MOLEKULÁRIS LENYOMATÚ POLIMER VÉKONYRÉTEGEK KÉSZÍTÉSE FELÜLETI PLAZMON REZONANCIA ÉRZÉKELÉSEN ALAPULÓ BIOSZENZORHOZ

MOLEKULÁRIS LENYOMATÚ POLIMER VÉKONYRÉTEGEK KÉSZÍTÉSE FELÜLETI PLAZMON REZONANCIA ÉRZÉKELÉSEN ALAPULÓ BIOSZENZORHOZ

Diplomamunka

Készítette:

Bognár Júlia

Témavezető: Dr. Horváth Viola Konzulens:

Dr. Gyurcsányi Ervin Róbert

Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Szervetlen és Analitikai Kémia Tanszék Budapest, 2010.

Tartalomjegyzék Tartalomjegyzék ............................................................................................................. 1 Alkalmazott rövidítések jegyzéke.................................................................................. 4 1.

Bevezetés .................................................................................................................. 6

2.

Irodalmi áttekintés .................................................................................................. 8

2.1. Molekuláris lenyomatú polimerek ............................................................................ 8 2.2. Fehérje templát imprintelésének nehézségei............................................................. 9 2.3. Fehérje-imprintelési stratégiák ................................................................................ 10 2.3.1. Három dimenziós lenyomatok – hidrogélek ................................................ 11 2.3.2. Kétdimenziós lenyomatok - felületi imprintelés.......................................... 14 2.3.2.1.

Vékony film előállítási módszerek ......................................................... 18

2.3.3. Epitóp-módszer ............................................................................................ 19 3.

Kísérletek ............................................................................................................... 22

3.1. Vegyszerek .............................................................................................................. 22 3.2. Eszközök, műszerek ................................................................................................ 23 3.3. Módszerek ............................................................................................................... 23 3.3.1. EDOT kémiai polimerizációja ..................................................................... 23 3.3.2. EDOT fotokémiai polimerizációja............................................................... 24 3.3.3. Oligotron átoldása vizes közegbe ................................................................ 24 3.3.4. Electrospotting tű készítése és vizsgálata .................................................... 25 3.3.4.1.

Pipettahegy hidrofilizálása...................................................................... 25

3.3.4.2.

Szigetelő toldat kialakítása ..................................................................... 25

3.3.5. Imprintelt polimerfilmek előállítása ............................................................ 26 3.3.5.1.

Polimerfilm előállítása arany elektród felületén ..................................... 26

3.3.5.2.

Polimerfilm előállítása SPR chip felületén ............................................. 28

3.3.6. Fehérje-kötődés vizsgálata a polimer filmeken ........................................... 29 3.3.6.1.

Fehérje felvitele a polimer filmekre........................................................ 29

3.3.6.2.

Megkötött fehérje mennyiségének meghatározása ................................. 30

3.3.6.3.

Mosási lépések ........................................................................................ 30 -1-

3.3.7. Nanorészecskék módosítása......................................................................... 31 3.3.7.1.

Avidin blokkolása biotinnal.................................................................... 31

3.3.8. A visszakötődés kiértékelése ....................................................................... 31 4.

Eredmények és értékelésük .................................................................................. 33

4.1. Kémiai és fotokémiai polimerizáció ....................................................................... 34 4.1.1. EDOT kémiai polimerizációja ..................................................................... 34 4.1.2. EDOT fotokémiai polimerizációja............................................................... 35 4.1.3. Oligotron átoldása vizes közegbe ................................................................ 35 4.2. Electrospotting tű készítése és vizsgálata................................................................ 36 4.3. Imprintelési kísérletek ............................................................................................. 37 4.3.1. Egylépéses imprintelés................................................................................. 38 4.3.2. Kétlépéses imprintelés ................................................................................. 40 4.3.2.1.

Avidin-HRP-re imprintelt EDOT-PSS filmek........................................ 40

4.3.2.2.

Avidinre imprintelt EDOT-PSS filmek .................................................. 42

4.3.2.3.

Avidinre imprintelt EDOT-PSSM filmek............................................... 44

4.3.3. Imprintelés nanorészecskéhez kapcsolt templáttal ...................................... 46 4.3.3.1.

Nanorészecskék módosítása avidinnel.................................................... 46

4.3.3.2.

Módosítatlan nanorészecskék vizsgálata ................................................ 50

5.

Összefoglalás .......................................................................................................... 58

6.

Köszönetnyilvánítás .............................................................................................. 60

7.

Irodalomjegyzék .................................................................................................... 61

8.

Függelék ................................................................................................................. 68

8.1. Kalibrációs adatok a tormaperoxidáz enzim aktivitásának méréséhez ................... 69 8.1.1. Kalibrációs adatok avidin-HRP aktivitásának méréséhez ........................... 69 8.1.2. Kalibrációs adatok biotin-HRP aktivitásának méréséhez ............................ 72 8.1.3. Kalibrációs adatok HRP aktivitásának méréséhez....................................... 74 8.2. Grafikonok forrásadatai........................................................................................... 75 8.2.1. Egy lépésben imprintelt polimer filmek által visszakötött avidin-HRP mennyisége (8. ábra) ............................................................................................... 75

-2-

8.2.2. Két lépésben imprintelt PEDOT-PSS filmek által visszakötött avidin-HRP mennyisége (9. ábra) ............................................................................................... 76 8.2.3. Két lépésben imprintelt PEDOT-PSS filmek által átlagosan visszakötött avidin mennyisége, detektálás biotin-HRP kapcsolásával (10. ábra)...................... 77 8.2.4. Két lépésben imprintelt PEDOT-PSSM filmek által átlagosan visszakötött avidin mennyisége (11. ábra) .................................................................................. 79 8.2.5. Ultrahangos kezelés hatása a peroxidáz enzim aktivitására (14. ábra) ........ 81 8.2.6. Biotin-HRP

és

HRP

visszakötődése

fluidMAG-biotinra

imprintelt

polimereken (17. ábra) ............................................................................................ 81 8.2.7. Hozzáférhető biotin mennyisége oxálsavas kezelés előtt és után (18. ábra) 82 8.3. Az egy-egy fluidMAG-biotin nanorészecskékhez kapcsolódó biotinok száma...... 83 8.4. A fluidMAG-biotin nanorészecskékkel történő imprintelés során kialakuló biotinkötőhelyek várható száma................................................................................. 84 8.5. FluidMAG-biotin nanorészecskékkel imprintelt polimer rétegek vastagságának meghatározása AFM felvétel alapján ............................................................... 85 8.5.1. A 25 ciklussal polimerizált, imprintelt polimer vastagsága ......................... 86 8.5.2. Az 50 ciklussal polimerizált, imprintelt polimer vastagsága ....................... 89 8.5.3. A 100 ciklussal polimerizált, imprintelt polimer vastagsága ....................... 92 8.5.4. A 200 ciklussal polimerizált, imprintelt poliemr vastagsága ....................... 94

-3-

Alkalmazott rövidítések jegyzéke (MAAP)2-Tb(III)

metakriloil-amidoantipirin-terbium

AAm

akrilamid

AcPABA

N-akriloil-para-aminobenzamidin

AMPS

2-akrilamido-2-metilpropánszulfonsav

APBA

3-aminofenilboronsav

APEOS

-aminopropiltrietoxiszilán

APS

ammónium-perszulfát

A-CD

akriloil--ciklodextrin

BisAm

N,N’-metilénbisz(akrilamid)

BSA

bovine serum albumin, marhaszérum albumin

CRP

C-reaktív protein

Cyt

citokróm-c

DHEBisAm

N,N’-(1,2-dihidroxietilén)-biszakrilamid

DMAEMA

2-(dimetilamino)etilmetakrilát

DMAPAAm

N,N-dimetilaminopropil-akrilamid

DPA

dipikolinsav

EDMA

etilénglikoldimetakrilát

EDOT

etilén-dioxitofén

Fbgn

fibrinogén

HAPEOS

(2-hidroxietil)-aminopropiltrietoxiszilán

Hb

hemoglobin

HEMA

hidroxietilmetakrilát

HFP

hexafluoropropilén

hGH

human growth hormone, humán növekedési faktor

HRP

horseradish peroxidase, tormaperoxidáz enzim

IgG

immunoglobulin

Lys

lizozim

-4-

MAA

metakrilsav

MAH-Cu(II)

metakriloil-Cu(II)–L-hisztidin komplex

MAPTAC

3-metakrilamidopropil-trimetilammónium klorid

Mb

mioglobin

MW

molecular weight, móltömeg

Na-PSS

poli(nátrium-4-sztirolszulfonát)

Na-PSSM

poli(nátrium-4-sztirolszulfonát-ko-maleinát)

NIPAAm

N-izopropil-akrilamid

NPPC

o-(4-nitrofenilfoszforil)kolin

PB

phospate buffer, foszfát puffer

PBS

phosphate buffered saline, foszfát pufferelt sóoldat

PEG-A

poli(etilénglikol) 200 diakrilát

PMOS

propiltrimetoxiszilán

PS

polisztirol

PSS

poli(sztirolszulfonsav)

PSSM

poli(sztirolszulfonsav-ko-maleinsav)

RNAse

ribonukleáz

SPR

surface plasmon resonance, felületi plazmon rezonancia

TEM

transzmissziós elektronmikroszkóp

TEMED

N,N,N’,N’-tetrametiléndiamin

TEOS

tetraetoxiszilán

tf.

térfogat

TMB

3,3’,5,5’-tetrametilbenzidin

wt%

tömegszázalék

-5-

1. Bevezetés A molekuláris lenyomatú polimerek (MIP, molecularly imprinted polymer) olyan szorbensek, amelyek az immunreakciókhoz hasonló szelektivitással és erősséggel képesek felismerni és megkötni egy kiválasztott vegyületet, a templátot. A MIP-ek annak köszönhetik e különleges tulajdonságukat, hogy előállításuk a szelektíven megkötni kívánt vegyület jelenlétében történik; a célszerűen megválasztott monomerek a templát köré rendeződnek, azzal kovalens vagy másodlagos kötéseket alakítanak ki, majd ebben az elrendezésben rögzülve polimerizálódnak. A templát ezután kimosható a szilárd, erősen keresztkötött polimerből, és így olyan mikropórusokat hagy hátra, amelyek alakjukat és a kötőhelyek elrendezését tekintve a templát komplementerét alkotják. A célvegyület az irodalom túlnyomó többségében viszonylag egyszerű molekula: gyógyszer [1,2,3], növényvédőszer [4,5,6], vagy kisméretű biomolekula, pl. cukor, aminosav [7,8,9]. A kétezres évek óta azonban a nagy molekulák, pl. fehérjék lenyomatképzése is a kutatások homlokterébe került [10,11,12], sőt egész sejtekre is készülnek

lenyomatok

[13,14,15].

A

fehérje-imprintelés

napjainkban

még

viszonylagosan szűkebb irodalmának oka azokban a nehézségekben keresendő, amelyek a templát nagy mérete és komplex szerkezete miatt lépnek fel. Az ezen problémák megoldására irányuló törekvések két fő csoportba sorolhatóak aszerint, hogy a nagy méretű fehérjék diffúzióját miképpen biztosítják a polimerben. Az egyik lehetőség alacsony keresztkötöttségű polimer tömbök (gélek) előállítása, a másik vékony, de erősen keresztkötött filmek polimerizálása, melyek csak a felületükön (azaz jól hozzáférhető helyen) tartalmazzák a fehérje lenyomatát. Diplomamunkám során fehérje lenyomatú polimer vékonyrétegeket állítottam elő. Kutatásaim kitűzött célja olyan körülmények kidolgozása volt, amelyek között mikrocseppentő robottal lehet a polimerizációs elegyet egy szenzor felületre juttatni, ott valamilyen módon bepolimerizálni, majd képalkotó felületi plazmon rezonancia (imaging Surface Plasmon Resonance, iSPR) készülékben végezni a mosási és visszakötődési lépéseket, ahol ezek közvetlenül detektálhatóak is. A választott iSPR érzékelés előnye, hogy egyidejűleg nagy számú minta vizsgálatára alkalmas. Így a fejlesztési fázisban az adott fehérje szelektív felismerésére gyorsan optimalizálható a monomer-összetétel. Ezt követően pedig, az (igen távoli) -6-

alkalmazási fázisban egyetlen mintából számos fehérje mennyiségi meghatározását teszi lehetővé azáltal, hogy egy szenzoron több, különböző fehérjére szelektív MIP film helyezhető el. A polimer filmeket először kémiai és fotokémiai úton próbáltam előállítani, de végül az elektrokémiai polimerizáció bizonyult célravezetőnek. Az imprintelési kísérleteket avidin modellfehérjével végeztem, amelyet a szenzor felületre adszorbeáltattam, és egy olyan vékony1 poli(etiléndioxitiofén) réteget igyekeztem köré növeszteni, amelyből a fehérje szabad kijutása még biztosított. Az imprintelhető felület növelése érdekében, valamint, hogy a megengedett polimer vastagság jóval nagyobb, tehát könnyebben kontrollálható lehessen, a fehérjét 100 nm átmérőjű részecskékhez kapcsoltam. Habár a kísérleteim egyelőre gyenge reprodukálhatósága még gátat szabott a komolyabb sikerek elérésének, a módszer mindenképpen ígéretesnek látszik a lenyomatképzés újszerű megvalósítására.

1

Az avidin molekula mérete ~10 nm, így a templátot be nem fedő polimer réteg vastagsága

legfeljebb 5 nm lehet.

-7-

2. Irodalmi áttekintés 2.1. Molekuláris lenyomatú polimerek A molekuláris lenyomatú polimerek előállításához használt prepolimerizációs elegy a célmolekulán (templáton) kívül az azzal kölcsönhatásba lépő funkcionális monomer(eke)t, kétértékű monomer(eke)t, iniciátort, valamint oldószert is tartalmaz. A kétértékű, ún. keresztkötő monomer szerepe a polimer térhálósítása, stabilizálása, illetve ezáltal a templát–funkcionális monomer adduktok rögzítése. Az oldószer (vagy porogén) egyrészt a polimer porózus szerkezetének kialakításáért felelős; másrészt a reakcióhő elvezetését szolgálja, ezáltal visszaszorítja a lokális túlmelegedés okozta mellékreakciókat. A polimer, alkalmazási területének megfelelően, többféle formában állítható elő. A hagyományos, tömbpolimerizációs eljárás során magas keresztkötő-aránnyal, szilárd tömb képződik. Ezt a további felhasználás előtt mozsárban összetörik, és szitafrakcionálással különítik el a megfelelő méretű szemcséket. Az eljárás anyag- és időigényes, és a lenyomathelyek részben sérülhetnek az aprítás során. Kromatográfiás alkalmazásokhoz általában gömb alakú szemcséket állítanak elő: ez megvalósítható a tömbpolimerizációhoz hasonló módon, de jóval kisebb monomer koncentráció alkalmazásával (1-5%), vagy az eredeti 40-60% monomert tartalmazó prepolimerizációs elegy emulgeálásával egy, a porogénnel nem elegyedő folytonos fázisban. Ez utóbbi módszer a szuszpenziós polimerizáció. További lehetőség a gömbszimmetrikus szemcsék előállítására, ha a polimerizációt szilikagél vagy más, gömb szemcséjű hordozó pórusaiban végezzük. Kémiai és mechanikai stabilitásuknak, a templátok széles körére optimalizálható és olcsó előállításuknak köszönhetően a molekuláris lenyomatú polimerek a klasszikus bioanalitikai

technikákban

felválthatják

a

természetes

felismerő

egységeket

(antitesteket, receptorokat, enzimeket). A MIP-ek alkalmazása így elképzelhető kromatográfiás állófázisként (különösen királis elválasztásokban [16,17]), szilárd fázisú extrakciós töltetként [18], szenzorok felismerő rétegeként [19], ligandumkötő assaykben [20], valamint katalizátorként is [21]. A fehérje-szelektív MIP-ek ezen kívül az orvosi diagnosztikában, illetve hatóanyag-célbajuttatásban is fontos szerepet játszhatnak [22]. A molekuláris lenyomatú polimerek napjainkban még viszonylag csekély

-8-

gyakorlati alkalmazása annak tudható be, hogy pontos működésükről kevesebb ismerettel rendelkezünk, mint a régóta használt természetes receptorokéról. Az 1990-es évek óta folyamatosan bővülő ez irányú kutatások (1. ábra) nyomán azonban várhatóan egyre nagyobb teret nyernek majd a MIP-ek a fent említett alkalmazásokban.

adott évben megjelent cikkek száma

600 500 400 300 200 100 0 1990

1995

2000

2005

2010

1. ábra: Molekuláris lenyomatú polimerek témájában végzett kutatások – az adott évben megjelent cikkek száma, az ISI Web of Science keresőprogrammal, „molecular* imprint*” kulcsszóval végzett keresés alapján

2.2. Fehérje templát imprintelésének nehézségei Fehérje templát imprintelésekor több olyan problémával is szembe kell nézni, melyek nagyrészt ismeretlenek a kismolekulák lenyomatképzésekor. Ezen nehézségek a fehérjék nagy méretére, összetettségére és rugalmas konformációjára, valamint oldhatósági korlátokra vezethetők vissza [23]. A hagyományos monolit szerkezetű polimerekben – azok porózussága ellenére is – gátolt a nagyméretű fehérjék diffúziója, ezáltal a templát csapdázódhat a kötőhelyén, illetve a visszakötődés során nem képes azt megközelíteni. A monolit összetörése, őrlése felszabadíthatja a nehezen hozzáférhető kötőhelyeket, ugyanakkor roncsolja is azokat [24]. A fehérje rugalmas konformációjának következtében kisebb szelektivitás várható, mint ami merev templátokkal elérhető. Ennek oka, hogy számos különböző komplex alakulhat ki a prepolimerizációs elegyben, s az így kialakuló kötőhelyek rendkívül heterogének lesznek [25]. A fehérjék rugalmas konformációja azt is lehetővé teheti, -9-

hogy egy fehérje beilleszkedjen egy másik templát által létrehozott kötőhelybe, ezáltal is csökkentve az imprintelt polimer szelektivitását, különösen fehérjecsaládok, vagy módosított fehérjék entitásai között [23]. A fehérje-imprintelés során további kihívást jelent a polimerizációs elegy kiválasztása.

A

hagyományos

denaturálódhatnak,

vagy

apoláris,

olyan

szerves

oldószerekben

konformációkba

illetve

a

fehérjék

aggregátumokba

rendeződhetnek, melyek alkalmatlanok a lenyomatképzésre. A fehérjék számára kedvező, közel fiziológiás, vizes közegben azonban az elterjedten használt monomerek nagy része nem, vagy csak részben oldható. A vizes közeg alkalmazásának másik hátránya,

hogy

a

kismolekulájú

lenyomatképzés

kulcsaként

számon

tartott

hidrogénkötéssel verseng az oldószer, illetve megbontja azt a templát és a funkcionális monomer között. Ugyanakkor igazolták, hogy ez a hatás sokkal kevésbé jelentős makromolekuláknál, mint kis molekulák esetében [24]. 2.3. Fehérje-imprintelési stratégiák A fehérjék imprintelésekor egy alkalmas polimerizációs elegy megoldást jelenthet mind az oldhatósági, mind a szelektivitási problémákra, így a sikeres lenyomatképzés kulcsa a fehérjék megfelelő diffúziójának biztosítása. Ennek alapvetően két iránya lehet, amelyek a hagyományos, erősen keresztkötött tömbpolimerizációs eljáráson alapulnak, de különböző módon segítik elő a fehérje mozgását. Az egyik lehetőség a diffúziós állandó növelése, a másik a diffúziós úthossz csökkentése. Előbbi a polimer keresztkötöttségi fokának csökkentésével valósítható meg, míg az utóbbihoz a polimer kiterjedését kell legalább az egyik térirányban csökkenteni. Turner [24] a különböző fehérje-imprintelési stratégiákat a polimer kiterjedése szerint osztályozza. A háromdimenziós polimer formák esetében elengedhetetlen a polimer nagy porozitása és pórusmérete, ami legjobban alacsony keresztkötöttségű gélek előállításával biztosítható. A gyakran akrilát alapú, nagy víztartalmú hidrogélek az erősen keresztkötött polimerekben mérhetőhöz képest megnövekedett diffúziós állandójuk által jelentenek megoldást a templát-csapdázódás problémájára. Az alacsony fokú keresztkötöttség ugyanakkor a polimer hosszú távú kémiai és mechanikai stabilitását veszélyezteti. Emiatt a környezeti paraméterek változtatása (ami szükségszerűen bekövetkezik, például a templát eltávolítását célzó erélyes mosási

- 10 -

lépésekben: savak, proteináz enzimek) könnyen a pórusok összeeséséhez, a lenyomathelyek megsemmisüléséhez vezethet a laza szerkezetű gélekben [24]. A felületi (vagy Turner áttekintő cikkében [24] kétdimenziósként szereplő) imprintelés során egy erősen keresztkötött, de vékony polimer filmet képeznek, melyet akár egy hordozó felülethez is rögzíthetnek. A fehérje egy-egy meghatározott részletének lenyomataként kialakított kötőhelyek a vékony filmben könnyebben hozzáférhetőek, mint a hagyományos tömbpolimerben, mivel a fehérjének kisebb utat kell megtennie a polimer felületétől a kötőhelyekig. A módszer hátránya, hogy a lenyomatok heterogének, és kevésbé szelektívek, mint a tömbpolimerizációval előállítottak, mivel csak a fehérjefelület egy részletét ismerik fel. Nagy előnyt jelent viszont a nagyfokú mobilitás mellett a szenzorfelülethez való kapcsolás lehetősége, valamint a hordozófelület által biztosított robusztusság [24]. Bossi [23] lényegében ugyanezen két fő csoportot különbözteti meg, ő azonban a lenyomatképzés célpontját emeli ki mint összehasonlítási szempontot, azaz aszerint csoportosítja az alkalmazott technikákat, hogy a fehérje alakját vagy szekvenciáját (illetve annak egy részletét) célozza a lenyomatképzés. Az általa tárgyalt, alakfelismerésre kialakított módszerek lényegében megegyeznek Turner három dimenziós

technikáival,

azaz

a

lágy

polimergélek

imprintelésével,

míg

a

szekvencia(részlet) felismerése vékony filmekkel, vagy az úgynevezett epitóp módszerrel valósítható meg. Mivel a fellelhető módszerek mindenre kiterjedő besorolása számos szempont szerint, vagyis csak igen összetett módon történhet, ezért (az áttekinthetőség érdekében) a továbbiakban a polimer kiterjedése – mint fő kategória – mentén mutatom be a fehérje-imprintelés leggyakrabban alkalmazott, konkrét megvalósítási lehetőségeit. Az idézett módszerek több szempontú osztályozását, és ezáltal a fehérje-imprintelés szerteágazó, és részben még kiaknázatlan lehetőségeit az 1. táblázatban foglalom össze. 2.3.1. Három dimenziós lenyomatok – hidrogélek A hidrogélek nagy vízmegkötő képességű, (vízben) oldhatatlan, keresztkötött homopolimer

vagy

hetero-kopolimer

hálózatok.

