Symposium
Micro-organismen, zo hou je ze in de hand
Wageningen, 26 januari 2016
FiMM, Postbus 381, 6700 AJ WAGENINGEN Tel. 06-44834988,
[email protected], www.fimm.nl
1
Programma Programma
Dinsdag 26 januari 2016, Hof van Wageningen te Wageningen
09.15 - 10.00
Ontvangst, koffie en thee, expositie apparatuur
10.00 - 10.10
Welkom en inleiding. Dr. Rijkelt Beumer (Wageningen Universiteit / FiMM)
10.10 - 10.40
Milde conservering: kan het beter dan hitte pasteurisatie? Dr. ir. Ariette Matser (Knowledge leader Sustainable Processing, Wageningen UR Food & Biobased Research)
10.40 - 11.10
Statistiek in relatie tot microbiologisch onderzoek (validatie, meetonzekerheid) Dr. Jo Klaessens (StatAlike BV)
11.10 - 11.40
Koffie en thee
11.40 - 12.10
Pathogenen in voedsel en mensen: monitoring door NVWA Ing. Coen van der Weijden (Senior Inspecteur, Nederlandse Voedsel en Waren Autoriteit)
12.10 - 12.40
Pathogenen in voedsel en mensen: spelden in twee verschillende hooibergen? Dr. Ingrid Friesema (Epidemioloog, Epidemiologie en surveillance van infectieziekten Clb-RIVM)
12.40 - 14.00
Lunch
14.00 - 14.30
Holy grail of microbiology testing: are we getting any closer? Dr. Adrianne Klijn (Group Leader Microbial and Molecular Analytics, Nestle Research Centre)
14.30 - 15.00
Clostridium botulinum; wat is het risico voor kant-en-klaar vacuüm of MAP verpakte producten Dr. ir. Marjon Wells-Bennik (Principle Scientist Food Safety, NIZO food research)
15.00 - 15.30
Beheersing en detectie van microbiële contaminatie via lucht Ir. Frans Saurwalt (Technisch manager contamination control, Kropman)
15.30 - 15.45
Afsluiting Rijkelt Beumer (Wageningen Universiteit/FiMM)
15.45 - 17.00
Hapje & drankje
2
Veilig voedsel door kennis FiMM geeft diverse cursussen levensmiddelenmicrobiologie en organiseert symposia en workshops om de kennis van u of uw collega’s over de microbiologie van voedingsmiddelen te vergroten. Cursus Levensmiddelenmicrobiologie en –hygiëne De hygiëne tijdens het productieproces bepaalt grotendeels de veiligheid en microbiologische kwaliteit van levensmiddelen. Daarvoor is een gedegen kennis nodig van micro-organismen: wat is hun gedrag in levensmiddelen en in de (productie)omgeving. Dat is wat u leert bij deze cursus. Deze vijfdaagse cursus levensmiddelenmicrobiologie en -hygiëne op hbo-niveau is bestemd voor mensen die bijvoorbeeld werkzaam zijn in de levensmiddelenindustrie, bij controlerende instanties of adviserende bedrijven. Vervolgcursus Levensmiddelenmicrobiologie Voor uw voedselveiligheidssysteem is een gevareninventarisatie onmisbaar. U bent verplicht een risicoanalyse op te stellen die degelijk onderbouwd is. Hoe u dat moet doen, dat leert u tijdens deze driedaagse cursus waarbij u vooral zelf aan de slag gaat. Via praktijkgerichte oefeningen leert u welke pathogene micro-organismen relevant zijn in uw grondstoffen, halffabricaten en/of eindproducten. U leert werken met de computerprogramma’s Risk Ranger®, Combase en Pathogen Modelling Program (PMP). Verder maken wij u vertrouwd met het uitvoeren van literatuuronderzoek zodat u uw risicoanalyses goed kunt onderbouwen. Seminar Listeria monocytogenes: voorkomen is beter dan genezen Listeria monocytogenes is de veroorzaker van listeriose, een infectie met soms een dodelijke afloop. L. monocytogenes komt algemeen voor en wordt, in wisselende aantallen, aangetroffen in vrijwel alle rauwe grondstoffen: groente, fruit, vis, vlees en melk. Omdat Listeria zich gemakkelijk vestigt in de productieomgeving van levensmiddelen, wordt deze ziekteverwekker vaak aangetroffen op moeilijk te reinigen oppervlakken. Via die besmette oppervlakken (bijvoorbeeld snijmachines) is besmetting van producten mogelijk. Daarom eist de wetgever een gedegen risicoanalyse voor deze producten om de kans op ziekte zo klein mogelijk te maken. Hoe? Dat leert u onder meer tijdens dit seminar. Workshop Kwaliteit van Microbiologische media Ook in de moderne microbiologie worden nog steeds traditionele voedingsbodems gemaakt om micro-organismen te laten groeien. Van al die media moet de gebruiker zeker zijn dat de samenstelling ervan geen of nauwelijks invloed heeft op de aanwezige (gezochte) micro-organismen. Controle van de media is noodzakelijk. In 2014 werd de nieuwe norm 'Microbiology of food, animal feeding stuffs and water - Preparation, production, storage and performance testing of culture media (ISO/DIS 11133:2012)' gepubliceerd. De workshop microbiologische media zorgt ervoor dat u in één dag op de hoogte bent van de belangrijkste zaken uit deze norm en over nieuwe ontwikkelingen met betrekking tot mediumbereiding en -controle. Advies & ondersteuning Heeft u microbiologische vraagstukken of wilt u advies? Ook daarvoor kunt u bij ons terecht. Bel ons op 06-44 83 49 88 of kijk op de website voor meer informatie. 3
Mild preservation Novel technologies for enhancing shelf life and quality
Nowadays there is a clear consumer demand for minimally processed
Benefits
products that are similar to fresh products in terms of vitamins and taste
Mild preservation at low temperatures
but have a longer shelf life. Food & Biobased Research develops and
Improved shelf life and quality
researches novel preservation methods that result in pasteurisation or sterilisation with less heat impact and yield a better quality compared to
Technology takeaways
conventional conservation methods.
Novel technologies
Technologies in different stages of development
High pressure processing: Pressures up to 700 MPa can be applied for
Microbiology, process homogeneity and product research is crucial
food preservation and preparation. High pressure is used in industry for pasteurisation of food products at room temperature and is also
Our expertise & facilities
potentially interesting for sterilisation.
Labscale and pilotscale equipment
Pulsed electric field processing: Preservation of bulk products by
Expertise on product-process
electrical impulses can be applied homogeneously through the product
interaction
for pasteurisation of liquid foods at reduced temperatures.
Pathogen research
Cold plasma treatment: Cold plasma gas is suitable for decontamination
Track record in implementation
of surfaces without affecting the quality of the product or packaging. Produced by electric discharges in inert gases that carry exited molecules, cold plasma gas offers the potential to inactivate microorganisms on surfaces at temperatures below 40 °C. Radio frequency heating: water immersed radio frequency heating is used for fast and homogeneous heating of packed products to achieve pasteurisation or sterilisation with improved quality compared to conventional processing.
Food & Biobased Research & mild preservation FBR has more than 15 years of experience in novel processing, including microbiology, product quality, process impact, technology development, implementation and consumer acceptance. This resulted in scientific publications, cooperation in many (international) projects and industrial cooperation for specific applications.
Information Ariette Matser T +31 (0)317 48 01 21 E
[email protected] Bornse Weilanden 9 6708 WG Wageningen The Netherlands www.wageningenUR.nl/fbr
Overview of novel processing technologies
Description
HP
HP
pasteurisation
sterilisation
PEF
Plasma
Radio
Batch process
Batch
Low thermal
Surface
Homogeneous
in which a
process in
pasteurisation
processing
heating with
packaged
which pre-
using short
by gas at
electro
product is put
heated
electric pulses
40°C to
magnetic
under high
packaged
to
inactivate
energy with
pressure (600
product is
electroporate
micro
long
MPa)
put under
membranes
organisms
wavelength
high
of bacteria
Frequency
pressure (700 MPa) Phase
Estimated
Commercially
Technology
Industrially in
Test
Test facilities
in use
proven
use for juices
facilities
available
(1500 l/h)
available
0.10-0.20
0.20-0.50
0.02-0.04
-
-
4-6 weeks
1 year
2-3 weeks
-
-
cooled
ambient
cooled
Fresh (texture
Freshly
Fresh
Fresh
Freshly cooked
maybe altered)
cooked
costs (€/kg) Shelf life Taste like
Cooperation on mild preservation In addition to the various bilateral projects with companies for specific applications of mild preservation technologies, Food & Biobased Research joins partners interested in mild preservation in larger platforms focussing on knowledge bottlenecks and implementation of mild preservation technologies. An example is the European project NovelQ where 37 partners worked together on the development of novel technologies, including high pressure, pulsed electric field processing, cold plasma and advanced heating technologies. Food & Biobased Research coordinated this project. Results are described in the final report of the project and over 150 scientific publications. Within the project PPS Mild Preservation, end users, technology suppliers, the NVWA and Wageningen UR Food & Biobased Research joined their forces to further develop these technologies in order to deliver added value for the food and technology sector.
References Timmermans, Nierop Groot, Nederhoff, van Boekel, Matser, Mastwijk. Pulsed electric field processing of different fruit juices: impact of pH and temperature on inactivation of spoilage and pathogenic micro-organisms. International Journal of Food Microbiology, Volume 173, 3 March 2014, Pages 105–111. Van Bokhorst-van de Veen, H., Xie, H., Esveld, E, Abee, T., Mastwijk, H. Nierop Groot, M.N. Inactivation of chemical and heat-resistant spores of Bacillus and Geobacillus by nitrogen cold atmospheric plasma and comparison to thermal and chemical based methods. Food Microbiology 2014. http://dx.doi.org/10.1016/j.fm.2014.03.018.
Wageningen UR Food & Biobased Research | 2015 | 046
Statistiek in relatie tot microbiologisch onderzoek Jo Klaessens StatAlike
Statistiek in relatie tot microbiologisch onderzoek
Statistiek In relatie tot microbiologisch onderzoek Validatie, meetonzekerheid
FIMM 26-01-2016
Statistiek
Achtergrond
1
Dr. Jo Klaessens StatAlike BV Paltzerweg 201 3734 CL Den Dolder
[email protected]
• Chemometricus • Gepromoveerd op onderzoek naar laboratorium performance • Achtergrond: QA officer bij BCO, hoofd lab bij zink smelter, hoofd lab bij R&D Center Sara Lee (koffie) • Sinds 2006 zelfstandig (StatAlike BV) • Auteur van de handboeken • Statistiek, validatie en meetonzekerheid • Statistiek in het laboratorium met Excel
• • • •
Voorzitter NEN normsubcommissie “Statistische methoden” Statistical method reviewer bij MicroVal Auditor bij RvA Interim kwaliteitsfunctionaris Statistiek
2
Om te beginnen… Laboratorium heeft kiemgetal bepaald volgens ISO 4833. Resultaat 39000 kve/g. Opdrachtgever klaagt dat kiemgetal te hoog is. Heranalyse (voor de zekerheid in duplo, in dezelfde serie) levert: 19000 en 20000 kve/g. Conclusie? Is er verschil? Micro-organismen, zo houd je het analyseproces in de hand. We komen terug op de vraag. Eerst wat theorie.
Statistiek
3
Waarom meten? Metingen worden uitgevoerd om beslissingen te nemen. vraagstelling meting beslissing analytisch microbiologisch fysisch visuele inspectie
• Voldoet het product? • Loopt het analyseproces goed (beheerst)?
Statistiek
4
Onzekerheid Hoe goed is een meetwaarde? Meetfout
Onzekerheid
Verschil van individuele meting met ware waarde Theoretisch: niet te bepalen omdat de ware waarde niet bekend is.
Eigenschap van het meetproces Deze gebruiken we in de praktijk.
Voor een goed gebruik van een meetwaarde altijd de onzekerheid mee-evalueren.
Statistiek
5
Waarom meten? Metingen worden uitgevoerd om beslissingen te nemen. vraagstelling meting beslissing analytisch microbiologisch fysisch visuele inspectie Numeriek: meetonzekerheid Ondanks de aanwezigheid van onzekerheid de juiste beslissing nemen. Statistiek
6
1 Kleine onzekerheid beslissingsgrens
gevonden concentratie
2 Grotere onzekerheid beslissingsgrens
Probleem
gevonden concentratie Statistiek
7
Gevolgen van onzekerheid eis voldoet
Ware waarde: product voldoet
voldoet niet
Ook het omgekeerde kan gebeuren: eis
x
voldoet
voldoet niet
Door onzekerheid in meting onjuiste beslissing
x
Onzekerheid kan foute beslissingen tot gevolg hebben terwijl er geen fouten gemaakt zijn in de uitvoering. Statistiek
8
Waar komt de onzekerheid vandaan? Zeer divers: alle stappen in het meetproces van monstername tot rapportage hebben een bijdrage aan de onzekerheid.
1. 2. 3. 4. 5.
Bemonsteren: is monster representatief? Monsteropslag en –conservering Uitvoering: toevallige effecten of fouten Batch voedingsbodem etc. (Ook het object kan veranderen in de tijd die nodig is voor de analyse)
Statistiek
9
Analysemethode en onzekerheid Een analysemethode heeft over het algemeen toevallige èn systematische afwijkingen. Soorten methoden Rationeel Doel: bepaling van het feitelijke gehalte.
Bijv. lactose met HPLC.
Empirisch Bepaalt een waarde die gerelateerd is aan gezochte grootheid. Het resultaat is methodebepaald. Bijv. microbiologische bepalingen
Statistiek
10
Vergelijken van resultaten Voorbeelden: • Zijn de resultaten van twee labs verschillend? • Is het resultaat van de heranalyse anders? Basisregels voor het vergelijken van resultaten: • Eerst log-transformeren (tenzij duidelijk is dat normale verdeling opgaat) • Gebruik de meest geschikte spreidingsmaat • Bij herhaalde meting zorg dat de juiste spreiding wordt uitgemiddeld Bij voorkeur prestatiekenmerken: • sr : herhaalbaarheid • sRw : intralab reproduceerbaarheid • sR : interlab reproduceerbaarheid Statistiek
11
Opbouw spreiding Intralab zijn er de volgende bronnen van spreiding: • spreiding binnen serie: herhaalbaarheid (sr) • spreiding van dag tot dag (std ) spreiding door platen, verschillende analisten etc.
