METODOLOGI PENELITIAN Tempat dan Waktu Penelitian ini dilaksanakan selama 3 (tiga) bulan yaitu pada bulan Februari - April 2012. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Lingkungan BDP, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, IPB. Pengukuran kandungan Pb pada air dan organ ikan dilakukan di Laboratorium Pengujian Departemen Teknologi Industri Pertanian, IPB. Analisa kadar lemak daging dilakukan di Laboratorium Nutrisi Ikan Departemen Budidaya Perairan Fakultas Kelautan dan Perikanan, IPB. Pembuatan preparat histopathologi insang dan ginjal
dilakukan di Bagian
Patologi, Departemen Klinik, Reproduksi dan patologi, Fakultas Kedokteran Hewan, IPB. Ikan Uji Ikan uji yang digunakan adalah ikan nila (O. niloticus) yang berumur 2 bulan (panjang : ± 20 cm, berat : ± 195.33 gram) yang bersumber dari kolam budidaya Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, IPB. Pada tahap proses akumulasi, padat penebaran ikan uji sebanyak 28 ekor pada setiap akuarium yang berukuran 70 x 60 x 50 cm3 sebanyak 3 unit. Sedangkan pada akuarium pengamatan uji depurasi sebanyak 4 ekor pada setiap akuarium yang berukuran 50 x 40 x 30 cm3. Pakan yang diberikan untuk ikan adalah pakan ikan komersil berbentuk pelet terapung yang biasa digunakan oleh para pembudidaya ikan. Pemberian dilakukan sebanyak 3 kali sehari secara at satiation. Metode Penelitian Penelitian ini menggunakan satu percobaan yaitu percobaan salinitas pada rancanagan percobaan dengan pengamatan berulang (repated measurement). Rancangan ini mengacu pada Matjik dan Sumertajaya (2002). Rancangan perlakuan pada percobaan ini yaitu satu faktor. Rancangan lingkungannya yaitu rancangan acak lengkap (RAL) dalam waktu (completly randomized design in time). Faktor perlakuan yaitu kosentrasi salinitas dengan waktu pengamatan yaitu selang waktu 0 jam, 60 jam dan 120 jam. Waktu pengamatan dilakukan untuk
35
melihat tingkat pengurangan Pb selama selang waktu tersebut. Masing-masing perlakuan memiliki tiga ulangan. Formulasi rancangan percobaan yaitu : Faktor Perlakuan A. Ikan yang dipelihara pada salinitas 0 ppt B. Ikan yang dipelihara pada salinitas 5 ppt C. Ikan yang dipelihara pada salinitas 10 ppt D. Ikan yang dipelihara pada salinitas 15 ppt E. Ikan yang dipelihara pada salinitas 20 ppt Waktu Pengamatan A. Ikan yang di pelihara selama 0 jam B. Ikan yang di pelihara selama 60 jam C. Ikan yang di pelihara selama 120 jam Prosedur Penelitian Penelitian ini terdiri dari 2 tahap, yaitu bagian pertama berupa perlakuan akumulasi logam berat Pb dalam ikan dan bagian kedua berupa perlakuan depurasi logam berat Pb dalam tubuh ikan dengan menggunakan salinitas yang berbeda serta
pengaruhnya terhadap tingkat konsumsi oksigen, kadar lemak,
pertumbuhan, kelangsungan hidup dan histopathologi insang dan ginjal. Tahap 1 Perlakuan Akumulasi Logam Berat Pb Perlakuan akumulasi Pb bertujuan untuk menetukan kosentrasi Pb dalam tubuh ikan nila (O. niloticus) yang diperoleh langsung dari kolam budidaya ditempatkan dalam akuarium pemeliharaan yang telah berisi air 150 liter dan telah dilengkapi dengan sistem aerasi. Sebanyak 84 ekor ikan nila (O. niloticus) yang terlihat baik secara fisik dimasukan kedalam akuarium pemeliharaan sebanyak 3 unit masing-masing 28 ekor per akuarium yang berukuran 70 x 60 x 50 cm3 untuk diaklimatisasi terlebih dahulu dengan lingkungan laboratorium (dalam akuarium) selama 3 (tiga) hari. Selama proses aklimatisasi diamati ikan yang kualitas baik sebagai ikan uji. Aklimatisasi ini bertujuan untuk menadaptasikan ikan nila (O. niloticus) pada media percobaan yang dilakukan selama 3 (tiga) hari tanpa pemberian kontaminan logam berat Pb.
