III.
METODOLOGI PENELITIAN
A. BAHAN DAN ALAT Bahan-bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini yaitu kedelai impor yang diperoleh dari KOPTI (Koperasi Produsen Tahu Tempe Indonesia) dan koagulan GDL (Glucono Delta Lactone) food grade. Bahan-bahan yang digunakan untuk analisis antara lain n-heksana PA, coomassie brilliant blue G-250 (CBBG), etanol 95%, asam fosforat 85%, dan bovine serum albumin (BSA), K2SO4, HgO, H2SO4 pekat, Na2S2O3.5H2O, H3BO3, HCl, akuades, indikator MR-MB, akrilamid, N,N‟-metilen bisakrilamid, amonium persulfat (APS), sodium dodecyl sulfate (SDS), tetrametil-etilendiamin (TEMED), glisin, gliserol, bromphenol blue, coomassie brilliant blue R-250, methanol, asam asetat glasial, akua-biodestilat, standar low molecular weight protein (LMW). 2-mercaptoethanol, dan Tris(hydroxymethyl)aminomethane. Alat-alat yang digunakan untuk pembuatan curd antara lain blender, heater, termometer, panci, kain saring, pencetak curd. Alat-alat yang digunakan untuk analisis adalah alat soxhlet, alat Kjeldahl, sentrifuge, perangkat alat elektroforesis, tabung Eppendorf, mikropipet, gelas piala, timbangan analitik, pH meter, labu takar, gelas ukur, hot plate, sudip, sarung tangan, spektrofotometer, tabung reaksi, kuvet, pipet, vortex, alat gelas untuk analisis sensori dan perangkat analisis tekstur (TA-XT2i).
B. METODE PENELITIAN Secara umum, penelitian ini terdiri dari dua tahapan. Tahap pertama merupakan tahap persiapan berupa penguasaan teknik pembuatan curd dan penetapan proses standar pembuatan curd. Tahap kedua merupakan tahapan penelitian utama. Pada tahap ini dilakukan analisis terhadap bahan baku kacang kedelai serta produk hasil berupa curd dan whey.
1.
Penelitian Pendahuluan Penelitian pendahuluan meliputi tahap penguasaan teknik pembuatan curd dengan mengadopsi metode pembuatan tahu di pabrik tahu lokal (“Diazara Tresna” di daerah Darmaga Bogor). Metode pembuatan curd tersebut telah dilakukan oleh Fahmi (2010), dimana telah diperoleh jumlah total penambahan air terbaik yaitu dengan perbandingan 1:15 berdasar berat kedelai, tekanan penekan curd sebesar 4.71 g/cm2 dan waktu penekanan selama 30 menit untuk menghasilkan curd yang baik. Pada penentuan proses untuk penelitian utama dilakukan trial and error terhadap suhu awal koagulasi, waktu koagulasi dan konsentrasi GDL yang diterapkan pada skala laboratorium.
2. Penelitian Utama Pada tahap ini dilakukan analisis terhadap bahan baku tepung kedelai, curd yang diperoleh melalui standar proses pembuatan curd pada tahapan pertama, serta whey hasil sampingan produk curd. Analisis yang dilakukan meliputi analisis tekstur curd secara subyektif dan obyektif, analisis kadar protein dengan metode Kjeldahl, analisis kadar air, analisis pH whey, pelarutan protein, analisis kadar protein Bradford, dan analisis SDS-PAGE. Skema penelitian pada tahap analisis ini dapat dilihat pada Gambar 19.
