BAB III
Metodologi Penelitian
III.1 Bahan dan Alat yang Digunakan dalam Penelitian Obyek penelitian ini adalah teripang hitam (holothuria edulis). Sampel berupa daging teripang hitam (Holothuri edulis) yang kering dari perairan laut Sulawesi Tengah diambil secara acak. Bahan untuk kegiatan penelitian dan penyiapan sampel meliputi: 1. Larutan standar campuran 10 macam asam amino p.a merk sigma digunakan sebagai larutan standar . 2. Aquadest digunakan sebagai pelarut diambil dari laboratorium penelitian kimia fisik material. 3. Campuran es-aseton , digunakan untuk membekukan sampel. 4. Larutan asam klorida 0,01N dapat dibuat dengan memipet HCl pekat kualitas p.a sebanyak 0,08 mL lalu dimasukkan ke dalam labu takar volume 100mL selanjunya ditambahkan aquades sampai tanda tera. Digunakan untuk mencuci larutan sampel agar semua partikel-partikel sampel dapat diperoleh secara maksimal. 5. Larutan asam klorida 0,02 N dapat dibuat dengan memipet HCl pekat kualitas p.a sebanyak 0,2 mL lalu dimasukkan ke dalam labu takar volume 100mL dan ditambahkan aquades sampai tanda tera. 6. Larutan asam klorida 6 N dapat dibuat dengan memipet HCl pekat kualitas p.a sebanyak 24 mL lalu dimasukkan ke dalam labu takar volume 50mL selanjutnya ditambahkan aquades sampai tanda tera. Digunakan untuk memecahkan ikatan peptida yang menghubungkan asam-asam amino didalam protein teripang hitam. 7. Butanol:asam asetat glasial:air (4:4:1 V/V)) ketiga zat tersebut kualitas p.a digunakan sebagai eluen (fase gerak) pada kromatografi lapis tipis (KLT). 8. Kloroform:metanol:amoniak (2:1:1 V/V) ketiga zat tersebut kualitas p.a digunakan sebagai eluen (fase gerak) pada kromatografi lapis tipis (KLT).
27
9. Kertas kromatografi No 42 dengan ukuran panjang kertas 15 cm dan lebar 10 cm digunakan sebagai pengganti silika gel untuk pembelajaran kromatografi pada tingkat SMA. 10. Silika gel 60 F 254 dengan ukuran 20 x 20 digunakan sebagai fase diam pada kromatografi lapis tipis. 11. H2SO4 pekat 15mL,
digunakan pada tahapan destruksi sampel menjadi
unsur-unsurnya. 12. Se (Selenium) 2 gram, digunakan untuk menaikkan titik didih dan mempercepat proses oksidasi. 13. NaOH 14 N dibuat dengan melarutkan 14 gr NaOH padat ke dalam labu takar 100 mL selanjutnya ditambahkan aquades sampai tanda tera. Digunakan pada tahap destilasi agar ammonium sulfat dipecah menjadi amonia. 14. H3BO3 2% dibuat dengan melarutkan 2 gr H3BO3 ke dalam labu takar 100 mL dan selanjutnya ditambahkan aquades sampai tanda tera. Digunakan sebagai larutan asam standar. 15. HCl 0,02 N dapat dibuat dengan memipet larutan HCl pekat kualitas p.a sebanyak 0,2 mL lalu dimasukkan ke dalam labu takar 100 mL, selanjutnya ditambahkan aquades sampai tanda tera. Digunakan sebagai peniter pada tahap titrasi. 16. Indikator BCG (Bromo Cresol Green). Digunakan untuk mengetahui titik akhir titrasi. 17. Ninhidrin 1%,ditimbang sebanyak 1 gr ninhidrin lalu dimasukkan ke dalam labu takar 25 mL selanjutnya ditambahkan aseton sampai tanda garis. Digunakan untuk menampakkan noda pada kromatogram TLC sehingga menghasilkan produk yang berwarna ungu. 18. Aseton kualitas p.a digunakan untuk melarutkan ninhidrin. 19. Membran filter 0,22 μm digunakan untuk menyaring larutan sampel. 20. Reagent OPA (ortoftaldehida) 50 mg digunakan sebagai pereaksi dalam analisis asam amino secara HPLC. 21. Bufer A: Asam asetat glasial dan natrium asetat kualitas p.a digunakan sebagai komponen buffer pH= 6,5 dengan jumlah natrium asetat tetap
