Real-time PCR - as flexible as you are
Molekuláris diagnosztika Becságh Péter Roche Magyarország Kft MOLSZE 2007. 08. 30.
Diagnostics
CE-IVD LightCycler System
• BIOKÉMIA: az élet molekuláris logikája • MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA: (biokémia + genetika +sejtbiológia) • koncepció, stílus, "az amivel a molekuláris biológusok foglalkoznak" (F. Crick) • Az élet bonyolultságát (komplexitás) az információs makromolekulák adják.
Diagnostics
Diagnostics
• DNS mint örökítıanyag (RNS vírusok, prionok) • Információáramlás: DNS « RNS › fehérje („centrális dogma”) • Lineáris információ › térbeli szerkezet › specifitás, funkció
Diagnostics
• Fehérjék szerkezet és funkció összefüggései; molekuláris kölcsönhatások: szerkezeti biológia • Az élı rendszert fenntartó fluxusok; metabolizmus, biokatalízis, reguláció: bioenergetika, anyagcsere biokémia,enzimológia • Információ tárolása és feldolgozása: „molekuláris biológia” • Teljes genomok, fehérje készletek, molekuláris interakciós hálózatok: genomika, proteomika, bioinformatika
Diagnostics
VIZSGÁLATI SZINTEK
• DNS minıségi, mennyiségi • RNS minıségi, mennyiségi • Fehérje, minıségi, mennyiségi
Diagnostics
Molekuláris vizsgálati területek
DNS (genomi RNS) A természetben elıforduló
Legspecifikusabb biomarkere minden élı szervezetnek
Diagnostics
Molekuláris Diagnosztika
Molekuláris diagnosztika a klinikai laboratóriumi diagnosztika azon ága, amely biológiai markerként DNS-t és RNS-t használ a klinikai vizsgálatokhoz.
Diagnostics
PCR
ELISA
RT PCR
FACS Fehérje chip
Chromogene Assay RAPD
AFLP
RFLP CobasAmplicorPCR Fragment Analízis, Real time PCR Génexpresszió, allél azonosítás, Microsatellita vizsgálat Northern blot Linear array
Western blot RTS
LC, GC - MS Fehérje szekvenálás NMR RTG Kristallográfia
PCR ELISA
DDPCR
Diagnostics
DNS, RNS, Fehérje vizsgálati eljárások
PFGE
SAGE Southern blot
pyroszekvenálás szekvenálás
GenChip Micro array
•
Northern, Suthern, Western Blot
•
Real time PCR
•
Differential Display
•
Microarrays
Singleplex
Multiplex
Diagnostics
Real-time PCR - as flexible as you are
Gyors, valós-idejő PCR rendszer, szepszist okozó mikróbák azonosítására
Diagnostics
CE-IVD LightCycler System
Nukleinsav célpontok baktériumok identifikálásához • • • • • • •
Virulencia gének toxin gének specifikus genom fragmentek 16S vagy 23S rDNS hsp65 gén gyrB gén 16S-23S rDNA spacer
Ribosomális RNS operon • Általános • A transzkriptumok a riboszóma fuknkciójához nélkülözhetetlenek • Többszörös kópiaszámban fordul elı • struktúra : 16S-spacer-23S-spacer-5S • tRNS gének a spaceren helyezkednek el
16S-23S rDNS spacer tulajdonságai • Amplicon hossz : 200 - 1000 bp – általában 500 bp
• Csoport és/vagy species specifikus különbségeket hordoz
Konzervált területek az rRNS operonon belől C
D
E
1
40
1391
16S rRNS Gürtler et al., 1996
F
G
H I J
tRNSala
B
tRNSile
A
1543
1
spacer
474
23S rRNS
2905
rDNS spacer nukleinsav szekvencia illesztés LMOB.SEQ LMOC.SEQ LMOF.SEQ LINB.SEQ LIVB.SEQ LSEB.SEQ LSEC.SEQ LWEB.SEQ LGRB.SEQ LGRC.SEQ LMUB.SEQ
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 * * * * * * * * * * * * * * TAAGGAAAAGGAAACCTGTGAGTTTTCGTTCTTCTCTATTTGTTCAGTTTTGAGAGGTTACTCTCTTTTATGTCAGATAAAGTATGCAAGGCACTA--TGCT-TGAAGCATCGCGCCACTACATTTTTGACGGGCCTATAGCTCAGCTGG ................................................................................................--....-............................................... ................................................................................................--....-............................................... ..........................................................C........G................C........AC.--....-..G.....A...................................... .....................................G....................C........AG...............C...C...G.GT--...C-.TGG...AA.A...........A........................ .....................................G..............................G...............C...C.....GT--...C-.TGG...AA.A...........A........................ ....................T................G..............................G...............C...C.....GT--...C-.TGG...AA.A...........A........................ ....................T................G..............................................C.......TAC.--....C..G.....A.T...........A........................ .......T.......T..C.-T.....A.......---.....................------....C.C..TA...G.-A...---...T..TAT.T..-.T..--..G.GCAGC.A.TC.G.AAA.T................... .......T.......T..C.-T.....A.......---.....................------....C.C..TA...G.-A...---...T..TAT.T..-.T..--..G.GCAGC.A.TC.G.AAA.T................... .......T.......T..C.-T.....A.......---.....................------....C.C..TA...G.-A...---...T..TAT.T..-.T..--..G.GCAGC.A.TC.G.AAA.T...................
