III.
METODOLOGI PENELITIAN
A. ALAT DAN BAHAN Alat yang digunakan pada penelitian kali ini meliputi pisau dan wadah untuk pengambilan sampel, seperangkat destilator, seperangkat alat ekstraksi soxhlet, pompa vacuum, whatman 41, vacuum rotary evaporator, freeze dryer, corong pemisah, spektrofotometer, inkubator, autoclaf, neraca analitik, gelas piala, gelas ukur, tabung reaksi, cawan petri, ose, bunsen, dan hotplate beserta stirer. Adapun bahan yang diperlukan yaitu daun dan ranting jarak pagar segar yang diambil dari kebun Leuwikopo IPB sebagai bahan baku utama untuk pembuatan ekstrak, pelarut berupa etanol, etil asetat, dan n-heksana, serta kultur Candida albicans, Pseudomonas Aeruginosa, dan Microsporum gypseum. Sedangkan bahan-bahan kimia yang digunakan adalah bahan-bahan kimia untuk analisis proksimat, anlisis total fenol (asam tanat, aquades, Na2CO3, reagen Follin-Ciocalteu, dan etanol PA), analisis antioksidan (DPPH, dan methanol PA), serta analisis aktivitas penghambatan mikroba (nutrient broth, nutrient agar, PDB, PDA, dan ketokonazol).
B. METODE PENELITIAN Secara umum penelitian ini dilakukan dalam beberapa tahapan. Pada tahap pertama dilakukan proses persiapan sampel daun dan ranting jarak pagar berupa pengecilan ukuran, pengeringan, dan pembuatan serbuk. Selanjutnya dilakukan beberapa analisis terhadap serbuk yang dihasilkan untuk mengetahui karakteristik bahan yang akan diekstraksi. Kemudian serbuk diekstraksi dengan metode soxhlet dan metode maserasi menggunakan pelarut etanol yang telah di destilasi sebelumnya. Ekstrak kasar yang diperoleh lalu dipekatkan dan dikeringkan untuk selanjutnya mengalami proses fraksinasi (partisi cair-cair). Proses fraksinasi dilakukan dengan menggunakan pelarut etil asetat dan n-heksan (yang telah didestilasi sebelummnya) untuk memisahkan zat sesuai kepolarannya. Fraksi ekstrak yang didapat kemudian dipekatkan dan dikeringkan hingga menjadi bahan yang siap untuk dianalisis. Analisis yang dilakukan terhadap sampel uji antara lain adalah analisis total fenol, analisis antioksidan, dan analisis antimikroba. Selain itu juga dilakukan analisis GC-MS untuk mengetahui senyawa-senyawa yang terkandung di dalam masing-masing ekstrak dan fraksi ekstrak. Berdasarkan hasil analisis tersebut ditentukan ekstrak atau fraksi ekstrak yang memiliki aktivitas antioksidan dan antimikroba terbaik yang berpotensi untuk dikembangkan menjadi produk personal hygiene. Selain itu, juga ditentukan pengaruh panas dalam proses ekstraksi terhadap sifat antioksidan dan antimikroba ekstrak kasar yang diperoleh. Garis besar pelaksanaan penelitian yang berupa ekstraksi, fraksinasi, dan pengujian ekstrak/fraksi ekstrak dari jarak pagar dapat dilihat pada Gambar 5. Adapun tahap lanjut dari penelitian berupa aplikasi ekstrak/fraksi ekstrak terpilih pada sabun transparan dapat dilihat pada Gambar 6.
15
Daun dan ranting jarak pagar
Diperkecil ukurannya, dikeringkan, dan dibuat menjadi serbuk
Analisis kadar air, abu, lemak, dan protein terhadap serbuk daun dan ranting jarak pagar
Ekstraksi serbuk dengan metode soxhlet (pelarut etanol 96% yang telah didestilasi) Disaring dengan Whatman 41, dipekatkan dengan vacuum rotary evaporator (40-600C), lalu dikeringkan dengan freeze dryer
Ekstraksi serbuk dengan metode maserasi (pelarut etanol 96% yang telah didestilasi) Disaring dengan Whatman 41, dipekatkan dan dikeringan dalam ruangan ber-AC (180C) [tidak menggunakan proses panas sama sekali]
Ekstrak kasar (soxhlet)
Ekstrak kasar (maserasi)
Fraksinasi (partisi) dengan pelarut etanol-air (2:3), etil asetat, dan heksan
Fraksi etanol air
Fraksi etil asetat
Fraksi heksan
Disaring dengan Whatman 41, dipekatkan dengan vacuum rotary evaporator (40-600C), lalu dikeringkan dengan freeze dryer
Fraksi etanol air siap uji
Fraksi etil asetat siap uji
Uji total fenol, aktivitas antioksidan, aktivitas antimikroba, dan identifikasi senyawa kimia dengan GC-MS
Ekstrak/fraksi ekstrak terpilih
Gambar 5. Ekstraksi, fraksinasi, dan pengujian ekstrak/fraksi ekstrak dari jarak pagar
16
Ekstrak/fraksi ekstrak terpilih
Penambahan ekstrak pada sabun komersil tanpa BHT (650C)
Sabun transparan dengan ekstrak jarak pagar
Analisis sabun (bagian tak larut dalam alkohol, pH, stabilitas busa, aktivitas antioksidan) serta uji kesukaan (warna dan aroma) oleh bebeapa orang panelis Gambar 6. Aplikasi ekstrak/fraksi ekstrak terpilih pada sabun transparan a.
