II.
METODOLOGI PENELITIAN
A. Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Pusat Riset Obat dan Makanan Badan POM RI pada bulan April 2011 hingga Juli 2011.
B. Bahan Bahan-bahan yang digunakan di dalam penelitian ini adalah sampel susu UHT, bakteri uji Salmonella Typhimurium (ATCC 14028) dan bakteri kontrol negatif Shigella sonnei (ATCC 25931). Media yang digunakan untuk menumbuhkan dan menghitung jumlah bakteri Salmonella Typhimurium dan Shigella sonnei yaitu larutan pengencer NaCl 0,85%, Heart Infusion Broth (Oxoid), dan Xylose Lysine Deoxycholate Agar (Oxoid). Bahan-bahan yang digunakan untuk mengisolasi DNA bakteri dengan menggunakan metode pendidihan yaitu buffer TE yang mengandung Tris.HCl 1 M pH 8,0 dan EDTA 0,5 M; lisozim (USB), dan proteinase K (USB). Bahan yang digunakan untuk mengisolasi DNA dengan menggunakan kit komersial QIAamp® DNA Blood Mini Kit (Qiagen) diantaranya adalah CTAB, Proteinase K, etanol 96%, buffer AL, buffer AW1, buffer AW2, dan buffer AE. Bahan-bahan yang digunakan untuk mengamplifikasi DNA dengan menggunakan real-time PCR yaitu buffer TE pH 8,0; forward primer invA (5’-ATC AGT ACC AGT CGT CTT ATC TTG AT-3’), reverse primer invA (5’-TCT GTT TAC CGG GCA TAC CAT-3’) (Shanmugasundaram et al. 2009), template DNA yang diperoleh dari tahap isolasi DNA, SsoFastTM EvaGreen® Supermix yang di dalamnya terdiri dari 2x reaction buffer dengan dNTPs, Sso7d-fusion polymerase, MgCl2, EvaGreen dye (sama dengan SYBR® Green I), dan penstabil. Bahan yang digunakan untuk mengukur kemurnian DNA dengan spektrofotometer uv-vis DNA adalah milliQ.
C. Alat Alat-alat yang digunakan di dalam penelitian ini adalah cawan petri, mikropipet, tip mikropipet, gelas ukur, gelas piala, tabung reaksi, batang lup inokulasi, rak tabung reaksi, vortex, neraca analitik, erlenmeyer, hot plate, label, inkubator, bulp, bunsen, korek, petroff-hausser, mikroskop, masker dan sarung tangan latex. Alat yang digunakan untuk isolasi DNA dan amplifikasi real-time PCR diantaranya adalah IQTM5 real-time PCR (Bio Rad), plate 96 Well Reaction (BioRad), PCR Sealer TM Microseal® ‘B’ Film (BioRad), Refrigerator, mikrosentrifus (Hettich), Water Bath, tabung mikrosentrifus 2 ml, tip berfilter, MixMate PCR 96. Alat yang digunakan untuk mengukur kemurnian isolat DNA adalah UV-VIS Spektrofotometer DNA (Shimadzu) dan kuvet.
D. Metode Penelitian a. Tahapan Pra-penelitian 1. 2.
Persiapan Bahan Kimia Persiapan Media Tumbuh Mikroba
b. Tahapan Penelitian Metode penelitian dapat dilihat pada Gambar 8. berikut ini.
