METODOLOGI PENELITIAN
Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilakukan pada bulan Juni 2011 hingga Januari 2012. Pemeliharaan ayam, vaksinasi dan pelaksanaan uji tantang serta pengamatan gejala klinis pasca uji tantang dilakukan di kandang Biosafety Level-2 (BSL-2) milik PT Medion, Bandung, Indonesia. Pembuatan preparat histopatologi, pewarnaan HE dan imunohistokimia dilakukan di Bagian Patologi, Departemen Klinik, Reproduksi dan Patologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor (IPB).
Materi Penelitian Hewan Percobaan Penelitian ini menggunakan 80 ekor day old chick (DOC) ayam pedaging strain Lohmann sebagai obyek penelitian, dipelihara dalam 4 lokal kandang SPF dengan diberikan pakan standard two feed system, pakan starter dan grower (SMS 1 dan SMS 2; SUG), air diberikan secara ad libitum dan menggunakan program medikasi standard. Selain itu digunakan 3 ekor kelinci strain White New Zealand yang berumur 2 bulan yang dipelihara dengan pemberian pakan dan minum secara ad libitum.
Bahan Penelitian Beberapa bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain :
Vaksin strain La Sota (MEDIVAC ND® dan MEDIVAC ND EMULSION ®)
Material pewarnaan organ dengan HE atau imunohistokimia (IHK)
Material uji titer antibodi dengan uji HI dan ELISA
Isolat virus velogenik lokal Indonesia (VND/Tasik/M13/2009)
Consumable pembuatan poliklonal antibodi, Complete Freund Adjuvant (CFA), Incomplete Freund Adjuvant (ICFA)
Metoda Penelitian Pembuatan Antibodi Poliklonal Pertama-tama kita siapkan kelinci strain New Zealand White yang berumur 2 bulan sebanyak 3 ekor. Masing-masing dilakukan pemeliharaan dengan program feeding yang standard dan dilakukan program aklimatisasi, adaptasi selama 7 hari dan pemberantasan
parasit dengan pemberian anti parasit. Setelah melewati masa adaptasi kelinci tersebut dibagi menjadi 2 kelompok. ekor.Kelompok
perlakuan
Kelompok perlakuan masing-masing
2 ekor, dan kelompok kontrol 1
kelompok
diinjeksi
virus
ND
lapang
(VND/Tasik/M13/2009) dosis tunggal secara sub cutan (1 dosis mengandung virus dengan konsentrasi 106 EID50 (Egg Infectious Dose50). Injeksi antigen ND pada hari ke-7 menggunakan antigen ND yang telah dicampur dengan adjuvant CFA. Kelinci tersebut dipelihara hingga 3 minggu berikutnya dan dilakukan boosting dengan cara menginjeksikan virus ND lapang (VND/Tasik/M13/2009) tersebut sesuai dengan kelompoknya.
Injeksi
antigen hari ke-28 dilakukan dengan menginjeksi antigen ND yang telah dicampur dalam adjuvant secara intra muscular. Setelah 3 minggu pasca boosting kemudian dilakukan pengambilan serum darah guna pemeriksaan antibodi terhadap ND dengan metoda Bradford serta dilakukan boosting berikutnya dengan menginjeksikan virus ND lapang yang sama yang telah dicampur dengan adjuvant PBS secara intra muskular. Setelah boosting kedua, maka dapat dilakukan pemanenan antibodi poliklonal dari kelinci tersebut. Pemanenan dilakukan setelah hasil screening antibodi dalam serum diukur tingkat konsentrasinya dengan metoda Bradford menggunakan alat spektrofotometer. Bila hasil konsentrasi yang didapat cukup tinggi maka dapat dilakukan pemanenan dan tidak diperlukan boosting berikutnya. Pemanenan serum dilakukan melalui vena marginalis telinga. Sebelumnya hewan dihandling dan dipreparir sehingga telinga terlihat jelas dan mudah untuk dilakukan pengambilan darah. Darah diambil seperlunya dan disimpan dalam kontainer khusus dan ditempatkan dalam refrigerator hingga terbentuk serum.
Untuk
Kelompok kontrol pada hari ke-7 hanya diinjeksi dengan PBS.
