25
METODOLOGI PENELITIAN Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilakukan di Bagian Ilmu dan Teknologi Benih, IPB dan Laboratorium Mikroba Simbiotik Tanaman, Pusat Penelitian Bioteknologi - LIPI, Cibinong. Penelitian dimulai bulan Pebruari sampai Oktober 2011.
Bahan dan Alat Penelitian Bahan Penelitian Bakteri Rhizobium Bakteri Rhizobium
sp. yang digunakan dalam penelitian ini merupakan
biakan koleksi kultur mikroba Pusat Penelitian Bioteknologi - LIPI
yang
diisolasi dari bintil akar tanaman kedelai dengan kode BTCC B 64. Biakan Rhizobium sp. yang memiliki karakter tumbuh lambat. Bakteri ini mampu hidup pada kondisi pH rendah dengan kisaran 3.5 – 4. Benih Kedelai Benih kedelai yang digunakan dalam penelitian ini adalah kedelai var. Anjasmoro, (Deskripsi terlampir pada Lampiran 8) merupakan Benih Bina Bersertifikat (benih dasar) produksi Balai Benih, Dinas Pertanian Jawa Timur Malang. Benih kedelai yang digunakan dipanen pada bulan Juli 2010. Umur benih kedelai pada saat digunakan yaitu 8 bulan. Benih memiliki kadar air 9.6% dan daya tumbuh 81.8%. Benih kedelai diberi perlakuan insersi pada bulan Maret 2011. Kadar air sebelum diinsersi 9.024% dan sesudah diinsersi
kadar air benih mencapai
9.275%. Hasil panen dari benih kedelai plus memiliki kadar air 8.10% sedangkan benih kontrol 7.99%. Bahan penelitian yang digunakan selengkapnya dapat dilihat pada Lampiran 3 sampai dengan Lampiran 5.
26
Alat Penelitian
Prototipe alat vakum insersi benih kedelai dapat dilihat pada Lampiran 7, selain itu juga alat pengecambah benih, oven, timbangan analitik dan alat penelitian penunjang lainnya. Metode Penelitian Penelitian ini terbagi menjadi 2 percobaan, yaitu : Percobaan 1. Pembuktian keberadaan dan viabilitas bakteri Rhizobium sp. yang telah diinsersi ke dalam benih kedelai serta mutu benih kedelai selama penyimpanan. Percobaan 2. Pengaruh insersi bakteri Rhizobium sp. dan periode simpan terhadap daya hasil dan mutu fisiologi benih kedelai. Benih yang telah diinsersi bakteri Rhizobium sp. dan benih tanpa
insersi
bakteri Rhizobium sp. (kontrol) kemudian digunakan untuk percobaan 1 dan 2.
Rancangan Percobaan Percobaan I: Pembuktian keberadaan dan viabilitas bakteri Rhizobium sp. yang telah diinsersi ke dalam benih kedelai serta mutu benihnya selama penyimpanan Rancangan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Rancangan Petak Terbagi (Split Plot Design) yang diacak secara lengkap. Faktor pertama adalah periode simpan sebagai petak utama dan faktor kedua adalah insersi bakteri Rhizobium sp. sebagai anak petak. Faktor pertama terdiri dari 5 taraf, yaitu: 1. S0 = 0 bulan
4. S3 = 3 bulan
2. S1 = 1 bulan
5. S4 = 4 bulan
3. S2 = 2 bulan
Faktor kedua terdiri dari 2 taraf, yaitu: 1. P1 = Tanpa insersi bakteri Rhizobium sp. (kontrol) 2. P2 = Insersi bakteri Rhizobium sp.
27
Percobaan ini terdiri dari 10 kombinasi perlakuan dengan 3 ulangan Model statistik rancangan percobaan yang digunakan adalah : Yijk = µ + Si + ηij + Pj + (SP)ij + εijk Keterangan:
Yijk
=
Nilai pengamatan pada perlakuan periode simpan ke-i (0, 1, 2, 3, 4) perlakuan insersi bakteri Rhizobium sp. ke-j (1, 2) dan ulangan ke-k
µ
=
Nilai rataan umum
Si
=
Pengaruh perlakuan periode simpan ke-i
ηij
=
Galat a (pengaruh perlakuan periode simpan)
Pj
=
Pengaruh perlakuan insersi bakteri Rhizobium sp. ke-j
(SP)ij
=
Pengaruh interaksi perlakuan periode simpan ke-i dan insersi bakteri Rhizobium sp. ke-j
εijk
=
Galat b (pengaruh interaksi perlakuan periode simpan dan insersi bakteri Rhizobium sp.