17
Kultur Murni ST & SS
Pengecekan
Kultur Murni ST & SS
Sampel Susu UHT spike
Inokulasi
Isolasi/Ekstraksi DNA
Metode Pendidihan
Metode Kit Komersial
Isolat/Template DNA
Isolat/Template DNA
Pengujian dengan Real-Time PCR
Pengujian dengan Real-Time PCR
1. Penentuan Konsentrasi Primer 2. Penentuan Spesifisitas Primer 3. Pengkuantifikasian ST pada Susu
Pengkuantifikasian ST pada Susu
Ket: ST (Salmonella Typhimurium); SS (Shigella sonnei)
Gambar 8. Diagram alir tahapan penelitian
a. Tahapan Pra-penelitian 1. Persiapan Bahan Kimia Bahan kimia yang disiapkan untuk penelitian ini diantaranya adalah larutan pengencer NaCl 0,85%, lisozim, proteinase K, CTAB, dan buffer TE pH 8,0. Pembuatan NaCl 0,85% dilakukan dengan melarutkan 4,25 gram kristal NaCl ke dalam 500 ml milliQ di dalam labu ukur dan diaduk hingga homogen. Lisozim dibuat dengan melarutkan 10 mg/ml lisozim dengan 25 ml larutan Tris.HCl 10 mM pH 8,0 dan dikocok sampai jernih. Pembuatan proteinase K dilakukan dengan melarutkan 10 mg/ml proteinase K dengan 25 ml Tris.HCl 10 mM pH 8,0 dan diaduk sampai jernih. Cetyl trimethilammonium bromide (CTAB) dibuat dengan melarutkan 10 gram CTAB, 41 gram NaCl, dan 7,87 gram HCl ke dalam 400 ml akuades. Kemudian larutan tersebut ditambah dengan NaOH sampai larutan mencapai pH 8,0 dan ditambah dengan 20 ml EDTA
18
0,5 M pH 8,0. Larutan tersebut dituang ke dalam labu ukur 500 ml dan ditera dengan akuades. Larutan dipindahkan ke dalam erlenmeyer, divortex sampai larut kemudian dilakukan degasing (penghilangan gas dari larutan). Larutan tersebut selanjutnya disaring dengan kertas saring dan disterilisasi dengan autoclave dan disimpan pada suhu ruang. Bahan kimia lainnya yang disiapkan adalah buffer TE pH 8,0. Buffer TE pH 8,0 dibuat dengan mencampurkan 5 ml Tris.HCl 1 M pH 8,0 dengan 1 ml EDTA 0,5 M ke dalam labu ukur 500 ml dan ditambahkan milliQ sampai tanda tera. EDTA 0,5 M pH 8,0 diperoleh dengan menimbang 18,6 gram EDTA (Titriplex®; C10H14Na2O8.2H2O) dan dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml kemudian ditambahkan dengan 80 ml milliQ sedikit demi sedikit. Larutan tersebut ditambah dengan NaOH sampai larutan tersebut memiliki pH 8,0. Larutan kemudian ditera dan disterilisasi dengan autoclave. Seluruh proses pembuatan tersebut dapat dilihat pada Lampiran 1a, b, c, d, dan e.
2. Persiapan Media Tumbuh Mikroba Media tumbuh yang digunakan baik untuk Salmonella Typhimurium maupun Shigella sonnei adalah Heart Infusion Broth (HIB) dan Xylose Lysine Deoxycholate Agar (XLDA). Media HIB dibuat dengan melarutkan 18,5 gram HIB dengan 500 ml akuades dan diaduk sampai homogen. Setiap 5 ml larutan HIB dipipet ke dalam tabung reaksi steril dan ditutup dengan kapas dan alumunium foil kemudian disterilisasi dalam autoclave. Media XLDA dibuat dengan melarutkan 27,75 gram XLDA ke dalam 500 ml akuades steril di dalam erlenmeyer steril. Kemudian larutan tersebut dipanaskan di atas hot plate sampai mendidih dan larut sempurna tetapi tidak sampai over heat. Setelah itu didinginkan sampai suhu 50oC dan masing-masing sebanyak 25 ml dituang ke dalam cawan petri steril. Proses tersebut dapat dilihat lebih jelas pada Lampiran 2a, b.
b. Tahapan Penelitian 1. Pengecekan Kemurnian Salmonella Typhimurium dan Shigella sonnei Masing-masing bakteri Salmonella Typhimurium dan Shigella sonnei pada media Heart Infusion Broth (HIB) yang disimpan dalam refrigerator diinokulasi sebanyak 1 ose ke dalam HIB baru kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Jika HIB yang telah diinkubasi tersebut menjadi keruh, selanjutnya HIB tersebut digores kuadran pada media Xylose Lysine Deoxycholate Agar (XLDA) yang berbeda, kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC. Satu koloni Salmonella Typhimurium dan Shigella sonnei spesifik yang tumbuh pada XLDA diinokulasikan kembali ke dalam media HIB baru yang berbeda pula dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam.