28
(1,7901 gram CH3COONa + 50 mL CH3COOH 0,01M), Na.EDTA 0,05 %, Metanol 9,0 %, THF 1,0 % digunakan sebagai eluen pada analisis HPLC. 22. Pereaksi B : Metanol 95 % , dibuat dengan cara memipet sebanyak 95mL larutan methanol kualitas p.a lalu dimasukkan ke dalam labu takar 100 mL, selanjutnya ditambahkan aquades sampai tanda garis. Digunakan sebagai eluen pada analisis secara HPLC. Alat yang digunakan dalam penelitian ini secara umum diuraikan sebagai berikut : 1. Lumpang dan alu tempat untuk menggerus daging teripang. 2. Penggiling dipakai untuk menggiling daging teripang. 3. Timbangan analitik dengan ketelitian 0,1 mg, untuk menimbang zat dan sampel yang digunakan dalam penelitian . 4. Freez dryer digunakan selama 24 jam agar sampel terbebas dari molekul air. 5. Pemanas listrik digunakan untuk memanaskan triptopan agar larut dengan sempurna. 6. Kaca masir digunakan untuk menyaring sampel. 7. Rotary evaporator digunakan pada suhu 800C untuk menguapkan filtrat yang terdapat dalam sampel . 8. Sprayer, dipakai untuk menampakkan noda pada silika plat 9. Oven, digunakan pada suhu 1100C. 10. Seperangkat alat HPLC. 11. Alat gelas seperti gelas kimia, labu takar, pipet volum, kaca arloji, pengaduk kaca,labu ulir, labu ekstraksi Kjeldahl, pendingin balik dan lainnya yang biasa digunakan di laboratorium untuk melarutkan atau menyiapkan larutan.
III.2 Pengambilan dan Penyiapan Sampel Teripang hitam (Holothuria edulis) yang diperkirakan sama ukurannya, yaitu panjang antara 25-30 cm dengan berat antara 0,50-1,25 kg dikumpul secara acak. Selanjutnya contoh diambil dagingnya, dipotong kecil lalu digiling sampai halus.
29
III.3 Penyiapan Larutan Standar Larutan standar dibuat dengan cara melarutkan sejumlah tertentu zat kimia kualitas p.a ke dalam aquadest dengan komposisi seperti dalam Tabel III.1. Tabel III.1 Komposisi Larutan Standar yang Digunakan pada Percobaan Analisi Kualitatif Secara Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Konsentrasi larutan
Komposisi larutan
Iso leusin 0,0001 M
0,0131 gram C6H13NO2 dilarutkan dalam aquadest hingga volume 1000 mL
Leusin 0,0001 M 0,0131 gram C6H13NO2 dilarutkan dalam aquadest hingga volume 1000 mL Lisin 0,0001 M 0,0146 gram C6H14N2O2 dilarutkan dalam aquadest hingga volume 1000 mL Metionin 0,0001 M 0,0149 gram C5H11NO2S dilarutkan dalam aquadest hingga volume 1000 mL Fenilalanin 0,0001 M 0,0165 gram C9H11NO2 dilarutkan dalam aquadest hingga volume 1000 mL Treonin 0,0001 M
0,0119 gram C4H9NO3 dilarutkan dalam aquadest hingga volume 1000 mL
Triptopan 0,0001 M
0,0204 gram C11H12N2O2 dilarutkan dalam larutan HCl 0,01M hingga volume 1000 mL
Valin 0,0001 M 0,0117 gram C5H10NO2 dilarutkan dalam aquadest hingga volume 1000 mL Histidin 0,0001 M 0,0155 gram C6H9N3O2 dilarutkan dalam aquadest hingga volume 1000 mL Arginin 0,0001 M 0,0174 gram C6H14N4O2 dilarutkan dalam aquadest hingga volume 1000 mL
30
III.4
Penyiapan Fase Diam Dan Fase Gerak Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
(1) Fase diam Fase diam yang digunakan untuk memisahkan substansi campuran menjadi komponen-komponennya berupa padatan yaitu sebuah lapis tipis silika (SiO2) yang dilekatkan pada lempeng logam. (2) Fase gerak Fase gerak yang digunakan untuk membawa komponen-komponen yang terdapat dalam campuran adalah n-butanol : asam asetat : air = 4: 1 : 1(V/V) pengembang yang sama dapat digunakan fase gerak kloroform : methanol : amoniak = 2 : 2 : 1(V/V).
