III.
METODOLOGI PENELITIAN
3.1. BAHAN DAN ALAT Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah susu kambing peranakan Etawah (susu kambing PE) yang diperoleh dari peternakan kambing di Ciapus Bogor, susu kambing Saanen yang diperoleh dari peternakan kambing di Condet Jakarta, susu skim bermerk “Sunlac”, kultur starter bakteri asam laktat (Lactobacillus bulgaricus dan Streptococcus thermophillus) diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi ITP, gula pasir, jahe, adas manis, cengkeh, kayu manis dan kapulaga. Media yang digunakan antara lain MRSB (deMann Rogosa Sharpe Broth), MRSA (deMann Rogosa Sharpe Agar), dan PCA (Plate Count Agar). Serta bahan-bahan untuk analisis kimia, mikrobiologi, dan sensori. Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah timbangan, kompor gas, panci, termometer, sendok pengaduk, cup plastik, bunsen, inkubator, laminar, otoklaf, mikropipet, refrigerator, pHmeter, viskometer, refraktometer Abbe, cawan, oven, alat-alat gelas, serta alat-alat lain untuk analisis sifat fisik, kimia, mikrobiologi dan sensori.
3.2. METODE PENELITIAN Penelitian yang dilakukan meliputi pembiakan dan pemeliharaan kultur, formulasi pembuatan yoghurt campuran susu kambing peranakan Etawah dan susu kambing Saanen, formulasi pembuatan yoghurt dari susu kambing peranakan Etawah serta penentuan formula terbaik berdasarkan uji hedonik dan analisa obyektif meliputi beberapa parameter, diantaranya pH, total padatan terlarut, total asam tertitrasi, dan viskositas. Selanjutya dilakukan diversifikasi rasa produk yoghurt susu kambing dengan menambahkan sirup berbahan dasar rempah-rempah, sebagai topping. Penambahan rasa pada yoghurt berupa sirup jahe dan sirup campuran dari adas manis, cengkeh, kayu manis, dan kapulaga. Penentuan formulasi diversifikasi rasa terbaik dilakukan melalui uji organoleptik dan analisa obyektif meliputi beberapa parameter diantaranya pH, total padatan terlarut, total asam tertitrasi, dan viskositas.
3.2.1. Pembiakan Kultur Kultur murni bakteri asam laktat disegarkan terlebih dahulu pada media MRSB dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Kemudian, sebanyak 2% dari kultur yang disegarkan tersebut diinokulasikan ke dalam larutan susu skim steril 10%. Setelah itu, kultur tersebut diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. Kultur hasil inkubasi ini disebut dengan kultur induk. Sebanyak 2% dari kultur induk diinokulasikan ke dalam larutan susu skim 10% dan glukosa murni 2% selanjutnya diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam dan hasilnya disebut dengan kultur kerja. Setelah itu, kultur kerja dipupukkan pada media MRSA untuk mengetahui populasinya. Kultur yang memenuhi syarat untuk siap dijadikan kultur starter yogurt adalah kultur dengan jumlah populasi yang lebih dari atau sama dengan 108 cfu/ml.
3.2.2. Pemeliharaan Kultur Kultur stok diambil menggunakan jarum ose dan dibuat tusukan pada media de Man Rogosa Sharpe Agar (MRSA) chalk semi solid. Media ini kemudian diinkubasi selama 1 hari pada suhu 43-45oC. Menumbuhkan kembali kultur dilakukan dengan cara satu loop kultur diinokulasikan pada media MRSB lalu diinkubasi pada suhu 43-45oC selama 1 hari. Kultur stok kemudian dapat disimpan di dalam refrigerator.
13
3.2.3. Penelitian Pendahuluan : Formulasi dan Pembuatan Yoghurt Campuran Susu Kambing Peranakan Etawah dan Susu Kambing Saanen Penelitian pendahuluan meliputi formulasi dan pembuatan yoghurt dari campuran susu kambing peranakan Etawah (PE) dan susu kambing Saanen serta analisa obyektif meliputi beberapa parameter, diantaranya pH, total padatan terlarut, total asam tertitrasi, dan viskositas. Pembuatan yoghurt susu kambing dilakukan dengan formula sampel campuran susu kambing peranakan Etawah dan susu kambing Saanen dengan perbandingan 1:5 serta perbandingan kultur Streptococcus thermophilus (ST) : Lactobacillus bulgaricus (LB) 1:1 dengan waktu inkubasi 24 jam, yang selanjutnya disebut dengan sampel ESa15. Perbandingan campuran susu kambing peranakan Etawah dengan susu kambing Saanen 1:5 diperoleh dari penelitian Rozali (2010). Tahapan pembuatan yoghurt campuran susu kambing dapat dilihat pada Gambar 8.