2. Inokulasi Sampel Pangan Susu UHT dengan Kultur Murni Salmonella Typhimurium dan Shigella sonnei Sebanyak 100 µl kultur murni Salmonella Typhimurium maupun Shigella sonnei yang telah dicek kemurniannya kemudian dimasukkan ke dalam 9 ml larutan pengencer NaCl 0,85%. Kemudian suspensi tersebut dihitung banyaknya/konsentrasi mikroba yang terkandung di dalamnya secara mikroskopi dengan petroff-hausser. Jika konsentrasi suspensi tersebut kurang dari 105 sel/ml maka suspensi ditambah kembali dengan kultur murni hingga konsentrasi suspensi mencapai 105 sel/ml, namun jika konsentrasi suspensi lebih dari
19
105 sel/ml maka dilakukan pengenceran pada suspensi tersebut dengan menggunakan larutan pengencer NaCl 0,85% sampai didapatkan suspensi dengan konsentrasi 105 sel/ml. Sebanyak 5 ml suspensi dengan konsentrasi 105 sel/ml tersebut dimasukkan ke dalam 5 ml susu UHT dan dikocok hingga homogen. Kemudian sampel susu UHT tersebut diinkubasi pada suhu 37oC selama 1 jam. Untuk mengetahui jumlah mikroba akhir Salmonella Typhimurium yang terkandung pada susu UHT, maka sampel susu UHT ditumbuhkan dan dihitung dengan metode konvensional pada media Xylose Lysine Deoxycholate Agar (XLDA) yang diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Sebelumnya untuk mengetahui jumlah mikroba (Salmonella Typhimurium) natural pada susu UHT, maka dilakukan penghitungan jumlah mikroba awal dengan menginokulasi 1 ml susu pada media XLDA dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam.
3. Isolasi/Ekstraksi DNA Mikroba Proses isolasi/ekstraksi DNA mikroba baik dari kultur murni maupun dari sampel susu UHT spike dapat dilakukan dengan dua metode, yaitu metode pendidihan dan metode kit komersial. Masing-masing metode dijelaskan pada sub bab di bawah ini.
a) Isolasi DNA Salmonella Typhimurium Pendidihan (Rahayu et al. 2009)
dengan
Metode
Satu ml suspensi kultur murni mikroba spesifik yang terdapat dalam media HIB atau sampel susu UHT spike dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifus. Suspensi tersebut disentrifus dalam mikrosentrifus selama 10 menit 14.000 rpm dengan suhu 20oC dengan tujuan untuk mengendapkan sel bakteri. Supernatan yang dihasilkan dibuang dan pelet diresuspensi dengan 500 µl buffer TE lalu dihomogenkan dengan cara divortex. Suspensi tersebut disentrifus kembali pada mikrosentrifus selama 3 menit 14.000 rpm pada suhu 20oC. Untuk sampel susu UHT spike, pencucian dengan buffer TE dan disentrifus dengan mikrosentrifus diulang kembali sebanyak satu kali. Pelet yang dihasilkan diresuspensi dengan 100 µl Lisozim dan dihomogenisasi dengan cara divortex. Kemudian suspensi tersebut diinkubasi pada suhu ruang selama 15 menit. Setelah diinkubasi, sebanyak 100 µl proteinase K ditambahkan ke dalam suspensi dan divortex sampai homogen. Selanjutnya suspensi diinkubasi pada suhu 55oC selama 1 jam dan dinkubasi kembali pada suhu 100oC selama 15 menit. Proses tersebut bertujuan untuk melisiskan sel bakteri dan menghilangkan protein-protein yang terkandung di dalamnya. Penambahan buffer TE berfungsi untuk menjaga kestabilan DNA pada saat melisiskan sel. Suspensi yang telah diinkubasi didinginkan dalam es sampai membeku dan di-thawing ketika selanjutnya akan disentrifus selama 5 menit 14.000 rpm pada suhu 20oC. Supernatan yang dihasilkan dipindahkan pada tabung mikrosentrifus baru, disimpan sebagai isolat DNA pada suhu -20oC. Diagram alir proses ini dapat dilihat pada Lampiran 3. Kemurnian isolat DNA yang dihasilkan dapat diketahui dengan mengukurnya pada spektrofotometer. Teknis pengukurannya adalah dengan membandingkan nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm (A260/A280). Isolat DNA dikatakan murni jika rasio diantara kedua nilai absorbansi tersebut berada pada selang 1,8 hingga 2,0 (Nolan et al. 2007)
20
b) Isolasi DNA Salmonella Typhimurium dengan Kit Komersial (Berdasarkan QIAamp® DNA Blood Mini Kit Handbook dengan modifikasi Bioteknologi PROM) Tahapan proses dengan menggunakan kit komersial dilakukan sesuai dengan anjuran dari produsen yang bersangkutan, salah satunya berdasarkan protokol/handbook yang dikeluarkan oleh Qiagen untuk penggunaan QIAamp® DNA Blood Mini Kit dalam mengisolasi/mengekstraksi DNA mikroba. Kit tersebut terdiri dari empat jenis buffer (AW1, AW2, AE, dan AL), collection tube, dan kolom mini dimana di dalamnya terdapat filter putih. Di bawah ini (Gambar 9.) merupakan gambar kit komersial yang digunakan pada penelitian ini.