22
Kacang kedelai
Susu kedelai
GDL 0.4%, 0.8% dan 1.2%
Tepung kedelai
Penghilangan Lemak
Koagulasi (20 menit) pada suhu awal 63 °C dan 83 °C
Pengukuran Kadar Protein Kjedahl
Whey Curd
Pelarutan total protein
Analisis Kadar air
filtrat
Elektroforesis SDS-PAGE
Analisis Obyektif Analisis Tekstur pH dan protein Bradford
Subyektif
Gambar 19. Skema penelitian utama
23
Analisis Protein Bradford
GEL
Analisis GEL
Dilakukan analisis terhadap sampel tepung kacang kedelai yang telah dihilangkan lemaknya. Analisis tersebut meliputi pengukuran kadar protein metode Kjedahl, pelarutan protein tepung kedelai metode Mujoo et al. (2003) yang dimodifikasi, analisis Bradford ekstrak tepung kedelai, elektroforesis SDS-PAGE dan analisis GEL elektroforesis. Sebelum proses koagulasi, kacang kedelai diekstrak menjadi susu kedelai dengan mengadopsi pembuatan susu kedelai Fahmi (2010). Skema pembuatan curd dapat dilihat pada Gambar 20. Kedelai *
Koagulan (GDL)
Dicuci dan direndam air (1:3) selama ±6 jam
Ditambahkan air (1:6)
Digiling
Ditambahkan air (1:4)
Bubur Kedelai
Ditimbang sesuai konsentrasi yang telah ditentukan (40 gram)
Dilarutkan dalam 100 ml aquades
Larutan stok GDL
(b) Dididihkan selama 10 menit sambil diaduk
Susu Kedelai **
Ampas Dibilas air mendidih (1:5)
Disaring
Dipanaskan (63 °C dan 83 °C)
Koagulan GDL ***
Dikoagulasi Susu Kedelai Didiamkan selama 20 menit
(a) Dicetak dan dipress dengan tekanan 4.71 g/cm2 selama 30 menit
*kacang kedelai 500g **susu kedelai @1200 ml *** GDL : 0.4%, 0.8% dan 1.2% dari vol. susu kedelai (larutan stok GDL 40%)
Whey
Curd
(c)
Gambar 20. Skema pembuatan curd meliputi: (a) persiapan susu, (b) persiapan koagulan dan (c) tahap pembentukan curd (Modifikasi metode Fahmi 2010) Pada proses koagulasi, susu kedelai dikoagulasi dengan menggunakan tiga konsentrasi GDL (0.4%, 0.8% dan 1.2%) dan dua suhu awal koagulasi (63 °C dan 83 °C). Kemudian dilakukan beberapa analisis terhadap curd yang dihasilkan meliputi, analisis kadar air, analisis tekstur obyektif dan subyektif. Sebelum analisis profil protein curd, pertama-tama curd dihilangkan kandungan lemaknya dengan cara merendam curd dalam heksan PA dengan perbandingan curd : heksan (1: 4) selama ± 6 jam, heksan dibuang melalui proses sentrifugasi pada kecepatan 12500 rpm selama 5 menit dan sisa heksan diuapkan disuhu ruang selama ± 2 jam. Curd yang telah bebas lemak dianalisis kadar proteinnya menggunakan metode Kjedahl dan pelarutan protein curd menggunakan metode Mujoo et al. (2003) yang dimodifikasi. Hasil pelarutan dianalisis kadar proteinnya menggunakan
24
metode Bradford dan dipisahkan secara elektroforesis SDS-PAGE. Gel elektroforesis dianalisis untuk mengetahui berat molekul (BM) pita protein, densitas pita protein dan identifikasi pita protein. Whey yang dihasilkan dari proses pembuatan curd dianalisis pH dan kadar proteinnya menggunakan metode Bradford.
C. PROSEDUR ANALISIS 1. Analisis Kadar Air Metode Oven (SNI 1992 yang Dimodifikasi) Sejumlah sampel curd (3-5g) dimasukkan ke dalam cawan yang telah diketahui beratnya. Kemudian cawan dimasukkan ke dalam oven bersuhu 105 oC hingga diperoleh berat yang konstan. Perhitungan kadar air dilakukan berdasarkan berat basah dengan menggunakan rumus : Kadar air (%bb) Dimana : a = berat cawan dan sampel awal (g) b = berat cawan dan sampel akhir (g) c = berat sampel awal (g)
2.