[26].

A

hidrogélek

alapját

leggyakrabban akrilát vagy szerves szilán monomerek képezik. A gélelektroforetikus technikákban használt, biokompatibilis (akrilamid és N,N’metilénbiszakrilamid

kopolimerjeként

előálló) - 11 -

poli(akrilamid)

gélek

ígéretes

lenyomatképző mátrixot jelentenek, mivel a poli(akrilamid)-on, inert természete és töltéssemlegessége következtében, alacsony nemspecifikus fehérje-kötődés várható. Ezt a feltételezést Liao és munkatársainak kísérletei is alátámasztják: a templát nélkül készített poli(akrilamid) gél egyik, általuk vizsgált fehérjét sem kötötte meg [27]. Ugyanakkor, a citokróm C, hemoglobin vagy transzferrin jelenlétében polimerizált gélek szelektíven megkötötték a templát fehérjét. A három fehérje együttes jelenlétében készített gél mindhármat megkötötte, vagyis egyszerre több(féle) templátra is kialakíthatóak szelektív kötőhelyek [28]. Az imprintelt poliakrilamid gél nagyfokú szelektivitását jelzi, hogy egy ló mioglobinra imprintelt gél csak a templát fehérjét adszorbeálta, és még a teljes 153 aminosavból álló szekvenciában mindössze 19 eltérést tartalmazó, és térszerkezetében is igen hasonló (2. ábra), bálna mioglobint sem kötötte meg.

a)

b)

2. ábra: Ló mioglobin (a); 29) és bálna mioglobin (b); 30) szerkezete

Ou és munkatársai úgy találták, hogy az alkalmazott keresztkötő-aránytól függetlenül, a lizozim templát mintegy 27%-a nem mosható ki az akrilamid, metakrilsav és

2-(dimetilamino)etil-metakrilát

monomerekből

készült

gélből.

Ezt

azzal

magyarázzák, hogy a gyökös mechanizmusú polimerizáció során a templát aminosavjai (különösen a triptofán, hisztidin, tirozin és cisztein) is hidrogént veszíthetnek, s a belőlük keletkezett gyökök kovalens kötéssel beépülhetnek a polimerhálóba [31]. Tapasztalataik szerint a metakrilsav arányának növelésével növekszik a kimosott templát mennyisége is, mivel a metakrilsav komplexálja a lizozimot, ezáltal megvédi a gyököktől. Hjertén kutatócsoportja [28] ugyanakkor nem tartja valószínűnek, hogy a

- 12 -

templát a gélhálózatoz kapcsolódna, még metakrilsav távollétében sem: a hemoglobinra imprintelt poli(akrilamid) gél ugyan nem volt teljesen kimosható (a gél enyhén elszíneződött maradt), de ennél egy, szabad aminosavak nagy koncentrációjának jelenlétében, egyébként azonos módon polimerizált gél színe sem volt halványabb a kimosás után. Mivel a szabad aminosavaknak ugyanúgy reagálniuk kell a gyökökkel, mint a fehérjének, ezért ha valóban a polimerhálózatba való beépülés okozná a templát csapdázódását, úgy az aminosavak jelenléte csökkentette volna ezt az effektust. Noha nem adtak magyarázatot a kimosódás elégtelenségének okára, úgy találták, hogy a templát nyomok még előnyösek is lehetnek a szelektív visszakötődés szempontjából, mivel a lehetséges felismerő mechanizmusok közül a protein-protein kölcsönhatás sem zárható ki. Liao és Hjertén azt tapasztalták, hogy a molekuláris felismerés a csak akrilamidot és N,N’-metilénbisz(akrilamid)-ot tartalmazó polimermátrixban is megvalósul, (sőt: akrilsav beépítésével gyengült az adszorpció), ennek ellenére számos szerző sikeresen imprintelt egyéb funkcionális monomerek hozzáadásával is. Az alapgél által kínált hidrogén-hidakon kívül elektrosztatikus kölcsönhatási lehetőség biztosítható akrilsavszármazékok [32,33] vagy más, ionos csoportot tartalmazó monomerek [34] beépítésével; hidrofób kölcsönhatás alakítható ki ciklodextrin-származékokkal [35]; de akár az igen erős és szelektív enzim-ligandum affinitás is felhasználható a lenyomatképzéshez [36]. Habár a természetben megfigyelhető legspecifikusabb kötődések is bizonyos láncok rugalmas mozgásával jönnek létre (pl. enzim – szubsztrát indukált illeszkedés), a mozgásszabadság tekintetében ezekkel rokonítható hidrogélek azonban jelenleg még nem rendelkeznek a merev polimerstruktúrákhoz mérhető szelektivitással, éppen a kötőhelyek laza szerkezetéből következő könnyű torzíthatóság miatt. A lágy poli(akrilamid) gélek kémiai és mechanikai stabilitásának növelésére elterjedt módszer a polimerréteg szilikagél [35,37], chitosan [38,39] vagy agaróz [40] gyöngyök felületén történő kialakítása. Ezáltal a hidrogélek a később tárgyalandó, felületi imprintelésben is elterjedten használatosak. A gélek stabilizálására további módszereket is ajánlanak: Hjertén a lágy, imprintelt szemcsék köré egy erősebben keresztkötött poli(akrilamid) réteget polimerizált [28]. Byrne [26] olyan hidrogél kialakítását javasolta, amelyben – a fehérjékhez hasonlóan – eltérő merevségű szerkezeti egységek: magas keresztkötöttségű felismerő foltok és alacsony keresztkötöttségű régiók váltakoznak. Enoki és - 13 -

munkatársai

[41]

a

polimerizációs

elegyhez

egy

reverzibilisen

blokkolt

monomerkomponenst is adtak, amelyből a gél létrejöttét követően további aktív monomereket szabadíthattak fel, és így utólagos keresztkötésekkel stabilizálták a szerkezetet. Úgy találták, hogy a templát jelenlétében utó-keresztkötött gél jobban kötötte a célvegyületet, mint az, amelyben a templát távollétében váltották ki ezt a késleltetett polimerizációt. A szerves szilánvegyületekből szol-gél reakcióval előállítható polisziloxánok az akrilamidhoz hasonlóan alkalmasak lenyomatképző mátrixnak, mivel vízoldható monomerekből, enyhe körülmények között polimerizálhatóak [24]. A szilanol csoportok kitűnő H-kötési lehetőséget biztosítanak a fehérjékkel, de különféle funkciós csoportok is beépíthetőek a szerves szilán monomerekbe, és ezáltal a polimer-hálózatba. A polisziloxánok további előnye az akrilamid-alapú polimerekkel szemben a merevebb szerkezet, és ennek köszönhetően nagyobb mechanikai és kémiai stabilitás. Venton és Gudipati [42] 3-aminopropiltrietoxiszilán és tetraetil-ortoszilikát monomerekből sikeresen készített ureáz enzimre illetve BSA-ra szelektív tömbpolimert. Ugyanakkor az ugyanilyen összetételű polisziloxánok mioglobinra illetve hemoglobinra imprintelve nem mutatkoztak szelektívnek egymás templátjával szemben. Az egyes MIP-ek ráadásul olyan erősen kötötték mindkét fehérjét, hogy 1 M NaCl-oldattal való mosás hatására is csak a megkötött fehérje 3-8 %-a mosódott ki. A fehérjéket csak denaturáló körülmények között lehetett kioldani, ekkor azonban már mutatkozott némi szelektivitás: a mioglobin- illetve hemoglobin-imprintelt polimerekből a karbamidos kezelés kevésbé oldotta ki a polimerek saját templátját, mint a másik fehérjét. 2.3.2. Kétdimenziós lenyomatok - felületi imprintelés A vékony polimerrétegek mikrogyöngyök felszínén vagy sík felületen is kialakíthatóak, ennek megfelelően a felületi imprintelés két csoportját különböztetjük meg: a mikrogyöngy felületi imprintelést, illetve az ún. bélyegző, vagy mikro-kontakt imprintelést (3. ábra). Mindkét esetben lerövidül a fehérje diffúziós úthossza a polimerréteg felületétől a kötőhelyekig. A mikrogyöngy felületi

imprintelés során

először

– aktivált

felületű

mikrogyöngyök jelenlétében – a fehérjék köré rendeződnek a funkcionális monomerek,

- 14 -

amelyekből ez után a gyöngyök felszínén polimerréteget képeznek. Végül a polimerrétegből eltávolítják a fehérje templátot. Ez a módszer tulajdonképpen tekinthető három dimenziós lenyomatképzésnek is, mivel a gyöngyök felületén kialakított réteg a teljes fehérje molekulákat magában foglalja. A mikrogyöngy-imprintelés akkor válik tisztán két dimenziós módszerré, ha kellően vékony polimer réteget alakítanak ki a gyöngyök felületén. Ez például úgy valósítható meg, ha az iniciátort a gyöngy felületén immobilizálják. A 2.3.1. fejezetben már említett chitosan vagy agaróz alapúakon kívül sokféle más anyagból készült mikrogyöngyök is használhatóak. Lulka és munkatársai szilikagyöngy felületén alakítottak ki ricinre, illetve annak A és B láncára imprintelt polisziloxán réteget [43]. Azt tapasztalták, hogy míg a különálló láncok homogén kötőhelyeket eredményeznek, addig a teljes ricin fehérjének két különböző affinitású kötőhely-csoportja alakul ki. Továbbá, a B lánc be tud kötődni az A lánc lenyomataiba, de ez fordítva nem valósult meg, valamint a teljes fehérje sem tud bekötődni egyik különálló lánc lenyomatába sem. Ezt a jelenséget a B lánc rugalmasabb szerkezetével, valamint a teljes fehérjének a láncokhoz viszonyított nagyobb méretével magyarázták. Shiomi és csoportja a fentihez hasonló módon készített hemoglobinra imprintelt polisziloxánt, de a templátot először imin kötéssel a szilika gyöngy felületére rögzítették. Az így imprintelt polimer nagyobb szelektivitást mutatott, mint az a MIP, amelyet szabad hemoglobinra imprinteltek [44]. Lu és munkatársai [45] polisztirol gyöngyök felületén hoztak létre hemoglobinra imprintelt poli(3-aminofenilboronsav) réteget. Az alkalmazott polimer szelektíven tudta visszakötni a hemoglobint, azonban a marha szérum albumin ugyanilyen körülmények között képzett lenyomata nem tudta visszakötni a templát fehérjét. Ezt a szerzők az imprinteléskor és a visszakötődéskor használt pufferek eltérő pH-jával magyarázták. Gai [46] illetve Tan [47] csoportja vasoxid magú, mágneses részecskék felszínén alakította ki a lizinre illetve BSA-ra imprintelt polimer réteget. Gültekin és munkatársai arany-ezüst nanoklasztereket vontak be a számos Bacillus és Clostridium faj spórájának jelenlétére jellemző dipikolinsavra imprintelt polimerréteggel [48]. A lenyomatképzés alapjául fém-koordinációs, kelátképző kölcsönhatást választottak, ami a templát oxocsoportja és a metakriloil-amidoantipirin-

- 15 -

terbium funkcionális monomer terbium(III) ionjai között lép fel. A dipikolinsav nem fehérje, de a fémion-koordinációs imprintelési elvet fehérjékre is alkalmazzák, a legelterjedtebben a Cu(II)–hisztidin keláció felhasználásával. Ennek kapcsán itt mutatnám be Odabasi és munkatársainak cikkét is, noha ők nem felületi lenyomatot, hanem tömbpolimert készítettek az N-metakriloil-L-hisztidin-metilészter rézkomplexe mint funkcionális monomer, valamint HEMA és EDMA segéd monomerek felhasználásával, lizozim fehérje jelenlétében [49]. A MIP szelektívnek bizonyult a hisztidint szintén tartalmazó citokróm c enzimmel és humán szérum albuminnal szemben, vagyis jobban kötötte a lizozimot, mint a citokróm c-t vagy a HSA-t. Özcan és csoportja a később tárgyalandó epitóp-módszerrel ötvözte a fémion-koordinációs imprintelést: L-hisztidin lenyomatát képezték az Odabasi által is használt kelátképző monomer és EDMA kopolimerében [50]. A szuszpenziós polimerizációval előállított, kis méretük miatt felületen imprinteltnek tekinthető polimergyöngyök nemcsak a hisztidin enantiomerjeinek elválasztására bizonyultak alkalmasnak, de a felszínén hisztidint tartalmazó citokróm c enzim elválasztására is (az ezzel nem rendelkező) ribonukleáz A enzimtől.

3. ábra: A fehérje imprintelés három alapvető módszere. a) tömbfázisú imprintelés kis mértékben keresztkötött hidrogélekkel. b) Mikrogyöngyök felületén történő imprintelés. c) Mikro-kontakt imprintelés sík felületen. ([51] 1. ábrája nyomán)

- 16 -

A felületi imprintelés másik megvalósítási formája az ún. mikro-kontakt imprintelés. Ennek során a fehérjét egy egyenletes felszínű hordozóra adszorbeáltatják, és vékony polimer réteget növesztenek rá, amelyet ez után egy másik hordozóhoz rögzítenek. Végül óvatosan leválasztják azt a hordozót, melyre eredetileg a fehérjét adszorbeáltatták, így a templát eltávolításával előáll a felületén imprintelt polimer réteg. A módszer előnye, hogy a templát egyáltalán nem csapdázódik a polimerben, csekély mennyiségű templát is elegendő a lenyomatképzéshez, és a felületi lenyomatok homogének. Chou és munkatársai [52] egy üveg fedőlemezre adszorbeáltatták a C-reaktív protein (CRP) templátot, és a funkcionális monomert o-(4-nitrofenilfoszforil)kolint, amely a CRP természetes foszforilkolin ligandumának egy analógja. Egy másik üveg hordozóra keresztkötő monomert és iniciátort adszorbeáltattak, majd a két üveglapot (értelemszerűen a funkcionalizált oldalak érintkeztetésével) egymásra helyezték, és UV polimerizációval rögzítették a fehérje lenyomatát. A fedőlemez eltávolítása és a templát kimosása után a 10 m vastag polimer réteg szelektíven visszakötötte a CRP-t. Shi és munkatársai [53] atomi simaságú csillámpala felületre adszorbeáltattak három jelentős véralkotót: marha szérum albumint (BSA), immunoglobulint (Ig) és fibrinogént. A fehérjéket vékony diszacharid réteggel vonták be, ami hidrogén-híd kölcsönhatásokat alakított ki a templáttal. Ez után egy vékony polimer réteget választottak le a mintákra, melyhez a diszacharidok kovalensen kapcsolódtak, ezáltal poliszacharid jellegű

üregeket

képeztek

a

templát

körül. A

polimerréteget

epoxigyantával egy üveg hordozóhoz rögzítették, végül a csillámpala, majd a templát eltávolításával kapták meg a felületén imprintelt polimer réteget (3. ábra c)). Visszakötődési vizsgálataik során az egyes MIP-ek sokkal nagyobb arányban kötötték meg a saját templátjukat, mint más fehérjéket. Kétkomponensű fehérje-oldatokból a templát minden esetben erősebben kötődött a kompetitív fehérjénél. A mikro-kontakt módszer egy speciális esetének tekinthető a Langmuirimprintelés: ennek során a fehérjét egy olyan, a víz/levegő határfelületen elhelyezkedő lipid mono- vagy kettősrétegre adszorbeáltatják, amely semleges és a fehérjével ellentétes töltésű komponenseket tartalmaz. A lipidek a töltésüknek megfelelően a fehérje köré rendeződnek. Az így kialakult kötőhelyeket általában a lipid rétegnek egy hidrofób szubsztráthoz való kötésével rögzítik.

- 17 -

Turner és munkatársai a nem-ionos metil-sztearát és a kationos dioktadecildimetilammónium bromid (DOMA) felületaktív komponensekből (valamint a fehérjeaggregáció visszaszorítását szolgáló poli(etilénglikol)-ból) képzett monorétegre adszorbeáltattak ferritint, illetve marha szérum albumint (BSA) [54]. A réteget oktadekántiollal

hidrofóbizált

QCM

szenzorra

immobilizálták.

A

fehérjék

izoelektromos pontja feletti pH-n, azaz anionos állapotban, a fehérjék térkitöltése határozta meg az imprintelt rétegek szelektivitását: a kisebb BSA nagy mértékben kötődött a ferritin lenyomataiba is, ugyanakkor a ferritint nem kötötte meg a BSA-ra imprintelt réteg. Az a tény, hogy a ferritin kationos állapotban (pH
A

plazmaleválasztáshoz

igen

hasonló

módszer

a

rádiófrekvenciás

katódporlasztás, ennek során azonban a plazmába polimer fragmenseket juttatnak be [56]. Szintén jól szabályozható rétegvastagság érhető el elektromosan vezető polimert eredményező monomerek elektrokémiai polimerizációjával. A vezető tulajdonságot a polimerek konjugált -elektronrendszere eredményezi, így jellemzően pirrol-, tiofén-, anilin-, indol- és acetilén-származékok használatosak az elektrokémiai polimerizáció során [57]. Az elektrokémiai polimerizációt általában galvano- vagy potenciosztatikus módban, esetleg potenciál pulzusokat alkalmazva végzik. A leválasztási folyamatot, és ezen keresztül a képződő polimer felületi morfológiáját az alkalmazott feszültségen - 18 -

kívül a monomer és az ellenion koncentrációja, utóbbi kémiai természete, az oldószer minősége és a hőmérséklet befolyásolja [58]. A film vastagságát az áthaladt töltés mennyisége határozza meg. 2.3.3. Epitóp-módszer Megfontolandó alternatívát jelenthet a molekuláris lenyomatképzés során történjék az bármilyen formában, vagyis tetszőleges polimer-geometria és templát– funkcionális monomer kölcsönhatás esetén is – a teljes fehérje helyett egy rövid szekvenciarészlet templátként való használata, vagyis az epitóp módszer alkalmazása. A kis molekulatömegű vegyületek sikeres lenyomatképzéséből, és az antitestantigén kölcsönhatás természetéből kiindulva Rachkov és Minoura fejlesztette ki az ún. epitóp-módszert [59]. Az immunológia egyik legalapvetőbb reakciójában a szervezet számára idegen fehérjemolekula felismerését annak egy kis (jellemzően legalább 8 aminosavból álló) szekvenciarészlete, az epitóp biztosítja. Ha ennek mintájára a felismerni kívánt fehérje helyett annak egy jól hozzáférhető részletét reprezentáló, néhány aminosavból álló peptidet használunk templátként, akkor azt a peptid lenyomata a teljes fehérjén is képes lehet felismerni és szelektíven megkötni. Az epitóp-módszerrel Rachkov és Minoura létrehozott egy, a 9 aminosavból álló oxitocinra szelektív, metakrilát-alapú polimert, az oxitocin C-terminálisa felőli 3 aminosavból álló szekvencia-részlet imprintelésével (4. ábra) [60].

