou hygienou ústní dutiny nebo se zubním zánětem/zákrokem. Dále jsou to streptokoky skupiny “milleri“, tj. S. anginosus, S. intermedius, S. constellatus (Lefort et al. 2002) a streptokoky antigenní skupiny D, tj. S. bovis a S. equinus aj. (Corredoira et al. 2008, Hoen et al. 2005). Z nutričních variant streptokoků jsou v souvislosti s IE popisovány Granulicatella sp. či Abiotrophia sp. (Lin a Hsu 2007). Nejčastějšími druhy enterokoků nalézaných u pacientů s IE jsou E. faecalis, E. faecium nebo E. durans (Habib et al. 2009). Na rozdíl od sepsí mohou infekční endokarditidu vzácně vyvolávat i náročné Gbakterie, jako např. bakterie skupiny HACEK (u přibliţně 5 % případů) : Haemophillus influenzae, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Cardiobacterium hominis, Eikenella sp. a Kingella sp., které bývají spojovány s infekcí respiračního ústrojí. S rozvojem alternativních metod detekce mikrobů se rozšířilo spektrum známých původců o tzv. atypické mikroorganismy (viz dále). Stále častěji, nyní především u pacientů s chlopenní náhradou, pacemakery nebo u imunokompromitovaných, bývají zachycovány intracelulární bakterie (Bartonella quintana, Brucella sp., Coxiella burnetii) nebo atypické aktinomycety, např. Tropheryma whipplei (Brouqui a Raoult 2001, Escher et al. 2010). Velmi vzácně jsou nalézány jako příčina IE anaeroby (např. Gemella sp., Peptostreptococcus sp.), kde je nejčastějším zdrojem gastrointestinální nebo urogenitální trakt, případně infekce hlavy a krku (Brook 2008, Zakir et al. 2004). U pacientů s imunosupresí nebo prostetickým materiálem můţeme nalézt vláknité houby, zejména Aspergillus sp. nebo kvasinky rodu Candida (Kalokhe et al. 2010, Baddley et al. 2008). V následující kapitole se budu dále blíţe věnovat faktorům virulence a patogenity stafylokoků, nejčastějším etiologickým agens popisovaným v souvislosti s IE.

13


2.4 Faktory virulence grampozitivních bakterií Díky zvýšené afinitě grampozitivních (G+) bakterií (především stafylokoků a viridujících streptokoků) k endokardu chlopní, vzbuzuje jejich nález v hemokultuře váţné podezření na IE (Habib et al. 2009). Kromě schopnosti odolávat účinku mikrobicidních proteinů produkovaných krevními destičkami (PMP), jsou G+ bakterie navíc rezistentní vůči komplementu. Zatímco některé streptokoky mají na svém povrchu dextrany, jimiţ adherují na trombotické vegetace, kmeny S. aureus disponují povrchovými adheziny, které jsou vázány v buněčné stěně (tzv. clumping factor neboli vázaná plasmakoaguláza), se schopností shlukovat krevní destičky a vytvářet tak základ infikované trombotické vegetace (Tak et al. 2002). U kmenů S. epidermidis byl popsán kapsulární polysacharid-adhesin (PS/A), fibrinogen-vázající protein (Fbe) a polysacharidový intercelulární antigen (PIA), které se podílejí na schopnosti S. epidermidis a některých KNS vázat fibrin a tvořit především na umělém materiálu tzv. biofilm. Jedná se o vrstvu stafylokoků obalenou extracelulární polysacharidovou matrix neboli bakteriálním slizem. Stafylokokový sliz účinkuje především na polymorfonukleáry, které atrahuje, vyvolá jejich degranulaci a potlačí jejich schopnost pohlcovat a zabíjet samotné stafylokoky. Bakterie v biofilmu jsou tak 10-1000x rezistentnější k antibiotikům neţ jejich planktonické formy (Que et al. 2005, Neut et al. 2007). Biofilm můţe fungovat jako mechanická bariéra pro průnik antibiotik. Uvnitř biofilmu můţe také vzniknout subpopulace buněk, které velmi pomalu rostou a jsou tak odolné k antibiotikům působícím na buněčnou stěnu. Toto malé procento rezistentních buněk, tzv. perzistorů, se můţe po ukončení antibiotické terapie stát základem nové rezistentní populace (Stewart a Costerton 2001).

2.5 Antibiotická rezistence u stafylokoků V současné době je přibliţně 98 % kmenů KNS a S. aureus rezistentních k penicilinu. Za rezistenci k jednoduchým betalaktamům (benzylpenicilinu aj.) je zodpovědný gen blaZ, který kóduje betalaktamázu štěpící betalaktamový kruh. Tyto kmeny jsou citlivé k betalaktamům s inhibitorem betalaktamáz. Téměř bezprostředně po uvedení isoxazolylových semisyntetických penicilinů (oxacilinu) odolných k účinkům betalaktamázy (i s inhibitorem betalaktamázy), byly

14


detekovány první kmeny KNS, které k nim byly rezistentní. Za rezistenci zodpovědný gen mecA kóduje alternativní formu transpeptidázy vázající penicilin (oxacilin), tzv. PBP-2A (penicilin binding protein). Tato forma proteinu umoţňuje syntézu buněčné stěny stafylokoků i v přítomnosti betalaktamových antibiotik a to i v kombinaci s inhibitory betalaktamáz. Gen mecA je součástí genové kazety umístěné na stafylokokovém chromozomu (tzv. SCC mecA), která kromě mecA obsahuje i geny rekombináz (ccr) zprostředkující správnou orientaci transpozonu při vloţení do chromozomu. Gen mecA je pod regulační kontrolou genů mecRI a mecI, ale podobně mohou být regulovány i geny spojené se syntézou penicilinázy (blaRI a blaI), viz Obr. 1. Celkem existuje přibliţně 5 typů chromozomálních kazet (SCCmecA typu IV). Sloţení a molekulární struktura jednotlivých typů kazet se liší a na těchto odlišnostech je zaloţená molekulární epidemiologie kmenů S. aureus rezistentních k meticilinu (oxacilinu), tzv. MRSA, viz dále. Kazety sloţitějších typů klonů stafylokoků (kazety SCCmecA typu IVV) mohou obsahovat celý plazmid nebo transpozony, které mohou nést geny rezistence k dalším antibiotikům (např. makrolidům nebo aminoglykosidům) (Melter 2008, Chambers 1997). Samotná citlivost/rezistence stafylokokového kmene k oxacilinu v podmínkách in vivo můţe být dána mírou exprese genů blaZ a mecA, resp. selekcí rezistentních buněk v rámci kmene. K úspěšné selekci rezistentních kmenů dochází pravděpodobně v prostředí s velkým selekčním tlakem antibiotik, např. ve zdravotnických zařízeních. U některých kmenů S. aureus a S. epidermidis byly popsány subpopulace (tzv. small colony variants, SCV´s), které jsou schopny perzistovat uvnitř makrofágů a neutrofilů a odolávat účinku aminoglykosidů a antibiotik působících na buněčnou stěnu. Po ukončení antibiotické terapie lyzuje S. aureus hostující buňky a opět infikuje okolní tkáň, coţ můţe vysvětlit rekurentní povahu některých konzervativně léčených endokarditid (Neut et al. 2007, Seifert et al. 2003, von Eiff 2008)

15


Obrázek 1. Základní struktura chromozomální kazety SCCmecA s regulačními geny. Gen mecA kóduje alternativní transpeptidázu PBP-2A, která zabraňuje účinku všech betalaktamových antibiotik i v kombinaci s betalaktamázami. Geny mecR1 a mecI regulují transkripci genu mecA, geny komplexu ccr A, B kódují integrázové a resolvázové rekombinázy, které zajišťují správnou orientaci při vložení SCCmec do chromozómu. Kazeta obsahuje také inzerční elementy (IS1272 a IS431). Kazety složitějších typů klonů stafylokoků mohou obsahovat celý plazmid nebo transpozony, které mohou nést geny rezistence k dalším antibiotikům (např. makrolidům nebo aminoglykosidům). PBP–2 protein vázající penicilin (z angl. penicilin binding protein), orfx otevřený čtecí rámec (z angl. open reading frame), IS inserční sekvence. (převzato z http://img.medscape.com, 25.4.2011).

2.5.1 Epidemiologie kmenů MRSA Výskyt MRSA je od roku 2000 sledován celoevropským systémem EARSS (European Antibiotic Resistance Surveillance System, http://www.rivm.nl/, 25.4.2011) a infikovaní pacienti jsou v nemocničních odděleních izolováni s přísným hygienickým reţimem. Vzhledem k rozdílům v antibiotické politice v jednotlivých zemích, je výskyt nemocničních kmenů MRSA nerovnoměrný: Podle údajů EARSS sleduje výskyt MRSA v Evropě tzv. severojiţní gradient s nejniţším výskytem v Nizozemí (< 1 %) a nejvyšším v Portugalsku (> 50 %), viz Obr. 2. V USA je přibliţně 60 % nozokomiálních kmenů S. aureus rezistentních k oxacilinu, v Japonsku je to dokonce 70 % kmenů (Habib et al. 2009). V České republice byl za posledních sedm let podle údajů Národní referenční laboratoře pro antibiotika (NRL ATB) zaznamenán vzestupný trend ve výskytu kmenů MRSA, tj. ze 4,3 % v roce 2000 na 15 % v roce 2009 (Hrabák, 2010, osobní komunikace). Zvýšil se také počet nemocnic, kde byl zaznamenán výskyt invazivní infekce vyvolané MRSA (z 11 kmenů v roce 2000 na 51

16


kmenů v roce 2005). Podle údajů antibiotického střediska Fakultní nemocnice u svaté Anny (FNusA) vzrostl výskyt kmenů MRSA na odděleních CKTCH v Brně v letech 2007-2008 aţ čytřikrát (ze 3 na 13 kmenů MRSA/rok) (Tejkalová 2009, osobní komunikace). V posledních letech se kromě nozokomiálních MRSA infekcí, především v USA a některých evropských zemích, objevují infekce MRSA i u ambulantních pacientů způsobené tzv. komunitními kmeny MRSA (tzv. CA-MRSA neboli community-aquired MRSA) (Melter 2008). Tyto kmeny jsou většinou dobře citlivé k ostatním antibiotikům, svými faktory virulence (Pantenův Valentinův leukocidin, PVL) jsou však obávanými původci infekcí měkkých tkání s rozsáhlou destrukcí, akutních pneumonií, ale i IE a to u pacientů bez rizikových faktorů, častěji však u intravenózních narkomanů, případně pacientů s furunkly nebo celulitidou (Garau et al. 2009, Melter 2008). Pro monitoring epidemiologicky závaţných kmenů MRSA lze vyuţít celou chromozomální kazetu SCCmecA. V současné době existuje ve světě přibliţně 5 klonálních typů MRSA (tříděných podle SCCmecA). V ČR je nejčastějším klonálním komplexem CC5, tzn. klon s kazetou SCCmecA typu IV s častou přidruţenou rezistencí k makrolidům nebo aminoglykosidům (Hrabák, 2010, osobní komunikace).

Obrázek 2. Výskyt kmenů MRSA v Evropě v roce 2009. Výskyt MRSA v České republice se pohybuje nyní okolo 15 %. (http://www.szu.cz/tema/prevence/earss/mezinarodni-databaze-vysledku-earss, 30.3.2011).

17


IE způsobená kmeny MRSA má horší prognózu (vyšší procento relapsů, srdečního selhání, selhání léčby a mortality) neţ IE způsobená citlivými kmeny S. aureus a to především u pacientů s prostetickou endokarditidou (Garau et al. 2009, Hill et al. 2008). Citlivé kmeny S. aureus stejně jako komunitní kmeny MRSA jsou nalézány u ambulantních pacientů, zatímco multirezistentní kmeny MRSA jako následek nozokomiální IE. Mortalita IE vyvolaná komunitními kmeny MRSA je srovnatelná mortalitou IE způsobenou citlivými kmeny S. aureus (Hill et al. 2008). Oproti tomu mortalita pacientů s IE vyvolanou nozokomiálními kmeny MRSA, především těch na dlouhodobé hemodialýze, můţe být 90-100 % (Kuo et al. 2007). Jelikoţ kolonizující kmeny MRSA představují potenciální příčinu nehojících se a protrahovaných infekcí, které prodluţují a prodraţují hospitalizaci a vystavují pacienta vyššímu riziku pooperačních komplikací, provádí se u pacientů před plánovaným chirurgickým výkonem screeningové vyšetření nosičství MRSA. V případě pozitivního záchytu je pacient dekolonizován intranasálně podávaným mupirocinem nebo některými antiseptickými přípravky vhodnými k aplikaci na kůţi a na sliznice s deklarovanou účinností na MRSA. Vţdy je takový pacient izolován a zdravotnický personál dodrţuje přísná hygienická opatření

(http://www.spnn.estranky.cz/clanky/dokumenty/doporucene-postupy-

pro-kontrolu-mrsa.html, 28.6. 2011). 2.5.2 Epidemiologie kmenů KNS rezistentních k oxacilinu (MRKNS) KNS se staly v posledních letech jednou z nejčastějších příčin nozokomiální bakteriémie a u pacientů s rizikovými faktory, jako je umělá chlopeň nebo intrakardiálně uloţený materiál, také nejčastější příčinou IE (von Eiff 2008, Huebner a Goldmann 1999). V současné době je přibliţně 80 % nemocničních a 30-40 % komunitních (tj. u zdravých nosičů) kmenů KNS rezistentních k oxacilinu (Piette a Verschraegen 2009, Zhang et al. 2004). Epidemiologický a klinický význam KNS je ve srovnání s MRSA omezený a výskyt rezistentních kmenů KNS tudíţ nevyţaduje provádění specifických preventivních opatření (http://www.spnn.estranky.cz/clanky/dokumenty/doporucene-postupy-pro-kontrolumrsa.html, 28.6. 2011). Největší výzvou pro současnou mikrobiologickou diagnostiku je však rozlišit kontaminující a kauzální rezistentní kmeny KNS (Chu et al. 2009, von Eiff, Peters a Heilmann 2002, von Eiff, Proctor a Peters 2001).

18


2.6 Predisponující faktory IE Hlavními predisponujícími faktory IE je bakteriémie a současné hemodynamické postiţení (vrozené nebo získané) srdečních chlopní. Nízká hladina bakteriémie vzniká během kaţdodenní pravidelné ústní hygieny či ţvýkání potravy. Přestoţe je mnoţství mikrobů velmi malé (cca 1-10 kolonie tvořících jednotek na mililitr (CFU/ml) krve) a trvá poměrně krátkou dobu, četnost těchto procedur můţe vysvětlit vznik IE u pacientů bez anamnézy předchozích invazivních výkonů (Strom et al. 1998). Zdrojem bakteriémií mohou být dále např. pneumonie, koţní infekce, infekce kloubů nebo kontaminované centrální katetry aj. Vznik bakteriémie je však v současné populaci vyspělých zemí spojován především s invazivními diagnostickými a terapeutickými zdravotnickými zákroky (stomatologické / ORL / gastrointestinální / dlouhodobá hemodialýza / intravenózní cévní katetry / nazotracheální odsávání / bronchoskopie / interní biopsie). Díky silné afinitě S. aureus k endokardu vede 10-30 % bakteriémií vzniklých z přítomnosti cévního katetru ke vzniku IE. Zvýšené riziko IE způsobené S. aureus v komunitě je v posledních letech pozorováno především u intravenózních narkomanů (Habib et al. 2009, Murray 2005, Lagier et al. 2008). Špatnou prognózu mají především pacienti na dlouhodobé hemodialýze a IE způsobené MRSA (Kuo et al. 2007). Revmatické postiţení chlopní jako hlavní predispozice IE je ve vyspělých zemích, kde jsou streptokokové infekce vesměs přeléčeny antibiotiky, na ústupu. V těchto zemích existuje vyšší riziko rozvoje IE u pacientů s vrozenou srdeční vadou (koarktace / ductus arteriosus / defekt komorového septa / bikuspidní aortální chlopeň aj.) nebo narušenou funkcí chlopní (sklerotické změny / mitrální prolaps aj.), které jsou zdrojem hemodynamické nestability a vzniku trombotických vegetací, jeţ mohou být infikovány (Habib et al. 2009). V rámci retrospektivní analýzy provedené u pacientů s IE hospitalizovaných na Mayo Clinic v Rochesteru (USA) a pacientů s IE hospitalizovaných ve Fakultní nemocnici Hradec Králové, byl u českých pacientů prokázán niţší věkový průměr s minimálním zastoupením intravenózních narkomanů, zato však častější revmatické onemocnění srdce a negativní výsledky kultivace etiologického agens (Pazdernik et al. 2009). Rizikovou skupinou pro rozvoj IE jsou rovněţ pacienti s intrakardiálně uloţeným tělesem (umělé povrchy defibrilátorů / pacemakerů / intrakardiálních elektrod), která jsou v srdci dlouhodobě či trvale uloţena, a mohou být přímo postiţena infekčním procesem nebo být zdrojem bakteriémie, která se šíří aţ na chlopenní cípy a endokard. Ve většině případů je

19


příčinou infekce intrakardiálních těles a prostetických chlopní jejich kontaminace bakteriální flórou v průběhu implantace (Habib et al. 2009) nebo kontaminací cévních katetrů. Podle výsledků prospektivní multicentrické mezinárodní studie je aţ 37 % případů prostetické IE je spojeno s nemocniční péčí (Nataloni et al. 2010).

2.7 Klinické projevy IE Ve většině případů jsou počáteční klinické projevy IE velmi podobné projevům klasického virového onemocnění, tj. zvýšená teplota (nad 38 °C), popř. zimnice a pocení, nechutenství, bolesti svalů a kloubů. Můţe se rovněţ vyskytovat srdeční šelest (aţ 85 % případů) nebo splenomegalie. Přibliţně u 30 % pacientů vznikají mozkové (u levostranného postiţení srdce) nebo plicní (u pravostranného postiţení srdce) embolizace, které vedou k podezření na IE. Periferní embolizace není jiţ celosvětově typickým projevem IE, neboť stanovení diagnózy zpravidla předchází těmto klinickým projevům. Oproti tomu cévní a imunologické projevy jako glomerulonefritida, Rothovy skvrny (hemoragické léze s bledým středem), Janewayovy léze (drobné, nebolestivé hemoragie na dlaních a ploskách nohou) nebo Oslerovy uzlíky (podkoţní hemoragie na špičkách prstů ruky, nebo palci na noze) zůstávají poměrně častým projevem (Habib et al. 2009), viz Tab. 1. Tabulka 1. Klinické projevy IE. 1. 2. 3. 4.

Nové vzniklá regurgitace (srdeční šelest) Embolizace neznámého původu Sepse neznámého původu (obzvláště je-li spojená s typickým kauzálním agens IE) Horečka (nejčastější projev IE) spojená s: a. Intrakardiálně uložený umělý materiál (např. umělá chlopeň, pacemaker, defibrilátor, konduity) b. Historie IE v anamnéze c. Vrozená srdeční nebo chlopenní vada d. Imunokompromitovaný pacient či intravenózně užívané drogy e. Predispozice spojená s nedávným zákrokem dprovázeným bakteriémií f. Příznaky vrozeného srdečního selhání g. Nově porucha vodivosti srdečního svalu h. Pozitivní hemokultury se záchytem typického kauzálního agens IE nebo pozitivní serologie chronické Qhorečky (mikrobiologické nálezy mohou předcházet srdečním projevům) i. Cévní nebo imunologické projevy: embolická příhoda, Rothovy skvrny, třískovité hemorhagie pod nehty, Janewayovy léze, Oslerovy uzlíky j. Ohniskové nebo nespecifické neurologické příznaky k. Prokázaná plicní embolizace/infiltrace (pravostranná IE) l. Výskyt zánětlivého ložiska v ledvinách, slezině, mozku nebo páteři bez vysvětlitelné příčiny

Pozn.: Objeví-li se některé z těchto klinických projevů, mělo by být pojato podezření na IE. U pacientů s febriliemi mohou diagnostice IE n pomoci další nespecifické projevy infekce, jako je zvýšená hladina C-reaktivního proteinu/ prokalcitoninu či zvýšená sedimentace (převzato z (Habib et al. 2009).

20


Přítomnost a intenzita klinických projevů IE vţdy závisí především na typu kauzálního agens a rozsahu postiţení chlopně. Průběh akutní IE je definován krátkou inkubační dobou, tj. rychlým nástupem klinických projevů (v řádu dnů – max 6 týdnů). Typickým projevem je vysoká horečka a rychlé a rozsáhlé pravostranné (u intravenózních narkomanů) nebo levostranné poškození srdce. U levostranného poškození je navíc vysoká pravděpodobnost rozvoje extrakardiálních (především mozkových) embolizací, coţ značně zhoršuje prognózu akutní formy IE. Nejčastějším etiologickým agens akutních IE je popisován S. aureus. Vysoce virulentní kmeny S. aureus mají schopnost adheze i na předem nepoškozené chlopně např. u intravenózních narkomanů. Taková IE je ve většině případů pravostranná a dobře reaguje na konzervativní terapii. V porovnání s jinými infekčními agens mají pacienti s levostrannou IE způsobenou S. aureus větší riziko embolických příhod či mozkové příhody spojené s vyšší pravděpodobností úmrtí (Miro et al. 2005, Fernandez Guerrero et al. 2009). Subakutní IE (forma „lenta”) je nejčastěji způsobena méně virulentními streptokoky, první klinické projevy nastupují nejdříve po 6-ti týdnech. Horečka je mírná nebo se nevyskytuje vůbec. Je zde velmi malá pravděpodobnost vzniku embolizací a tudíţ i lepší prognóza onemocnění. Projevy IE mohou v důsledku započetí antibiotické terapie přejít od akutního onemocnění aţ k subakutnímu / chronickému průběhu. Naopak u imunodeficientních pacientů můţe subakutní forma probíhat jako akutní (Habib et al. 2009). Ve vyspělých zemích sledujeme v posledních letech většinu učebnicových projevů IE zřídka. Přibývá pacientů pokročilého věku, pacientů s časnou formou PVE a imunokompromitovaných, u nichţ jsou klinické projevy IE omezeny jen na velmi nespecifické symptomy za současné absence výše zmíněných standardních příznaků. Afebrilně můţe IE probíhat u pacientů po proběhlé antibiotické léčbě a u IE způsobené méně virulentními nebo atypickými mikroorganismy (Habib et al. 2009). U pacientů s umělými srdečními náhradami je často problematické na základě klinických projevů (např. paravalvární leak, tj. zpětný průnik krve okolo chlopně) určit, zdali se jedná o endokarditidu infekčního nebo neinfekčního původu (Fernandez Guerrero et al. 2009). U intravenózních narkomanů, kde IE probíhá akutně a často s postiţením pravého srdce, zcela chybí cévní projevy a embolizace do mozku či periferií (Westphal et al. 2009). Jelikoţ můţe být podezření na IE vysloveno na základě velmi rozdílných klinických projevů, zůstává diagnostika IE pro lékaře stále velkou výzvou. V závislosti na klinických

21


projevech IE mohou být pacienti vyšetřeni několika specialisty s podezřením na celou řadu alternativních diagnóz. K určení správné diagnózy a léčby tohoto onemocnění je optimální spolupráce kardiologa či kardiochirurga s infektologem a mikrobiologem.

