Microbiologische media … toetsen, of je kan het schudden
Praktijkdag microbiologie: ontwikkelingen rond methoden
Rijkelt Beumer Wageningen Universiteit Stichting FiMM
Microbiologische media … toetsen, of je kan het schudden
Klinkt ouderwets … microbiologische media: maar ze zijn nog steeds nodig: discussie over voorkant van het methodenboek:
moest daar niet een modern plaatje op?
Standaardisatie in levensmiddelenmicrobiologie Er geldt (nog) een algemene regel voor het gebruik van methoden in de levensmiddelenmicrobiologie:
The law of confusion: Het aantal methoden (M) om een (groep van)
micro-organisme aan te tonen is: M = N + 1
Standaardisatie in levensmiddelenmicrobiologie
Microbiologen gebruiken eerder elkaars tandenborstel dan elkaars methoden (naar DAA Mossel
Toetsen van media volgens ISO 11133 kent een lange historie
Ik denk dat het begin jaren ‘90 begon
met 3 verschillende werkgroepen nu is het 1 grote groep en over een paar jaar (?) is het echt af? 2017?
Definitie: wat is een voedingsbodem samenstelling van stoffen in vloeibare, half vaste of vaste vorm bestaande uit natuurlijke en/of synthetische bestanddelen die bedoeld zijn de groei van micro-organismen te bevorderen (al dan niet met remming van bepaalde micro-organismen)
gebruikt worden bij het identificeren van mo of de micro-organismen in leven moeten houden.
Indeling van voedingsmedia ingedeeld naar gebruik
* * * * * * *
transportmedium bewaarmedium suspensie/verdunningsmedium resuscitatiemedium (voor)ophoping selectieve ophoping (selectief) isolatie/tel-medium
Indeling van voedingsmedia
ingedeeld naar bereiding
* kant en klaar medium helemaal kant en klaar medium moet nog opgesmolten worden, evt. toevoegingen * medium bereid uit pot van fabrikant, evt. toevoegingen
* medium bereid uit de ‘losse’ componenten
Het begint met water
- minder dan 100 kve/ml, als het kan <100 ml - geleidbaarheid <25 Scm-1 - liever nog <5 Scm-1
- Pas op: demi-water: bevat vaak veel mo
Dan komt het bereiden van media -
afwegen, water toevoegen, oplossen indien nodig, pH meten afvullen in buizen, flessen steriliseren (autoclaaf, filtreren) maken en toevoegen supplementen gebruiken na drogen van platen
-
bewaren en houdbaarheid opsmelten en afkoelen ontluchten toevoegen supplementen gebruiken na drogen van platen
Toetsen van media: waarom? * acceptatie van een batch medium
* geschikt om te gebruiken * geeft consistente resultaten
* effect bereiden * effect houdbaarheid
* effect dalende wateractiviteit (syneresis)
Toetsen van media: door wie?
Commerciële bedrijven, die kant en klaar media, gedeeltelijk bereide media, of droge media produceren/distribueren
Niet-commerciële bedrijven die media doorgeven aan andere partijen Microbiologische laboratoria die media maken voor eigen gebruikderden
Toetsen van media: nodig Toetsstammen (zie hiervoor: www.wfcc.info) Samenwerkingsverband van de International Union of Biological Sciences (UBS) en Microbiological Societies (IUMS) Catalogus (vrij te downloaden) met alle referentiestammen voor het toetsen van kweekmedia
Bewaren/aanhouden van toetsstammen
ontvangst referentiestam
verifiëer en archiveer de bijgeleverde documenten
verifiëer reinheid en karakteristieken
Nee
klopt het? Ja
reconstituteer de stam volgens instructies.
maak een verdunning in een geschikt medium
isoleer de stam op een geschikt medium (bv TSA)
verdeel in buisjes en bewaar in diepvriezer
reference stock
ontdooi snel
kweek op geschikt vast medium, dat wordt de werkcultuur.
verifiëer reinheid en morfologie
Nee
klopt dit?