4. ábra: Az epitóp-módszer; oxitocin (H2N-Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly) felismerése a Cterminálison található peptidrészlet (H2N-Tyr-Pro-Leu-Gly) imprintelésével. A monomerelegy a peptidrészletet tartalmazza templátként (a), és e körül formálódnak a kötőhelyek a polimerizáció során (b). A templát eltávolítását követően kapott üres kötőhelyekbe (c) a rövid peptid, vagy az azonos terminálissal rendelkező oxitocin is visszakötődhet (d). [59 1. ábrája alapján]

- 19 -

Nishino és munkatársai [61] a jóval nagyobb citokróm c, szérum albumin és alkohol-dehidrogenáz fehérjék szelektív felismerését valósították meg vizes közegben, a megfelelő fehérje C-terminális felőli 9 aminosavból álló szekvencia-részletének imprintelésével. A választott templát-hosszúság közel egyedi kódot biztosít a fehérjék nem strukturált részének azonosításához, és ezáltal nagyfokú szelektivitást eredményez. Rachkovék [60] templátjának negyedik aminosavja eltért az anyavegyületétől, az YPLG szekvenciára imprintelt polimer mégis képes volt megkötni a CYIQNCPLG szekvenciájú oxitocint is. Ugyanakkor Nishino és munkatársai azt tapasztalták, hogy a nonapeptid

templátra

imprintelt

filmek

sokkal

érzékenyebbek

a

szekvencia

helyességére: az STQTALA C-terminálisú BSA kötődése jelentősen lecsökkent a negyedik aminosav cseréjével kapott nonapetid-változatokra (STQAALA, STQLALA, STQEALA, STQYALA) imprintelt polimereken, a pontos szekvenciával imprintelt polimeren tapasztalt kötődéshez képest. A lenyomatok eltérő szekvencia-érzékenységét véleményem szerint az is okozhatta, hogy Rachkov a peptid templát végén, míg Nishino a peptid közepén elhelyezkedő aminosavat

cserélte. A láncvégi aminosav már valószínűleg nem

ágyazódott be a polimerbe, így nem vett részt a kötőhely kialakításában. Ezzel szemben a lánc belsejében elhelyezkedő aminosav bizonyosan nem lógott még ki a polimerből, azaz részt vett a kötőhely kialakításában. Brown és Puleo lizozimra, illetve a fehérje egy 16 aminosavból álló részletére készített imprintelt polimert [62]. A teljes fehérjére imprintelt polimer 4-5-ször annyi lizozimot kötött meg a hasonló méretű ribonukleáz A-hoz képest, mind kompetitív mind nemkompetitív körülmények között. Ugyanakkor a peptidre imprintelt polimer csak statisztikailag nem szignifikáns mértékben kötött több lizozimot, mint ribonukleázt. A szerzők ezt egyrészt az egyesével készített polimerek változékonyságával, másrészt a peptid templát kis méretével magyarázzák, amely így nagyrészt csapdázódhatott a polimerben, s csak kis mennyisége képezett a lizozim számára is hozzáférhető, felületi lenyomatokat. Ez, a szerzők által adott magyarázat azonban nem koherens a korábbi tapasztalatokkal, miszerint a csapdázódás inkább a nagyobb méretű fehérjékre jellemző, semmint a kisebb peptidekre.

- 20 -

polimer kiterjedése

„2D” „3D”

templát–

tömbfázisú, általában gyengén keresztkötött

monomer

hidrogélek

vékony, általában erősen keresztkötött, felületen imprintelt filmek mikrogyöngy felületén

kölcsönhatás

másodrendű kölcsönhatás (pl. H-híd, elektrosztatikus vonzás)

fémionkoordináció enzim-ligandum affinitás epitóp imprintelés

AAm, BisAm / Cyt / [27] AAm, BisAm / RNAse, Lys, Mb / [28] DMAEMA, MAA, AAm, BisAm / Lys / [31] MAA, AAm, BisAm / BSA / [32] DMAEMA, MAA, AAm, BisAm / hGH / [33] AAm, BisAm, AMPS, MAPTAC / Hb / [34] AAm, BisAm / Hb / [40] APEOS, TEOS / BSA, ureáz / [42]

MAH-Cu(II), EDMA, HEMA / Lys / [49]

PS / APBA / Hb / [45] Fe3O4 / NIPAAm, AAm, BisAAm / Lys / [46] szilika / A CD, AAm, BisAm / Hb / [35] szilika / AAm, DMAPAAm, BisAm, DHEBisAm / Lys / [37] chitosan / AAm, BisAm / Hb / [38] chitosan / AAm, BisAm / BSA / [39] agaróz / AAm, BisAm / Hb / [40] szilika / HAPEOS, TEOS / ricin / [43] szilika / APEOS, PMOS / Hb / [44] Fe3O4 / MAA, EDMA / BSA / [47]

sík felületen (mikro-kontakt imprintelés)

HFP / BSA, IgG, Fbgn / [53]

Ag-Au / (MAAP)2-Tb(III) / DPA / [48] (szuszpenziós polim.) / MAH-Cu(II), EDMA / L-His / [50]

AcPABA, AAm, BisAm / tripszin / [36]

NPPC, EDMA / CRP / [52]

APEOS, TEOS / Lys / [62]

AAm, BisAm, PEG-A / nonapeptid

MAA, EDMA / tetrapeptid / [60]

/ [61]

1. táblázat: A bemutatott fehérje-imprintelési módszerek több szempontú csoportosítása. Az egyes cellákban feltüntett adatok: mikrogyöngy anyaga (ha van) / funkcionális monomer(ek) / templát / hivatkozás. A rövidítések feloldását ld. az 1. oldalon..

- 21 -

3. Kísérletek 3.1. Vegyszerek Oldószerek, gázok: víz (gyártó: Millipore, tisztaság: MilliQ); metanol (gyártó: Merck, tisztaság: gradient grade); tetrahidrofurán (gyártó: Sigma-Aldrich, tisztaság: >99,0%) Gázok: argon (gyártó: Linde, tisztaság: >99,995%); nitrogén (gyártó. Linde, tisztaság: >99,996%) Polimerizációs elegyek összetevői: ammónium-perszulfát (gyártó: Sigma-Aldrich, tisztaság: A.C.S. reagent), N,N,N’,N’tetrametiléndiamin (gyártó: Bethesda Research Laboratories, tisztaság: electrophoresis grade);

4,4’-azobisz(4-cianovaleriánsav) (gyártó: Aldrich, tisztaság: ≥75%)

OLIGOTRON: poli(3,4-etiléndioxitoifén), tetrametakrilát végcsoportokkal (gyártó: Aldrich, 0,5 wt% nitrometánban);

3,4-etiléndioxitiofén (gyártó: Aldrich, tisztaság: 97%);

poli(nátrium-4-sztirolszulfonát-ko-maleinát) (sztirolszulfonsav:maleinsav = 3:1, gyártó: Aldrich,);

poli(nátrium-4-sztirolszulfonát) (gyártó: Aldrich)

avidin (gyártó: Sigma, tisztaság: ≥98%); avidin-HRP (gyártó: Sigma); biotin (gyártó: Sigma, tisztaság: ≥99% );

biotin-HRP (gyártó: Sigma); HRP (gyártó: Sigma)

FluidMAG-biotin (gyártó: Chemicell, 100 nm hidrodinamikai átmérőjű, vasoxid magú, keményítő mátrixszal bevont és biotinilált szemcsék 0,05% nátrium-azidot tartalmazó vizes szuszpenzióban. Nanorészecskék sűrűsége: ~1,25 g/cm3, szuszpenzió koncentrációja: 10 mg/ml, ~1,8·1015 g-1 nanorészecske van a száraz anyagban. A nanorészecskék kapacitása 75 g sztreptavidin / 1 mg nanorészecske.)

Elektródok és polimerek tisztításához használt vegyszerek: alumina paszta (gyártó: Buehler); kénsav (gyártó: Sigma-Aldrich, 95-97%, tisztaság: puriss p.a.);

hidrogén-peroxid (gyártó: Sigma-Aldrich, 20 wt% vízben, tisztaság: puriss p.a.);

nátrium-dihidrogénfoszfát-monohidrát (gyártó: Fluka, tisztaság: puriss p.a.); nátrium hidroxid (gyártó: Fluka, tisztaság: ≥98,0%); nátrium klorid (gyártó: Riedel–de Haën, tisztaság: puriss);

Tween20 (gyártó: Sigma, tisztaság: for molecular biology);

Egyéb vegyszerek: poli(diallil-dimetilammónium klorid) (gyártó: Aldrich, 20 et% vízben, átlagos MW: 200 000-350 000);

poli(vinilpirrolidon) (gyártó: Sigma, átlagos MW: 360 000), brómkrezol

- 22 -

zöld nátrium sója (gyártó: Sigma-Aldrich, tisztaság: A.C.S. reagent), 3,3’,5,5’tetrametilbenzidin (gyártó: Sigma, folyadék szubsztrát-rendszer ELISA teszthez); oxálsav (gyártó: Fluka, tisztaság: purum)

3.2. Eszközök, műszerek bepárló készülék (Turbo Vap LV, gyártó: Zymark) kémcsőkeverő (REAX 2000, gyártó: Heildolph) mágneses szeparátor (MagnetoPURE, gyártó: Chemicell) orbitális rázógép ( UNIMAX 2010, gyártó: Heildolph) ultrahangos vízfürdő (Realsonic 40S, gyártó: Realtrade) ultrahangos keverő (Ultrasonic Homogenizer UH-50, gyártó: SMT Company) UV lámpa (MINUVIS 245 nm / 366 nm, gyártó: Desaga) optikai mikroszkóp (OLYMPUS BH-2) mikrotiter tálca olvasó (Elx808, gyártó: BioTek) potenciosztát/galvanosztát (Autolab PGSTAT100, gyártó: Metrohm) pásztázó elektronmikroszkóp (Inspect S50, gyártó: FEI) atomerő mikroszkóp (Innova SPM, gyártó: Veeco) profilométer (Alpha-Step 500, gyártó: Tencor Instruments) 3.3. Módszerek 3.3.1. EDOT kémiai polimerizációja Az EDOT kémiai polimerizációját ammónium-perszulfát (APS) oxidálószerrel és N,N,N’,N’-tetrametiléndiamin (TEMED) katalizátorral végeztem. 25 mM Na-PSS elleniont és 10 mM EDOT-ot vízben feloldottam, majd az oldatot argonnal oxigénmentesítettem, és 400 l-ét lezárható üvegbe mértem. Hozzáadtam 10-10 l APS és TEMED oldatot, melyeket 0,04 – 0,8 M-os vizes oldatként készítettem el, a kívánt mólaránynak megfelelően (ld. 2. Táblázat, „V” jelű minták). Az „A” jelű minták esetében a monomerből 20 mM-os oldatot készítettem, 10% acetonitrilt tartalmazó vízben. Az A10 jelű mintához 10-10 l, míg az A20 jelűhöz 2020 l 0,8 ill. 0,08 M koncentrációjú APS ill. TEMED oldatot adtam.

- 23 -

Megmértem

az

elegyek összemérésétől

(katalizátor hozzáadását

követő

homogenizálástól) eltelt időt az elegy elszíneződéséig („polimerizáció kezdete”).

EDOT ill.

EDOT-PSS :

Na-PSS

APS : TEMED

koncentráció

mólarány

kód V11 V10

10 mM ill. 25 mM

V20 A10

20 mM ill. 25 mM

A20

APS

TEMED

koncentráció koncentráció

1:1:1

0,4 M

0,04 M

1 : 1 : 0,1

0,4 M

0,04 M

1 : 2 : 0,2

0,8 M

0,08 M

1 : 1 : 0,1

0,8 M

0,08 M

1 : 2 : 0,2

0,8 M

0,08 M

EDOT-PSS oldószere

víz

10% acetonitril tartalmú víz

2. Táblázat: EDOT kémiai polimerizációjának vizsgálatához alkalmazott prepolimerizációs elegyek összetétele

3.3.2. EDOT fotokémiai polimerizációja Az

EDOT

fotokémiai

polimerizációját

a

vízoldható

4,4’-azobisz(4-

cianovaleriánsav) (ACVA) iniciátorral végeztem. 12,5 mM Na-PSS-t, 10 mM EDOT-ot és 1 mM ACVA iniciátort vízben feloldottam. Az oldatot argon átbuborékoltatásával oxigénmentesítettem, majd 200 l-ét küvettába pipettáztam, illetve 2 l-ét tárgylemezre cseppentettem, melyet egy celofánnal lezárt Petri-csészébe helyeztem. A mintákat 245 nm hullámhosszon sugárzó UV-lámpával megvilágítottam, és megmértem az elszíneződés kezdetéig eltelt időt („polimerizáció kezdete”). 3.3.3. Oligotron átoldása vizes közegbe 1 ml Oligotron szuszpenziót (nitrometánban) nitrogén áramban, 40 °C-on szárazra pároltam, 10*100 l-es részletekben. A beszárított oligomert metanolban, metanol-víz 1:1 arányú elegyében, illetve vízben próbáltam visszaoldani, ultrahangos keverő segítségével. A kapott szuszpenziókat tárgylemezre cseppentve optikai mikroszkóppal vizsgáltam.

- 24 -

3.3.4. Electrospotting tű készítése és vizsgálata 3.3.4.1. Pipettahegy hidrofilizálása A következő módszereket alkalmaztam a pipettahegyek hidrofilizálására. Néhány darab, 10 l-es polipropilén pipettahegyet poli(diallildimetilammónium klorid) polielektrolit 20 w%-os vizes oldatába merítettem 10 percre, majd a hegyeket vízzel mostam 10 percig, ultrahangos fürdőben. Néhány másik pipettaheggyel poli(vinilpirrolidon) 50 g/l-es metanolos oldatát szívtam fel, majd 10 s után a folyadékot kifolyattam, és a pipettahegyet megszárítottam. Újabb 10-12 pipettahegyet oxigén plazmában való kezeléssel hidrofilizáltam. A hidrofilizálás eredményességét nyitott és lezárt végű pipettahegyen is vizsgáltam: a pipettahegy végét brómkrezol zöld festék tömény vizes oldatába mártottam, majd szemrevételezéssel, illetve az acél tűvel lezárt hegyek esetében mikroszkóp alatt ellenőriztem, hogy a kavitásban meddig kúszott fel a folyadék. 3.3.4.2. Szigetelő toldat kialakítása Egy 375 m átmérőjű, tömör rozsdamentes acél mikrocseppentő (BioRad Calligrapher) tű végére a hidrofilizált, 10 l-es polipropilén pipettahegyek egyikéből levágott toldatot illesztettem, amit hőre zsugorodó műanyag csővel rögzítettem. A pipettahegy végét szikével ferdére metszettem, hogy elősegítsem a folyadék felszívódását a kavitásba (5. ábra).

5. ábra: Electrospotting tű felépítése

- 25 -

Az electrospotting tű hegyét 10 mM EDOT és 25 mM NaPSS vizes oldatába mártottam, majd a tűt egy megtisztított SPR szenzor arany felületéhez érintve rögzítettem. Az arany mint munkaelektród és a tű mint ellenelektród között 0,9 V potenciálon,

60 s

alatt

hoztam

létre

polimer

filmet

a

kavitásba

juttatott

monomerelegyből. 3.3.5. Imprintelt polimerfilmek előállítása Az imprintelési kísérletek során kétféle szubsztrátra (arany elektródra és SPR chipre), és ennek megfelelően két különböző elektrokémiai cella elrendezésben készítettem polimerfilmeket. 3.3.5.1. Polimerfilm előállítása arany elektród felületén Egy 2 mm átmérőjű, teflon bevonatú arany elektródot 1,0 m-es, majd 0,05 m-es alumina pasztával políroztam, majd vízben ultrahangoztam. Ez után az elektródot Ag/AgCl szál szemi-referencia elektród és platina szál ellenelektród mellett elektrokémiai tisztításnak vetettem alá: 0,1 M pH=7,4 foszfát pufferben 300 ciklust végeztem fel a 3. Táblázatban látható potenciál lépcsőkkel [63]. 1. 2. 3.

potenciál

potenciálon tartás ideje

1,6 V 0V -0,8 V

0,1 s 0,1 s 0,1 s

3. Táblázat: Elektrokémiai tisztításhoz alkalmazott potenciál lépcsők

Az elektrokémiai tisztítás hatására az elektród felületén néhány nanométer mélységben az arany szerkezete polikristályosból 111 kristályrácsúvá alakul. Az elektród előkészítését vizes öblítéssel és nitrogénnel való szárítással fejeztem be. A polimer filmek előállítását a 6. ábra a) részén látható cella elrendezésben végeztem. Az elektród köré koncentrikus elrendezésben egy teflon gyűrűt és egy levágott pipetta hegyet rögzítettem, így egy legfeljebb 0,5 ml folyadék befogadására alkalmas tartályt kaptam. Ebbe merítettem az ellenelektródként használt platina szálat, valamint a szemi-referencia elektród Ag/AgCl szálat. Ezek ellepéséhez legalább 50 l prepolimerizációs elegyet kellett a cellába tölteni. A cellát, összeállítását követően, argon átbuborékoltatásával oxigénmentesített prepolimerizációs eleggyel töltöttem fel, majd kronoamperometriás módszerrel hoztam - 26 -

létre a polimer filmeket, vagyis a kívánt filmvastagságnak megfelelő ideig 0,7 ill. 0,8 V potenciál feszültséget adtam az arany munkaelektródra. A polimer filmeket végül vízzel öblítettem, és nitrogénnel szárítottam. A prepolimerizációs elegy összetétele az egyes kísérletekben eltérő volt. Az A összetétel esetén (és későbbi, mosási lépésekben) alkalmazott 0,01 M pH=7,4 foszfát puffert (PB-t) nátrium-dihidrogén-foszfát-hidrát vizes oldatából készítettem, az oldat pH-ját nátrium-hidroxid oldattal állítottam a kívánt értékre. NIP elegy

MIP elegy

10 mM EDOT

A összetétel

0,1 mg/ml avidin-HRP

25 mM NaPSS

a NIP elegyben oldva

0,01 M pH=7,4 PB-ben oldva 10 mM EDOT

B összetétel

25 mM NaPSS vízben oldva 10 mM EDOT

C összetétel

25 mM NaPSSM vízben oldva

4. Táblázat: A kísérletekben alkalmazott különböző prepolimerizációs elegyek összetétele

a)

b)

6. ábra: Cella elrendezések elektrokémiai polimerizációhoz a) arany elektród, ill. b) SPR chip felületén.

- 27 -

3.3.5.2. Polimerfilm előállítása SPR chip felületén Más mérésekhez korábban már használt SPR chipeket (szükség szerint üvegvágóval kisebb darabokra vágva) piranha oldatban (3 tf. 98%-os kénsav és 1 tf. 30%-os hidrogén-peroxid oldat elegye) áztatva megtisztítottam, vízzel alaposan leöblítettem, majd nitrogénnel megszárítottam. A megtisztított chipeket hármasával a 6. ábra b) részén látható cellában rögzítettem, kezdetben parafilm, később teflon gyűrűs tömítéssel. Az argon átbuborékoltatással oxigénmentesített prepolimerizációs elegy fölé nitrogént fúvattam a polimerizáció ideje alatt. A platina szál ellenelektródot és az Ag/AgCl szál referencia elektródot mindig azon chip fölé rögzítettem, amelyiken éppen létrehoztam a polimer filmet. A munkaelektródot alufólia segítségével csatlakoztattam az áramkörhöz, és a kívánt filmvastagságnak megfelelő ciklusszámban ismételve az 5. Táblázatban ismertetett potenciál pulzusokat, létrehoztam a polimer filmet. Amikor mindhárom chipen elkészült a film, a cellát szétszereltem, a chipeket vízzel leöblítettem, és nitrogénnel megszárítottam. A parafilm tömítés nyomát ez után a chip tetrahidrofuránba merítésével távolítottam el. Ez a PEDOT filmet érintetlenül hagyta. Végül ismét vízzel öblítettem, és nitrogénnel szárítottam a chipet. A későbbi kísérletekben használt teflon gyűrűs tömítés nem ragadt rá a chipre, ezért nem igényelt további kezelést az első vizes öblítés, szárítás után.