2.8 Kritéria pro diagnostiku IE Jako první se o definici diagnostických znaků IE pokusil na přelomu 19. a 20. století kanadský lékař William Osler1. Mezi hlavní diagnostické znaky IE zařadil střídavé horečky s nálezem šelestu na srdci a embolické nebo koţní projevy (tzv. Oslerovy uzlíky). Diagnóza však byla většinou definitivně potvrzena aţ při pitvě, neboť většina pacientů tomuto onemocnění v předantibiotické éře podlehla (Osler 1885). První diagnostická kritéria pro diagnostiku IE navrţená von Reynem v roce 1981 (tzv. Beth Israel criteria) se opírala především o klinické projevy onemocnění, výsledky mikrobiologického vyšetření (hemokultury) a histopatologickou analýzu chirurgicky odstraněné vegetace. Von Reyn kritéria popisovala IE v kategoriích „prokázaná“ IE, „pravděpodobná“ IE, „možná“ IE a „vyloučená“ IE (viz Tab. 2). Do skupiny s „prokázanou“ diagnózou IE mohli být díky příliš striktnímu nastavení kritérií zařazeni pouze pacienti s pozitivním histologickým a kultivačním nálezem, tj. pouze chirurgicky léčení pacienti, coţ odpovídalo pouhé třetině pacientů s akutní infekční endokarditidou. Navíc tato kritéria nezohledňovala intravenózní narkomanii jako predisponující faktor a nezahrnovala echokardiografii. Sensitivita těchto kritérií se pohybovala mezi 40-70 % (Naber et al. 2001). Po zavedení dvourozměrné Dopplerovské echokardiografie (1981), jeţ umoţňuje neinvazivní záchyt vegetací nebo abscesu nativních i umělých chlopní a jiných materiálů byla vytvořena tzv. Duke (neboli Durackova) kritéria, kterými se řídí diagnostika IE dodnes (Durack, Lukes a Bright 1994). Tato kritéria popisují diagnózu IE v kategoriích „prokázaná“, „možná“

a

„vyloučená“

IE.

Hlavními

kritérii

je

průkaz

etiologického

agens

v hemokultuře/chirurgickém materiálu a pozitivní nález při echokardiografii. Dalšími kritérii jsou rovněţ horečka, cévní příznaky nebo předchozí onemocnění srdce či intravenózní narkomanie (viz Tab. 2). Při zachované vysoké specificitě (87-99 %) předchozích von Reyn kritérií došlo k výraznému zvýšení jejich sensitivity (aţ na 75-100 %). 1

William Osler (1849-1919) kladl důraz na správnou komunikaci s pacientem a odebrání správné diagnózy s

důrazem na historii klinických projevů: "Listen to your patient, he is telling you the diagnosis".

22


Pro účely dalšího zvýšení sensitivity a specificity Duke kritérií byly navrţeny úpravy Duke kritérií (Li et al. 2000), viz Tab. 2 a 3. Tyto úpravy měly především zvýšit diagnostický práh kritérií u pacientů s „možnou“ diagnózou IE. Tato skupina pacientů byla proto jasně definována přítomností 1 hlavního a 1 vedlejšího kritéria nebo tří vedlejších kritérií. Modifikace rovněţ zohledňují zvýšený výskyt bakteriémií způsobených S. aureus, které jsou spojeny s vysokým rizikem vzniku endovaskulárních infekcí. Pro zvýšení sensitivity Duke kritérií u pacientů s prostetickou endokarditidou a pacientů s „možnou“ diagnózou IE je doporučeno provádět transezofageální echokardiografii (TEE), která má vyšší sensitivitu neţ standardně prováděná transtorakální echokardiografie (TTE). Ve snaze předejít kultivačně negativním výsledkům u pacientů s IE způsobenou kultivačně náročnými mikroorganismy (např. Coxiella burnetii či Bartonella quintana), jsou do modifikovaných Duke kritérií zahrnuty rovněţ nepřímé alternativní metody serologického průkazu protilátek (Fournier et al. 2010). Zánětlivé markery, leukocytóza, příp. anemie postrádají potřebnou specificitu a proto zatím nebyly do Duke diagnostických kritérií zavzaty. Mohou však ve sporných případech pomoci potvrdit/vyvrátit podezření na IE (Baddour et al. 2005). Přestoţe byla sensitivita a specificita Duke kritérií modifikacemi Li a kol (2000) podstatně zvýšena, stále je citlivost a specificita nedostatečná, především díky falešně negativním/pozitivním výsledkům transezofageální a transtorakální echokardiografie a kultivace. Riziko poddiagnostikování choroby i s vyuţitím modifikovaných Duke kritérií je vysoké především u pacientů s prostetickou IE (Sohail et al. 2008).

23


Tabulka 2. Srovnání diagnostických kritérií pro infekční endokarditidu dle Von Reyn a Duke (Tissières et al. 2003). Diagnostika IE „Prokázaná“ IE

Kritéria Von Reyn (Von Reyn et al. 1981) Etiologické agens prokázáno z vegetace nebo periferního embolu pomocí bakteriologie nebo histologie

„Pravděpodobná“ IE

*2 nebo více pozitivních hemokultur spojených s jedním z těchto faktorů:  nově vzniklá regurgitace spojená se šelestem  získaná nebo vrozená srdeční vada nebo *Méně než 2 pozitivní hemokultury nebo negativní hemokultury spojené s:  horečkou  nově vzniklou regurgitací spojenou se šelestem  patologickými cévními projevy

„Možná“ IE

*2 nebo více pozitivních hemokultur spojených s jedním z těchto faktorů**:  Získaná nebo vrozená srdeční vada  Patologické cévní projevy nebo *Méně než 2 pozitivní hemokultury nebo negativní hemokultury spojené s:  horečkou  nově vzniklou regurgitací/šelestem  jiným vaskulárním fenoménem nebo **V případě viridujících streptokoků stačí pro splnění kritérií „možné“/“pravděpodobné“ IE pouze 2 a více pozitivních hemokultur bez dalších klinických projevů. *Stanovení alternativní diagnózy, IE je nepravděpodobná nebo *IE je pravděpodobná, pacient je zajištěn empirickou antibiotickou terapií nebo *Klinicky diagnostikovaná, leč kultivačně negativní IE

„Vyloučen“á IE

24

Modifikovaná Duke kritéria (Li et al. 2000) *Některá z patologických kritériií nebo *Klinická kritéria: 2 hlavní nebo 1 hlavní + 3vedlejší nebo 5 vedlejších kritérií (viz níže)

*1 hlavní + 1 vedlejší kritérium nebo *3 vedlejší kritéria

*Jiná prokázaná diagnóza vysvětlující příznaky daného onemocnění nebo *Vymizení příznaků nemoci během < 4 dnů antibiotické léčby nebo *Nepřítomnost peroperačního nebo sekčního nálezu odpovídajícího IE poté, co byl pacient léčen antibiotiky < 4 dny. nebo *Nesplňuje kritéria pro :“možnou “IE

Molekulárně-mikrobiologická diagnostika u pacientů s infekční endokarditidou Tabulka 3. Duke kritéria a jejich modifikace (viz tučně) (Li et al. 2000). Patologická kritéria:  Průkaz mikroorganismů kultivačně nebo histologicky ve vegetaci nebo ve vegetaci, která embolizovala nebo v nitrosrdečním abscesu nebo  Průkaz patologických útvarů, jako např. vegetace nebo nitrosrdeční absces, přičemž histologické vyšetření potvrdí aktivní endokarditidu Klinická kritéria: Hlavní kritéria:  Pozitivní hemokultury**, tj  ve dvou různých hemokulturách zjištěn typický mikroorganismus vyvolávající IE (viridující streptokoky*, Streptococcus bovis, mikroorganismy skupiny HACEK, S. aureus nebo enterokoky (nejedná-li se o nozokomiální infekci a není-li znám primární zdroj infekce) nebo  stejný nález alespoň ve 3 ze 4 odebraných hemokultur anebo ve většině ze čtyř a více odebraných hemokultur (= alespoň 3 ze 4 či 5, alespoň 4 z 6 apod.) – ve všech případech časový rozdíl mezi prvním a posledním odběrem musí být větší než 1 hodina nebo  stejný nález v alespoň dvou hemokulturách odebraných v časovém rozpětí 12h a více nebo  izolace Coxiella burnetii z jedné hemokultury nebo průkaz IgG protilátek proti tomuto agens (ve fázi I) v titru > 1:800.  

Známky postižení endokardu (podle echokardiografického vyšetření, TEE je doporučováno u pacientů s prostetickou endokarditidou, u pacientů s „možnou“ diagnózou IE nebo u komplikované IE – paravalvární absces, TTE je doporučováno u ostatních pacientů) oscilující intrakardiálně uložené těleso, vázané na chlopně nebo jejich podpůrný aparát, pohybující se v místě regurgitačního jetu, nebo lokalizované na implantovaném materiálu, přičemž neexistuje jiné anatomické vysvětlení

nebo  intrakardiální absces nebo  nově vzniklá částečná dehiscence umělé chlopně**** Vedlejší kritéria  Predispozice  přítomnost onemocnění srdce, které je doprovázeno vyšším výskytem IE (zejména: mechanická protéza chlopně nebo bioprotéza, IE v anamnéze, cyanotické vrozené vady, uměle vytvořené levo-pravé shunty nebo konduity, bikuspidální aortální chlopeň, významná mitrální nebo aortální regurgitace, aortální stenóza, defekt septa komor, ductua arteriosus patens, koarktace aorty, hypertrofická kardiomyopatie, stav po operaci srdce s přetrvávající hemodynamickou abnormalitou nebo  intravenózní narkomanie     

Horečka: 38 °C a více Cévní příznaky: velké arteriální embolizace, septické plicní infarkty, mykotická aneurysmata, nitrolební krvácení, konjunktivální hemoragie a Janewayovy léze Imunologické příznaky: glomerulonefritida, Oslerovy uzlíky, Rothovy skvrny, pozitivní revmatoidní faktor Mikrobiologický nález: pozitivní hemokultivace nesplňující výše uvedená kritéria*** nebo serologický průkaz aktivní infekce připouštějící IE. Echokardiografický nález svědčící pro IE,který nesplňuje hlavní kritéria (v modifikované verzi kritérií bylo toto kritérium vypuštěno)

*Viridující streptokoky zahrnují rovněž nutriční varianty streptokoků: např. Abiotrophia sp. a Gemella sp. **Jedna hemokultura odpovídá jednomu odběru krve, bez ohledu na to, do kolika nádobek byla krev při tomto odběru rozdělena. ***S výjimkou koagulázanegativních stafylokoků zachycených z jediné hemokultury, a rovněž organismů jako jsou mykobakteria, která vyvolávají IE. **** Nově vzniklá valvární regurgitace ve shodě s evropskými doporučenými postupy není považována za dostatečně spolehlivý a specifický projev IE.

25


2.9 Léčba IE Diagnostika a léčba IE se v České republice řídí doporučenými postupy České Kardiologické Společnosti (ČKS) (Beneš et al. 2007), resp. souhrnem doporučení Evropské společnosti kardiologů (ESC) a Americké asociace kardiologů (AHA) (Baddour et al. 2005, Habib et al. 2009). 2.9.1 Konzervativní léčba Léčba IE je primárně konzervativní a zahrnuje sloţku kauzální (podávání antibiotik) a asymptomatickou (antipyretika, diuretika, antiarytmika atd.). Volba antibiotik závisí na etiologii a citlivosti izolovaného agens. Kromě typu infekčního agens je způsob a trvání cílené kombinované baktericidní terapie antibiotiky závislý na typu a průběhu endokarditidy (IE nativních / prostetických chlopní, akutní / subakutní průběh, levostranná / pravostranná IE) (Beneš et al. 2007, Westphal et al. 2009). Pro empirickou léčbu IE byla navrţena řada terapeutických schémat. Jako nejracionálnější se jeví postup, který vychází z kvalifikovaného odhadu pravděpodobné etiologie podle anamnestických a klinických dat. Léčba akutní IE u i.v. narkomana, kde je nejpravděpodobnějším agens S. aureus, se opírá o protistafylokoková antibiotika. Léčba subakutní NIE nebo pozdní PIE je namířena především proti streptokokům a enterokokům, ale měla být účinná i vůči stafylokokům a komunitním gramnegativním baktériím (neissérie, enterobaktérie, mikroby skupiny HACEK). Léčba časné PIE směřuje proti nozokomiálním stafylokokům a gram-negativním nefermentujícím tyčkám. Takto terapie je účinná i proti běţným vyvolavatelům komunitní IE. V těchto případech se doporučuje podat kombinaci antibiotik, obvykle je však nutná i reoperace chlopně (Beneš et al. 2007). Základem cílené léčby jsou většinou antibiotika působící na buněčnou stěnu (např. oxacilin, cefalosporiny, karbapenemy) s případnou kombinací s aminoglykosidy (synergie) (Beneš et al. 2007). Oxacilin rezistentní kmeny KNS nebo S. aureus jsou rezistentní nejen vůči účinku oxacilinu, ale i jiných betalaktamových a karbapenemových antibiotik včetně jejich inhibitorů betalaktamáz, coţ značně omezuje terapeutické moţnosti stafylokokových endokarditid (Melter 2008). Léčba nativní IE způsobené MRSA nebo MRKNS se opírá o kombinaci vankomycin a gentamicin, u prostetické IE je to vankomycin, rifampicin a gentamicin (Habib et al. 2009, Baddour et al. 2005). Přestoţe je většina stafylokoků antimikrobiálními látkami z krve odstraněna, 17-34 % případů zůstává kultivačně pozitivních více neţ 24h i přes léčbu antibiotiky (Fernandez Guerrero et al. 2009). Tento paradox můţe

26


být vysvětlen tím, ţe stafylokoky mohou in vivo přeţívat uvnitř buněk endotelia (Watkin et al. 2003). Problematické bývá započetí cílené antibiotické terapie u pacientů s negativními výsledky hemokultur, kde dochází k prodlení mezi prvními klinickými projevy onemocnění a definitivní diagnózou IE. Včasné zahájení cílené antibiotické terapie je přitom klíčové nejen pro eradikaci lokální infekce, ale rovněţ pro sníţení rizika dalších komplikací, jakými jsou srdeční selhání nebo septická embolizace (Westphal et al. 2009). 2.9.2 Chirurgická léčba Vzhledem ke špatné vaskularizaci srdečních chlopní a případnému růstu růstu některých mikroorganismů (např. stafylokoků) ve formě biofilmu, je eradikace infekčního agens ve vegetaci na chlopni konzervativním postupem poměrně obtíţná (Westphal et al. 2009). Nejúčinnější je eradikace mikroorganismůve vegetaci chirurgickým odstraněním (viz Obr. 3) a následnou antibiotickou terapií (Murdoch et al. 2009, Pol et al. 2010). Chirurgická intervence je indikována aţ u 30 % případů aktivní IE a dalších 20-40 % pacientů dospěje k operaci po vyléčení infekce (Habib et al. 2009). Včasná a dobře indikovaná chirurgická léčba výrazně sniţuje riziko úmrtí především u pacientů s prostetickou IE (Pol et al. 2010, Murdoch et al. 2009, Fernandez Guerrero et al. 2009). Akutní endokarditida je řešena chirurgicky nejčastěji z následujících indikací: riziko embolizací, přítomnost houbového etiologického agens nebo multirezistentního infekčního agens, šíření infekce do paravalvárních tkání, časná infekce protézy nebo dysfunkce protézy. Chirurgický zákrok je kontraindikován u pacientů s multiorgánovým selháním, závaţnou mozkovou dysfunkcí či chronickým kardiálním selháváním (NYHA III-IV) a zvaţován u osob starších 75-80 let, u nichţ jsou funkční rezervy natolik sníţeny, ţe je pravděpodobnost vyléčení i po chirurgickém zákroku nízká (Beneš et al. 2007).

27


Obrázek 3. Chirurgické odstranění vegetací na nativní aortální (vlevo) a mitrální (vpravo) chlopni. Uvedeno s laskavým svolením MUDr. J. Pola, CKTCH, Brno.

2.10 Současné metody diagnostiky IE Diagnostika a následná cílená antibiotická/chirurgická terapie IE se opírá především o rychlou a včasnou identifikaci etiologického agens a jeho citlivosti k antibiotikům z krve pacienta a zobrazení srdečních chlopní pomocí echokardiografie. 2.10.1 Echokardiografie Tato základní zobrazovací metoda slouţí pro průkaz mobilních chlopenních vegetací, abscesů, perforací cípů nebo ruptury závěsného aparátu chlopní a případně akutní infekce u pacientů s podezřením na IE nativních nebo prostetických chlopní. Přítomnost vegetací nativních chlopní se při echokardiografii projevuje nově vzniklou regurgitací či přítomností vlajících útvarů na chlopních způsobující paravalvární leak. Infekce umělých chlopní a intrakardiálně uloţeného materiálu se při echokardiografii projevuje jeho uvolněním, vznikem perivalvulárního abscesu, pseudoaneurysmat nebo fistulí či nově vzniklou prostetickou regurgitací. Při dobré vyšetřitelnosti a menší klinické naléhavosti postačuje transtorakální echokardiografie (TTE). Nález však bývá při klinickém podezření prokázán pomocí TTE jen přibliţně u 50 % případů. Oproti tomu jícnová echokardiografie (TEE) dosahuje při průkazu vegetací citlivost vyšší neţ 90 % a je indikována při podezření na moţné komplikace IE. Vţdy se TEE provádí při podezření na IE chlopenních protéz nebo při obtíţné vyšetřitelnosti transtorakálním přístupem (Beneš et al. 2007).

28


Po třech týdnech aţ třech měsících po započaté terapii lze pomocí echokardiografie sledovat u části pacientů vymizení (30 %) nebo alespoň zmenšení vegetací (18 %). Pacienti, u nichţ se velikost vegetací nemění (40 %) či dochází k jejich zvětšení (11 %), jsou většinou následně indikováni k chirurgickému odstranění nálezu (Vuille et al. 1994). Pomocí echokardiografie nelze odlišit vegetace aktivní IE od vyléčené IE. Falešně pozitivní nálezy bývají spojeny s přítomností tumorů či neinfekčních vegetací např. u pacientů se systémovým lupus erythrematodes mechanickým uvolněním umělé náhrady bez infekční souvislosti (Habib et al. 2009). Nově byl zaznamenán fatální případ neinfekční prostetické endokarditidy v souvislosti s alergií na umělou prasečí chlopeň (Fournier et al. 2011). 2.10.2 Standardní mikrobiologická diagnostika Rychlá identifikace etiologického agens má klíčový význam pro léčbu IE. Metody standardní mikrobiologické diagnostiky zahrnují kultivaci infekčního agens z krve (hemokultivace), a v případě chirurgického zákroku i kultivaci agens z bakteriální vegetace. Při IE je bakteriémie relativně nízká. Před započetím antibiotické terapie je v 1ml krve okolo 1-10 mikroorganismů (Watkin et al. 2003). Vzorky krve se lege artis odebírají do 2-3 aerobních a anaerobních kultivačních nádobek (hemokultura) a to před započetím antibiotické terapie nebo v tzv. „antibiotickém okně“ z artérií či vén (Habib et al. 2009). Je-li pacient v době odběru pod antibiotickou clonou, lze přítomnosti antibiotik v krvi zamezit aktivním uhlím (Watkin et al. 2003). Odběr se provádí přísně sterilně, aby bylo zamezeno kontaminaci materiálu z kůţe, která je kolonizována především KNS. Automatizovaný systém pro odečítání hemokultur (např. BacTAlert, BacTec) umoţňuje detekci i malého nárůstu mikrobů prostřednictvím detektoru vzestupu hladiny CO2. Přestoţe jsou anaeroby velmi vzácnými agens způsobujícími IE, provádí se standardně hemokultivace i v anaerobních podmínkách (Brook 2008). Dosaţená anaerobní atmosféra však nikdy není dokonalá a proto zde rostou i fakultativně anaerobní mikroorganismy, jako např. streptokoky nebo S. aureus. Výsledek hemokultivace lze potvrdit kultivací agens např. z embolů získaných při embolektomii nebo hnisu odebraného punkcí z metastatických abscesů. U chirurgicky léčených pacientů lze k potvrzení přítomnosti/identifikaci agens vyuţít i excidované části nativních chlopní nebo mělého materiálu s bakteriálními vegetacemi (Beneš et al. 2007). Pro kultivaci agens z materiálu je vyuţívaná stejná sada půd jako pro hemokultury, navíc se pro zvýšení citlivosti provádí subkultivace z bujónu. Dobře rostoucí agens (např. stafylokoky, streptokoky a enterokoky) je identifikováno včetně citlivosti k

29


antibiotikům do 48-72h od doručení materiálu do laboratoře. Inkubace po dobu pěti aţ šesti dnů by měla stačit i pro záchyt ostatních běţně rostoucích patogenů. 2.10.2.1.1 Odlišení stafylokoků od ostatních bakterií způsobujících IE Z pozitivní hemokultury, která jiţ po 6 h můţe signalizovat růst mikrobů, je proveden nátěr na sklíčko, Gramovo barvení a mikroskopie, kde pozorujeme grampozitivní koky. Pozitivní hemokultura (nebo chirurgický materiál) je inokulována na paletu běţných i selektivních půd. Po 24 h inkubaci odlišíme stafylokoky od streptokoků/enterokoků růstem na krevním agaru s 10% NaCl. Paletu půd můţeme doplnit rychlým biochemickým testem produkce katalázy, kterou mají stafylokoky na rozdíl od streptokoků pozitivní. Pro rychlé rozlišení IE způsobené S. aureus od IE způsobené jinými grampozitivními mikroby je moţné vyuţít detekci kapsulárních antigenů, peptidoglykanu nebo kyseliny teichoové pomocí ELISA (Tak et al. 2002). 2.10.2.1.2 Rozlišení kmenů S. aureus a KNS. Na běţném krevním agaru rostou S. aureus v krémových koloniích se širokou zónou beta-hemolýzy, zatímco KNS v drobnějších bělavých koloniích, většinou bez hemolýzy. K odlišení S. aureus a KNS lze vyuţít schopnosti S. aureus sráţet plazmu (test vázané/volné plasmakoagulázy) nebo tvořit hyaluronidázu (Murray et al. 2003). U kmenů S. aureus izolovaných od pacientů léčených dlouhodobě antibiotiky mohou být pozorovány kolonie atypických vlastností, tzv. malé varianty kolonií (small colony variants, SCV) S. aureus. Nejenţe jsou kolonie velmi drobné, ale mají sníţenou produkci plazmakoagulázy a zvýšené nároky na hemin v kultivační půdě (Fernandez Guerrero et al. 2009, Watkin et al. 2003). Při identifikaci se proto mikrobiolog řídí také antibiogramem, kde jsou KNS často multirezistentní, zatímco kmeny S. aureus spíše citlivé. Biochemické dourčení KNS po úroveň druhu je důleţité, neboť průběh IE způsobený S. lugdunensis a v některých případech S. capitis můţe svou akutní formou klinických projevů spíše připomínat S. aureus (Piette a Verschraegen 2009). Vzhledem k tomu, ţe KNS mohou být etiologickým agens prostetických i nativních IE stejně jako kontaminací, je nutné v případě přítomnosti KNS nejdříve vyloučit moţnou kontaminaci při odběru hemokultury nebo zpracování materiálu (Piette a Verschraegen 2009). Na případnou kontaminaci kmeny KNS lze částečně usuzovat i z počtu pozitivních výsledků ze všech odebraných hemokultur (viz Duke kritéria).