Susu Kambing Saanen
Susu Kambing PE
Pencampuran hingga homogen Pemanasan pada suhu 80oC selama 15 menit Pendinginan hingga suhu 450C Inokulasi bakteri 2% Inkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam Penyimpanan dalam refrigerator Yoghurt campuran susu kambing Gambar 8. Proses pembuatan yoghurt campuran susu kambing
3.2.4. Penelitian Lanjutan : Formulasi dan Pembuatan Yoghurt Susu Kambing Peranakan Etawah Pembuatan yoghurt susu kambing dilakukan dengan enam formula sampel yang meliputi tiga formula dengan susu kambing murni (K) dan tiga formula dengan penambahan susu skim sebanyak 15% (KS). Penambahan susu skim bertujuan untuk memberikan tekstur set yoghurt yang lebih baik. Selanjutnya dilakukan penentuan perbandingan kultur Streptococcus thermophilus (ST) : Lactobacillus bulgaricus (LB) dengan tiga perbandingan yaitu 1:1, 2:3, dan 3:2. Penentuan perbandingan kultur bertujuan untuk menentukan jumlah bakteri yang tepat dalam pembuatan yoghurt susu kambing. Formula yoghurt susu kambing dapat dilihat pada Tabel 6.
14
Tabel 6. Formula yosghurt susu kambing Kode Formula K11 K23 K32
Perlakuan Susu kambing PE Susu kambing PE Susu kambing PE Susu kambing PE + susu skim 15% Susu kambing PE + susu skim 15% Susu kambing PE + susu skim 15%
KS11 KS23 KS32
Perbandingan Bakteri (ST:LB) 1:1 2:3 3:2 1:1 2:3 3:2
Sebelum menentukan formula terbaik dilakukan penentuan waktu inkubasi yang sesuai untuk keenam formula sampel. Penentuan waktu inkubasi dilakukan dengan pengamatan setiap 4 jam selama 24 jam. Pengamatan yang dilakukan meliputi pengukuran total padatan terlarut, viskositas, total asam tertitrasi, pH, dan struktur set yoghurt yang baik. Proses penentuan formulasi terbaik dari yoghurt susu kambing ditentukan berdasarkan uji hedonik, uji peringkat kesukaan, dan pengukuran objektif meliputi pH, total asam tertitrasi, total padatan terlarut, dan viskositas. Tahapan-tahapan pembuatan yoghurt susu kambing dapat dilihat pada Gambar 9.
Susu kambing PE
Susu kambing PE
Susu skim 15%
Pencampuran
Pemanasan pada suhu 800C selama 15 menit Pendinginan hingga suhu 450C Inokulasi bakteri 2% Inkubasi pada suhu 370C selama 24 jam Penyimpanan dalam refrigerator Yoghurt susu kambing Gambar 9. Proses pembuatan yoghurt susu kambing
15
3.2.5. Diversifikasi Citarasa Yoghurt Penambahan citarasa pada yoghurt susu kambing adalah sirup yang akan dibuat dengan berbahan dasar rempah–rempahan. Rempah–rempah dipilih karena senyawa aromatik rempah diduga mampu menutupi bau prengus (goaty) susu kambing. Selain itu, penggunaan sirup rempah ini juga untuk memberikan variasi rasa karena umumnya yoghurt memiliki rasa buah-buahan. Sirup yang akan dibuat terdiri atas tiga jenis. Sirup I adalah sirup yang dibuat dengan bahan dasar jahe dan gula pasir. Sirup II adalah sirup yang dibuat dengan bahan dasar campuran antara cengkeh, kapulaga, dan kayu manis serta gula pasir. Sirup III adalah sirup yang dibuat dengan bahan dasar campuran antara cengkeh, kapulaga, dan adas manis serta gula pasir. Formulasi penggunaan rempah-rempah mengacu pada penelitian Rozali (2010) dan dilakukan modifikasi dalam pembuatan sirup (Tabel 7). Penambahan rasa tiga jenis sirup ini diaplikasikan untuk formula yoghurt terbaik sebagai topping. Selanjutnya, penentuan formula terbaik dilakukan dengan uji hedonik dan uji peringkat hedonik, serta analisa sifat fisikokimia dan mikrobiologi.