1. 2.

potenciál

potenciálon tartás ideje

adatrögzítés időköze

1V 0,2 V

0,05 s 0,05 s

0,005 s 0,001 s

5. Táblázat: Elektrokémiai polimerizációhoz alkalmazott potenciál lépcsők

- 28 -

3.3.6. Fehérje-kötődés vizsgálata a polimer filmeken 3.3.6.1. Fehérje felvitele a polimer filmekre A polimer filmekre 1-8 l fehérje-oldatot2 mértem, az elektródokat illetve chipeket lefedve hűtőládába tettem (az oldószer-párolgás minimalizálására), majd a jellemzően 30 perc inkubációs idő leteltével felitattam az oldatot, és az arany szubsztrátot vízzel alaposan leöblítettem, végül megszárítottam. Ezt a fehérje-felviteli eljárást többféle művelet megvalósításához is alkalmaztam. Egyrészt visszakötődés vizsgálatakor így vittem fel a mintákra az avidin-HRP, biotinHRP ill. HRP oldatot. Enzim nélküli avidin visszakötődésének vizsgálatakor az avidin felvitelét követően a fenti eljárást biotin-HRP oldattal is elvégeztem, így a megkötött avidinhez kapcsolt biotin-HRP-t tudtam kvanitfikálni. Másrészt ezt az eljárást alkalmaztam akkor is, amikor a két lépéses imprintelés során az alsó polimer rétegre adszorbeáltattam a templát avidin vagy avidin-HRP-t. Nanorészecskéhez kapcsolt avidin-HRP ill. biotin templát felvitelét ezzel szemben a nanorészecske szuszpenzió arany szubsztrátra szárításával oldottam meg, és azokban a kísérletekben csak a fehérje-visszakötést valósítottam meg a fenti módon. koncentráció [mg/ml]

fehérje típusa

oldószer

0,1

avidin

PB

0,1

avidin-HRP

PB

0,5

avidin-HRP

PB

0,5

biotin-HRP

PB

0,5

HRP

PB

6. Táblázat: A kísérletek során alkalmazott fehérje-oldatok összetétele

2

Az imprintelés során felmerült nehézségek miatt a kísérletek egy részében már csak biotinra

képeztem lenyomatot, és annak a visszakötődését vizsgáltam ugyanolyan módon, mint az avidinét. Habár a biotin nem fehérje, az egyszerűség kedvéért a 3.3.6. szakaszban „fehérje” alatt értem a biotint is.

- 29 -

3.3.6.2. Megkötött fehérje mennyiségének meghatározása A HRP mennyiségének meghatározásához kalibrációt végeztem: 200 l TMB reagenshez 5 l ismert koncentrációjú enzim-oldatot adtam egy Eppendorf-csőben, majd az inkubációs idő leteltével 50 l 0,5 M-os kénsavval leállítottam a reakciót. A homogenizált oldat 200 l-ét mikrotiter tálcára mértem, és mikrotiter tálca olvasó segítségével meghatároztam az abszorbanciáját 450 nm hullámhosszon. Ezt a műveletsort vak mintával (0,01 M pH = 7,4 foszfát pufferben zérus enzimkoncentráció) is elvégeztem. A mintákon megkötött HRP mennyiségét azonos elven, de a minta geometriájának megfelelően módosított elrendezésben mértem. Az elektródokat és az SPR chipekből vágott nyolcad darabokat az Eppendorf-csőbe, míg a negyedelt SPR chipeket egyenes talpú üveghenger aljára helyeztem, majd rájuk mértem a (200 l) TMB reagens oldatot. Némelyik mintát nem tudtam a szűk hengerben vízszintesen elhelyezni, így azokat nem lepte volna el teljesen a 200 l oldat. Ezekhez 400 l TMB-t adtam, és ennek megfelelően a stop reagens kénsav mennyiségét is megkétszereztem, így a mért abszorbanciák közvetlenül összehasonlíthatóak. 3.3.6.3. Mosási lépések Az arany elektródon készült polimer filmek mosását úgy végeztem, hogy az elektródot egy 2 ml mosófolyadékot tartalmazó üveghengerbe merítettem, miközben a folyadékot kevertettem. A jellemzően 10 perces mosás után az elektródot vízzel leöblítettem, és megszárítottam, majd a polimerben maradt fehérje mennyiségét a 3.3.6.2. szakaszban leírtak szerint mértem meg. Az SPR chipen kialakított polimereket mosóoldatot tartalmazó főzőpohárban ultrahangos vízfürdőre tettem. Az alkalmazott mosófolyadékok az alábbiak voltak: víz PB:

0,01 M-os, pH=7,4 foszfát puffer

Tween:

5% Tween20 oldva 0,01 M-os, pH=7,4 foszfát pufferben

PBS:

0,15 M NaCl oldva 0,01 M-os, pH=7,4 foszfát pufferben

- 30 -

3.3.7. Nanorészecskék módosítása Jellemzően 20 l FluidMAG-biotin szuszpenziót 3*1 ml foszfát pufferelt sóoldattal (PBS: 0,01 M pH=7,4 PB-ben oldott 0,15 M NaCl) mostam, majd a második mosás után a részecskéket 0,5 ml PBS-ben reszuszpendáltam. (A nanorészecskéket mágneses szeparátorral választottam el a felülúszótól.) Az összegyűjtött részecskékhez meghatározott mennyiségű fehérje-oldatot adtam (ez kísérletenként eltérő volt), és a szuszpenziót 15 percig rázattam (~200 min-1). A szeparálást és a felülúszó leszívását követően a részecskéket ismét 3*1 ml PBS oldattal, majd 3*1 ml PB oldattal mostam, végül a kívánt koncentráció eléréséhez szükséges térfogatú foszfát pufferben szuszpendáltam. 3.3.7.1. Avidin blokkolása biotinnal Az 1 mg/ml-es avidin-oldathoz háromszoros anyagmennyiségű biotin-oldatot adtam 10 részletben, minden részlet hozzáadása után 10 s-ig homogenizálva az oldatot. A teljes mennyiség hozzáadása után az oldatot még 15 percig rázattam, hogy lehetőleg minden biotin kapcsolódjon avidinhoz, s így átlagosan minden avidin molekula 4 kötőhelyéből 3-at blokkoljak. 3.3.8. A visszakötődés kiértékelése A mért abszorbanciákból az alábbiak szerint számoltam a polimereken megkötött fehérje mennyiségét, illetve a felületi borítottságot:  A minták és standard oldatok abszorbanciáiból kivontam az adott mérési sorozatban a vak mintára mért abszorbancia értékét, így megkaptam az egyes mintákra jellemző nettó abszorbanciákat.  A mért nettó abszorbanciából (A, aU) az adott mérés inkubálási idejéhez (t, min) tartozó

kalibrációs

egyenes

meredekségének

(mt,

ml/mg)

segítségével

meghatároztam, hogy milyen koncentrációjú (c, mg/ml) HRP-oldatnak felel meg az az enzimmennyiség, amely a jelet szolgáltatta. A kalibrációs adatokat a Függelék tartalmazza. c

- 31 -

A mt

(1)

 A teljes reakcióelegy térfogatának (V, ml; jellemzően 0,25 ml), és az éppen mért enzimforma (avidin-HRP, biotin-HRP, vagy HRP) moláris tömegének (MW, mg/mmol) ismeretében meghatároztam a polimer filmben lévő (aktív) enzimforma anyagmennyiségét (n, mol). n

cV 10 3 MW

(2)

 A polimer film átmérője (d = 3,5 mm) alapján meghatároztam a sík felszínűnek tekintett polimer molekuláris borítottságát (b, mol/mm2). b

4n d2  

- 32 -

(3)

4. Eredmények és értékelésük Diplomamunkám olyan új, molekuláris lenyomatképzésen és felületi plazmon rezonancia érzékelésen alapuló méréstechnikai eljárás kidolgozását célozta, amely tetszőleges

teljes

fehérjemolekulára

vonatkozó

imprintelési

protokoll

gyors

optimalizálását, és a szenzor kialakításának köszönhetően összetett mintákból többféle célmolekula egyidejű, szelektív detektálását teheti lehetővé. A szakirodalmi áttekintésben nagy részletességgel tárgyalt fehérje-imprintelési módozatok közül a vékony rétegek felületi lenyomatképzését valósítottam meg, de a bemutatott mikro-kontakt imprinteléstől eltérő kivitelezésben. Ennek oka, hogy a választott, az automatizálhatóságot biztosító mikrocseppentési eljárással ez a módszer nem megvalósítható. A felületi lenyomatképzés előnye (a gélek előállításával szemben) a polimer réteg nagyobb kémiai és mechanikai stabilitása. Utóbbihoz hozzájárul a szenzor felületen való kialakítás is, aminek azonban ennél is fontosabb hozadéka, hogy lehetségessé válik nagy számú polimer film gyors és automatizálható előállítása és vizsgálata. Az imprintelési kísérleteimhez használt modellfehérje, az avidin a tojásfehérjében található, tetramer szerkezetű molekula. Mérete 10 nm körüli, és magas izoelektromos pontjának (pI = 10,5) köszönhetően a legtöbb pH-n erősen pozitív töltésű. Az avidin templát és a választott polimer (PEDOT-PSS) között túlnyomórészt hidrogén-hidas és elektrosztatikus kölcsönhatásokra lehet számítani. Az EDOT monomer redox mechanizmusú polimerizációját kémiai és fotokémiai indukálással is elvégeztem, de a legcélravezetőbbnek az elektrokémiai megvalósítás bizonyult. Ehhez létrehoztam egy olyan mikrocseppentő tűt, amelynek segítségével az SPR felületre való felcseppentéssel egyidejűleg valósítható meg a monomerelegy polimerizációja is. Imprintelési kísérleteimet az egyszerűség kedvéért makroszkopikus méretben (a mikrocseppentéshez képest legalább ezerszeres térfogatban) végeztem. Többféle lenyomatképzési módszert, és kétféle elektrokémiai polimerizációs eljárást is kipróbáltam. Kezdetben szabad fehérjét használtam templátként, majd a polimer film vastagságának

jobb

kontrollálhatósága

érdekében

nanorészecskéhez

próbáltam

kapcsolni azokat, így az imprintelhető polimer felület is megnövekszik. További előnyt

- 33 -

jelent, hogy a választott, mágneses nanorészecskék alkalmazása igen gazdaságossá teheti

az

imprintelt

rétegek

előállítását,

hiszen

külső

mágneses

térben

a

nanorészecskéhez kapcsolt fehérje visszanyerhető a polimerből, és így újabb lenyomatképzéshez felhasználható. 4.1. Kémiai és fotokémiai polimerizáció 4.1.1. EDOT kémiai polimerizációja A 3.3.1. szakaszban leírtak szerint elvégeztem az EDOT monomer kémiai polimerizációját, különböző arányban alkalmazott ammónium-perszulfát oxidálószer és N,N,N’,N’-tetrametiléndiamin (TEMED) katalizátor jelenlétében. Az 7. Táblázatban látható, hogy a katalizátor/oxidálószer hányados növelése (V10, V20 minták →V11 minta) jelentősen lecsökkentette a polimerizáció látható megindulásáig szükséges időt, ugyanakkor a polimer végső megjelenése így is több mint 3 óra alatt alakult csak ki. Ráadásul a minta világos színe arra utal, hogy – a nagy arányú gyökképződés következtében – az összefüggő polimer hálózat helyett rövid láncok sokasága jött létre, ami pedig a lenyomatképzés szempontjából célszerűtlen. A fehérjék számára még elviselhető, 10% acetonitrilt tartalmazó közegben nagyobb a monomer oldhatósága, mint tiszta vízben, és a kétszeresére növelt EDOT koncentráció gyorsabban meginduló polimerizációt is eredményezett (A10 és A20 jelű minták), de a reakció teljes végbemenetele változatlanul több órát vett igénybe. Ilyen hosszú idő alatt az SPR szenzoron elhelyezett, igen kis térfogatú csepp már beszárad, vagyis a kémiailag indukált polimerizáció túl lassú a kitűzött cél megvalósításához. minta EDOT-PSS:APS:TEMED

polimerizáció

jele V11

mólarány 1:1:1

kezdete 10 perc

V10

1 : 1 : 0,1

90 perc

V20

1 : 2 : 0,2

30 perc

A10

1 : 1 : 0,1

15 perc

A20

1 : 2 : 0,2

1 perc

polimer végső megjelenése sárga oldat feketés kék oldat kiülepedett fekete szemcsék felett zöldeskék oldat

7. Táblázat: EDOT kémiai polimerizációjának eredménye

- 34 -

4.1.2. EDOT fotokémiai polimerizációja A 3.3.2. szakaszban ismertetett módon, fotokémiai iniciálással is elvégeztem az EDOT polimerizációját. A tömbfázisú és a cseppentett minták is csak a megvilágítás kezdetétől mért 15-30 perc elteltével váltak halvány sárga színűvé, és mindkét esetben csak kisebb foltokban (a tömbfázisú minta esetében a küvetta falán, a folyadékfelszín felett) alakult ki a PEDOT polimerre jellemző fekete szín, több mint 3 óra UV besugárzás után. Ezekben a foltokban valószínűleg bepárlódás, illetve a nem megfelelő oldat-homogenitás következtében lokálisan nagyobb monomer-koncentráció alakult ki, és ez tette lehetővé a polimerizáció gyors, és sűrű hálózatot eredményező lezajlását. Mivel azonban az EDOT maximális vízoldhatósága (10 mM) mellett még lassú és nem teljes a reakció végbemenetele, ezért a fotokémiai polimerizáció sem alkalmas vékony PEDOT filmek kialakítására az SPR szenzor felületén. 4.1.3. Oligotron átoldása vizes közegbe Az EDOT (polimerizálható metakrilát csoportokkal lezárt) oligomerje, az Oligotron, gyorsan polimerizálható UV fényben, de az eredeti oldószere (nitrometán) nem kompatibilis a fehérjékkel. Az oligomert ezért a 3.3.3 fejezetben ismertetett módon megpróbáltam vizes közegbe hozni. Mivel a beszárított oligomer egy része a bepárlócső falára tapadt, és onnan ultrahangos keverő segítségével sem lehetett visszaoldani, ezért csak az eredeti térfogatnál kisebb mennyiségű oldószert alkalmaztam a visszaoldási próba során, hogy ne híguljon jelentősen a minta. Az optikai mikroszkópos vizsgálat alapján a nitrometánban diszpergált oligomerek 1 m-es szemcsék formájában, egymástól elkülönülten, szabadon mozogtak. A metanolban illetve vizes metanolban (1:1) diszpergált mintában a jellemzően 1-2 m-es, összetapadt szemcsék között több, 5-10 m-es nagyságú aggregátum is megtalálható volt. A vizes szuszpenzió meghatározóan 4-8 m-es aggregátumokból állt, de kisebb mennyiségben tartalmazott 1-2 m-es szemcséket is. Az elvégzett kísérletek alapján az Oligotron nem diszpergálható vizes közegben, így fehérjék lenyomatképzésére alkalmatlan.

- 35 -

4.2. Electrospotting tű készítése és vizsgálata Mivel a kémiai és fotokémiai polimerizáció nem bizonyult megfelelőnek, elektrokémiai úton kellett megoldani az EDOT polimerizációját a szenzorfelületen. A mikrocseppentés során egy (előzőleg folyadékba merített) rozsdamentes acél tűt érint a robot a szenzor felületéhez. Ahhoz, hogy a cseppentéssel egyidejűleg valósíthassuk meg az elektrokémiai polimerizációt is, egy olyan, szigetelő anyagból készült kapilláris toldattal kell ellátni a tűt, amelyben azonban a folyadék képes egészen az acél tűvel való érintkezésig felkúszni. Ezt a toldatot a 3.3.4.2. szakaszban leírtak szerint, pipettahegyből készítettem el. Az electrospotting tű – mint felül zárt kapilláris – folyadékba merítésekor a kavitásban lévő légnyomás a kapilláris emelkedés ellen hat, így ahhoz, hogy ugyanolyan magasra feljusson a folyadék, mint egy nyitott kapillárisban, sokkal nagyobb adhézió szükséges a kapilláris belső fala és a folyadék (esetünkben víz) között. Ennek elősegítésére a polipropilén felületet különböző bevonatokkal igyekeztem hidrofilizálni, a 3.3.4.1. szakaszban leírt módszerekkel. Az alkalmazott polielektrolit bevonat hatására javult a felszívóképesség, de továbbra is csak a nyitott hegy szívta föl a folyadékot a kellő magasságig. Egy szabadalmi leirat [64] nyomán poli(vinilpirrolidon) bevonattal is próbálkoztam: az így hidrofilizált, nyitott pipettahegyben igen jól emelkedett a folyadékszint, akárcsak a plazmában kezeltekben. Végül egy plazma-kezelt pipettaheggyel folytattam a próbálkozásokat, és azt tapasztaltam, hogy a rendelkezésre álló vágószerszámokkal kivitelezhető legkisebb kavitásban sem volt képes az acél tűig emelkedni a folyadékszint, a benn szoruló levegőbuborék következtében. A pipettahegy végét ezért ferdére vágtam, és így a víz már elérte az acél tűt. Az így készített electrospotting tűvel reprodukálhatóan sikerült 600 m-es átmérőjű PEDOT filmet létrehozni arany felületen. A továbbiakban az imprintelési kísérleteket – az egyszerűbb kivitelezés kedvéért – makroszkopikus méretekben végeztem.

- 36 -

4.3. Imprintelési kísérletek Az imprintelési kísérleteket egy, a tömbpolimerizációs eljáráséhoz hasonló elegyösszetétellel kezdtem, vagyis a fehérje a monomerelegyben volt oldva. Elektrokémiai polimerizációval vékony polimer filmet hoztam létre, amelyben elviekben a véletlenszerűen elhelyezkedő fehérje molekulák nagy valószínűséggel kerültek volna a felszín közelébe is, és így könnyen hozzáférhető, felületi lenyomatokat képeztek volna (7. ábra a)). Mivel azonban a választott fehérje –a várakozásokkal ellentétben- nem tudott feldúsulni a felületen a polimerizáció ideje alatt, ezért más módszerre tértem át. Ennek során a fehérjéket egy vékony, nem imprintelt polimer rétegre adszorbeáltattam, majd egy olyan vékony polimer filmet próbáltam közéjük növeszteni, amely nem lepi el a őket (7. ábra b)). Az avidin molekulák átmérője mindössze 10 nm körül van, ezért a polimer film vastagságát nagyon pontosan kellene tudni szabályozni. Ez nem sikerült, ezért a templát eltávolítása nehézségekbe ütközött. A polimer vastagságának jobb szabályozhatósága érdekében végül 100 nm átmérőjű nanorészecskéhez kapcsolt fehérjével imprinteltem. Ekkor a nanorészecskéhez kapcsolt templátot már közvetlenül az arany felületre (és nem egy alsó polimer rétegre) vittem fel, majd a nanorészecskék közé PEDOT-PSS réteget polimerizáltam (7. ábra c)).

- 37 -

7. ábra: Diplomamunkámban alkalmazott lenyomatképzési módszerek. a) egy lépéses imprintelés: vékony film előállítása a templátot is tartalmazó monomerelegyből, b) két lépéses imprintelés: vékony polimer réteg létrehozása egy alsó polimer filmre adszorbeáltatott templátok köré, c) imprintelés nanorészecskékkel: vékony polimer réteg létrehozása az arany felületre adszorbeáltatott templátok köré.

4.3.1. Egylépéses imprintelés A fehérje-imprintelési kísérleteket avidin modellfehérjével kezdtem, amelyhez a közvetlen detektálhatóság kedvéért tormaperoxidáz (HRP) enzim volt kapcsolva. Az enzim mennyiségét egy reagens (TMB) nagy feleslegben történő hozzáadásával határoztam meg, amelynek hidrogénperoxiddal történő oxidációját az enzim katalizálja, és amelyből a reakció hatására kék színű termék képződik (jellemző elnyelési hullámhossza 655 nm). Az enzimreakciót tömény kénsavval állítjuk le, amely az enzimet inaktiválja. A sav hatására a termék átalakul, sárga színű lesz (jellemző elnyelési hullámhossza 450 nm). Így az oldat fotometriás mérésekor az abszorbanciából a keletkezett termék mennyisége, illetve ezen keresztül az enzim mennyisége kalibrációval meghatározható.

- 38 -

A 3.3.5.1 szakaszban leírtak szerint különböző vastagságú imprintelt és nem imprintelt polimer filmeket hoztam létre az A összetételű prepolimerizációs elegyek alkalmazásával, kronoamperometriás módon. A vékonyabb filmeket 15 s-ig, a vastagabbakat 30 s-ig polimerizáltam 0,7 V (illetve a fehérjét is tartalmazó elegyek esetében előkísérletek tapasztalataira támaszkodva 0,8 V) potenciálon. A kapott filmek megjelenésbeli sajátosságait a 8. Táblázatban foglaltam össze. A PEDOT filmek sárgás színe 10 nm körüli, míg a kékes szín 10-100 nm-es rétegvastagságra utal. minta jele

prepolimerizációs elegy

alkalmazott potenciál

polimerizáció ideje

áthaladt töltés

megjelenés

E1

A MIP

0,8 V

30 s

1,16 mC

kék réteg

E2

A MIP

0,8 V

15 s

0,635 mC

E3

A NIP

0,7 V

30 s

0,689 mC

E4

A NIP

0,7 V

15 s

0,342 mC

kék gyűrűben sárga réteg világoskék réteg sárga réteg

8. Táblázat: Egylépéses polimerizációval előállított filmek

A polimerekből a 3.3.6.3. szakaszban leírt módon kimostam a templátot: ötször Tween, háromszor PB, végül víz mosóoldatban való kevertetéssel (10-10 percig). A kimosottság ellenőrzését követően 1-1 l 0,1 mg/ml-es avidin-HRP (PB-ben, 10 percig) visszakötődését vizsgáltam az elektródokon, a 3.3.6. szakaszban leírt módon. A kötődés erősségének vizsgálatára a mintákat a 3.3.6.3. szakasz szerint foszfát pufferrel, majd tweenes oldattal mostam, mindkét lépés után megmérve a polimerekben maradt avidinHRP mennyiségét. A mért abszorbanciákból kiszámítottam, hogy az egyes lépések után mekkora a polimer filmek enzim-borítottsága, és a kapott értékeket a Függelékben, valamint a 8. ábrán tüntettem fel. Látható, hogy az imprintelt polimerek nem tudtak a referencia polimerhez képest nagyobb mennyiségű avidin-tormaperoxidázt megkötni, és a megkötött fehérje foszfát pufferrel könnyen lemosódott, azaz nem valósult meg a lenyomatképzés. Úgy véltük, ezt az okozhatta, hogy a polimerizáció során a pozitív potenciálon tartott felülethez a(z alkalmazott pH-n) a szintén pozitív töltésű avidin nem tudott közel jutni. Ennek leküzdésére a következő kísérletekben két lépésben végeztem el az imprintelést.