30


2.10.2.1.3 Stanovení citlivosti stafylokoků k antibiotikům Dle výsledků bakteriologické identifikace je provedeno testování citlivosti k antibiotikům pomocí mikrodilučního a diskového difuzního testu se sadou antibiotik působícím proti stafylokokům, viz Tab. 4. Tabulka 4. Příklad antibiotik působících proti stafylokokům.

Název antibiotika Oxacilin

Zkratka OXA

Erytromycin Klindamycin Sulfomethoxazol/trimetorpim Amoxicilin/klavulanát*

E DA SXT AMC

Doxycyklin Cefoxitin** Chloramfenikol Gentamicin Vankomycin Teikoplanin Rifampicin Linezolid Tigecyklin

DO CXT C CN VA TEC RD LIN TIG

Skupina isoxalylové peniciliny stabilní vůči betalaktamáze makrolidy linkosamidy sulfonamidy betalaktamy s inhibitorem betalaktamázy tetracykliny cefalosporiny II. generace amfenikoly aminoglykosidy glykopeptidy glykopeptidy ansamyciny oxazolidinony glycylcykliny

Pozn. * Alternativně lze použít ampicilin-sulbaktam. ** Cefoxitin je dobrým induktorem exprese genu mecA, proto se využívá pro in vitro testování citlivosti izolátů k betalaktamáza - stabilním antibiotikům, např. oxacilinu (viz Tab. 5). Pro léčbu se cefoxitin nevyužívá, neboť je silným induktorem betalaktamáz.

Jelikoţ byl cefoxitin prokázán jako lepší induktor exprese genu mecA a tvorby PBP2A neţ oxacilin (Swenson, Tenover a Grp 2005), pouţívá se ke stanovení citlivosti stafylokoků ke všem antibiotikům působícím na buněčnou stěnu (tj. betalaktamy a karbapenemy) společně s oxacilinem. Zpravidla se mikrodiluční metodou testuje citlivost k oxacilinu a diskovým difuzním testem citlivost k cefoxitinu (30 µg) a oxacilinu (1 µg). Kmeny citlivé k cefoxitinu i augmentinu (betalaktamu potencovanému inhibitorem betalkatamázy) jsou hodnoceny jako citlivé k účinku betalaktamů. Kmeny rezistentní k augmentinu a citlivé k cefoxitinu jsou hodnoceny jako citlivé k oxacilinu,ale rezistentní ke všem betalaktamům s inhibitory betalaktamáz. Kmeny rezistentní k augmentinu i cefoxitinu jsou hodnoceny jako rezistentní ke všem betalaktamům včetně karbapenemů, s výjimkou antibiotik s prokázanou aktivitou nebo vysokými klinickými breakpointy proti MRSA (Juránková, 2011, osobní komunikace).

31


Pro citlivější a rychlejší záchyt rezistentních kmenů S. aureus se doporučuje vzorky kultivovat na selektivní půdě pro MRSA (půda s NaCl obsahující antibiotikum o koncentraci inhibující citlivé kmeny S. aureus nebo chromogenní půda) a zároveň i na půdě neselektivní, neboť MRSA s extrémně nízkou koncentrací buněk rezistentních k oxacilinu se mohou jevit na selektivních půdách jako kmeny citlivé. Je rovněţ moţné vyuţít latexovou aglutinaci pro průkaz proteinu PBP-2A. U kmenů s hraniční citlivostí je doporučováno konfirmovat výsledek standardních fenotypových testů metodou PCR (přítomnost genu mecA)2. 2.10.3 Histologie Alternativou kultivace je histopatologické vyšetření peroperačně odebraného materiálu, který je fixován v parafínovém bločku nebo formalínu. Histopatologická analýza není ovlivněna probíhající antibiotickou terapií a je nejspolehlivějším ukazatelem aktivní bakteriální endokarditidy (Watkin et al. 2003). Od roku 1994 je jedním z patologických Duke kritérií (Durack et al. 1994). Na rozdíl od kultivace nebo PCR je však pomocí histologie moţná identifikace mikroorganismů jen na úrovni grampozitivní/negativní koky/tyčinky, někdy nemusí být mikrobiální buňky viditelné vůbec. 2.10.4 Alternativní metody detekce patogenů 2.10.4.1 Serologie K identifikaci atypických agens, které jsou kultivačně náročné, jako např. Bartonella quintana nebo Coxiella burnetii, lze pouţít nepřímou detekci protilátek pomocí imunofluorescence nebo ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) (Watkin et al. 2003, Habib et al. 2009, Fournier et al. 2010). Serologický průkaz Coxiella burnetii je od roku 2001 součástí hlavních dianostických Duke kritérií. U detekce protilátek proti chlamydiím byla pozorována

zkříţená

reaktivita

s

antigeny

Bartonella

quintana.

Prostřednictvím

imunologického rozboru moči lze rovněţ pomocí ELISA detekovat produkty metabolismu bakterie Legionella sp., jejíţ role etiologického agens IE však zatím nebyla prokázána (Watkin et al. 2003). 2

Doporučený postup pro kontrolu výskytu kmenů S. aureus rezistentních k oxacilinu a s jinou nebezpečnou

antibiotickou rezistencí v nemocničních zařízeních, Zpráva CEM (SZÚ Praha) 2006, ročník 15, příloha 1.

32


2.10.4.2 Molekulárně-biologická detekce Vývoj molekulárních metod v posledních 20 letech započal novou éru v diagnostice infekčních nemocí. Z moţností molekulární detekce patogena se v klinické mikrobiologické praxi v současné době nejvíce vyuţívá polymerázová řetězová reakce (PCR). Opakovanými cykly denaturace dvoušroubovice DNA, připojení primerů a syntézy nového vlákna dochází na základě komplementarity k tvorbě aţ biliónu kopií daného úseku DNA. V závislosti na počtu cyklů a efektivitě PCR tak během 2-3 hodin vznikne in vitro replikací aţ jedna miliarda kopií cíleného úseku DNA patogena (Mullis 1990). Molekulární detekce DNA patogena můţe být provedena s menší či větší úspěšností z různého klinického materiálu. U pacientů s IE se nejčastěji jedná buď o krev (Moore et al. 2001), vegetaci z peroperačně odstraněné chlopně (Grijalva et al. 2003) nebo embolus (Tak a Shukla 2004). Kritickým krokem pro analýzu nukleových kyselin patogenů pomocí molekulárně-biologických metod je efektivní izolace DNA patogena. Metoda PCR ukázala svůj velký přínos především u akutních, ţivot ohroţujících stavů (meningitidy, prostetické kloubní infekce, akutní IE), kde je důleţité kauzální agens rychle identifikovat a začít antibiotickou terapii (Sontakke et al. 2009). Její význam spočívá především v detekci atypických/špatně rostoucích patogenů u kultivačně negativních pacientů nebo dobře rostoucího agens u pacientů dlouhodobě léčených antibiotiky (Grijalva et al. 2003, Brouqui a Raoult 2001, Goldenberger et al. 1997, Pada et al. 2009). 2.10.4.2.1 Detekce patogenů pomocí širokospektré PCR Vzhledem k širokému spektru patogenů, které IE způsobují, je vhodné vyuţít tzv. panbakteriální/panfungální PCR (Sontakke et al. 2009). Cílovým místem amplifikace je gen produkující esenciální struktury buňky, např. gen pro ribozomální RNA podjednotku 16S (16S rRNA ) nebo oblast mezi geny pro 8- 23S rRNA u bakterií, příp. 5S-23S rRNA u hub (Harris a Hartley 2003, Sontakke et al. 2009). Gen pro 16S rRNA je sloţen z konzervativních a variabilních úseků, tj. oblastí, kde se sekvence jednotlivých mikroorganismů shodují, resp. liší. Primery jsou navrhovány do konzervativních oblastí genu. Samotná pozitivita PCR ukazuje na přítomnost bakterií nebo hub v materiálu, ale pro identifikaci je nutné provést sekvencování a zjištěnou sekvenci DNA PCR produktu porovnat s některou z veřejně dostupných internetových databází bakteriálních/houbových sekvencí, např. National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nih.gov/blast.cgi/, 1.7.2011), Ribosomal Differentiation of Medical Microorganisms (http://www.ridom-rdna.de, 1.7. 2011), EZ taxon (http://147.47.212.35:8080/,

1.7.2011),

33

16SPath

DB


(http://147.8.74.24/16SpathDB/main.php/, 1.7.2011) nebo SepsiTest (http://www.sepsitestblast.de/en/index.html/, 1.7.2011). Správnost sekvencí v databázi je důleţitá pro přesnou identifikaci patogena. Shoda sekvence s referenční sekvencí v 98-100 % umoţňuje identifikaci mikroorganismu po úroveň druhu, 97% shoda sekvencí umoţňuje identifikaci pouze po úroveň rodu. (Harris a Hartley 2003). Minimální sekvenční variabilita genu 16S rDNA mezi rody a druhy některých streptokoků a enterobakterií, neumoţňuje jejich identifikaci a je nutné pouţít pro tento účel jiný gen (Drancourt et al. 2000). V takovém případě je moţné sekvencovat např. gen pro beta podjednotku RNA polymerázy (rpoB), který zprostředkovává transkripci (Mollet, Drancourt a Raoult 1997), gen pro superoxiddismutázu (sodA) (Poyart et al. 2001) nebo výsledek potvrdit amplifikací druhově specifických cílových genů (Moore et al. 2001, Qin a Urdahl 2001). Moţnost vyuţít širokospektrou PCR a sekvencování genu 16S rDNA pro průkaz infekčního agens v chlopních u pacientů s infekční endokarditidou prokázal poprvé Goldenberger a kol. (1997). Výsledky PCR byly srovnány se standardními kultivačními metodami pro záchyt patogena a ukázaly vysoké procento shody. V následujících letech několik autorů větších studií prokázalo přínos širokospektré PCR a sekvencování pro záchyt etiologického agens IE, zejména u pacientů s kultivačně negativním výsledkem (viz Tab. 5). 2.10.4.2.2 Detekce patogenů pomocí specifické PCR Pro specifickou PCR je cílovým místem amplifikace gen, který kóduje specifický protein, např. receptor na povrchu mikroorganismu nebo enzym specifický pro určitý druh mikroba nebo skupinu mikrobů. Přítomnost/nepřítomnost produktu specifické PCR potom svědčí pro přítomnost/nepřítomnost konkrétního mikroba, na něhoţ je v analyzovaném materiálu podezření. Lze také vyuţít specifické detekční systémy, které jsou pro časovou a finanční úsporu navrţeny v uspořádání tzv. multiplex PCR. Jedna reakce je navrţena na několik specifických cílových míst a produkty amplifikace je moţné od sebe oddělit na základě rozdílných délek gelovou elektroforézou nebo pouţitím odlišných fluorescenčních sond. Kromě záchytu kultivačně náročných patogenů lze specifickou PCR také vyuţít pro stanovení antibiotické rezistence (Moore et al. 2001). Cílovým místem amplifikace můţe být např. gen mecA, kódující rezistenci k oxacilinu a ostatním beta-laktamům u stafylokoků (Kobayashi et al. 1994), gen van A, B nebo C, kódující rezistenci k vankomycinu u enterokoků (Free a Sahm 1995) nebo PBP1a/PBP2b kódující rezistenci k penicilinu u streptokoků (Coffey et al. 1995).

34


Tabulka 5. Přehled studií, které provedly širokospektrou PCR a sekvencování pro detekci patogenů u chirurgicky léčených pacientů s IE. Počet pacientů s „prokázanou „IE / kontrolní pacienti

Cílové místo

Sensitivita a specificita PCR

Sensitivita a specificita kultivace

18/0

16S rDNA

N

N

(Goldenberger et al. 1997)

49/14

16S rDNA

82.6 % /100 % a

17.6 % / 88.9 % b

(Bosshard et al. 2003)

17/13

16S rDNA

93 % sensitivita

N

(Grijalva et al. 2003)*

28/61

16S rDNA

N

N

(Lang et al. 2004)

52/16

16S rDNA

41.2 % / 100 %

77.8 % / 93 %

(Breitkopf et al. 2005)

127/118

16S rDNA

61 % sensitivita

13 % sensitivita

(Greub et al. 2005)

156/0

16S rDNA

N

N

(Rovery et al. 2005)

35/120

16S rDNA

96 % / 95.3 %

N

(Marin et al. 2006)

74/16

16S rDNA

72 % / 100 %

26 % / 62 %

(Voldstedlund et al. 2008)

241/0

23S rDNA

96.4 % / 100 %

33.4 % / 96.6 %

(Vollmer et al. 2010)

549/ c

16S rDNA

N

N

Literatura

(Fournier et al. 2010)

Pozn. Ve všech studiích byly hemokultury použity jako zlatý diagnostický standard. Kultivace agens z chlopně prokázala nižší sensitivitu a specificitu než PCR. Někteří autoři provedli vyšetření metodou PCR i kultivací i u kontrolní skupiny pacientů s neinfekční kardiologickou diagnózou. a Pokud byli zahrnuti jen pacienti s NVE, byla sensitivita 94.1 %. b Bylo provedeno pouze u pacientů s NVE. c Všichni pacienti zařazení do souboru měli negativní výsledek hemokultur. Pomocí PCR bylo zachyceno etiologické agens u 476 pacientů. * V rámci této studie byla testována širokospektrá PCR a sekvencování pro diagnostiku IE u chirurgicky ošetřených pacientů v CKTCH, Brno. Legenda: N sensitivita a specificita nebyly v těchto studiích stanoveny.

35


3 CÍLE STUDIE a) popsat vyuţití širokospektré PCR a sekvencování pro rutinní mikrobiologickou diagnostiku b) zavést multiplex PCR pro specifickou detekci stafylokoků a jejich rezistence k oxacilinu (resp. beta-laktamům) a stanovit její analytickou sensitivitu a specificitu c) stanovit vyuţitelnost metody specifické PCR pro detekci stafylokoků z krve a intranasálních výtěrů při screeningu MRSA d) srovnat výsledky specifické PCR a širokospektré PCR se sekvencováním e) provést klinickou validaci PCR u pacientů s „prokázanou“ diagnózou IE stafylokokové etiologie a chirurgicky ošetřených pacientů s jinou, neinfekční diagnózou f) objasnit přínos/diagnostický význam PCR pro detekci stafylokoků u pacientů s „možnou“ diagnózou IE nebo negativními výsledky standardní kultivace

36


4 MATERIÁL A METODY 4.1 Optimalizace PCR pro průkaz stafylokoků 4.1.1 Testované kmeny Po účely optimalizace této PCR bylo pouţito celkem 14 referenčních kmenů stafylokoků a 173 kmenů patogenních bakterií a hub izolovaných z klinického materiálu (viz Tab. 6 a 7). Tabulka 6. Seznam referenčních kmenů. Koaguláza-pozitivní kmeny Číslo kmene (CCM*) Staphylococcus intermedius CCM4710 Staphylococcus aureus – rezistentní k oxacilinu CCM 7111 Koagulázanegativní kmeny Staphylococcus haemolyticus CCM2729 Staphylococcus hominis sbsp.hominis CCM2732 Staphylococcus epidermidis CCM2124 Staphylococcus lugdunensis CCM4068 Staphylococcus caprae CCM4546 Staphylococcus schleiferi CCM4070 Staphylococcus sciuri sbsp.sciuri – rezistentní k oxacilinu CCM7040 Staphylococcus saprophyticus CCM2727 Staphylococcus simulans CCM2724 Staphylococcus xylosus CCM2725 Staphylococcus warneri CCM2731 Staphylococcus capitis CCM2735 *Kmeny dodala Česká sbírka mikroorganismů (Brno).

4.1.1.1 Stanovení antibiotické citlivosti Pro testování citlivosti klinických izolátů stafylokoků k oxacilinu byl pouţit diskový difuzní test a mikrodiluční test. Pro tuto práci byly vyuţity breakpointové hodnoty antibiotik podle doporučení Mezinárodní společnosti pro klinické standardy (NCCLS). Minimální inhibiční koncentrace (MIC) oxacilinu u jednotlivých izolátů byla stanovena pomocí mikrodilučního testu. Breakpoint pro oxacilin byl stanoven 2 µg/ml u S. aureus a 0.5 µg/ml u KNS. Mikrodiluční test byl potvrzen diskovým difuzním testem s oxacilinem (1 µg, Oxoid, UK) a cefoxitinem (30 µg, Oxoid, UK), který je lepším induktorem rezistence, resp. exprese genu mecA. Breakpoint oxacilinu byl pro S. aureus > 13 mm, pro KNS > 18 mm, breakpoint cefoxitinu byl pro S. aureus > 20 mm a pro KNS > 25 mm. Dle dopopručení NCCLS byly všechny kmeny citlivé k cefoxitinu (CXT) hodnoceny jako citlivé k oxacilinu a ke všem betalaktamovým antibiotikům.

37

Molekulárně-mikrobiologická diagnostika u pacientů s infekční endokarditidou Tabulka 7. Klinické kmeny použité pro testování PCR specifické pro stafylokoky. S. aureus (n=64)

Počet izolátů

MRSA

29 a

MRSA + Gram-negativní tyčinky

1a

MRSA + Pseudomonas aeruginosa

1a

MSSA

29 b

MSSA + Candida albicans

1b

MSSA + Klebsiella pneumoniae

1b

MSSA + Escherichia coli

2b

Koagulázanegativní stafylokoky (n=53) MRKNS

22 a

MRKNS + K.pneumoniae + Proteus mirabilis

1a

MRKNS + P. mirabilis

1a

MRKNS + P. aeruginosa

2a

MRKNS + C. albicans

2a

MRKNS + Enterococcus faecalis

1a

MRKNS + Branhamella catarrhalis

1a

MRKNS + kvasinky (bez bližší specifikace)

1a

MSKNS

20 c

MSKNS + Streptococcus pneumoniae MSKNS + Gram-negativní bakterie (bez bližší specifikace)

1c 1c

Smíšené izoláty stafylokoků (n=7) MRSA + MSSA

1

MRSA + MSKNS

1

MSSA + MRKNS

3

MSSA + MSKNS

1

MSKNS + MRKNS

1

Izoláty jiných bakterií a hub (n=49) E. faecalis

2

E. coli

12

P. aeruginosa

3

K. pneumoniae

13

Klebsiella oxytoca

1

Klebsiella sp.

1

Enterobacter sp.

1

Acinetobacter baumanii Gram-negativní nefermentující tyčinky (bez bližší specifikace)

3

Gramnegativní tyčinky (bez bližší specifikace)

3

Kvasinky (bez bližší specifikace)

3

P. aeruginosa + P. mirabilis

1

P. aeruginosa + C. albicans + Candida tropicalis

1

E. coli + E. faecalis

1

3

C. albicans + C. tropicalis

1

CELKEM

173

Všechny kmeny MRKNS (n=31) a MRSA (n=31) rezistentní k oxacilinu byly rezistetní i k cefoxitinu. b Všechny kmeny MSSA (n=33) byly citlivé k oxacilinu i cefoxitinu. c Sedm z 22 kmenů MSKNS bylo rezistentních k oxacilinu, ale citlivých k cefoxitinu. Kmeny poskytl MÚ FNuSA v Brně. a

38


4.2 Analyzovaná skupina V letech 2004-2008 byl v naší laboratoři zpracován chirurgický materiál (nativní a prostetický) u 161 chirurgicky ošetřených pacientů s IE ze tří specializovaných kardiochirurgických center: Centrum kardiovaskulární a transplantační chirurgie (CKTCH) v Brně, Kardiocentrum Institutu Klinické a Experimentální Medicíny (IKEM) v Praze a Kardiochirurgická klinika Karlovy Univerzity v Hradci Králové. Do analyzovaného souboru bylo zahrnuto 60 pacientů, u nichţ byl pomocí molekulární metody a/nebo standardní mikrobiologické metody nalezen v krvi a/nebo v peroperačním materiálu KNS nebo S. aureus. Nebyli zahrnuti pacienti s jedním pozitivním záchytem KNS nebo pacienti, u nichţ byl nalezen kromě KNS i jiný patogen způsobující IE.

4.3 Kontrolní skupina Do kontrolní skupiny bylo zahrnuto 59 pacientů, kteří podstoupili kardiochirurgický zákrok pro jinou, neinfekční diagnózu. Při echokardiografii ani v průběhu operace nebylo podezření na akutní nebo jiţ proběhlou infekci. Peroperačně odstraněná chlopeň (ve většině případů aortální) byla vyšetřena na přítomnost DNA patogena pomocí širokospektré PCR a sekvencování a specifické PCR pro záchyt stafylokoků. Hemokultury ani odběr peroperačního materiálu pro standardní kultivační vyšetření nebyly provedeny.