Tabel 7. Formula sirup rempah-rempah Formula Sirup Jahe Sirup CKK Sirup CKA
Jahe 250 -
Jumlah Rempah-rempah (g/1 liter air) Cengkeh Kapulaga Kayu Manis 75 75 50 60 90 -
Adas Manis 50
3.2.6. Pengukuran Stabilitas Yoghurt Selama Penyimpanan Pengukuran stabilitas yoghurt dilakukan untuk mengamati kestabilan yoghurt selama penyimpanan dengan parameter yang diamati yaitu pH, total asam tertitrasi, dan total padatan terlarut serta viabilitas bakteri asam laktat. Pengamatan dilakukan untuk penyimpanan selama 15 hari (hari ke-0 sampai hari ke-15) pada suhu 10oC. Yoghurt yang baik menurut CODEX (2003) memiliki viabilitas bakteri asam laktat minimal 107 cfu/g.
3.3. ANALISIS KARAKTERISTIK MUTU YOGHURT Analisis yang dilakukan meliputi analisis fisik (derajat keasaman dengan pH-meter, viskositas dengan viskometer Brookfield, total padatan terlarut dengan refraktometer), analisis kimia (total asam tertitrasi, kadar air, kadar abu, kadar lemak, kadar protein, dan kadar karbohidrat) dan analisis mikrobiologi.
3.3.1. Analisis Fisik a. Derajat Keasaman Yoghurt (Apriyantono et al., 1989) Pengukuran derajat keasaman (pH) dilakukan dengan pH meter. Untuk sampel yang berbentuk larutan atau tidak terlalu pekat maka penetapan pH dapat langsung dilakukan, jika terlalu pekat maka harus diencerkan terlebih dahulu. Perlu diperhatikan faktor pengencer, harus sama untuk setiap sampel sama. Sedangkan untuk sampel kering dilakukan dengan metode ekstraksi. Sebelumnya alat dikalibrasi menggunakan dua larutan buffer yang mewakili pH rendah (4,00) dan pH tinggi (7,00). Sebanyak 25 ml sampel ditempatkan di gelas piala 100 ml. Kemudian elektroda pH meter dicelupkan di dalam sampel, dan nilai pH dapat dibaca pada layar pH meter. Pengukuran nilai pH dilakukan duplo untuk masing-masing formula yoghurt.
16
b. Viskositas Yoghurt (Faridah et al., 2009) Set yoghurt merupakan fluida karena dapat bergerak dari satu titik ke titik lain. Pengukuran viskositas fluida menggunakan alat viscometer Brookfield. Pengukuran fluida dengan kekentalan yang belum diketahui dianjurkan dengan mencoba menggunakan spindle bernomor besar hingga kecil dengan kecepatan putar dari rendah ke tinggi. Batas atas viskositas tiap spindle pada berbagai kecepatan dapat dilihat pada Tabel 8. Hal ini karena terdapat batas atas viskositas (cP) yang dapat terukur oleh tiap spindle pada bagian kecepatan putar, yaitu : Tabel 8. Batas atas viskositas (cp) tiap spindle pada berbagai kecepatan Spindle No. 1 No. 2 No. 3 No. 4
60 100 500 2000 10000
30 200 1000 4000 20000
Rpm 12 500 2500 10000 50000
6 1000 5000 20000 100000
Contoh sebanyak 200 ml dimasukkan ke dalam gelas piala 250 ml. Spindle dicelupkan ke dalam contoh dan atur ketinggian viskometer hingga tanda garis tercelup. Pengukuran dilakukan dengan menekan tombol ON dan biarkan spindle berputar selama 20-30 detik, dan angka yang ditunjukkan oleh jarum dibaca secara tepat. Viskositas dihitung dengan persamaan (1):
Viskositas (cP) = skala yang terbaca x faktor konversi
(1)
Tabel 9. Faktor konversi penetapan viskositas Spindle No. 1 No. 2 No. 3 No. 4
Rpm 60 1 5 20 100
30 2 10 40 200
12 5 25 100 500
6 10 50 200 1000
c. Total Padatan Terlarut Pengukuran total padatan terlarut (TPT) dilakukan dengan menggunakan Refractometer Abbe. Sebelum dilakukan pengukuran sampel, alat dibersihkan terlebih dahulu dengan alkohol dan dikeringkan dengan tissue. Sampel yang akan diukur kemudian diletakkan secukupnya pada tempat pembacaan, kemudian nilai TPT ditunjukkan oleh angka yang didapat pada batas persilangan garis diagonal yang terlihat pada alat.