Gambar 9. Kit komersial QIAamp® DNA Blood Mini Kit (Qiagen) Proses isolasi/ekstraksi DNA dilakukan dengan penambahan buffer AL yang dilakukan setelah penambahan proteinase K dimana bersama-sama dengan proteinase K berfungsi untuk melisiskan sel bakteri sehingga dinding sel bakteri rusak. Supernatan yang dihasilkan dari proses sentrifugasi suspensi tersebut dimasukkan ke dalam kolom mini berfilter sehingga DNA tersangkut/terikat di dalamnya. Penambahan buffer AW1 dan buffer AW2 yang dilakukan setelahnya kedalam kolom mini berfilter yang berfungsi untuk pencucian dimana proses pencucian tersebut dapat meningkatkan kemurnian DNA nantinya serta meyakinkan penghilangan kontaminan secara keseluruhan dari proses tersebut tanpa mempengaruhi pengikatan DNA pada filter. Penambahan buffer AE ke dalam kolom mini dan dilakukan proses sentrifugasi setelah proses pencucian berfungsi untuk mengelusi DNA dari filter dan juga berfungsi dalam penyimpanan purifikasi DNA. Supernatan yang dihasilkan merupakan isolat DNA yang kemudian disimpan di dalam freezer suhu -20oC. Buffer AE yang digunakan mengandung 10 mM Tris.Cl; 0,5 mM EDTA pH 9,0 dimana pH yang basa dapat menghindari DNA dari degradasi karena hidrolisis asam. Teknis pengisolasian DNA dengan kit komersial pertama-tama adalah satu ml suspensi kultur murni mikroba spesifik yang terdapat dalam media HIB atau sampel susu UHT dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifus. Kemudian ditambahkan dengan 1 ml CTAB sebagai suatu modifikasi metode dari prosedur yang ditunjukkan pada handbook produsen kit, kemudian divortex hingga homogen. Suspensi tersebut disentrifus selama 1 menit dengan kecepatan 13000 rpm dan supernatan yang dihasilkan dibuang sehingga menyisakan pelet pada tabung mikrosentrifus. Jika tidak dihasilkan pelet, maka suspensi disisakan sebanyak 200 µl supernatan pada tabung mikrosentrifus. Kemudian ditambahkan proteinase K sebanyak 30 µl ke dalam tabung mikrosentrifus, dan
21
dihomogenkan dengan vortex kemudian diinkubasi selama 20 menit pada suhu 65oC. Setelah itu, ditambahkan buffer AL sebanyak 300 µl dan dihomogenkan dengan vortex. Suspensi diinkubasi selama 10 menit di dalam water bath pada suhu 65oC. Setelah itu, ditambahkan 500 µl etanol (96-100%), dihomogenkan dengan vortex dan disentrifus selama 2 menit dengan kecepatan 10000 rpm. Supernatan yang dihasilkan dipipet dan dimasukkan ke dalam kolom mini yang sudah dipasang pada collection tube, kemudian disentrifus 8000 rpm selama 1 menit. Sebanyak 500 µl buffer AW1 ditambahkan ke dalam kolom mini yang masih terpasang pada collection tube dan disentrifus 8000 rpm selama 1 menit. Tahap selanjutnya adalah kolom mini dipindahkan ke dalam collection tube yang baru dan ditambahkan dengan 500 µl buffer AW2 ke dalam kolom mini, kemudian disentrifus 13000 rpm selama 3 menit. Kolom mini dipindahkan kembali ke dalam collection tube dan disentrifus kembali selama 1 menit 13000 rpm. Kolom mini dipindahkan ke dalam tabung