Samen: intralabreproduceerbaarheid sRw 2 sRw sr2 std2
Op soortgelijke manier tussen de laboratoria (model ISO 5725): • spreiding binnen serie: herSamen: interlabhaalbaarheid (sr) reproduceerbaarheid sR • tussen-lab spreiding (sL )
sR2 sr2 sL2 Statistiek
12
Opbouw spreiding Effecten analisten, stoven, platen
schematisch
sRw
sr
std
sr
sL
Daarbij: verschillen tussen labs in uitvoering
= meetonzekerheid (bij microbiologie)
sR
• Metingen uit dezelfde meetreeks herhaalbaarheid sr • Metingen uit hetzelfde lab intralab reproduceerbaarheid sRw • Metingen uit verschillende labs interlab reproduceerbaarheid sR Statistiek
13
Tussenlab spreiding Voorbeeld: uitgebreide laboratorium vergelijking. Hetzelfde monster wordt door laboratoria A t/m F herhaaldelijk gemeten 160 150 140
sL tussen-lab spreiding
130 120 110 100 90
bias (d) voor laboratorium G
80 70 60
19
23
26
0
26
26
10
A
B
C
D
E
F
G
gemiddelde ± 2s
laboratorium
aantal resultaten
Statistiek
14
Vergelijken met een toets Indien de prestatiekenmerken voor spreiding beschikbaar zijn vergelijk met Z-toets: • Bereken het verschil Δ • Bereken de standaardafwijking van het verschil sΔ • Indien 2 dan is het verschil niet significant s
d.w.z. Δ wijkt niet significant af van 0.
Indien de prestatiekenmerken voor spreiding niet bekend en er zijn groepjes metingen vergelijk met T-toets
Statistiek
15
Voorbeelden 1) Vergelijking twee metingen x en y uit verschillende series (dezelfde methode, hetzelfde lab)
x y
s 2 s Rw
2) Vergelijking duplo-metingen x1 en x2 met eerdere meting y (dezelfde methode, hetzelfde lab) sr en sRw zijn bekend.
x
x1 x2 2
xy
s x std2
sr2 s2 2 s Rw sr2 r 2 2
2 s s x2 s y2 2sRw
s y s Rw
sr2 2
Statistiek
16
Voorbeelden 3) Vergelijking twee resultaten x en y uit verschillende labs (wel dezelfde methode)
s 2 s R
x y
4) Vergelijking duplo-metingen x1 en x2 van lab 1 met een meting y (dezelfde methode, hetzelfde lab) sr, sRw en sR zijn bekend.
x
x1 x2 2
s x sL2
sr2 s2 sR2 sr2 r 2 2
s y sR
sr2 s s s 2 s 2
xy
2 x
2 y
2 R
Statistiek
17
Het beginvoorbeeld Klant klaagt dat kiemgetal (39000 kve/g) te hoog is. Heranalyse (voor de zekerheid in duplo, dezelfde serie) levert: 19000 en 20000 kve/g. Is er verschil? Gegevens: ISO 4833: r =0,25 en R = 0,45 validatie: sr =0,08 en sRw = 0,12 Eerst log transformatie: kve/g
log(kve/g)
y
39000
4,591
x1
19000
4,279
x2
20000
4,301
0,301
s s s 0,16 2 x
2 y
x 4,290 2 s x sRw
0,082 sr2 0,12 2 0,106 2 2
s y sRw 0,12
1,882 < 2, verschil niet significant s Statistiek
18
Ander voorbeeld Klant klaagt dat kiemgetal (39000 kve/g) te hoog is. Hij heeft een eigen analyse met dezelfde methode: 18000 kve/g. Is er verschil? Gegevens: ISO 4833: r =0,25 en R = 0,45 validatie: sr =0,08 en sRw = 0,12 Eerst log transformatie: kve/g
log(kve/g)
Vergelijking tussen labs, dus werk met
y
39000
4,591
x
18000
4,255
sR
R 0,161 2,8
0,336
s 2 sR 0,16
1,477 < 2, verschil niet significant s Statistiek
19
Tot besluit Validatie en meetonzekerheid: • Om vast te stellen dat de methode voldoet, resp. dat het lab de methode beheerst • Om accreditatie te realiseren. Maar ook om het proces met opdrachtgevers in de hand te houden: • Zijn verschillen echt of lijkt het maar zo? Dan geldt wel: • Gebruik de juiste spreidingsmaat • En bij herhaalde meting zorg dat de juiste spreiding wordt uitgemiddeld
Statistiek
20
Pathogenen in voedsel en mensen: monitoring door de Nederlandse Voedsel en Waren Autoriteit Coen van der Weijden NVWA, Divisie Consument en Veiligheid Domein Pathogene micro-organismen en alimentaire zoönosen Inleiding Micro-organismen zijn de oudste, meest flexibele en snelst aanpassende levensvorm op aarde. Ze zijn dan ook nagenoeg op elke plek van de aarde terug te vinden. Ze hebben veelal een merkbaar effect op hun omgeving en andere levensvormen, de mens niet uitgezonderd. Onbewust van het bestaan van micro-organismen, moet de mens zich al ver voor de beschreven geschiedenis bewust zijn geweest van de effecten die micro-organismen kunnen hebben op voedsel en de eigen gezondheid. Respectievelijk in de vorm van bederf en ziekte. Waarschijnlijk later, maar in ieder geval al vanaf zo’n 8.000 jaar geleden heeft de mensheid onbewust micro-organismen ingezet voor het maken van bier, later wijn, boter, kaas, brood en gefermenteerde worst, met als gevolg dat de grondstof (granen, melk, vlees) in een andere vorm langer houdbaar bleek. Sinds de tijd van, en voornamelijk door, Louis Pasteur (1822-1895) weten we dat sommige soorten micro-organismen het bereiden van bier, wijn, boter, kaas, brood, worst, yoghurt, en vele andere voedingsmiddelen mogelijk, mogelijk maken in een proces dat we nu fermentatie noemen. Maar ook dat (veelal andere soorten) micro-organismen bederf en ziekte kunnen veroorzaken als ze aanwezig zijn in voedingsmiddelen of de grondstoffen ervan. Ondanks die kennis en sindsdien versnelde technologische vooruitgang, is het tegenwoordig nog onmogelijk gebleken voedselinfecties uit te bannen. Geschat wordt dat jaarlijks in Nederland nog zo’n 700.000 personen een voedselinfectie krijgen.
Voedselveiligheid: wetgeving en NVWA In het kader van de voedselveiligheid is in Europa geharmoniseerde regelgeving van kracht om voedselinfecties zo veel mogelijk te voorkomen. Deze regelgeving is vastgelegd in verordeningen die rechtstreeks van toepassing zijn in elke lidstaat. Aanvullend zijn in Nederland ten aanzien van voedselveiligheid eisen vastgelegd in Warenwetbesluiten. Primaire verantwoordelijkheid voor het volgen van de regelgeving ligt bij de voedingsmiddelbedrijven. Daaronder vallen de primaire producenten en importeurs,( industriële) voedselverwerkers, retail en horeca. De belangrijkste eisen daaromtrent betreffen het voldoen aan voedselveiligheidseisen (risicoanalyse ten aanzien van proces en voldoen aan microbiologische criteria), traceerbaarheid kunnen aantonen (een stap voor- en achteruit), het melden van onveilige voedingsmiddelen aan lokale autoriteiten en terughalen van de markt waar nodig. Lokale autoriteiten (zoals de Nederlandse Voedsel en Warenautoriteit) dienen controles uit te voeren om naleving van de wetgeving door voedingsmiddelbedrijven te volgen en bevorderen.
Pathogenen in voedsel en mensen:
De Nederlandse Voedsel en Warenautoriteit (NVWA) houdt in de gehele voedselketen, van import, diervoeding en boerderij tot en met verkoop aan consument, toezicht op uitvoering van de Europese en nationale wetgeving. De NVWA toezichtsactiviteiten die daarmee samenhangen zijn: (onaangekondigde) inspecties, audits en monsternames; opvolging van (consument) klachten en meldingen van bedrijven en andere landen; advies aan en ondersteuning van relevante ministeries en Europese instanties. Om het beschikbare budget zo effectief mogelijk in te kunnen zetten hanteert NVWA primair een risicogerichte en kennisgedreven aanpak gericht op de verschillende voedselketens. Deze aanpak wordt ondersteund door risicobeoordelingen van het Bureau Risicobeoordeling & Onderzoeksprogrammering (BuRO) dat onderdeel is van de NVWA, maar volledig onafhankelijk van toezicht is gepositioneerd.
Monsteronderzoek Bij monsteronderzoek wordt in elk stadium van voedselproductie tot en met retail en horeca monsters genomen. Monsteronderzoek heeft tot doel prevalentie van pathogenen in de voedselketen te bepalen en toezicht te houden op naleving van individuele bedrijven ten aanzien van wetgeving. Ook worden er monsters genomen in Europees verband waarbij antimicrobiële resistentie van pathogenen (en antibioticagebruik) bij landbouwhuisdieren wordt gevolgd, en wordt bij voedseluitbraken ook bij consumenten bemonsterd. Analyses worden uitgevoerd conform Europese wetgeving en richtlijnen (meestal detectie, resulterend in ‘aan- of afwezig ’), afhankelijk van het pathogene organisme aangevuld met een telling (kve/g), sero- of genotypering en bepaling van het antibioticaresistentie profiel. Het resultaat van monstername en analyse wordt in toenemende mate, buiten gebruik voor direct toezicht van de NVWA richting betreffende bedrijven, op verzoek van de Tweede Kamer ook openbaar gemaakt. Trendanalyse van voedingsmiddel/pathogeen combinaties zijn nuttig om het effect van afspraken met en/of binnen de voedselverwerkende industrie omtrent hygiëne en preventie te meten. Zo is de daling in het vóórkomen van Salmonella in kippenvlees bemonsterd in de retail waarschijnlijk het gevolg van procedurele en hygiëne maatregelen bij vleeskuikenbedrijven en kippenslachterijen. Ook kan trendanalyse in combinatie met ziektecijfers waar het RIVM over beschikt, aanwijzingen geven voor bronattributie (welke route/waarsoort leidt tot ziekte). Bij trendanalyse moeten we altijd aandacht houden voor veranderende aspecten in monstername en analyse in de tijd. Zo kan het voorkomen dat monsters niet aselect genomen (kunnen) worden. Bijvoorbeeld door veranderend aanbod, of vragen nieuwe inzichten om een andere inzet van analyses. Wat betreft dat laatste: begin deze eeuw was de focus aangaande het pathogeen Shigatoxine producerende Escherichia coli (STEC)voornamelijk gericht op serotype O157:H7, die met name in de Verenigde Staten een aantal grote voedselvergiftigingen heeft veroorzaakt (aldaar vaak Hamburger Disease genoemd). Het afgelopen decennium heeft echter laten zien dat andere serotypes ook grote uitbraken tot gevolg kunnen hebben. Bijvoorbeeld de uitbraak in 2011 van STEC O104:H4 in fenegriek met meer dan 4.000 zieken en 53 sterfgevallen, voornamelijk in Duitsland, maar ook daarbuiten. monitoring door de Nederlandse Voedsel en Waren Autoriteit
Als gevolg daarvan heeft onderzoek aangetoond dat de koppeling tussen serotype en ziekteverwekkend vermogen minder sterk is dan daarvoor werd aangenomen, maar dat een analyse op virulentiefactoren het ziekteverwekkend vermogen beter voorspelt. Het beleid van de NVWA en analyse inzet van het NVWA laboratorium is daarop aangepast. Dit verklaart waarschijnlijk het toegenomen percentage positieve monsters voor STEC dat we zien bij monsternames na 2011.
Listeria monocytogenes en listeriose Pathogenen verschillen buiten hun wetenschappelijke naam veelal ook in eigenschappen relevant voor voedselveiligheid. Listeria monocytogenes is in veel opzichten bijzonder. Niet eens zozeer omdat deze bacterie op veel verschillende plekken in de natuur terug te vinden is (bodem, oppervlaktewater, dieren, mens), maar met name omdat hij kan groeien bij lage temperaturen (onder optimale omstandigheden zelfs onder het vriespunt), tolerant is tegen een hoge concentratie zout, droogte en invriezen. Mede vanwege deze eigenschappen blijkt deze bacterie zich langdurig te kunnen vestigen in een voedselprocesomgeving en op lastig schoon te maken apparatuur. Het is geen sporenvormer en kan dus met behulp van verhitting snel worden afgedood. Echter, bij onvoldoende verhitting bij de consument (bijvoorbeeld magnetronmaaltijd, verwarming voorgegaarde producten of de zijkant van een ‘medium’ gebakken stuk vlees) kan er voldoende levensvatbare Listeria in een product overblijven dat bij consumeren kan leiden tot het ziektebeeld listeriose. Daarbij lopen risicogroepen (met name bij verlaagde afweer: on- of pasgeborenen, ouderen, zieken) bij infectie met relatief weinig levensvatbare Listeria cellen kans op een ernstig ziekteverloop (in 2014 in de EU 15% sterfte na diagnose van listeriose) met een incubatieperiode van 3 tot 70 dagen. Ondanks dat bekend is dat listeriose bijna exclusief door besmet voedsel wordt veroorzaakt, is maar in 1% tot 5% van de gevallen de bron aanwijsbaar. Tevens blijken veel isolaten pas over langere tijd een cluster te vormen die aanwijzing geven voor een gemeenschappelijke bron. Zo is er een nog lopende uitbraak (in ieder geval nog lopend op 17 december 2015) in Zuid-Duitsland waarbij 66 zieken (waarvan 6 overleden) betrokken zijn, duidelijk is dat de bron gemeenschappelijk moet zijn, en waarbij 3 jaar zit tussen de eerste zieke en de (vooralsnog) laatste. In de Verenigde Staten (VS) is recent een listeriose uitbraak opgelost die vijf jaar en drie maanden duurde voordat de bron (kaasfabriek) gevonden werd. Hierbij blijken nieuwe typeringstechnieken (met name Whole Genome Sequencing) in toenemende mate behulpzaam bij het identificeren van clusters en daarmee bronopsporing. Analyse van grote listeriose uitbraken in de VS laat zien dat de bron in alle te traceren gevallen een voedselprocesomgeving is geweest, waarbij over een langere periode met enige regelmaat voedsel besmet is geraakt. De lokale autoriteit heeft in die gevallen geconcludeerd dat het HACCP plan en/of Listeria omgevingsmonitoring afwezig was of tekort geschoten had. Opvallend ook dat bij deze uitbraken niet alleen de bij velen bekende risicoproducten als rauwmelkse producten, vlees of vis betrokken zijn, maar ook producten uit de groenten en fruit sector (meloen, taugé, appels). Vanwege hiervoor genoemde eigenschappen is in Europese verordening speciale aandacht voor Listeria onderzoek bij kant-en-klare (ready-to-eat; RTE) voedingsmiddelen, waarbij de acceptatiegrens ligt bij 100 kolonievormende eenheden per gram (kve/g) product op einde van de opgegeven houdbaarheidstermijn (THT). Omdat Listeria ook bij koelkast temperaturen kan monitoring door de Nederlandse Voedsel en Waren Autoriteit
uitgroeien wordt producenten gevraagd aan te tonen dat Listeria onder 100 kve/g blijft op THT. Kan de producent dat niet, dan geldt de grens ‘Listeria afwezig in 25 gram product’ voordat het product de directe controle van de producent heeft verlaten. Deze laatste grens geldt sowieso bij voeding voor pasgeborenen en voeding voor medisch gebruik. Er zijn ook uitzonderingen op deze regelgeving, evenals er aanvullende eisen zijn ten aanzien van omgevingscontroles. De wetgeving is dan ook complex. Omdat het in deze samenvatting niet past daar volledig in te zijn wil ik voor een vollediger verhaal verwijzen naar de betreffende verordening (2073/2005) en de toelichting van de NVWA in de vorm van een infoblad (infoblad 85); zie ook de referentielijst hieronder.