36
Setelah menjalani proses aklimatisasi, sebanyak 150 liter air pada media pemeliharaan, diberikan Pb(NO3)2 yang mengandung konsentrasi awal logam berat Pb didalam air sebesar 2.36 mg/l. Proses pemeliharaan dilakukan selama 28 hari dan selama pemeliharaan ikan nila diberi pakan secara at satiation dengan frekuensi pemberian 3 kali sehari. Selama percobaan berlangsung pergantian air juga dilakukan sebanyak 100% setiap 3 hari dan untuk menjaga konsentrasi bahan uji tetap tersedia untuk penyerapan maka pada saat dilakukan pergantian air lalu dilakukan pemberian Pb(No3)2 dengan konsentrasi yang sama pada awal percobaan. Untuk pengukuran logam berat Pb pada air dan daging ikan serta pengukuran peubah pertumbuhan, pengambilan sampel dilakukan sebelum aplikasi dan setiap minggu setelah aplikasi selama empat minggu. Begitu pula pada pengukuran kualitas air dilakukan setiap minggu untuk menilai kelayakan media pemeliharaan terhadap pertumbuhan dan kelangsungan hidup serta melihat kemungkinan pengaruh logam berat Pb. Parameter kualitas air meliputi suhu, pH, salinitas, oksigen terlarut dan alkalinitas. Tahap 2. Perlakuan Depurasi Logam Berat Pb pada Air Bersalinitas Ikan uji yang mengandung logam berat Pb pada proses akumulasi dimasukan kedalam wadah perlakuan. Sebagai perlakuan adalah menempatkan ikan yang telah terakumulasi logam berat pada media pemeliharaan air bersalinitas. Tingkat salinitas media pemeliharaan yaitu 0, 5, 10, 15 dan 20 ppt masing-masing diulang 3 kali. Sebanyak 4 ekor ikan nila (O. niloticus) yang terlihat baik secara fisik dari proses akumulasi dimasukan kedalam masingmasing akuarium yang berukuran 50 x 40 x 30 cm3 yang berisi 30 L air bersalinitas tanpa bahan uji (Clean water). Ikan diadaptasikan terlebih dahulu secara bertahap terhadap salinitas selama 10 jam. Langakah adaptasi yaitu pada jam pertama semua perlakuan salinitas kecuali kontrol diadaptasikan pada salinitas 5 ppt. Untuk perlakuan 10, 15 dan 20 ppt selanjutnya dinaikan sebesar 5 ppt setiap 2 jam secara bertahap berturut-turut seperti disajikan pada tabel lampiran 1. Untuk keperluan masing-masing perlakuan, setelah dilakukan adaptasi pada masing-masing wadah dilakukan pengambilan sampel pertama (jam ke-0), pengambilan sampel dan pengukuran parameter selanjutnya dilakukan pada jam 37
ke-60 dan jam ke-120. Untuk mendapatkan sampel daging guna pengukuran kandungan logam berat Pb, lemak dan histopathologi yaitu diambil 3 ekor setiap perlakuan dengan cara memotong bagian organ yang dibutuhkan (daging, insang dan ginjal) dan selanjutnya sampel dimasukan kedalam botol sampel untuk dianalisis. Pada percobaan ini dilakukan pengukuran tingkat konsumsi oksigen pada kondisi metabolisme aktif. Pada setiap kali pengambilan sampel dilakukan juga penimbangan bobot tubuh setiap ikan. Selama percobaan berlangsung ikan diberi pakan berupa pelet yang diberikan dua kali per hari sebanyak 3 persen dari bobot ikan (Yunus et al. 1990). Jumlah pakan yang diberikan disesuaikan setiap hari yang didasarkan atas data penimbangan biomasa ikan. Sisa pakan dan kotoran dibersikan dari tempat percobaan dengan cara menyipon setiap saat sebelum pemebrian pakan. Parameter Pengamatan Tingkat Konsumsi Oksigen (TKO) Tingkat konsumsi oksigen diukur pada awal penelitian dengan menghitung rasio oksigen terlarut pada awal dan akhir pengamatan. Tingkat konsumsi oksigen dilakukan pada kondisi ikan setelah diberi makan (metabolisme aktif) dengan menggunakan sistem tertutup (air diam). Pengukuran konsumsi oksigen dilakukan dengan cara menempatkan ikan masing-masing 2 ekor ke dalam akuarium (volume 30 liter air) dan bobot ikan sebelumnya ditimbang terlebih dahulu. Sebelum ikan ditempatkan ke dalam wadah percobaan, air terlebih dahulu diaerasi dengan kuat (bubling) sehingga kandungan oksigennya bertambah dan mencapai titik jenuh oksigen, kemudian dilakukan pengukuran oksigen terlarut sebagai DO awal. Ikan ditimbang kemudian dimasukan kedalam media respirasi dan ditutup selama 1 jam untuk dihitung DO akhir, maka akan didapatkan tingkat konsumsi oksigen dengan menggunakan rumus : TKO =