LMOB.SEQ LMOC.SEQ LMOF.SEQ LINB.SEQ LIVB.SEQ LSEB.SEQ LSEC.SEQ LWEB.SEQ LGRB.SEQ LGRC.SEQ LMUB.SEQ
150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 * * * * * * * * * * * * * * * TTAGAGCGCACGCCTGATAAGCGTGAGGTCGATGGTTCGAGTCCATTTAGGCCCACTTTTTCTTTCTGACATAAGAAATACAAATAATCATA-CCCTTTTAC---GGGG-CCTTAGCTCAGCTGGGAGAGCGCCTGCTTTGCACGCAGGA ......................................................................GC....................-T.......T---....-........................................ ............................................................................................-.........---....-........................................ .......................................................................CG.AG..A...TTC...TTA.-TT.C...TA---....-........................................ .......................................................................G......C..----TG.ATA.-..TA....A---....-........................................ .......................................................................G.......---C..TTG..C.-T...A...ATAA....-........................................ .......................................................................G.......---C..TTG....-A...A...TTAA....-........................................ .......................................................................C..AG..A.....AT..T..TT.....C..A---....G........................................ ...............................................................A..--....------------.TC.TT..-TATC....T---....-........................................ ...............................................................A..--....------------.TC.TT..-TATC....T---....-........................................ ...............................................................A..--....------------.TC.TT..-TATC....T---....-........................................
LMOB.SEQ LMOC.SEQ LMOF.SEQ LINB.SEQ LIVB.SEQ LSEB.SEQ LSEC.SEQ LWEB.SEQ LGRB.SEQ LGRC.SEQ LMUB.SEQ
300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 410 420 430 * * * * * * * * * * * * * * GGTCAGCGGTTCGATCCCGCTAGGCTCCACCAAAATTGTTCTTTGAAAACTAGATAAGAAAGTTAGTAAAGTTAGCATA---GATAATTTAT-TATTTATGACACAAGTAACCGAGAATCATCTGAAAGTGAATCTTTCATCTGATTGGA ...............................................................................---..........-......................................................... ...............................................................................---..........-......................................................... .............................................G.................................---..........-.....................................................A... ...............................................................................---A...GG.A.C-......................................................... ...............................................................................---AG..G.A..AC..................................................A...C.. ...............................................................................---AG..G.G..AC..................................................A...C.. ...............................................................................---.....G.A..-..................................................A...... ...................................-......................................T..C.AGT..A..C..G.-A.------.A.G............................A.....CG..--..... ...................................-.........T............................T..C.AGT..A..C..G.-A.------.A.G............................A.....CG..--..... ...................................-......................................T..C.AGT..A..C..G.-A.------.A.G............................A.....CG..--.....
LMOB.SEQ LMOC.SEQ LMOF.SEQ LINB.SEQ LIVB.SEQ LSEB.SEQ LSEC.SEQ LWEB.SEQ LGRB.SEQ LGRC.SEQ LMUB.SEQ
440 450 460 470 480 490 * * * * * * AGTA-TCATCGCTGATACGGAAAATCAGAAAAACAACCTTTACTTCGTAGAAGTAAATT T...-...................................................... ....-...................................................... ....-.................C.................................... ....-..............A..........................A.C.......... C...-.............A..C...T.....................AC.......... C...-.............A..C...T.....................AC.......... ....-.............CA.CG..T......................T.......... ...GG..........-C..C.G..GA..C....AG...-....GCAA.C.-C.....-. ...GG..........-C..C.G..GA..C....AG...-....GCAA.C.-C.....-. ...GG..........-C..C.G..GA..C....AG...-....GCAA.C.-C.....-.