4.4 Sběr klinických dat Pro kaţdého pacienta s podezřením na IE byl retrospektivně vyplněn formulář s následujícími údaji: 1) demografické údaje (pohlaví / věk / datum hospitalizace) 2) vstupní klinický obraz (febrilie / nové šelesty / známky arteriální embolizace / Oslerovy nodozity / NYHA / srdeční selhávání / edém plic / glomerulonefritida / kardiogenní šok / septický stav / multiorgánové selhání aj.) 3) vstupní laboratorní obraz (CRP / počet leukocytů / prokalcitonin/FW / RF aj.) 4) výsledek

transtorakální

/

transezofageální

echokardiografie

(typ

postiţené

chlopně/stupeň poruchy chlopně / dehiscence prostetické chlopně nebo jiného intrakardiálně uloţeného materiálu/přítomnost vlajících vegetací nebo perianulárního abscesu)

39


5) predispozice (intravenózní narkomanie/revmatická horečka / vrozená srdeční vada/prostetická chlopeň / dlouhodobá intravenózní terapie) a předchozí operace srdce 6) výsledky hemokultur (včetně počtu vpichů, časový odstup mezi odběry) před přijetím do specializovaného kardiochirurgického centra 7) výsledek kultivace a PCR z pooperačního materiálu 8) typ a délka konzervativní antibiotické léčby před operací 9) stav pacienta po 1 roce od chirurgického zákroku

4.5 Metody průkazu patogenů 4.5.1 Hemokultury Standardní hemokultivace (≥ 3 odběry) byla provedena v mikrobiologických laboratořích nemocničních zařízení, na kterých byli pacienti hospitalizováni před přijetím na specializovaná pracoviště a/nebo v laboratořích specializovaných kardiochirurgických pracovišť bezprostředně před operací. Nález KNS byl interpretován jako pozitivní pouze pokud byl prokázán v nejméně třech hemokulturách nebo ve dvou hemokulturách odebraných s minimálně 12h intervalem. Pacienti, u nichţ byl nález KNS doprovázen přítomností jiného agens typicky IE, nebyli zahrnuti do této studie. 4.5.2 Kultivace z chirurgického materiálu Chirurgický materiál byl odebrán do sterilní nádobky a zaslán do lokální klinické mikrobiologické laboratoře při příslušném specializovaném kardiochirurgickém centru. Nativní chlopeň byla mechanicky rozdrcena a homogenizována. Materiál z prostetické chlopně nebo část elektrody byl(a) sonikován(a) v bujónu. Podle standardního postupu dané mikrobiologické laboratoře byl bujón inokulován na sadu pevných kultivačních médií. Pro testování antibiotické citlivosti byl pouţit diskový difuzní test a/nebo mikrodiluční metoda pro přesné stanovení MIC, opět podle standardního operačního postupu dané mikrobiologické laboratoře. 4.5.3 Molekulárně-biologická detekce 4.5.3.1 Izolace DNA z bakteriální / houbové suspenze Bakteriální suspenze (500 µl) byla centrifugována 10 min. při 7500 rpm. Supernatant byl odstraněn a k sedimentu byl přidán pufr AE (QIAamp Blood Mini Kit, Qiagen,

40


Německo). Suspenze byla promíchána (15 s) a inkubována 15 min. při 95 °C. Na závěr byla provedena centrifugace při 7500 rpm po dobu 15 min. a supernatant byl pouţit jako templát pro širokospektrou PCR, která obsahuje interní kontrolu amplifikace (IKA) a pro specifickou multiplex PCR (viz dále). 4.5.3.2 Izolace DNA z chirurgického materiálu Chirurgický materiál pacientů s IE a pacientů kontrolní skupiny byl ve sterilních nádobkách bez transportního média doručen do Genetické laboratoře CKTCH. Materiál o velikosti cca 3x3 mm byl sterilními nástroji (pinzeta, skalpel) rozdrcen a vloţen do sterilní zkumavky (2 ml). Elektroda/umělá náhrada chlopně, na níţ nebyly viditelné vegetace, byla umístěna do zkumavky se sterilní vodou. Zkumavka byla vloţena do ultrazvukové lázně po dobu 5 min. (Ultrasonic LC 30H, P-lab, Česká republika). K takto připravenému materiálu byly přidány lytické enzymy: lysozym pro narušení buněčné stěny bakterií (180 mg/l, Sigma, Německo), lysostaphin pro narušení buněčné stěny stafylokoků (1,8 mg/ml, Sigma, Německo), lytikáza pro narušení buněčné stěny hub (5 U/µl, Sigma, Něměcko) a LBQ (500mM Na2 EDTA, 1M Tris, Triton X-100). Proběhla inkubace po dobu 30 min. při 37 °C. Následně byla provedena izolace DNA pomocí komerční soupravy QIAmp Blood Mini Kit (Qiagen, Německo) podle doporučení výrobce. DNA byla v posledním kroku eluována v 50 µl pufru a uchována při -20 °C. Celý proces izolace DNA probíhal v přísně sterilních podmínkách. Pro kontrolu bakteriální kontaminace prostředí při zpracování vzorku, byl zařazen vzorek sterilní vody (Braun, Německo), tzv. kontrola izolace DNA (IC). 4.5.3.3 Specifická PCR pro průkaz stafylokoků Byla navrţena cílová místa a délka amplifikovaných fragmentů pro detekci S. aureus, KNS

a

rezistence

k

oxacilinu.

Pomocí

softwarového

http://eu.idtdna.com/analyzer/applications/oligoanalyzer/default.aspx,

programu 1.7.2011)

( bylo

provedeno testování moţných interakcí mezi primery v multiplexovém uspořádání. Po optimalizaci s referenčními a klinickými kmeny byly zvoleny optimální podmínky amplifikace a sloţení PCR. Byly pouţity 3 páry primerů pro: 1) oblast genu pro 16S rRNA specifická pro stafylokoky, 2) gen femB specifický pro S. aureus a 3) gen mecA pro rezistenci k meticilinu/oxacilinu (viz Tab. 9). Příprava PCR proběhla následovně: 5µl templátové DNA bylo přidáno k 35µl PCR mixu o výsledném sloţení: 1x HotStartTaq MasterMix s 1.5 mM MgCl2 (Qiagen, Německo), 1 µM přímého a zpětného primeru femB, 0.35 µM přímého a

41


zpětného primeru mecA, 0.125 µM přímého a zpětného primeru pro sekvenci 16S rDNA specifickou pro stafylokoky. Po počáteční denaturaci při 94 °C 15 min., následovalo 10 cyklů při 94 °C 45 s, 59 °C 40 s, 68 °C 1 min. a 25 cyklů při 94 °C 1 min., 54 °C 50 s, 68 °C 2 min. (T3000 Thermocycler, Biometra, Německo). Elektroforéza byla provedena na 2 % agarózovém gelu (Serva, Německo) s EtBr (0.5 mg/ml) při 90V po dobu 45 min. S kaţdým vzorkem byl navíc analyzován vzorek pozitivní amplifikační kontroly (genomová DNA referenčního kmene MRSA) a negativní kontroly (sterilní voda), viz Obr. 4.

Obrázek 4. Kontrolní panel metody multiplex PCR specifické pro průkaz stafylokoků. Legenda: IC izolační kontrola, NC negativní kontrola, PC pozitivní kontrola, M100 molekulární žebříček 100-1000 bp. Interní amplifikační kontrola (IAC) není v reakci zahrnuta.

4.5.3.4 Širokospektrá PCR a sekvencování Primery byly navrţeny do konzervativní oblasti 16S rDNA (1243-1294bp, 1435-1465 bp) tak, aby uvnitř amplikonu zůstaly hypervariabilní oblasti V8-V9 ( viz Tab. 8). Sloţení PCR bylo následující: 1x HotStartTaq Master Mix, jehoţ součástí je 1.5 mM MgCl2 (Qiagen, Německo), 0.5 µM přímého a zpětného primeru pro širokospektrý záchyt bakterií (UNB1 a a UNB2b), 0.5 mM MgCl2, 0.02 mM dUTP a 0.025 mg/ml 8-methoxypsoralen (Sigma-Aldrich, Německo). Dekontaminace zahrnovala inkubaci PCR mixu při 4 °C po dobu 90 min. s následnou inkubací v UV linkeru (Bio-link BLX-365, Vilber Lourmat, Francie) při 30J po dobu 7 min. Do kaţdé reakční směsi bylo poté přidáno 5 µl DNA templátové DNA. Byla provedena amplifikace ve 35 cyklech při 96 °C 15 min., 96 °C 10 s, 57 °C 10 s, 72 °C 30 s (Peltier Thermocycler, MJ research, USA). Elektroforéza byla provedena na 2 % agarózovém gelu (Serva, Německo) při 90V po dobu 35 min. Produkt PCR byl přečištěn z gelu pomocí Gel

42


extraction Kit (Qiagen, Německo). Po proběhnutí sekvenační reakce (Big Dye Terminator 1.1/3.1 Ready Reaction cycle Sequencing Kit, Applied Biosystems, USA, California) byl produkt přečištěn pomocí soupravy BigDye X-terminator Kit (Applied Biosystems, USA, California). Sekvencování fragmentů o délce 372 bp bylo provedeno na čtyřkapilárním sekvenátoru ABI Avant 3100 (Applied Biosystems, USA, California). Výsledná sekvence byla srovnána

s

veřejně

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/,

dostupnými 1.7.2011)

sekvencí:

databázemi a

SepsiTest

Blast

GenBank

(http://www.sepsitest-

blast.de/en/index.html, 1.7.2011). S kaţdou sadou vzorků byl proveden kontrolní panel (viz Obr. 5). Jako pozitivní kontrola (PC) slouţila plazmidová DNA o konečné koncentraci 10^4 kopií/µl (variabilní oblast V8 a V9 16S rDNA Streptococcus pyogenes). Pro negativní kontrolu (NC) byla místo templátové DNA pouţita sterilní voda. K oběma kontrolám byla přidána interní kontrola amplifikace (IKA) pro odhalení případných falešně negativních výsledků v důsledku přítomnosti inhibitorů Taq polymerázy. Totálně negativní kontrola (TNC) slouţila pro kontrolu přípravy a dekontaminace reakční směsi PCR a neobsahovala IKA ani templátovou DNA.

Obrázek 5. Kontrolní panel br-PCR. Legenda: IC izolační kontrola, NC negativní kontrola, PC pozitivní kontrola, C4 koncentrace plazmidové DNA: 10^4 k/µl, C3 koncentrace plazmidové DNA: 10^3 k/µl, C2 koncentrace plazmidové DNA: 10^2 k/µl , TNC totálně negativní kontrola, M100 molekulární žebříček 100-1000bp. Interní amplifikační kontrola (IKA) má délku 519 bp, produkt 16S rDNA (oblasti V8-V9) má délku 372 bp.

43


Tabulka 8. Primery použité pro specifickou a širokospektrou PCR. Cílové místo

Délka

Přímé (5´-3´)

Zpětné (5´-3´)

CCTATAAGACTGGGATAACTTCGGG

CTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCG

791 bp

femB

TTACAGAGTTAACTGTTACC

ATACAAATCCAGCACGCTCT

651 bp

mecA

GTAGAAATGACTGAACGTCCGATAA

CCAATTCCACATTGTTTCGGTCTAA

310 bp

AACTGGAGGAAGGTGGGGAT

AGGAGGTGATCCAGCCGCA

372 bp

16SrDNA Stafylokoky

16SrDNA Panbakteriální

produktu

Literatura (Mason et al. 2001) (Jonas et al. 2002) (Jonas et al. 2002) (Grijalva et al. 2003)

4.6 Statistika Hladina významnosti demografických rozdílů mezi analyzovanou a kontrolní skupinou byla vypočítána pomocí neparametrického Mann-Whitney testu (věk) a χ2 testu. Pomocí AUC (Area Under the Curve) a MedCalc 11.1.0.0 (MedCalc Software 1993-2009) byl proveden výpočet intervalů spolehlivosti sensitivity a specificity PCR. Výpočet vycházel z binormálního modelu. Diagnostická síla PCR byla potvrzena pomocí

ROC (Receiver

Operating Characteristics ) SPSS Inc. web calculator (Eng, 2006), verze SPSS 17.02 (SPSS Inc., 2009) (http://www.jrocfit.org, 1.7.2011 ). Pro párové srovnání obou PCR metod u pacientů prokázanou diagnózou IE a kontrolní skupiny byl pouţit Mc Nemarův test. Párové srovnání výsledků hemokultur s kultivací nebo PCR z chirurgického materiálu u pacientů s „možnou“ nebo „prokázanou“ diagnózou IE bylo provedeno pomocí Mc Nemarova testu. Pro stanovení významnosti rozdílů klinických parametrů mezi pacienty s IE způsobenými S. aureus a KNS byl pouţit Fisherův test shody dvou relativních četností s oboustranným rozdělením. Rozdíly mezi srovnávanými skupinami byly povaţovány za statisticky významné při p < 0.05.

44


5 VÝSLEDKY 5.1 Přínos širokospektré detekce bakterií pro klinickou praxi V rámci doktorského studia jsem se v Genetické laboratoři CKTCH podílela na rutinním molekulárně-biologickém vyšetření klinických vzorků od pacientů s infekčním onemocněním. Výhodou molekulárně-biologické metody zaloţené na širokospektré PCR a sekvencování je její nezávislost na viabilitě bakterií a moţnost záchytu DNA jakéhokoliv bakteriálního agens, které se v materiálu vyskytuje bez nutnosti předchozí kultivace. Uplatňuje se zejména v případech nekultivovatelných, obtíţně kultivovatelných nebo na transport náročných patogenů, případně u vzorků odebraných při současné antibiotické terapii. V letech 2007-2010 jsem se podílela na přípravě publikací čtyř zajímavých kazuistik, kde se širokospektrá PCR ukázala jako velmi potřebná pro diagnostiku infekčních onemocnění u pacientů v závaţném stavu. Ve spolupráci s Klinikou infekčních chorob v Brně je popisována sepse vyvolaná bakterií Capnocytophaga canimorsus (viz Příloha 1), ve spolupráci s Kardiochirurgickým centrem FN Ostrava je prezentována kazuistika kultivačně negativní IE aortální a mitrální chlopně způsobená Tropheryma whipplei (viz Příloha 2), ve spolupráci s Úrazovou nemocnicí v Brně uvádím kazuistiku těţké rekurentní infekce umělého kolenního kloubu s nesouhlasnými výsledky standardní kutivace a PCR (viz Příloha 3). V roce 2010 byla publikována kazuistika pacienta chirurgicky ošetřeného v CKTCH s diagnózou IE aortální chlopně způsobenou Cardiobacterium valvarum, kterou nebylo moţné identifikovat pomocí běţných biochemických testů (viz Příloha 4). Ve studii, která uvádí výsledky chirurgické léčby IE na CKTCH, bylo etiologické agens stanoveno podle výsledků hemokultur, PCR a kultivace agens z peroperačního materiálu. Nejčastějším etiologickým agens byly S. aureus a KNS. Vzhledem k jiţ nízké či nulové ţivotnosti infekčního agens v době chirurgického výkonu se ukázala metoda širokospektré PCR chirurgického materiálu být v mnoha případech jedinou moţností identifikace mikrobiálního nebo mykotického původce endokarditidy (viz Příloha 5). Z důvodu častého záchytu stafylokoků pomocí širokospektré PCR a sekvencování v klinických vzorcích jsem tuto metodu doplnila o méně časově i finančně náročnou specifickou PCR pro záchyt těchto bakterií, s moţností stanovení rezistence k oxacilinu (viz dále).

45


5.2 Optimalizace podmínek PCR specifické pro stafylokoky Pro optimalizaci specifické PCR byla pouţita templátová DNA kmene S. aureus rezistentního k oxacilinu (MRSA). Empiricky byla stanovena optimální koncentrace hořečnatých iontů v reakční směsi a teplota připojení jednotlivých primerových párů. Kaţdý primerový pár byl testován v oddělené reakční zkumavce s cílem získat silný produkt PCR. Díky rozdílné teplotě tání jednotlivých párů primerů bylo nutné po přidání do jedné reakce optimalizovat podmínky amplifikace. Výsledkem optimalizace podmínek PCR byly tři fragmenty přibliţně stejné intenzity a definované délky (viz Obr. 6).

Obrázek 6. Postupná optimalizace multiplex PCR specifické pro průkaz stafylokoků. Cílovými místy amplifikace byl 1) gen specifický pro stafylokoky (16S rDNA-sta, 791bp), 2) gen specifický pro S. aureus (femB, 651bp) a 3) gen kódující rezistenci k oxacilinu,resp. všem beta-laktamovým antibiotikům (mecA, 310bp). Byly nalezeny optimální podmínky reakce s použitím všech primerových párů v jedné reakci. M100 molekulární žebříček (1000 - 100bp).

5.2.1 Analytická sensitivita PCR pro stafylokoky Plná zdravá krev byla očkována postipně ředěnou suspenzí MRSA, se vstupní koncentrací 4.106 CFU/ml aţ 4 CFU/ml. DNA byla izolována z 500 µl plné krve. Mez detekce MRSA byla opakovaně stanovena na 4 CFU/ml plné krve (viz Obr. 7).

46


Obrázek 7. Analytická sensitivita PCR specifické pro stafylokoky. Koncentrace suspenzí jsou uvedeny v řádech (tzn. např. 10^6=4.10^6). Každé ředění bylo provedeno v duplikátu, experiment byl několikrát opakován včetně očkování krve suspenzí MRSA, izolace DNA a PCR. Zktratky: CI kontrola izolace, NC negativní kontrola, PC pozitivní kontrola PCR, M100 molekulární žebříček (1000 - 100bp).

5.2.2 Analytická specificita PCR pro stafylokoky Ke stanovení analytické specificity PCR bylo pouţito 14 referenčních a 173 klinických kmenů stafylokoků a jiných bakterií. Kmeny stafylokoků rezistentních/citlivých k oxacilinu poskytly typické vzory produktů PCR (viz Obr. 8). Výsledek testování specifické PCR byl porovnán se standardní kultivací a stanovením antibiotické citlivosti pomocí mikrodilučního a diskového difuzního testu (viz Tab. 9).

Obrázek 8. Přehled typických vzorů produktů specifické PCR u jednotlivých druhů stafylokoků. Legenda: MSSA kmen S. aureus citlivý k oxacilinu; MRSA kmen S. aureus rezistentní k oxacilinu;MSKNS koagulázanegativní stafylokok citlivý k oxacilinu; MRKNS koagulázanegativní stafylokok rezistentní k oxacilinu, M100 molekulární žebříček (1000 - 100 bp).

47

Molekulárně-mikrobiologická diagnostika u pacientů s infekční endokarditidou Tabulka 9. Výsledky identifiakace klinických kmenů stafylokoků pomocí specifické PCR a standardní kultivace. Fenotypová identifikace* MRSA MRSA + jiný kmen MSSA MSSA + jiný kmen Celkem MRKNS MRKNS + jiný kmen MSKNS MSKNS + jiný kmen Celkem Smíšené kmeny stafylokoků Ostatní bakterie Celkem

Shoda s PCR 28 2 29 3 62 22 9 11 1 43 0 49 154

Neshoda s PCR 1a 0 0 1b 2 0 0 9c 1d 10 7e 0 19

Celkem 29 2 29 4 64 22 9 20 2 53 7 49 173

aU

kmene nebyla prokázána přítomnost genu mecA. b U smíšeného kmene MRSA a E. coli byla prokázána pouze E. coli. sedmi kmenů citlivých k cefoxitinu a rezistentních k oxacilinu byla prokázána přítomnost genu mecA. Dva kmeny citlivé k oxacilinu a cefoxitinu (jeden dubiózní) prokázaly přítomnost genu mecA. d Tento kmen byl citlivý k oxacilinu a cefoxitinu a prokázal gen mecA. e U smíšených kmenů nebylo možné odlišit jednotlivé kmeny (viz Tab. 11). cU

Pomocí specifické PCR byly u 63/64 (98 %) čistých a smíšených kmenů S. aureus prokázány geny 16rRNA-sta a femB. U jednoho smíšeného kmene S. aureus a E. coli nebyl při PCR specifické pro stafylokoky nalezen ţádný produkt. Pomocí sekvencování genu pro 16S rRNA byla s 99 % shodou prokázána E. coli (nebyl sledován polymikrobální signál). Pravděpodobně se jednalo o chybný odběr kolonií S. aureus. U 30/31 (97 %) čistých i smíšených kmenů S. aureus rezistentních k oxacilinu a cefoxitinu byl prokázán gen mecA. Ţádný z 31 kmenů S. aureus citlivých k oxacilinu i cefoxitinu neprokázal gen mecA (viz Tab. 10). U třinácti referenčních kmenů KNS byl zachycen gen pro 16S rRNA, sekvencce specifická pro stafylokoky (sta). Z celkem 13 kmenů KNS byla jen u kmene S. sciuri rezistentního k oxacilinu prokázána přítomnost genu mecA. U všech 53 čistých i smíšených klinických kmenů KNS byl prokázán gen 16S rRNA-sta (viz Tab. 9). Gen mecA byl nalezen u všech 31 kmenů KNS rezistentních k oxacilinu i cefoxitinu, u všech 8 kmenů rezistentních k oxacilinu a citlivých k cefoxitinu a u 2/12 kmenů citlivých k oxacilinu i cefoxitinu (viz Tab. 10). U ţádného ze 49 kontrolních kmenů jiných G+ nebo gramnegativních (G-) bakterií nebyly pozorovány produkty PCR specifické pro stafylokoky. Pro kontrolu přítomnosti

48


bakteriální DNA u těchto kmenů byla provedena širokospektrá PCR s interní amplifikační kontrolou, která ve všech 49 případech poskytla pozitivní výsledek (data nejsou ukázána). Všechny smíšené kmeny MRKNS a MSSA nebo MRKNS a MSKNS prokázaly obrazec produktů PCR identický s MRSA nebo MRKNS (viz Tab. 11). Tabulka 10. Srovnání PCR a diskového difuzního testuvu klinických kmenů stafylokoků.

PCR

oxa R cxt R (n=31)

KNS (n=53) oxa R cxt C (n=8)

mecA +

31

8

2

0

0

31

mecA-

0

0

12

32

0

0

oxa C cxt C (n=14)

oxa C cxt C (n=32)

S. aureus (n=63) oxaR cxt C oxaR cxt R (n=0) (n=31)

Pozn. Tabulka zahrnuje 63/64 čistých/smíšených kmenů S. aureus. Dle dopopručení NCCLS byly všechny kmeny citlivé k cefoxitinu hodnoceny jako citlivé ke všem beta-laktamovým antibiotikům. Legenda: Oxa oxacilin (Oxoid, 1 g), Cxt cefoxitin (Oxoid, 30µg).

Tabulka 11. Výsledky PCR a standardní kultivace u smíšených klinických kmenů stafylokoků. Standardní kultivace MRKNS + MSSA MRKNS + MSKNS MRSA + MSSA

Výsledky multiplex PCR femB mecA + + + + +

16S rDNA- sta + + +

Výsledek MRSA MRKNS MRSA

Pozn. Smíšené kmeny MRKNS a MSSA poskytovaly falešně pozitivní profil MRSA.

5.2.3 PCR pro intranasální screening MRSA Pro případné vyuţití našeho systému pro specifickou detekci stafylokoků pro intranasální screening byla testována účinnost flokovaných a běţných typů tampónů bez transportního média. Tampóny byly ponořeny do suspenze MRSA o klesající koncentraci a DNA byla izolována z takto vzniklé suspenze pomocí standarní izolační metodiky zavedené v Genetické laboratoři CKTCH. Flokované tampóny při tomto testu neukázaly vyšší citlivost záchytu agens neţ standardně pouţívané tampóny. Vyšetření pomocí specifické PCR pro stafylokoky bylo pilotně provedeno u několika pacientů s prokázaným nosičstvím MRSA. Díky tomu, ţe metoda vyuţívá jako cílový gen

49


mecA, který se vyskytuje u KNS i S. aureus, nebylo moţné smíšenou kolonizaci MRKNS a MSSA odlišit od kolonizace MRSA.