Vx DOto DOtt WxT
38
dengan :
TKO = tingkat konsumsi oksigen (mg O2/g/jam) V
= volume air dalam wadah (L)
DOto = konsentrasi oksigen terlarut pada awal pengamatan (mg/L) DOtt = konsentrasi oksigen terlarut pada waktu t (mg/L) W = bobot ikan uji (g) T = periode pengamatan (jam) Kandungan Logam Berat Pb di Air dan di Daging Ikan Analisa Pb dilakukan dengan menggunakan spektrofotometrik serapan atom (Atomic Asdorbent Spectrofotometric, AAS) yaitu prosedur spectroanalytical untuk penentuan kualitatif dari unsur-unsur kimia menggunakan penyerapan radiasi optic (cahaya) oleh atom bebas dalam bentuk gas. Prinsip analisanya menggunakan prinsip berdasarkan Hukum Lambert-Beert yaitu banyaknya sinar yang diserap berbanding lurus dengan kadar zat. Persamaan garis antara konsentrasi logam berat dengan absorbansi adalah persamaan linier dengan koefisien arah positif yaitu Y = a + bX. Dengan memasukkan nilai absorbansi larutan contoh ke persamaan garis larutan standar maka kadar logam berat contoh dapat diketahui. Larutan contoh yang mengandung ion logam dilewatkan melalui nyala udara-asetilen bersuhu 2000 0C sehingga terjadi penguapan dan sebagian tereduksi menjadi atom. Lampu katoda yang sangat kuat mengeluarkan energi pada panjang gelombang tertentu dan akan diserap oleh atom-atom logam berat yang sedang di analisis. Jumlah energi cahaya yang diserap atom logam berat pada panjang gelombang tertentu ini sebanding dengan jumlah zat yang diuapkan pada saat dilewatkan melalui nyala api udara-asetilen. Setiap unsur logam berat membutuhkan lampu katoda yang berbeda. Keseluruhan prosedur ini sangat sensitif dan selektif karena setiap unsur membutuhkan panjang gelombang yang sangat pasti (Tinsley 1979). Kadar Lemak Ikan Lemak tubuh ikan ditentukan dengan menggunakan metode ekstrasi lemak (Sudarmadji et al. 1984). Sampel seberat 2 gram (W1) dimasukkan ke dalam kertas saring dan dimasukkan ke dalam selongsong lemak, kemudian dimasukkan ke dalam labu lemak yang sudah ditimbang berat tetapnya (W2) dan 39
disambungkan dengan tabung soxhlet. Selongsong lemak dimasukkan ke dalam ruang ekstraktor tabung soxhlet dan disiram dengan pelarut lemak. Tabung ekstraksi dipasang pada alat destilasi soxhlet lalu dipanaskan pada suhu 40 °C dengan menggunakan pemanas listrik selama 6 jam. Pelarut lemak yang ada dalam labu lemak didestilasi hingga semua pelarut lemak menguap. Pada saat destilasi pelarut akan tertampung di ruang ekstraktor, pelarut dikeluarkan sehingga tidak kembali ke labu lemak, selanjutnya labu lemak dikeringkan dalam oven pada suhu 105 °C, setelah itu labu didinginkan dalam desikator sampai beratnya konstan (W3) (OAC-I 1999). Kadar lemak ditentukan dengan rumus :
% Kadar lemak = W3 −W2 W1 × 100%
Keterangan : W1 = Berat sampel (gram) W2 = Berat labu lemak tanpa lemak (gram) W3 = Berat labu lemak dengan lemak (gram) Kelangsungan Hidup Kelangsungan hidup dihitung dengan mengamati jumlah ikan nila yang dipelihara pada awal pengamatan dan jumlah ikan nila yang dipelihara pada akhir pengamatan. Penghitungan kelangsungan hidup pada ikan menggunakan rumus Effendie (1979) :