Persiapan Sampel Sampel daun jarak pagar diambil pada saat dilakukan pemangkasan tanaman jarak. Sampel basah yang ada dipisahkan bagian daun dan ranting. Masing-masing bagian sampel segar kemudian dirajang dan dikeringanginkan selama ± 7 hari hingga benar-benar kering. Sampel kering lalu digiling dengan blender hingga menjadi serbuk untuk memudahkan proses ekstraksi. Sampel serbuk kering dikemas dalam kantong plastik dan disimpan dalam freezer sebelum dilakukan proses ekstraksi. Karakterisasi yang dilakukan terhadap sampel serbuk kering sebelum digunakan dalam penelitian meliputi analisa kadar air, kadar abu, kadar lemak, dan kadar protein. Prosedur analisa proksimat sampel jarak pagar disajikan pada Lampiran 1.
b. Ekstraksi Senyawa Aktif Proses ekstraksi dilakukan dengan dua metode ekstraksi yaitu sokhlet (mewakili metode ekstraksi panas) dan maserasi (mewakili metode ekstraksi dingin). Metode ekstraksi soxhlet dilakukan dengan cara menimbang ± 40-45 gram serbuk sampel kering lalu memasukkannya ke dalam selongsong yang terbuat dari kertas saring. Selongsong kemudian dimasukkan ke dalam alat ekstraksi soxhlet dan diekstraksi menggunakan pelarut etanol 96% yang telah didestilasi sebelumnya. Proses ekstraksi dilakukan hingga terjadi refluks sebanyak sepuluh kali. Waktu yang dibutuhkan untuk satu kali refluks mencapai 50-60 menit. Esktrak yang diperoleh kemudian disaring dengan kertas saring Whatman 41 dengan bantuan pompa vakum, lalu dipisahkan dari pelarut (dipekatkan) dengan menggunakan vacuum rotary evaporator hingga diperoleh ekstrak kental. Ekstrak yang didapat kemudian dikeringkan dengan pengering beku (freeze dryer) hingga didapat ekstrak kasar kering. Adapun metode maserasi dilakukan dengan cara menimbang serbuk sampel kering sebanyak 120 gram lalu diekstraksi menggunakan pelarut etanol 96% (3 x 240 ml) yang telah didestilasi sebelumnya. Serbuk sampel kering yang telah ditimbang direndam dalam pelarut selama 24 jam pada suhu kamar. Ekstrak yang diperoleh kemudian dipekatkan
17
dengan cara dikeringanginkan dalam ruangan ber-AC hingga pelarut menguap dan ekstrak megering (tanpa menggunakan panas sama sekali). Ekstrak kering kemudian dikerik dan dikemas dalam kemasan plastik, lalu disimpan di dalam freezer sebelum digunakan sebagai bahan analisis. c.