3.3.2. Analisis Kimia a. Total Asam Tertitrasi (AOAC, 1995) Pengukuran total asam tertitrasi merupakan penentuan konsentrasi total asam. Pada susu segar total asam tertitrasi dihitung sebagai persen asam laktat. Pengukuran asam tertitrasi menggunakan prinsip asam basa. Sebanyak 10 ml sampel dimasukkan ke dalam erlenmeyer, kemudian ditambahkan 3 tetes indikator phenolphtalein 1%. Sampel dititrasi dengan larutan NaOH 0.1 N yang telah terstandardisasi sampai terbentuk warna merah muda yang merupakan titik akhir titrasi. Volume titran yang digunakan, normalitas basa standar, volume atau berat contoh digunakan untuk menghitung total asam tertitrasi. Perhitungan total asam tertitrasi dapat dihitung dengan persamaan (2):
17
Total Asam Laktat % =
V NaOH x N NaOH x 90 x 100 2 V sampel x 1000
b. Kadar Air Yoghurt dengan Metode Oven Vakum (Apriyantono, 1989 di dalam Fathir, 2010) Cawan kosong dan tutupnya dikeringkan dalam oven dengan suhu 105oC selama 30 menit, lalu didinginkan dalam desikator. Cawan kering diambil dengan penjepit dan ditimbang berat contoh yang telah dihomogenkan sebanyak 5 gram contoh dalam cawan. Cawan beserta isinya dan tutup cawan diletakkan dalam oven vakum. Dipanaskan pada suhu 70oC dengan vakum dipertahankan sekitar 25 mmHg. Pengeringan dilakukan selama 6 jam. Selama pengeringan berjalan biarkan udara mengalir melalui botol pengeringan gas yang berisi H2SO4 dengan kecepatan rendah (sekitar 2 gelembung per detik), lalu tutup aliran vakum ke pompa. Pompa jangan ditutup dulu sebelum tekanan vakum dalam gelas pengaman dihilangkan untuk mencegah agar oli tidak terhisap ke dalam gelas. Aliran udara kering yang melewati H2SO4 dinaikkan untuk menghilangkan tekanan vakum dalam oven. Cawan ditutup, dinginkan dalam desikator selama 15 menit dan ditimbang. Pemanasan kembali dilakukan sampai diperoleh berat yang tetap. Kadar air yoghurt dapat ditentukan dari persamaan (3)
Kadar air yoghurt %= Keterangan : W1 W2
W2 W1
x 100
(3)
= berat sampel (gram) = kehilangan berat (gram)
c. Kadar Abu Yoghurt dengan Metode Pengabuan Kering (AOAC, 1999) Pengukuran kadar abu ditentukan dengan menggunakan alat tanur. Cawan porselen dipanaskan terlebih dahulu dalam tanur, kemudian didinginkan dalam desikator dan ditimbang. Contoh sebanyak 3-5 gram di dalam cawan porselen dibakar sampai tidak berasap dan diabukan dalam tanur bersuhu 600oC sampai berwarna putih (semua sampel telah menjadi abu) dan berat konstan. Kemudian didinginkan dalam desikator dan ditimbang. Perhitungan kadar abu produk dapat dilihat pada persamaan (4):
Kadar abu % bb = Keterangan : % bb W W1 W2
W1 – W2 x 100% W
(4)
= kadar abu per bahan basah (%) = bobot bahan awal sebelum diabukan (g) = bobot contoh+cawan kosong setelah diabukan (g) = bobot cawan kosong (g)
18
d. Kadar Lemak Yoghurt dengan Metode Soxhlet (AOAC, 1999) Metode yang digunakan di dalam analisis lemak adalah metode ekstrasi soxhlet. Pertama, labu lemak yang akan digunakan dikeringkan di dalam oven, kemudian didinginkan dalam desikator dan ditimbang beratnya. Contoh sebanyak 5 gram dalam bentuk tepung dibungkus dengan kertas saring kemudian kertas saring yang berisi contoh tersebut dimasukkan ke dalam alat ekstrasi soxhlet. Alat kondensor diletakkan di atasnya dan labu lemak diletakkan di bawahnya. Pelarut heksana dimasukkan ke dalam alat ekstrasi soxhlet sampai contoh terendam. Selanjutnya dilakukan refluks selama minimal 6 jam sampai pelarut yang turun kembali ke dalam labu lemak berwarna jernih. Pelarut yang ada di dalam labu lemak didestilasi dan pelarut ditampung kembali. Kemudian labu lemak yang berisi lemak hasil ekstrasi dipanaskan di dalam oven pada suhu 150oC hingga mencapai berat konstan, kemudian didinginkan di dalam desikator. Selanjutnya labu beserta lemak di dalamnya ditimbang dan berat lemak dapat diketahui. Perhitungan kadar lemak dapat dilihat pada persamaan (5).