Analisis Kadar Protein Metode Kjeldahl (AOAC 1995 yang dimodifikasi) Sejumlah sampel curd (100-250 mg) ditimbang ke dalam labu Kjeldahl. Kemudian ditambahkan 1.0 ± 0.1 g K2SO4 , 40 ± 10 mg HgO dan 2 ± 0.1 ml H2SO4. Sampel dididihkan selama 1-1.5 jam dengan kenaikan suhu secara bertahap sampai cairan menjadi jernih, lalu didinginkan. Sejumlah kecil akuades diteteskan secara perlahan lewat dinding labu kemudian labu digoyang pelan agar kristal yang terbentuk larut kembali. Isi labu kemudian dipindahkan ke dalam alat destilasi dan labu dibilas 5-6 kali dengan 1-2 ml akuades. Selanjutnya ditambahkan 810 ml larutan 60% NaOH-5% Na2S2O3 ke dalam alat destilasi. Erlenmeyer yang berisi 5 ml H3BO3 dan 2 tetes indikator metilen red-metilen blue (MRMB) diletakkan di bawah kondensor dengan kondisi ujung kondensor terendam di bawah larutan H3BO3. Destilasi dilakukan hingga diperoleh destilat sebanyak ± 15 ml. Destilat yang diperoleh selanjutnya diencerkan hingga ± 50 ml dan dititrasi dengan HCl terstandar sampai terjadi perubahan warna menjadi abu-abu. Perhitungan kadar protein dilakukan dengan rumus : (ml HCl-ml blanko) %N x N HCl x 14.007 x 100 mg sampel g Kadar protein bahan basah % N x Faktor Konversi 100 g
3. Pelarutan Total Protein (Mujoo et al. 2003 yang dimodifikasi) Proses ini merupakan modifikasi dari metode Mujoo et al. (2003) pada beberapa bagian (Lampiran 2b.). Proses pelarutan protein yang telah dimodofikasi menggunakan larutan M (buffer tris pH 8.4 yang mengandung 0.02 M 2-mercaptoethanol). Sampel yang digunakan adalah tepung kedelai dan curd berbagai perlakuan yang telah dihilangkan lemaknya terlebih dahulu (halaman 24). Sebanyak 20 mg sampel curd dan tepung kedelai yang telah bebas lemak dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 2 ml yang kemudian diekstraksi/dilarutkan sebanyak 3 tahapan. Pembuatan larutan M dapat dilihat pada Lampiran 2. Skema pelarutan protein dapat dilihat pada Gambar 21.
25
20 mg curd bebas lemak
Ditambah 0.5 ml pelarut M
Divorteks selama 1 menit Diinkubasi pada penangas air suhu 80 °C selama 1 jam ( vorteks tiap 10 menit selama 1 menit)
Disentrifuse (20 menit, 25 °C, 15000 rpm)
Endapan
Ditambah 0.5 ml pelarut M
Diinkubasi pada penangas air suhu 80 °C selama 1 jam ( vorteks tiap 20 menit selama 1 menit)
Disentrifuse (20 menit, 25 °C, 15000 rpm)
Filtrat Dimasukkan ke tabung eppendorf
Endapan
Ditambah 0.5 ml pelarut M
Diinkubasi pada penangas air suhu 80 oC selama 40 menit ( vorteks tiap 20 menit selama 1 menit)
Disentrifuse (20 menit, 25 oC, 15000 rpm)
Endapan
Gambar 21. Skema pelarutan protein metode Mujoo et al. (2003) yang dimodifikasi
26
4.
Analisis pH (Moizuddin et al. 1999) Tingkat keasaman whey hasil koagulasi dan pengepresan curd diukur dengan menggunakan pH meter pada suhu ruang
5.
Analisis Kadar Protein Metode Bradford (Bradford 1976) a.
Preparasi pereaksi Bradford Sebanyak 100 mg pewarna CBB G-250 dilarutkan ke dalam 50 ml etanol 95%. Selanjutnya ditambahkan 100 ml asam fosforat 85% dan ditepatkan hingga 1 liter dengan menggunakan akuades. Larutan kemudian disaring menggunakan kertas Whatman No.1 dan disimpan dalam botol gelap.
b.