- 39 -

: E1 (vastag MIP)

: E2 (vékony MIP)

: E3 (vastag NIP)

: E4 (vékony NIP)

felületi borítottság [mol/mm2]

2,50E-15

2,00E-15

1,50E-15

1,00E-15

5,00E-16

0,00E+00 visszakötött

PB

Tween

mosási lépések

8. ábra: Egy lépésben imprintelt polimer filmek által visszakötött avidin-HRP mennyisége. Részletes adatok a Függelékben.

4.3.2. Kétlépéses imprintelés 4.3.2.1. Avidin-HRP-re imprintelt EDOT-PSS filmek Első lépésben kronoamperometriásan, 15 illetve 30 s-ig tartó polimerizációval, 0,7 V feszültséget alkalmazva létrehoztam nem imprintelt rétegeket a B összetételű elegyből. Az imprinteléshez 0,1 mg/ml-es avidin-HRP oldatot adszorbeáltattam a polimerrétegekre, a 3.3.6.1. szakaszban ismertetett módon, és megmértem az adszorbeált fehérje mennyiségét. Az elektródokra (a nem imprintelt mintákra is) ez után újabb 15 s-ig tartó, kronoamperometriás polimerizációval 0,7 V-on egy második PEDOT réteget növesztettem (9. Táblázat). minta jele

polim. ideje

1. réteg áthaladt megjelenés töltés

2. réteg áthaladt töltés

megjelenés zöldeskék réteg

K1 K2

MIP MIP

30 s 15 s

0,647 mC 0,290 mC

világoskék réteg narancssárga réteg

0,196 mC 0,321 mC

K3

NIP

30 s

0,633 mC

világoskék réteg

0,374 mC

K4

NIP

15 s

0,305 mC

narancssárga réteg

0,332 mC

világos, kékeszöld réteg v.kék gyűrűben sárgás réteg

9. Táblázat: Kétlépéses polimerizációval előállított PEDOT-PSS filmek

- 40 -

Miután az imprintelt mintákon megmértem a második PEDOT-PSS rétegből hozzáférhető templát mennyiségét, a polimereket ötszöri tweenes, háromszori foszfát pufferes, végül tiszta víz mosóoldatban való kevertetéssel (10-10 percig) kimostam. A templát eltávolításának ellenőrzése után megmértem az avidin-HRP visszakötődését (1 l 0,1 mg/ml-es avidin-HRP PB-ben, 10 percig), és kétszeri foszfát pufferes, végül tweenes mosással vizsgáltam a kötődés erősségét. Minden lépést követően megmértem a polimerekben lévő fehérje mennyiségét (9. ábra). Nem tapasztaltam szignifikáns különbséget a MIP és a NIP között sem közvetlenül a visszakötődés után, sem a mosási lépéseket követően. : K1 (vastag MI)P

: K2 (vékony MIP)

: K3 (vastag NIP)

: K4 (vékony NIP)

felületi borítottság [mol/mm2]

2,0E-15 1,8E-15 1,6E-15 1,4E-15 1,2E-15 1,0E-15 8,0E-16 6,0E-16 4,0E-16 2,0E-16 0,0E+00 adszorbeált

hozzáférhető

tisztaság ell.

visszakötött

1. PB

2. PB

tween

mosási lépések 9. ábra: Két lépésben imprintelt PEDOT-PSS filmek által visszakötött avidin-HRP mennyisége. Részletes adatok a Függelékben.

A kísérletben az első probléma az volt, hogy az avidin közismerten erős adszorpciós tulajdonsága ellenére az elméleti teljes avidin-borítottság (8,3*10-14 mol avidin/mm2 [65]) töredékét mértem csak a templát alsó polimer rétegen való adszorpciójakor. Feltételeztem, hogy esetleg a nagy ionerősségű monomer-oldat inaktiválja a HRP enzimet, és emiatt tűnt úgy, hogy nagyon kicsi az avidin adszorpciója. Ezért a következő kísérletekben enzim nélküli avidint használtam

- 41 -

templátként, és a mennyiségét közvetetten, biotin-HRP hozzákapcsolásával mértem meg3. A másik probléma az volt, hogy a felső polimer réteg elkészülte után már csak nagyon kis avidin-HRP mennyiség volt mérhető, ami arra utalhat, hogy a polimer réteg nagyrészt beborította az avidin-HRP-t. Valószínű, hogy ezután nem is tudtam rendesen kimosni, vagyis a kötőhelyek nem szabadultak fel. 4.3.2.2. Avidinre imprintelt EDOT-PSS filmek Az új mintákat az előzőekhez hasonló módon készítettem el, azzal a különbséggel, hogy az imprinteléshez most avidin-HRP helyett 0,1 mg/ml avidin oldatot használtam, illetve az alsó polimer réteget minden esetben 15 s-ig tartó polimerizációval hoztam létre. Mivel az előző tapasztalatok azt mutatták, hogy még a 15 s-ig polimerizált felső réteg is beborítja a fehérjét (9. ábra), ezért az új minták esetében vékonyabb felső réteget készítettem: 5 s-ig tartó polimerizációval (10. Táblázat). A korábbihoz hasonlóan, de most biotin-HRP kapcsolásán keresztül (3.3.6.1.) megmértem a második PEDOT-PSS rétegből hozzáférhető templát mennyiségét, majd a polimereket ötszöri tweenes, háromszori foszfát pufferes, végül tiszta víz mosóoldatban való kevertetéssel (10-10 percig) kimostam. A templát eltávolításának ellenőrzése után megmértem az avidin visszakötődését a rétegekbe (1 l 0,1 mg/ml-es avidin PB-ben 30 percig, majd 0,5 mg/ml biotin-HRP kapcsolása PB-ből 30 percig), és pufferes mosással vizsgáltam a kötődés erősségét, utóbbi esetben már újabb biotin-HRP kapcsolása nélkül (10. ábra).

3

A biotin molekula az avidinnel a legerősebb ismert ligandum-fehérje kölcsönhatást létesíti, 15

ponton lépnek fel másodlagos kötőerők a kisméretű biotin molekula és az avidin között. A kialakuló komplex stabilitási állandója 1015 M-1.

- 42 -

minta jele

alsó réteg (15 s) áthaladt töltés megjelenés (mC)

felső réteg (5 s) áthaladt töltés megjelenés (C)

K5

MIP

0,135

47,2

K6

MIP

0,208

64,8

K7

MIP

0,300

79,7

K8

MIP

0,287

K9

NIP

0,210

103

K10

NIP

0,228

102

K11

NIP

0,260

114

K12

NIP

0,262

99,2

sárga réteg

33,1

sárga réteg

10. Táblázat: Kétlépéses polimerizációval, avidinre imprintelt PEDOT-PSS filmek

felületi borítottság [mol/mm2]

MIP

NIP

1,00E-15

5,00E-16

0,00E+00 hozzáférhető

tisztaság ell.

visszakötött avidin

PB

(biotin nélk.)

10. ábra: Két lépésben imprintelt PEDOT-PSS filmek által átlagosan visszakötött avidin mennyisége, detektálás biotin-HRP kapcsolásával. A hibasávok a 2 ill. 4 párhuzamos mérés terjedelmét jelölik, részletes adatok a Függelékben.

A biotin-HRP-vel történő detektálásnak (amely enzimforma nem érintkezett a monomer oldattal), illetve a vékonyabb felső polimer rétegnek köszönhetően mintegy két nagyságrenddel nagyobb mennyiségű hozzáférhető fehérjét mértem a két rétegű

- 43 -

polimerben a polimerizáció befejezte után. Az avidin visszakötődése némileg nagyobb volt az imprintelt polimeren, mint a nem-imprintelten, bár a mérés szórása meglehetősen nagy volt. A visszakötődés erőssége azonban továbbra sem bizonyult megfelelőnek, hiszen a foszfát pufferes mosás után most sem volt jelentős különbség az imprintelt és a referencia polimerben megtartott fehérje mennyisége között. A harmadik kísérlet-sorozatban a nagyobb erősségű kötőhelyek kialakítása érdekében maleinát egységeket is tartalmazó poli(nátrium-4-sztirolszulfonát)-ra (PSSM) cseréltem az EDOT ellenionját. Ez új funkciós csoportokat; gyengén savas karboxilcsoportokat is tartalmaz az erősen savas szulfonsavcsoportok mellett és várhatóan több ponton tud kölcsönhatást kialakítani a fehérjével. 4.3.2.3. Avidinre imprintelt EDOT-PSSM filmek A második kísérlet-sorozattal azonos módon, de a C összetételű prepolimerizációs elegyet (3.3.5.1) alkalmazva, elkészítettem a 11. Táblázatban felsorolt, avidinre imprintelt, két rétegű polimereket. A második rétegből hozzáférhető templát mennyiségét biotin-HRP kapcsolásával megmértem, majd a polimereket ötszöri tweenes, háromszori foszfát pufferes, végül tiszta víz mosóoldatban való kevertetéssel (10-10 percig) kimostam. A templát eltávolításának ellenőrzése után megmértem az avidin visszakötődését a rétegekbe (1 l 0,1 mg/ml-es avidin PB-ben 30 percig, majd 0,5 mg/ml biotin-HRP kapcsolása PB-ből 30 percig), és pufferes mosással vizsgáltam a kötődés erősségét, utóbbi esetben már újabb biotin-HRP kapcsolása nélkül. A visszakötődés mérését kétszer végeztem el (11. ábra).

minta jele

alsó réteg (15 s) áthaladt töltés megjelenés (mC)

felső réteg (5 s) áthaladt töltés megjelenés (C) 53,0

K13

MIP

0,136

K14

MIP

0,164

K15

MIP

0,157

K16

NIP

0,152

74,1

K17

NIP

0,164

84,2

K18

NIP

0,132

72,3

58,5 sárga réteg

54,3

narancssárga réteg

11. Táblázat: Kétlépéses polimerizációval, avidinre imprintelt PEDOT-PSSM filmek

- 44 -

felületi borítottság [mol/mm2]

MIP

NIP

1,5E-15

1,0E-15

5,0E-16

0,0E+00 hozzáférhető tisztaság ell. visszakötött PB-s mosás tisztaság ell. visszakötött PB-s mosás (adszorbeált) után után

11. ábra: Két lépésben imprintelt PEDOT-PSSM filmek által átlagosan visszakötött avidin mennyisége. A hibasávok a 3 párhuzamos mérés terjedelmét jelölik, részletes adatok a Függelékben

A 11. ábrán látható, hogy a visszakötődés jól reprodukálható volt, de továbbra sem tanúskodott sikeres lenyomatképzésről; nem volt különbség az imprintelt és a nem imprintelt rétegek között, és az enyhe pufferes mosás is eltávolította a visszakötött fehérje zömét. A változatlanul alacsony szintű templát-hozzáférhetőség azt sejteti, hogy az 5 s alatt létrehozott polimer réteg is olyan vastag, hogy befedi a fehérjét. A továbbiakban ezért 100 nm átmérőjű, mágneses nanorészecskéhez kapcsolt fehérjével próbáltam imprintelni. Így az arany felületre rendezett nanorészecskék közé akár 50 nm vastag polimer réteg is növeszthető (szemben a fehérje saját mérete által megengedett 5 nm-es vastagsággal), anélkül, hogy a nanorészecskék – és velük a fehérjék – eltemetődnének (7. ábra c)).

- 45 -

4.3.3. Imprintelés nanorészecskéhez kapcsolt templáttal A vasoxid maggal rendelkező, keményítő mátrixszal bevont nanorészecskéket biotiniláltan vásároltuk. A termék specifikációban szereplő adatok alapján egy nanorészecskéhez

átlagosan

mintegy

500

biotin

kapcsolódik

(számítások

a

Függelékben: 8.3). A szemcsék paramágneses tulajdonságúak, vagyis önmagukban nem mágnesesek, de külső mágneses tér segítségével elválaszthatóak az oldatfázistól. A több vasoxid mag következtében a szemcsék az imprintelési mechanizmust bemutató ábrával (7. ábra.) ellentétben szabálytalan alakúak (12. ábra).

12. ábra: TEM felvétel az összetapadt vasoxid magokról [66]

4.3.3.1. Nanorészecskék módosítása avidinnel A biotiniláltan vásárolt nanorészecskékhez a 3.3.7. fejezetben ismertetett módon próbáltam avidint kapcsolni. Mivel a kapcsoláshoz a gyártó nem adott meg kidolgozott eljárást, az első kísérletben a gyártó egy másik, hasonló termékéhez tartozó kapcsolási protokollt adaptáltam [67], és így a fluidMAG-biotin termék specifikációjában szereplő elméleti avidin-kötő kapacitás (1,4·10-11 mol avidin/l fluidMAG-biotin szuszpenzió) 1,8-szeresét adtam a nanorészecskékhez. Mivel azonban egy avidin négy biotint is megköthet, így a módosító fehérje összekapcsolta a nanorészecskéket, és szabad szemmel is látható aggregátumok keletkeztek (13. ábra). A 2-4. kísérletekben (12. Táblázat) ezért még nagyobb avidin-feleslegeket alkalmaztam, de ez sem szorította vissza az aggregációt. Az 5. kísérletben megpróbáltam az avidin négy kötőhelyéből átlagosan hármat előzetesen szabad biotinnal lekötni (3.3.7.1), majd a blokkolt avidinnel módosítani a fluidMAG-biotin részecskéket, de ez sem hozta meg a várt eredményt.

- 46 -

módosított fluidMAG-biotin szuszpenzió

módosító fehérje-oldat (0,5 mg/ml, PBS-ben)

alkalmazott avidin-

megjegyzés

felesleg

1.

20 l

160 l avidin-HRP

1,8x

2.

20 l

200 l avidin

5x

3.

4 l

80 l avidin

10x

4.

4 l

160 l avidin

20x

5.

20 l

100 l 1mg/ml-es avidin

2,5x

blokkolt avidin

6.

5 l

48,5 l avidin

5x

szuszpenzió

7.

5 l

48,5 l avidin

5x

blokkolt avidin, szuszpenzió

12. Táblázat: FluidMAG-biotin részecskék módosítása

Valószínűleg az alkalmazott igen nagy avidin-feleslegek azért nem tudták megakadályozni az aggregátum-képződést, mert az összegyűjtött nanorészecskékhez történő hozzáadásukkor – a vortexelést megelőző pillanatokban – lokálisan éppen az összetömörített nanorészecskék voltak nagy feleslegben. Ahhoz, hogy az avidin valóban minden pillanatban feleslegben lehessen, a nanorészecskéknek híg szuszpenzióban kell lenniük, amikor a fehérjével találkoznak. Ennek megvalósítására a 6. kísérletben a szokott módon megmosott nanorészecskékből 160 l foszfát pufferes szuszpenziót készítettem, amelyet 10 részletben adagoltam az ötszörös feleslegnyi avidint tartalmazó oldathoz. A nanorészecske-szuszpenzió minden részletének hozzáadása után 10 s-ig homogenizáltam az elegyet, majd a teljes mennyiség hozzáadása után további 15 percig rázattam, végül 3.3.7. szakaszban leírtak szerint mostam a részecskéket.

- 47 -

a)

b)

13. ábra: Elektronmikroszkópos felvétel arany felületre szárított, a) avidinnel módosított (12. Táblázat/2.), illetve b) módosítatlan nanorészecskékről. Látható, hogy míg a módosítatlan szemcsék homogén borítást adnak, addig a módosított nanorészecsék aggregálódtak, s csak kis hányaduk van jelen egyedi szemcseként.

A szuszpenziós módosítás is aggregátumok képződéséhez vezetett, még blokkolt avidin alkalmazásával is, ezért az avidin-tormaperoxidázzal módosított szemcsékből megfelelően híg szuszpenziót készítettem foszfát pufferben, amit kettéosztottam. A szuszpenzió egyik felét 3 s-ig ultrahangos keverővel kezeltem. Ennek hatására az aggregátumok szétestek, és homogén, sárga oldatot kaptam. Kontrollként a 10-4 mg/mles avidin-HRP oldat (PB-ben) egyik felét ugyanígy kezeltem ultrahanggal, majd a 3.3.6.2. szakaszban leírt módon meghatároztam az ultrahanggal kezelt és nem kezelt minták aktivitását.

- 48 -

nettó abszorbancia [aU]

: FluidMAG-hoz kapcsolt (F)

: 0,0001 mg/ml szabad (S)

4,00 3,50 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00 nem kezelt

ultrahangozott

14. ábra: Ultrahangos kezelés hatása a tormaperoxidáz enzim aktivitására. A hibasávok a két-két párhuzamos mérés egyedi értékeit mutatják. Részletes adatok a Függelékben.

A 14. ábrán látható, hogy a szabad avidin-HRP aktivitása kevesebb mint kétharmadára

csökkent

az

ultrahangos

kezelés

hatására.

Ugyanakkor

a

nanorészecskéhez kapcsolt enzimet tartalmazó mintában jelentősen megnövekedett az enzimaktivitás. Ezt feltehetően az aggregátumok szétesése okozta, hiszen így jelentős mennyiségű enzim került jól hozzáférhető helyzetbe. Habár az ultrahangos kezeléssel sikerült aggregátumoktól mentes (15 percen túl ülepedő) fehérje-módosítású nanorészecskéket előállítani, az ultrahang fehérje-károsító hatása miatt ezt a módszert nem tudtam elfogadni. A nanorészecskék aggregáció-mentes avidin-módosításának nehézségei miatt a további kísérleteimet módosítatlan nanorészecskékkel végeztem.

- 49 -

4.3.3.2. Módosítatlan nanorészecskék vizsgálata Cseppentési előkísérlet A fluidMAG-biotin szuszpenzióból háromszori vizes mosással eltávolítottam a termék tartósítására használt nátrium-azid nyomokat4, majd 0,3, illetve 0,06 mg/ml koncentrációjú vizes szuszpenziókat készítettem a részecskékből. Mivel korábbi tanszéki mérések azt mutatták, hogy a templát az aranyon is jól adszorbeálódik, ezért a nanorészecskés imprintelési kísérletekben már elhagytam az alsó polimer réteget, és a fluidMAG-biotin

szuszpenziók

5-5 l-ét

megtisztított

SPR

szenzor

felületére

pipettáztam. Mindkét koncentrációból egy-egy mintát enyhén (~200 min-1), illetve intenzíven rázatva (2000 min-1) beszárítottam. Azt tapasztaltam, hogy az enyhén mozgatott mintákon a nanorészecskék szoros illeszkedésű, önrendeződő réteget képeztek, az eredeti cseppmérethez képest (a felületre szárított nanorészecskék számával közel arányosan) csökkent területen (15. ábra). Intenzív rázatás hatására szabálytalan alakú, inhomogén foltok keletkeztek, így a nanorészecskék felvitelét a továbbiakban enyhe rázatással valósítottam meg. Mivel a 6. ábra b) részén látható cella elrendezéssel az 5 l-es cseppek méreténél nagyobb, 3,5 mm átmérőjű polimer film hozható létre, ezért a beszárítást 20 l-ből is elvégeztem. Az így elérhető mintegy 5 mm átmérőjű

cseppterület

leghomogénebb

borítását

0,15 mg/ml-es

szuszpenzió

rászárításával kaptam, ezért ezt a koncentrációt alkalmaztam a továbbiakban.

15. ábra: Arany felületre szárított 5-5 l fluidMAG-biotin szuszpenzió – a nanorészecskék szoros illeszkedésű önrendeződése – optikai mikroszkópos felvétel

4

A nátrium-azid a HRP enzim aktivitását jelentősen csökkenti.