SR
Nt 100% No
Keterangan : SR = Survival Rate (%) Nt = Jumlah ikan pada akhir pengamatan (ekor) N0 = Jumlah ikan pada awal pengamatan (ekor) Laju Pertumbuhan Laju pertumbuhan menggunakan data yang diperoleh dengan mengambil ikan nila pada awal dan akhir percobaan dan ditimbang bobotnya. Laju pertumbuhan dihitung dengan menggunakan rumus Zooneveld et al. (1991) : Wt 1 100% Wo
t
40
Keterangan : Wt = Bobot rata-rata ikan pada hari ke-t (gram) Wo = Bobot rata-rata ikan pada hari ke-0 (gram)
t
= Waktu (hari)
α = Laju pertumbuhan spesifik (% berat badan/hari) Uji Histopathologi Pengamatan histopathologi dilakukan pengamatan dengan menggunakan metode mikroteknik, yaitu dengan cara membuat preparat histopathologi. Preparat histopathologi yang dibuat adalah insang dan ginjal ikan. Prosedur dalam pembuatan preparat histologist adalah Ikan dibedah dan diambil bagian insang dan ginjalnya, Kemudian diawetkan dengan formalin 4% selama 24 jam dan difiksasi dengan alcohol 70% selama 24 jam. Setelah itu dimasukan ke dalam alcohol 80%, 95%, absolute i dan ii, larutan alcohol : xylol (1:1), xylol:paraffin (1:1), paraffin I dan II 1 jam. Kemudian sampel ditanam dalam cetakan dan dibiarkan mengeras membentuk blok yang kemudian ditempel pada blok kayu (holder), lalu sampel dipotong dengan microtome dengan ketebalan 6-10 mikron. Potongan ditempel
pada gelas objek yang sebelumnya telah diolesi dengan
glycerin albumin. Sampel dikeringkan pada incubator 40oC selama 24 jam lalu diwarnai dengan HE. Proses pewarnaan dengan menggunakan hemotoxylin dan eosin dengan langakah sebagai berikut : deparafinasi dengan xylol I dan II masing-masing 2 menit, lalu dimasukan ke dalam alcohol absolut, 96% dan 90% masing-masing selama 2 menit. Kemudian dimasukan ke daalam alkohol 80% dan 70% masingmasing 20 detik. Dicuci dengan air mengalir lebih kurang 2 menit dan dimasukan ke dalam haemotoxylin selama 4 menit lalu dicuci lagi dengan air mengalir sampai jernih. Dimasukkan ke dalam eosin selama 1,5 menit dan dicuci kembali dengan air mengalir sampai jernih. Direndam dengan alcohol 70%, 89%, 90%, absolute, Xylol i dan ii masing-masing 2 menit. Setelah sampel siap, ditutup dengan cover glass yang sudah ditetes dengan elemen neu dan dikeringkan dalam oven pada suhu 40oC selama 24 jam, kemudian diamati di bawah mikroskop.
41
Pengukuran Kualitas Air Pengukuran kualitas air terdiri salinitas, suhu, pH, DO dan alkalinitas. Pengukuran salinitas dilakukan setia hari dan pengaturan salinitas untuk mencapai nilai salinitas perlakuan dilakukan setiap 8 jam. Pengukuran suhu, pH, DO dan alkalinitas dilakukan setiap hari pada waktu pagi dan sore selama penelitian. Pengukuran ini bertujuan untuk mengetahui kualitas air sebelum dan sesudah menggunakan salinitas serta mengetahui kualitas air selama proses budidaya ikan nila. Analisis Data Data pengukuran konsentrasi logam berat Pb di air dan ikan, tingkat konsumsi oksigen, pertumbuhan bobot tubuh, kadar lemak dan kelangsungan hidup dianalisis dengan sidik ragam (ANOVA). Histopathologi insang dan ginjal dianalisis secara deskriptif. Hasil yang disajikan merupakan nilai rata-rata (±) dan standar deviasi (SD). Selanjutnya jika hasil pengujian keragaman dari parameterparameter tersebut menunjukan perbedaan yang nyata, pengujian akan dilanjutkan dengan uji tukey (BNJ) untuk menguji perbedaan terkecil dari nilai tengah antara perlakuan. Dari data hasil penelitian ini akan dilihat pula pola hubungan antara salinitas dengan setiap parameter uji.
42