5.3 Detekce stafylokoků u chirurgicky léčených pacientů s IE V období od 04/2004 do 03/2008 jsme v Genetické laboratoři CKTCH vyšetřili chirurgický materiál od 161 pacientů se suspektní IE, u 60 (37 %) pacientů bylo podezření na IE stafylokokové etiologie. Diagnóza IE stanovená podle Duke kritérií na základě klinického obrazu, echokardiografického vyšetření a výsledků hemokultur byla hodnocena jako „prokázaná“ u 35 (58 %) pacientů, jako „možná“ pak v 25 (42 %) případech. Do kontrolní skupiny bylo zařazeno 59 pacientů s neinfekční kardiologickou diagnózou. Byly srovnány klinické parametry u pacientů s IE a pacientů s jinou diagnózou (viz Tab. 12). V souboru pacientů s IE bylo 44 (73 %) muţů, průměrný věk všech pacientů s IE byl niţší neţ v kontrolní skupině (57 vs. 64, p < 0.001). U pacientů s „prokázanou“ IE byla sledována vyšší mortalita neţ u pacientů s „možnou“ diagnózou IE (29 % vs. 8 %, p < 0.05) Nejčastěji byla infekcí postiţena nativní aortální chlopeň. Nativní chlopeň byla častěji spojená s „prokázanou“ diagnózou neţ umělá chlopeň (77 % vs. 48 %, p < 0.05). V souboru bylo 7 (12 %) narkomanů, u všech byla před operací „prokázaná“ diagnóza IE. Do jednoho roku od chirurgického výkonu zemřelo 14 (28 %) pacientů s podezřením na IE. Výsledky standardních kultivačních i molekulárních metod u pacientů s podezřením na IE a pacientů kontrolní skupiny jsou uvedeny v Tabulce 13. Tabulka 12. Klinické parametry u pacientů s IE a pacientů s jinou diagnózou (kontrolní skupina). Kontrolní Pacienti P Diagnóza IE skupina s IE „Prokázaná“ „Možná“ (n=59) (n=60) (n=35) (n=25) Věk 1 64 (33;84) 57 (18;84) < 0.001 56 (18;78) 58 (32;84) Muži 34 (58 %) 44 (73 %) 0.074 24 (69 %) 20 (80 %) NIE 56 (95 %) 39 (65 %) 27 (77 %) 12 (48 %) < 0.001 PIE 2 3 (5 %) 21 (35 %) 8 (23 %) 13 (52 %) Typ chlopně Ao 52 (88 %) 28 (47 %) 14 (40 %) 14 (56 %) Mi 2 (3 %) 13 (22 %) 8 (23 %) 5 (20 %) < 0.001 Tri 1 (2 %) 3 (5 %) 3 (9 %) 0 (0 %) Jiné 4 (7 %) 16 (27 %) 10 (29 %) 6 (24 %) Narkomani N 7 (12 %) 7 (20 %) 0 (0 %) Úmrtnost 3 N 14 (28 %) 10 (29 %) 4 (8 %)

P 0.185 0.323 0.042

0.154 0.017 0.046

Věkový medián, v závorkách je uvedeno rozmezí hodnot mezi 5tým a 95tým percentilem. 2 Zahrnuje infekci náhradní chlopně a dalších intrakardiálně uložených těles. 3 Byli zařazeni pouze pacienti, kteří přišli na roční kontrolu (n=50). Hladiny významnosti byly vypočítány pomocí neparametrického testu Mann-Whitney (věk) a χ2 testu.Legenda:P hladina významnosti, NIE nativní infekční endokarditida, PIE prostetická infekční endokarditida, Ao aortální chlopeň, Mi mitrální chlopeň, Tri trikuspidální chlopeň, jiné elektrody nebo elektrody + chlopeň nebo více než jedna chlopeň, N data nebyla dostupná. 1

50

Molekulárně-mikrobiologická diagnostika u pacientů s infekční endokarditidou Tabulka 13. Výsledky provedených testů u pacientů s IE a pacientů v kontrolní skupině. Kontrolní skupina

Pacienti s IE Provedené testy Hemokultury (n=60)

pozitivní

44 (73 %)

S. aureus

32 (73 %)

Širokospektrá PCR (n=60)

9 (36 %)

N

1

27 (77 %)

5 (56 %)

N

8 (18 %)

1

4 (11 %)

4 (44 %)

N

S. aureus + KNS

3 (7 %)

1b

3(9 %)

0(0 %)

N

Jinéc

1 (2 %)

N

1 (3 %)

0 (0 %)

N

negativní

16 (27 %)

0 (0 %)

16 (64 %)

N

pozitivní

22 (38 %)

9 (27 %)

13 (52 %)

N

S. aureus

9 (41 %)

0

7 (78 %)

2 (15 %)

N

KNSd

10 (45 %)

3

0 (0 %)

10 (77 %)

N

Jinée

3 (14 %)

N

2 (22 %)

1 (8 %)

N

negativní

36 (62 %)

24 (73 %)

12 (48 %)

N

pozitivní

51 (85 %)

31 (89 %)

20 (80 %)

3 (5 %)

S. aureus

33 (65 %)

N

24 (77 %)

9 (45 %)

0 (0 %)

13 (25 %)

N

5 (16 %)

8 (40 %)

0 (0 %)

2 (6 %)

1 (5 %)

0 (0 %)

2 (7 %)

3 (15 %)

3(100 %)

KNSf

Specifická PCR (n=53)

Staphylococcus sp. g

3 (6 %)

Jinéh

2 (4 %)

N

negativní

9 (15 %)

4 (11 %)

5 (20 %)

56 (95 %)

pozitivní

48 (91 %)

30 (88 %)

18 (95 %)

1(2 %)

S. aureus

33 (69 %)

0

25 (83 %)

8 (44 %)

0 (0 %)

KNS

15 (31 %)

8

5 (17 %)

10 (56 %)

1 (100 %)

5 (9 %)

4 (12 %)

1 (5 %)

58(98 %)

positive

52 (87 %)

31 (89 %)

21 (84 %)

3 (5 %)

S. aureus

34 (65 %)

0

25 (81 %)

9 (43 %)

0 (0 %)

5 (16 %)

11 (52 %)

1 (33 %)

1 (3 %)

1 (5 %)

0 (0 %)

negativní PCR** (n=60)

„Možná“IE

35 (100 %)

KNSa

Kultivace materiálu (n=58)

Oxa-rez. „Prokázaná“IE kmeny *

Celkem

16 (31 %)

8

Staphylococcus sp. g

2 (4 %)

N

Jinéh

0 (0 %)

0 (0 %)

0 (0 %)

2 (67 %)

8 (13 %)

4 (11 %)

4 (20 %)

56 (95 %)

KNSi

negativní

*Fenotypové stanovení citlivosti k antibiotikům bylo provedeno pomocí mikrodilučního testu a diskového difuzního testu (oxacilin a cefoxitin). Genotypové stanovení bylo založeno na průkazu genu mecA. ** Zahrnuje výsledek specifické i širokospektré PCR. a S. epidermidis (5), S. capitis (1), KNS bez bližšího určení (2). b KNS rezistentní k oxacilinu. c U jednoho pacienta byl v čtyřech vzorcích odebraných v časovém intervalu delším než 12h nalezeno Corynebacterium sp. d S. epidermidis (5), KNS bez bližšího určení (5). e Micrococcus luteus (1), Propionibacterium acnes (1) a mikroskopicky anaerobní G+ koky, které nebyly blíže identifikovány (1). f S. epidermidis (12) a S. haemolyticus (1). g Širokospektrá PCR velmi slabě pozitivní; u tří pacientů byl pomocí sekvencování zachycen Staphylococcus sp., který nebylo možné blíže identifikovat, u dalších dvou pacientů s IE a tří pacientů z kontrolní skupiny nebylo agens pomocí sekvencování identifikováno. h Agens nemohlo být blíže identifikováno díky slabé pozitivitě. i S. epidermidis (12), S. haemolyticus (1), KNS bez bližšího určení (3). Legenda: N neprovedeno, KNS koagulázanegativní stafylokoky, oxa-rez. oxacilin rezistentní.

51


5.3.1 Srovnání specifické a širokospektré PCR Byla provedena validace metod PCR včetně stanovení analytické a klinické specificity a sensitivity. Výsledky širokospektré a specifické PCR se u pacientů s „prokázanou“ diagnózou IE a kontrolní skupinou významně nelišily (98 % vs. 97 %, p= 0,734, viz Tab. 14). Pro další analýzu proto byly jejich výsledky spojeny. Tabulka 14. Srovnání výsledků širokospektré a specifické PCR u pacientů s IE a kontrolní skupiny. Širokospektrá Specifická PCR PCR Pacienti (n=112) Kontrolní pacienti (n=59) Pacienti s IE (n=53*) pozitivní

pozitivní

48

1

47

negativní

negativní

61

56

5

negativní

pozitivní

1

0

1

pozitivní

negativní

2

2

0

Shoda

97 %

97 %

98 % 0.734

Hladina významnosti (p)

*Obě metody PCR byly provedeny u 53/60 pacientů s IE. Pro párové srovnání obou PCR metod u pacientů „prokázanou“ diagnózou IE a pacientů kontrolní skupiny byl použit Mc Nemarův test.

Klinickou sensitivitu a specificitu PCR jsme určili zhodnocením výsledků u pacientů s „prokázanou“ diagnózou IE (n=34) a u pacientů kontrolní skupiny (n=59). Jako pozitivní byl hodnocen výsledek alespoň jednou z metod PCR. Počet pozitivních výsledků byl podle očekávání signifikantně vyšší u pacientů s IE neţ u kontrolní skupiny (89 % vs. 5 %, p < 0.001). S. aureus i KNS byly nalezeny významně častěji u pacientů s „prokázanou“ diagnózou IE neţ u pacientů kontrolní skupiny (80 % vs. 0 %, p < 0.001 u S. aureus, a 14 % vs. 2 %, p= 0.022 u KNS), viz Tab. 15. Tabulka 15. Klinická citlivost a specificita PCR. „Prokázaná“ IE (n=35) Kontrolní skupina (n=59) PCR + 31 (89 %) 3 (5 %) S. aureus 25 (80 %) 0 (0 %) KNS 5 (14 %) 1 (2 %) Ostatní 1 1 (3 %) 2 (3 %) PCR 4 (11 %) 56 (95 %) Sensitivita 89 %, specificita 95 %, PPV 92 %, NPV 94 %, AUC: 0.884(0.803 – 0.943)

P < 0.001 < 0.001 0.022 < 0.001

Výsledek obou metod PCR byl sloučen na základě vysoké shody v předchozí analýze. Výsledek byl považován za pozitivní pokud alespoň jeden z testů byl pozitivní. 1 Agens nebylo možné identifikovat pomocí sekvencování díky slabé pozitivitě produktu širokospektré PCR, specifická PCR nebyla provedena. Diagnostická síla testu byla potvrzena pomocí ROC (Receiver Operating Characteristics ) web calculator (Eng, 2006), verze SPSS 17.02 (SPSS Inc., 2009) a pomocí AUC (Area Under the Curve) a MedCalc 11.1.0.0 (MedCalc Software 1993-2009) byl proveden výpočet intervalů spolehlivosti sensitivity a specificity PCR. Výpočet vycházel z binormálního modelu.

52


5.3.2 Srovnání PCR se standardní kultivací u pacientů s IE Za účelem stanovení úlohy PCR v diagnostice stafylokokové IE byla provedena retrospektivní analýza a srovnání s výsledky předoperačních hemokultur a peroperační kultivace z chirurgického materiálu. Výsledky PCR se shodovaly s výsledky hemokultur (včetně negativních výsledků) u 72 % případů. Oba testy se lépe shodovaly u pacientů s předoperačně „prokázanou“ diagnózou IE neţ u pacientů s předoperačně „možnou“ diagnózou IE (88 % vs. 48 %, p < 0.001), viz Tab. 16. Kultivace agens z chirurgického materiálu se shodovala s hemokulturami u 31 % případů. Shoda byla nízká u pacientů s „prokázanou“ i „možnou“ diagnózou IE (27 % vs. 36 %, p= 0,463), viz Tab. 17. Tabulka 16. Korelace výsledků hemokultivace a PCR u pacientů s IE. Hemokultura

PCR

Diagnóza IE (n=60) „Prokázaná“ (n=35)

„Možná“ (n=25)

negativní

negativní

0

4

negativní

pozitivní

0

12

pozitivní

negativní

4

1

pozitivní

pozitivní

31

8

88 %

48 %

Shoda Celková shoda

72 %

Hladina významnosti (p)

0.001

Pozn. Pro párové srovnání (pair-wise comparison) obou testů u pacientů s „možnou“ a „prokázanou „diagnózou IE byl použit Mc Nemarův test. Tabulka 17. Korelace výsledků hemokultivace a kultivace z chirurgického materiálu u pacientů s IE. Hemokultura

Kultivace z materiálu

negativní negativní pozitivní pozitivní

negativní pozitivní negativní pozitivní

Diagnóza IE (n=58*) „Prokázaná“ (n=33) „Možná“ (n=25) 0 6 0 10 24 6 9 3

Shoda

27 %

Celková shoda Hladina významnosti (p)

36 % 31 % 0.463

Pozn. *Kultivace agens z peroperačního materiálu byla provedena u 58 /60 pacientů s IE. Pro párové srovnání obou testů u pacientů s „možnou“ a „prokázanou“ diagnózou IE byl použit Mc Nemarův test.

53


5.3.3 Stanovení etiologie IE u jednotlivých pacientů Pro stanovení etiologie a pooperační diagnózy IE u kaţdého pacienta, byly výsledky předoperačních hemokultur, kultivace a PCR z chirurgického materiálu interpretovány v kontextu s klinickým stavem pacientů před operací a operačním nálezem (viz Tab. 18). KNS v peroperačním materiálu byly povaţovány za etiologické agens IE pouze tehdy, byl-li pozitivní nález potvrzen alespoň dvěma provedenými metodami a výsledek souhlasil s echokardiografickým nálezem. Oproti tomu, S. aureus byl povaţován za etiologii, byl-li nalezen kteroukoliv metodou. U 11/12 pacientů s pozitivním výsledkem hemokultur a PCR z chirurgického materiálu byl shodně zachycen S. aureus (7) nebo KNS (4). U zbylého jednoho pacienta s „prokázanou“ IE byl nalezen S. aureus v jedné a blíţe neurčený KNS v dalších třech hemokulturách, zatímco z chirurgicky odstraněné vegetace na mitrální chlopni byl vypěstován Micrococcus luteus. V embolu dolní končetiny a poté i v chirurgicky odstraněné vegetaci na mitrální chlopni byl pomocí sekvencování variabilní oblasti V2-V9 genu 16S rDNA prokázán S. haemolyticus. U celkem 27 pacientů byl zaznamenán pozitivní výsledek hemokultur a PCR, v 23 případech byl nalezen S. aureus, ve 4 případech byl prokázán S. epidermidis. Výsledek kultivace z chirurgicky odstraněného materiálu byl v 25 případech negativní a ve 2 případech nebyl chirurgem zaslán na kultivační vyšetření. Aţ 75 % těchto pacientů bylo před výkonem zaléčeno antibiotiky v období delším neţ 5 dní, coţ velmi pravděpodobně přispělo k negativním výsledkům kultivace (viz Tab. 18). Ve třech případech nebyly výsledky PCR a hemokultivace v plné shodě. U dvou pacientů s „prokázanou“ IE byl nalezen v hemokulturách S. aureus a KNS: u jednoho pacienta byl nalezen S. aureus opakovaně v několika odběrech a KNS ve dvou odběrech, u druhého pacienta byl nalezen KNS i S. aureus ve třech po sobě jdoucích odběrech. Pomocí PCR byl u obou pacientů určen s 98 % shodou s referenční sekvencí S. aureus, který byl potvrzen detekcí dvou dalších specifických genů pro S. aureus. U jednoho pacienta bylo ve 4/6 hemokultur odebraných více neţ 12 hodin po sobě prokázáno Corynebacterium sp., zatímco PCR zacílená na dva specifické geny a 16S rDNA doplněná sekvencováním prokázala S. aureus s 99 % shodou s referenční sekvencí v databázi. Tento pacient zemřel týden po operaci na následky rozsáhlých embolizací v mozku a játrech, krvácení do mozku a pravostranné hemiparézy. Vzhledem ke klinickému průběhu IE u tohoto pacienta a k tomu, ţe Corynebacterium sp. je častěji popisováno jako součást přirozené

54


mikroflóry lidské kůţe neţ etiologické agens IE, byl za etiologické agens IE povaţován S. aureus. U pěti pacientů nebylo při kultivaci ani PCR z chirurgického materiálu nalezeno etilogické agens, zatímco v předoperačně odebraných hemokulturách byl prokázán S. aureus. U 4/5 pacientů byl S. aureus nalezen nejméně ve třech odběrech, u jednoho pacienta byl S. aureus vypěstován jen v 1/14 odběrů. Jelikoţ u tohoto pacienta byla postiţena intrakardiální elektroda, je moţné, ţe na kultivační a PCR vyšetření byla odeslána neadekvátní část materiálu nebo vegetace, nebo se jednalo o neinfekční trombus. Jediný nález S. aureus pak mohl představovat pouze přechodnou bakteriémii, která nebyla příčinou endokarditidy. Pro toto tvrzení by také svědčilo rychlé vymizení S. aureus z krve po proběhnutí konzervativní antibiotické léčby. Jelikoţ však nebylo provedeno histopatologické vyšetření odstraněné vegetace, nelze diagnózu IE jednoznačně prokázat nebo vyloučit. U pěti pacientů s negativním výsledkem hemokultur se shodoval výsledek kultivace a PCR z chirurgického materiálu. U dvou pacientů byl zachycen S. aureus a u třech S. epidermidis. U dvou dalších pacientů s negativním výsledkem hemokultur se výsledky kultivace a PCR z chirurgického materiálu lišily. U jednoho pacienta s „možnou“ diagnózou IE byl z chirurgického materiálu vypěstován S. epidermidis, zatímco širokospektrá PCR se sekvencováním zachytila s 99 % shodou s referenční sekvencí čistý signál S. aureus a ten byl navíc potvrzen záchytem dvou dalších specifických genů. S. epidermidis byl proto povaţován za kontaminaci a případ uzavřen jako IE s etiologií S. aureus. U pacienta s „možnou“ diagnózou IE bylo za anaerobních podmínek z chirurgického materiálu vypěstováno Propionibacterium acnes zatímco PCR specifická pro stafylokoky prokázala slabě pozitivní záchyt KNS. Histopatologická analýza nativní chlopně neprokázala přítomnost aktivní endokarditidy, oba pooperační testy byly pravděpodobně falešně pozitivní díky kontaminaci z prostředí (viz dále). U tří pacientů s „možnou“ diagnózou IE byl shodně prokázán negativní výsledek hemokultur a PCR, zatímco z chirurgického materiálu byl vypěstován blíţe nespecifikovaný KNS. U prvního pacienta byl nález při echokardiografickém vyšetření hodnocen jako starší vegetace nebo fibroblastom. Tento nález však do týdne progredoval, přitom byl pozorován perikardiální výpotek (1cm) s paralelním nárůstem CRP z 90 aţ na 300 mg/l v průběhu 4 dní. Z důvodu opakované peritonitidy stafylokokového původu při peritoneální dialýze byl pacient zaléčen před operací antibiotiky. Peroperačně byly na cípech chlopně nalezeny křehké

55


vegetace a hnis. Materiál však nebyl zaslán na histologické vyšetření a tak nebylo moţné diagnózu IE způsobenou KNS spolehlivě prokázat nebo vyloučit. Druhý pacient byl dlouhodobě léčen pro mnohočetná loţiska S. aureus v defektu po popálení dolní končetiny. Před dvěma lety prodělal infekci na intrakardiální elektrodě. V důsledku progerese vegetací na elektrodě i přes konzervativní léčbu bylo nutné elektrody chirurgicky odstranit. Materiál (elektroda) nebylo moţné zaslat na histopatologické vyšetření pro průkaz nebo vyloučení IE. U třetího pacienta bylo při echokardiografickém vyšetření zjištěno uvolnění mechanické aortální chlopně, CRP bylo mírně zvýšené (58 mg/ml). Peroperačně byla nalezena prázdná abscesová dutina a subvalvární lem kolem celého anulu. Histopatologické vyšetření nebylo provedeno a tak nebylo moţné diagnózu IE prokázat ani vyloučit. U šesti pacientů byly hemokultury a kultivace z chirurgického materiálu negativní zatímco PCR prokázala S. aureus (3) a KNS (3). U všech pacientů, u nichţ byl pomocí obou PCR testů prokázán S. aureus, byl tento patogen nalezen v periferních koţních embolech (1) nebo byla zaznamenána horečka a příznaky meningitidy spojené se zvýšenými zánětlivými markery (2). Naproti tomu pacienti s nálezem KNS měli předoperačně jen mírně zvýšené zánětlivé markery a KNS byl prokázán u 2/3 pacientů, a to pouze jedním PCR testem. U 2 pacientů byly při echokardiografickém zobrazení patrné vegetace. Přestoţe byl u všech tří pacientů makroskopicky suspektní zánět nebo křehká vegetace, nebyl zaslán chirurgický materiál na histopatologické vyšetření, a tak nebylo moţné infekční proces na endokardu spolehlivě prokázat nebo vyloučit.

56

Molekulárně-mikrobiologická diagnostika u pacientů s infekční endokarditidou Tabulka 18. Výsledky provedených metod u pacientů s IE. Předoperační Duke criteria

„Prokázaná“ IE (n=35 ) „Možná“ IE (n=25)

Výsledky jednotlivých testů HK KT PCR + + + (n=35) + + N + + (n=9) (n=16)

+ + + + -

+ + + + -

Celkem

Počet Etiologie * pacientů S. aureus 9a 7 0 20 17 2 2 4 4 3 0 5 1 7 3 6 0 60

0 4 1 3 0 3 41

KNS 2 3 0 0 3 1 0 4b 3c 3c 19

Antibiotická léčba před operací (n=59 a) <=5 dní >5 dní Bez ATB 2 5 1 3 15 2 1 1 0 0 4 0 0 0 0 1 1 1 9

3 5 1 5 1 5 45

0 0 0 1 1 0 5

U jednoho pacienta byl při specifické PCR nalezen KNS a při kultivací z chirurgického materiálu P. acnes – oba nálezy byly interpretovány jako velmi pravděpodobná kontaminace. b Nález KNS byl u těchto pacientů posuzován vzhledem k výsledkům ostatních metod a klinickému projevu. Legenda: ATB antibiotika, HK hemokultura, KT kultivace z tkáně (chirurgického materiálu), N neprovedeno. a

5.3.4 Stanovení úlohy PCR v diagnostice IE Za účelem stanovení úlohy PCR pro diagnostiku IE bylo provedeno přehodnocení předoperačně stanovené diagnózy IE na základě kultivace a PCR z chirurgického materiálu (viz Obr. 9). Zatímco pacienti s předoperačně „prokázanou“ diagnózou IE zůstali v této skupině i po operaci, počet pacientů s „možnou“ diagnózou IE se po operaci výrazně sníţil. Byl-li brán v úvahu výsledek PCR, došlo k výraznějšímu sníţení počtu pacientů s „možnou“ diagnózou IE (25 vs. 8 p < 0.011) ve srovnání se situací, kdy byl brán v úvahu výsledek kultivace agens z chirurgického materiálu (25 vs. 16, p < 0.048). U šesti pacientů s „možnou“ předoperační diagnózou IE, kde byl nalezen KNS pouze při kultivaci nebo PCR z chirurgického materiálu, a jednoho pacienta s pozitivním nálezem S. aureus pouze v 1/14 hemokultur, nebylo bez histologického vyšetření moţné určit, zdali se jednalo o kontaminaci, přechodnou bakteriémii nebo aktivní endokarditidu. U těchto pacientů nebylo tedy moţné diagnózu IE vyloučit ani potvrdit. U jednoho pacienta s falešně pozitivním výsledkem PCR i kultivace z chirurgicky odstraněného materiálu pomohla histopatologická analýza materiálu vyloučit předoperační podezření na aktivní endokarditidu.

57


Přehodnocení Duke kritérií na základě výsledků pooperačních testů

Obrázek 9. Schéma přehodnocení Duke kritérií na základě výsledku kultivace agens a/nebo PCR z chirurgického materiálu. PCR test zahrnuje ve většině případů výsledky širokospektré a specifické PCR. Jestliže byly brány v potaz výsledky obou pooperačních testů, zůstalo 7/8 pacientů s diagnózou „možné“ IE, kterou nešlo bez histopatologické analýzy prokázat ani vyloučit. Tito pacienti měli pozitivní jen jeden z provedených testů: kultivaci z tkáně (3 případy KNS), PCR (3 případy KNS), hemokulturu (1 případ S. aureus 1/14 odběrů). 1/8 pacientů prokázal sice pozitivitu při KT i PCR (P. acnes a KNS),ale nalezená agens se neshodovala a histopatologie zde nepotvrdila diagnózu IE. Legenda: nd počet pacientů s „prokázanou“ diagnózou IE, np počet pacientů s „možnou“ diagnózou IE, nr počet pacientů s „vyloučenou“ IE.