- 50 -

Nanorészecskék jelenlétének vizsgálata Megtisztított SPR chipekre nem módosított fluidMAG-biotin szemcséket szárítottam, majd a 3.3.5.2. szakaszban bemutatott módon a C összetételű elegyből polimer filmet hoztam létre a chipeken. A filmvastagság jobb szabályozhatósága érdekében a korábbi kronoamperometriás módszer helyett potenciál pulzusokat alkalmaztam [68]. A 250 illetve 500 ciklussal5 polimerizált filmek egy részét 5 percig vízben ultrahangoztam, hogy eltávolítsam a nanorészecskéket. Elektron-

illetve

atomerő

mikroszkópos

felvételek

alapján

próbáltam

megállapítani, hogy az imprintelt polimer rétegekben maradtak-e nanorészecskék az ultrahangos fürdőben való mosás után. Az elektronmikroszkópos felvételek (17. ábra) ugyan közvetlenül nem hasonlíthatóak össze, mivel különböző nagyítással készültek, de az megállapítható, hogy a SEM felbontása nem elegendő ahhoz, hogy különbséget tehessünk a templátot tartalmazó és nem tartalmazó minták között. Az elektronmikroszkóppal a polimer rétegek

határáról

készített

elemösszetétel-térkép

sem

mutatott

egyértelműen

elkülöníthető vas-gazdag és vas-szegény régiókat, holott a polimert nem tartalmazó felületrészen

nem

lehettek

vasoxid

magú

nanorészecskék,

míg

a

vizsgált

polimerfilmben számosan voltak. A nanorészecskék jelenléte az atomerő mikroszkóppal készített képeken sem volt egyértelműen megállapítható.

5

Ezek a ciklusszámok 12,5 ill. 25 s-ig tartó kronoamperometriás polimerizációnak felelnek meg.

- 51 -

16. ábra: SEM felvételek a különböző vastagságú imprintelt polimer rétegekről. a) 250 ciklus, mosott, b) 500 ciklus, mosott, c) 250 ciklus, nem mosott, d) 500 ciklus, nem mosott. A felvételek különböző nagyítás mellett készültek.

Az is lehetséges, hogy a mikroszkópos vizsgálat azért nem mutatott különbséget az ultrahangos fürdőben kezelt és a nem mosott polimerek között, mert a templátot nem is sikerült eltávolítani annak következtében, hogy az alkalmazott ciklusszámok túl vastag PEDOT-PSS réteget eredményeztek. A továbbiakban ezért megpróbáltam meghatározni egy-egy adott ciklusszámmal kialakítható polimer vastagságát. Nem imprintelt polimer réteg vastagságának meghatározása A pulzus technikával létrehozott filmek vastagságát először nem imprintelt polimeren vizsgáltam. A 3.3.5.2. szakaszban bemutatott módon 250, 500 és 750

- 52 -

ciklussal PEDOT-PSS rétegeket hoztam létre a B összetételű prepolimerizációs elegyből. A filmek vastagságát profilométerrel határoztam meg. A mérésekből látszott, hogy a polimer teljes vastagsága csak lassan épül ki , vagyis a folt szélén vékonyabb a film, mint a közepén. A különböző ciklusszámokkal készült filmek vastagságát a 13. Táblázatban tüntettem fel.

minta jele

ciklusszám

megjelenés

vastagság

N1

NIP

250

sötét sárga réteg

40-50 nm

N2

NIP

500

barnás színű réteg

50-60 nm

N3

NIP

750

szürkés barna réteg

80-90 nm

13. Táblázat: Nem imprintelt polimer filmek vastagsága

Imprintelt polimer réteg vastagságának meghatározása Megtisztított chipekre 20-20 l 0,15 mg/ml-es fluidMAG-biotin szuszpenzióból nanorészecskéket szárítottam, majd a 3.3.5.2. szakaszban leírt módon 25, 50, 100 illetve 200 polimerizációs ciklust alkalmazva hoztam létre az imprintelt filmeket (szintén a B összetételű elegyből). A nem imprintelt rétegek mérései alapján a 250 ciklussal létrehozott, 40-50 nm-es vastagság lenne a legmegfelelőbb, mivel azonban a nanorészecskék jelenléte jelentősen lecsökkenti a PEDOT által kitöltendő térfogatot, nyilvánvaló, hogy az imprintelt filmeknél azonos filmvastagság eléréshez kisebb ciklusszám szükséges, mint a nem imprintelteknél. A polimerek vastagságát egy műanyag csipesz szárával ejtett karcolás mentén atomerő mikroszkóppal vizsgáltam, kontakt módban. A Függelékben (8.5) részletesen bemutatott mérési eredmények alapján nem lehetett egyértelműen meghatározni, hogy egy adott ciklusszám milyen polimer vastagságot eredményez. Továbbá, az imprintelt filmek esetében igen rosszul reprodukálható

a

rétegvastagság,

ami

valószínűleg

az

arany

szubsztrát

szennyezettségének tudható be. Ez ugyanis hatással van a nanorészecskék rendeződésére, és ezáltal a polimer réteg növekedésére.

- 53 -

Mivel a legkisebb ciklusszámokkal készült polimert megfelelő vastagságúnak (4050 nm) mértem, ezért megpróbáltam egy-egy ilyen filmet a lenyomatképzés szempontjából is jellemezni. Imprintelt polimer réteg vizsgálata A C összetételű prepolimerizációs elegyből két-két 25 (N4, N5) ill. 50 (N6, N7) ciklussal polimerizált PEDOT réteget növesztettem a chipre felvitt biotinilált nanorészecskékre. A nanorészecske templátot a chipek 30 percig PBS-ben való ultrahangozásával, majd vizes öblítéssel próbáltam eltávolítani. Ezután mértem a biotinHRP visszakötődését (8 l 0,5 mg/ml biotin-HRP PB-ben, 30 perc inkubáció) a 3.3.6.1. szakaszban leírt módon. Azt, hogy a kötődés szelektív-e, biotin nélküli tormaperoxidáz enzim (8 l 0,5 mg/ml HRP PB-ben, 30 perc inkubáció) adszorbeáltatásával vizsgáltam. : biotin-HRP

: HRP

felületi borítottság [mol/mm 2]

3,0E-15 2,5E-15 2,0E-15 1,5E-15 1,0E-15 5,0E-16 0,0E+00 25 ciklus

50 ciklus

17. ábra: Biotin-HRP és HRP visszakötődése fluidMAG-biotinra imprintelt polimereken. A hibasávok a két-két párhuzamos mérés egyedi értékeit mutatják. Részletes adatok a Függelékben.

A 16. ábrán látható, hogy a vizsgált polimerek a vastagságuktól függetlenül közel azonos mennyiségű biotin-HRP-t kötöttek meg, és ez a kötődés nem volt specifikus, hiszen a tormaperoxidáz enzimből is nagyjából ugyanannyi kötődött meg. Mivel a visszakötött biotin-mennyiség az elméletileg várhatónak csak 5-6%-a (részletes számítások a Függelékben: 8.4), ezért valószínűsíthető, hogy a kötőhelyek nem hozzáférhetőek., vagyis a polimer réteg mégis túl vastag lett, és a nanorészecskék - 54 -

nem tudtak deszorbeálódni, illetve a polimerből kiszakadni az ultrahangos fürdő hatására. A továbbiakban ezért azt próbáltam megállapítani, hogy milyen ciklusszám eredményez olyan polimer-vastagságot, amelyben a lehető legtöbb kötőhely tud kialakulni, de a nanorészecskék még eltávolíthatóak. Templát eltávolíthatóságának vizsgálata Az ultrahangozásnál hatásosabb módszerrel, a nanorészecskék oxálsavval történő feloldásával vizsgáltam, hogy különböző a ciklusszámmal polimerizált filmekből valóban eltávolítható-e a templát. A jelen lévő biotin mennyiségét avidin-HRP hozzákapcsolásán keresztül mértem meg. Azt is vizsgáltam, hogy az oxálsavas kioldás előtt a polimer rétegek mennyire borítják be a nanorészecskéket. A B összetételű prepolimerizációs elegyből különböző vastagságú imprintelt, és egy nem imprintelt polimer réteget hoztam létre (14. Táblázat), valamint készítettem egy olyan mintát is, amelyre csak rászárítottam a nanorészecskéket, de nem hoztam létre rajta polimer filmet. minta jele

minta típusa

ciklusszám

N4

N9

NIP

25

N5

N10

MIP

25

N6

N11

MIP

50

N7

N12

MIP

200

csak rászárítva

0

N8

14. Táblázat: Minták a nanorészecskék jelenlétének vizsgálatához

A polimereken 5-5 l 0,5 mg/ml-es avidin-HRP-oldatot (PB-ben) inkubáltam 30 percig a 3.3.6.1. szakasznak megfelelően, majd a nem specifikus avidin-kötődés megbontása érdekében a mintákat 10 s-ig 0,05% Tweent és 0,13 M NaCl-ot tartalmazó foszfát pufferrel (PBS-Tween), majd vízzel mostam spriccflaskából, és végül megszárítottam őket. A templátként jelen lévő és hozzáférhető (illetve az arany felületre szárított) fluidMAG-biotin mennyiségét így a hozzá kapcsolt avidin-HRP segítségével mértem meg, a 3.3.6.2. szakaszban leírt módon. Ezt követően a mintákat üveghenger aljára helyeztem, és 500 l 0,1 M-os oxálsav-oldattal (pH = 4, NaOH-oldattal beállítva) 17 órán keresztül rázattam - 55 -

(200 min-1). Előkísérletek alapján ennek hatására a fluidMAG-biotin részecskék feloldódnak, így a kezelést követő vizes öblítés után a nanorészecskék kioldottnak tekinthetőek a mintákból. Ennek ellenőrzésére a megszárított mintákon ismét avidinHRP-t inkubáltam, a kioldás előttivel azonos módon, és szintén meghatároztam a specifikusan kötődött avidin-HRP mennyiségét. Az oxálsavas kioldás előtti mérésektől azt vártam, hogy míg a nem imprintelt filmen csak az avidin-HRP nem specifikus adszorpciója jelenik meg, addig a nanorészecskéket

is

tartalmazó

mintákon

jelentős

specifikus

kötődés

lesz

megfigyelhető, amely csökkenni fog a polimerizációs ciklusszám növekedésével (ide értve a 0 ciklussal készült, rászárított mintát is). A növekvő ciklusszámmal ugyanis egyre vastagabb polimer réteg képződik a nanorészecskék körül, amelyeknek így egyre kisebb felülete marad hozzáférhető, s ezáltal a felületükön egyenletesen eloszló biotinokból mind kevesebbhez tud avidin-HRP kötődni. Miután a templátot oxálsavban feloldottam, és kiöblítettem a polimerekből, azt vártam, hogy az imprintelt és nem imprintelt mintákon sem lesz biotin kimutatható, vagyis csak az avidin-HRP nem specifikus adszorpcióját fogom mérni. : kioldás után

felületi borítottság [mol/mm

2

]

: kioldás előtt 8,0E-15 7,0E-15 6,0E-15 5,0E-15 4,0E-15 3,0E-15 2,0E-15 1,0E-15 0,0E+00 NIP 25 ciklus

rászárított

MIP 25 ciklus

MIP 50 ciklus

MIP 200 ciklus

18. ábra: Hozzáférhető biotin mennyisége oxálsavas kezelés előtt és után. A hibasávok a két-két párhuzamos mérés egyedi értékeit mutatják. Részletes adatok a Függelékben.

A 18. ábrán bemutatott eredmények alapján a PBS-Tween mosással meg nem bontható nem specifikus avidin-HRP kötődés mértéke a PEDOT-PSS rétegen illetve az arany felületen is ~1,9·10-15 mol/mm2 (a nem imprintelt filmek mérései, illetve a

- 56 -

rászárított minta kioldás utáni mérése alapján). Az imprintelt filmeken a kioldás után mérhető, ennél valamivel nagyobb enzimaktivitás a nanorészecskék alkalmazásának köszönhetően megnövekedett polimer felületnek tudható be. A nanorészecskék oxálsavas kioldását követő mérésekből sajnos a várt tendencia nem volt megfigyelhető, vagyis a növekvő rétegvastagsággal nem csökkent az adszorbeálódó avidin-HRP mennyisége. Ezeknél a méréseknél egyöntetűen igen alacsony enzimaktivitások adódtak. Ezt az okozhatta, hogy az arany felületre szárított nanorészecskék

még

tartalmazhattak

nátrium-azidot,

amelynek

már

nyomnyi

mennyisége is inaktiválja a tormaperoxidáz enzimet [69]. Ezeket a kísérletek tehát jobban kimosott nanorészecskékkel érdemes lenne megismételni.

- 57 -

5. Összefoglalás Diplomamunkámban felületi plazmon rezonancia szenzorhoz kapcsolt fehérje lenyomatú polimer vékonyrétegek előállításával foglalkoztam. Kutatásaim kitűzött célja volt egy olyan módszer kifejlesztése, mellyel az SPR szenzor felületére közvetlenül vihetőek fel különböző összetételű prepolimerizációs elegyek, mikrocseppentő robot segítségével, és ott valamilyen módon bepolimerizálhatóak. Az így előállított polimer filmek mosása, és a fehérje kötődési mérések az iSPR készülék átfolyó cellájában valósíthatóak meg, lehetőséget teremetve ezzel nagyszámú minta egyidejű vizsgálatára, és így a prepolimerizációs elegy összetételének gyors optimalizálására is. Mivel a tanszéken korábban már sikeresen készítettek felületen imprintelt nanorudakat poli(eitléndioxitiofén)-ből (PEDOT), ezért kísérleteimhez ezt a polimert használtam. Megvizsgáltam a szenzor felületen való polimerizáció megvalósításának lehetőségét, és megállapítottam, hogy a kémiai úton, illetve UV besugárzással indukált polimerizáció nem elég gyors: nem tud teljesen végbemenni, mielőtt az alkalmazandó igen kis csepptérfogat beszáradna. A választott monomer polimerizációját ezért elektrokémiai

úton

valósítottam

meg.

Ennek

a

prepolimerizációs

elegy

felcseppentésével egyidejű végrehajtásához létrehoztam egy ún. electrospotting tűt, mely a mikrocseppentő robot tűjének egy szigetelő, hidrofilizált felületű toldattal kiegészített változata. Az SPR szenzor arany felületén (mint munkaelektródon) a toldatos, rozsdamentes acél cseppentő tű (mint ellenelektród) segítségével sikerült 0,6 mm átmérőjű PEDOT filmeket előállítanom. Az imprintelési kísérleteket makroszkopikus méretekben végeztem, avidin modellfehérjével. Kezdetben olyan módszert alkalmaztam, amelynek során a templátot is tartalmazó monomerelegyből egy lépésben hoztam létre vékony polimer filmeket. Ezekben a fehérje véletlenszerű eloszlása, illetve a polimer film igen vékony volta miatt a fehérjék jelentős része a felszín közelében helyezkedett volna el, ezáltal jól hozzáférhető, felületi lenyomatok alakultak volna ki. Mivel azonban az elektrokémiai polimerizáció során pozitív potenciálon tartott felületen az avidin nem dúsult fel, ezért más módszert kellett választani. A továbbiakban egy alsó, nem imprintelt polimer rétegre adszorbeáltattam a fehérje molekulákat, majd megpróbáltam közéjük olyan vékony (mintegy 5 nm-es)

- 58 -

polimer filmet növeszteni, amely a molekulák fél magasságáig ér. Így azok könnyen eltávolíthatóak a polimerből, amelyben jól megközelíthető lenyomatokat hagynak hátra. A kívánt rétegvastagságot azonban nem sikerült előállítani, ezért olyan módszert kerestem, amely lehetővé teszi, hogy vastagabb polimer filmet növesszek. Ezt biztosíthatja a fehérjék hozzákapcsolása egy náluk jóval nagyobb, 100 nm átmérőjű nanorészecskéhez. Így már akár 50 nm vastag polimer réteg is létrehozható a szenzor felületre adszorbeáltatott templátok köré. Ezen kísérleteimben már elhagytam az alsó polimer réteget, mert korábbi tanszéki eredmények arra mutattak, hogy a templát az arany

felületen

is

megfelelően

adszorbeálódik.

Munkám

során

mágneses

nanorészecskéket használtam, ezek segítségével a fehérjék károsodás nélkül visszanyerhetőek a polimerből, és újabb lenyomatképzésben felhasználhatóak. Mivel egyelőre – az alkalmazott nagy avidin-felesleg, illetve egyéb kezelések ellenére – nem tudtam megoldani a nanorészecskék aggregáció nélküli avidinmódosítását, ezért a vázolt imprintelési módszert módosítatlan (biotiniláltan vásárolható) részecskékkel vizsgáltam. A filmvastagság jobb kézben tartása érdekében a korábbi

kronoamperometriás

módszer

helyett

potenciál

pulzusokat

ismételve

növesztettem polimer rétegeket a nanorészecskék köré, és igyekeztem megállapítani azt a ciklusszámot, amely a megfelelő polimer vastagságot eredményezi. Ezt az értéket még nem sikerült meghatároznom, mivel nem volt jól reprodukálható a filmvastagság, amit feltehetően a szenzor felület szennyezettsége okozott. Ez ugyanis hatással van a nanorészecskék önrendeződésére, és ezáltal befolyásolja a polimer réteg növekedését. További

kísérletekben

új

SPR

szenzorral

dolgozva

várható,

hogy

a

nanorészecskéket még éppen nem csapdázó polimer réteg vastagsága, illetve az ennek előállításához szükséges polimerizációs paraméterek megállapíthatóak lesznek. A biotinilált nanorészecskék avidin-módosítása szintén további kutatások tárgya, és megoldását követően (esetleg más, eleve fehérje módosítású mágneses nanorészecskék alkalmazásával) a kötőhelyek vizsgálatára lehet térni. Az igen vékony polimer filmek előállítására is alkalmas pulzus technikára csak a nanorészecskék bevezetésekor tértem át, érdemes lehet azonban ezt a technikát használva a szabad fehérjék imprinteléséhez is visszanyúlni. Így ugyan elvész a templát visszanyerhetősége, de a módszer egyszerűbben adaptálható tetszőleges fehérjével való imprintelésre, mint a nanorészecskék módosítását is tartalmazó protokoll. - 59 -

6. Köszönetnyilvánítás Elsősorban szeretném megköszönni témavezetőmnek, Dr. Horváth Violának a diplomamunka elkészítésének minden fázisában nyújtott segítségét és támogatását. Köszönettel tartozom Dr. Gyurcsányi Ervin Róbertnek is, amiért ötleteivel, szakmai tanácsaival számos alkalommal segített a kísérleteimet továbblendíteni egy-egy holtpontról. Szerteágazó műszeres mérési eredményeim nem jöhettek volna létre a BME Elektronikai Technológia Tanszék munkatársainak mindig készséges segítsége nélkül. Ezúton szeretnék köszönetet mondani a mérések szervezéséért Molnár László Milánnak, a profilometriás mérés kivitelezéséért Bonyár Attilának, a SEM felvételek elkészítéséért Rigler Dánielnek, és a hosszas AFM méréseket elvégző Dávid Szabolcsnak. Köszönöm továbbá Fürjes Péternek (KFKI), hogy a pipettahegyek plazma kezelésével hozzájárult a kísérleteim sikeréhez. Végül, de nem utolsó sorban szeretnék köszönetet mondani barátomnak, Erdőssy Jánosnak a kézirat gondos átolvasásáért, a gépelési és stilisztikai hibák kiszűréséért, valamint szüleimnek az egyetemi tanulmányaim folytatásához nyújtott erkölcsi és anyagi támogatásáért.

- 60 -

7. Irodalomjegyzék 1.

Sellergren B: Direct drug determination by selective sample enrichment on an imprinted polymer. Analytical Chemstry, 1994, 66:1578-1582

2.

Mullett WM, Lai EPC: Determination of theophylline in serum by molecularly imprinted solid-phase extraction with pulsed elution. Analytical Chemistry, 1998, 70:3636-3641

3.

Beltran A, Marcé RM, Cormack PAG, Borrull F: Synthesis by precipitation polymerisation of molecularly imprinted polymer microspheres for the selective extraction of carbamazepine and oxcabazepine from human urine. Journal of Chromatography A, 2009, 1216:2248-2253

4.

Matsui J, Miyoshi Y, Doblhoff-Dier O, Takeuchi T: A molecularly imprinted synthetic polymer receptor selective for atrazine. Analytical Chemistry, 1995, 67:4404-4408

5.

Haupt K, Dzgoev A, Mosbach K: Assay system for the herbicide 2,4dichlorophenoxyacetic acid using a molecularly imprinted polymer as an artificial recognition element. Analytical Chemistry, 1998, 70:628-631

6.

Horváth V, Lorántfy B, Tóth B, Bognár J, László K, Horvai G: Preparation of terbutylazine imprinted polymer microspheres using viscous polymerization solvents. Journal of Separation Science, 2009, 32:3347-3358

7.

Ersöz A, Denizli A, Özcan A, Say R: Molecularly imprinted ligand-exchange recognition assay of glucose by quartz crystal microbalance. Biosensors and Bioelectronics, 2005, 20:2197-2202

8.

Wang W, Gao S, Wang B: Building fluorescent sensors by template polymerization: The preparation of a fluorescent sensor for D-fructose. Organic Letters, 1999, 1:1209-1212

9.

Vidyasankar S, Ru M, Arnold FH: Molecularly imprinted ligand-exchange adsorbents for the chiral separation of underivatized amino acids. Journal of Chromatography A, 1997, 775:51-63

10.

Bossi A, Piletsky SA, Piletska EV, Righetti PG, Turner APF: Surface-grafted molecularly imprinted polymers for protein recognition. Analytical Chemistry, 2001, 73:5281-5286

- 61 -

11.

