Molekuláris biológiai diagnosztika alkalmazása (HIV, HCV, HBV szabad vírus mennyiség meghatározás)
a napi rutin diagnosztikában Reichenberger Anna Mária , Dr. Sárvári Csilla Dr. Ujhelyi Eszter Fıvárosi Önkormányzat Egyesített Szent István és Szent László Kórház – Rendelıintézet V. Fertızı Belgyógyászat, Immunológiai Laboratórium
PCR Polymerase Chain Reaction Polimeráz Lánc Reakció alig több mint egy évtizede fedezték fel és azóta széles kırben elterjedt vizsgálat
2007-tıl COBAS Amplicor „real-time” rendszer
A HIV-PCR-en kívül,
Vizsgálati palettánk 2008-ban tovább bıvült
2008 februárjában a HCV, HCV 2008 májusában a HBV szabad vírus mennyiség meghatározás is
HIV
bevezetésre került a napi diagnosztikába.
HBV
HCV
1 nagy csı vagy 2 kis csı EDTA-s vér szükséges
A mintákat 6 órán belül centrifugálni kell (1600 g, 20 perc)
1100 – 1200 µl-enként csavaros kupakos mőanyag csövekben -70 °C –on tároljuk
HIV, HBV
HCV
szobahı
:
maximum 1 nap
nem tárolható
2-8C
:
5 nap
3 nap
-20 - -80 C :
tartósan tárolható
olvasztható :
5x
tartósan tárolható
2x!
RNS/DNS veszteség nélkül
Az eredmény szempontjából legideálisabb 2 órán belül lefagyasztani a centrifugált mintát
Ha a mintát más intézménybıl küldik, a vérvétel elıtt mindenképpen konzultáljanak a vizsgálatot végzı laboratóriummal!
Mikor, hogyan történjen a minta levétele, szállítása…
A PCR vizsgálatok eredményét nagyban befolyásolják: • Mintavételi módszer • Szállítás • Feldolgozás • Tárolás • Betegfaktorok (kor/tünet megléte, a fertızés stádiuma…)
Human Immunodeficiency Virus sejtmentes gömb alakú 100 nm átmérıjő RNS tartalmú vírus. Az AIDS kórokozója
100 nm
HIV Szerzett Immunhiányos tünetegyüttes
HIV ≠ AIDS
A fertızés átvihetı szexuális kontaktussal, fertızött vérrel vagy vérkészítményekkel, fertızött anyáról magzatra valamint anyatejjel.
٠a vírus szaporodása és kiürülése dinamikus folyamat ٠a plazma viraemia szintje stabil
- HIV mennyiségi PCR (egyéb labor. Markerekkel együtt) a HIV-1 pozitív betegek progressziójára és antivirális monitorozására
- Ferttızött anyák újszülötteinek vizsgálatára
HIV≠AIDS
Hepatitisek • 10 x könnyebben terjed, mint a HIV • Második leggyakoribb májbetegségi halál ok • Minden 12-dik ember hepatitis fertızött • Fıleg fertızött vér útján terjed (i.v. drog, szex, tetoválás, piercing)
DNS vírus 42 nm
Hepatitis „B” vírus • A ‘60-as évek óta lehet kimutatni • 1981 óta van ellene oltás Nálunk 1999. Július óta kötelezı (14 éves korban oltanak) • Vírushordozók aránya 0,5 – 1 % • Krónikus májbetegségek legfıbb okozója • 300-350 millió krónikus beteg világszerte • Évente 6 millió ember hal meg HBV szövıdményben
Egy szálú RNS vírus
HEPATITIS „C” vírus • 1989-ben regisztrálták • Poszt transzfúziós Hepatitisek 90-95 %-áért felelıs • 1992 óta szőrik a véradókat • 70 %-ban alakul ki májbetegség a fertızötteknél • Magyarországon 160.000 embert regisztráltak • Világszerte 170 millió fertızött • Tünetmentes hosszú lappangási idı
A fertızöttek 70%-ánál alakul ki májbetegség
Súlyos esetben májzsugor vagy akár májcarcinoma
20 hepatitis centrumban Folyamatosak a szőrések
A kétféle hepatitis évente több, mint másfél millió ember halálát okozza világszerte
Védekezés: • Hepatitis „B” ellen → védıoltás • Hepatitis „C” ellen → odafigyelés
HBV és HCV PCR vizsgálatok:
Egyéb vírusspecifikus markerekkel együtt - segít a diagnózis felállításában - krónikus betegek terápiás gondozásában
Kvantitatív HCV PCR Interferon (IF) terápia monitorozása Monogram
1. vizsg.
2. vizsg.
V. A.
2.980.000 IU/ml
RNS nem detektálható
24.600
48
E. A.
IU/ml
G. K. Cs. B. G. L. B. Z.
3. vizsg.
megjegyzés
Eredményes RNS nem detektálható
1.510.000
3.990.000
IU/ml
IU/ml
352.000
214.000
372.000
IU/ml
IU/ml
IU/ml
4.530.000
M.H.A.
IU/ml
Méréshatár alatt
601.000
23.700
914
IU/ml
IU/ml
IU/ml
terápia Interferon (IF) Kezelés a PCR alapján eredménytelen Elviekben abba kéne hagyni az IF terápiát
A PCR vizsgálat
AmpliPrep feltöltése reagensekkel és egyéb kellékekkel
Az automata 3 fı lépése • Minta DNS/RNS izolálása – AmpliPrep • reverz transzkripció – TaqMan48 • Amplifikálás, jelölt próba mérése – TaqMan48
AmpliPrep/TaqMan teszt Valós idejő PCR technológia Adott számú ciklus Ciklusonként növekvı jelzıfesték intenzitás Vizsgált vírus független azonosítása Qualitatív és quantitatív eredmény egyszerre
Target Not Detected
Méréshatár alatt
-
RNS/DNS nem kimutatható
-
van kimutatható, de nem mérhetı
vírusmennyiség a mintában Mért érték A méréstartomány
: HIV esetében
40 – 10.000.000 cp/ml
HCV esetében 15 – 69.000.000 IU/ml HBV esetében 12– 110.000.000 IU/ml
Méréshatár felett
- Az adott értékhatár feletti vírusmennyiség
A vizsgálatok gyakoriságát protokoll írja elı, amelyet a minden évben megtartott consensus meeting határoz meg. (lsd Infektológia 2008 decemberi száma)
2000-2006 összesen 6079 PCR a Real-time rendszer bevezetése - óta: 2007-ben összesen: 1211 2008 HIV 1290 2008 (februártól) HCV 615 2008 (májustól) HBV 220 2008-ban Összesen: 2125 2009 HIV 2009 HCV 2009 HBV 2009-ben Összesen: (augusztus 25-ig)
971 833 225 2029
A negatív szerológiai eredményt adó minták aránya a kért PCR vizsgálatokhoz képest
763
800 700
HCV PCR kérés
600 500
HCV szerológia negatív HBV PCR kérés
400 300 200
200
100 0
14 = 7%
HBV HCV 38 = 5%
HBV szerológia negatív
Rutinszerően elvégezzük a konfirmáló ELISA vizsgálatot…
…az igen költséges PCR vizsgálat elıtt
160
2008 2009
140
HIV PCR
120
Vizsgálat kérések emelkedése havi lebontásban
100 80 60 40 20 0 I.
140
2008 2009
120
HCV PCR
40
30
80
25
V.
VII.
IX.
XI.
HBV PCR
2008 2009
35
100
III.
20
60
15
40
10 20
5
0 I.
III.
V.
VII.
IX.
XI.
0 I.
III.
V.
VII.
IX.
XI.