5.3.5 Etiologie a klinické projevy IE Čtyřicet pacientů bylo po důkladné reevaluaci diagnostikováno s IE způsobenou S. aureus, jedenáct s IE způsobenou S. epidermidis a v jednom případě byla diagnostikována IE s původcem S. haemolyticus. Mortalita stafylokokové IE v našem souboru byla 31 %. Kromě významné souvislosti S. aureus s nativní IE, nebyl mezi uvedenými klinickými parametry a druhem etiologického agens prokázán ţádný statisticky významný rozdíl (viz Tab. 19). U kmenů KNS byl prokázán častější výskyt genu mecA neţ u S. aureus (8/11 vs. 0/39, p < 0.001). Fenotypové stanovení citlivosti k oxacilinu zcela korelovalo se záchytem genu mecA u kmenů S. aureus, zatímco u KNS docházelo k neshodám, kdyţ u 3 kmenů fenotypově citlivých k oxacilinu byl gen mecA zachycen.

58

Molekulárně-mikrobiologická diagnostika u pacientů s infekční endokarditidou Tabulka 19. Etiologie a demografické údaje u pacientů s „prokázanou“ diagnózou IE stafylokokového původu.

Echokardiografie Nativní IE

Aortální chlopeň

Vegetace

Absces

Embolizace

Narkomani

Úrmrtnost po 1 roce

Etiologie Stafylokoky (n=52)

35 (67 %)

28 (54 %)

41 (79 %)

4 (8 %)

23 (44 %)

7 (13 %)

13 (31 %)

a

S. aureus (n=40)

31 (78 %)

22 (55 %)

33 (83 %)

3 (8 %)

20 (50 %)

6 (15 %)

11 (34 %)

b

KNS * (n=12)

4 (33 %)

6 (50 %)

8 (67 %)

1 (8 %)

3 (25 %)

1 (8 %)

2 (20 %)

p value

0.011

1.000

0.253

1.000

0.188

1.000

0.466

V této tabulce nejsou zahrnuty údaje pacientů, kteří po operaci neprokázali jednoznačně diagnózu IE. *S. haemolyticus (1) and S. epidermidis (11). a Údaje o jednoročním sledování byly dostupné u 42/52, b u 32/40 pacientů a c u 10/12 pacientů. Ke zjištění významnosti rozdílů mezi pacienty s IE způsobenými S. aureus a KNS byl použit Fisher test o shodě dvou relativních četností s oboustranným rozdělením. Jako statisticky významný rozdíl byla stanovena hodnota p < 0.05.

59

c


6 DISKUSE IE způsobená stafylokoky je závaţná, ţivot ohroţující infekce. Včasná diagnostika a zahájení odpovídající terapie jsou klíčové pro prognózu nemocných. V současné době je diagnostika IE zaloţená na charakteru klinických příznaků, echokardiografickém nálezu a výsledcích hemokultur. I přes konzervativní antibiotickou léčbu dospěje přibliţně třetina pacientů k chirurgickému řešení (Habib et al. 2009). V Genetické laboratoři CKTCH se vyuţívá širokospektrá PCR a sekvencování pro rutinní molekulární diagnostiku patogenů z chirurgického materiálu pacientů s IE. V této práci bylo uvedeno vyuţití širokospektré PCR v klinické praxi a tato metoda byla doplněna o PCR pro specifický záchyt stafylokoků, kde v rámci jedné reakce, bez nutnosti sekvencování, rozlišíme kmeny S. aureus od KNS a stanovíme přítomnost genu rezistence k oxacilinu, nejčastěji pouţívanému protistafylokokovému antibiotiku. V druhé části práce byla stanovena úloha PCR v diagnostice stafylokokové IE srovnáním výsledků PCR se standardní kultivací a klinickými projevy IE.

6.1 Vyuţití širokospektré PCR a sekvencování v diagnostické praxi Na čtyřech kazuistikách pacientů s akutním infekčním onemocněním byly demonstrovány široké moţnosti vyuţití širokospektré PCR a sekvencování pro detekci mikroorganismů v různém klinickém materiálu. Metoda poskytuje výsledek do 24h a je vhodná pro záchyt atypických patogenů, které rostou jen za speciálních podmínek nebo jsou běţnými biochemickými panely obtíţně identifikovatelné. U souboru pacientů s IE chirurgicky ošetřených na CKTCH v letech 2005-2009 prokázala širokospektrá PCR a sekvencování lepší schopnost identifikace kauzálního agens z chirurgického materiálu neţ standardní kultivace a to i u běţně kultivovatelných mikroorganismů. Přestoţe tato metoda neumoţňuje stanovit aktuální citlivost nalezeného agens k antibiotikům, lze se při léčbě řídit alespoň primární rezistencí daného druhu mikroorganismu.

6.2 Výsledky testování PCR specifické pro stafylokoky Výsledky specifické PCR se zcela shodovaly se standardní kultivací v záchytu S. aureus i KNS a neposkytovaly ţádné zkříţené reakce s jinými druhy mikroorganismů. Stanovení rezistence bylo více ovlivněno nestejnou expresí genu mecA u kmenů KNS neţ u kmenů S. aureus (viz Tab. 20).

60

Molekulárně-mikrobiologická diagnostika u pacientů s infekční endokarditidou Tabulka 20. Stanovení analytické sensitivity a specificity PCR. Sensitivita

Specificita

PPV

NPV

100 %

100 %

100 %

100 %

98 %

81 %

85 %

97 %

100 %

100 %

100 %

100 %

97 %

100 %

100 %

97 %

KNS

100 %

100 %

100 %

100 %

Rezistence k oxacilinu u KNS

100 %

55 %

75 %

100 %

Stafylokoky Rezistence k oxacilinu u stafylokoků S. aureus Rezistence k oxacilinu u S. aureus

Pozn. Do výpočtu byly zahrnuty stafylokoky v čisté i smíšené kultuře. Rezistence k oxacilinu/cefoxitinu stanovená fenotypovými testy sloužila jako standard. Legenda: PPV pozitivní prediktivní hodnota, NPV negativní prediktivní hodnota.

Ţádný z kmenů S. aureus fenotypově citlivých k oxacilinu i cefoxitinu (MSSA) neprokázal přítomnost genu mecA. U 1/32 (3 %) kmenů S. aureus fenotypově rezistentních k oxacilinu i cefoxitinu (MRSA) nebyla prokázána přítomnost genu mecA. Mohlo se jednat o tzv. hyperproducenta beta-laktamázy nebo kmen se špatnou funkcí normálního proteinu PBP. Kmen s nadprodukcí betalaktamázy by bylo moţné prokázat např. diskovým difuzním testem s betalaktamem potencovaným inhibitorem betalaktamázy (např. amoksiklav nebo augmentin) nebo průkazem genu bla Z (Jain, Agarwal a Verma 2008, Martineau et al. 2000). U 10/22 (45 %) kmenů KNS citlivých k oxacilinu byl nalezen gen mecA. Sedm z deseti těchto kmenů bylo rezistentních k oxacilinu, ale citlivých k cefoxitinu. Diskrepanci mezi disky způsobenou kultivačními podmínkami, např. vyšší hustota inokula, odlišná kvalita pouţívaných antibiotických disků (Souza Antunes et al. 2007), prodlouţená doba inkubace (Ferreira et al. 2003) nebo zvýšená koncentrace solí nebo sacharózy (Graham et al. 2000, Chambers 1997) lze v tomto případě vyloučit, neboť tyto faktory by ovlivnily oxacilinový i cefoxitinový disk stejně. Jelikoţ je cefoxitinový disk lepším induktorem rezistence k oxacilinu, předpokládáme, ţe gen mecA nebyl u těchto kmenů exprimován (Hussain et al. 2000, Ferreira et al. 2003) nebo buňky rostly pomaleji a citlivost k cefoxitinu byla odečtena příliš brzy (Prère et al. 2006). Ze stejného důvodu mohlo dojít k diskrepanci mezi genotypovým a fenotypovým projevem u dalších dvou kmenů citlivých k oxacilinu i cefoxitinu, které prokázaly přítomnost genu mecA. Jeden kmen KNS, u něhoţ byl zachycen gen mecA, vykazoval dubiózní citlivost k cefoxitinu. Pravděpodobně se jednalo o heterorezistentní kmen. Bylo prokázáno, ţe u KNS fenotypově citlivých k oxacilinu je subpopulace rezistentních buněk menší neţ u kmene S.

61


aureus. V důsledku toho je exprese rezistence k oxacilinu u KNS daleko více variabilní a proto můţe být stanovení pomocí standardního diskového testu falešně negativní (Rallapalli, Verghese a Verma 2008). Jelikoţ se hodnota MIC, resp. míra exprese genu pro rezistenci, můţe v průběhu terapie měnit, jak bylo prokázáno např. u pacientů s IE způsobenou KNS léčených teikoplaninem (Chomarat, Espinouse a Flandrois 1991), je vţdy vhodné klinika na toto riziko upozornit a rezistenci monitorovat. Podcenění přítomnosti dormantního genu rezistence by totiţ mohlo mít za následek selhání antibiotik a draţší léčbu spojenou s prodlouţenou hospitalizací. U nejednoznačných výsledků testů citlivosti je moţné rovněţ vyuţít alternativní fenotypové metody testování, např. agar-diluční test s oxacilinem (Ferreira et al. 2003), resp. tzv. MRSA Screen test pro selektivní růst a identifikaci MRSA nebo průkaz PBP-2A pomocí latexové aglutinace aj. (Jain et al. 2008). Podle doporučení NRL ATB je vhodné fenotypové testy kombinovat3. Pro lepší záchyt heterorezistentních kmenů pomocí cefoxitinového diskového testu doporučují Frigatto a kol. (2005) u KNS sníţit breakpoint cefoxitinového disku navrhovaný NCCLS, neboť většina heterorezistentních kmenů KNS ukázala zónu inhibice aţ kolem 26 mm. Evropská komise pro stanovení antibiotické citlivosti (EUCAST) navrhuje potvrdit cefoxitinový diskový test pomocí MIC s cefoxitinem ovšem pouze u S. aureus

a S. lugdunensis, neboť

u kmenů KNS

se neukázal

jako spolehlivý

(http://www.eucast.org/clinical_breakpoints/, 13.7.2011). Přestoţe některé studie pouţívají mecA jako zlatý standard pro validaci různých technik zaloţených na fenotypovém projevu rezistence (Hussain et al. 2000, Zhang et al. 2004, Prère et al. 2006, Ferreira et al. 2003), v běţných mikrobiologických laboratořích se test PCR pro průkaz mecA neprovádí. Význam stanovení genu mecA vidíme především při průkazu heterorezistentních kmenů stafylokoků a u pacientů s kultivačně negativním výsledkem. Pro účely vyuţití genotypového stanovení rezistence v praxi by však bylo nutné rozšířit spektrum genů vyuţitelných pro diagnostiku kódující rezistenci k aminoglykosidům, erytromycinu a makrolidům. V budoucnu bude proto důleţité zaměřit se na objevení vztahů mezi těmito geny a fenotypovým projevem rezistence (Martineau et al. 2000). 3

Doporučený postup pro kontrolu výskytu kmenů S. aureus rezistentních k oxacilinu a s jinou nebezpečnou

antibiotickou rezistencí v nemocničních zařízeních, Zpráva CEM (SZÚ Praha) 2006, ročník 15, příloha 1.

62


6.3 Vyuţití specifické PCR pro intranasální screening MRSA Z epidemiologických důvodů se u pacientů před kardiochirurgickým zákrokem provádí

intranasální

screening

MRSA

v

nose/rektu

(http://www.spnn.estranky.cz/clanky/dokumenty/doporucene-postupy-pro-kontrolumrsa.html, 28.6. 2011). Jelikoţ zde mohou být přítomny rovněţ kolonizující kmeny KNS rezistentní k oxacilinu, nemůţe být specifická PCR (ani v kombinaci se širokospektrou PCR) pro tyto účely pouţita bez předchozí izolace čistých kmenů MRSA, neboť tyto metody nejsou u směsných vzorků S. aureus a KNS dostatečně specifické (Becker et al. 2006). Moţnou alternativou je pouţití PCR cílené do oblasti orf-XmecA v rámci chromozomální kazety SCCmecA, který je spojen pouze s S. aureus a tudíţ případné rezistentní kmeny KNS nezachytí (Huletsky et al. 2004). Z moţných komerčně dodávaných souprav, které specificky detekují kmeny S. aureus rezistentní k oxacilinu v nosní dutině nebo v krvi jsou k dispozici: GeneOhmMRSA (BD diagnostics), Xpert MRSA (Cepheid), GenoType MRSA (Hain Life Science) nebo BacLite Rapid MRSA (Acolyte Biomedica). Tyto komerční soupravy poskytují rychlý výsledek, avšak pro svou finanční nákladnost nemají význam pro plošný screening všech pacientů, ale spíše pro rychlou konfirmaci u pacientů opětovně přijatých k hospitalizaci s MRSA v anamnéze (Floré, Van den Abeele a Verschraegen 2010).

6.4 Vyuţití specifické PCR pro detekci stafylokoků v krvi 6.4.1 Sensitivita specifické PCR v krvi U většiny pacientů se stafylokokovou endokarditidou (na rozdíl od pacientů se stafylokokovou sepsí) byla sledována velmi nízká hladina bakteriémie (1-10 CFU/ml) (Watkin et al. 2003). Zatímco mez detekce rutinně vyuţívané širokospektré PCR pro bakterie přímo z krve je přibliţně 40 CFU/ml, mez detekce MRSA v krvi pomocí specifické PCR je přibliţně 4 CFU/ml. Alternativně lze pro záchyt stafylokoků v krvi/pozitivních hemokulturách vyuţít některé z následujících diagnostických souprav. 6.4.2 Komerční soupravy pro detekci patogenů v krvi 6.4.2.1 Soupravy závislé na předchozí kultivaci patogena Tyto soupravy vyuţívají jako vstupní materiál pozitivní hemokultury. StaphPlex (Qiagen, Německo) je zaloţen na multiplexní technologii, jeţ umoţňuje rozlišit mezi 5 druhy

63


KNS, S. aureus, určit přítomnost PVL a rezistenci k oxacilinu na základě přítomnosti genu mecA a přítomnost dalších genů kódující rezistenci k antibiotikům. Kromě toho lze tímto přístupem určit typ genové kazety SCCmec, takţe lze zároveň vysledovat epidemiologii kmene. Přestoţe má vysokou pozitivní prediktivní hodnotu, jeho citlivost pro stanovení antibiotické rezistence k dalším antibiotikům se ukázala jako nedostačující (Tang et al. 2007). IsoAmp Rapid Staph Detection Kit (BioHelix) je typickou „ lab-on-chip technologií “, která vyuţívá pro detekci S. aureus z pozitivní hemokultury izotermální amplifikaci dvou specifických míst na genomu pomocí helikázy a následné hybridizace specifické sondy, jíţ je produkt reakce vizualizován na testovacím prouţku. Prove-it Sepsis (Mobidiag) je mikročipovou technologií, která umoţňuje do 3 hodin záchyt aţ 27 druhů grampozitivních a gramnegativních bakterií a genu mecA kódující rezistenci k oxacilinu u stafylokoků. Všechny tyto systémy jsou však závislé na pozitivním výsledku kultivace a tak postrádají jednu z nejdůleţitějších výhod molekulárně-biologických systémů a to je rychlý výsledek, který není ovlivněn antibiotickou léčbou. 6.4.2.2 Soupravy pro přímou detekci patogenů v krvi Pro přímou detekci a identifikaci stafylokoků a dalších bakterií molekulárně biologickými metodami z krve jsou v současnosti nejvíce nabízeny následující tři komerční soupravy: SeptiFast (Roche) a SepsiTest (Molzym), VYOO (SIRS Lab). SeptiFast

kit

(Roche)

je

určen

pro

detekci

DNA

25

nejčastějších

bakteriálních/houbových původců sepse. Cílovým místem pro PCR v reálném čase je intragenová oblast mezi geny pro 16S rRNA a 23S rRNA. Tato oblast se vyznačuje vysokou sensitivitou díky přítomnosti více kopií operonů těchto genů. SeptiFast mecA umoţňuje stanovit rezistenci k oxacilinu u vzorků s pozitivním záchytem stafylokoků. SeptiFast prokázal ve srovnání s hemokultivací dobrý záchyt nejčastějších patogenů IE – S. aureus, streptokoky a enterokoky (Greub et al. 2005, Casalta et al. 2009). Přestoţe je souprava SeptiFast rychlejší neţ běţná hemokultivace, nekultivovatelné nebo náročné mikroby způsobující IE (Tropheryma whipplei, HACEK aj.) nejsou systémem SeptiFast zachyceny (Ecker et al. 2010). Problematická je přítomnost humánní DNA, jeţ můţe obsahovat motivy komplementární k primerům specifickým pro detekci bakterií a tak můţe dojít k nespecifickému navázání a sníţení citlivosti systému (Horz et al. 2010, Casalta et al. 2009). Pilotní studie s 15 pacienty s aktivní infekční endokarditidou prokázala vyšší citlivost soupravy SeptiFast oproti standardní kutivaci agens z chirurgického materiálu (Fernández et al. 2010).

64


Komerční souprava SepsiTest (Molzym) je zaloţená na panbakteriální a panfungální detekci přímo z klinického materiálu. Souprava v rámci izolace bakteriální DNA ze vzorku odstraní i humánní DNA tzv. selektivní lyzí , kdy jsou nejdříve lyzovány humánní buňky a poté je degradována a odstaněna veškěrá humánní DNA. Po následné lyzi patogenních buněk ve vzorku zůstává jen bakteriální DNA. Současně s touto komerční soupravou je nabízen i přístup ke kontrolované databázi sekvencí omezené jen na ty mikroorgasnimy, které byly prokázány v souvislosti s medicínsky významnými mikroby způsobujícími sepse, SepsiTest BLAST (http://www.sepsitest-blast.de/en/index.html). Výhodou tohoto systému oproti SeptiFast (Roche) je moţnost detekovat kterékoli agens přítomné ve vzorku, nejen oněch 25 mikrobů spojených se sepsí (Horz et al. 2010). Komerční souprava VYOO (SIRS Lab) vyuţívá při izolaci DNA z materiálu protein, který váţe methylovanou DNA prokayot, zatímco aţ 90 % humánní DNA je odstraněno ze vzorku. Na izolaci navazuje panbakteriální PCR se zaměřením na gen pro 16S rRNA. Jedná se o multiplex PCR, která zachytí aţ 34 druhů klinicky významných bakterií, 7 druhů hub a 5 genů pro záchyt rezistence k antibiotikům. Ačkoliv je většina těchto systémů zaloţených na širokospektré detekci bakterií, můţe mít jejich vysoká citlivost na svědomí detekci kontaminující DNA bakterií z prostředí. Proto se systém neobejde bez pečlivé kontroly kontaminace v průběhu procesu a důsledné interpretace nálezu KNS.

65


6.5 Efektivita PCR pro průkaz stafylokoků v chirurgickém materiálu Celkem jsme vyšetřili materiál od 60 pacientů s IE stafylokokového původu chirurgicky ošetřených ve třech kardiochirurgických centrech. Do kontrolní skupiny bylo zařazeno 59 pacientů operovaných pro jinou kardiologickou diagnózu. Kromě širokospektré PCR byla pro záchyt stafylokoků v chirurgickém materiálu pouţita i specifická PCR. Z analýzy vyplývá, ţe obě metody PCR jsou velmi účinnými diagnostickými nástroji pro detekci DNA stafylokoků v chirurgicky odstraněném materiálu. Do osmi hodin od doručení materiálu do laboratoře bylo moţné identifikovat a rozlišit mezi S. aureus a KNS, včetně rezistence k oxacilinu pomocí detekce genu mecA. Druhová identifikace KNS nebo identifikace jakéhokoliv jiného patogena pomocí sekvencování je následně moţná do dalších 4 hodin. U pacientů s „prokázanou“ diagnózou IE a pacientů kontrolní skupiny dosáhly obě metody PCR (pozitivita byla brána v úvahu, jestliţe byl jeden z testů pozitivní) diagnostické sensitivity 89 % a specificity 95 %, PPV 92 % a NPV 94 %. Pokud by byl pozitivní výsledek brán v úvahu jen v případě současné pozitivity obou PCR testů, specificita by se zvýšila na 98 %, zatímco sensitivita by zůstala 89 %, PPV a NPV by byly 97 % a 94 %.

6.6 Srovnání PCR se standardními metodami průkazu etiologie Plná shoda výsledků hemokultur a PCR se projevila častěji u pacientů s „prokázanou“ diagnózou IE neţ u těch s „možnou“ diagnózou IE a byla významně vyšší neţ shoda hemokultivace s kultivací agens z chirurgického materiálu. Kultivace z chirurgicky ošetřeného materiálu se zcela shodovala s výsledkem hemokultury u 17/58 (29 %) pacientů, včetně 6 negativních výsledků. Nízká shoda obou kultivačních testů byla prokázána u většiny těchto pacientů pravděpodobně důsledkem předchozí antibiotické léčby. Antibiotická terapie v době odběru hemokultury/chirurgického materiálu na kultivační vyšetření je zodpovědná za přibliţně 5-31 % falešně negativních výsledků hemokultur a aţ 70 % falešně negativních výsledků kultivace z chirurgického materiálu (Watkin et al. 2003, Podglajen et al. 2003, Voldstedlund et al. 2008, Goldenberger et al. 1997, Grijalva et al. 2003). U tří z šesti kultivačně negativních případů PCR jako jediná z metod dokázala identifikovat etiologické agens (S. aureus). U jednoho pacienta, kde byly výsledky hemokultur a kultivace z tkáně falešně pozitivní, PCR pomohla určit etiologii IE jako S. haemolyticus.