Ja
bereid inoculum voor toets
In plaats van het bereiden van een suspensie voor de test, mag ook: - de stam geënt worden op een geschikt medium, bv een schuine buis TSA, bebroed en max 4 weken bewaard worden; dit is de ‘stock culture’
- er mag ook een suspensie gemaakt worden, die ingevroren wordt bij -70ºC; dit is de ‘stock culture’ beide kunnen (later) afgestreken worden op een geschikt medium; dit is de werkcultuur hiervan moet nog geverifiëerd worden of alles klopt
Toetsen van media: welke toetsstammen? Aerococcus viridans Aspergillus brasiliensis Bacillus cereus B. subtilis ssp spizizenii Campylobacter jejuni Citrobacter freundii Clostridium perfringens Cl. bifermentans Enterobacter aerogenes Enterococcus faecalis E. faecium; E. hirae E. coli (2x); E. coli O157 Klebsiella pmeumoniae Lactobacillus sakei Lactococcus lactis Legionella pneumophila
L. anisa Listeria monocytogenes 4b Listeria innocua Proteus mirabilis Pseudomonas aeruginosa Ps. fluorescens Saccharomyces cereviseae Salm. Typhimurium of Enteritidis Staph. aureus Staph. epidermidis Staph. saprofyticus Vibrio cholerae non O1/non O1139 V. furnissii V. vulnificus V. parahaemolyticus Wallemia sebi Yersinia enterocolitica
Toetsen van media Hoeveelheid micro-organismen (kve) nodig voor:
Productiviteit, kwantitatief, plaat verdunningsvlst
80-120 kve 103-104 kve
Productiviteit, kwalitatief plaat kwalitatief, ophopingen kwalitatief, vaste transportmedia
103-104 kve ≤ 100 kve 104-106 kve
Selectiviteit, vast, vloeibaar
104-106 kve
Specificiteit, vast
103-104 kve
Toetsen van media Toetsen: - kwantitatief of kwalitatief, hoeft niet beide - media voor tellingen: altijd kwantitatief - nieuw medium/nieuwe producent: bvk kwantitatief
- hoe vaak, en na welke handeling? … dat bepaalt de eindgebruiker Let op: interacties tussen stammen in vloeibare media!
Toetsen van vaste media
kwantitatief uitplaten
kwalitatief uitstrijken
andere kwalitatieve methoden
Kwantitatief uitplaten: ‘wanted’
productiviteit ‘wanted’ mo productiviteits ratio (PR) PR = kve te testen medium kve referentiemedium selectieve media: niet selectieve media: PR > 1.4: zoek oorzaak!
PR 0,5 PR 0,7
Een voorbeeld van kwantitatief uitplaten
42 ref.medium (ns)
25 testmedium (ns)
25/42 = 0.6 (<0.7), dus niet goed
Kwantitatief uitplaten: ‘unwanted’
selectiviteit ‘unwanted’ mo Selectiviteits Factor = Do ref.medium – Ds test medium Do: hoogste verdunning met groei op niet sel. ref.medium Ds: hoogste verdunning ,met groei in selectief testmedium (gebruik de logwaarden: de 10-4 verdunning is 4)
SF 2
Kwalitatief uitstrijken
Interpretatie groei van 0-2
2 PR
1
‘wanted’: 2
0
‘unwanted’: (partly) inhibited, 0 of 1
1,4 1,2 1
0,8 0,6
1,31
1,27 1,13
0,96
0,84
0,8
0,4
0,2 0
PCA Difco
PCA Merck fresh
PCA Oxoid
2 weeks Minimum PR: 0.7
Example: specificity – ALOA Criterion: blue/green colonies with (Lm) or without precipitation halo (Li)
•L. innocua
•L. monocytogenes
ALOA- Selective enumeration L. monocytogenes Growth characteristics, different suppliers
AES
Oxoid
Biomerieux
Productivity Results - ALOA 1,8 1,6
productivity ratio
1,4 1,2
1 0,8 0,6
1,19
0,995
1,005
2 weeks
4 weeks
0,4
0,2 0
fresh
•Minimum PR: 0.5
Productivity Results - TSC 1,8
1,6
productivity ratio
1,4
1,2
1
Merck 1.2
1.37
0,8
Oxoid
0,6
0,4
0.65 0.68
0,2
0.15 0.12
0
fresh
2 weeks
4 weeks
Minimum PR: 0.5
- geen verschil tussen aeroob of anaeroob bewaren - geen verschil tussen giet- of strijkplaat