mikrosentrifus steril dan ditambahkan ke dalamnya sebanyak 80 µl buffer AE yang kemudian disentrifus 8000 rpm selama 1 menit. Supernatan yang diperoleh pada tabung mikrosentrifus merupakan isolat DNA yang akan digunakan pada tahap selanjutnya dan isolat tersebut disimpan pada freezer dengan sehu 20oC. Diagram alir proses ini dapat dilihat pada Lampiran 4. Kemudian kemurnian isolat DNA yang dihasilkan dapat diketahui dengan mengukurnya pada spektrofotometer. Gambar penggunaan kolom mini dan collection tube dapat dilihat pada gambar berikut ini (Gambar 10.).
filter pada kolom mini
Gambar 10.
(a) (b) Proses isolasi/ekstraksi DNA dengan menggunakan metode kit komersial, (a) penambahan buffer AW1 ke dalam kolom mini, (b) hasil sentrifugasi setelah penambahan AW1 dan supernatan yang terdapat di bawah dibuang untuk selanjutnya filter dicuci kembali dengan buffer AW2.
4. Pengujian Salmonella Typhimurium dengan Real-Time PCR Penggunaan real-time PCR dilakukan dengan membuat master mix terlebih dahulu kemudian diamplifikasi dengan memasukkan master mix tersebut ke dalam alat real-time PCR.
a) Pembuatan Master Mix Master mix untuk pengujian dengan real-time PCR terdiri dari 7 µl buffer TE, 10 µl SsoFastTM EvaGreen® Supermix (terdiri dari 2x reaction buffer dengan dNTPs, Sso7dfusion polymerase, MgCl2, EvaGreen dye, dan penstabil), dan masing-masing 0,5 µl
22
reverse dan forward primer InvA pada konsentrasi tertentu. Volume master mix keseluruhan untuk pengujian satu jenis template DNA adalah 18 µl. Bahan-bahan untuk membuat master mix tersebut dicampur dalam satu tabung mikrosentrifus 2 ml dan dihomogenkan dengan vortex. Untuk melakukan pengujian beberapa jenis template DNA, maka volume masing-masing bahan dikali dengan banyaknya jenis template DNA yang akan diuji pada real-time PCR dan dicampur di dalam tabung mikrosentrifus. Kemudian masing-masing 18 µl campuran master mix yang telah dibuat pada tabung mikrosentrifus tersebut diambil dan dimasukkan kedalam setiap well yang kemudian ditambahkan dengan 2 µl template DNA yang selanjutnya dihomogenkan pada MixMate PCR 96 dan dimasukkan pada alat real-time PCR.
b) Amplifikasi dengan real-time PCR Masing-masing sebanyak 18 µl master mix dan 2 µl template/isolat DNA yang telah dibuat dimasukkan ke dalam setiap well pada plate 96 Well Reaction. Kemudian well ditutup dengan PCR SealerTM Microseal® ‘B’ Film dan dihomogenkan dengan menggunakan MixMate PCR 96. Well dimasukkan ke dalam real-time PCR yang telah diatur dengan protokol PCR tertentu. Protokol PCR yang digunakan adalah predenaturasi pada suhu 95oC selama 1 menit, diikuti dengan 35 siklus denaturasi pada suhu 95oC selama 30 detik dan annealing pada suhu 58.1oC selama 1 menit. Primer elongasi dilakukan pada suhu 72oC selama 1 menit 30 detik dan final elongasi selama 10 menit pada suhu 72oC. Analisis melting curve dari produk akhir PCR dilakukan sebanyak 81 siklus pada suhu 55oC selama 10 detik. Kemudian dilakukan running dengan real-time PCR.