Listeria monstername resultaten Listeria analyses uitgevoerd op voedingmiddelen vanaf januari 2010 laat zien dat in Nederland Listeria terug te vinden is in nagenoeg alle voedingsmiddelen (aanwezig in 25 gram), waarbij aantallen boven de grens van 100 kve/g met name terug te vinden waren in vleeswaren en vis. Heel hoge hoeveelheden (>10.000 kve/g) zijn gevonden in een aantal monsters paté, zalm en forel. Deze resultaten zijn vergelijkbaar met resultaten gevonden in geheel Europa, als ook in de VS. Opvallend is het relatief hoge percentage positieven (aanwezig in 25 gr) in sushi (14%), een voedingsmiddel die alleen in 2013 bemonsterd is. Hierbij bleek dat deze positieven terug te voeren waren op twee producenten. Onze ervaring is dat als een producent geregeld onvoldoende kan aantonen dat Listeria tot einde THT onder 100 kve/g blijft, dat resulteerd in het van de markt halen van partijen waarin Listeria alleen aangetoond is in 25 gram. Onze ervaring leert dat producenten in veel gevallen onvoldoende kunnen aantonen dat Listeria tot einde THT onder 100 kve/g blijft, waardoor partijen van de markt gehaald moeten worden als Listeria is aangetoond (in 25 gram), ook als nog niet aangetoond is dat de partij meer dan 100 kve/g Listeria bevat. Op alle door het NVWA laboratorium verkregen Listeria isolaten worden verschillende typeringen uitgevoerd om brononderzoek te doen en vergelijkingen te maken met de humane listeriose gevallen. Vooralsnog is serotypering in isolaten de meest gebruikte typeringsmethode. Daarbij blijken de meeste serotypen van type 1/2a te zijn, en in mindere mate 1/2b en 1/2c, en in nog mindere mate van andere types. Behalve in het jaar 2013 waarin we eenmalig aandacht voor sushi hebben gehad ten aanzien van Listeria, waarbij we vaker type 4b vaststelden. Serotyperingsresultaten geven onvoldoende informatie om te bepalen of een producent incidenteel last heeft van een opnieuw binnenkomende stam vanuit de externe omgeving of grondstoffen, dan wel dat een producent last heeft van een persisterende besmetting in de productieomgeving of apparatuur. Whole Genome Sequencing heeft een grotere gevoeligheid in deze en kan dat onderscheid nagenoeg altijd wel maken. Overigens, in beide gevallen zullen er afdoende maatregelen genomen moeten zijn op basis van een risicoanalyse om contaminatie van de productieomgeving en product zoveel mogelijk te beperken, aanwezigheid in de productieomgeving en product te detecteren en bestrijden, en te vermijden dat eenmaal gecontamineerd product op de markt wordt gebracht. monitoring door de Nederlandse Voedsel en Waren Autoriteit
Referenties History of Microorganisms in Food; hoofdstuk in Modern Food Microbiology; DOI 10.1007/0-38723413-6_1 Staat van Infectieziekten in Nederland 2008; RIVM rapport 210211005/2009 Registratie voedselinfecties en -vergiftigingen in Nederland, 2014; RIVM Rapport 2015-0075 Staat van Zoönosen 2014; RIVM Rapport 2015-0151 EU report trends and sources zoonoses and food borne outbreaks 2014; doi:10.2903/j.efsa.2015.4329 EU Verordening 178/2002 – General Food Law; eur-lex.europa.eu EU Verordening 853/2004 – General rules on hygiene of all food; eur-lex.europa.eu EU Verordening 853/2004 – Specific hygiene rules on products of animal origin; eur-lex.europa.eu EU verordening 2073/2005 – Microbiological criteria; eur-lex.europa.eu Warenwetbesluit Hygiëne van Levensmiddelen; wetten.overheid.nl Warenwetbesluit Bereiding en Behandeling van Levensmiddelen; wetten.overheid.nl NVWA Infoblad 64 Borging van voedselveiligheid – grondstoffen; www.nvwa.nl NVWA Infoblad 65 Borging van voedselveiligheid – consumptiegereed; www.nvwa.nl NVWA Infoblad 85 Verordening 2073 microbiologische criteria; www.nvwa.nl NVWA Meldwijzer Onveilige Levensmiddelen; www.nvwa.nl German Outbreak of Escherichia coli O104:H4 Associated with Sprouts; n engl j med 365;19 Ongoing outbreak of invasive listeriosis, Germany, 2012 to 2015; Eurosuveillance 20, issue 50, 17 Dec 2015 Multistate Outbreak of Listeriosis Linked to Soft Cheeses; www.cdc.gov/listeria/outbreaks/softcheeses-09-15/ Epidemic Profile of Shiga-Toxin–Producing Escherichia coli O104:H4 Outbreak in Germany; n engl j med 365;19 Control of Listeria monocytogenes in the Food-Processing Environment; Journal of Food Protection, Vol. 65, No. 4, 2002, Pages 709–725 Listeria monocytogenes Persistence in Food-Associated Environments: Epidemiology, Strain Characteristics, and Implications for Public Health; Journal of Food Protection, Vol. 77, No. 1, 2014, Pages 150–170 Relevance of microbial finished product testing in food safety management; Food Control 60 (2016) 31-43 SANCO-2952-2005 guidance doc 882 - micro sampling & testing SANCO-1628-2008 on Listeria monocytogenes shelf-life studies EURL Guidelines on sampling the food processing area and equipment for the detection of Listeria monocytogenes EURL Lm Technical guidance - for conducting shelf-life studies on Listeria monocytogenes in ready-toeat foods EURL Technical guidance - On shelf-life studies for Listeria monocytogenes in ready-to-eat food
monitoring door de Nederlandse Voedsel en Waren Autoriteit
Pathogenen in voedsel en mensen: monitoring door NVWA Coen van der Weijden Senior Inspecteur
Nederlandse Voedselen Warenautoriteit
FIMM Symposium 'Micro-organismen, zo hou je ze in de hand' 26 januari 2016
Inhoud NVWA Monstername projecten • Listeria monocytogenes • •
Nederlandse Voedsel- en Warenautoriteit De NVWA bewaakt de gezondheid van dieren en planten, het dierenwelzijn, en de veiligheid van voedsel en consumentenproducten, en handhaaft de natuurwetgeving
3
Activiteiten NVWA tav veiligheid van voedsel Toezicht: toetsen op relevante wet- en regelgeving - Audits, inspecties en monstername/onderzoek in de keten: diervoeders, primaire productie/verwerking industriële verwerking, retail/horeca, import - Klachten en meldingen Bronopsporing voedsel gerelateerde uitbraken (RIVM/GGD) Beoordeling meldingen bedrijven - Advies en ondersteuning VWS en EZ Beleidsondersteuning (signalering risico’s) EU werkgroepen (oa. microbiologische criteria) 7
Monstername resultaten – een selectie In vlees:
Salmonella Campylobacter STEC (ShigaToxine producerende Escherichia coli) Alle waarsoorten: Listeria monocytogenes Niet in deze presentatie: andere waarsoort/pathogeen combinaties: zuivel, eieren, insecten, schaal/schelpdieren, vis, kiemgroenten, (verse) kruiden, groenten en fruit, samengestelde producten Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, E. coli, Shigella, Vibrio, Yersinia, Norovirus, Hepatitis A/E, Giarda, Cryptosporidium, Trichinella, … 10
Salmonella in vlees (retail)
11
Salmonella serotypes in kip (retail)
12
Campylobacter in vlees (retail)
13
Shiga-toxine producerende E. coli (STEC) in vlees (retail) aanpassing analyse
14
STEC serotypes in vlees (retail) 2010 O157
2011
2012
2
hoog risico serotypes andere serotypes
1 1
16 aanpassing analyse
15
2013
9
Samenvatting vlees in retail Prevalentie van Salmonella in kip daalt gestaag, maar Salmonella serovar infantis wordt vaker gevonden Campylobacter in kip blijft onverminderd hoog Aanpassing inzet STEC analyse (serotype, mn O157 > stx1/2 screen) terug te zien in resultaat: meer positieven
Uitgebreidere ketengerichte analyse op historische data (ook andere waarsoort/pathogeen combinaties) loopt 16
Listeria monocytogenes Gram positief, facultatief anaeroob, niet sporenvormend Te vinden in water en bodem, bij wilde en (landbouw)huisdieren, mens Prevalentie: <1-10%
Onder optimale omstandigheden groei bij: -2 – 45oC pH 4,6-9,6 Tolerant tegen zout (tot 13% NaCl), droogte, invriezen Inactivatie: T>50oC Vormt biofilms op verscheidene materialen Dus ook te vinden in voedselverwerkingsomgevingen Veroorzaker van Listeriose
17
Bevestigde humane zoönose gevallen in EU 2014
Listeriose weinig gerapporteerd
19
Bevestigd aantal sterfgevallen in EU 2014
Listeriose case fatality rate (15%)
20
Sinds 2011 toename in bevestigde gevallen in EU
21
Listeriose weinig te koppelen aan uitbraken
2011 2012 2013 2014
Listeriose aantal overleden 1476 134 1642 198 1763 191 2161 210
bewezen voedseluitbraken aantal zieken overleden 3 16 4 9 55 9 12 51 3 15 106 17
VS
Listeriose aantal overleden
bewezen voedseluitbraken aantal zieken overleden 5 32 9 5 168 35 4 36 5 6 30 6 9 55 13
EU
2010 2011 2012 2013 2014 22
jaarlijks ~1600
jaarlijks ~260
Bron vaak in procesomgeving VS
Listeriose (jaarlijks ~1600, 260 overleden) aantal
overleden product
bron
aug - oct 2011
100+
33
meloen
wassen/pakken
mrt - sep 2012
22
4
kaas
?
mei - jul 2013
6
1
kaas
?
jun - aug 2014
5
2
tauge
irrigatiewater
sep '13 - oct '14
5
1
kaas
procesapparatuur
oct '14 - jan '15
35
7
caramel appels
verpakkken
jan '10 - feb '15
10
3
roomijs
procesapparatuur
jun '10 - sep '15
30
3
kaas
procesapparatuur
Gemeenschappelijke oorzaak in casussen VS: HACCP en/of Listeria m. monitoring plan afwezig/schiet tekort 25
EU wetgeving tav Listeria monocytogenes Verordening 2073/2005 Uitgangspunt: ≤100 cfu Listeria m. per gram in een kant en klaar (K&K) voedingsmiddel levert een verwaarloosbaar risico op. Kant en klaar: voedingsmiddel dat onvoldoende kiemreductie ondergaat bij bereiding voor consumptie (dus ook voorgegaarde prod.) K&K voor pasgeborenen of medische doeleinden eis: tot einde THT: Listeria m. afwezig in 25 gram (n=10, c=0) Andere K&K: bij verlaten producenta: Listeria m. afwezig in 25 gram (n=5, c=0) tot einde THT: ≤100 cfu Listeria m. per gram (n=5, c=0) a: indien niet aantoonbaar dat >100cfu/g einde THT niet gehaald wordt 26
Handelen NVWA tav Listeria m. bij monstername Verordening 2073/2005 Indien Listeria m. aanwezig in 25 gram, maar ≤100 cfu/gr : en producent toont niet aan dat einde THT Listeria m. ≤100 cfu/gr dan partij van de markt Indien Listeria m. >100 cfu/gr: dan partij van de markt Opdracht VWS: aandacht voor Listeria m. in vis en zuivelsector
27
Waren; # bemonsterd
Voor deze en volgende slides:
1/1/2010 – 3/12/2015
29
Listeria m. gevonden bij NVWA monsternames Waarsoort Samengesteld Vis Vlees Groenten & fruit Zuivel Rest
n 2068 6095 5211 2488 1544 319
Listeria aanw. 112 218 82 26 3 0
% positief 5,4% 3,6% 1,6% 1,0% 0,2% -
Top 3 sushi, humus, tahin zalm, haring, paling bewerkt, vleeswaar, tartaar spinazie, kiemgroenten, andijvie zachte kazen -
Listeria m. >100 cfu/g: - incidenteel in ‘samengestelde producten’ (3/2068) - iets vaker in ‘vleeswaren’ (10/2422) en ‘vis’ (34/6095) Hoge hoeveelheden (>10.000 cfu/g) zijn gevonden in: - pate (4 monsters) - (gerookte) zalm (3 monsters) en forel (2 monsters) 36
Serotypes Listeria m. isolaten bij NVWA 100 90
% of total typed samples
80 70
2007 2008
60
2009 2010
50
2011
40
2012 2013
30 20 10 0 4b
1/2a
1/2b
1/2c
other
food serotypes
3a
3b
4d
Samenvatting Listeria m. in voedsel
(2007-2013)
Listeria m. te vinden in alle type waarsoorten vaker in vleeswaren en vis uitgroei in pate en visproducten Meestvoorkomende serotype is 1/2a Afhankelijk van waarsoort komen ook andere serotypes voor vb serotype 4b in sushi
Met dank aan Els Biesta-Peters (NVWA, Laboratorium Voedselveiligheid) Ben Wit (NVWA) Ingrid Friesema (RIVM)
Pathogenen in voedsel en mensen: spelden in twee verschillende hooibergen? Ingrid Friesema Epidemiologie en Surveillance van Infectieziekten, Centrum Infectieziektebestrijding Rijksinstituut voor Volksgezondheid en Milieu (RIVM) Besmetting met pathogenen Een voedselpathogeen kan omschreven worden als een micro-organisme dat oraal - via voedsel of water - het lichaam weet binnen te dringen, daarbij niet onschadelijk wordt gemaakt door maagzuur of gal en vervolgens ziekte kan veroorzaken. Besmetting met een voedselpathogeen leidt meestal tot gastroenteritis, met symptomen als buikpijn, diarree, misselijkheid en/of braken. Maar er zijn ook voedselpathogenen die bijvoorbeeld meningitis, sepsis of hepatitis kunnen veroorzaken. Echter, een voedselpathogeen hoeft niet per definitie via voedsel ziekte te veroorzaken. De pathogeen kan ook bijvoorbeeld via mens op mens transmissie, worden doorgegeven door onder andere het niet (goed) wassen van de handen na toiletbezoek. Sommige voedselpathogenen hebben landbouwhuisdieren als reservoir, waardoor ze via het vlees in de voedselketen terecht komen, maar ook ziekte kunnen veroorzaken door bijvoorbeeld direct dier-mens contact.
