MOLEKULÁRIS GENETIKA A LABORATÓRIUMI MEDICINÁBAN Laboratóriumi Medicina Intézet 2017.
1
Történeti áttekintés
Humán genom projekt • 20-25 000 gén azonosítása • 1,800 betegséghez köthető gén • 1000 genetikai teszt • 350 biotechnológiai eszköz • Egyéni tulajdonságok meghatározása; populációs haplotípus meghatározás: HapMaps (haplotype map) • Etikai és törvényi szabályozás (ELSI)
3
A jelenleg folyó kutatások
• Gének pontos lokalizációja és funkciómeghatározása • DNS szekvencia elrendeződése • Kromoszómális struktúra és elrendeződés • Nemkódoló DNS szakaszok típusa, mérete, megoszlása, információtartalma és funkciója • A génkifejeződés szabályozása, fehérjeszintézis és poszt transzlációs események • SNP összefüggése különböző betegségekkel (egyéni érzékenység) • Multigénes alacsony penetranciájú megbetegedések • Összetett rendszerbiológia – mikrobiális konzorciumok környezeti célokra • Fejlődésgenetika,-genomika
Genomika
Strukturális genomika
Komparatív genomika
Funkcionális genomika
A genomika vizsgálómódszerei DNS
RNS
Szekvenciaanalízis: •Southern blot •Restrikciós térképezés •Sanger-féle lánctermináció •DNS microarray •NGS újgenerációs szekvenálás
Minőségi meghatározás: •Elektroforézis •Northern blot •Dot blot •in situ hibridizáció •Expressziós microarray • mRNS, miRNS, lnc-RNS
Amplifikálás •In vivo: DNS-klónozás •In vitro: PCR, real time-PCR
Amplifikálás: •Egy ill. kétlépcsős reverz transzkripciós real time PCR
Molekuláris hibridizációs technikák: Microarray Egy kisméretű (1-2 cm2) szilárd hordozó (pl. szilikon, üveg) felületére szabályos elrendezésben több 10000, eltérő szekvenciájú DNS próbát rögzítenek. A próbák 20-5000 nukleotid hosszúságúak, génekre vagy cDNS-ekre specifikus oligonukleotidok vagy in vitro szintetizált DNSfragmentumok. Az eljárás lényege, hogy mikroszkóp segítségével detektálják azokat a próbákat a chipen, amelyekkel komplementer DNS vagy RNS jelen van a mintában. Ennél a módszernél a mintát kell fluoreszcens módon jelölni. A klasszikus hibridizációs módszerekhez képest a chip technológiánál megfordult a próba és a minta viszonya: itt a próbát, míg az előző módszereknél a mintát immobilizálják.
Molekuláris hibridizációs technikák: Linear Array HPV genotipizáló teszt 1. HPV target DNS és humán genomiális DNS kinyerése 2. Target szekvencia amplifikáció (PCR): szelektív amplifikálás 37 HPV genotípusból származó DNS-hez és a humán β-globin génhez alkalmazott biotinilált primerekkel 3. Hibridizáció: Linear Array HPV genotipizáló csík a HPV és β-globin próbákkal fedve 4. Kimutatási reakció: sztreptavidintormaperoxidáz konjugátum és tetrametilbenzidin szubsztrátoldat 37 anogenitális HPV genotípus azonosítására alkalmas: 6, 11, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 59, 61, 62, 64, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 (MM9), 81, 82 (MM4), 83 (MM7), 84 (MM8), IS39, CP6108
Amplifikálás, valós idejű detekció: PCR A PCR-t a DNS-szál egy rövid, jól definiált szakaszának amplifikálására használják: egyetlen gén, génrészlet Az élő szervezetekkel ellentétben a PCR-folyamat csak kis DNS-szakaszok másolására képes, ezek hossza általában legfeljebb 10 kbp=1000 bázispár. A PCR reakció komponensei: 1.DNS-templát – ez tartalmazza a DNS-szakasz amplifikálandó régióját 2.Primerpár– amely meghatározza az amplifikálandó szakasz elejét és végét (forward, reverse primer) 3. 4.DNS-polimeráz – amely lemásolja az amplifikálandó szakaszt 5.Nukleotidok– amelyekből felépíti az új DNS-t
a
DNS-polimeráz
6.Puffer – amely biztosítja a DNS-polimeráz számára megfelelő kémiai környezetet
Amplifikálás, valós idejű detekció: PCR A Real-Time PCR során a DNS mennyiségének mérése fluoreszcens detektáláson alapul, amihez kettős szálú DNS-hez kötődő fluoreszcens festékeket vagy fluoreszcensen jelölt szekvenciaspecifikus próbákat használnak. A Q-PCR mérés alapvető feltétele, hogy a fluoreszcens jel erőssége egyenesen arányos legyen az amplikon mennyiségével.