- tot 2 weken bewaren geen invloed •E.coli: groei op alle Merck gietplaten
Productivity ratios MYP
Productivity > 0.5 No E. coli growth Good specificity
Productivity Ratio
1.5
1.0
Merck Oxoid Difco
* *
0.5
Supplier
pH declared
Fresh
s 4
W
ee k
s ee k W 2
Fr es h
0.0
2 weeks
4 weeks
pH
Aw
pH
Aw
pH
AW
Merck
7.2 +/- 0.2
7.2
0.989
7.2
0.986
7.2
0.986
Oxoid
7.2 +/- 0.2
7.0
0.988
7,0
0.986
7,0
0.988
Difco
7.2 +/- 0.1
7.2
0.993
7.2
0.992
7.2
0.992
Productivity ratios CFC
Productivity > 0.5
Good selectivity
Coloration differed depending on supplier
Productivity ratio
1.5
Merck Oxoid Biokar
1.0
0.5
Merck Oxoid Biokar
pH declared 7.1 +/- 0.2 7.1 +/- 0.2 7.1 +/- 0.2
Fresh pH 7.0 7.1 7.1
Aw 0.992 0.993 0.995
8 days pH ------------7.1
Aw ------------0.997
s 4
2
Supplier
W ee k
s W ee k
ay s D 8
Fr es h
0.0
2 weeks pH Aw 7.1 0.995 7.1 0.994 7.1 0.997
4 weeks pH 7.1 7.2 7.2
AW 0.992 0.991 0.994
Toetsen van vloeibare media kwantitatieve buismethode: productiviteit
ent ≤100 kve/10 ml en bebroed, onderzoek 10µl: >10 kve van max 10kve/ml naar 1000 kve/ml? selectiviteit: laatste verd. werkcultuur (>10 kve/ml), delen door laatste verd. gg (<10 kve) in 10 µl. SF ≥2 kwalitatieve buismethode (1 buis target, de ander nt, of mix) target (≤100 kve) en non-target (>1000 kve); bebroed zie boven voor productiviteit; gg (<10 kve) voor selectiviteit
kwalitatieve éénbuismethode (troebeling)
geen (0), lichte (1) of duidelijke (2) troebeling
Kwalitatieve methode (twee buizen)
EE-broth
Productivity test
Sufficient growth on VRBG plates(cfu>10)
Selectivity test
Criteria: total inhibition on TSA pH declared
Fresh
Week 2
Week 4
E. faecalis
pH
E. faecalis
pH
E. faecalis
pH
Oxoid
7.2±0.2
0
7.0
0
7.1
0
7.0
Merck
7.2±0.2
0.33
7.0
0
7.1
3
7.1
BD
7.2±0.2
Batch 1
26
7.2
>126
7.2
23
7.2
Batch 2
>174
7.1
Fraser
Productivity test
Sufficient growth on ALOA plates(cfu>10)
Selectivity test
Criteria: <100 colonies of E. coli and E. faecalis pH declared
Batch Fresh
Week 1
E.coli
E. faecalis
pH
1
0
>34.11
7.0
2
0
>100
6.9
Week 2
E.coli
E. faecalis
pH
E.coli
E. faecalis
pH
0
>66.67
6.9
0
>100
6.9
on TSA Oxoid
7.2±0.2
Merck
7.2±0.2
0.33
0
7.0
0
0
6.9
0
0
6.9
BD
7.2±0.2
0
0
7.1
0
0
7.1
0
0
7.1
Some of the plates exceed the criteria
Conclusion: Performance of Oxoid is not satisfactory
Regular versus expired media! Rappaport Vassiliadis
RVS selective enrichment for Salmonella Control strains:
S. Typhimurium ATCC 14028 +E. coli ATCC 25922 +Ps. aeruginosa ATCC 27853
Criteria ISO > 10 colonies on XLD
Result RVSregular → 1.3log5 Result RVSexpired → 4.5log4
Regular versus expired media! Rappaport Vassiliadis
Control strains: E. coli ATCC 25922 Criteria ISO < 100 colonies on TSA
Result RVSregular → No growth Result RVSexpired → 4.5 cells
Control strains: E. faecalis ATCC 29212 Criteria ISO < 10 colonies on TSA
Result RVSregular → No growth Result RVSexpired → 0.2 cells No growth
Toetsen van microbiologische media Joint Working Group ISO/TC 34/SC 9/WG 5 and ISO/TC 147/SC 4/WG 12
Microbiology of food, animal feed and water – Preparation, production, storage and performance testing of culture media Bevestigingsmedia en reagentia volgende telefonische vergadering: 30 april volgende bijeenkomst: waarschijnlijk dit najaar
Begonnen in de jaren ‘90; in 2005 dachten we: still a long way to go? En nu? ….
Dank aan MSc-studenten, Wilma Hazeleger en Heidy den Besten van de lsg FHM. WUR