Pembentukan kurva standar Sebanyak 100 ul larutan BSA (100-1000 µg/ml) dipipet ke dalam tabung reaksi berukuran 1.2 x 10 cm. Kemudian ditambahkan 5 ml pereaksi Bradford. Larutan kemudian divorteks dan diukur secara spektrofotometri pada λ 595 nm setelah 5 menit. Untuk blanko, sebanyak 100 µl akuades ditambahkan 5 ml perekasi Bradford dan diukur dengan cara yang sama. Kurva standar yang diperoleh digunakan untuk mengukur konsentrasi sampel.
c.
Pengukuran sampel Prinsip pengukuran kadar protein menggunakan metode Bradford adalah pengikatan pewarna CBBG yang terdapat dalam peraksi Bradford dengan protein yang mengandung residu asam amino dengan rantai samping aromatik (Tirosin, Triptofan dan Fenilalanin) atau bersifat basa (Arginin, Histidin dan Leusin) membentuk kompleks berwarna biru yang dapat diukur absorbansinya. Sampel yang digunakan adalah whey hasil koagulasi dan hasil pelarutan protein. Sebanyak 100 µl sampel dipipet ke dalam tabung reaksi berukuran 1.2 x 10 cm. Kemudian ditambahkan 5 ml pereaksi Bradford. Larutan kemudian divorteks dan didiamkan selama 5 menit, kemudian diukur absrobansinya menggunakan spektrofotometer SIMADZU UV-2450 (UV Vis Spectrofotometer) pada λ 595 nm.
6.
Analisis SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Laemmli 1970) Analisis SDS-PAGE dilakukan menggunakan gel akrilamid dengan konsentrasi separating gel 12% dan stacking gel 5%. Sampel yang dielektroforesis adalah supernatan hasil pelarutan protein dengan metode Mujoo et al. (2003) yang dimodifikasi dari sampel kacang kedelai giling dan curd kedelai. Tahapan yang harus dilakukan dalam melakukan SDS-PAGE adalah a) pembuatan separating gel; b) pembuatan stacking gel; c) preparasi dan injeksi sampel; d) running SDS-PAGE; e) pewarnaan gel; f) destaining gel; dan g) penentuan berat molekul protein-protein yang terpisahkan. Pembuatan larutan stok dan larutan kerja untuk analisis SDSPAGE dapat dilihat pada Lampiran 1. a)
Pembuatan separating gel Dua lempengan kaca (mini slab) yang akan digunakan sebagai cetakan gel dirangkai sesuai dengan petunjuk pemakaian. Sebanyak 4 ml larutan A dipipet ke dalam gelas piala, kemudian ditambahkan 2.5 ml larutan B dan 3.5 ml akua-biodestilat. Campuran kemudian diaduk perlahan dengan menggoyangkan gelas piala. Selanjutnya, sebanyak 50 µl APS 10% dan 5 µl TEMED ditambahkan ke dalam campuran dan diaduk kembali dengan
27
b)
perlahan. Campuran dimasukkan ke dalam lempengan kaca (mini slab) tanpa menimbulkan gelembung udara dengan menggunakan mikropipet sampai sekitar 1 cm dari atas lempengan. Bagian yang tidak diisi gel diberi akuades untuk meratakan gel yang terbentuk. Gel kemudian dibiarkan mengalami polimerisasi selama 30-60 menit. Pembuatan stacking gel
c)
Air dibuang dari atas separating gel dan dikeringkan dengan menggunakan tissue. Akua-biodestilat, larutan A, dan larutan C masing-maasing sebanyak, 0.67 ml, dan 1.0 ml dicampurkan ke dalam gelas piala dan diaduk perlahan dengan cara menggoyangkan gelas piala. Selanjutnya, sebanyak 30 µl APS 10% dan 5 µl TEMED ditambahkan ke dalam campuran dan diaduk kembali dengan perlahan. Campuran dimasukkan ke dalam mini slab, kemudian sisir dimasukkan dengan cepat tanpa menimbulkan gelembung udara. Stacking gel dibiarkan mengalami polimerisasi selama 30-60 menit. Setelah gel berpolimerisasi, sisir diangkat dari atas gel dengan perlahan dan slab ditempatkan ke dalam wadah elektroforesis. Buffer elektroforesis dimasukkan ke dalam wadah elektroforesis di bagian dalam dan luar agar gel terendam. Preparasi dan injeksi sampel