Data yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan uji-F pada taraf 5%. Apabila didapatkan tolok ukur yang dipengaruhi secara nyata oleh perlakuan, maka dilakukan uji lanjut dengan uji Duncan Multiple Range Test (DMRT) pada taraf 5%. Analisis data ini dilakukan dengan bantuan program Statistical Analysis System (SAS) 9.
Percobaan II: Pengaruh insersi bakteri Rhizobium sp. dan periode simpan terhadap daya hasil dan mutu fisiologi benih kedelai. Rancangan percobaan yang digunakan dalam percobaan kedua adalah Rancangan Petak Terbagi (Split Plot Design) yang diacak secara lengkap seperti yang telah dipaparkan sebelumnya pada percobaan pertama. Data yang diperoleh dari percobaan kedua yang dilakukan di lapangan dianalisis dengan menggunakan uji-F pada taraf 5%. Apabila didapatkan tolok ukur yang dipengaruhi secara nyata oleh perlakuan, maka dilakukan uji lanjut dengan uji Duncan Multiple Range Test (DMRT) pada taraf 5%. Analisis data ini dilakukan dengan bantuan program Statistical Analysis System (SAS) 9.
28
Pelaksanaan Penelitian Percobaan I: Pembuktian keberadaan dan viabilitas bakteri Rhizobium sp. yang telah diinsersi ke dalam benih kedelai serta mutu benihnya selama penyimpanan. Preparasi media dan larutan Media agar manitol ekstrak ragi (YEMA) menurut Vincent (1970) Media YEMA (Lampiran 3) digunakan untuk menumbuhkan, memelihara dan regenerasi biakan bakteri Rhizobium sp., serta dapat pula digunakan sebagai media selektif untuk membedakan isolat bakteri yang didapat dengan bakteri yang lain.
Regenerasi biakan bakteri Rhizobium sp. Bakteri Rhizobium sp. BTCC B 64 yang akan digunakan dalam penelitian ini diregenerasi terlebih dahulu. Biakan bakteri diambil secara aseptik dengan menggunakan jarum ose dalam ruang steril (laminar air flow). Biakan digoreskan secara zig-zag pada permukaan agar miring YEMA steril dan dibuat ulangan 3 kali. Biakan kemudian disimpan dalam lemari penyimpanan (inkubator) pada suhu 28 – 30 0C selama 7 hari. Biakan selanjutnya ditumbuhkan pada media YEM broth (Lampiran 3) untuk digunakan sebagai starter dalam penelitian ini.
Insersi bakteri Rhizobium sp. pada benih kedelai Benih kedelai sebanyak 1 kg dicampur dengan 10 ml suspensi bakteri Rhizobium sp. dengan populasi sel sekitar 109 sel/ml. Benih dimasukkan ke dalam alat vakum dengan tekanan 300 mBar selama 4-5 menit. Alat vakum selanjutnya dibuka secara mendadak sehingga memberikan tekanan untuk mendorong bakteri Rhizobium sp. masuk ke dalam benih. Alat vakum yang digunakan adalah mixer vacuum device yang dirancang untuk membuat benih kedelai lebih baik dari sebelumnya, melalui proses pencampuran dan pemvakuman dengan suspensi bakteri Rhizobium sp. Kapasitas alat vakum ini mampu menampung ± 50 kg benih dengan putaran 30-40 rpm. Diharapkan dari metode ini udara yang ada di sekitar pori-pori benih akan terisap
29
dan suspensi bakteri Rhizobium sp. dapat menembus lapisan kulit benih dengan bantuan tekanan udara pada alat vakum (Subagio, 1999). Alat vakum baru dapat dibuka apabila proses insersi bakteri Rhizobium sp. pada benih kedelai telah selesai dilakukan. Benih yang berada di dalam alat vakum dikeluarkan dan ditempatkan pada bak plastik penampungan.