Proses Fraksinasi Proses fraksinasi kasar yang dilakukan mengacu pada metode Windarwati (2011) yaitu proses partisi menggunakan pelarut etanol-air (2:3), heksan dan etil asetat. Ekstrak kasar dilarutkan dalam pelarut Sebanyak 50 gram ekstrak kasar dilarutkan dalam 500 ml pelarut campuran etanol air. Larutan selanjutnya dipartisi dengan menambahkan 1000 ml pelarut n-heksan, dikocok dalam labu pemisah dan didiamkan selama 30-60 menit hingga terdapat dua lapisan (lapisan etanol air di bagian bawah dan lapisan n-heksan di bagian atas). Kedua lapisan yang terbentuk kemudian dipisahkan. Proses penambahan heksan pada lapisan atas etanol air diulangi tiga kali. Lapisan heksan yang terbentuk selama tiga kali penambahan digabungkan menjadi satu dan disebut sebagai fraksi heksan. Lapisan etanol air sisa dari proses partisi heksan kemudian dipartisi lebih lanjut dengan etil asetat. Proses yang terjadi sama dengan proses partisi dengan pelarut heksan hanya saja pelarut heksan digantikan dengan etil asetat. Sebanyak 1000 ml pelarut etil asetat ditambahkan dalam lapisan etanol air, dikocok dalam labu pemisah dan didiamkan selama 30-60 menit hingga terdapat dua lapisan (lapisan etanol air di bagian bawah dan lapisan etil asetat di bagian atas). Kedua lapisan yang terbentuk kemudian dipisahkan. Proses penambahan etil asetat pada lapisan atas etanol air diulangi tiga kali. Lapisan etil asetat yang terbentuk selama tiga kali penambahan digabungkan menjadi satu dan disebut sebagai fraksi etil asetat. Adapun lapisan etanol air disebut sebagai fraksi etanol air. Fraksi etil asetat dan fraksi etanol air adalah fraksi yang diinginkan pada penelitian ini. Oleh karena itu, kedua fraksi ini harus diproses lebih lanjut. Fraksi etil asetat dan fraksi etanol air yang diperoleh selanjutnya dipisahkan dari pelarutnya (dipekatkan) menggunakan vacuum rotary evaporator pada suhu 500C hingga diperoleh ekstrak kental. Ekstrak kental tersebut kemudian dikeringkan menggunakan pengering beku (freeze dryer) hingga diperoleh fraksi ekstrak. Perhitungan rendemen proses ekstraksi dan fraksi ekstrak terhadap bobot serbuk kering yang digunakan adalah sebagai berikut: %
%
100%
100%
d. Analisis Ekstrak dan Fraksi Ekstrak Ekstrak kasar, fraksi etil asetat, dan fraksi etanol air yang dihasilkan selanjutnya dianalisa kandungan total fenol dengan metode Folin-Ciocalteu, aktivitas antioksidan dengan metode perendaman DPPH, aktivitas antimikroba dengan metode difusi sumur atau disc diffusion, dan diidentifikasi komposisi senyawa kimianya dengan metode GC-MS.
18
e.
Uji Total Fenol Sebanyak 0.1 ml cairan ekstrak dalam metanol (konsentrasi 1 mg ekstrak/ml) diencerkan menjadi 1 ml dengan aquadest. Ke dalam larutan tersebut dimasukkan 0.5 ml reagen Folin Ciocalteu yang diikuti dengan penambahan 2 ml larutan Na2CO3 7.5%. Cairan kemudian divortex dan dibiarkan (diinkubasi) selama 30 menit pada suhu 400C. Absorbansi sampel diukur pada panjang gelombang 760 nm. Absorbansi yang terbaca merupakan nilai y yang dimasukkan ke dalam persamaan garis yang didapat dari pembuatan kurva standar asam tanat pada konsentrasi 25-125 mg/L. Dengan demikian akan diperoleh kandungan total fenol (nilai x) sampel yang dinyatakan sebagai mg ekuivalen asam tanat/g sampel ekstrak. Perhitungan total fenol adalah sebagai berikut: ⁄ 1
3.5
f.
Uji Aktivitas Antioksidan dengan Metode Efek Perendaman terhadap Radikal Bebas DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhidrazil) (Liyana dan Shahidi, 2005) Prinsip pengujian aktivitas antioksidan dengan metode DPPH adalah ketika larutan DPPH bercampur dengan senyawa yang dapat mendonorkan atom hidrogen (zatn antioksidan), maka DPPH akan tereduksi dan akan kehilangan warna ungunya. Sebanyak 2 ml DPPH 0.136 mM dalam metanol dicampurkan dengan 2 ml ekstrak dalam metanol yang terdiri dari konsentrasi 4, 6, 8, 10, 12, 16, dan 20 ppm. Setelah itu cairan disimpan di ruang gelap pada suhu ruang selama 30 menit, kemudian absorbansi diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 517 nm. Vitamin C digunakan sebagai pembanding. Sebagai kontrol, disiapkan metanol sebanyak 4 ml tanpa penambahan ekstrak dan ditetapkan sebagai 0% absorban. Kapasitas antioksidan ( persen penghambatan) dapat dihitung dengan rumus berikut: %
g.