Meldingsplicht en registratie In Nederland wordt het vóórkomen van een aantal voedselpathogenen geregistreerd via een aantal systemen. Pathogenen die in de meldingsplicht zijn opgenomen, moeten door artsen en laboratoria aan de lokale GGD gemeld worden zodra ze aangetoond zijn. De GGD geeft vervolgens de melding door aan het Centrum voor Infectieziektebestrijding van het RIVM, zodat de betreffende ziekten landelijk in de gaten gehouden kunnen worden. In een aantal gevallen is er een vrijwillige laboratoriumsurveillance opgezet, zoals voor Campylobacter en Salmonella waar geen meldingsplicht voor geldt. Maar ook voor een aantal meldingsplichtige pathogenen is er een laboratoriumsurveillance opgezet, zoals voor shigatoxineproducerende Escherichia coli (STEC), Listeria monocytogenes en hepatitis A virus. Naast specifieke pathogenen bestaat er een meldingsplicht voor voedseluitbraken, waarbij er sprake moet zijn van 2 of meer zieken met dezelfde ziekteverschijnselen of verwekker en een onderlinge epidemiologische of microbiologische relatie wijzend op voedsel als bron. Bovengenoemde systemen leveren in veel gevallen specifieke typeringsuitslagen op, waardoor op een hoger detailniveau dan species trends gevolgd en clusters opgespoord kunnen worden.
Pathogenen in voedsel en mensen:
Vergelijken van isolaten uit patiënten en voedsel Typering van isolaten maakt het mogelijk om humane isolaten te vergelijken met isolaten uit voedsel en andere niet-humane bronnen. De niet-humane isolaten kunnen ruwweg in 2 categorieën worden onderverdeeld: 1. isolaten die gevonden zijn na aanwijzingen dat een voedselproduct mogelijk besmet was; en 2. isolaten gevonden in voedselproducten of andere bronnen die op basis van monitoring getest zijn. Als er in een voedselrestant een stam gevonden wordt die identiek is aan de stam gevonden bij de patiënt, is er een directe link tussen ziekte en het betreffende voedselproduct aangetoond. Een dergelijke link wordt zelden aangetroffen. Dit komt voornamelijk, omdat er vaak geen voedselrestant meer is door de tijd die is verstreken sinds het moment van consumptie. Daarnaast is ook lang niet altijd duidelijk welk voedselproduct(en) de mogelijke veroorzaker van de ziekte was (waren), inclusief de mogelijkheid van besmetting via andere routes dan voedsel bij veel voedselpathogenen. Bij uitbraken wordt dit laatste probleem verkleind, aangezien de informatie van meerdere zieken gecombineerd en geanalyseerd kan worden. Echter, bij de meeste uitbraken is er sprake van een eenmalige besmetting, waardoor ook hier zelden nog een voedselrestant beschikbaar is om de microbiologische link te leggen. Resultaten monitoringsonderzoek voedsel kan richtinggevend zijn Vergelijking van humane isolaten met isolaten uit monitoringsonderzoek zal zelden tot een directe link leiden, maar kan wel richtinggevend zijn. Types die wel in voedsel worden aangetroffen, maar zelden of nooit bij patiënten, zijn mogelijk minder ziekteverwekkend voor mensen. Listeria monocytogenes serotype 3a wordt bijvoorbeeld wel in voedsel aangetroffen, maar heel zelden bij patiënten. Aan de andere kant werd in de monitoring in de afgelopen jaren meerdere keren per jaar Listeria monocytogenes in partijen tahoe/tofu aangetoond. Binnen de meldingsplicht is daarom recent een vraag over consumptie van tahoe/tofu toegevoegd om na te gaan of dit regelmatig gemeld wordt door patiënten met listeriose.
Onderzoek op projectbasis Naast de 'standaard' meldingsplicht, surveillance en monitoring wordt onderzoek op projectbasis uitgevoerd. Via patiënt-controle onderzoek kan bijvoorbeeld bekeken worden welke voedselproducten meer gegeten worden door patiënten. Dit is recent gedaan voor STEC [1] en listeriose [2] en dit onderzoek is nog gaande voor hepatitis E en voor cryptosporidose.
Populatiestudies Daarnaast zijn en worden er populatiestudies uitgevoerd, waarbij mensen - ongeacht hun ziektestatus - gevraagd worden een vragenlijst in te vullen en bloed en/of ontlasting af te (laten) nemen. Voorbeelden hiervan zijn de Pienter-studie [3], Gezin en Gezondheid (onderzoek bij jonge gezinnen [4]) en KizSS (onderzoek in kinderdagverblijven [5, 6]). Deze onderzoeken geven een breder beeld van het vóórkomen van pathogenen in de bevolking dan als alleen naar de (ernstig) zieken die gemeld worden, wordt gekeken.
spelden in twee verschillende hooibergen?
Bronattributie en transmissieroutes Via patiënt-controle onderzoek kan inzicht verkregen worden in de besmettingsbron (bijvoorbeeld een voedingsmiddel), maar het levert niet voldoende informatie om de infectie aan het oorspronkelijke reservoir (bijvoorbeeld runderen) toe te schrijven. Door te kijken welke subtypes bij zowel patiënten als in de (hoofd)reservoirs van de betreffende pathogeen voorkomen, kan met behulp van modellering bepaald worden in welke mate de humane infecties toegeschreven kunnen worden aan de verschillende reservoirs. Dergelijke bronattributie studies zijn in Nederland uitgevoerd voor Salmonella [7] en Campylobacter [8]. In deze studies zijn daarnaast de resultaten van de bronattributie gecombineerd met de gegevens uit een patiënt-controle onderzoek waarbij een analyse van de risicofactoren per reservoir is uitgevoerd. Dergelijke analyses leveren meer inzicht in de verschillende transmissieroutes per reservoir.
Referenties 1.
2. 3. 4.
5.
6.
7.
8.
Friesema IH, Schotsborg M, Heck MEOC, van Pelt W. Risk factors for sporadic Shiga toxinproducing Escherichia coli O157 and non-O157 illness in The Netherlands, 2008-2012, using periodically surveyed controls. Epidemiol Infect. 2015;143:1360-7. Friesema IH, Kuiling S, van der Ende A, Heck ME, Spanjaard L, van Pelt W. Risk factors for sporadic listeriosis in the Netherlands, 2008 to 2013. Euro Surveill. 2015;20:pii: 21199. Van der Klis F, Mollema L, van Weert Y. PIENTER 2; a summary of the main findings. Bilthoven: RIVM, 2012. Enserink R, Lugner A, Suijkerbuijk A, Bruijning-Verhagen P, Smit HA, van Pelt W. Gastrointestinal and respiratory illness in children that do and do not attend child day care centers: a cost-ofillness study. PLoS One. 2014;9:e104940. Enserink R, Noel H, Friesema I, Jager CD, Kooistra M, Kortbeek T, et al. The KIzSS network, a sentinel surveillance system for infectious diseases in day care centers: study protocol. BMC Infect Dis. 2012;12:259. Enserink R, van den Wijngaard C, Bruijning-Verhagen P, van Asten L, Mughini-Gras L, Duizer E, et al. Gastroenteritis attributable to 16 enteropathogens in children attending day care: significant effects of rotavirus, norovirus, astrovirus, Cryptosporidium and Giardia. Pediatr Infect Dis J. 2015;34:5-10. Mughini-Gras L, Enserink R, Friesema I, Heck M, van Duynhoven Y, van Pelt W. Risk factors for human salmonellosis originating from pigs, cattle, broiler chickens and egg laying hens: a combined case-control and source attribution analysis. PLoS One. 2014;9:e87933. Mughini Gras L, Smid JH, Wagenaar JA, de Boer AG, Havelaar AH, Friesema IH, et al. Risk factors for campylobacteriosis of chicken, ruminant, and environmental origin: a combined case-control and source attribution analysis. PLoS ONE. 2012;7:e42599.
spelden in twee verschillende hooibergen?
Pathogenen in voedsel en mensen spelden in twee verschillende hooibergen?
Pathogenen in voedsel en mensen | 26 januari 2016
Achtergrondinformatie ● Micro-organismen in voedsel: – Nuttige (bv in yoghurt, bier) – Voedselbederf – Ziekteverwekkers › Voedselvergiftiging/-intoxicatie › Voedselinfectie ● Bacterie ● Virus ● Parasiet ● Meer besmettingsroutes – Persoon op persoon (fecaal-oraal, SOA), omgeving, diercontact ● Niet alleen maagdarminfecties – Hepatitis, sepsis, meningitis, HUS 2
Pathogenen in voedsel en mensen | 26 januari 2016
Registratie van ziekten (1) ● Surveillance van meldingsplichtige ziekten › › ›
Salmonella typhi (buiktyfus) Clostridium botulinum (botulisme) Shigella (dysenterie/shigellose)
● Laboratorium surveillance netwerk › ›
Salmonella Campylobacter
● Combinatie meldingsplicht en laboratorium surveillance › › ›
STEC/EHEC Listeria monocytogenes Hepatitis A virus
● Projecten ›
Patiënt-controle onderzoek (cryptosporidose / hepatitis E)
● Virologische weekstaten 3
Pathogenen in voedsel en mensen | 26 januari 2016
Registratie van ziekten (2)
4
Pathogenen in voedsel en mensen | 26 januari 2016
Op zoek naar de bron ● ● ● ● ●
Expert elicitaties Ecologische studies Uitbraak onderzoeken Case-control/cohort studies Microbiële subtypering
Pathogenen in voedsel en mensen | 26 januari 2016
5
Ecologische studie: H7N7 en Campylobacter De vogelpest leidde in 2003 tot de ruiming van zo’n 30 miljoen vogels. Tegelijkertijd daalde het aantal humane campylobacteriose-gevallen in de ruimingsgebieden met 44-70%. (Friesema et al. Emerg Infect Dis 2012;18(3):466-8)
6
Pathogenen in voedsel en mensen | 26 januari 2016
Ecologische studie: STEC en de veestapel (1) jan
feb
mrt
apr
may
jun
jul
aug
sep
oct
nov
dec 24% 21%
8 7
18%
Dairy Cattle Veal Calves
6
15%
5
12%
4
9%
3 6%
2
Positive farms 1999-2005
Human STEC O157 / 4wk, 1999-2005
9
3%
1 0
0% 1-4
5-8
9-12
13-16
17-20
21-24
25-28
29-32
33-36
37-40
41-44
45-48
49-52
4-weekly periods 7
Pathogenen in voedsel en mensen | 26 januari 2016
Ecologische studie: STEC en de veestapel (2) 1999-2008 ● Analyse op gemeenteniveau: – Humane STEC O157 infecties – Populatiegrootte – Veedichtheid: runderen, varkens, kippen ● Relatie tussen humane infecties en runderdichtheid – met name in de zomer in jonge kinderen
● Verlaagd risico in gebieden met hoge kippendichtheid
(Friesema et al. Epidemiol Infect 2011;139:1081-7) 8
Pathogenen in voedsel en mensen | 26 januari 2016
Listeriose in Nederland 100 90
Aantal meldingen
80 70 60 50 40 30 20 10 0 2005
2006
2007
2008
2009
2010
2011
2012
2013
2014
2015
Pathogenen in voedsel en mensen | 26 januari 2016
9
Serotypen binnen listeriose-patiënten Aantal meldingen met isolaat
100 90 80 70
overig
60
4b
50
1/2c
40
1/2b
30
1/2a
20 10 0 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014
10
Pathogenen in voedsel en mensen | 26 januari 2016
Patiënt-controle onderzoek: listeriose ● Specifieke groep ● Ernstig ziektebeeld ● Voedsel- versus humane isolaten ● Juli 2008 – december 2013 ● Leeftijd & geslacht ● Onderliggend lijden ● Medicijngebruik: – Immunosuppressiva – Maagzuurremmers (Friesema et al. Euro Surveill 2015;20(31):pii=21199) Pathogenen in voedsel en mensen | 26 januari 2016
11
Bronattributie: microbiële subtypering ● Salmonella Sero/faag-typering en/of MLVA ● Campylobacter MLST ● STEC Serotypering ● Verschillende modellen – Proportional similarity index (simple area of overlap) – Dutch model (proportional assignment) o
Original (van Pelt et al. Infectieziekten Bull 1999;10:240–243)
o
Modified (Mughini-Gras et al. Epidemiol Infect 2014;142:1070-82)
– Danish model (Bayesian assignment) o
Original (Hald et al. Risk Anal 2004;24:255-69)
o
Modified (Mullner et al. Risk Anal 2009;29:970-84)
– Asymmetric island model (population genetics) o o
‒ 12
Campylobacter, only MLST (Wilson et al. PLoS Genet 2008;4(9):e1000203) Salmonella, only MLVA (Mughini-Gras et al. Infect Genet Evol 2014;28:251-60)
STRUCTURE (distance-based algorithm) Pathogenen in voedsel en mensen | 26 januari 2016
Salmonella bronattributie in Nederland (1) 100% 90%
Number of salmonellosis cases
80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%
Pigs
Cattle
Broilers
Layers/eggs
Reptiles
Travel
Outbreaks
Unknown
Pathogenen in voedsel en mensen | 26 januari 2016
13
Salmonella bronattributie in Nederland (2) 6000
Number of salmonellosis cases
5000
4000
3000
2000
1000
0
Pigs 14
Cattle
Broilers
Layers/eggs
Reptiles
Travel
Outbreaks
Unknown
Pathogenen in voedsel en mensen | 26 januari 2016
Campylobacter bronattributie in NL
15
Pathogenen in voedsel en mensen | 26 januari 2016
Bron-specifieke risicofactoren - Salmonella
Mughini-Gras et al. PLoS One. 2014;9(2):e87933
16
Pathogenen in voedsel en mensen | 26 januari 2016
Bron-specifieke risicofactoren - Campylobacter
Mughini-Gras et al. Epidemiol Infect. 2013;141(12):2526-35 Mughini-Gras et al. PLoS One. 2012;7(8):e42599
17
Pathogenen in voedsel en mensen | 26 januari 2016
Conclusie ● ● ● ● ●
Micro-organisme vs pathogeen Reservoir besmetting Voedselproduct Momentopname Besmetting vs infectie
● Brononderzoek ● Bronattributie
18
Pathogenen in voedsel en mensen | 26 januari 2016
19
Pathogenen in voedsel en mensen | 26 januari 2016
Holy grail of microbiology testing: are we getting any closer? Adrianne Klijn Nestlé Research Centre 1. Introductie Microbiologische methoden hebben een rijke historie die ver teruggaat. De principes van toen, vormen nog steeds de basis voor veel van de huidige microbiologische methoden. Een voorbeeld hiervan is Salmonella, die werd voor het eerst beschreven door Daniel Salmon in 1885. De definitie van toen wordt nog steeds gebruikt in de huidige ISO methode. Omdat ISO methoden vooral gebaseerd zijn op generieke ingrediënten die vrij verkrijgbaar zijn, worden in deze methoden vaak de kweekprincipes toegepast. Alternatieve methoden mogen gebruikt worden, mits ze gevalideerd zijn volgens ISO 16140. Door de jaren heen zijn er veel alternatieve methoden op de markt gekomen en is de keuze in microbiologische methoden enorm.