Shiomi T, Matsui M, Mizukami F, Sakaguchi K: A method for the molecular imprinting of hemoglobin on silica surfaces using silanes. Biomaterials, 2005, 26:5564-5571

12.

Bereli N, Andac M, Baydemir G, Say R, Galaev IY, Denizli A: Protein recognition via ion-coordinated molecularly imprinted supermacroporous cryogels. Journal of Chromatography A, 2008, 1190:18-26

13.

Bolisay LD, Culver JN, Kofinas P: Molecularly imprinted polymers for tobacco mosaic virus recognition. Biomaterials, 2006, 27:4165-4168

14.

Jenik M, Schirhagl R, Schirk C, Hayden O, Lieberzeit P, Blaas D, Paul G, Dickert FL: Sensing picornaviruses using molecular imprinting techniques on a quartz cristal microbalance. Analytical Chemistry, 2009, 81:5320-5326

15.

Hayden O, Bindeus R, Haderspöck C, Mann KJ, Wirl B, Dickert FL: Masssensitive detection of cells, viruses and enzymes with artificial receptors. Sensors and Actuators B, 2003, 91:316-319

16.

Fischer L, Müller R, Ekberg B, Mosbach K: Direct enantioseparation of badrenergic blockers using a chiral stationary phase prepared by molecular imprinting. Journal of the American Chemical Society, 1991, 113:9358-9360

17.

Ansell RJ: Molecularly imprinted polymers for the enantioseparation of chiral drugs. Advanced Drug Delivery Reviews, 2005, 57:1809-1835

18.

Pichon V: Selective sample treatment using molecularly imprinted polymers. Journal of Chromatography A, 2007, 1152:41-53

19.

Holthoff EL, Bright FV: Molecularly templated materials in chemical sensing. Analytica Chimica Acta, 2007, 594:147-161

20.

Ansell RJ: MIP-ligand binding assays (pseudo-immunoassays). Bioseparation, 2002, 10:365-377

21.

Alexander C, Davidson L, Hayes W: Imprinted polymers: artificial molecular recognition materials with applications in synthesis and catalysis. Tetrahedron, 2003, 59:2025-2057

22.

Alvarez-Lorenzo C, Concheiro A: Molecularly imprinted polymers for drug delivery. Journal of Chromatography B, 2004, 804:231-245

- 62 -

23.

Bossi A, Bonini F, Turner APF, Piletsky SA: Molecularly imprinted polymers for the recognition of proteins: The state of the art. Biosensors and Bioelectronics, 2007; 22:1131-1137.

24.

Turner NW, Jeans CW, Brain KR, Allender CJ, Hlady V, Britt DW: From 3D to 2D: A review of the molecular imprinting of proteins. Biotechnology Progress, 2006; 22:1474-1489.

25.

Nicholls IA, Adbo K, Andersson HS, Andersson PO, Ankarloo J, HedinDahlström J, Jokela P, Karlsson JG, Olofsson L, Rosengren J, Shoravi S, Svenson J, Wikman S: Can we rationally design molecularly imprinted polimers? Analytica Chimica Acta, 2001; 435:9-18.

26.

Byrne ME, Park K, Peppas NA: Molecular imprinting within hydrogels. Advanced Drug Delivery Reviews, 2002; 54:149-161

27. Liao JL, Wang Y, Hjertén S: A novel support with artificially created recognition for the selective removal of proteins and for affinity chromatography. Chromatographia, 1996, 42:259-262 28.

Hjertén S, Liao JL, Nakazato K, Wang Y, Zamaratskaia G, Zhang HX: Gels mimicking antibodies in their selective recognition of proteins. Chromatographia, 1997, 44:227-234

29.

PDB ID: 1DWT, Chu K, Vojtechovsky J, Mcmahon BH, Sweet RM, Berendzen J, Schlichting I: Structure of a ligand-binding intermediate in wild-type carbonmonoxy myoglobin. Nature, 2000, 403:921-923

30.

PDB ID: 1VXH, Yang F, Phillips Jr. GN: Crystal structures of CO-, deoxy- and met-myoglobins at various pH values. Journal of Molecular Biology, 1996, 256:762-774

31.

Ou SH, Wu MC, Chou TC, Liu CC: Polyacrylamide gels with electrostatic functional groups for the molecular imprinting of lysozyme. Analytica Chimica Acta, 2004, 405:163-166

32.

Pang X, Cheng G, Lu S, Tang E: Synthesis of polyacrylamide gel beads with electrostatic functional groups for the molecular imprinting of bovine serum albumine. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2006, 384:225-230

- 63 -

33.

Kublickas R, Werner C, Jariene G, Voit B, Lašas L: Polyacrylamide gels containing ionized functional groups for the molecular imprinting of human growth hormone. Polymer Bulletin, 2007, 58:611-617

34.

Janiak DS, Ayyub OB, Kofinas P: Effects of charge density on the recognition properties of molecularly imprinted polymeric hydrogels. Macromolecules, 2009, 42:1703-1709

35.

Zhang W, Qin L, Chen RR, He XW, Li WY, Zhang YK: Protein imprinted polymer using acryloyl--cyclodextrin and acrylamide as monomers. Applied Surface Science, 2010, 256:3000-3005

36.

Vaidya AA, Lele BS, Kulkarni MG, Mashelkar MA: Creating a macromolecular receptor by affinity imprinting. Journal of Applied Polymer Science, 2001, 81:1075-1083

37.

Hirayama K, Sakai Y, Kameoka K: Synthesis of polymer particles with specific lysozyme recognition sites by a molecular imprinting technique. Journal of Applied Polymer Science, 2001, 81:3378-3387

38.

Guo TY, Xia YQ, Hao GJ, Song MD, Zhang BH: Adsorptive separation of hemoglobin by molecularly imprinted chitosan beads. Biomaterials, 2004, 25:5905-5912

39.

Fu G, Zhao J, Yu H, Liu L, He B: Bovine serum albumin-imprinted polymer gels prepared by graft copolymerization of acrylamide on chitosan. Reactive and Functional Polymers, 2007, 67:442-450

40.

Tong D, Hetényi Cs, Bikádi Zs, Gao JP, Hjertén S: Some studies of the chromatographic properties of gels (‘artificial antibodies/receptors’) for selective adsorption of proteins. Chromatographia, 2001, 54:7-14

41.

Enoki T, Tanaka K, Watanabe T, Oya T, Sakiyama T, Takeoka Y, Ito K, Wang G, Annaka M, Hara K, Du R, Chuang J, Wasserman K, Grosberg AY, Masamune S, Tanaka T: Frustations in polymer conformation in gels and their minimization through molecular imprinting. Physical Review Letters, 2000; 85:5000-5003

42.

Venton DL, Gudipati E: Influence of protein on polysiloxane polymer formation: evidence for induction of complementary protein-polymer interactions. Biochimica et Biophysica Acta, 1995, 1250:126-136

- 64 -

43.

Lulka MF, Iqbal SS, Chambers JP, Valdes ER, Thompson RG, Goode MT, Valdes JJ: Molecular imprinting of ricin and it’s a and B chains to organic silanes: fluorescence detection. Materials Science and Engineering C, 2000, 11:101-105

44.

Shiomi T, Matsui M, Mizukami F, Sakaguchi K: A method for the molecular imprinting of hemoglobin on silica surfaces using silanes. Biomaterials, 2005, 26:5564-5571

45.

Lu Y, Yan CL, Gao SY: Preparation and recognition of surface molecularly imprinted core-shell microbeads for protein in aqueous solutions. Applied Surface Science, 2009, 255:6061-6066

46.

Gai QQ, Qu F, Liu ZJ, Dai RJ, Zhang YK: Superparamegnetic lysozyme surfaceimprinted polymer prepared by atom transfer radical polymerization and its application for protein separation. Journal of Chromatography A, 2010, 1217:5035-5042

47.

Tan CJ, Chua HG, Ker KH, Tong YW: Preparation of bovine serum albumin surface-imprinted submicrometer particles with magnetic susceptibility through core-shell mini-emulsion polymerization. Analytical Chemistry, 2008, 80:683-692

48.

Gültekin A, Ersöz A, Sarıözlu NY, Denizli A, Say R: Nanosensors having dipicolinic acid imprinted nanoshell for Bacillus cereus spores detection. Journal of Nanoparticle Research, 2010, 12:2069-2079

49.

Odabasi M, Say R, Denizli A: Molecular imprinted particles for lysozyme purification. Materials Science and Engineering C, 2007, 27:90-99

50.

Özcan AA, Say R, Denizli A, Ersöz A: L-histidine imprinted synthetic receptor for biochromatography applications. Analytical Chemistry, 2006, 78:72537258

51.

Ratner BD, Shi H: Recognition templates for biomaterials with engineered bioreactivity. Current Opinion in Solid State and Materials Science, 1999, 4:395-402

52.

Chou PC, Rick J, Chou TC: C-reactive protein thin-film molecularly imprinted polymers formed using a micro-contact approach. Analytica Chimica Acta, 2005, 542:20-25 - 65 -

53.

Shi H, Tsai WB, Garrison MD, Ferrari S, Ratner BD: Template-imprinted nanostructured surfaces for protein recognition. Letters to Nature, 1999, 398:593-597

54.

Turner NW, Wright BE, Hlady V, Britt DW: Formation of protein molecular imprints within Langmuir monolayers: A quartz cristal microbalance study. Journal of Colloid and Interface Science, 2007, 308:71-80

55.

Hegemann D: Macroscopic control of plasma polymerization processes. Pure and Applied Chemistry, 2008, 80:1893-1900

56.

Hishmen GA, Barr TL, Sklyarov A, Hardcastle S: Thin polymer films prepared by radio frequency plasma sputtering of polytetrafluoroethylene and polyetherimide targets. Journal of Vacuum Science and Technology A, 1996, 14:1330-1339

57.

Vidal JC, Garcia-Ruiz E, Castillo JR: Recent advances in electropolymerized conducting poymers in amperometric biosensors. Microchimica Acta, 2003, 143:93-111

58.

Schuhmann W, Kranz C, Wohlschläger H, Strohmeier J: Pulse technique for the electrochemical deposition of polymer films on electrode surfaces. Biosensors and Bioelectronics, 1997, 12:1157-1167

59.

Rachkov A, Minoura N: Towards molecularly imprinted polymers selective to peptides and proteins. The epitope approach. Biochimica et Biophysica Acta, 2001, 1544:255-266

60.

Rachkov A, Minoura N: Recognition of oxytocin and oxytocin-related peptides in aqueous media using a molceularly imprinted polymer synthesized by the epitope approach. Journal of Chromatography A, 2000, 889:111-118

61.

Nishino H, Huang CS, Shea KJ: Selective protein capture by epitope imprinting. Angewandte Chemie International Edition, 2006, 45:2392-2396

62.

Brown ME, Puleo DA: Protein binding to peptide-imprinted porous silica scaffolds. Chemical Engineering Journal, 2008, 137:97-101

63

Hoogvliet JC, Dijksma M, Kamp B, van Bennekom WP: Electrochemical pretreatment of polycrystalline gold electrodes to produce a reproducible surface roughness for self-assembly: A study in phosphate buffer pH 7.4. Analytical Chemisrty, 2000, 72:2016-2021 - 66 -

64.

Schwartz A, Graper J, Williams J: Method of applying a hydrophilic coating to a polymeric substrate and articles prepared thereby. 1986, US Pat.No. 4,589,873

65.

Ebersole RC, Miller JA, Moran JR, Ward MD: Spontaneously formed functionally active avidin monolayers on metal surfaces: A strategy for immobilizing biological reagents and design of piezoelectric biosensors. Journal of the American Chemical Society, 1990, 112:3239-3241

66.

http://www.chemicell.com/products/Magnetic_Nanoparticle/ Magnetic_Nanoparticles.html

67.

Chemicell Protokol B1: Immobilization of biotinylated ligands with SiMAGStreptavidin. http://www.chemicell.com/products/protocols/docs/SiMAGStreptavidin.pdf

68.

El Enany GM: Electrochemical synthesis of high charge capacity poly(3,4 ethylenedioxythiophene) using pulse polymerization technique. Zastita Materijala, 2009, 50:193-196

69.

Gibbs J: Selecting the detection system – colorimetric, fluorescent, luminescent methods. ELISA technical Bulletin No.5, Corning Inc. Life Sciences.

- 67 -

8. Függelék

- 68 -

8.1. Kalibrációs adatok a tormaperoxidáz enzim aktivitásának méréséhez 8.1.1. Kalibrációs adatok avidin-HRP aktivitásának méréséhez A standard oldatok mérési eredményeiből meghatároztam az egyes inkubációs időkhöz (t) tartozó, origóból induló kalibrációs egyenes meredekségét (mt). A kapott meredekségeket az inkubációs idő függvényében ábrázolva meghatároztam az összefüggést az inkubációs idő és a kalibrációs egyenes meredeksége között. A későbbiekben ezen függvényt alkalmazva számítottam ki a kalibrációs egyenes meredekségét (mt). cstd

c

[mg/ml] [mg/ml]

t

A

cstd

c

t

A

[min]

[aU]

[mg/ml]

[mg/ml]

[min]

[aU]

1E-05

2E-07

1

0,047

1E-03

2E-05

2

1,715

1E-05

2E-07

1

0,034

1E-03

2E-05

2

1,432

1E-05

2E-07

1

0,044

1E-05

2E-07

3,5

0,030

1E-05

2E-07

1

0,039

3E-05

5,E-07

3,5

0,102

1E-05

2E-07

1

0,047

5E-05

1E-06

3,5

0,304

1E-05

2E-07

1

0,054

5E-05

1E-06

3,5

0,132

1E-05

2E-07

1

0,039

8E-05

1E-06

3,5

0,472

1E-05

2E-07

1

0,042

1E-04

2E-06

3,5

0,562

1E-05

2E-07

1

0,031

1E-04

2E-06

3,5

1,229

1E-05

2E-07

1

0,040

1E-04

2E-06

3,5

0,610

1E-04

2E-06

1

0,529

5E-04

1E-05

3,5

6,638

1E-04

2E-06

1

0,587

5E-04

1E-05

3,5

2,558

1E-04

2E-06

1

0,570

5E-04

1E-05

3,5

5,372

1E-04

2E-06

1

0,484

1E-03

2E-05

3,5

7,500

1E-04

2E-06

1

0,530

1E-03

2E-05

3,5

4,303

1E-04

2E-06

1

0,518

1E-03

2E-05

3,5

7,730

1E-04

2E-06

1

0,258

1E-03

2E-05

3,5

7,602

1E-04

2E-06

1

0,311

1E-06

2E-08

10

0,015

1E-04

2E-06

1

0,284

1E-05

2E-07

10

0,070

1E-04

2E-06

1

0,310

1E-05

2E-07

10

0,000

1E-05

2E-07

2

0,083

1E-04

2E-06

10

0,775

1E-05

2E-07

2

0,081

1E-04

2E-06

10

0,169

1E-04

2E-06

2

0,598

1E-06

2E-08

30

0,036

1E-04

2E-06

2

0,593

1E-05

2E-07

30

0,243

1E-04

2E-06

2

1,142

1E-04

2E-06

30

3,215

1E-04

2E-06

2

1,051

- 69 -

avidin-HRP kalibráció

: 1 perc

9,00

y = 87167x R2 = 0,1417

8,00

: 2 perc

7,00

y = 223324x R2 = 0,8361

nettó abszorbancia

6,00

: 3,5 perc

5,00

y = 369557x R2 = 0,8358

4,00

: 10 perc

3,00

y = 240130x R2 = 0,5587

2,00

: 30 perc

1,00 0,00 0,0E+00

y = 2E+06x R2 = 0,999 5,0E-06

1,0E-05

1,5E-05

2,0E-05

2,5E-05

valódi koncentráció [mg/ml]

avidin-HRP kalibráció - kinagyítás

: 1 perc y = 223324x R2 = 0,8361

1,40

: 2 perc

1,20

y = 87167x R2 = 0,1417

nettó abszorbancia

1,00

: 3,5 perc y = 369557x R2 = 0,8358

0,80 0,60

: 10 perc y = 240130x R2 = 0,5587

0,40

: 30 perc

0,20 0,00 0,0E+00

y = 2E+06x R2 = 0,999 1,0E-06

2,0E-06

3,0E-06

valódi koncentráció [mg/ml]

- 70 -

4,0E-06

5,0E-06

mt

[min]

[ml/mg]

1

223 324

2

87 167

3,5

369 557

10

240 130

30

2 000 000

avidin-HRP: kalibrációs egyenes meredeksége

2 500 000

kalibrációs egyenes meredksége

t

2 000 000

y = 63006x R2 = 0,9161

1 500 000

1 000 000

500 000

0 0

5

10

15

20

inkubációs idő [min]

Avidin-HRP mérések kiértékelésekor alkalmazott mennyiségek: mt = 63 006·t MW = 151 600 Da (avidin:HRP = 1:1,9)

- 71 -

25

30

35

8.1.2. Kalibrációs adatok biotin-HRP aktivitásának méréséhez A standard oldatok mérési eredményeiből meghatároztam az egyes inkubációs időkhöz (t) tartozó, origóból induló kalibrációs egyenes meredekségét (mt). A kapott meredekségeket az inkubációs idő függvényében ábrázolva meghatároztam az összefüggést az inkubációs idő és a kalibrációs egyenes meredeksége között. A későbbiekben ezen függvényt alkalmazva számítottam ki a kalibrációs egyenes meredekségét (mt). cstd

c

t

A

[mg/ml]

[mg/ml]

[min]

[aU]

1E-05

2E-07

1,5

0,145

1E-04

2E-06

1,5

1,665

1E-03

2E-05

1,5

3,987

1E-05

2E-07

2,5

0,503

1E-04

2E-06

2,5

3,886

1E-03

2E-05

2,5

0,268

1E-05

2E-07

5

0,632

1E-05

2E-07

5

0,581

1E-05

2E-07

5

0,618

1E-05

2E-07

5

0,607

1E-05

2E-07

5

0,617

1E-04

2E-06

5

3,969

1E-04

2E-06

5

3,785

1E-04

2E-06

5

4,008

1E-04

2E-06

5

4,113

1E-04

2E-06

5

4,094

1E-06

2E-08

30

0,268

1E-06

2E-08

30

0,219

1E-05

2E-07

30

1,856

1E-05

2E-07

30

1,805

- 72 -

nettó abszorbancia

biotin-H R P kalibráció 4,50

: 1,5 perc

4,00

y = 209784x R 2 = 0,7865

3,50

: 2,5 perc

3,00

y = 33406x R 2 = -0,8291

2,50

: 5 perc y = 2E +06x R 2 = 0,9898

2,00 1,50

: 30 perc y = 9E +06x R 2 = 0,9961

1,00 0,50 0,00 0,0E +00

5,0E -06

1,0E -05

1,5E -05

2,0E -05

2,5E -05

va lódi konce ntrá ció [m g/m l]

10 000 000

mt [ml/mg]

1,5

209 784

2,5

33 406

5

2 000 000

30

9 000 000

kalibrációs egyenes meredksége

t [min]

biotin-HRP: kalibrációs egyenes meredeksége

8 000 000

y = 300373x R2 = 0,9846

6 000 000 4 000 000 2 000 000 0 0

5

10

15

20

inkubációs idő [min]

Biotin-HRP mérések kiértékelésekor alkalmazott mennyiségek: mt = 300 373·t MW = 44 488 Da (biotin:HRP = 2:1)

- 73 -

25

30

35

8.1.3. Kalibrációs adatok HRP aktivitásának méréséhez A standard oldatok mérési eredményeiből meghatároztam az egyes inkubációs időkhöz (t) tartozó, origóból induló kalibrációs egyenes meredekségét (mt). cstd

c

t

A

[mg/ml]

[mg/ml]

[min]

[aU]

1E-04

2E-06

1,5

1,665

1E-05

2E-07

1,5

0,145

1E-04

2E-06

1,5

1,516

1E-04

2E-06

1,5

1,439

1E-04

2E-06

1,5

1,608

1E-05

2E-07

1,5

0,148

1E-05

2E-07

1,5

0,158

HRP kalibráció 1,80 1,60

nettó abszorbancia

1,40 1,20

: 1,5 perc

1,00

y = 793866x R2 = 0,9912

0,80 0,60 0,40 0,20 0,00 0,0E+00

5,0E-07

1,0E-06

1,5E-06

valódi koncentráció [mg/ml]

HRP mérések kiértékelésekor alkalmazott mennyiségek: m1,5 = 793 866·t MW = 44 000 Da

- 74 -

2,0E-06

2,5E-06

8.2. Grafikonok forrásadatai 8.2.1. Egy lépésben imprintelt polimer filmek által visszakötött avidin-HRP mennyisége (8. ábra) minta

visszakötött (t = 5 min)

PB-s mosás után (t = 5 min)

tweenes mosás után (t = 15 min)

jele

A [aU]

c [mg/ml]

n [mol]

b [mol/mm ]

A [aU]

c [mg/ml]

n [mol]

b [mol/mm ]