5. Penentuan Konsentrasi Primer Penentuan konsentrasi primer pada penelitian ini dilakukan dengan cara menguji primer dengan konsetrasi 0,0125; 0,025; dan 0,125 µM pada sampel kultur murni Salmonella Typhimurium, menguji primer dengan konsentrasi 0,025 dan 0,125 µM untuk sampel suspensi 103 sel/ml Salmonella Typhimurium dan sampel susu UHT spike Salmonella Typhimurium ke dalam real-time PCR dengan melalui dua tahap yang telah dijelaskan pada sub bab sebelumnya. Kemudian dipilih konsentrasi primer yang sesuai/tepat. Konsentrasi primer yang sesuai/tepat adalah konsentrasi primer yang menghasilkan nilai Ct yang paling rendah dan tanpa menghasilkan atau seminimal mungkin menghasilkan primer-dimer pada kurva puncak pelelehan (Pestana et al. 2010).
6. Penentuan Spesifisitas Primer (Ahmed et al. 2009) Isolat DNA kultur murni Salmonella Typhimurium sebagai kontrol positif dan isolat DNA Shigella sonnei sebagai kontrol negatif diuji dengan real-time PCR. Pengujian dengan real-time PCR telah dijelaskan pada sub bab sebelumnya. Penentuan spesifisitas dilakukan dengan menggunakan primer InvA forward dan reverse yang telah dianalisis dengan Basic Local Alignment Search Tool (NCBI 2011) dimana sekuen oligonukleotida primer yang digunakan tersebut telah spesifik untuk Salmonella dan tidak sesuai dengan sekuen gen pada patogen tertentu yang biasa terdapat pada susu. Kemudian setelah pengujian dengan realtime PCR selesai, dilakukan analisis terhadap kurva puncak pelelehan (melt peak curve) dan kurva amplifikasi yang dihasilkan. Jika primer yang digunakan spesifik untuk Salmonella Typhimurium, maka Shigella sonnei tidak akan teramplifikasi dan tidak akan menghasilkan
23
nilai Tm pada melt peak curve sedangkan Salmonella Typhimurium akan teramplifikasi dan menghasilkan nilai Tm.
7. Pengkuantifikasian Salmonella Typhimurium pada Sampel Pangan Proses pengkuantifikasian dilakukan dengan membuat kurva standar yang menghubungkan nilai Ct yang diperoleh dengan real-time PCR pada sumbu-y dan log konsentrasi mikroba pada sumbu-x. Kurva standar dibuat dengan mengencerkan 100 µl kultur murni Salmonella Typhimurium ke dalam 9 ml larutan pengencer NaCl 0,85%. Suspensi tersebut dihitung kandungan sel dalam setiap ml pengencer dengan hitungan mikroskopi pada petroff-hausser. Setelah diperoleh sejumlah 108 sel/ml dalam suspensi, maka dilakukan pengenceran hingga 103 sel/ml. Kemudian dilakukan isolasi DNA dan pengujian dengan real-time PCR sampai diperoleh nilai Ct dan kurva standar yang menghasilkan persamaan garis dengan efisiensi 96-110%; dan slope -3,1 hingga -3,6 (Pestana et al. 2010). Efisiensi merupakan faktor penting untuk setiap metode kuantitatif PCR yang reliable (Siebert 1999). Efisiensi amplifikasi dapat dihitung dengan menggunakan persamaan: % E = [(10-1/slope)-1] x 100% Nilai Threshold Cycle (Ct) dari hasil pengujian sejumlah 105 sel/ml Salmonella Typhimurium pada sampel susu spike dimasukkan ke dalam persamaan garis yang diperoleh. Hal tersebut dilakukan untuk mengetahui nilai konsentrasi Salmonella Typhimurium yang terdapat pada susu berdasarkan pengujian dengan real-time PCR. Nilai konsentrasi hasil pengujian dengan real-time PCR tersebut kemudian dibandingkan dengan nilai konsentrasi yang sesungguhnya dimana dihitung dengan petroff-hausser dan dengan metode konvensional pada media XLDA.
24