Benih
selanjutnya dikering anginkan dengan menggunakan kipas angin selama ± 6 jam. Diharapkan kadar air benih sama seperti kadar air awal sebelum benih diinsersi. Kadar air awal sebelum diinsersi = 9.024% dan kadar air sesudah insersi = 9.275%. Benih kedelai plus dan benih kontrol kedelai untuk setiap satuan percobaan disimpan sebanyak ± 3000 butir yaitu untuk uji viabilitas benih di laboratorium (5 taraf periode simpan x 2 taraf insersi x 3 ulangan x 5 tolok ukur) dan uji lapangan 800 butir (5 taraf periode simpan x 2 taraf insersi x 4 ulangan x 10 tanaman x 2 benih yang ditanam/polibag), kemudian dikemas ke dalam plastik polyethylene dan ditutup rapat. Benih selanjutnya disimpan dalam ruang penyimpanan pada suhu kamar antara 24-31oC dan kelembaban nisbi udara sekitar 80-90% selama periode simpan 0, 1, 2, 3 dan 4 bulan.
Pembuatan preparat irisan benih kedelai dengan metode parafin Pembuatan preparat bertujuan untuk mengetahui apakah bakteri Rhizobium sp. yang diinsersi telah masuk ke dalam jaringan benih kedelai. Hasil dari irisan tersebut akan menunjukkan sampai sejauh mana bakteri Rhizobium sp. masuk ke dalam jaringan internal benih. Irisan benih kedelai juga dapat membandingkan antara preparat sampel benih kedelai yang diinsersi bakteri Rhizobium sp. dengan benih tanpa diinsersi bakteri Rhizobium sp. Pembuatan preparat irisan dengan metode parafin adalah sebagai berikut (Rijadi, 2008): 1.
Benih difiksasi dengan cara benih dimasukkan ke dalam larutan alkohol 70% kemudian udara disekitar benih dibuat vakum. Fiksasi benih dilakukan selama 24 jam.
30
2.
Benih didehidrasi dengan alkohol secara bertahap mulai dari alkohol 70%, 80%, 90% dan alkohol absolut masing-masing dilakukan secara bertahap selama 3 jam.
3.
Benih dimasukkan ke dalam larutan alkohol dan xylene dengan perbandingan tertentu secara bertahap, mulai dari alkohol abs: xylene (3:1), alkohol abs: xylene (1:1), alkohol abs: xylene (1:3), dan xylene abs masingmasing dilakukan secara bertahap selama 3 jam.
4.
Benih kemudian dimasukkan ke dalam larutan xylene dan parafin cair dengan perbandingan tertentu secara bertahap mulai dari xylene: parafin (3:1), xylene: parafin (1:1), xylene: parafin (1:3), dan xylene murni.
5.
Benih selanjutnya dicetak dalam kotak-kotak kertas, setelah parafin dan benih mengeras dipasang di holder mikrotom.
6.
Pengirisan sampel dilakukan dengan menggunakan mikrotom dengan ketebalan ± 10 mikron.
7.
Pita-pita parafin ± 5 cm diletakkan pada objek glass dan diolesi larutan haupt adhesive, dipanaskan diatas hot plate pada suhu 400 C. Perlakuan ini dilakukan sampai sampel menempel dan kering selama ± 3 hari.
8.
Pewarnaan preparat dilakukan secara bertahap: xylene (1), xylene (2), xylene:Alk abs(3:1), xylene :Alk abs(1:1), xylene :Alk abs(1:3), Alk absolut (1), Alk 95%, Alk 80%, Alk 70%, Alk 60%, Alk 50%, Alk 40%, Alk 30%, Alk 20%, Alk 10%, Aquades (1), Safranin1%, Aquades (2), Aquades (3), Fast green 0.5%, Aquades (4), Aquades (5), Alk 10%, Alk 20%, Alk 30%, Alk 40%, Alk 50%, Alk 60%, Alk 70%, Alk 80%, Alk 95%, Alk abs(2), Alk abs(3), Alk abs : xylene (3:1), Alk abs : xylene (1:1), Alk abs : xylene (1:3), xylene (3), xylene (4).
9.
Preparat ditetesi entellan secukupnya sebagai perekat kemudian ditutup dengan cover glass.
10.
Preparat siap untuk diamati dibawah mikroskop.