Kvantitatív valós idejű PCR: kvantitatív HBV DNS kimutatás • HBV GeneProof HBV kvantitatív in vitro diagnosztikai teszt Kiindulási minta: serum Metodika 1. A minta előkészítése (dekontaminálás, DNS izolálás) 2. A kiválasztott target DNS amplifikálása PCR reakció során 3. Az amplifikációs termékek hibridizációja target specifikus oligonukleotid próbákhoz LightCycler 2.0 4. A hibridizált termékek detektálása kolorimetriás módszerrel
A betegségek genetikai és genomikai szerepének vizsgálata • szegregációs analízis: • Az adott genetikai eltérés öröklődésének (monogénes: autoszomális domináns, recesszív, X kromoszómához kötött, mitokondriális DNS-hez kapcsolt illetve poligénes), penetranciájának és kifejeződésének (kisfokú, enyhe, erős) vizsgálata. • linkage analízis (kapcsoltsági vizsgálat): • A betegség kialakításában résztvevő gén vagy gének egymással illetve más génekkel történő együttes öröklődésének meghatározása. • asszociációs vizsgálatok (társulás elemzés): • Azonosítja, milyen allélvariánsok szerepelnek hajlamosító tényezőként az egyes betegségekben. A család alapú asszociációs vizsgálatok a transzmissziós diszequilibrium tesztek. A populációs alapon szervezett vizsgálatok pedig allélcsoportok illetve haplocsoportok vizsgálata alapján történik. A legújabb kutatási irányvonal a teljes genom asszociációs vizsgálat (genome-wide association studies, GWAS).
Monogénes öröklődésű megbetegedések •Leggyakrabban mendeli öröklésmenet •Alacsony prevalencia 1:2000 •Magas penetrancia •A környezeti és életmódbeli hatások szerepe a betegség megjelenésére kisfokú
• A Genomikai Medicina és Ritka Betegségek Intézete (GRI) • diagnosztizálja azokat a betegségeket, melyek kialakulásában az egyes gének rendellenességei szerepet játszanak, illetve a humán genom bizonyos variációi ismeretében becsli a gyakori, komplex betegségek kialakulásának valószínűségét • genetikai tanácsadás, családtervezést, bizonyos betegségek és gyógyszer mellékhatások megelőzését
OMIM adatbázis
Mi a különbség mutáció és polimorfizmus között? Egy nukleotidot érintő polimorfizmus (SNP) vs. mutáció Több generáción keresztül történő szekvenciát érintő változás
• A mutáció véletlenszerű esemény
Time
csupán néhánynak van hatása a következő generációkban • A szekvenciák összehasonlítása az evolúciógenetika alapja
Összehasonlítás s1 és s2
s 1: A C A G A G T A – A C s 2: A C A T A – T A G A C szubsztitúció
deléció
inzerció
Genetikai tesztek Prevenciós tesztek: preimplantációs tesztek Prediktív tesztek: preszimptómás tesztek Diagnosztikus tesztek: prenatális és újszülöttkori diagnosztikus tesztek A teszteknek analitikai és klinikai validitáson kell átesniük széles körű felhasználásuk előtt! Genetikai tesztelés
Genetikai szűrés
Kiválasztott gének célzott vizsgálata • SNP fókuszált vizsgálata • LD (linkage disequilibrium) vizsgálat • Génkifejeződés mennyiségi vizsgálata • Hipotézis indukálta célzott genetikai vizsgálatok • „nagy gén nagy hatás” • APC, RET, BRCA, BRAF, p53 • Jelátviteli útvonal vizsgálata • EGFR, VEGF, TLR (receptoriális) • MAPK, JNK, RTK (kináz gátlás) • NfKB, Wnt (transzkripciós faktor)
Új generációs szekvenálás (NGS) • Az új generációs szekvenálási technikák segítségével, különböző módszerekkel gyorsan, nagy mennyiségű szekvencia adathoz juthatunk bármilyen eredetű nukleinsav mintából • Az új generációs szekvenálás felhasználási területei: a genom, a célzott (pl. EXOM) és az RNS szekvenálás • A új generációs szekvenálás alkalmas transzkripciós faktor kötőhelyek karakterizálására • személyre szabható diagnosztika és terápia
• http://elte.prompt.hu/sites/default/files/tananyagok/Gen technologia/ch05s02.html
Genome wide analysis studies (GWAS) • A humán genom teljes hosszában azonosítják az SNP-ket • Jelenleg folyamatban van a HapMap projekt, mely az emberi genom 3.1 millió SNP-re vonatkozó térképét tartalmazza rekombinációs forrópontokra, LD blokkokra és az SNP előfordulás alapvető összefüggéseire vonatkozóan. • A HapMap négy, földrajzilag és etnikailag eltérő népcsoportból származó 270 egyén teljes genom szekvenálásából származik. Eddig a vizsgált során az azonos népcsoportba tartozó személyeknél körülbelül 25-30%-os SNP átfedést azonosítottak. Kimutatták, hogy a rekombinációs arány szisztematikusan különbözik az egyes gének vonatkozásában illetve eltérő funkciójú gének között, valamint azonosítottak a populációs természetes szelekcióban szerepet játszó allél polimorfizmusokat.