III.4.1 Prosedur Kromatografi Lapis Tipis Sampel hasil hidrolisis yang dalam bentuk filtrat beserta larutan asam amino standar dengan konsentrasi tertentu ditotolkan pada plat lapisan tipis silika G60 F254 menggunakan pipa kapiler yang dilakukan sedemikian rupa sehingga didapatkan noda berbentuk bulatan. Penotolan dilakukan pada jarak antara noda sebesar 1,5 cm. Pelat lapisan tipis ini kemudian dimasukkan ke dalam bejana kromatografi yang telah dijenuhkan dengan uap fasa gerak. Bejana ditutup rapat dan dilakukan elusi sampai fasa gerak mencapai jarak േ15 cm dari atas plat.
III.4.2 Pengkondisian Kromatografi Lapis Tipis Setelah elusi selesai, pelat dikeluarkan dari bejana, dikeringkan diudara dan noda dapat dilihat dengan menyemprotkan larutan ninhidrin. Perlakuan diulang kembali pada konsentrasi sampel tetap dengan memfariasikan komposisi fase gerak hingga diperoleh kondisi pemisahan sampel yang optimum. Fasa gerak dan jarak elusi yang memberikan pemisahan terbaik dilakukan untuk analisis kualitatif. Besaran kromatografi yang diukur untuk menentukan kondisi optimum adalah harga Rf.
31
III.5 Analisis Protein dengan Mikro-Kjeldahl Ditimbang 0,1 gram sampel, kemudian dipindahkan ke dalam labu Kjeldahl 30 mL. Ditambahkan 2 gram campuran reagen selenium dan 10 mL H2SO4 pekat, setelah itu ditambahkan beberapa butir batu didih dan sampel didihkan selama 1 – 1,5 jam hingga cairan menjadi jernih, lalu didinginkan. Kemudian dipipet 10 mL dan dimasukkan ke dalam alat destilasi beserta 5 mL NaOH 14 N. Erlemeyer yang berisi 5 mL larutan H3BO3 2% dan 2 tetes indikator Bromo Cresol Green (BCG) diletakkan di bawah kondensor dimana ujung tabung kondensor harus terendam di bawah larutan H3BO3 2%, kemudian dititrasi dengan HCl 0,1 N sampai terjadi perubahan warna dari biru menjadi merah muda. Dilakukan juga penetapan blanko. Adapun cara kerja penetapan blanko sama dengan cara kerja penetapan nitrogen total, hanya saja pada penetapan blanko tidak ditambahkan sampel teripang ke dalam labu Kjeldhal. Perhitungan kadar protein dilakukan dengan Persamaan II.6 berikut. % N = ( mL HCl – mL blanko)
x N.HCl x 14,008 x 100%
Berat sampel (g) x 1000
(II.6)
% Protein = % N x 6,25
III.5.1 Analisis Asam Amino Prosedur yang dilakukan dalam penentuan kandungan dan komposisi asam amino dalam sampel teripang hitam (Holothuria edulis) adalah hidrolisis protein, dilanjutkan pada tahap derivatisasi dan injeksi. (1) Hidrolisis protein Tabung uji untuk hidrolisis dipilih tabung reaksi yang dilengkapi dengan penutup tabung. Ditimbang dengan menggunakan timbangan analitik 1 gram sampel daging teripang hitam yang telah digiling halus, lalu dituangkan ke dalam tabung reaksi bertutup, ditambahkan 3 mL HCl 6 N. Larutan sampel dalam tabung bertutup dihidrolisis pada suhu 1100C selama 24-36 jam sampai hidrolisis diperkirakan sempurna. Ketika sampel didinginkan setelah hidrolisis, tabung
32
dibuka lalu isinya dituang ke dalam wadah labu alas bulat 50 mL, sampel dicuci sebanyak 4 kali dengan 2 mL HCl 0,01 N selanjutnya larutan sampel yang telah dicuci dikumpulkan dalam labu alas bulat dan diuapkan dengan alat rotary evaporator pada suhu 800C. Sampel kering ditambahkan lagi sebanyak 5 mL HCl 0,02 N dan disaring dengan membran filter 0,22 μm, diambil 50 μL larutan sampel untuk dianalisis secara kromatografi lapis tipis (KLT). Sedangkan analisis sampel untuk penetapan asam amino dengan kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) dilakukan di Laboratorium Terpadu, Institut Pertanian Bogor. (2) Derivatisasi dan Injeksi 50 μL larutan sampel dicampur dengan jumlah yang sama buffer kalium borat. 