Pembuatan preparat dengan SEM
a. Preparasi larutan untuk Scanning Electrone Microscope 1. Larutan Caccodylate
31
a. Larutan stok: 0.2 M sodium caccodylate 42.6 gr ditambahkan aquades hingga volume menjadi 1000 ml pada pH 8.4 b. Larutan Caccodylate (siap pakai): 50 ml larutan stok ditambahkan pada
0.1 M HCl sebanyak 5.4 ml, kemudian
dibuat hingga volumenya menjadi 200 ml pada pH 8.4. 2. Glutaraldehyde
2.5 %
terdiri dari 5
ml
glutaraldehyde
ditambahkan caccodylate buffer hingga volume mencapai 40 ml. b. Preparasi spesimen (benih) dilakukan pada suhu 40C. a. Pembersihan sampel dilakukan dengan cara merendam sampel benih kedelai dalam larutan buffer caccodylate selama kurang lebih 2 jam, kemudian diagitasi dalam ultrasonic cleaner selama 5 detik. b. Prefiksasi dilakukan dengan memasukkan sampel ke dalam larutan glutaraldehyde 2.5% beberapa jam selama 2 hari. c. Fiksasi sampel selanjutnya dilakukan dimana sampel direndam dalam larutan tannic acid 2% selama 6 jam kemudian dicuci dengan larutan buffer caccodylate 5 detik diulangi sebanyak 4 kali. d. Perlakuan dehidrasi dilakukan dengan merendam dalam alkohol 50% selama 5 detik dan diulangi sebanyak 4 kali; kemudian alkohol 70% selama 20 detik; alkohol 85% selama 20 detik; alkohol 95% selama 20 detik dan akhirnya alkohol absolut selama 10 detik diulang sebanyak 2 kali. f. Sampel kemudian dimasukkan ke dalam auto fine coater, untuk selanjutnya sampel dilihat dengan menggunakan mikroskop SEM dengan perbesaran objek hingga 100.000 kali. Percobaan II: Pengaruh insersi bakteri Rhizobium sp. dan periode simpan terhadap daya hasil dan mutu fisiologi benih kedelai. Pelaksanaan di Lapangan a.
Persiapan media tanam Media tanam yang digunakan adalah campuran tanah yang diambil dari
Cibinong dan pasir Cimangkok dengan perbandingan 1 : 1. Tanah top soil yang digunakan sebagai gambaran tanah yang miskin hara sehingga pada penelitian ini
32
dilakukan pemupukan. Hal ini dilakukan agar pengaruh bakteri Rhizobium sp. lebih terlihat peranannya dalam meningkatkan penambatan unsur hara N baik dari tanah maupun udara. Media tanam yang akan digunakan dilakukan analisis terlebih dahulu terhadap kandungan unsur N. Media tanam yang akan digunakan diayak dengan ayakan berukuran 5 mm kemudian dimasukkan ke dalam plastik dengan kapasitas 3 kg. Media tanam selanjutnya di kukus dalam dandang, pada saat air telah mendidih, pemanasan dilanjutkan hingga 2 jam. Media tanam kemudian dimasukkan ke dalam polibag dengan kapasitas 3 kg. Sebelum dan sesudah percobaan media tanam dianalisis kadar nitrogennya. b.
Penanaman Media tanam yang digunakan terlebih dahulu disiram dengan air sampai
mencapai kapasitas lapang dan diletakkan di tempat percobaan. Lubang tanam dibuat dengan kedalam ± 3-5 cm. Benih yang telah disiapkan (benih plus dan benih kontrol) ditanam sebanyak 2 benih ke dalam lubang tanam dan ditutup dengan media tanam. Penjarangan dilakukan 1 minggu setelah tanam dengan mempertahankan satu tanaman yang pertumbuhannya paling baik dan sisanya dipotong bagian batang di atas permukaan media. Setiap perlakuan diulang sebanyak empat kali, tiap satuan percobaan ulangan terdapat sepuluh polibag, Setiap periode penyimpanan dilakukan penanaman dimulai dari 0 bulan sampai 4 bulan. Lapangan yang digunakan dengan ukuran 12 x 2 m. Lapangan tersebut dibatasi dengan plastik putih transparan agar terhindar dari gangguan hewan di sekitar lokasi seperti kambing dan sebagainya sehingga dapat merusak tanaman. Percobaan dilakukan di kebun percobaan Pusat Penelitian Bioteknologi Cibinong. c.