d)
Sebanyak 40 µl sampel dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf dan ditambahkan 10 µl buffer sampel. Tabung kemudian dipanaskan selama 5 menit dalam air mendidih 100 ˚C. Sampel kemudian siap diinjeksikan ke dalam sumur menggunakan mikropipet. Mikropipet dibilas menggunakan akuades setiap kali ingin memesukkan sampel lain. Pada salah satu sumur, ditempatkan sebanyak 7.5 µl protein marker. Running SDS-PAGE
e)
Katup elektroda dipasang dengan arus mengalir ke anoda. Sumber listrik dinyalakan dan dijaga konstan pada 70 V. Running dilakukan selama 180 menit sampai migrasi dye tersisa sekitar 0.5 cm dari dasar. Setelah selesai, aliran listrik dimatikan dan katup elektroda dilepaskan, lalu plat gel dipindahkan dari elektroda. Pewarnaan gel Gel diangkat dari slab dan dipindahkan ke dalam wadah tertutup yang telah berisi pewarna coomassie brilliant blue (kurang lebih 20 ml). Kemudian didiamkan selama 20 menit.
f)
Destaining gel
g)
Gel diangkat dan dicuci menggunakan akuades beberapa kali. Larutan penghilang warna ditambahkan (destaining solution) dan digoyangkan sesekali hingga latar belakang pita protein menjadi terang. Selanjutnya, larutan penghilang warna dibuang dan gel siap dianalisis. Penentuan berat molekul protein yang terpisahkan Berat molekul protein sampel dapat dihitung dari persamaan regresi antara mobilitas relatif protein marker (penanda protein) dengan logaritma dari berat molekul marker yang telah diketahui. Mobilitas relatif protein dihitung dengan membandingkan jarak migrasi protein diukur dari garis awal separating gel sampai ujung pita protein yang dibandingkan dengan jarak migrasi tracking dye. Mobilitas relatif tersebut dirumuskan sebagai: jarak migrasi protein
28
7.
Analisis Gel Electrophoresis Gel hasil elektroforesis SDS-PAGE tersebut di dokumentasikan dalam bentuk gambar dengan menggunakan Gel-Doc (Bio-rad). Hasil GEL-DOC tersebut kemudian dianalisis densitas pita proteinnya dengan menggunakan ImageJ 1.42q (software dari Wayne Rasband, National Institute of Health, USA (http://rsb.info.nih.gov/ij).
8.
Analisis Tekstur Curd secara Obyektif Tekstur curd dianalisis dengan metode Texture Profile Analysis (TPA) menggunakan alat TA-XT2i. Setting alat TA-XT2i untuk pengukuran TPA curd dapat dilihat pada Tabel 5. Sampel curd yang akan diuji merupakan sampel curd yang telah disimpan dalam rendaman air selama 1 malam di dalam lemari pendingin. Satu jam sebelum pengukuran, sampel curd di biarkan dahulu di suhu ruang. Pengukuran sampel curd dilakukan sebanyak empat kali dari empat titik yang berbeda. Sampel curd yang akan diukur dipotong berbentuk silinder dengan diameter ±3.5 cm. Sampel dianalisis menggunakan probe P/100 dengan diameter 100mm. Parameter yang diukur menggunakan metode TPA adalah kekerasan, kohesivitas dan daya kunyah curd. Tabel 5. Setting TA-XT2i untuk pengukuran TPA curd Pre-test speed
1.5 mm/sec
Test speed
1.5 mm/sec
Post-test speed
1.0 mm/sec
Target mode
0 = distance
Unit distance
% strain
Distance
60%
Time
5 sec
Trigger type
0 = Auto (force)
Unit force
grams
Trigger force
20 g
Tare mode