Karakterisasi protein dengan metoda Western Blot Secara umum ada 3 tahapan utama dalam proses karakterisasi dengan metoda ini yaitu preparasi sampel, elektroforesis dan transfer protein serta pewarnaan. Dalam preparasi sampel beberapa tahapan yang dilalui antara lain lysis buffer, penghambatan enzim protease dan phosphatase, persiapan lisat, penentuan konsentrasi protein serta persiapan sampel untuk loading ke dalam gel. Tahapan elektroforesis meliputi preparasi SDS-PAGE
(Sodium
Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis), kontrol positif, penentuan bobot molekul, loading sample dan running gel, serta penggunaan loading control. Tahapan yang terakhir dari metoda ini yaitu transfer protein dan pewarnaan meliputi visualisai protein dalam gel, transfer, visualisasi membran protein dilanjutkan dengan blocking membran, inkubasi antibodi primer dan dilanjutkan dengan inkubasi antibodi sekunder. Dari hasil yang
ada dapat dilihat berapa berat molekul (kDa) dan konsentrasi protein (mg/ml) dalam serum tersebut untuk menentukan apakah antigen yang digunakan benar benar murni virus ND.
Pemeliharaan Ayam Sebanyak 80 ekor DOC dipelihara secara berkelompok dalam beberapa area terpisah di kandang BSL-2 milik PT Medion, Bandung. Secara umum dikelompokkan menjadi 2 kelompok besar, yaitu ayam yang divaksinasi pada umur 4 hari dan ayam yang tidak dilakukan vaksinasi. Pada kelompok ayam yang dilakukan vaksinasi, pada umur 4 hari, ayam-ayam tersebut dilakukan vaksinasi dengan memberikan vaksin live dan killed strain La Sota secara tetes mata sebanyak 1 tetes dan injeksi vaksin inaktif Medivac Emultion® secara sub cutan sebanyak 0.2 ml/ekor. Kemudian ayam-ayam tersebut dipelihara dengan program pemeliharaan yang standard secara terpisah sesuai kelompok masing-masing perlakuan hingga umur 22 hari.Pakan yang digunakan adalah pakan starter dan grower (SMS 1 dan SMS 2; SUG), two feed system, dan menggunakan program medikasi standard yang diterapkan di Satwa Utama Group (SUG). Guna pemeriksaan titer, maka dilakukan pengambilan darah pada umur 1, 18, dan 22 hari. Sampel darah tersebut diuji dengan metoda Hemagglutination inhibition (HI).
Infeksi Virus Tantang Setelah ayam berumur 20 hari maka ayam dikelompokkan ke dalam 4 kelompok yaitu: Kelompok ayam yang tidak divaksin dan tidak ditantang sebagai kontrol negatif (K1) Kelompok ayam yang tidak divaksin tapi ditantang dengan virus lapang, sebagai kontrol positif (K2) Kelompok ayam yang divaksinasi dan ditantang dengan virus lapangan (P1) Kelompok ayam yang divaksinasi tapi tidak ditantang (P2)
Masing-masing kelompok ayam dipelihara dalam area yang terpisah. Pada umur 25 hari ayam dalam kelompok yang ditantang, dilakukan infeksi dengan menginjeksikan virus ND velogenik isolat lokal (VND/Tasik/M13/2009) secara intra muscular (Tran Dinh Tu et al. 1998) dengan dosis 104 EID50 (sesuai standard BPMSOH dan FOHI). Setelah diinfeksi, maka dilakukan pengamatan dan pencatatan gejala klinis hingga 7 hari pasca infeksi (Loke et al. 2005).
Pengamatan Gejala Klinis, Penghitungan Asupan Feed Intake (FI), Penentuan Body weight (BW) dan Feed Conversion Rate (FCR) Pengamatan gejala klinis dilakukan selama penelitian, yang meliputi perubahan tingkah laku, penurunan nafsu makan, kesiagaan (alert) dan kematian. Setiap pukul 06.00 pagi dilakukan pemberian pakan sesuai standard, dan pada jam yang sama dilakukan penimbangan sisa pakan yang masih terdapat di dalam tempat pakan.