Kadar lemak % bb= Keterangan : % bb W W1 W2
W1 – W2 x 100% W
(5)
= kadar lemak per bahan basah (%) = bobot contoh (g) = bobot labu lemak + lemak hasil ekstraksi (g) = bobot labu lemak kosong (g)
e. Kadar Protein Yoghurt dengan Metode Kjehdal (AOAC, 1999) Contoh ditimbang sejumlah 0,2 gram dimasukkan ke dalam labu Kjeldahl, lalu ditambahkan 1,9 + 0,1 gram K2SO4, 40 + 10 mg HgO, dan 2,0 + 0,1 ml H2SO4. Kemudian contoh didestruksi sampai cairan menjadi jernih (sekitar 1 jam). Larutan jernih ini kemudian dipindahkan ke dalam alat destilasi. Labu Kjeldahl dicuci dengan akuades (1-2 ml) kemudian air cucian dimasukkan ke dalam alat destilasi ditambahkan 8-10 ml larutan NaOH-Na2S2O3. Dibawah kondensor diletakkan erlenmeyer yang berisi 5 ml larutan H3BO3 dan 2-4 tetes indikator (campuran 2 bagian metil merah 0,2% dalam alkohol dan 1 bagian metil biru 0,2% dalam alkohol). Ujung tabung kondensor harus terendam di dalam larutan H3BO3. Kemudian isi erlenmeyer diencerkan sampai 50 ml lalu titrasi dengan HCl 0,02 N sampai terjadi perubahan warna menjadi abu-abu. Prosedur yang sama dilakukan juga terhadap blanko. Hitung %N dan kadar protein contoh dengan persamaan (6.1) dan (6.2):
%N =
ml HCl-ml HCl blankox N HCl x 14.007 x 100% mg sampel Kadar protein (%bb) = %N x faktor konversi (6.38)
Keterangan : % bb %N
(6.1)
(6.2)
= kadar protein per bahan basah (%) = kandungan nitrogen pada contoh (%)
19
f. Kadar Karbohidrat Yoghurt (by difference) Kadar karbohidrat basis basah dihitung dengan menggunakan persamaan (7):
Kadar karbohidrat (% bb) = 100% - (P + A+ KA + L)
Keterangan : % bb P A KA L
(7)
= kadar karbohidrat per bahan basah (%) = kadar protein (%) = kadar abu (%) = kadar air (%) = kadar lemak (%)
3.3.3. Analisis Mikrobiologi a. Total Bakteri Asam Laktat (Fardiaz, 1987) Uji viabilitas bakteri asam laktat dilakukan dengan metode agar tuang. Sebanyak 1 ml sampel diencerkan dalam 9 ml larutan fisiologis (NaCl 0,85%) hingga pengenceran 10-9. Pemupukan dilakukan secara duplo dari tingkat pengenceran 10-8 sampai 10-10 dengan cara memipet 1 ml atau 0.1 ml sampel yang telah diencerkan ke dalam cawan petri steril, kemudian ditambahkan 15-20 ml MRSA cair steril. Cawan petri digoyangkan secara mendatar supaya sampel tersebar merata. Setelah agar membeku, diinkubasi dengan posisi terbalik pada suhu 37oC selama 2 – 3 hari. Jumlah koloni yang tumbuh dihitung dengan menggunakan metode SPC dan dinyatakan dalam satuan CFU/ml atau log CFU/ml.
3.3.4. Uji Organoleptik Uji organoleptik yang digunakan adalah uji kesukaan (hedonik) dan uji peringkat hedonik. Uji hedonik dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui tingkat kesukaan panelis terhadap formula yoghurt susu kambing. Skala yang digunakan adalah skala 1 (sangat tidak disukai) sampai 7 (sangat disukai). Atribut yang diuji adalah rasa, aroma, dan tekstur untuk sampel yoghurt plain. Kemudian uji hedonik juga digunakan untuk mengetahui tingkat kesukaan yoghurt susu kambing dengan topping sirup berbasis rempah-rempah. Atribut yang diuji adalah rasa, aroma, warna, dan tingkat kemanisan. Uji peringkat hedonik dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui urutan sampel yang paling disukai oleh panelis. Atribut yang digunakan adalah penilaian keseluruhan (overall) dengan menggunakan skala 1 (paling disukai) sampai 4 (paling tidak disukai). Uji peringkat hedonik dilakukan untuk sampel yoghurt plain dan yoghurt susu kambing dengan topping sirup berbasis rempah-rempah. Pengujian dilakukan oleh 30 panelis tidak terlatih. Panelis menilai produk secara subyektif dan spontan tanpa membandingkan antar sampel.
20