0 = Auto
Interpretasi beberapa parameter tekstur : Kekerasan menunjukkan besarnya gaya yang diberikan hingga obyek mengalami perubahan bentuk. Tekanan probe yang diberikan terhadap objek, menghasilkan grafik TPA yang meningkat hingga mencapai batas tertentu dimana objek akan mengalami perubahan bentuk dan pada saat objek hancur, grafik TPA akan menunjukkan pola penurunan. Sehingga parameter kekerasan dapat diperoleh dari nilai gaya pada puncak tertinggi di kurva pertama. Kohesivitas merupakan rasio usaha yang dibutuhkan untuk menekan pangan pada gigitan kedua dibandingkan dengan usaha yang dibutuhkan untuk menekan pada gigitan pertama. Luas area dibawah kurva merupakan integral dari waktu (t) terhadap gaya(F) yang setara dengan usaha. Sehingga parameter kohesivitas dapat diperoleh dari rasio luas area dibawah kurva kedua dengan luas area dibawah kurva pertama. Daya kunyah merupakan besarnya tenaga yang dibutuhkan untuk menghancurkan pangan semi padat menjadi bentuk yang siap ditelan. Parameter daya kunyah dipengaruhi oleh kekerasan dan kekompakan objek, sehingga merupakan hasil perkalian antara kekerasan dan kohesivitas.
29
Kelengketan merupakan besarnya tenaga yang dibutuhkan untuk mengunyah pangan padat menjadi bentuk yang siap ditelan. Parameter kelengketan merupakan perkalian antara kekerasan, kohesivitas dan elastisitas.
9.
Analisis Tekstur Curd secara Subyektif Serangkaian uji segitiga dan uji ranking terhadap kekerasan penekanan curd dilakukan dalam beberapa tahap untuk menyeleksi panelis. Dibutuhkan sebanyak 6-18 calon panelis yang selanjutnya akan diberikan pelatihan mengenai pengujian kekerasan curd menggunakan telunjuk dan ibu jari. Pelatihan yang dilakukan meliputi teknik pengujian, penyamaan persepsi kekerasan, penentuan sampel referen dan teknik penilaian organoleptik. Dalam proses pelatihan, dilakukan uji rating skala garis (0 = lunak dan 15 = keras) sampel tahu komersial terhadap sampel referen hingga diperoleh konsistensi panelis pada penilaian sampel tahu komersial. Penilaian subyektif terhadap beberapa tahu komersil tersebut dijadikan kurva standar hubungan antara tingkat kekerasan tahu (Hardness) dengan penilaian subyektifnya. Selanjutnya, panelis diminta menguji sampel tahu komersil lain yang belum pernah diujikan menggunakan uji rating skala garis. Kuesioner uji penekanan sampel curd dapat dilihat pada Lampiran 2. Pengolahan data uji penekanan menggunakan bantuan program statistik SPSS 15.0.
D. RANCANGAN PERCOBAAN Rancangan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah rancangan acak lengkap dengan dua faktor dan dua kali ulangan. Faktor yang digunakan meliputi suhu awal koagulasi (α) dan konsentrasi koagulan GDL (β). Faktor suhu awal koagulasi terdiri atas dua taraf, yaitu suhu 63 °C (α1) dan suhu 83 °C (α2), sedangkan konsentrasi koagulan terdiri atas tiga taraf, yaitu 0.4% (β1), 0.8% N (β2), dan 1.2% (β3). Model matematika untuk rancangan percobaan ini adalah: Yijk µ + αi + βj + (αβ)ij + Σij dimana:
Yijk µ αi βj (αβ)i j Σij i j
respon pada perlakuan α ke-i, perlakuan β ke-j, ulangan ke-k = pengaruh rata-rata sebenarnya = pengaruh perlakuan suhu awal koagulasi ke-i = pengaruh perlakuan konsentrasi koagulan ke-j = pengaruh interaksi α ke-i dan β ke-j = pengaruh acak (galat pada perlakuan ke-i kelompok ke-j) = 1, 2 = 1, 2, 3
30