Szekvencia Szekvencia illesztés illesztés Chlamydia Chlamydia trachomatis trachomatis és és más más Chlamydia Chlamydia fajok fajok plasmid plasmid szekvenciái szekvenciái Azonos Azonos fajba fajba tartozó tartozó törzsek vagy izolátumok törzsek vagy izolátumok szekvenciái szekvenciái Közeli Közeli fajok fajok szekvenciái szekvenciái
Jellemzı Nukleinsav szakasz felsokszorozása, PCR
1. A nukleinsav izolátum kettıs szálú DNS termékének denaturálása hıvel 1. 2.
3.
2. Annealing, rövid, mesterséges nukleinsav darabok (Primerek) bekötıdése a megfelelı, specifikus DNS szakaszra 3. Lánchosszabítás(de novo synthesis)a Taq-Polymerase enzim meghosszabítja a bekötıdött primereket 4. Detektálás specifikus, mesterséges nukleinsav darabokkal a PCR-t követıen (AMPLICOR, COBAS AMPLICOR) 4. vagy a PCR alatt ciklusról ciklusra (LighCycler, COBAS TAQMAN48)
5
te
pla5
m Te 5
x = G:T mismatch = A:C mismatch
5 5
x
5 5
x
F
P r o b e
x 5 62
58
54
Temperature ( C)
50
Diagnostics
Nukleinsav próba bekötése
A specifikus nukleinsav próba lehetıséget ad a PCR végén a keletkezı jellemzı termék rögzítésére és elválasztására, másrészt valós idejő technika alkalmazása esetén a PCR során keletkezı termékek mennyiségének és minıségének folyamatos követésére.
Diagnostics
PCR technikával felsokszorozott jellemzı nukleinsav szakasz
Lb2 conservative
high variability
Lb1 low variability
conservative
Probe low variability
Spacer Technológia
16S
23S
ITS (Spacer)
Generikus Primerek (“pan bacteria”)
Specifikus nukleinsav próba
Amplifikációs görbe Group (e.g. Enterobacteriaceae)
Ciklusok
Olvadáspont analízis E. coli
Ent.bacter cloacae
Tm
Diagnostics
Diagnostics
Olvadáspont analízis
Diagnostics
Munkafolyamat
Minta
Teljes Vér (EDTA) Minta Elıkészítés
Lízis, Nukleinsav kivonás
PCR Analízis
Gram (-)
Gram (+)
Fungi
• Escherichia coli • Klebsiella (pneumoniae, oxyt.) • Serratia marcescens • Enterobacter (cloacae, aerog.) • Proteus mirabilis • Pseudomonas aeruginosa • Acinetobacter baumanii • Stenotrophomonas maltophilia
• Staphylococcus aureus • CoNS • Streptococcus pneumoniae • Streptococcus spp. • Enterococcus faecium • Enterococcus faecalis
• Candida albicans • Candida tropicalis • Candida parapsilosis • Candida krusei • Candida glabrata • Aspergillus fumigatus
MRSA (mecA) VRE (van A, B)
Diagnostics
Fertızés kimutatása 6 órán belől
1. nap
2. nap
3. nap
4. nap
kezelés
2-3 nap
hemokultúra
Gram
Species
rezisztencia
tenyésztés
kezelés
6h PCR
Gram, Species, Rezisztencia (VRE & MRSA)
PCR
Diagnostics
Hagyományos és Molekuláris Diagnosztika összehasonlítása A PCR korábban ad használható eredményt
Példa: Intenz Sepsis in Intensive Care Medicine Expected medical benefit: Improved initial antibiotics therapy Decreased Sepsis severity Reduced resistance of nosocomial pathogens
Benefit for the patient:
Less risk of complications
Economic benefit: Shorter stay in intensive care * Enhanced competitiveness (lower DRG case cost; improved infection statistics)
Freed ICU beds available for elective surgery
* 26% had incorrect initial “empiric” antibiotic therapy, with 3,1 additional ICU days on average: Source: M.H.Kollef et al, Inadequate Antimicrobial Treatment of Infections, CHEST 1999, 115:462-474
Diagnostics
Our approach: PCR speeds up microbiology