2. Het selecteren van microbiologische methoden Bij het selecteren van microbiologische methoden zijn er meerdere criteria. De belangrijkste zijn onder te brengen in: 1. 2. 3. 4.
Prijs Gebruikersgemak Time to result Betrouwbaarheid
2.1 Prijs Het criterium rond prijs is duidelijk: het liefst zo laag mogelijk! Toch komt daar meer bij kijken. Veel van de nieuwe methoden zijn duurder in vergelijking met de kweekmethoden. Maar daar staat wel tegenover dat de resultaten vaak eerder beschikbaar zijn. Het is dan ook belangrijk om de meerprijs hier tegen af te zetten. Doordat de resultaten eerder beschikbaar zijn kan er beter en sneller worden ingespeeld op probleemsituaties (bijvoorbeeld bij een waterlekkage in de fabriek). Met alternatieve methoden kunnen ingrediënten en producten vaak sneller vrijgegeven worden, waardoor bijvoorbeeld op opslagkosten bespaard kan worden. Bij de prijs is het ook belangrijk dat er niet alleen naar de directe prijs (zoals de kitprijs) gekeken wordt, maar ook naar alle zaken die erbij kunnen komen. Zoals de benodigde apparatuur (bijvoorbeeld ELISA of PCR machines), randapparatuur (denk aan UV-kabinetten) en verbruiksartikelen (waaronder pipetpuntjes) die bij dezelfde leverancier als de kit gekocht moeten worden. Dat kan dan oplopen in transport- en importkosten. 2.2 Gebruikersgemak Voor veel kweekmethoden is een goed getrainde microbioloog onmisbaar. Er is veel kennis nodig; niet alleen om alle monsters correct voor te bewerken, maar ook het aflezen van platen en het bevestigen van kolonies vergt ervaring. Het is niet altijd even makkelijk om overal in de wereld goed Holy grail of microbiology testing: are we getting any closer?
getrainde microbiologen te vinden en te houden. Een geautomatiseerde methode kan het analytische proces vereenvoudigen. Bij de selectie van geautomatiseerde methoden spelen meerdere zaken een rol: Is de capaciteit van de apparatuur afgestemd op wat het lab nodig heeft? Hoeveel ruimte neemt de apparatuur in beslag? Fabriekslabs zijn vaak niet erg groot. Kunnen alle analyses op eenzelfde platform of moeten er meerdere komen? Wie onderhoudt de apparatuur, wat gebeurt er als er een probleem is (back-up apparatuur zelfde dag)? Maar zelfs bij geautomatiseerde methoden blijft microbiologische kennis nodig. Bijvoorbeeld voor alternatieve methoden die gebaseerd zijn op immunologische principes wordt toch nog een kweekmethode gebruikt voor het bevestigen van een vermoedelijk positief resultaat. 2.3 Time to result Ook hier kan men het simpel houden: het liefst zo snel mogelijk! Hoe sneller men kan inspelen op problemen in de productieomgeving, hoe beter. Ook bij het vrijgeven van ingrediënten en produkten is tijd essentieël, vooral bij produkten met een korte houdbaarheidstermijn. Met de huidige methoden is dat niet altijd mogelijk en worden er beslissingen genomen op basis van zogenaamde indicator organismen en volgen de resultaten voor de relevante pathogenen later. Om de tijd tot detectie terug te brengen kan men er voor kiezen om de monsters niet naar een centraal laboratorium te sturen, maar ter plekke de analyses uit te laten voeren in een fabriekslaboratorium. Dit kan de tijd tot detectie inderdaad terug brengen. Maar een volledig uitgerust microbiologisch lab, op het juiste biosafety level met apparatuur en getrainde analisten is een behoorlijke investering. 2.4 Betrouwbaarheid Microbiologische resultaten worden niet alleen binnen maar ook buiten het produktiebedrijf gebruikt. Zo wordt bij ingrediënten en produkten vaak een Certificate Of Analysis (COA) meegeleverd als bewijs dat er getest is, hoe de test gedaan is en wat de resultaten zijn. Ook officiële instellingen testen monsters en evalueren analytische data, bijvoorbeeld bij het importeren van goederen. Afhankelijk van de methode die gebruikt is kunnen deze resultaten verschillen. In Noord-Amerika gebruikt men BAM (Bacteriological Analytical Manual), in China gebruikt men GB methoden, terwijl in Europa ISO methoden worden gebruikt. Welke van deze methoden geeft de juiste informatie? Om die vraag te kunnen beantwoorden moeten we eerst bepalen wat de 'juiste informatie' is? Wat een methode meet is gebaseerd op de definitie van dat principe. Voor Salmonella is er een phenotypsiche definitie (morfologie, biochemische reacties) en een genetische definitie (InvA gen), maar geen van beide kunnen ze echt garant staan voor de voedselveiligheid. Als we kijken naar Shigatoxin producerende Escherichia coli kan er geen phenotypische definitie worden vastgesteld, alleen een genetische. Dit verschil in definities kan ook problemen geven bij het valideren van een alternatieve methode die gebaseerd is op een ander principe dan de referentie methode.
Holy grail of microbiology testing: are we getting any closer?
3. De weg er naar toe Zoals al eerder gezegd, door de jaren heen zijn er veel alternatieve methoden op de markt gekomen en is de keuze enorm. Deze alternatieve methoden zijn onder te brengen in verschillende principes zoals: 1. 2. 3. 4. 5. 6.
Kweekmethoden (kant-en-klaar media, chromogene/fluorogene media, etc.) Immunologische methoden (ELISA, ELFA, etc.) Moleculaire methoden (Real-Time PCR, Isothermal PCR, digital droplet PCR, etc.) Biochemische methoden (impedantie, ATP, etc.) Microscopische methoden (bijvoorbeeld FISH) Biosensor (Molecular Imprinted Polymers (MIP), nanofluidic, etc.)
Er zijn verschillende alternatieven waarbij het medium voor kweekmethoden niet door het lab zelf gemaakt hoeft te worden. Denk aan kant-en-klaar media en petrifilm. Deze methoden verhogen het gebruikersgemak: ze zijn minder arbeidsintensief; het identificeren van micro-organismen wordt vereenvoudigd; het totale proces kan verkort worden. Echter het zijn niet altijd goedkopere methoden. Voor methoden die gebaseerd zijn op immunologische principes zijn er volledig geautomatiseerde systemen met een hoge capaciteit. Binnen Nestlé zijn dit de meest gebruikte methoden voor Salmonella. Het grote voordeel hiervan is het gebruikersgemak, maar deze methoden geven relatief vaker vermoedelijke positieve resultaten die dan nog wel met een kweekmethode moeten worden bevestigd. Moleculaire methoden hebben de meest dynamische vooruitgang gemaakt. Zo zijn we begonnen met PCR en agarose gels, maar inmiddels is de Real-Time PCR al routine geworden en kijken we nu al naar de volgende generaties: Isothermal PCR, waar geen thermal cycler maar enzymen worden gebruikt voor de amplificering. Hierbij wordt een resultaat in 10 min verkregen. Droplet-digital PCR, waarbij van 20 µl 20.000 druppels wordt gemaakt; elk met hun eigen PCR reactie. Lab-on-chip, waar meerdere PCR reacties plaatsvinden en pathogenen gedetecteerd en geïdentificeerd kunnen worden. Moleculaire methoden zoals whole genome sequencing worden nu al toegepast en geven een ongekend inzicht in outbreak investigations. Echter metagenomics maakt zijn intocht en dat zal ook weer nieuwe inzichten geven. Deze methoden hebben veel te bieden en zullen bepalen hoe er in levensmiddelenmicrobiologie in de toekomst getest zal worden. Wel zijn er aandachtspunten die in acht genomen moeten worden. Ongetwijfeld zal de traditionele microbiologie een sleutelrol blijven houden.
Holy grail of microbiology testing: are we getting any closer?
The holy grail of microbiology testing: Are we getting any closer? Adrianne Klijn
CONFIDENTIAL Proprietary information of Nestlé S. A., Vevey, Switzerland This document should not be reproduced or disclosed without prior authorisation
Holy grail of microbiology testing: Are we getting any closer? Wat zijn de belangrijkste selectiecriteria? Hoe ver zijn we?
2
CONFIDENTIAL Proprietary information of Nestlé S. A., Vevey, Switzerland This document should not be reproduced or disclosed without prior authorisation
Nestlé in Figures
OVER 1 BILLION PRODUCTS SOLD
EVERY DAY
Turnover 2014: CHF 91.6 billion >330’000 employees in 150 countries >447 factories in 86 countries >2,000 brands
3
January 2016
R&D at Nestlé
CONFIDENTIAL Proprietary information of Nestlé S. A., Vevey, Switzerland This document should not be reproduced or disclosed without prior authorisation
Microbiologische laboratoria in de hele wereld
CONFIDENTIAL Proprietary information of Nestlé S. A., Vevey, Switzerland This document should not be reproduced or disclosed without prior authorisation
Holy grail of microbiology testing Wat zijn de belangrijkste selectiecriteria?
Rekening houdend met de huidige criteria en de toekomstige criteria
CONFIDENTIAL Proprietary information of Nestlé S. A., Vevey, Switzerland This document should not be reproduced or disclosed without prior authorisation
5
Wat zijn de belangrijkste selectiecriteria? Prijs Gebruikersgemak Time to result Betrouwbare methoden
6
CONFIDENTIAL Proprietary information of Nestlé S. A., Vevey, Switzerland This document should not be reproduced or disclosed without prior authorisation
Selectiecriteria voor microbiologische methoden Prijs Zo laag mogelijk!
Rekening houdend met het hele produktieproces: vasthouden van ingredienten /producten kost ook geld.
Non-proprietary methods
(ISO principe) Zelfde product bij meerdere leveranciers
Proprietary methods
Totale prijs: kit, verbruiksartikelen, (rand) apparatuur Distributiekanalen
Inrichting van laboratorium
Autoclaven Biosafety level Microbiologisch lab??? CONFIDENTIAL Proprietary information of Nestlé S. A., Vevey, Switzerland This document should not be reproduced or disclosed without prior authorisation
7
Selectiecriteria voor microbiologische methoden Gebruikersgemak
8
Minimale training
Methode kan uitgevoerd worden door iemand zonder microbiologische training Resultaten zijn gemakkelijk te interpreteren Fabriekslaboratorarium
Een platform
Hetzelfde apparaat kan worden gebruikt voor verschillende testen, bv. Salmonella, Listeria en Stec.
Een uniek protocol
Minimaliseren van adapaties voor verschillende monsters
Geautomatiseerd
Weinig hands-on-time nodig van de analist
Volume flexible
High throughput labs/ kleine fabriekslaboratoria Binnen hetzelfde lab, waar hoeveelheid monsters sterk kan fluctureren
Ruimte
Small footprint Troubleshooting/back-up equipment CONFIDENTIAL Proprietary information of Nestlé S. A., Vevey, Switzerland This document should not be reproduced or disclosed without prior authorisation
Selectiecriteria voor microbiologische methoden Time to result Zo snel mogelijk!