66


PCR potvrdila výsledek hemokultur u 41/60 (67 %) pacientů s IE, včetně 3 negativních výsledků. U 2/41 případů pomohla PCR stanovit etiologii, v hemokultuře byly zachyceny S. aureus i KNS, zatímco PCR zachytila jen S. aureus. U jednoho pacienta s odlišným výsledkem hemokultur a PCR, kde Corynebacterium sp. zachycené v hemokulturách bylo povaţováno za kontaminaci a byl pomocí PCR zachycen S. aureus velmi pravděpodobně jako skutečné etiologické agens IE. Falešně pozitivní výsledky kultivace bývají v důsledku kontaminace při odběru nebo v průběhu zpracování pozorovány přibliţně u 14-17 % kultivací z chlopně a aţ 30 % hemokultivací, nejčastěji nalézaným agens je KNS, dále také Micrococcus luteus nebo Corynebacterium sp. (Voldstedlund et al. 2008). Výsledky kultivace a PCR z chirurgicky odstraněného materiálu se plně shodovaly jen u 19/58 (33 %) pacientů, včetně 5 negativních případů. U těchto pěti pacientů byla hemokultura jedinou metodou, která zachytila S. aureus. U jednoho z uvedených pěti pacientů s „možnou“ předoperační diagnózou IE byl S. aureus nalezen jen v 1/14 odběrů a nebylo moţné rozhodnout, zda se jedná o přechodnou bakteriémii nebo skutečnou etiologii IE. Je moţné, ţe u ostatních čtyř pacientů mohl být záchyt agens v chirurgickém materiálu zatíţen chybným pooperačním odběrem materiálu, který je problematický převáţně u pacientů s prostetickými materiály (Rovery et al. 2005, Vollmer et al. 2010, Bosshard et al. 2003). Falešně negativní výsledky pooperačních testů mohly být rovněţ způsobeny usmrcením mikroba a degradací DNA z vegetace předchozí antibiotickou léčbou, neboť samotná DNA stafylokoků (na rozdíl od bartonel nebo streptokoků) má schopnost v tělě rychle degradovat (Rovery et al. 2005). U tří pacientů s negativním výsledkem hemokultur a PCR z chirurgického materiálu byl při kultivaci chirugického materiálu vypěstován KNS a u dalších tří pacientů s negativním výsledkem hemokultur a kultivace agens z chirurgicky odstraněného materiálu nalezen KNS pomocí PCR. Interpretace výskytu kmenů KNS u pacientů s „možnou“ diagnózou IE je obtíţná, neboť je nutné odlišit kauzální kmeny od kontaminace, ke které můţe dojít při odběru, transportu nebo zpracování materiálu (Fredricks a Relman 1999). Ačkoliv se doporučuje provádět kontrolní odběry a testy sterility odběrových souprav (Greub et al. 2005, Qin a Urdahl 2001), v praxi je tento postup obtíţně aplikovatelný. Výhodou detekce stafylokoků pomocí dvou přístupů PCR (širokospektrá a specifická) s různými cílovými geny je moţnost vyloučit kontaminaci při zpracování, je-li agens zachyceno jen jednou z metod (Breitkopf et al. 2005, Moore et al. 2001). Přesto, tento přístup nebylo moţné u dvou ze tří pacientů s nálezem KNS vyuţít, neboť chirurgický materiál byl zpracován jen pomocí

67


specifické PCR. Bez výsledku histopatologické analýzy tak nebylo moţné KNS povaţovat za etiologické agens a diagnózu IE tak jednoznačně potvrdit. Při interpretaci nálezu KNS u pacientů s „možnou“ diagnózou IE lze vycházet z toho, ţe biofilm-pozitivní kmeny (přítomnost ica operonu) se současným průkazem genu mecA jsou významně častěji nalézány u kmenů způsobujících bakteriémie, neţ je tomu u kontaminujících kmenů (Piette a Verschraegen 2009, Ruhe et al. 2004). Další moţností je určit původ kmene na základě shodného/rozdílného antibiogramu. Tento přístup je však pouze orientační a má svá omezení je-li pacient vyšetřen na různých mikrobiologických pracovištích. Antibiogram jednoho kmene se totiţ můţe v závislosti na způsobu a podmínkách kultivace mezi laboratořemi lišit a interpretace nálezu takových kmenů je proto retrospektivně problematická (viz dále). Alternativně lze pro účely rozlišení mezi patogenními a kontaminujícími kmeny KNS pouţít nástroje molekulární epidemiologie, např. pulzní gelovou elektroforézu (PFGE) (Dobbins et al. 2002).

6.7 Etiologie IE v našem souboru U 52/60 pacientů byla stanovena diagnóza stafylokokové IE. S. aureus byl jako etiologické agens nalezen ve 40 případech (70 %). U pacientů s IE způsobenou KNS byl nejčastěji nalezen S. epidermidis. Gen mecA nebyl zachycen u ţádného kmene S. aureus, ale u 72 % kmenů KNS. Tři kmeny KNS, u nichţ byl zachycen gen mecA byly fenotypově citlivé k oxacilinu. Mohlo se jednat o záchyt genu, který se fenotypově neprojevil. Srovnání záchytu genu mecA a fenotypového projevu je však u pacientů s IE problematické, neboť pacienti jsou často v závislosti na klinických projevech onemocnění vyšetřeni v několika nemocničních, resp. mikrobiologických zařízeních. Stanovení citlivosti k antibiotikům je závislé na standardním operačním postupu dané labratoře, přípravě půd pro testování antibiotik, hustotě inokula, kvalitě antibiotických disků, příp. kontaminaci a nakonec i na zkušenostech odečítajícího mikrobiologa. Retrospektivně lze proto obtíţně srovnávat fenotypový projev rezistence kmene vypěstovaného v hemokulturách v různých mikrobiologických laboratořích v průběhu hospitalizace pacienta v různých nemocničních zařízeních s průkazem genu mecA u kmene nalezeného v chirurgickém materiálu pacienta.

68


6.8 Role PCR v diagnostice IE V této práci jsem prokázala význam PCR v diagnostice IE, především u pacientů s „možnou“ diagnózou IE. Přestoţe je kultivace z chirurgického materiálu součástí patologických Duke kritérií, u ţádného z pacientů, kde byla provedena PCR, jsme neprokázali přínos kultivace ke zvýšení diagnostické síly Duke kritérií. Na základě této skutečnosti prokázané u pacientů s tak dobře rostoucím agens jako jsou stafylokoky, lze předpokládat, ţe o to více bude tento přínos zřejmý pro detekci obtíţně kultivovatelných mikroorganismů (Fournier et al. 2010). Faktem však zůstává, ţe PCR umoţňuje záchyt DNA ţivých i mrtvých mikrobiálních buněk. Výsledkem PCR zaměřené na detekci bakteriální DNA se tak nelze spolehlivě řídit při stanovení aktivity onemocnění či monitorování úspěšnosti léčby infekce. Proto by měla být PCR prováděna vţdy současně s histopatologickou analýzou chirurgického materiálu (Rovery et al. 2005). Jako alternativu histopatologického průkazu lze vyuţít molekulární metody zaloţené na detekci mRNA, jeţ je přítomna jen u ţivotaschopných buněk (Keer a Birch 2003). Další moţností je vyuţití interkalačních fluorescenčních barviv, jako ethydium monoazid (EMA) nebo propidium monoazid (PMA), které pronikají jen do mrtvých buněk s poškozenou buněčnou stěnou a po fotoaktivaci se kovalentně váţí na dvoušroubovici DNA. Zabraňuje se tak oddálení řetězců při teplotní denaturaci a tudíţ i syntéze komplementárního řetězce během PCR. Následná amplifikace pomocí PCR tak proběhne jen u DNA ţivých buněk (Nocker, Cheung a Camper 2006).

6.9 Klinické projevy IE způsobené stafylokoky V souboru bylo zastoupeno 40 (77 %) pacientů s IE způsobenou S. aureus. Třetina pacientů v důsledku stafylokokové endokarditidy i přes chirurgickou a antibiotickou léčbu do roka od operace zemřela. Klinické projevy a důleţité charakteristiky u pacientů s IE způsobené S. aureus a KNS se výrazně nelišily, coţ zdůrazňuje rostoucí význam KNS jako etiologického agens IE. Tyto závěry však mohou být zkresleny poměrně malým statistickým souborem a také tím, ţe všichni pacienti zahrnutí do vyšetřovaného souboru byli ze specializovaných kardiochirurgických center s vyšším zastoupením pacientů s dalšími, závaţnějšími diagnózami, komorbiditami nebo nozokomiálními infekcemi.

69


6.10 International Collaboration on Endocarditis (ICE) Vzhledem k relativně nízké incidenci IE v populaci je poměrně obtíţné provádět statisticky validní analýzy klinických dat u pacientů s IE. Pro účely získání rozsáhlé databáze prospektivně sbíraných klinických dat byla zaloţena mezinárodní pracovní skupina pro výzkum IE (ICE), která sdruţuje odborníky ze 70 výzkumných a klinických institucí 30 zemí. Cílem spolupráce je získat vhled do epidemiologie a kliniky IE. Výstupy ze statistických analýz pak umoţní lépe přizpůsobit terapeutické a diagnostické postupy IE s cílem sníţit úmrtnost tohoto onemocnění. Od roku 2009 se CKTCH společně s I. interní kardiologickou klinikou a Mikrobiologickým ústavem Fakultní nemocnice u svaté Anny a Interní klinikou a Oddělením klinické mikrobiologie Fakultní nemocnice v Brně podílí na několika projektech mezinárodní skupiny ICE.

70


7 ZÁVĚR V první části disertační práce jsem provedla návrh specifických genetických markerů pro detekci S. aureus, KNS a rezistence k betalaktamům pro analýzu v jedné reakci. V rámci optimalizace s klinickými a sbírkovými kmeny různých mikroorganismů byla stanovena analytická specificita a sensitivita nové metody PCR pro identifikaci S. aureus nebo KNS a stanovení citlivosti k oxacilinu. Výsledky specifické PCR pro stafylokoky neukázaly ţádnou zkříţenou reaktivitu s jiným druhem mikroorganismu. Záchyt genu mecA koreloval s fenotypovým projevem rezistence k oxacilinu a cefoxitinu u 97 % kmenů S. aureus a 55 % kmenů KNS. PCR (detekci genu mecA) tak nelze k průkazu rezistence především u KNS vţdy spolehlivě vyuţít a je nutné se řídit především fenotypovým projevem. U kultivačně negativních pacientů můţe být však PCR vhodnou metodou detekce agens a orientačního stanovení rezistence. V druhé části práce byly výsledky specifické PCR společně s širokospektrou PCR a sekvencováním, které se v laboratoři školitele pouţívá pro rutinní diagnostiku, srovnány s výsledky standardní kultivace u pacientů se stafylokokovou IE. Metoda je vysoce citlivá pro detekci agens ze srdečních vegetací. V případě, ţe byl povaţován za pozitivní výsledek pozitivní záchyt v kterékoli z obou metod PCR, byla klinická sensitivita PCR 89 % a specificita 95 %. Pro zvýšení specificity PCR testování doporučuji hodnotit výsledky obou metod PCR jako pozitivní pouze v případě pozitivního záchytu pomocí obou metod. Výsledek hemokultivace se shodoval s PCR u 72 % případů, zatímco s kultivací z chirurgického materiálu se výsledek hemokultury shodoval jen u 31 % případů. U většiny pacientů zahrnutých do tohoto souboru byl zjištěn falešně negativní výsledek kultivace z chirurgického materiálu v důsledku antibiotické léčby. Výsledky PCR byly interpretovány u kaţdého pacienta v kontextu s výsledky ostatních standardních diagnostických testů a klinickými projevy IE. PCR prokázala větší diagnostickou sílu neţ kultivace z chirurgického materiálu, především u pacientů s „možnou“ diagnózou IE před operací. U sedmi pacientů nebylo moţné diagnózu aktivní IE potvrdit ani vyloučit bez výsledků histopatologické analýzy chirurgicky odstraněného materiálu. Naše výsledky ukázaly, ţe rutinní pouţití PCR pro diagnostiku IE není uţitečné jen pro kultivačně negativní případy, ale také pro nesouhlasné výsledky kultivace z chirurgického materiálu a hemokultivace, dále u pacientů, kde je hemokultura pozitivní jen jednou nebo jsou-li v sérii hemokultur kmeny KNS s dvěma odlišnými antibiogramy. PCR lze rovněţ pouţít v

71


případech, kdy výměna chlopně u pacienta po kardiochirurgickém zákroku pro neinfekční příčinu prokáţe pozitivní histopatologický nález. V souboru bylo zastoupeno 40 pacientů s IE způsobenou S. aureus a 12 pacientů s IE způsobenou KNS. Třetina pacientů zahrnutých do souboru i přes chirurgickou a antibiotickou léčbu do roka od operace zemřela. Ve srovnání s jinými zeměmi byla IE způsobená MRSA u pacientů z center zahrnutých do studie vzácná. Výsledky této práce ukazují, ţe širokospektrá a specifická PCR jsou velmi účinnými diagnostickými nástroji pro detekci DNA stafylokoků z chirurgicky odstraněného materiálu pacientů s IE. PCR je vhodná pro potvrzení předoperační diagnózy zaloţené na echokardiografii a kultivaci patogena z krve. Do osmi hodin od doručení materiálu do laboratoře je moţné identifikovat a rozlišit mezi S. aureus a KNS, včetně rezistence k oxacilinu pomocí detekce genu mecA. Druhová identifikace KNS nebo jiného (i obtíţně kultivovatelného) patogena pomocí sekvencování je moţná do dalších 4 hodin. Vzhledem ke zvyšující se incidenci IE a suboptimální senzitivitě a specificitě standardních kultivačních metod u pacientů pod antibiotickou léčbou doporučuji PCR zahrnout do diagnostických Duke kritérií.

72


8 LITERATURA Baddley, J. W., D. K. Benjamin, M. Patel, J. Miró, E. Athan, B. Barsic, E. Bouza, L. Clara, T. Elliott, Z. Kanafani, J. Klein, S. Lerakis, D. Levine, D. Spelman, E. Rubinstein, P. Tornos, A. J. Morris, P. Pappas, V. G. Fowler, V. H. Chu, C. Cabell & I. C. o. E.-P. C. S. G. (ICE-PCS) (2008) Candida infective endocarditis. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 27, 519-29. Baddour, L. M., W. R. Wilson, A. S. Bayer, V. G. Fowler, A. F. Bolger, M. E. Levison, P. Ferrieri, M. A. Gerber, L. Y. Tani, M. H. Gewitz, D. C. Tong, J. M. Steckelberg, R. S. Baltimore, S. T. Shulman, J. C. Burns, D. A. Falace, J. W. Newburger, T. J. Pallasch, M. Takahashi, K. A. Taubert, E. d. Committee on Rheumatic Fever, and Kawasaki Disease, C. o. C. D. i. t. Young, S. r. Councils on Clinical Cardiology, and Cardiovascular Surgery and Anesthesia, A. H. Association & I. D. S. o. America (2005) Infective endocarditis: diagnosis, antimicrobial therapy, and management of complications: a statement for healthcare professionals from the Committee on Rheumatic Fever, Endocarditis, and Kawasaki Disease, Council on Cardiovascular Disease in the Young, and the Councils on Clinical Cardiology, Stroke, and Cardiovascular Surgery and Anesthesia, American Heart Association: endorsed by the Infectious Diseases Society of America. Circulation, 111, e394-434. Becker, K., I. Pagnier, B. Schuhen, F. Wenzelburger, A. W. Friedrich, F. Kipp, G. Peters & C. von Eiff (2006) Does nasal cocolonization by methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci and methicillin-susceptible Staphylococcus aureus strains occur frequently enough to represent a risk of false-positive methicillin-resistant S. aureus determinations by molecular methods? J Clin Microbiol, 44, 229-31. Beneš, J. (2010) Mění se incidence infekčníá endokarditidy? Interv Akut Kardiol, 9, 231-232. Beneš, J., M. Kabelková, O. Dţupová, V. Vacek, M. Helcl, O. Myslivec, R. Feuereisl & V. Vondráček (2000) Infekční endokarditida - pacienti hospitalizovaní na Infekční klinice Fakultní nemocnice Bulovka v letech 1990-1999. Cor Vasa, 42, 389-396. Beneš, J., A. Mokráček & P. Gregor (2007) Infekční endokarditida. Doporučené postupy diagnostiky, léčby, dispenzarizace a profylaxe. Cor Vasa, 49, 157-171. Bosshard, P. P., A. Kronenberg, R. Zbinden, C. Ruef, E. C. Böttger & M. Altwegg (2003) Etiologic diagnosis of infective endocarditis by broad-range polymerase chain reaction: a 3-year experience. Clin Infect Dis, 37, 167-72. Breitkopf, C., D. Hammel, H. H. Scheld, G. Peters & K. Becker (2005) Impact of a molecular approach to improve the microbiological diagnosis of infective heart valve endocarditis. Circulation, 111, 1415-21. Brook, I. (2008) Infective endocarditis caused by anaerobic bacteria. Arch Cardiovasc Dis, 101, 665-76. Brouqui, P. & D. Raoult (2001) Endocarditis due to rare and fastidious bacteria. Clin Microbiol Rev, 14, 177-207. Casalta, J. P., F. Gouriet, V. Roux, F. Thuny, G. Habib & D. Raoult (2009) Evaluation of the LightCycler SeptiFast test in the rapid etiologic diagnostic of infectious endocarditis. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 28, 569-73. Chambers, H. F. (1997) Methicillin resistance in staphylococci: molecular and biochemical basis and clinical implications. Clin Microbiol Rev, 10, 781-91. Chomarat, M., D. Espinouse & J. P. Flandrois (1991) Coagulase-negative staphylococci emerging during teicoplanin therapy and problems in the determination of their sensitivity. J Antimicrob Chemother, 27, 475-80.

73


Christy, N. P., B. M. Christy & B. G. Wood (1971) Gustav Mahler and his illnesses. Trans Am Clin Climatol Assoc, 82, 200-217. Chu, V. H. (2008) Coagulase-negative staphylococci and endocarditis: reappraisal in the 21st century. Enferm Infecc Microbiol Clin, 26, 261-2. Chu, V. H., C. H. Cabell, D. K. Benjamin, E. F. Kuniholm, V. G. Fowler, J. Engemann, D. J. Sexton, G. R. Corey & A. Wang (2004) Early predictors of in-hospital death in infective endocarditis. Circulation, 109, 1745-9. Chu, V. H., J. M. Miro, B. Hoen, C. H. Cabell, P. A. Pappas, P. Jones, M. E. Stryjewski, I. Anguera, S. Braun, P. Muñoz, P. Commerford, P. Tornos, J. Francis, M. Oyonarte, C. Selton-Suty, A. J. Morris, G. Habib, B. Almirante, D. J. Sexton, G. R. Corey, V. G. Fowler & I. C. o. E.-P. C. S. Group (2009) Coagulase-negative staphylococcal prosthetic valve endocarditis--a contemporary update based on the International Collaboration on Endocarditis: prospective cohort study. Heart, 95, 570-6. Chu, V. H., C. W. Woods, J. M. Miro, B. Hoen, C. H. Cabell, P. A. Pappas, J. Federspiel, E. Athan, M. E. Stryjewski, F. Nacinovich, F. Marco, D. P. Levine, T. S. Elliott, C. Q. Fortes, P. Tornos, D. L. Gordon, R. Utili, F. Delahaye, G. R. Corey, V. G. Fowler & I. C. o. E.-P. C. S. Group (2008) Emergence of coagulase-negative staphylococci as a cause of native valve endocarditis. Clin Infect Dis, 46, 232-42. Coffey, T. J., C. G. Dowson, M. Daniels & B. G. Spratt (1995) Genetics and molecular biology of beta-lactam-resistant pneumococci. Microb Drug Resist, 1, 29-34. Corredoira, J., M. P. Alonso, A. Coira, E. Casariego, C. Arias, D. Alonso, J. Pita, A. Rodriguez, M. J. López & J. Varela (2008) Characteristics of Streptococcus bovis endocarditis and its differences with Streptococcus viridans endocarditis. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 27, 285-91. Dobbins, B. M., P. Kite, A. Kindon, M. J. McMahon & M. H. Wilcox (2002) DNA fingerprinting analysis of coagulase negative staphylococci implicated in catheter related bloodstream infections. J Clin Pathol, 55, 824-8. Drancourt, M., C. Bollet, A. Carlioz, R. Martelin, J. P. Gayral & D. Raoult (2000) 16S ribosomal DNA sequence analysis of a large collection of environmental and clinical unidentifiable bacterial isolates. J Clin Microbiol, 38, 3623-30. Durack, D. T., A. S. Lukes & D. K. Bright (1994) New criteria for diagnosis of infective endocarditis: utilization of specific echocardiographic findings. Duke Endocarditis Service. Am J Med, 96, 200-9. Ecker, D. J., R. Sampath, H. Li, C. Massire, H. E. Matthews, D. Toleno, T. A. Hall, L. B. Blyn, M. W. Eshoo, R. Ranken, S. A. Hofstadler & Y. W. Tang (2010) New technology for rapid molecular diagnosis of bloodstream infections. Expert Rev Mol Diagn, 10, 399-415. Escher, R., S. Roth, S. Droz, K. Egli, M. Altwegg & M. G. Täuber (2010) Endocarditis due to Tropheryma whipplei: rapid detection, limited genetic diversity, and long-term clinical outcome in a local experience. Clin Microbiol Infect, 16, 1213-22. Fernandez Guerrero, M., J. Gonzalez Lopez, A. Goyenechea, J. Fraile & M. de Gorgolas (2009) Endocarditis Caused by Staphylococcus aureus A Reappraisal of the Epidemiologic, Clinical, and Pathologic Manifestations With Analysis of Factors Determining Outcome. Medicine, 1-22. Fernández, A. L., E. Varela, L. Martínez, A. Martínez, J. Sierra, J. R. González-Juanatey & B. Regueiro (2010) Evaluation of a multiplex real-time PCR assay for detecting pathogens in cardiac valve tissue in patients with endocarditis. Rev Esp Cardiol, 63, 1205-8.