Pemeliharaan Pemeliharaan yang dilakukan meliputi penyiraman setiap hari pada pagi dan
sore hari. d.
Pemupukkan Pemupukkan diberikan 0.0625 g NPK (15:15:15)/ polibag dilakukan pada
14 HST dan 45 HST. e.
Pemanenan Pemanenan dilakukan setelah buah kedelai masak fisiologi, menurut kriteria
masak panen kedelai yang ditandai dengan batang, daun, dan buah sudah menjadi
33
kuning; pangkal buah dan pangkal pelepahnya masih hijau; polong kedelai yang sudah terasa keras, bernas dan berwarna kecoklatan. Hasil panen selanjutnya diolah, dijemur dibawah sinar matahari untuk selanjutnya ditimbang untuk daya hasil dan dianalisis mutu fisiologinya.
Pengamatan Penelitian
Percobaan I. Pembuktian keberadaan dan viabilitas bakteri Rhizobium sp. yang telah diinsersi ke dalam benih kedelai serta mutu benihnya selama penyimpanan. Pengamatan keberadaan bakteri Rhizobium sp Pengamatan keberadaan bakteri Rhizobium sp. pada preparat awetan irisan benih dengan metode parafin dilakukan dibawah mikroskop untuk memastikan adanya bakteri dalam jaringan benih selama disimpan.
Pengamatan viabilitas bakteri dalam benih Viabilitas bakteri Rhizobium sp. dalam benih kedelai selama penyimpanan dilakukan dengan menggunakan metode “drop plate” menurut Miles dan Misra (Somasegaran dan Hoben, 1985).
Benih sebanyak 1 gram ditimbang dan
selanjutnya dipotong-potong dengan menggunakan pinset dan pisau. Benih dimasukkan ke dalam 9 ml aquades steril, setelah itu diambil 1 ml suspensi, dimasukkan ke 9 ml aquades steril berikutnya. Perlakuan ini terus dilakukan hingga pada pengenceran ke 10
-10
. Masing-masing pengenceran tersebut diambil
50µl dan ditanam pada media YEMA yang telah diberi pewarnaan merah kongo . Koloni bakteri yang tumbuh dan tidak menyerap warna merah kongo pada media selektif adalah bakteri Rhizobium sp.
Jumlah koloni yang tumbuh kemudian
dihitung dan dimasukkan kedalam rumus:
Jumlah koloni yang tumbuh x faktor pengencerannya x volume suspensi = sel/ml
34
Pengamatan viabilitas benih Pengamatan viabilitas benih dilakukan terhadap benih yang telah diinsersi maupun benih yang tidak diinsersi (kontrol) sehingga mutu benih tetap dapat diketahui baik sebelum dan sesudah dilakukan percobaan. Pengamatan viabilitas benih dilakukan terhadap kadar air benih (%), viabilitas total dengan tolok ukur potensi tumbuh maksimum (%), viabilitas potensial dengan tolok ukur berkecambah (%),
daya
uji vigor benih dengan tolok ukur indeks vigor (%) dan
kecepatan tumbuh (%/etmal). Pengujian viabilitas benih dilakukan dengan menanam benih pada media kertas merang. Benih kedelai yang telah diinsersi dan benih kontrol dikecambahkan pada media kertas merang dan metode penanaman benih menggunakan metode uji kertas digulung didirikan dalam plastik (UKDdp). Setiap satuan percobaan pada uji viabilitas benih ditanam 25 butir benih dibuat tiga ulangan. Perkecambahan dilakukan dengan menggunakan alat pengecambah benih (APB) tipe IPB 72-1. Pengamatan di laboratorium dilakukan dengan menganalisis mutu fisiologi benih dengan tolok ukur:
1. Kadar air (KA) Menentukan kadar air benih digunakan rumus sebagai berikut: M2-M3 Kadar air (%) = x 100 % M2-M1 Keterangan: M1 = Berat cawan + tutup M2 = Berat cawan + tutup + benih sebelum dioven M3 = Berat cawan + tutup + benih sesudah dioven 2.