In plaats van hygiëne indicatoren, test voor aanwezigheidheid van pathogenen. Functie van hygiëne indicatoren is beperkt
Time to result
Terugbrengen time to result: • Finished product (release testing) • Raw materials • Environmental samples
Real-Time
On-line testing
CONFIDENTIAL Proprietary information of Nestlé S. A., Vevey, Switzerland This document should not be reproduced or disclosed without prior authorisation
9
Selectiecriteria voor microbiologische methoden Betrouwbare methoden
10
Een internationale methode
Zelfde resultaten als de autoriteiten Een Certificate Of Analysis (COA)
Gevalideerde methoden
ISO 16140 in Europa (MicroVal and AFNOR) Alleen als er een referentie methode is Validation is alleen maar het begin, blijf kritisch
Good performance
ISO 16140 (2016) criteria Fout-negatief 0% Fout-positief 0%
CONFIDENTIAL Proprietary information of Nestlé S. A., Vevey, Switzerland This document should not be reproduced or disclosed without prior authorisation
Selectiecriteria voor microbiologische methoden Betrouwbare methoden
Salmonella Phenotypische definitie
Genetische definitie
Voedselveiligheid
InvA gene
Gram-negative, motile rods Oxidase → negatief Fermentatie glucose → positief Fermentatie lactose → negatief Waterstofsulfide gas → positief Lysine decarboxylase → positief Urease hydrolyse → negatief Indool vorming → negatief
CONFIDENTIAL Proprietary information of Nestlé S. A., Vevey, Switzerland This document should not be reproduced or disclosed without prior authorisation
11
Selectiecriteria voor microbiologische methoden Betrouwbare methoden Reported foodborne outbreak by etiology in percentage in 2013 36
Voedselveiligheid
33 24
Bacterial
6
1
Chemical and toxin
Parasitic
Viral
Unknown
Foodborne Disease Outbreak Surveillance System, united States 2013
12
CONFIDENTIAL Proprietary information of Nestlé S. A., Vevey, Switzerland This document should not be reproduced or disclosed without prior authorisation
Methoden voor bekende oorzaken maar niet voor onbekende oorzaken
Selectiecriteria voor microbiologische methoden Betrouwbare methoden Single International recognised method
Zelfde resultaten als de autoriteiten Een Certificate Of Analysis (COA)
Gevalideerde methoden
ISO 16140 in Europa (MicroVal and AFNOR) Alleen als er een referentiemethode is Validation is alleen maar het begin, blijf kritisch
Good performance
ISO 16140 (2016) criteria Fout-negatief 0% Fout-positive 0%
Methoden die de voedselveiligheid in zijn totaliteit waarborgen
CONFIDENTIAL Proprietary information of Nestlé S. A., Vevey, Switzerland This document should not be reproduced or disclosed without prior authorisation
13
Wat zijn de belangrijkste selectiecriteria? Prijs Gebruikersgemak Time to result Betrouwbare methoden
14
CONFIDENTIAL Proprietary information of Nestlé S. A., Vevey, Switzerland This document should not be reproduced or disclosed without prior authorisation
Holy grail of microbiology testing: Are we getting any closer? Wat zijn de belangrijkste selectiecriteria? Hoe ver zijn we?
CONFIDENTIAL Proprietary information of Nestlé S. A., Vevey, Switzerland This document should not be reproduced or disclosed without prior authorisation
15
Hoe ver zijn we? 1. Kweekmethoden 2. Immunologische methoden 3. Moleculaire methoden 4. Biochemische methoden 5. Microscopische methoden 6. Biosensor
16
CONFIDENTIAL Proprietary information of Nestlé S. A., Vevey, Switzerland This document should not be reproduced or disclosed without prior authorisation
Hoe ver zijn we ? Kant-en-Klaar media Kweek methoden
Chromogene/ fluorogene agar One broth one agar
Petrifilm CONFIDENTIAL Proprietary information of Nestlé S. A., Vevey, Switzerland This document should not be reproduced or disclosed without prior authorisation
17
Hoe ver zijn we? Volledig geautomatiseerde ELISA/ELFA Immunologische methoden
Dipsticks
Faagmethoden
18
CONFIDENTIAL Proprietary information of Nestlé S. A., Vevey, Switzerland This document should not be reproduced or disclosed without prior authorisation
Hoe ver zijn we? Geautomatiseerd Isothermal Digital PCR
Moleculaire methoden voor detectie
Molecular flow
Lab-on-chip Array
CONFIDENTIAL Proprietary information of Nestlé S. A., Vevey, Switzerland This document should not be reproduced or disclosed without prior authorisation
19
Hoe ver zijn we? Salmonella serotyping
Moleculaire methoden voor bevestiging
20
Whole genome sequencing
CONFIDENTIAL Proprietary information of Nestlé S. A., Vevey, Switzerland This document should not be reproduced or disclosed without prior authorisation
Whole genome sequencing
Target
Sequencing
Bioinformatics
Single pure strain
In de toekomst:
Gebruikt voor: Outbreak investigation
Pathogen characterisation
Link smaller outbreaks Determine which patients are linked to outbreak Determine size of outbreak Track potential source of the outbreak Determine likely route of contamination
Identifying strains with high virulence potential Resistance to antimicrobials Input for risk assessment Method development
CONFIDENTIAL Proprietary information of Nestlé S. A., Vevey, Switzerland This document should not be reproduced or disclosed without prior authorisation
Hoe ver zijn we? Salmonella serotyping
Moleculaire methoden voor bevestiging
Whole genome sequencing
Metagenomics
22
CONFIDENTIAL Proprietary information of Nestlé S. A., Vevey, Switzerland This document should not be reproduced or disclosed without prior authorisation
Metagenomics
Target
Sequencing
Bioinformatics
Swab Raw material Finished product
Gebruikt voor: Establishing baselines Genetic fingerprint / profiles
Detecting deviations / a change from the norm Signal banks
Mobile devices (Oxford Nanopore technologies) Data gathered in the field and analysis remotely Multiple targets e.g. microbiology, detection GMO and authenticity ….. CONFIDENTIAL Proprietary information of Nestlé S. A., Vevey, Switzerland This document should not be reproduced or disclosed without prior authorisation
Holy grail of microbiology testing: Are we getting any closer? Wat zijn de belangrijkste selectiecriteria? Hoe ver zijn we?
24
CONFIDENTIAL Proprietary information of Nestlé S. A., Vevey, Switzerland This document should not be reproduced or disclosed without prior authorisation
Holy grail of microbiology testing: Are we getting any closer? Huidige
25
Toekomstige
Prijs
Nieuwe methoden (cultuur/immunologie) dalen in prijs. Competive market.
In de toekomst zal de totaalprijs en het hele plaatje een grotere rol spelen
Gebruikers gemak
Automatisering maakt testen in fabrieks lab makkelijker
Gebruikersgemak nog verder verbeteren.
Time to result
Resultaten volgende dag Versterken van issue management
On-line
Betrouwbare methoden
Methoden worden verbeterd Methoden worden nauwkeuriger Evaluatie & criteria worden aangescherpt
Totale beeld voor voedselveiligheid Karakteriseren van onbekende bacterien, viable/non-culturable bacterien en totaalbeeld microbiota
CONFIDENTIAL Proprietary information of Nestlé S. A., Vevey, Switzerland This document should not be reproduced or disclosed without prior authorisation
Holy grail of microbiology testing: Are we getting any closer? Aandachtspunten: Bij veel moleculaire methoden blijft het kweken van de microorganismen belangrijk (ophoping) Ook het isoleren van de micro-organismen blijft belangrijk. Positief PCR signaal is niet voldoende. Meten is niet weten! Om de voedselveiligheid echt te kunnen waarborgen blijft het begrijpen van micro-organismen belangrijk.
26
CONFIDENTIAL Proprietary information of Nestlé S. A., Vevey, Switzerland This document should not be reproduced or disclosed without prior authorisation
Holy grail of microbiology testing: Are we getting any closer?
2013
27
CONFIDENTIAL Proprietary information of Nestlé S. A., Vevey, Switzerland This document should not be reproduced or disclosed without prior authorisation
The quest for the holy grail
28
CONFIDENTIAL Proprietary information of Nestlé S. A., Vevey, Switzerland This document should not be reproduced or disclosed without prior authorisation
Acknowledgements
David Tomas
Leen Baert
CONFIDENTIAL Proprietary information of Nestlé S. A., Vevey, Switzerland This document should not be reproduced or disclosed without prior authorisation
Clostridium botulinum - wat is het risico voor levensmiddelen inclusief kant-en-klaar vacuüm of MAP verpakte producten Marjon Wells-Bennik NIZO food research Inleiding Clostridium botulinum is een een gram-positieve anaërobe, sporenvormende, staafvormige bacterie behorende tot het geslacht Clostridium. Deze bacterie produceert het toxine botuline, één van de giftigste stoffen op aarde. C. botulinum is van belang voor voedselveiligheid, bioterrorisme en cosmetische toepassingen. De mortaliteit van botulisme is hoog: 1-10% bij behandeling in het ziekenhuis (doorgaans langdurige intensive care), en >60% wanneer geen behandeling plaatsvindt. Sporen van C. botulinum komen wijdverbreid voor in grond, marine sedimenten en plantaardig materiaal. Deze inerte sporen kunnen echter ontkiemen onder gunstige omstandigheden, waarna uitgroei van vegetatieve cellen kan plaatsvinden, gevolgd door toxine produktie en sporulatie.
Botuline toxine De bacterie bevat genen die coderen voor het botulinum toxine; dit toxine is een van de meest krachtige neurotoxinen die bekend zijn, en 30 nanogram (3x10-8 g) kan al fataal zijn als gevolg van slappe verlamming van spieren door blokkade van signaaloverdracht tussen de zenuw en de spier (acetylcholine komt niet meer vrij in de synaps). Dit mechanisme ligt ten grondslag aan het gebruik van extreem lage concentraties van botulinum in cosmetische toepassingen (onder meer Botox): gezichtsspieren worden zeer lokaal verlamd na injectie waardoor geen rimpelvorming meer kan optreden. Gezien de hoge toxiciteit van het toxine dat C. botulinum produceert wordt deze bacterie als een klasse A bioterrorisme bedreiging beschouwd.
Belang voor levensmiddelenproducenten Voor levensmiddelenproducenten is C. botulinum van belang omdat sporen van dit organisme middels ingredienten in produkten terecht kunnen komen, en onder gunstige omstandigheden kunnen ontkiemen en uitgroeien. Een adequaat begrip van de risico’s geassocieerd met C. botulinum in levensmiddelen en implementatie van de juiste beheersmaatregelen is daarom essentieel. Dit wordt in de presentatie geschetst en hieronder samengevat.
Groepen Clostridium botulinum Hoewel de naam van het organisme suggereert dat het om één soort gaat, is het belangrijk onderscheid te maken tussen 4 verschillende groepen van C. botulinum. Species binnen groep I, III en IV zijn isolaten proteolytisch, terwijl isolaten binnen groep II niet-proteolytisch zijn. Daarnaast kunnen isolaten van groep II en III bij koelkasttemperaturen groeien, terwijl voor de andere stammen geldt dat een minimum groeitemperatuur van 10°C nodig is.
Fout! Geen tekst met de opgegeven stijl in het document.
Om het nog complexer te maken wordt er onderscheid gemaakt tussen 7 toxine-typen (A tot G) waarvan alleen type C en D, behorend tot groep III, niet toxisch is voor de mens. Toxine type A, B en F worden aangetroffen in groep I; toxine type B, E en F in groep II (niet-proteolytisch); en toxine type G in groep IV. De 2 belangrijkste groepen die van belang zijn voor voedselvergiftigingen zijn: 1. Isolaten behorende tot groep I, welke toxine A, B, of F produceren en proteolytisch zijn. De sporen van deze isolaten zijn relatief hitteresistent. De meeste uitbraken gerelateerd aan deze soorten kunnen worden herleid op gebreken in processing (verhitting of lekke seals) of te hoge pH van de ingeblikte levensmiddelen. Bederf is doorgaans goed waarneembaar. 2. Isolaten behorende tot groep II, welke toxine B, E, of F produceren en niet-proteolytsch zijn. De sporen van deze isolaten zijn relatief hittegevoelig. Deze stammen kunnen groeien boven de 3°C. De meeste uitbraken gerelateerd aan deze soorten zijn te herleiden op bewaring bij te hoge temperatuur van ready-to-eat levensmiddelen die vervolgens geconsumeerd worden. Bederf is doorgaans niet goed waarneembaar. Met name deze groep vormt ook een potentieel risico voor kant-en-klaar vacuüm of MAP verpakte producten. Voor de verschillende C. botulinum groepen in verschillende typen levensmiddelen liggen een aantal richtlijnen voor beheersing vast, en deze worden in de presentatie nader benoemd. Uiteindelijk is het voor beheersing van Clostridium botulinum essentieel dat Good Manufacturing Practices en Hygienic Practices zijn ingebouwd in het proces, met aandacht voor: 1) formulering (nieuw(?) recept, ingredienten, verpakking); 2) het verhittingsproces; 3) de bewaringstemperaturen in de keten; en tot slot 4) de beoogde THT datum. Alleen een dergelijke aanpak leidt tot een gedegen beheersing van deze sporenvormer, zonder recalls en incidenten.
Fout! Geen tekst met de opgegeven stijl in het document.
Beheersing en detectie van microbiële contaminatie via lucht Frans. W. Saurwalt Kropman Contamination Control Microbiële contaminatie in lucht Sprekend over de beheersing en detectie van microbiële contaminatie in lucht is het belangrijk te beseffen waar we over spreken. Lucht kan grote hoeveelheden deeltjes bevatten waarbij de deeltjesgrootte en de aantallen omgekeerd evenredig zijn. Grote deeltjes vertegenwoordigen een groot deel vaan de massa met een beperkt aantal, terwijl de overgrote meerderheid van deeltjes klein zijn en vrijwel geen massa bijdragen. Zie afbeelding 1.
Afbeelding 1. Deeltjesgrootte in relatie tot het aantal (ref. 1). Een deel van deze deeltjes kan van microbiële aard zijn. Daarbij kan worden gedacht aan sporen, pollen, bacteriën en virussen. Deze komen voor in buitenlucht maar kunnen ook in meer gecontroleerde omgevingen voorkomen. Bronnen daarvan zijn meestal de mens, maar ook verwerkte materialen kunnen een bron van besmetting vormen.
Sectoren en microbiële belasting Sectoren die te maken hebben met het beheersen van microbiële belasting zijn de (Bio-)farmacie, medische instrumenten, gezondheidszorg, voedingsmiddelenproductie. Deze sectoren kunnen voor specifieke omstandigheden gebruikmaken van cleanroomtechnieken. Er zijn meer sectoren die daar gebruik van maken, soms met veel strengere reinheidseisen, zoals de chipsindustrie. Daarbij worden alle substanties, dood zowel als levend als contaminaten beschouwd en bestreden / beheerst. De sectoren kunnen in grote lijnen naar een aantal aspecten worden vergeleken. Zie daarvoor afbeelding 2.
Beheersing en detectie van microbiële contaminatie via lucht
Afbeelding 2. Vergelijking van een aantal aspecten naar sector.