Dari perlakuan
tersebut dapat diketahui asupan pakan harian masing masing individu dalam satu kelompok perlakuan. Penimbangan bobot badan dilakukan rutin setiap minggunya. Penimbangan bobot badan juga dilakukan terhadap masing-masing individu ayam sehingga didapatkan data bobot badan mingguan. Data yang ada kemudian dikumpulkan dan dihitung secara statistik sehingga didapatkan data rata-rata dalam setiap kelompok. Konversi pakan dapat dihitung apabila data bobot badan dan asupan pakan sudah tersedia. FCR merupakan nilai perbandingan konversi pakan yang diperlukan untuk menghasilkan 1 kg daging. Pemeriksaan Patologi Anatomi Otak, Duodenum dan Proventrikulus dan Pembuatan Preparat Histopatologi Selama penelitian dilakukan pencatatan perubahan gejala klinis dan apabila terdapat ayam yang mati maka segera dilakukan nekropsi guna mengetahui perubahan patologi anatomi dari ayam tersebut dan mengambil beberapa organ guna pemeriksaan lebih lanjut (Bell et al. 1995). Apabila ayam masih dalam keadaan hidup maka dilakukan nekropsi pada hari ke 3, 5 dan 7 pasca infeksi masing-masing 3 ekor tiap kelompok guna dilihat perubahan patologi anatomi serta pengambilan organ guna pemeriksaan lebih lanjut. Organ yang diambil dimasukkan dalam kontainer khusus dan difiksasi dengan larutan buffer neutral formalin (BNF) 10 %, kemudian dilakukan dehidrasi menggunakan alkohol tissue processor melalui alkohol dan xylene bertingkat (Mohammadamin & Qubih 2011). Setelah itu preparat direndam dalam media parafin cair sebelum dibuat blok parafin. Proses selanjutnya adalah embedding dalam parafin serta didinginkan pada suhu kamar, sehingga menjadi blok parafin. Pemotongan dilakukan dengan menggunakan mikrotom setebal 3-4 µm. Potongan organ diletakkan pada gelas obyek yang sebelumnya telah dilapisi gelatin dan CrK(SO)4. Selanjutnya dilakukan proses deparafinasi dan rehidrasi untuk proses pewarnaan HE dan imunohistokimia.
Pewarnaan Imunohistokimia Sesuai
dengan
metoda
yang
dianjurkan
oleh
perusahaan
pembuat
kit
imunohistokimia, maka dilakukan unmasking antigen retrieval dan kemudian dilanjutkan dengan mengunakan DAB (3,3-diamino benzidine) kit.
Blocking aktifitas endogenous
dengan preparat H2O2 3 % selama 20 menit. Selanjutnya dilakukan pencucian dengan PBS tween dan kemudian direndam dalam susu skim 0.1 % selama 30 menit, kemudian dicuci kembali dengan PBS tween. Antibodi primer yang digunakan adalah antibodi poliklonal yang dipanen dari kelinci yang diinjeksi dengan virus ND isolat lokal (VND/Tasik/M13/2009). Inkubasi selama 24 jam pada suhu 4º C, kemudian preparat dibilas dengan PBS tween dan ditambahkan antibodi sekunder.
Preparat diinkubasi selama 1 jam.
Setelah antibodi
sekunder dibilas dengan distillated water (DW), dilakukan pewarnaan dengan DAB sebagai kromogen. Sebagai counterstain digunakan Lillie Mayer hematoksilin agar mendapatkan wara kebiruan sebagai latar belakang serta antigen yang telah terwarnai dengan kromogen akan berwarna kecoklatan. Hasil preparat yang telah terwarnai kemudian diamati di bawah mikroskop. Pemeriksaan dinyatakan positif apabila dalam pembacaan preparat ditemukan antigen yang terwarnai kecoklatan dan dinyatakan negatif apabila preparat semua penampang tampak kebiruan dan tidak ditemukan antigen yang terwarnai kecoklatan sama sekali.
Analisa Statistika Data data tentang perbedaan bobot badan, FCR, titer antibodi akan ditabulasikan dalam bentuk rataan, standard deviasi, koefisien variasi dan disajikan dalam bentuk tabel. Data hasil pemeriksaan histopatologi dengan pewarnaan
HE dan immunohistokimia
dianalisa secara deskriptif dan kualitatif. Rancangan Acak Lengkap (RAL) digunakan untuk mengetahui signifikasi perbedaankadar titer antibodi, FCR, feed intake dan bobot badan (Steel & Torrie 1993).