74


Ferreira, R. B., N. L. Iorio, K. L. Malvar, A. P. Nunes, L. S. Fonseca, C. C. Bastos & K. R. Santos (2003) Coagulase-negative staphylococci: comparison of phenotypic and genotypic oxacillin susceptibility tests and evaluation of the agar screening test by using different concentrations of oxacillin. J Clin Microbiol, 41, 3609-14. Fitzgerald, J. R., A. Loughman, F. Keane, M. Brennan, M. Knobel, J. Higgins, L. Visai, P. Speziale, D. Cox & T. J. Foster (2006) Fibronectin-binding proteins of Staphylococcus aureus mediate activation of human platelets via fibrinogen and fibronectin bridges to integrin GPIIb/IIIa and IgG binding to the FcgammaRIIa receptor. Mol Microbiol, 59, 212-30. Fitzsimmons, K., A. I. Bamber & H. B. Smalley (2010) Infective endocarditis: changing aetiology of disease. Br J Biomed Sci, 67, 35-41. Floré, K., A. M. Van den Abeele & G. Verschraegen (2010) Speed of molecular detection techniques for methicillin-resistant Staphylococcus aureus admission screening in an acute care hospital. J Hosp Infect, 75, 103-6. Fournier, P., F. Thuny, D. Grisoli, H. Lepidi, J. Vitte, J. Casalta, P. Weiller, G. Habib & D. Raoult (2011) A deadly aversion to pork. Lancet, 1542-1542. Fournier, P. E., F. Thuny, H. Richet, H. Lepidi, J. P. Casalta, J. P. Arzouni, M. Maurin, M. Célard, J. L. Mainardi, T. Caus, F. Collart, G. Habib & D. Raoult (2010) Comprehensive diagnostic strategy for blood culture-negative endocarditis: a prospective study of 819 new cases. Clin Infect Dis, 51, 131-40. Fowler, V. G., J. M. Miro, B. Hoen, C. H. Cabell, E. Abrutyn, E. Rubinstein, G. R. Corey, D. Spelman, S. F. Bradley, B. Barsic, P. A. Pappas, K. J. Anstrom, D. Wray, C. Q. Fortes, I. Anguera, E. Athan, P. Jones, J. T. van der Meer, T. S. Elliott, D. P. Levine, A. S. Bayer & I. Investigators (2005) Staphylococcus aureus endocarditis: a consequence of medical progress. JAMA, 293, 3012-21. Fredricks, D. & D. Relman (1999) Application of polymerase chain reaction to the diagnosis of infectious diseases. Clinical Infectious Diseases, 475-486. Free, L. & D. Sahm (1995) Investigation of the reformulated remel synergy quad plate for detection of high-level aminoglycoside and vancomycin resistance among enterococci. Journal of Clinical Microbiology, 1643-1645. Garau, J., E. Bouza, J. Chastre, F. Gudiol & S. Harbarth (2009) Management of methicillinresistant Staphylococcus aureus infections. Clin Microbiol Infect, 15, 125-36. Goldenberger, D., A. Künzli, P. Vogt, R. Zbinden & M. Altwegg (1997) Molecular diagnosis of bacterial endocarditis by broad-range PCR amplification and direct sequencing. J Clin Microbiol, 35, 2733-9. Graham, J. C., O. M. Murphy, D. Stewart, A. M. Kearns, A. Galloway & R. Freeman (2000) Comparison of PCR detection of mecA with methicillin and oxacillin disc susceptibility testing in coagulase-negative staphylococci. J Antimicrob Chemother, 45, 111-3. Greub, G., H. Lepidi, C. Rovery, J. Casalta, G. Habib, F. Collard, P. Fournier & D. Raoult (2005) Diagnosis of infectious endocarditis in patients undergoing valve surgery. American Journal of Medicine, 230-238. Grijalva, M., R. Horváth, M. Dendis, J. Erný & J. Benedík (2003) Molecular diagnosis of culture negative infective endocarditis: clinical validation in a group of surgically treated patients. Heart, 89, 263-8. Habib, G., B. Hoen, P. Tornos, F. Thuny, B. Prendergast, I. Vilacosta, P. Moreillon, M. de Jesus Antunes, U. Thilen, J. Lekakis, M. Lengyel, L. Müller, C. K. Naber, P. Nihoyannopoulos, A. Moritz, J. L. Zamorano & E. C. f. P. Guidelines (2009) Guidelines on the prevention, diagnosis, and treatment of infective endocarditis (new

75


version 2009): the Task Force on the Prevention, Diagnosis, and Treatment of Infective Endocarditis of the European Society of Cardiology (ESC). Endorsed by the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ESCMID) and the International Society of Chemotherapy (ISC) for Infection and Cancer. Eur Heart J, 30, 2369-413. Harris, K. A. & J. C. Hartley (2003) Development of broad-range 16S rDNA PCR for use in the routine diagnostic clinical microbiology service. J Med Microbiol, 52, 685-91. Hill, E. E., P. Herijgers, M. C. Herregods & W. E. Peetermans (2006) Evolving trends in infective endocarditis. Clin Microbiol Infect, 12, 5-12. Hill, E. E., W. E. Peetermans, S. Vanderschueren, P. Claus, M. C. Herregods & P. Herijgers (2008) Methicillin-resistant versus methicillin-sensitive Staphylococcus aureus infective endocarditis. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 27, 445-50. Hoen, B., C. Chirouze, C. H. Cabell, C. Selton-Suty, F. Duchêne, L. Olaison, J. M. Miro, G. Habib, E. Abrutyn, S. Eykyn, Y. Bernard, F. Marco, G. R. Corey & I. C. o. E. S. Group (2005) Emergence of endocarditis due to group D streptococci: findings derived from the merged database of the International Collaboration on Endocarditis. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 24, 12-6. Horz, H. P., S. Scheer, M. E. Vianna & G. Conrads (2010) New methods for selective isolation of bacterial DNA from human clinical specimens. Anaerobe, 16, 47-53. Huebner, J. & D. A. Goldmann (1999) Coagulase-negative staphylococci: role as pathogens. Annu Rev Med, 50, 223-36. Huletsky, A., R. Giroux, V. Rossbach, M. Gagnon, M. Vaillancourt, M. Bernier, F. Gagnon, K. Truchon, M. Bastien, F. J. Picard, A. van Belkum, M. Ouellette, P. H. Roy & M. G. Bergeron (2004) New real-time PCR assay for rapid detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus directly from specimens containing a mixture of staphylococci. J Clin Microbiol, 42, 1875-84. Hussain, Z., L. Stoakes, V. Massey, D. Diagre, V. Fitzgerald, S. El Sayed & R. Lannigan (2000) Correlation of oxacillin MIC with mecA gene carriage in coagulase-negative staphylococci. J Clin Microbiol, 38, 752-4. Jain, A., A. Agarwal & R. Verma (2008) Cefoxitin disc diffusion test for detection of meticillin-resistant staphylococci. Journal of Medical Microbiology, 957-961. Jonas, D., M. Speck, F. D. Daschner & H. Grundmann (2002) Rapid PCR-based identification of methicillin-resistant Staphylococcus aureus from screening swabs. J Clin Microbiol, 40, 1821-3. Kalokhe, A. S., N. Rouphael, M. F. El Chami, K. A. Workowski, G. Ganesh & J. T. Jacob (2010) Aspergillus endocarditis: a review of the literature. Int J Infect Dis, 14, e10407. Keer, J. T. & L. Birch (2003) Molecular methods for the assessment of bacterial viability. J Microbiol Methods, 53, 175-83. Kobayashi, Y., M. Kizaki, Y. Kawakami, H. Uchida & Y. Ikeda (1994) Assessment of the ED-PCR method for detection of the mecA gene of Staphylococcus aureus. Journal of Hospital Infection, 71-73. Kuo, C. B., J. C. Lin, M. Y. Peng, N. C. Wang & F. Y. Chang (2007) Endocarditis: impact of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in hemodialysis patients and communityacquired infection. J Microbiol Immunol Infect, 40, 317-24. Lagier, J. C., L. Letranchant, C. Selton-Suty, J. Nloga, N. Aissa, C. Alauzet, J. P. Carteaux, T. May & T. Doco-Lecompte (2008) [Staphylococcus aureus bacteremia and endocarditis]. Ann Cardiol Angeiol (Paris), 57, 71-7.

76


Lang, S., R. Watkin, P. Lambert, R. Bonser, W. Littler & T. Elliott (2004) Evaluation of PCR in the molecular diagnosis of endocarditis. Journal of Infection, 269-275. Lefort, A., O. Lortholary, P. Casassus, C. Selton-Suty, L. Guillevin, J. L. Mainardi & b.-H. S. I. E. S. Group (2002) Comparison between adult endocarditis due to beta-hemolytic streptococci (serogroups A, B, C, and G) and Streptococcus milleri: a multicenter study in France. Arch Intern Med, 162, 2450-6. Li, J., D. Sexton, N. Mick, R. Nettles, V. Fowler, T. Ryan, T. Bashore & G. Corey (2000) Proposed modifications to the Duke criteria for the diagnosis of infective endocarditis. Clinical Infectious Diseases, 633-638. Lin, C. H. & R. B. Hsu (2007) Infective endocarditis caused by nutritionally variant streptococci. Am J Med Sci, 334, 235-9. Mahesh, B., G. Angelini, M. Caputo, X. Y. Jin & A. Bryan (2005) Prosthetic valve endocarditis. Ann Thorac Surg, 80, 1151-8. Marin, M., P. Munoz, M. Sanchez, M. del Rosal, L. Alcala, M. Rodriguez-Creixems, E. Bouza & G. Grp (2006) Molecular diagnosis of infective endocarditis by real-time broad-range polymerase chain reaction (PCR) and Sequencing directly from heart valve tissue. Medicine, 195-202. Martineau, F., F. Picard, N. Lansac, C. Menard, P. Roy, M. Ouellette & M. Bergeron (2000) Correlation between the resistance genotype determined by multiplex PCR assays and the antibiotic susceptibility patterns of Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 231-238. Mason, W. J., J. S. Blevins, K. Beenken, N. Wibowo, N. Ojha & M. S. Smeltzer (2001) Multiplex PCR protocol for the diagnosis of staphylococcal infection. J Clin Microbiol, 39, 3332-8. Melter, O. (2008) Staphylococcus aureus rezistentní k meticilinu (OR-SA) – obávaný původce infekcí u lidí a zvířat. Klin mikrobiol infek lék, 5, 178-185. Miro, J. M., I. Anguera, C. H. Cabell, A. Y. Chen, J. A. Stafford, G. R. Corey, L. Olaison, S. Eykyn, B. Hoen, E. Abrutyn, D. Raoult, A. Bayer, V. G. Fowler & I. C. o. E. M. D. S. Group (2005) Staphylococcus aureus native valve infective endocarditis: report of 566 episodes from the International Collaboration on Endocarditis Merged Database. Clin Infect Dis, 41, 507-14. Mollet, C., M. Drancourt & D. Raoult (1997) rpoB sequence analysis as a novel basis for bacterial identification. Molecular Microbiology, 1005-1011. Moore, J., B. Millar, X. Yongmin, N. Woodford, S. Vincent, C. Goldsmith, R. McClurg, M. Crowe, R. Hone & P. Murphy (2001) A rapid molecular assay for the detection of antibiotic resistance determinants in causal agents of infective endocarditis. Journal of Applied Microbiology, 719-726. Mullis, K. B. (1990) Target amplification for DNA analysis by the polymerase chain reaction. Ann Biol Clin (Paris), 48, 579-82. Murdoch, D. R., G. R. Corey, B. Hoen, J. M. Miró, V. G. Fowler, A. S. Bayer, A. W. Karchmer, L. Olaison, P. A. Pappas, P. Moreillon, S. T. Chambers, V. H. Chu, V. Falcó, D. J. Holland, P. Jones, J. L. Klein, N. J. Raymond, K. M. Read, M. F. Tripodi, R. Utili, A. Wang, C. W. Woods, C. H. Cabell & I. C. o. E.-P. C. S. I.-P. Investigators (2009) Clinical presentation, etiology, and outcome of infective endocarditis in the 21st century: the International Collaboration on Endocarditis-Prospective Cohort Study. Arch Intern Med, 169, 463-73. Murray, P. R., E. J. Baron, J. H. Jorgensen, M. A. Pfaller & R. H. Yolken. 2003. Mannual of Clinical MIcrobiology. Washington DC: ASM Press.

77


Murray, R. J. (2005) Staphylococcus aureus infective endocarditis: diagnosis and management guidelines. Intern Med J, 35 Suppl 2, S25-44. Naber, C. K., T. Bartel, H. Eggebrecht & R. Erbel (2001) [Diagnosis of endocarditis today: Duke criteria or clinical judgment?]. Herz, 26, 379-90. Nataloni, M., M. Pergolini, G. Rescigno & R. Mocchegiani (2010) Prosthetic valve endocarditis. J Cardiovasc Med (Hagerstown), 11, 869-83. Neut, D., H. C. van der Mei, S. K. Bulstra & H. J. Busscher (2007) The role of small-colony variants in failure to diagnose and treat biofilm infections in orthopedics. Acta Orthop, 78, 299-308. Nocker, A., C. Y. Cheung & A. K. Camper (2006) Comparison of propidium monoazide with ethidium monoazide for differentiation of live vs. dead bacteria by selective removal of DNA from dead cells. J Microbiol Methods, 67, 310-20. Osler, W. (1885) The Gulstonian Lectures, on Malignant Endocarditis. Br Med J, 1, 577-9. Pada, S., D. C. Lye, Y. S. Leo & T. Barkham (2009) Utility of 16S ribosomal DNA sequencing in the diagnosis of Staphylococcus lugdunensis native valve infective endocarditis: case report and literature review. Int J Infect Dis, 13, e511-3. Pazdernik, M., L. M. Baddour & R. Pelouch (2009) Infective endocarditis in the Czech Republic: eight years of experience at one of the country's largest medical centers. J Heart Valve Dis, 18, 395-400. Petti, C. A., K. E. Simmon, J. M. Miro, B. Hoen, F. Marco, V. H. Chu, E. Athan, S. Bukovski, E. Bouza, S. Bradley, V. G. Fowler, E. Giannitsioti, D. Gordon, P. Reinbott, T. Korman, S. Lang, C. Garcia-de-la-Maria, A. Raglio, A. J. Morris, P. Plesiat, S. Ryan, T. Doco-Lecompte, F. Tripodi, R. Utili, D. Wray, J. J. Federspiel, K. Boisson, L. B. Reller, D. R. Murdoch, C. W. Woods & I. C. o. E.-M. Investigators (2008) Genotypic diversity of coagulase-negative staphylococci causing endocarditis: a global perspective. J Clin Microbiol, 46, 1780-4. Piette, A. & G. Verschraegen (2009) Role of coagulase-negative staphylococci in human disease. Vet Microbiol, 134, 45-54. Piper, C., R. Körfer & D. Horstkotte (2001) Prosthetic valve endocarditis. Heart, 85, 590-3. Podglajen, I., F. Bellery, C. Poyart, P. Coudol, A. Buu-Hoï, P. Bruneval & J. L. Mainardi (2003) Comparative molecular and microbiologic diagnosis of bacterial endocarditis. Emerg Infect Dis, 9, 1543-7. Pol, J., J. Černý, J. Ondrášek, B. Ţaloudíková, D. Vršanský, T. Freiberger & P. Němec (2010) Diagnostika a výsledky chirurgické léčby infekční endokarditidy. Cor Vasa, 52, 340346. Poyart, C., G. Quesne, C. Boumaila & P. Trieu-Cuot (2001) Rapid and accurate species-level identification of coagulase-negative staphylococci by using the sodA gene as a target. J Clin Microbiol, 39, 4296-301. Prendergast, B. D. (2006) The changing face of infective endocarditis. Heart, 92, 879-85. Prère, M. F., O. Baron, S. Cohen Bacrie & O. Fayet (2006) Genotype MRSA, a new genetic test for the rapid identification of staphylococci and detection of mecA gene. Pathol Biol (Paris), 54, 502-5. Qin, X. & K. Urdahl (2001) PCR and sequencing of independent genetic targets for the diagnosis of culture negative bacterial endocarditis. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 145-149. Que, Y. A., J. A. Haefliger, L. Piroth, P. François, E. Widmer, J. M. Entenza, B. Sinha, M. Herrmann, P. Francioli, P. Vaudaux & P. Moreillon (2005) Fibrinogen and fibronectin binding cooperate for valve infection and invasion in Staphylococcus aureus experimental endocarditis. J Exp Med, 201, 1627-35.

78


Rallapalli, S., S. Verghese & R. S. Verma (2008) Validation of multiplex PCR strategy for simultaneous detection and identification of methicillin resistant Staphylococcus aureus. Indian J Med Microbiol, 26, 361-4. Rasmussen, R. V., U. Snygg-Martin, L. Olaison, R. Andersson, K. Buchholtz, C. T. Larsen, T. F. Hansen, L. Køber, C. Hassager & N. E. Bruun (2009) One-year mortality in coagulase-negative Staphylococcus and Staphylococcus aureus infective endocarditis. Scand J Infect Dis, 41, 456-61. Rovery, C., G. Greub, H. Lepidi, J. P. Casalta, G. Habib, F. Collart & D. Raoult (2005) PCR detection of bacteria on cardiac valves of patients with treated bacterial endocarditis. J Clin Microbiol, 43, 163-7. Ruhe, J., A. Menon, D. Mushatt, P. Dejace & R. Hasbun (2004) Non- epidermidis coagulasenegative staphylococcal bacteremia: clinical predictors of true bacteremia. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 23, 495-8. Seifert, H., H. Wisplinghoff, P. Schnabel & C. von Eiff (2003) Small colony variants of Staphylococcus aureus and pacemaker-related infection. Emerg Infect Dis, 9, 1316-8. Senining, R. C., H. Ahmad, R. Shahzad, A. Stahl-Avicolli, T. J. Lamoste, N. E. Soto, E. I. Abter & E. K. Chapnick (2001) Late prosthetic valve endocarditis caused by Staphylococcus hemolyticus. Clin Infect Dis, 32, E100-1. Sohail, M. R., D. Z. Uslan, A. H. Khan, P. A. Friedman, D. L. Hayes, W. R. Wilson, J. M. Steckelberg, S. M. Jenkins & L. M. Baddour (2008) Infective endocarditis complicating permanent pacemaker and implantable cardioverter-defibrillator infection. Mayo Clin Proc, 83, 46-53. Sontakke, S., M. Cadenas, R. Maggi, P. Diniz & E. Breitschwerdt (2009) Use of broad range 16S rDNA PCR in clinical microbiology. Journal of Microbiological Methods, 217225. Souza Antunes, A. L., C. Secchi, K. C. Reiter, L. R. Rodrigues Perez, A. L. Peixoto de Freitas & P. Alves d'Azevedo (2007) Evaluation of oxacillin and cefoxitin disks for detection of resistance in coagulase negative staphylococci. Mem Inst Oswaldo Cruz, 102, 71923. Stewart, P. S. & J. W. Costerton (2001) Antibiotic resistance of bacteria in biofilms. Lancet, 358, 135-8. Strom, B. L., E. Abrutyn, J. A. Berlin, J. L. Kinman, R. S. Feldman, P. D. Stolley, M. E. Levison, O. M. Korzeniowski & D. Kaye (1998) Dental and cardiac risk factors for infective endocarditis. A population-based, case-control study. Ann Intern Med, 129, 761-9. Swenson, J., F. Tenover & C. D. S. Grp (2005) Results of disk diffusion testing with cefoxitin correlate with presence of mecA in Staphylococcus spp. Journal of Clinical Microbiology, 3818-3823. Tak, T., K. D. Reed, R. C. Haselby, C. S. McCauley & S. K. Shukla (2002) An update on the epidemiology, pathogenesis and management of infective endocarditis with emphasis on Staphylococcus aureus. WMJ, 101, 24-33. Tak, T. & S. K. Shukla (2004) Molecular diagnosis of infective endocarditis: a helpful addition to the Duke criteria. Clin Med Res, 2, 206-8. Tang, Y. W., A. Kilic, Q. Yang, S. K. McAllister, H. Li, R. S. Miller, M. McCormac, K. D. Tracy, C. W. Stratton, J. Han & B. Limbago (2007) StaphPlex system for rapid and simultaneous identification of antibiotic resistance determinants and Panton-Valentine leukocidin detection of staphylococci from positive blood cultures. J Clin Microbiol, 45, 1867-73.

79


Tissières, P., A. Gervaix, M. Beghetti & E. T. Jaeggi (2003) Value and limitations of the von Reyn, Duke, and modified Duke criteria for the diagnosis of infective endocarditis in children. Pediatrics, 112, e467. Tornos, P., B. Almirante, M. Olona, G. Permanyer, T. González, J. Carballo, A. Pahissa & J. Soler-Soler (1997) Clinical outcome and long-term prognosis of late prosthetic valve endocarditis: a 20-year experience. Clin Infect Dis, 24, 381-6. Voldstedlund, M., L. Nørum Pedersen, U. Baandrup, K. E. Klaaborg & K. Fuursted (2008) Broad-range PCR and sequencing in routine diagnosis of infective endocarditis. APMIS, 116, 190-8. Vollmer, T., C. Piper, D. Horstkotte, R. Körfer, K. Kleesiek & J. Dreier (2010) 23S rDNA real-time polymerase chain reaction of heart valves: a decisive tool in the diagnosis of infective endocarditis. Eur Heart J, 31, 1105-13. von Eiff, C. (2008) Staphylococcus aureus small colony variants: a challenge to microbiologists and clinicians. Int J Antimicrob Agents, 31, 507-10. von Eiff, C., G. Peters & C. Heilmann (2002) Pathogenesis of infections due to coagulasenegative staphylococci. Lancet Infect Dis, 2, 677-85. von Eiff, C., R. A. Proctor & G. Peters (2001) Coagulase-negative staphylococci. Pathogens have major role in nosocomial infections. Postgrad Med, 110, 63-4, 69-70, 73-6. Von Reyn, C. F., B. S. Levy, R. D. Arbeit, G. Friedland & C. S. Crumpacker (1981) Infective endocarditis: an analysis based on strict case definitions. Ann Intern Med, 94, 505-18. Vuille, C., M. Nidorf, A. Weyman & M. Picard (1994) Natural-history of vegetations during successful medical-treatment of endocarditis. American Heart Journal, 1200-1209. Wang, A., E. Athan, P. A. Pappas, V. G. Fowler, L. Olaison, C. Paré, B. Almirante, P. Muñoz, M. Rizzi, C. Naber, M. Logar, P. Tattevin, D. L. Iarussi, C. Selton-Suty, S. B. Jones, J. Casabé, A. Morris, G. R. Corey, C. H. Cabell & I. C. o. E.-P. C. S. Investigators (2007) Contemporary clinical profile and outcome of prosthetic valve endocarditis. JAMA, 297, 1354-61. Watkin, R., S. Lang, P. Lambert, W. Littler & T. Elliott (2003) The microbial diagnosis of infective endocarditis. Journal of Infection, 1-11. Westphal, N., B. Plicht & C. Naber (2009) Infective endocarditis--prophylaxis, diagnostic criteria, and treatment. Dtsch Arztebl Int, 106, 481-9; quiz 490. Zakir, R. M., A. Al-Dehneh, L. Dabu, R. Kapila & M. Saric (2004) Mitral bioprosthetic valve endocarditis caused by an unusual microorganism, Gemella morbillorum, in an intravenous drug user. J Clin Microbiol, 42, 4893-6. Zhang, K., J. Sparling, B. L. Chow, S. Elsayed, Z. Hussain, D. L. Church, D. B. Gregson, T. Louie & J. M. Conly (2004) New quadriplex PCR assay for detection of methicillin and mupirocin resistance and simultaneous discrimination of Staphylococcus aureus from coagulase-negative staphylococci. J Clin Microbiol, 42, 4947-55.

80


9 SEZNAM PŘÍLOH P1

Freibergerová M., Pařízková R., Ţaloudíková B., Freiberger T., Juránková J., Burget I., Husa P. Sepse vyvolaná bakterií Capnocytophaga canimorsus, možnosti diagnostiky a léčby. Klin mikrobiol inf lék. 2007;13(3):115-118.

P2

Kolek M., Ţaloudíková B., Freiberger T., Brát R. Infekční endokarditida aortální a mitrální chlopně vyvolaná Tropheryma whipplei při nepřítomnosti gastrointestinálních projevů Whippleovy choroby. Klin mikrobiol inf lék 2007;13(5):212-215.

P3

Ţaloudíková B., Kelbl M., Paša L, Freiberger T. Genotypic versus phenotypic methods in detection of Listeria monocytogenes prosthetic joint infection. J Med Microbiol 2009;Jun;58(Pt 6);829-31.

P4

Vaněrková M., Ţaloudíková B., Němcová E., Juránková J., Pol J., Černý J., Němec P., Freiberger T. Detection of Cardiobacterium valvarum in a patient with aortic valve infective endocarditis by broad-range PCR. J Med Microbiol. 2010;59(Pt2):231-234.

P5

Pol J., Černý J., Ondrášek J., Ţaloudíková B., Vršanský D., Freiberger T., Němec P. Diagnostika a výsledky chirurgické léčby infekční endokarditidy. Cor Vasa 2010, 52(5-6).

P6

Ţaloudíková B., Němcová E., Pol J., Šorm Z., Wurmová Š., Novotná K., Vaněrková M., Holá V., Růţička F., Dušek L., Němec P., Freiberger T. PCR and standard culture in surgically treated patients with staphylococcal infective endocarditis: A 4-year retrospective study. Zasláno k publikaci.

81

Molekulárně-mikrobiologická diagnostika u pacientů s infekční endokarditidou

Recommend Documents