5μL campuran tersebut diambil dan disimpan pada suatu vial auto sampler antara posisi 1-44. Vial lain dengan larutan kerja reagen OPA ditempatkan pada posisi 45 dari korsel autosampler. Selanjutnya sampel sebanyak 5 μL diinjeksikan ke dalam kolom HPLC. Agar proses pemisahan asam amino memberikan hasil yang baik, maka setiap proses kromatografi kolom selalu disetimbangkan dengan buffer A. Hal ini dapat diprogramkan kedalam file gradien dari programmer gradien K-45. Profil gradien asam-asam amino hidrolisat dapat dilihat pada Tabel III.2 di bawah ini. Tabel III.2 Profil gradien asam-asam amino hidrolisa Waktu(menit)
Aliran(mL/menit)
%B
0
1
0
1
1
0
2
1
15
5
1
15
13
1
42
15
1
42
20
1
70
22
1
100
26
1
100
28
1
0
33
38
1
0
III.5.2 Analisis Data Dalam penentuan macam dan komposisi asam amino dalam penelitian ini, dilakukan analisis secara kualitatif dan kuantitatif dari data kromatogram yang diperoleh. Analisis kualitatif dilakukan dengan cara membandingkan waktu retensi asam amino sampel dengan waktu retensi asam amino standar tertentu, dimana waktu retensi yang sama menunjukkan asam amino yang sama. Analisis kuantitatif dilakukan berdasarkan perhitungan area asam amino sampel yang dibandingkan area asam amino standar, sebagai berikut:
( Asp / Ast) x Cs x V x BM AA =
X 100 % C
Keterangan : AA = Kadar asam amino penyusunnya (%) Asp = Luas area asam amino sampel (AU) Ast = Luas area asam amino standar (AU) Cs
= Banyaknya mol asam amino standar ( μmol/mL )
V
= Jumlah volume sampel (mL)
BM = Berat molekul asam amino (gram/mol) C
= Berat sampel yang ditimbang (μg)
Secara keseluruhan prosedur penelitian ini dapat dilihat pada Gambar III.1 berikut.
34
III.6 Diagram Alir penelitian
Daging teripang halus (1 gram) 1. Ditambahkan 3,0 mL HCl 6N, dilarutkan 2. Dimasukkan ke dalam tabung ulir Larutan hidrolisis 1. 2. 3. 4.
Dioven pada suhu 1100C selama 24-36 jam Ditambahkan 2 mL HCl 0,01N Diuapkan dengan evaporator berputar pada suhu 800C Ditambahkan 5 mL HCl 0,02N
Larutan hidrolisat (5 mL) 1. Disaring dengan membran filter 0,22μm
Residu
Filtrat
ASAM AMINO
KLT
HPLC
Gambar III.1 Diagram alir penelitian
35
III.7 Menentukan Jenis Asam Amino Esensial dan gugus Peptida dalam Protein untuk Pembelajaran Kimia di SMA dengan membuat Modul Praktikum Modul praktikum yang dibuat dan dianalisis adalah suatu modul yang bertujuan untuk menambah pemahaman materi pelajaran tentang protein di SMA. Materi pelajaran tentang protein di SMA biasanya hanya disampaikan dengan metode ceramah dan diskusi kelas, dan belum mengenal cara menentukan jenis asam amino dan gugus peptida dalam protein secara eksperimen (dapat dilihat pada lampiran I) Dengan modul praktikum ini diharapkan siswa dapat menentukan susunan asam amino dan gugus peptida dalam protein secara kromatografi kertas. Modul praktikum dibuat dan cara kerjanya mengikuti diagram alir seperti yang ditampilkan pada Gambar III.2. Penjenuhan Kertas Kromatografi 1. n-butanol 25mL, asam asetat 5mL dan air 5mL 2. Dimasukkan ke dalam bejana pengembang 3. Disiapkan kertas kromatografi,diberi garis dasar dengan jarak 1,5cm dari tepi bawah 4. Dibuat titik dengan pensil 5. Kertas kromatografi di masukkan ke dalam bejana pengembang 6. Didiamkan selama ±1 jam, bejana ditutup.
Kelarutan Asam Amino 1. Kertas yang jenuh diangkat 2. Ditotolkan sampel 3. Kertas dimasukkan ke dalam bejana pengembang.
4. Didiamkan sampai pelarut tidak lagi merembes 5. 6. 7. 8.
ke atas. Kertas dianginkan sampai kering Noda sampel terakhir ditandai dengan Pensil Disemprot kertas dengan ninhidrin,dikeringkan Diukur noda dari titik awal.
Hitung Nilai Rf
36
Gambar III.2 Diagram alir penentuan asam amino dan gugus peptida dalam protein Secara kromatografi kertas
37