100%
Uji Aktivitas Penghambatan Mikroba Aktivitas penghambatan mikroba dianalisa dengan metode difusi sumur. Pada metode ini kultur uji berupa Candida albicans, Microsporum gypseum, dan Pseudomonas aeruginosa yang akan digunakan disegarkan terlebih dahulu dengan cara diambil satu ose, lalu ditumbuhkan pada media pertumbuhan PDB 10 ml untuk golongan khamir dan kapang serta ditumbuhkan pada media NB 10 ml untuk bakteri. Kultur Candida albicans dan Pseudomonas aeruginosa lalu diinkubasi pada suhu 300C selama 24 jam sementara itu kultur Microsporum gypseum diinkubasi pada suhu 300C selama 48-72 jam. Pada metode difusi sumur, dari kultur yang telah disegarkan, sebanyak 0.25 ml Candida albicans diambil dan dimasukkan ke dalam media agar 25 ml yang kemudian dituangkan ke dalam cawan petri steril. Media agar untuk kapang dan khamir adalah PDA sedangkan media agar untuk bakteri adalah NA. Agar dibiarkan membeku. Setelah beku dibuat lubang atau sumur menggunakan alat pembuat sumur berdiameter 1 cm (10 mm). Teteskan fraksi uji dan jaga, jangan sampai fraksi tersebut keluar lubang. Inkubasikan pada suhu 370C selama 48 jam. Sedangkan untuk Microsporum gypseum, agar dibuat terlebih
19
dahulu dalam cawan petri dan dibiarkan mengeras. Setelah itu biakan cair mikroorganisme dituang di atas agar dan diratakan. Kemudian barulah dibuat sumur dan fraksi uji diteteskan. Adapun pada metode disc diffusion, kertas cakram yang terbuat dari Whatman 42 berdiameter 6 mm dicelupkan ke dalam larutan ekstrak 1%, 2%, dan 3%. Kertas ini selanjutnya diletakkan di atas agar cawan yang telah diinokulasikan mikroorganisme Pseudomonas aeruginosa dengan metode tuang. Inkubasikan agar pada suhu 370C selama 24 jam. Amati penghambatan pertumbuhan mikroba yang terjadi dan ukur zona penghambatan yang terbentuk yang ditandai dengan tidak terdapatnya pertumbuhan mikroba di sekeliling sumur. Tentukan jenis mikroba yang mampu mengalami penghambatan paling tinggi dan ekstrak atau fraksi ekstrak mana yang memberikan penghambatan paling tinggi tersebut.
h. Identifikasi Senyawa Kimia dengan GC-MS Identifikasi senyawa kimia dalam ekstrak terpilih dilakukan menggunakan GC-MS (Gas Chromatography-Mass Spectrometry) Agilent 19091S-433. Analisis dilakukan di Puslabfor Mabes Polri Jakarta. Sejumlah kecil ekstrak dilarutkan dalam pelarut yang digunakan saat pembuatan ekstrak. Bila masih terdapat ekstrak yang tidak larut maka dilakukan proses sentrifugasi. Larutan ekstrak kemudian diambil dengan jarum inject khusus lalu disuntikan ke dalam alat GC-MS. Metode yang digunakan pada analisis ini adalam metode umum dengan suhu inlet untuk ekstrak soxhlet 1000C dan 400C untuk ekstrak maserasi. i.
Penambahan Fraksi Ekstrak Terpilih pada Sabun Batang Transparan Penambahan fraksi ekstrak terpilih pada sabun batang transparan dilakukan dengan cara melelehkan sabun transparan komersial tanpa penambahan BHT pada suhu 600C. Kemudian ekstrak/fraksi ekstrak terpilih ditambahkan pada suhu 650C dan diaduk menggunakan stirrer selama 5-7 menit. Sabun kemudian dicetak dalam wadah. Penambahan ekstrak dilakukan pada tiga tingkat konsentrasi yaitu 0.2 gram, 0.4 gram, dan 0.8 gram pada tiap batch proses yang berisi 300 gram sabun. Sabun yang telah jadi kemudian didiamkan selama 1-2 hari. Penyimpanan sabun dilakukan pada kondisi suhu 500C selama 3 hari untuk kemudian dianalisis. Parameter yang diukur setelah 3 hari penyimpanan adalah pH, aktivitas antioksidan dengan metode DPPH, stabilitas busa, bagian tak larut dalam alkohol, serta uji organoleptik (kesukaan terhadap aroma dan warna). Sementara itu, parameter yang diukur setiap harinya adalah pH dan aktivitas antioksidan. Prosedur analisa sabun disajikan pada Lampiran 2.
20