Genome wide association studies
Manhattan plot: minden pont egy SNP-t jelöl, az x-tengelyen a lokalizáció az y-tengelyen az asszociáció szorossága látható. Jelen vizsgálat egy mikrocirkulációs rendellenességeket vizsgáló tanulmány része, melyben a kisérszűkülettel összefüggő SNP variánsok ábrázolódnak Ikram MK et al (2010) Four Novel Loci (19q13, 6q24, 12q24, and 5q14) Influence the Microcirculation In Vivo. PLoS Genet. 2010 6(10):e1001184
Poligénes és multifaktoriális betegségek • Több gén, génkomplexumok és környezeti hatások interferenciája befolyásolja a kialakulást • Populációs szinten magas prevalenciájú betegségek • Gének penetranciája változó, széles skálán mozog • Családi halmozódást mutathat a betegség és a génkomplexumok mutathatnak hasonlóságokat a családon belül, de többnyire nem figyelhető meg a családi öröklődési mintázat • Csupán a genetikai vizsgálattal nehéz egy személy lehetséges érintettségét pontosan meghatározni!!! • • • • • •
Hypertonia Stroke Sporadikus daganatok Diabetes mellitus Asthma Epilepszia
• Ritkán néhány veleszületett rendellenesség: • Szájpadhasadék • Velőcső defektusok
Genom-környezet interferencia • Gének Magas vagy alacsony penetranciájú • Környezet • Külső • fizikai • kémyiai • biológiai • társadalmi
Epigenetika • Örökölhető sejtfenotípus és génkifejeződés eltérések, melyek a DNS szekvenciától függetlenek: • Kromoszomális remodelling • Hiszton módosulás • DNS metilációs mintázat • Fehérjét nem kódoló RNS szakaszok: miRNS
http://learn.genetics.utah.edu/content/epigenetics/intro/
A genomika hatásai Molekuláris medicina • diagnosztika, prevenció • betegségek genetikai pediszpozíciójának meghatározása • molekuláris alapú egyénre szabott gyógyszerelés • molekuláris célzott terápia • donor-recipiens egyezőség meghatározása transzplantációs programban Mikrobiológia •patogének gyors azonosítása és célzott kezelése • új energiatermelési eljárások (bioüzemanyag) • környezeti szennyezők monitorozása • a toxikus anyagok biztonságos lebontása, megsemmisítése
A genomika hatásai Kockázatbecslés • az egészségügyi kockázat meghatározása fizikai és kémiai környezeti expozíció során, daganatkockázat DNS azonosítás (Igazságügyi orvostan) • áldozatok és elkövetők azonosítása • apasági és családi eredet meghatározás • biológiai szennyezők azonosítása Bioarchaeológia, Antropológia, Evolúció- és Migrációkutatás • a csírasejtes mutációk tanulmányozása • mitokondriális DNS, Y kromoszóma meghatározás
Elsi: etikai, jogi, és társadalmi következmények
• A genomikai információ személyes és megbízható kezelése biztosító
társaságok, alkalmazók, törvényhozók, oktatási intézmények, katonai intézmények és egyéb szerveket érintően. • Pszichoszociális hatás, stigmatizáció, diszkrimináció az egyéni genomikai különbözőségből fakadóan. • Reproduktív következmények becslése és szabályozása a reproduktivitást érintő döntéshozatalban. • Klinikai vonatkozások beleértve az orvosképzés, genetikai információ szolgáltatása az egészségügyi ellátó személyzet felé, a genetikailag elemzett személy ill. a népesség tájékoztatása a lehetőségekről és korlátokról, szociális kockázat, standard protokoll és minőségbiztosítás alkalmazása.
Hgp-n túl: mi a következő lépés?
HapMap Genetikai változékonyság meghatározása a humán genomban
Systems Biology Mikrobiális genom lehetőségei energiatermelés és környezeti célok felhasználására