Lucht, een lastig te beheersen fluïdum Lucht is een lastig te beheersen fluïdum. We kennen het allemaal maar zijn ons vaak niet erg bewust van het complexe van luchtbewegingen. Deze worden natuurkundig beschreven via de Navier-Stokes formules, waarbij allerlei invloeden en randvoorwaarden erg bepalend zijn, zoals de temperatuureffecten en de mate van turbulentie. Ook de vormen van objecten waardoor of langs de lucht stroomt bepalen in grote mate de stroming. Vorm van deeltjes in lucht Wanneer we spreken over deeltjes in lucht en speciaal over micro-organismen wordt het voorspellen van het gedrag van dergelijke contaminanten nog complexer. In de wereld van de 'contamination control' worden deeltjes vaak aangeduid met slechts één dimensie: een bepaalde grootte in micrometer (= 1/1000 mm). Echter, er moet worden bedacht dat een deeltje een drie dimensionaal object is en zeker niet met per definitie een bolvorm. Het kunnen draadvormige en platte vormen betreffen en ook de soortelijke massa van de substantie kan verschillen. Deeltjesdetectoren kunnen meestal alleen een soort equivalente diameter vaststellen maar scheren daarmee deeltjes van verschillende vorm en textuur over één kam terwijl het deeltjesgedrag zeer kan verschillen. Deeltjes zijn niet bedreigend als ze niet op een oppervlak vallen waar ze niet bedoeld zijn. De wijze van vallen / sedimenteren is echter niet heel eenvoudig.
Creëren van een schone luchtomgeving Om een schone omgeving te maken (in lucht gemeten) worden een aantal strategieën gebruikt; • Het filteren van de ingeblazen lucht zodat deze heel schoon is. • Het tegenhouden van minder schone omgevingslucht door en (bouwkundige) schil • Het bewerkstelligen van een naar buiten gerichte luchtstroming door lekken en openingen • Het beperken van de verspreiding van deeltjes door mensen (kleding en gedrag) • Het beperken van de verspreiding van deeltjes door apparatuur en (hulp)middelen
Beheersing en detectie van microbiële contaminatie via lucht
Onderzoek heeft uitgewezen dat kleine deeltjes maar voor een heel klein deel microbieel van aard zijn. Grotere deeltjes vormen veelvuldig een microbiële belasting. Grotere deeltjes kunnen één of meerdere microben dragen.
Afbeelding 3. (ref. 2)
Bepalen microbiële inhoud van lucht Om de microbiële inhoud van lucht te bepalen zijn een aantal technieken beschikbaar: * deeltjesteller op basis van laserlichtverstrooing: meet zowel dode als levende deeltjes * microbiologische airsampler: meet kweekbare micro-organismen * gebruik van sedimentatieplaten: meet kweekbare micro-organismen * deeltjesteller voor meten sedimentatie grotere deeltjes * deeltjesteller met identificatie mogelijkheid Deeltjesteller op basis van laserlichtverstrooing Allereerst bestaat de conventionele deeltjesteller op basis van laserlichtverstrooing. Deze kan online een waarde genereren voor de concentratie, verdeeld naar deeltjesgrootte per eenheid van de aangezogen lucht. Daarbij worden zowel dode als levende deeltjes geteld en niet onderscheiden. Microbiologische airsampler Een gangbare techniek voor het tellen van kiemen vormt een microbiologische air sampler. Deze zuigt ook lucht aan maar laat door een specifiek stromingspatroon en snelheid deeltjes van bepaalde grootte neerslaan op een voedingsbodem. Na een voldoende monsternametijd volgt opkweken van micro-organismen op de voedingsbodem. Na enkele dagen wordt het aantal kolonies op de bodem geteld en het aantal kolonievormende eenheden per hoeveelheid lucht bepaald. De telling en het getal is niet specifiek voor de aard van de microben. Maar geoefende tellers herkennen wel diverse veel voorkomende micro-organismen, meestal de door mensen verspreidde soorten. Bij problemen, hoge aantallen of twijfel, worden vaak de gevonden organismen verder gedetermineerd. Voor bepaalde groepen organismen bestaan er verschillende soorten voedingsbodems. Echter, uit diverse studies is bekend dat de methode niet bijzonder nauwkeurig is. Maar het is wel de meest geaccepteerde en de minst slechte wijze van vergelijkbaar vaststellen van het aantal kve's per inhoud lucht (bij soortgelijk apparaat, medium en incubatieprocedure).
Beheersing en detectie van microbiële contaminatie via lucht
Gebruik van sedimentatieplaten Een ander methode is het gebruik van sedimentatieplaten. Daarbij wordt beoogd met name die microben te detecteren die uit / door de lucht vallen en op een relevant oppervlak terecht komen. Ook daarvoor geldt de beperking dat het een methode is met voedingsbodems die een kweekperiode noodzakelijk maken. Deeltjesteller voor meten grotere deeltjes Moderne optische technieken hebben geleid tot de ontwikkeling van deeltjessedimentatie meetapparatuur die vrijwel online de sedimentatie van grotere deeltjes ≥ ca. 20 µm tot ca. 200 µm detecteren. Daarbij blijkt dat deze veel meer voorkomen, ook in cleanrooms, als uit de deeltjesmetingen op de gangbare groottes van ≥ 0,5µ en ≥ 5µm zou worden verwacht. De bron van deze deeltjes is niet de gefilterd ingeblazen lucht. Met een redelijk eindfilter komt daar vrijwel geen levend deeltje doorheen. Het betreft vooral de mens als bron, en diverse materialen, grondstoffen en handeling als bron en verspreidings mechanisme. Deeltjesteller met identificatie mogelijkheid Een heel nieuwe ontwikkeling is de deeltjesteller die ook identificeert of een deeltje karakteristieken heeft die gecorreleerd worden met levende organismen. Op basis van metabolisme en chemische eigenschappen wordt gekeken naar de reflectie van laser door: * Gereduceerde Nicotinamide-adenine- dinucleotide (NADH) * Riboflavine (vitamin B2) * Dipicolinic Acid (DPA) Deze methode biedt de potentie van het vrijwel direct beschikbaar komen van de meetwaarden, net zoals bij een conventionele deeltjesteller. Daarbij is het veel eenvoudiger de correlatie te leggen tussen gebeurtenissen en handelingen en hun effect op de reinheid van de lucht. Een voorbeeld is een studie naar de deeltjes en kiem concentratie in een schone kleedsluis bij het omkleden van diverse personen. Zie afbeelding 4. Een probleem is echter nog wel de mogelijke valse positieven doordat stoffen soms een vergelijkbare reflectie hebben als de als de onderscheidde karakteristieke stoffen. De verwachting is echter dat deze beperkingen en onzekerheden zullen worden gepareerd en voldoende betrouwbare detectie mogelijk wordt.
Beheersing en detectie van microbiële contaminatie via lucht
Afbeelding 4. Studie naar de deeltjes en kiemconcentratie in een schone kleedsluis (ref 3).
Contaminatieniveaus in lucht Dit alles overziend is natuurlijk de grote vraag; welke niveaus zij acceptabel? Zijn er 'classes' voor de reinheid van lucht met betrekking tot kiemen? Het antwoord is zeer bescheiden. Alleen voor de omstandigheden waaronder steriele medicijnen geproduceerd mogen worden bestaat een soort classificatie. Deze is in Europa vervat in de Eudralex GMP document Volume 4 Annex 1 betreffende productie van steriele geneesmiddelen. Daarin wordt voor typische productiestappen een bepaalde klasse voorgeschreven, variërend van de laagste klasse D tot de hoogste: A. De microbiologische eisen aan de omgeving zijn weergegeven in afbeelding 5.
Afbeelding 5. Microbiologische eisen omgeving (ref 4).
Beheersing en detectie van microbiële contaminatie via lucht
Daarin zijn de kolom van het aantal kve/m3 en van de sedimentatie (settle plates) herkenbaar. Het betreft echter gemiddelde waarden, maar de wijze hoe met de gemeten waarden om te gaan is niet verder uitgewerkt. Er wordt gewezen op het gemiddelde, maar omdat het waarden betreft die een handhavingskader vormen is er veel verwarring hoe daar exact mee om te gaan. Ook in de gezondheidszorg worden soms waarden voor de kiemconcenratie in lucht en voor de kiemsedimentatie gebruikt. Binnen CEN verband wordt getracht dat Europa breed vast te leggen als streefgetallen. Waardes in de range van klasse C en B worden daarbij als realistisch beschouwd. In allerlei andere richtlijnen en standaarden wordt voor de kwaliteit en /of veiligheid geen reinheidseis voor microbiologie in lucht genoemd. Er wordt vooral gewezen op een risico/impact afweging. Deels is dat te verklaren door de praktische verlegenheid met de kweekaspecten die met de huidige technieken gepaard gaan en die het vaststellen van de oorzaak-gevolg relaties tussen handelingen en de gevolgen moeilijk maken. Nieuwe technieken die vrijwel direct meetwaarden genereren zullen daarin een grote doorbraak mogelijk maken.
Referenties 1) 2) 3) 4)
Recknagel Verlag W. Whyte, M Green, WM Whyte, Removal efficiency of high efficiency filters against microbecarrying particles (MCP’s) incleanrooms (Clean Air and Containment review issue 14 April 2013) Tim Sandle e. a., Assessing airborne contamination using a novel rapid detection method, European journal of parenteral and pharmaceutical sciences, 2014 Vol 19 (4) EudraLex - Volume 4 Good manufacturing practice (GMP) Guidelines. Annex 1 Manufacture of Sterile Medicinal Products
Beheersing en detectie van microbiële contaminatie via lucht
European Hygienic Engineering & Design Group
Beheersing en Detectie van Microbiele Contaminatie via lucht
Document Name
Micro-organismen, 26 Januari 2016 FIMM Symposium
European Hygienic Engineering & Design Group
Frans Saurwalt • Voorzitter van EHEDG-NL (expert in div. subgroups) • Voorzitter (International Confederation of Contamination Control Societies) • (Vereniging voor Contamination Control NL) • Expert/Convenor in ISO TC-209 Clean Rooms and other Controlled Environments
• Secretaris CEN TC 156 WG 18 Hospital ventilation • Werkgroep Infectie preventie
Document Name Micro-organismen, 26 Januari 2016 FIMM Symposium
European Hygienic Engineering & Design Group
Frans Saurwalt
Integraal Ontwerp/Bouw van Procesinstallaties & Ge”controleerde” omgevingen Documentatie, Commissioning, Testen/kwalificatie/validatie, Food, Farma, Biotech, Medical devices, Gezondheidszorg, µ-Electronics Functie
Werkgever:
Technisch Manager Document Name Micro-organismen, 26 Januari 2016 FIMM Symposium
European Hygienic Engineering & Design Group
Take home message: • Er gaat meer door de lucht dan je denkt • Lucht volgt meestal niet ‘de pijlen‘ • Het gaat nooit om lucht alleen • Microbiele contaminatie is een uitdaging: • Detectiemethoden • Grenswaarden / classificatie
Document Name Micro-organismen, 26 Januari 2016 FIMM Symposium
European Hygienic Engineering & Design Group
1. Microbiële contaminatie? 2. Lucht ? 3. onderlinge Relatie en Beïnvloeding 4. Hoe houd je ze tegen 5. Hoe meet je microbiële contaminatie in lucht? 6. Welke niveaus hanteer je Document Name Micro-organismen, 26 Januari 2016 FIMM Symposium
European Hygienic Engineering & Design Group
Introductie • Waar mensen zijn….. • Waar producten worden gestort….. • Waar producten worden bewerkt….. • Waar machines draaien…… & • Waar in de buitenlucht van alles gebeurt…. Komt er van alles in de lucht! o.a. microbiële besmettingsbronnen Document Name Micro-organismen, 26 Januari 2016 FIMM Symposium
European Hygienic Engineering & Design Group
Luchtgedragen contaminaten Verdeling naar deeltjesgrootte in een grote stad
(Bron: Recknagel) Document Name Micro-organismen, 26 Januari 2016 FIMM Symposium
European Hygienic Engineering & Design Group
Ref: G. Prout
Document Name Micro-organismen, 26 Januari 2016 FIMM Symposium
European Hygienic Engineering & Design Group
Ref: G. Prout Document Name Micro-organismen, 26 Januari 2016 FIMM Symposium
European Hygienic Engineering & Design Group
Relatieve aanwezigheid van kiemen per deeltjesgrootte. Ref: W. Whyte e.a. Document Name Micro-organismen, 26 Januari 2016 FIMM Symposium
European Hygienic Engineering & Design Group
Document Name Micro-organismen, 26 Januari 2016 FIMM Symposium
European Hygienic Engineering & Design Group
Document Name Micro-organismen, 26 Januari 2016 FIMM Symposium
European Hygienic Engineering & Design Group
Document Name Micro-organismen, 26 Januari 2016 FIMM Symposium
European Hygienic Engineering & Design Group
Document Name Micro-organismen, 26 Januari 2016 FIMM Symposium
European Hygienic Engineering & Design Group
Document Name Micro-organismen, 26 Januari 2016 FIMM Symposium
European Hygienic Engineering & Design Group
Document Name Micro-organismen, 26 Januari 2016 FIMM Symposium
European Hygienic Engineering & Design Group
steriliteit product=voedingsbodem deeltjes in lucht kiemen in lucht oppervlakte reinheid moleculaire contaminatie vaste media: gassen/water volume en handling productiekosten personeel in omgeving
Micro-E ±nee nee ≥0,1µm nee ja! ja ultra puur groot zeer hoog nee
Farma Voeding OK's ja nee ±ja / nee soms altijd ja ≥0,5µm ≥ 1 µm ≥ 2-3 µm ja (ja) (ja) ja ja nee nee nee nee puur zuiver zuiver beperkt groot patient hoog laag laag beperkt vaak ±altijd Alleen indicatief
Document Name Micro-organismen, 26 Januari 2016 FIMM Symposium
European Hygienic Engineering & Design Group
1. Microbiële contaminatie? 2. Lucht ? 3. onderlinge Relatie en Beïnvloeding 4. Hoe houd je ze tegen 5. Hoe meet je microbiële contaminatie in lucht? 6. Welke niveaus hanteer je Document Name Micro-organismen, 26 Januari 2016 FIMM Symposium
European Hygienic Engineering & Design Group
Luchtstroming • • • • •
Navier-Stokes vergelijkingen beschrijven fluïda:
Snelheid Richting Temperatuur/dichtheid Uitgeoefende krachten Turbulentie intensiteit
Document Name Micro-organismen, 26 Januari 2016 FIMM Symposium
European Hygienic Engineering & Design Group
Document Name Micro-organismen, 26 Januari 2016 FIMM Symposium
European Hygienic Engineering & Design Group
Ref: Ljungqvist e.a. Document Name Micro-organismen, 26 Januari 2016 FIMM Symposium
European Hygienic Engineering & Design Group
patroon van rook in Uni Directionele Flow (UDF) v=0,2 m/s
Laminaire stroming
Turbulente stroming
Ref: Ljungqvist e.a. Document Name Micro-organismen, 26 Januari 2016 FIMM Symposium
European Hygienic Engineering & Design Group
Luchtstroming moeilijk precies te voorspellen…. …………..als er te veel graden van vrijheid zijn. (vx,y,z ,ρ, dt, k-ε) Algemeen: • Opwaarts effect warmtebronnen / warme lucht • Neerwaarts effect van koude lucht • Grotere invloed van wijze van toevoer t.o.v. wijze van afvoer Omstroomde objecten hebben grote invloed Luchtstromingen zijn goed te voorspellen bij beperkte graden van vrijheid: • Stroming door openingen ca. v> 0,4 m/s • UDF v>0,2 m/s zonder obstructie of temperatuur invloed. • ± bij zeer turbulente stromingen.