A [aU]

c [mg/ml]

n [mol]

b [mol/mm ]

E1

3,201

1,02E-05

1,68E-14

1,74E-15

0,624

1,98E-06

3,27E-15

3,40E-16

0,522

5,52E-07

9,11E-16

9,47E-17

E2

2,651

8,42E-06

1,39E-14

1,44E-15

0,566

1,80E-06

2,96E-15

3,08E-16

0,528

5,59E-07

9,21E-16

9,57E-17

E3

2,909

9,24E-06

1,52E-14

1,58E-15

0,604

1,92E-06

3,16E-15

3,29E-16

0,611

6,46E-07

1,07E-15

1,11E-16

E4

3,766

1,20E-05

1,97E-14

2,05E-15

0,931

2,96E-06

4,88E-15

5,07E-16

0,757

8,01E-07

1,32E-15

1,37E-16

2

- 75 -

2

2

8.2.2. Két lépésben imprintelt PEDOT-PSS filmek által visszakötött avidin-HRP mennyisége (9. ábra) minta

adszorbeált (t = 5 min)

hozzáférhető (t = 30 min)

tisztaság ell. (t = 30 min)

jele

A [aU]

c [mg/ml]

n [mol]

b [mol/mm ]

A [aU]

c [mg/ml]

n [mol]

b [mol/mm ]

A [aU]

c [mg/ml]

n [mol]

b [mol/mm ]

K1

0,651

2,07E-06

3,41E-15

3,54E-16

0,099

5,21E-08

8,59E-17

8,93E-18

0,036

1,90E-08

3,14E-17

3,26E-18

K2

1,066

3,38E-06

5,58E-15

5,80E-16

0,206

1,09E-07

1,79E-16

1,86E-17

0,068

3,60E-08

5,93E-17

6,17E-18

K3

0,016

8,46E-09

1,40E-17

1,45E-18

0,021

1,11E-08

1,83E-17

1,90E-18

K4

0,008

4,50E-09

7,42E-18

7,71E-19

0,013

6,88E-09

1,13E-17

1,18E-18

minta

2

visszakötött (t = 5 min)

2

1. PB-s mosás után (t = 5 min)

2

2. PB-s mosás után (t = 10 min)

jele

A [aU]

c [mg/ml]

n [mol]

b [mol/mm ]

A [aU]

c [mg/ml]

n [mol]

b [mol/mm ]

A [aU]

c [mg/ml]

n [mol]

b [mol/mm ]

K1

2,104

6,68E-06

1,10E-14

1,14E-15

0,430

1,36E-06

2,25E-15

2,34E-16

0,626

9,94E-07

1,64E-15

1,70E-16

K2

3,480

1,10E-05

1,82E-14

1,89E-15

0,543

1,72E-06

2,84E-15

2,95E-16

0,772

1,23E-06

2,02E-15

2,10E-16

K3

1,521

4,83E-06

7,96E-15

8,28E-16

0,429

1,36E-06

2,25E-15

2,33E-16

0,491

7,79E-07

1,29E-15

1,34E-16

K4

2,095

6,65E-06

1,10E-14

1,14E-15

0,710

2,25E-06

3,72E-15

3,86E-16

1,244

1,97E-06

3,26E-15

3,38E-16

minta

2

tweenes mosás után (t = 10 min)

jele

A [aU]

c [mg/ml]

n [mol]

b [mol/mm ]

K1

0,461

7,32E-07

1,21E-15

1,25E-16

K2

0,436

6,92E-07

1,14E-15

1,19E-16

K3

0,412

6,54E-07

1,08E-15

1,12E-16

K4

0,657

1,04E-06

1,72E-15

1,79E-16

2

- 76 -

2

2

8.2.3. Két lépésben imprintelt PEDOT-PSS filmek által átlagosan visszakötött avidin mennyisége, detektálás biotin-HRP kapcsolásával (10. ábra) hozzáférhető (t = 5 min)

tisztaság ell. (t = 30 ill. 5 min)

minta jele

A [aU]

c [mg/ml]

n [mol]

b [mol/mm ]

K5

1,088

7,24E-07

4,07E-15

4,23E-16

K6

0,695

4,63E-07

2,60E-15

2,70E-16

K7

2,531

1,69E-06

9,47E-15

K8

2,489

1,66E-06

K9

0,392

K10

2

visszakötött (t = 5 min) 2

2

A [aU]

c [mg/ml]

n [mol]

b [mol/mm ]

A [aU]

c [mg/ml]

n [mol]

b [mol/mm ]

9,84E-16

0,165

1,10E-07

6,17E-16

6,42E-17

2,898

1,93E-06

1,08E-14

1,13E-15

9,31E-15

9,68E-16

0,180

1,20E-07

6,74E-16

7,00E-17

1,493

9,94E-07

5,59E-15

5,81E-16

2,61E-07

1,47E-15

1,52E-16

0,022

2,44E-09

1,37E-17

1,43E-18

0,579

3,86E-07

2,17E-15

2,25E-16

1,530

1,02E-06

5,72E-15

5,95E-16

0,000

0,00E+00

0,00E+00

0,00E+00

0,124

8,26E-08

4,64E-16

4,82E-17

K11

0,747

4,97E-07

2,80E-15

2,91E-16

0,039

4,33E-09

2,43E-17

2,53E-18

0,790

5,26E-07

2,96E-15

3,07E-16

K12

1,459

9,71E-07

5,46E-15

5,67E-16

0,229

2,54E-08

1,43E-16

1,48E-17

1,541

1,03E-06

5,77E-15

5,99E-16

MIP átl.

1,701

1,13E-06

6,36E-15

6,61E-16

0,173

1,15E-07

6,45E-16

6,71E-17

2,196

1,46E-06

8,21E-15

8,54E-16

NIP átl.

1,032

6,87E-07

3,86E-15

4,01E-16

0,073

8,05E-09

4,52E-17

4,7E-18

0,759

5,05E-07

2,84E-15

2,95E-16

- 77 -

PB-s mosás utáb (t = 5 min) minta jele

2

A [aU]

c [mg/ml]

n [mol]

b [mol/mm ]

K7

0,596

3,97E-07

2,23E-15

2,32E-16

K8

0,420

2,80E-07

1,57E-15

1,63E-16

K9

0,037

2,46E-08

1,38E-16

1,44E-17

K10

0,021

1,40E-08

7,86E-17

8,17E-18

K11

0,130

8,66E-08

4,86E-16

5,06E-17

K12

0,236

1,57E-07

8,83E-16

9,18E-17

MIP átl.

0,508

3,38E-07

1,9E-15

1,98E-16

NIP átl.

0,106

7,06E-08

3,97E-16

4,12E-17

K5 K6

- 78 -

8.2.4. Két lépésben imprintelt PEDOT-PSSM filmek által átlagosan visszakötött avidin mennyisége (11. ábra) hozzáférhető (t = 5 min)

tisztaság ell. (t = 30 min)

visszakötött (t = 5 min)

minta jele

A [aU]

c [mg/ml]

n [mol]

b [mol/mm ]

A [aU]

c [mg/ml]

n [mol]

b [mol/mm ]

A [aU]

c [mg/ml]

n [mol]

b [mol/mm ]

K13

1,768

1,18E-06

6,62E-15

6,88E-16

0,135

1,50E-08

8,42E-17

8,75E-18

2,423

1,61E-06

9,07E-15

9,42E-16

K14

0,273

1,82E-07

1,02E-15

1,06E-16

0,088

9,77E-09

5,49E-17

5,70E-18

3,958

2,64E-06

1,48E-14

1,54E-15

K15

1,329

8,85E-07

4,97E-15

5,17E-16

0,217

2,41E-08

1,35E-16

1,41E-17

4,164

2,77E-06

1,56E-14

1,62E-15

K16

0,308

2,05E-07

1,15E-15

1,20E-16

0,047

5,22E-09

2,93E-17

3,05E-18

2,485

1,65E-06

9,30E-15

9,66E-16

K17

3,843

2,56E-06

1,44E-14

1,49E-15

0,446

4,95E-08

2,78E-16

2,89E-17

3,968

2,64E-06

1,48E-14

1,54E-15

K18

2,009

1,34E-06

7,52E-15

7,81E-16

0,855

9,49E-08

5,33E-16

5,54E-17

3,864

2,57E-06

1,45E-14

1,50E-15

MIP átl.

1,123

7,48E-07

4,20E-15

4,37E-16

0,147

1,63E-08

9,15E-17

9,51E-18

3,515

2,34E-06

1,32E-14

1,37E-15

NIP átl.

2,053

1,37E-06

7,68E-15

7,99E-16

0,449

4,99E-08

2,80E-16

2,91E-17

3,439

2,29E-06

1,29E-14

1,34E-15

2

PB-s mosás után (t = 5 min)

2

tisztaság ell. (t = 30 min)

2

visszakötött (t = 5 min)

minta jele

A [aU]

c [mg/ml]

n [mol]

b [mol/mm ]

A [aU]

c [mg/ml]

n [mol]

b [mol/mm ]

A [aU]

c [mg/ml]

n [mol]

b [mol/mm ]

K13

0,175

1,17E-07

6,55E-16

6,81E-17

0,044

4,88E-09

2,74E-17

2,85E-18

2,984

1,99E-06

1,12E-14

1,16E-15

K14

0,420

2,80E-07

1,57E-15

1,63E-16

0,231

2,56E-08

1,44E-16

1,50E-17

4,012

2,67E-06

1,50E-14

1,56E-15

K15

0,462

3,08E-07

1,73E-15

1,80E-16

0,242

2,69E-08

1,51E-16

1,57E-17

3,804

2,53E-06

1,42E-14

1,48E-15

K16

0,209

1,39E-07

7,82E-16

8,13E-17

0,089

9,88E-09

5,55E-17

5,77E-18

2,197

1,46E-06

8,22E-15

8,54E-16

K17

0,344

2,29E-07

1,29E-15

1,34E-16

0,353

3,92E-08

2,20E-16

2,29E-17

3,864

2,57E-06

1,45E-14

1,50E-15

K18

0,480

3,20E-07

1,80E-15

1,87E-16

0,363

4,03E-08

2,26E-16

2,35E-17

3,765

2,51E-06

1,41E-14

1,46E-15

MIP átl.

0,352

2,35E-07

1,32E-15

1,37E-16

0,172

1,91E-08

1,07E-16

1,12E-17

3,600

2,40E-06

1,35E-14

1,40E-15

NIP átl.

0,344

2,29E-07

1,29E-15

1,34E-16

0,268

2,98E-08

1,67E-16

1,74E-17

3,275

2,18E-06

1,23E-14

1,27E-15

2

- 79 -

2

2

PB-s mosás után (t = 5 min) minta jele

A [aU]

c [mg/ml]

n [mol]

b [mol/mm ]

K13

0,429

2,86E-07

1,61E-15

1,67E-16

K14

0,705

4,69E-07

2,64E-15

2,74E-16

K15

0,540

3,60E-07

2,02E-15

2,10E-16

K16

0,406

2,70E-07

1,52E-15

1,58E-16

K17

0,558

3,72E-07

2,09E-15

2,17E-16

K18

0,786

5,23E-07

2,94E-15

3,06E-16

MIP átl.

0,558

3,72E-07

2,09E-15

2,17E-16

NIP átl.

0,583

3,88E-07

2,18E-15

2,27E-16

- 80 -

2

8.2.5. Ultrahangos kezelés hatása a peroxidáz enzim aktivitására (14. ábra) minta jele

nem kezelt (t = 3 min)

ultrahangozott (t = 2 min)

A [aU]

A [aU]

F1

1,253

3,802

F2

0,958

3,807

S1

0,598

0,352

S2

0,593

0,367

fluidMAG-biotinhoz kötött, átl.

1,106

3,805

szabad avidin-HRP átl.

0,596

0,360

8.2.6. Biotin-HRP és HRP visszakötődése fluidMAG-biotinra imprintelt polimereken (17. ábra) biotin-HRP kötődése (t = 2,5 min)

HRP kötődése (t = 1,5 min)

minta jele

A [aU]

c [mg/ml]

n [mol]

b [mol/mm ]

A [aU]

c [mg/ml]

n [mol]

b [mol/mm ]

N4

2,964

3,95E-06

2,22E-14

2,31E-15

2,955

3,72E-06

2,11E-14

2,2E-15

N5

3,500

4,66E-06

2,62E-14

2,72E-15

3,500

4,41E-06

2,51E-14

2,6E-15

N6

1,418

1,89E-06

1,06E-14

1,10E-15

3,378

4,26E-06

2,42E-14

2,51E-15

N7

3,473

4,62E-06

2,60E-14

2,70E-15

3,385

4,26E-06

2,42E-14

2,52E-15

25 ciklus átl.

3,232

4,30E-06

2,42E-14

2,51E-15

3,228

4,07E-06

2,31E-14

2,4E-15

50 ciklus átl.

2,446

3,26E-06

1,83E-14

1,90E-15

3,382

4,26E-06

2,42E-14

2,52E-15

2

- 81 -

2

8.2.7. Hozzáférhető biotin mennyisége oxálsavas kezelés előtt és után (18. ábra) kioldás előtt (t = 1 ill. 2 min)

kioldás után (t = 1 min)

minta jele

A [aU]

c [mg/ml]

n [mol]

b [mol/mm ]

A [aU]

c [mg/ml]

n [mol]

b [mol/mm ]

N4

0,837

6,64E-06

1,10E-14

1,14E-15

1,227

1,95E-05

3,21E-14

3,34E-15

N5

3,844

3,05E-05

5,03E-14

5,23E-15

1,974

3,13E-05

5,17E-14

5,37E-15

N6

3,810

3,02E-05

4,99E-14

5,18E-15

1,790

2,84E-05

4,69E-14

4,87E-15

N7

3,928

3,12E-05

5,14E-14

5,34E-15

1,397

2,22E-05

3,66E-14

3,80E-15

N8

2,569

4,08E-05

6,72E-14

6,99E-15

0,846

1,34E-05

2,21E-14

2,30E-15

N9

0,717

1,14E-05

1,88E-14

1,95E-15

0,318

5,05E-06

8,32E-15

8,65E-16

N10

1,574

2,50E-05

4,12E-14

4,28E-15

1,339

2,13E-05

3,50E-14

3,64E-15

N11

1,019

1,62E-05

2,67E-14

2,77E-15

1,008

1,60E-05

2,64E-14

2,74E-15

N12

1,763

2,80E-05

4,61E-14

4,80E-15

1,319

2,09E-05

3,45E-14

3,59E-15

NIP 25 ciklus

0,777

9,01E-06

1,49E-14

1,54E-15

0,773

1,23E-05

2,02E-14

2,10E-15

rászárított

2,569

4,08E-05

6,72E-14

6,99E-15

0,846

1,34E-05

2,21E-14

2,30E-15

MIP 25 ciklus

2,709

2,77E-05

4,58E-14

4,76E-15

1,657

2,63E-05

4,34E-14

4,51E-15

MIP 50 ciklus

2,415

2,32E-05

3,83E-14

3,98E-15

1,399

2,22E-05

3,66E-14

3,81E-15

MIP 200 ciklus

2,846

2,96E-05

4,88E-14

5,07E-15

1,358

2,16E-05

3,55E-14

3,69E-15

2

- 82 -

2

8.3. Az egy-egy fluidMAG-biotin nanorészecskékhez kapcsolódó biotinok száma  A fluidMAG-biotin szuszpenzió termék specifikációjában szereplő adatok: szuszpenzió koncentrációja: 10 mg/ml a száraz anyagban: ~1,8·1015 g-1 nanorészecske avidin-kötő képesség: 75 g sztreptavidin / 1 mg nanorészecske  1 mg szuszpenzió nanorészecske-tartalma: 1 mg*1,8·1015 g-1 = 1,8·1012 (db) nanorészecske  a megkötött sztreptavidin mennyisége: 75g mol  10 6  1,42  10 9 mol g mol 52 800 mol

 mivel 1 biotin 1 sztreptavidinhoz (vagy avidinhoz) tud kötődni, ezért ugyanennyi mól biotint tartalmaz a vizsgált 1 mg termék, azaz 1,42  10 9 mol  6  10 23 mol 1 db biotin található 1,8  10

12

db nanorészecskén 

500 biotin/nanorészecske

- 83 -

 473

biotin ≈ nanorészecske

8.4. A fluidMAG-biotin nanorészecskékkel történő imprintelés során kialakuló biotin-kötőhelyek várható száma  Egyetlen nanorészecske által lefedett terület: (100 nm)2 = 104 nm2  A

3,5 mm

átmérőjű

polimer

felületen

az

imprinteléskor

elhelyezkedő

nanorészecskék száma, a nanorészecskék négyzetes illeszkedését feltételezve (alsó becslés):

3,5 10

6



2

nm 

10 4 nm 4

 4  9,62  10 8 (db) nanorészecske

 Feltételezve, hogy valóban a nanorészecskék félmagasságáig érő (tehát 50 nm vastag) polimer film jött létre, minden nanorészecske éppen a rajta található biotinok felével képez lenyomatot, vagyis 1 nanorészecske ~250 kötőhelyet alakít ki. Így a lenyomathelyek teljes száma: 9,62·108 (db) * 250 (kötőhely/db) = 2,41·1011 kötőhely, azaz 2,41  1011  4,01  10 13 mol biotin 6  10 23 mol 1

tud

kötőhelyekbe.  Ebből az elméleti teljes borítottság: 4,01  10 13 mol biotin  mol  4,2  10 14 mm 2 3,5mm 2   4

- 84 -

visszakötődni

a

kialakított

8.5. FluidMAG-biotin

nanorészecskékkel

imprintelt

polimer

rétegek

vastagságának meghatározása AFM felvétel alapján Az AFM felvételeket Gwyddion szoftver segítségével dolgoztam fel. A mintatartó esetleges ferdeségét úgy korrigáltam, hogy az adatokat egy, a képpontokra illesztett sík magasságértékeivel csökkentettem. A képalkotás során esett vonalhibákat a szomszédos képpontok értékeinek átlagosával javítottam. Végül képenként 3-4 szakaszt jelöltem ki, amelyek a polimer réteget és a tiszta arany felületet is magukban foglalják, és az ezen szakaszok menti magasság-profil kiértékelésével (kézi illesztést követő leolvasással) határoztam meg az egyes polimer mintákhoz tartozó átlagos rétegvastagságot. Az AFM képeken kijelölt szakaszokat, és az ezek mentén kirajzolt magasságprofilokat összefoglaló ábrákat minden, vizsgált képre feltüntetek, de a profilok kinagyítását és az illesztést csak egy-egy esetben mutatom be. A leolvasott vastagságok összefoglalva: polimerizációs

AFM felvétel

profil

leolvasott vastagság

átlagos

ciklusszám

sorszáma

sorszáma

[nm]

vastagság [nm]

1. profil 2. profil 3. profil 4. profil 1. profil 2. profil 3. profil 1. profil 2. profil 3. profil 4. profil 5. profil 3. profil 1. profil 2. profil 3. profil 4. profil 1. profil 2. profil 3. profil

45 53 34 50 39 52 34 30 40 24 49 50 38 33 39 29 24 53 40 60

1. kép 25 ciklus 2. kép

50 ciklus

1. kép

2. kép 100 ciklus

1. kép

200 ciklus

1. kép

- 85 -

43,9

38,5

31,3

51,0

8.5.1. A 25 ciklussal polimerizált, imprintelt polimer vastagsága

- 86 -

45 nm = 195-150

Az első profilról leolvasott vastagság: 45 nm (198 nm – 153 nm), a további profilokról sorrendben 53 nm, 34 nm, 50 nm volt leolvasható.

- 87 -

A 25 ciklussal polimerizált mintáról készült második AFM felvételen kijelölt 3 profilból leolvasott vastagságok: 39 nm, 52 nm, 34 nm.

- 88 -

8.5.2. Az 50 ciklussal polimerizált, imprintelt polimer vastagsága

- 89 -

Az 50 ciklussal polimerizált mintáról készült első AFM felvétel 2. profiljáról leolvasható vastagság: 40 nm (436 nm – 396 nm). Az első kép 1. és 35. profiljairól leolvasott értékek rendre: 30 nm, 24 nm, 49 nm, 50 nm. - 90 -

Az 50 ciklussal polimerizált mintáról készült második AFM felvétel 3. profiljáról leolvasott vastagság: 38 nm. - 91 -

8.5.3. A 100 ciklussal polimerizált, imprintelt polimer vastagsága

- 92 -

A 100 ciklussal polimerizált mintáról készült első AFM felvétel 2. profiljáról leolvasható vastagság: 39 nm (84 nm – 45 nm). Az első kép 1. és 3-4. profiljairól leolvasott értékek rendre: 33 nm, 29 nm, 24 nm. - 93 -

8.5.4. A 200 ciklussal polimerizált, imprintelt poliemr vastagsága

- 94 -

A 200 ciklussal polimerizált mintáról készült első AFM felvétel 1. profiljáról leolvasható vastagság: 53 nm (129 nm – 76 nm). Az első kép 2. és 3. profiljairól leolvasott értékek: 40 nm, 60 nm. - 95 -