Potensi tumbuh maksimum (PTM) Potensi tumbuh maksimum benih dihitung setelah didapatkan data kecambah normal dan kecambah abnormal diakhir pengujian. Menentukan potensi tumbuh maksimum digunakan rumus sebagai berikut: Jumlah kecambah normal dan abnormal PTM (%) =
x 100% Jumlah benih yang di tanam
35
3.
Daya berkecambah (DB) Pengamatan persentase kecambah normal untuk kedelai pada hari ke-3 (first count) dan hari ke-5 (final count), Menentukan daya berkecambah benih digunakan rumus sebagai berikut:
Jumlah kecambah normal pada hit. ke 1 dan hit. ke 2 DB (%) =
x 100% Jumlah benih yang ditanam
4. Kecepatan tumbuh (KCT) Kecepatan tumbuh (KCT) diukur dengan jumlah tambahan kecambah setiap hari/etmal selama perkecambahan (% per hari atau % per etmal). Menentukan kecepatan tumbuh digunakan rumus sebagai berikut (Sadjad, 1993):
t.5 KCT = ∑ d t.0
Keterangan : KCT = Kecepatan tumbuh t = Kurun waktu perkecambahan d =Tambahan persentase kecambah normal setiap waktu pengamatan.
5.
Indeks vigor (IV) Indeks vigor ditentukan berdasarkan jumlah kecambah normal pada hitungan pertama yaitu hari ke-3. Menentukan indeks vigor digunakan rumus sebagai berikut: Jumlah k ecambah normal pada hit. ke 1 IV (%) =
Jumlah benih yang ditanam
X 100%
36
Percobaan II.
Pengaruh insersi bakteri Rhizobium sp. dan periode simpan terhadap daya hasil dan mutu fisiologi benih kedelai.
Pengamatan pada percobaan 2 dilakukan pada pertumbuhan tanaman kedelai di lapangan meliputi: Fase vegetatif (6 MST) Tinggi tanaman (cm), jumlah daun, jumlah bintil akar, bobot basah bintil akar (g) dan bobot kering bintil akar(g) Fase generatif (12 MST) Tinggi tanaman (cm), panjang akar (cm), bobot kering tanaman bagian atas (g), bobot kering bagian bawah (g), jumlah polong dan bobot kering polong(g), bobot kering benih (g). Hasil benih kedelai: bobot kering benih/tanaman (g) diuji mutu benihnya Konfirmasi infeksi bakteri Rhizobium sp. pada bintil perakaran tanaman kedelai dan untuk mengetahui efektifitas isolat bakteri Rhizobium sp. dengan melihat jumlah bintil akar pada perakaran. Pengujian mutu benih yang dihasilkan seperti pada percobaan I.
Alir penelitian yang dilakukan dalam percobaan I dan percobaan II ditunjukkan pada Gambar 3.
37
Bakteri Rhizobium sp. Teknologi insersi
Benih kedelai var. Anjasmoro Percobaan I Pembuktian keberadaan dan viabilitas bakteri Rhizobium sp. yang telah diinsersi ke dalam benih kedelai serta mutu benih selama 4 bulan
Percobaan II Pengaruh insersi bakteri Rhizobium sp. dan periode simpan terhadap daya hasil dan mutu fisiologi benih kedelai.
Uji mutu benih
Pengamatan setiap periode penyimpanan: Keberadaan bakteri dalam benih Viabilitas bakteri Rhizobium sp. (populasi sel/ml dalam benih) Mutu fisiologi benih kedelai: \ -Kadar air -Viabilitas total : potensi tumbuh maksimum -Viabilitas potensial : daya berkecambah -Vigor: indeks vigor, kecepatan tumbuh
Pertumbuhan tanaman kedelai di lapang Fase vegetatif (6 MST) Tinggi tanaman, jumlah daun, jumlah bintil akar, bobot basah dan kering bintil akar Fase generatif (12 MST) Tinggi tanaman, panjang akar, bobot kering tanaman bagian atas dan bawah, jumlah polong Hasil benih kedelai: bobot basah benih/tanaman (g) Mutu fisiologi benih kedelai yang dihasilkan: - Kadar air - Viabilitas total: potensi tumbuh maksimum - Viabilitas potensial : daya berkecambah - Vigor: indeks vigor, kecepatan tumbuh
Gambar 3. Bagan alir penelitian