Ref: Ljungqvist e.a. Document Name Micro-organismen, 26 Januari 2016 FIMM Symposium
European Hygienic Engineering & Design Group
1. Microbiële contaminatie? 2. Lucht ? 3. onderlinge Relatie en Beïnvloeding 4. Hoe houd je ze tegen 5. Hoe meet je microbiële contaminatie in lucht? 6. Welke niveaus hanteer je Document Name Micro-organismen, 26 Januari 2016 FIMM Symposium
European Hygienic Engineering & Design Group
Deeltjes gedrag (in lucht): • Karakteristieke afmeting • Vorm • Soortelijke massa • Lading
Instantane verspreiding ondanks grote luchtverplaatsing tijdens OK-test Document Name Micro-organismen, 26 Januari 2016 FIMM Symposium
European Hygienic Engineering & Design Group
verspreiding van deeltjes in een horizontale luchtstroom van 0,45 m/sec Document Name Micro-organismen, 26 Januari 2016 FIMM Symposium
Relatie tussen d en D • d = equivalente diameter • D = deeltjesgrootte • Een maat voor een 3-dimensionaal object !?
Relatie tussen grootte en equivalente diameter deeltjes vorm Afmeting sphere r elipsoide
a > b >
d volume 2r c
2(abc)
1/3
blok
L
W
H 2(3LWH/4π)
cylinder
L
r
curve fibre
L
r >>
2(3r l/4) 2 1/3 R ~2(3r l/4)
2
1/3
1/3
d oppervlak 2r
D 2r
2√(ab)
2a
2√(LW/π)
L
2√(2rl/π) ~2√(2rl/π)
L 2R
• Complete huidschilfer is 44 x 33 x 4 µm • Voorbeeld: huiddeeltjes 30 x 20 x 2 µm -> d = 13, D = 30 µm. Tabel: Koos Agricola OC-Cannon/Technology of Sense/VCCN Document Name Micro-organismen, 26 Januari 2016 FIMM Symposium
European Hygienic Engineering & Design Group
Media
Verpakking
Overdracht via neerslag
gassen vloeistoffen
Kleding
Grondstoffen /Onderdelen
Product
Mens
contact
Slijtage Onderhoud
Equipment proces-, meet- en hulpapparatuur
Lucht omgeving
Infrastructuur luchtbehandeling bouw indeling
Bron: Lezingen programma Nationale Cleanroom Dag VCCN Contamination Control als Rode Draad! Document Name Micro-organismen, 26 Januari 2016 FIMM Symposium
European Hygienic Engineering & Design Group
Luchtstroming en contaminanten
Ref: Ljungqvist e.a. Document Name Micro-organismen, 26 Januari 2016 FIMM Symposium
European Hygienic Engineering & Design Group
Ref: G. Prout Document Name Micro-organismen, 26 Januari 2016 FIMM Symposium
European Hygienic Engineering & Design Group
Normale kleding: Ca. 40 kve/s pp
kve/s pp
Ref: Ljungqvist e.a. Document Name Micro-organismen, 26 Januari 2016 FIMM Symposium
European Hygienic Engineering & Design Group
Bron sterkte Concentratie ??? Kleding systeem is bijzonder van invloed! Concentratie : Bronsterkte/Luchthoeveelheid….
Ref: J. Holla Document Name Micro-organismen, 26 Januari 2016 FIMM Symposium
European Hygienic Engineering & Design Group
1. Microbiële contaminatie? 2. Lucht ? 3. onderlinge Relatie en Beïnvloeding 4. Hoe houd je ze tegen 5. Hoe meet je microbiële contaminatie in lucht? 6. Welke niveaus hanteer je Document Name Micro-organismen, 26 Januari 2016 FIMM Symposium
European Hygienic Engineering & Design Group
Ref: W. Whyte e.a. Document Name Micro-organismen, 26 Januari 2016 FIMM Symposium
European Hygienic Engineering & Design Group
1. 2. 3. 4.
Focus op cfu/m3 tijdens bedrijf Nadruk op “bron sterkte” op basis van “kledingconcept” Het is mogelijk ook andere bronnen toe te voegen Rekenmethodiek voor benodigde luchthoeveelheid:
5. Twee ventilatieconcepten: UDF of Mengend system • UDF: “verdringende stroming • Mengend: “verdunnende stroming” 6. Afschermen (stroming naar buiten! Flow/Pressure cascade) Ref: Ljungqvist e.a. Document Name Micro-organismen, 26 Januari 2016 FIMM Symposium
European Hygienic Engineering & Design Group
Filtering van lucht.
Ref: W. Whyte e.a. Document Name Micro-organismen, 26 Januari 2016 FIMM Symposium
European Hygienic Engineering & Design Group
Whyte e.a. 99,99% removal of MCP : filter efficiency > 90% [EN 1822] E11 General filter type
Testing and classification standard
Filter test type and application to the food industry
First filter stage to collect very coarse dust (larger than PM10 fine dust fraction)
EN 779
Arrestance Am %
G1
Am < 65
G4
90 ≤ Am
Medium fine filters used as first stage depending on product risk (typically 60-80% to PM10)
EN 779
Efficiency Em to 0.4 µm %
M5
40 ≤ Em < 60
M6
60 ≤ Em < 80
Fine filters used as secondary stage (typically ≥ 60% to PM1 fine dust)
EN 779
Efficiency Em to 0.4 µm %
Minimum Efficiency 0.4 µm %
Additional requirement for minimum efficiency. Used as secondary stage in Zone M or to protect EPA/HEPA type filters in Zone H.
EPA and HEPA type filters for specific particulate control
Ultra Low Penetration Air (ULPA) filters
G2
65 ≤ Am < 80
G3
80 ≤ Am < 90
Average mass of synthetic test dust (ASHRAE dust) retained in the filter as percentage of mass of dust fed to the filter. Not recommended as a single filter for food work.
Average fractional collection efficiency to 0.4 µm particles of a liquid test aerosol (mostly DEHS). Used as single stage or first filter stage for general, less critical food processing areas (Zone B).
F7
80 ≤ Em < 90
≥ 35
F8
90 ≤ Em < 95
≥ 55
F9
95 ≤ Em
EN 1822
Minimum MPPS %
E10
≥ 85
E11
≥ 95
E12
≥ 99,5
H13
≥ 99,95
H14
≥ 99,995
EN 1822
Minimum MPPS %
U15
≥ 99,9995
U16
≥ 99,99995
U17
≥ 99,999995
≥ 70 Initial efficiency to synthetic test aerosol at Most Penetrating Particle Size (MPPS). MPPS mostly is between 0.1 – 0.3 µm. Approaching 100% retention of particles > 0.5 µm.
HEPA classes H13/H14 require individual leakage testing by manufacturer. Filters installed for high risk food applications. Filters used for laboratory work, in safety cabinets and some mini environments for specific applications.
Document Name Micro-organismen, 26 Januari 2016 FIMM Symposium
European Hygienic Engineering & Design Group
Verdringen: Uni Directionele Flow UDF! (vaak nog LAF) Snelheid 0,35 – 0,55 m/s Veel lucht circ.voud >100/h Hoge mate van bescherming!
Verdunnen: Mengend / Turbulent nvt. Snelheid < 0,25 m/s Circ. Voud 10 – 40/h Redelijke mate van bescherming
Document Name Micro-organismen, 26 Januari 2016 FIMM Symposium
European Hygienic Engineering & Design Group
Mengend
Evt UDF
Document Name Micro-organismen, 26 Januari 2016 FIMM Symposium
European Hygienic Engineering & Design Group
1. Microbiële contaminatie? 2. Lucht ? 3. onderlinge Relatie en Beïnvloeding 4. Hoe houd je ze tegen 5. Hoe meet je microbiële contaminatie in lucht? 6. Welke niveaus hanteer je Document Name Micro-organismen, 26 Januari 2016 FIMM Symposium
European Hygienic Engineering & Design Group
Laser Deeltjesteller Range: 0,2 – 10 µm Debiet: 28 l/min Instantaan uitkomst Classificatie van een ruimte op basis van deeltjes in lucht volgens NEN-EN-ISO-14644-1 Meet alle objecten zonder onderscheid tussen dood of levend
Document Name Micro-organismen, 26 Januari 2016 FIMM Symposium
Oppervlakte reinheid / sedimentatie
Document Name Micro-organismen, 26 Januari 2016 FIMM Symposium
European Hygienic Engineering & Design Group
Document Name Micro-organismen, 26 Januari 2016 FIMM Symposium
European Hygienic Engineering & Design Group
Microbiologische AirSampler Range: 0,2 – 10 µm Debiet: 28 l/min Meten via Agar plaatjes Resultaat na incubatie Geen algemene Classificatie van een ruimte op basis van kiemen in lucht NEN-EN-ISO-14698-1/2 Meet organismen die overleven en groeien op voedigsbodem: selectief Document Name Micro-organismen, 26 Januari 2016 FIMM Symposium
European Hygienic Engineering & Design Group
Instantaneous Microbial Detector Laser induced Fluorescence Reflection Detection Metabolisme en Chemie: • Gereduceerde Nicotinamide-adeninedinucleotide (NADH) • Riboflavine (vitamin B2) • Dipicolinic Acid (DPA) Enorm voordeel: Instantane waarden Discussie: Valse positieven door fluorescentie van materialen
Document Name Micro-organismen, 26 Januari 2016 FIMM Symposium
European Hygienic Engineering & Design Group
Ref:
Document Name Micro-organismen, 26 Januari 2016 FIMM Symposium
European Hygienic Engineering & Design Group
1. Microbiële contaminatie? 2. Lucht ? 3. onderlinge Relatie en Beïnvloeding 4. Hoe houd je ze tegen 5. Hoe meet je microbiële contaminatie in lucht? 6. Welke niveaus hanteer je Document Name Micro-organismen, 26 Januari 2016 FIMM Symposium
European Hygienic Engineering & Design Group
Niveaus voor microniele contaminatie. Alleen redelijk concreet de GMP voor steriele geneesmiddelen:
Eudralex: Volume 4; Annex 1 Document Name Micro-organismen, 26 Januari 2016 FIMM Symposium
European Hygienic Engineering & Design Group
Niveaus voor microniele contaminatie. Work in progress: CEN draft on operating theatres:
Document Name Micro-organismen, 26 Januari 2016 FIMM Symposium
European Hygienic Engineering & Design Group
Richtlijnen die niets melden over niveaus: • EHEDG • Medical devices • ISO-14698 1 / 2
Huidige ontwikkeling CEN TC 243 WG5 microbiologie Deze probeert de inhoud van ISO 14698 te actualiseren.
Basis: risico / impact assesment Classificatie op basis van specifieke organismen tegen een achtergrond niveau van algemene organismen.
Document Name Micro-organismen, 26 Januari 2016 FIMM Symposium
European Hygienic Engineering & Design Group
1. Microbiële contaminatie? 2. Lucht ? 3. onderlinge Relatie en Beïnvloeding 4. Hoe houd je ze tegen 5. Hoe meet je microbiële contaminatie in lucht? 6. Welke niveaus hanteer je ……..? Document Name Micro-organismen, 26 Januari 2016 FIMM Symposium
European Hygienic Engineering & Design Group
Take home message: • Er gaat meer door de lucht dan je denkt • Lucht volgt meestal niet ‘de pijlen‘ • Het gaat nooit om lucht alleen • Microbiele contaminatie is een uitdaging: • Detectiemethoden • Grenswaarden / classificatie
Document Name Micro-organismen, 26 Januari 2016 FIMM Symposium
European Hygienic Engineering & Design Group
Referenties: Liungqvist, Reinmüller e.a., Practical Safety ventilation in Operating Rooms – An introduction. Report D2013:02 , CHALMERS UNIVERSITY OF TECHNOLOGY W. Whyte, M Green, WM Whyte, Removal efficiency of high efficiency filters against microbe-carrying particles (MCP’s) in cleanrooms (Clean Air and Containment review issue 14 April 2013) Gerry Prout, The nature and environmental impact of control of floorlevel contamination. European Journal of Parenteral Pharmaceutical Sciences 2009, 14(I): 13-18 John Holla, Clean rooms in the food sector. Definitions, design and air handling, Proceedings EHEDG World Congress on Hygienic Engineering & Design 2012 - Spain
Tim Sandle e. a., Assessing airborne contamination using a novel rapid detection method, European journal of parenteral and pharmaceutical sciences, 2014 Vol 19 (4)
Met dank aan: EHEDG Building Design Subgroup members (Draft Guidance Document) EHEDG Air Handling Subgroup members (Draft Guidance Document) ISO TC 209 WG 3 and 4 team experts CEN TC 156 WG 18 team experts Kropman Contamination Control design team
Document Name Micro-organismen, 26 Januari 2016 FIMM Symposium
European Hygienic Engineering & Design Group
Bedankt voor uw aandacht!
Document Name Micro-organismen, 26 Januari 2016 FIMM Symposium